39

การทดลองที่ 4 กรดอะมิโนและโปรตีน 1

อ. ชัยวัฒน วามวรรัตน

วัตถุประสงค 1. เพ่ือศึกษาสมบัติทางเคมีบางประการของกรดอะมิโนและโปรตีน 2. เพ่ือใหรูจักวิธีที่ใชในการวิเคราะหหาปริมาณโปรตีน

โปรตีนเปนพอลิเมอรที่ประกอบขึ้นจากมอโนเมอรที่เรียกวา กรดอะมิโน ซึ่งมีอยู 20 ชนิดดวยกัน

ในจํานวนนี้มี 19 ชนิดที่มีโครงสรางทั่วไปเปนดังนี้

แตละชนิดมีความแตกตางที่หมู R ดังรูปที่ 1 ยกเวนกรดอะมิโนโพรลีน ซึ่งหมู R เกิดพันธะกับไนโตรเจนอะตอม เกิดเปนกรดอิมิโน ดังมีโครงสรางตอไปนี ้

โครงสรางของกรดอะมิโนในธรรมชาติเปน แอล-ไอโซเมอร ยกเวนกรดอะมิโนไกลซีน โครงสรางหมู R ของกรดอะมิโนทั้ง 20 ชนิด แสดงไวในรูปที่ 1 ตําแหนงคารบอนอะตอมที่เปน

ศูนยกลางเรียกวา ตําแหนง α คารบอนที่อยูถัดไปทางหมู R เรียก β, γ, δ (อานวา เดลตา) ε (อานวา เอปซิลอน) และ ξ (อานวา เซตา) ตามลําดับ กรดอะมิโนแตละชนิดมีช่ือยอที่แทนดวยอักษรตัวพิมพใหญ

ภาษาอังกฤษ 1 ตัวหรืออักษรภาษาอังกฤษ 3 ตวโดยที่อักษรตัวแรกตองเปนตัวพิมพใหญเสมอ ดังแสดงใน

รูปที่ 1

โปรตีนเปนมหโมเลกุลเกิดจากการเชื่อมตอของกรดอะมิโนโดยพันธะเพปไทด กรดอะมิโนแตละ

หนวยในโปรตีนเรียกวา กรดอะมิโนสวนที่เหลือ (amino acid residue) โปรตีนแตละชนิดแตกตางกันที่จํานวนกรดอะมิโนที่ตอเช่ือมกันและลําดับของกรดอะมิโน

ปฏิกิริยาตาง ๆ ของกรดอะมิโน ปฏิกิริยาเคมีของกรดอะมิโน เกิดข้ึนจากหมูแอลฟาอะมิโน หรือ แอลฟาคารบอกซิลิก หรือจากหมู

R ของกรดอะมิโนบางชนิด ปฏิกิริยาที่ศึกษาในการทดลองนี้มีดังนี ้

ปฏิกิริยานินไฮดริน (Ninhydrin reaction)

นินไฮดริน (triketohydrindene hydrate) ซึ่งเปนสารออกซิไดสสามารถเกิดปฏิกิริยากับหมู

แอลฟาอะมิโนของกรดอะมิโนที่พีเอช 4-8 ใหสารที่มีสีน้ําเงินมวงเกิดขึ้น ปฏิกิริยาที่เกิดข้ึนมีอยู 2 ข้ันตอน

ดวยกัน ข้ันแรกเปนปฏิกิริยาระหวางกรดอะมิโนและนินไฮดรินเกิดสารประกอบไฮดรินแดนติน (hydrin-dantin) อัลดีไฮด คารบอนไดออกไซด และแอมโมเนียขึ้นดังสมการ

40

รูปที่ 1 แสดงโครงสรางของกรดอะมิโนแตละชนิด อะตอมที่มีสีแดงแสดงถึงหมู R ของกรดอะมิโน ที่มา : http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Amino_acids_2.png

41

ในข้ันที่ 2 แอมโมเนียที่เกิดข้ึนจากขั้นแรกเขาทําปฏิกิริยากับไฮดรินแดนตินและนินไฮดรินอีกโมเลกุลหนึ่ง

เกิดสารประกอบที่ใหสีน้ําเงินมวงดังสมการ

กรดอิมิโน ไดแก โพรลีนและไฮดรอกซีโพรลีนเมื่อเกิดปฏิกิริยากับนินไฮดรินจะใหสารประกอบที่มี

สีเหลืองแทน ดังสมการ

นอกจากนี้สารประกอบพวกเอมีนปฐมภูมิ (primary amine)และแอมโมเนียก็สามารถเกิดปฏิกิริยาไดเชนเดียวกัน แตไมมีคารบอนไดออกไซดเกิดข้ึน ปฏิกิริยานี้มีความไวสูงจึงมีประโยชนในการวิเคราะหเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ ตัวอยางของการ

วิเคราะหเชิงคุณภาพ เชน การระบุตําแหนงของกรดอะมิโนที่แยกไดหลังการทําโครมาโทกราฟแบบกระดาษ

(จะไดปฏิบัติในการทดลองเรื่อง โครมาโตกราฟหลักการแบงสวน) สวนการวิเคราะหเชิงปริมาณ เชน การ

หาปริมาณกรดอะมิโนในสารละลาย โดยการวัดความเขมของสีที่เกิดขึ้น สีน้ําเงินมวงและสีเหลืองที่ไดจาก

ปฏิกิริยาวัดคาการดูดแสงไดที่ 570 และ 440 นาโนเมตรตามลําดับ ความเขมของสีเปนสัดสวนโดยตรง

กับปริมาณกรดอะมิโนที่มีอยู

ปฏิกิริยาแซนโธโพรทีอิก (Xanthoproteic reaction) ปฏิกิริยานี้ทดสอบกรดอะมิโนที่มีวงแหวนแอโรแมติก (aromatic ring) ที่แขนงขาง ซึ่งไดแก

กรดอะมิโนไทโรซีน ทริพโตเฟน และเฟนิลอะลานีน โดยเกิด nitration ที่วงแหวนแอโรแมติกเมื่อทํา

ปฏิกิริยากับกรดไนตริกเขมขนที่อุณหภูมิสูง ไดสารละลายสีเหลืองใส สารละลายนี้เม่ือทําใหเปนดางจะได

เกลือที่มีสีสม ซึ่งเปนผลบวกของปฏิกิริยา โปรตีนที่มีกรดอะมิโนดังกลาวเปนองคประกอบอยูก็สามารถ

เกิดปฏิกิริยาไดเชนเดียวกัน

ปฏิกิริยาซากากูชิ (Sakaguchi reaction) ปฏิกิริยานี้ทดสอบกรดอะมิโนที่มีหมูกัวนิดีน (guanidine) ที่แขนงขาง ซึ่งมีอยูเพียงชนิดเดียว คือกรดอะมิโนอารจินีน โดยใหสารละลายสีแดงเมื่อทําปฏิกิริยากับแอลฟาแนพธอลและโซเดียมไฮโปโบรไมต

โปรตีนที่มีกรดอะมิโนอารจินีนเปนองคประกอบก็สามารถใหผลบวกไดเชนเดียวกัน

42

ปฏิกิริยาตะกั่วซัลไฟด (Lead sulphide reaction) ปฏิกิริยานี้ทดสอบกรดอะมิโนที่มีธาตุซัลเฟอรเปนองคประกอบและธาตุซัลเฟอรที่อยูในโมเลกุลนั้น

ถูกทําลายไดงายในสารละลายที่เปนดาง ไดแก กรดอะมิโนซิสเทอีน(cysteine) และซีสทีน(cystine) ยกเวน

กรดอะมิโนเมทไธโอนีน เม่ือตมกรดอะมิโนดังกลาวในสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดเขมขนจะใหโซเดียม

ซัลไฟด (Na2S) ซึ่งตกตะกอนลงมาเปนตะกอนสีดําของตะกั่วซัลไฟด (lead sulphide) เม่ือเติมตะกั่วแอซี-เตท (lead acetate) ดังสมการ Na2S + (CH3COO) 2Pb PbS + 2 CH3COONa โปรตีนที่มีกรดอะมิโนดังกลาวเปนองคประกอบจะเกิดปฏิกิริยาไดเชนกัน

ปฏิกิริยาฮอฟกินส-โคล (Hopkins-Cole’s reaction) ปฏิกิริยานี้ใชทดสอบกรดอะมิโนที่มีวงแหวนอินโดล( indole ring )ที่แขนงขาง ซึ่งไดแก กรดอะมิ-โนทริพโตเฟน โดยเกิดปฏิกิริยากับกรดไกลออกซิลิก (glyoxalic acid) ในกรดซัลฟวริกเขมขน แลวใหวง

แหวนสีมวงข้ึนที่รอยตอระหวางช้ันสารละลายกับชั้นกรดซัลฟวริก โปรตีนที่มีกรดอะมิโนทริพโตเฟนเปน

องคประกอบใหผลบวกกับปฏิกิริยานี้ได

วิธีที่ใชในการวิเคราะหหาปริมาณโปรตีน

1. วิธีวัดการดูดแสงที่ชวงคล่ืนอัลตราไวโอเลต โปรตีนสามารถดูดกลืนแสงสูงสุดในชวงคล่ืนอัลตราไวโอเลตที่ 200 และ 280 นาโนเมตร การดูด

แสงที่ความยาวคลื่นหลังเปนผลจากการดูดแสงของกรดอะมิโนที่มีหมู R เปนวงแหวนแอโรแมติก ไดแก

ทริพโตเฟน ไทโรซีน เฟนิลอะลานีน และฮีสทิดีน สวนการดูดแสงที่ความยาวคลื่นแรกเปนผลจากการดูด

แสงของพันธะเพปไทดซึ่งมีอยูมากมายในโปรตีน โดยทั่วไปเรานิยมวัดปริมาณโปรตีนที่ 280 นาโนเมตร เนื่องจากมีสารประกอบอื่นๆ ที่ดูดกลืนแสงความยาวคลื่นนี้นอยกวาความยาวคลื่นที่ส้ันกวานี้ กรดนิวคลีอิกสามารถดูดกลืนแสงไดที่ 280 นาโนเมตรไดเชนกัน ดังนั้นโปรตีนที่สกัดจากเซลลซึ่ง

ยังมีดีเอ็นเอและอารเอ็นเอปะปนอยูจะรบกวนการวิเคราะห การหาปริมาณโปรตีนจึงตองหักปริมาณกรด

นิวคลีอิกซึ่งหาไดจากการวัดการดูดแสงที่ความยาวคลื่นที่มีการดูดแสงสูงสุดของกรดนิวคลีอิกที่ 260 นาโน

เมตร แลวคํานวณหาปริมาณโปรตีนไดจากสูตร

ความเขมขนโปรตีน (มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) = 1.55 A280

- 0.76 A260

43

2. วิธีไบยูเรท (Biuret assay) ปฏิกิริยานี้ใชทดสอบสารที่ประกอบดวยพันธะเพปไทดตั้งแต 2 พันธะขึ้นไป โดยใหทําปฏิกิริยากับ

ทองแดงซัลเฟตในสารละลายที่มีสภาวะเปนดาง คิวปริกไอออน (Cu2+) ในน้ํายาจะเกิดสารประกอบ

เชิงซอนกับไนโตรเจนอะตอมที่พันธะเพปไทด (รูปที่ 1) สารประกอบที่มีกรดอะมิโนอยางนอย 3 หนวย

(tripeptide) และโปรตีนใหผลบวกกับปฏิกิริยานี้โดยใหสารละลายที่มีสีมวง ความเขมของสีที่เกิดข้ึนเปน

สัดสวนโดยตรงกับจํานวนพันธะเพปไทดที่มีอยูและคงตัวอยูไดหลายวันถาเก็บไวในที่มืด ปฏิกิริยานี้จึงมี

ประโยชนในการวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนในสารละลาย โดยวัดคาการดูดแสงของสีมวงที่เกิดข้ึนหลังจาก

ปฏิกิริยาผานไป 30 นาที ที่ 540 นาโนเมตร แลวเทียบหาความเขมขนจากกราฟมาตรฐานของสารละลายโปรตีนมาตรฐาน

รูปที่ 2 การเกิดสารประกอบเชิงซอนของ Cu2+ กับพันธะเพปไทด

วิธีนี้มีสารรบกวนปฏิกิริยาหลายชนิด ไดแก แอมโมเนียมไอออนที่ความเขมขนสูงๆ ซึ่งจะเกิดสาร

ประกอบเชิงซอนกับคิวปริกไอออน ตัวรีดิวซ เชนน้ําตาลรีดิวซิ่งซึ่งจะรีดิวซคิวปริกไอออนเปนคิวปรัสไอออน

ใหเห็นเปนตะกอนสีสม

3. วิธีลอรี (Lowry assay) ในสภาวะที่เปนดางคิวปริกไอออนเกิดสารประกอบเชิงซอนกับพันธะเพปไทดของโปรตีน พรอมกัน

นั้นก็ถูกรีดิวซเปนคิวปรัสไอออน ปฏิกิริยาขั้นแรกนี้มีความคลายคลึงกับวิธีไบยูเรท เมื่อเติมน้ํายาโฟลิน-ซีออคาลโท (Folin-Ciocalteau) ซึ่งเปนเกลือฟอสโฟโมลิบเดตฟอสโฟทังสเทตในสารละลายกรด หมู R ของสวนที่เหลือของไทโรซีน ทริพโตเฟน และซีสเตอีนในโปรตีนรวมถึงคิวปรัสไอออนจะเกิดปฏิกิริยากับ

สารในน้ํายาซึ่งถูกรีดิวซเกิดเปนสารประกอบที่มีสีน้ําเงิน โปรตีนแตละชนิดใหความเขมของสีแตกตางกัน

ออกไปขึ้นอยูกับปริมาณไทโรซีน และทริปโตเฟนที่มีอยู วิธีนี้มีสารรบกวนปฏิกิริยามากมาย ตัวอยาง เชน สารรีดิวซ เชน 2-mercaptoethanol เปนตน

บัฟเฟอรหลายชนิด เชน HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2 ethanesulfonic acid) EDTA แอมโมเนียมซัลเฟตปริมาณสูง

4. วิธีแบรดฟอรด (Bradford assay หรือ dye-binding assay)

โปรตีนจับกับสี Coomassie Brilliant blue G-250 ดวยแรงยึดเหนี่ยวไฮโดรโฟบิกและแรงยึด

เหนี่ยวไอออนนิกรวมกัน ประจุบวกที่แขนงขางของกรดอะมิโนโดยเฉพาะสวนที่เหลือของอารจีนีนมี

บทบาทสําคัญในการจับกับโมเลกุลของสีซึ่งมีประจุลบ (รูปที่ 3) โมเลกุลของสีในสภาพที่มีประจุลบใหสีน้ําเงิน แตเมื่อรับโปรตอนแลวจะเปลี่ยนเปนสีแดงสมออน ๆ การจับของสีกับโปรตีนในสภาวะที่เปนกรดจึง

44

ชวยคงสภาพโครงสรางประจุลบของสีไวและใหสีน้ําเงินที่เขมข้ึนตามปริมาณโปรตีนที่มีอยู นอกจากนี้ยัง

เปล่ียนสมบัติการดูดแสงของสีจากเดิมที่มีคา λmax เปน 465 นาโนเมตร ไปเปน 595 นาโนเมตร

รูปที่ 3 ก. โครงสรางที่มีประจุลบของสี Coomassie brilliant Blue G-250

ข. สเปคตรัมของสี Coomassie brilliant Blue G-250 เม่ือไมไดจับกับโปรตีน (สีแดง) และ สเปคตรัมของสี Coomassie brilliant Blue G-250 เม่ือจับกับโปรตีน (สีเขียว) ที่มา : http://www.bmglabtech.com/application-notes/absorbance/bradford-omega-158.cfm

การทดลองที่ 4.1 ปฏิกิริยานินไฮดริน (Ninhydrin reaction) สารเคมีที่ใช 1. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนไกลซีน 2. สารละลาย 0.05% กรดอะมิโนโพรลีน 3. สารละลาย 1% แอลบูมินของไขขาว 4. สารละลายตัวอยางหมายเลข PC............. 5. น้ํายานินไฮดริน (0.2 % นินไฮดรินในเอธานอล)

6. สารละลายซิเตรทบัฟเฟอร 0.1 โมลารพีเอช 5.0

วิธีทดลอง 1. ปเปตสารละลายที่จะทดสอบ (ขอ 1-4 ในหัวขอสารเคมีที่ใช) ลงในหลอดทดลอง หลอดละ 1 ชนิด ๆ

ละ 1 มิลลิลิตร และเติมน้ํากล่ันลงในหลอดทดลองอีกหลอดหนึ่งไวเปนหลอดเปรียบเทียบ 2. เติมสารละลายซิเตรทบัฟเฟอรลงในแตละหลอด ๆ ละ 2 มิลลิลิตร 3. เติมน้ํายานินไฮดรินลงในแตละหลอด ๆ ละ 1 มิลลิลิตร 4. ผสมสารละลายที่เติมลงในแตละหลอดใหเขากันและนําทุกหลอดไปตมในน้ําเดือด 5 นาที สังเกตสีที่

เกิดข้ึน โดยเทียบกับหลอดที่ใสน้ํากล่ัน

การทดลองที่ 4.2 ปฏิกิริยาแซนโธโพรทีอิก (Xanthoproteic reaction) สารเคมีที่ใช 1. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนไทโรซีน 2. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนไกลซีน 3. สารละลาย 1% แอลบูมินของไขขาว 4. สารละลาย 1% เจลาติน 5. สารละลายตัวอยางหมายเลข PC............. 6. สารละลาย 0.5% ฟนอล

45

6. กรดไนตริกเขมขน 7. สารละลาย 40% โซเดียมไฮดรอกไซด วิธีทดลอง 1. ปเปตสารละลายที่จะทดสอบ (ขอ 1-5 ในหัวขอสารเคมีที่ใช) ลงในหลอดทดลองหลอดละ 1 ชนิด ๆ

ละ 1 มิลลิลิตร 2. เติมกรดไนตริกเขมขนลงในแตละหลอด ๆ ละ 1 มิลลิลิตร แลวผสมใหเขากัน 3. นําทุกหลอดไปตมในน้ําเดือด 5 นาที แลวทําใหเย็นลงโดยใชน้ําประปาหลอ สังเกตสีของสารละลายและ

เปรียบเทียบสีระหวางสารที่ใชทดสอบ 4. คอย ๆ หยด สารละลาย 40% โซเดียมไฮดรอกไซดลงไปเรื่อย ๆ (ใหทําในตูควัน) เขยาใหเขากันหลังเติมทุกครั้ง จนสังเกตเห็นสีที่เปล่ียนแปลงไปอยางสมบูรณและเปรียบเทียบความเขมของสีระหวางสารที่ใช

ทดสอบโดยเทียบกับหลอดที่ใสฟนอลซึ่งใหผลบวกกับการทดสอบ

การทดลองที่ 4.3 ปฏิกิริยาซากากูชิ (Sakaguchi reaction)

สารเคมีที่ใช 1. สารละลาย 0.05 % กรดอะมิโนอารจินีน 2. สารละลาย 0.1 % กรดอะมิโนไกลซีน 3. สารละลาย 1% แอลบูมินของไขขาว 4. สารละลายตัวอยางหมายเลข PC............. 5. สารละลาย 5% แอลฟา-แนพธอล (α - naphthol) ในเอธานอล 6. สารละลาย 40% โซเดียมไฮดรอกไซด

7. น้ํายาโซเดียมไฮโปโบรไมต วิธีทดลอง 1. ปเปตสารละลายที่จะทดสอบ (ขอ 1-4 ในหัวขอสารเคมีที่ใช) ลงในหลอดทดลองหลอดละ 1 ชนิด ๆ

ละ 1 มิลลิลิตร 2. เติมสารละลาย 40% โซเดียมไฮดรอกไซดลงในแตละหลอด ๆ ละ 5 หยด 3. เติมสารละลายแอลฟา-แนพธอล ลงในแตละหลอด ๆ ละ 2 หยด แลวเขยาผสมใหเขากันนําทุกหลอด

ไปแชใหเย็นในน้ําแข็ง 4. เติมน้ํายาโซเดียมไฮโปโบรไมตลงในแตละหลอดๆ ละ 3 หยด ผสมใหเขากัน แลวสังเกตสีที่เกิดขึ้น และ

เปรียบเทียบความเขมของสีระหวางสารที่ใชทดสอบ

การทดลองที่ 4.4 ปฏิกิริยาตะกั่วซัลไฟด (Lead Sulphide reaction)

สารเคมีที่ใช 1. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนซิสเตอีน 2. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนไกลซีน 3. สารละลาย 1% แอลบูมินไขขาว 4. สารละลายตัวอยางหมายเลข PC............. 5. สารละลาย 40% โซเดียมไฮดรอกไซด 6. สารละลาย 5% ตะกั่วแอซีเตท

46

วิธีทดลอง 1. ปเปตสารละลายที่จะทดสอบ (ขอ 1-4 ในหัวขอสารเคมีที่ใช) ลงในหลอดทดลอง หลอดละ 1 ชนิด ๆ

ละ 1 มิลลิลิตร แลวเติมสารละลาย 40% โซเดียมไฮดรอกไซดลงในทุกหลอด หลอดละ 5 หยด 2. เติมสารละลายตะกั่วแอซีเตท 2 หยด และนําไปตมในน้ําเดือด 2-3 นาที สังเกตผลที่เกิดข้ึน

การทดลองที่ 4.5 ปฏิกิริยาฮอฟกินส-โคล (Hopkins-Cole’s reaction)

สารเคมีที่ใช 1. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนทริพโตเฟน 2. สารละลาย 0.1% กรดอะมิโนไกลซีน 3. สารละลาย 1% แอลบูมินไขขาว 4. สารละลาย 1% เจลาติน 5. สารละลายตัวอยางหมายเลข PC............. 6. น้ํายาฮอฟกินส-โคล 7. กรดซัลฟวริกเขมขน วิธีทดลอง 1. ปเปตสารละลายที่จะทดสอบ (ขอ 1-5 ในหัวขอสารเคมีที่ใช) ลงในหลอดทดลอง หลอดละ 1 ชนิด ๆ

ละ 1 มิลลิลิตร แลวเติมน้ํายาฮอฟกินส-โคลลงในทุกหลอด หลอดละ 2 มิลลิลิตร 2. เอียงหลอดแลวคอย ๆ ใชหลอดหยด หยดกรดซัลฟวริกเขมขนลงขาง ๆ หลอดทดลองแลวสังเกตการ

เกิดวงแหวนสีมวงที่รอยตอระหวางช้ันของสารละลาย คอยๆทําทีละหลอด

การทดลองที่ 4.6 ปฏิกิริยาโมลิสซ (Molisch’s test) เพ่ือใชทดสอบโปรตีนที่เปนไกลโคโปรตีน สารเคมีที่ใช 1. สารละลาย 1% แอลบูมินไขขาว 2. สารละลาย 1% เจลาติน 3. สารละลาย 1% ซูโครส 4. สารละลายแอลฟา-แนพธอล (5% ในเอธานอล)

5. กรดซัลฟวริกเขมขน วิธีทดลอง 1. ปเปตสารละลายที่จะทดสอบ (ขอ 1-3 ในหัวขอสารเคมีที่ใช) ลงในหลอดทดลอง หลอดละ 1 ชนิด ๆ

ละ 1 มิลลิลิตร เติมสารละลายแอลฟา-แนพธอลลงในหลอดทดลองทุกหลอด หลอดละ 5 หยด 2. คอยๆ ใชหลอดหยดหยดกรดซัลฟวริกเขมขนลงขางๆ หลอดทดลอง แลวสังเกตการเกิดวงแหวนสีมวงที่

รอยตอระหวางช้ันของสารละลาย และเปรียบเทียบผลที่เกิดข้ึนกับหลอดที่ใหผลบวกซึ่งใชสารละลายซูโครส

แทนสารละลายโปรตีน

สารละลายกรดอะมิโนหรือโปรตีนที่ตองใชในการทดลองที่ 4.1-4.6 ไดสรุปไวในตารางบันทึกผล

การทดลองที่ 1

47

ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 1 ผลการทดสอบของกรดอะมิโนชนิดตาง ๆ กับปฏิกิริยาการทดสอบกรดอะมิโน สารละลายกรดอะมิโนที่ใช สารละลายโปรตีนที่ใช

ปฏิกิริยา ไกลซีน โพรลีน ไทโรซีน อารจินีน ซิสเตอีน

ทริพ

โตเฟน แอลบูมิน

ไขขาว เจลาติน

สารละลาย

ซูโครส สารละลาย

ฟนอล

สารละลาย ตัวอยาง หมายเลข PU.........

ผล(+)หรือ (-) นิน

ไฮดริน ลักษณะผลการ

ทดสอบ

ผล(+)หรือ (-) แซนโธ

โพรทีอิก ลักษณะผลการ

ทดสอบ

ผล(+)หรือ (-) ซากากูชิ ลักษณะผลการ

ทดสอบ

ผล(+)หรือ (-) ตะกั่ว

ซัลไฟด ลักษณะผลการ

ทดสอบ

ผล(+)หรือ (-) ฮอฟ

กินส-โคล

ลักษณะผลการ

ทดสอบ

ผล(+)หรือ(-) โมลิสซ ลักษณะผลการ

ทดสอบ

49

สอบปฏิบัติการประจําบท การทดลองที่ 4.7-4.8 เปนวิธีวิเคราะหหาปริมาณโปรตีน ใหแตละกลุมเจือจางสารละลาย 1% แอลบูมิน

ไขขาวดวยน้ํากล่ันโดยการทํา ten-fold serial dilution ใหไดอีก 3 ความเขมขน โดยมีความเขมขน

สุดทายเปน 10 ug/mL ทุกความเขมขนรวมถึงความเขมขนเริ่มตน ทั้งหมดนําไปใชในการทดลองทั้งสอง

ซึ่งในแตละการทดลองใชแตละความเขมขนเปนปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ดังนั้นจงคํานวณวา 0.5 มิลลิลิตร

ของแตละความเขมขนมีปริมาณโปรตีนเปนน้ําหนักเทาใด (ตอบเปนมิลลิกรัม ไมโครกรัม หรือนาโนกรัม) การทดลองวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนนี้ แตละกลุมจะไดรับสารละลายโปรตีนตัวอยางที่ไมทราบ

ความเขมขน เปนหมายเลข PC ........ ใหหาวา 1. มีวิธีใดที่ใชวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนของสารละลายโปรตีนตัวอยางนี้ไดโดยไมตองเจือจางเลย

2. เม่ือเลือกวิธีวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนไดแลว จงหาความเขมขนของสารละลายโปรตีนตัวอยางโดยเปรียบเทียบคาการดูดแสงของสารละลายโปรตีนตัวอยางกับคาการดูดแสงของสารละลายโปรตีนความเขม

ขนใดความเขมขนหนึ่งที่สามารถใชเปรียบเทียบกันได ซึ่งคาการดูดแสงทั้งสองควรมีคาใกลเคียงกัน การที่จะเลือกวิธีสําหรับใชวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนในสารละลายโปรตีนตัวอยางไดนั้นตองทราบ

ถึงความไว (Sensitivity) ของแตละวิธีเสียกอน ซึ่งก็คือระดับปริมาณโปรตีนนอยที่สุดที่สามารถวิเคราะห

ได โดยนําแตละความเขมขนที่เตรียมไดไปทําใหเกิดสีดวยวิธีตางๆ แลวสังเกตวาปริมาณโปรตีนนอยถึง

ระดับใดที่ยังสามารถเห็นสีที่เกิดขึ้นหรือตรวจสอบวัดคาการดูดแสงของสีที่เกิดขึ้นดวยเครื่องสเปกโทรโฟ-

โตมิเตอรวาปริมาณโปรตีนนอยถึงระดับใดที่ยังสามารถวัดคาการดูดแสงได (ดูการทดลองเรื่องสเปกโทร-

โฟโตมิเตอร ซึ่งไดระบุไววาการวิเคราะหเชิงปริมาณควรอานคาการดูดแสงจากคาใดถึงคาใดจึงถือวาเปน

คาที่เช่ือถือได)

ตารางบันทึกผลการทดลองที่ 2 คาการดูดแสงและความเขมขนของโปรตีนชนิดตาง ๆ เม่ือวิเคราะหดวย

วิธีวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนวิธีตาง ๆ

คาการดูดแสง (A) ที่อานไดของ ความเขมขนของแอลบูมินไขขาว วิธีวิเคราะห/ความยาว

คล่ืนที่วัดการดูดแสง 10 mg/mL (1%)

................. ................. 10 μg/mL

สารละลาย โปรตีนตัวอยาง

หมายเลข PC….

ไบยูเรท/540 nm

แบรดฟอรด/595 nm

............mg

............mg ............mg ............mg

............ μg

............ μg ............ μg ............ μg

ปริมาตร 0.5 มิลลิลิตร ที่ใชในการวิเคราะห

มีปริมาณโปรตีนเทากับ .............ng

.............ng .............ng .............ng

..................mg ....................μg (หาจากการทดลอง)

50

การเตรียมสารละลายโปรตีนสําหรับการทดลองที่ 4.7-4.8

1. เตรียมหลอดทดลองไว 6 หลอด หลอดที่ 1-4 ใหปเปตสารละลายแอลบูมินไขขาวที่เตรียมไว

แลว (4 ความเขมขน) ลงในแตละหลอด ๆ ละ 1 ความเขมขน ๆ ละ 0.5 มิลลิลิตร ปเปตสารละลาย

โปรตีนตัวอยาง 0.5 มิลลิลิตร ลงในหลอดที่ 5 และปเปตน้ํากล่ัน 0.5 มิลลิลิตร ลงในหลอดที่ 6

2. ทั้ง 6 หลอดที่เตรียมไดในขอ 1 ถือเปน 1 ชุด ซึ่งใชสําหรับ 1 การทดลอง ใหเตรียมเชนนี้

เพ่ิมอีกชุด สําหรับอีกหนึ่งการทดลองที่เหลือ (การทดลองที่ 4.8) 3. นําแตละชุดที่เตรียมไดไปวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนดวยวิธีตาง ๆ ตอไปนี้ การทดลองที่ 4.7 การวิเคราะหปริมาณโปรตีนดวยวิธีไบยูเรท (Biuret assay) สารเคมีที่ใช 1. สารละลายแอลบูมินไขขาว 4 ความเขมขนจาก 10 mg/mL ถึง 10 μg/mL 2. สารละลายโปรตีนตัวอยาง หมายเลข PC...............

3. น้ํายาไบยูเรท วิธีทดลอง 1. เติมน้ํายาไบยูเรทลงในหลอดทุกหลอด ๆ ละ 2 มิลลิลิตร ผสมใหเขากันแลวตั้งทิ้งไว 30 นาที 2. วัดคาการดูดแสงทุกหลอดท่ีความยาวคลื่น 540 นาโนเมตร โดยใชหลอดที่ 6 ในการตั้ง 100% T 3. สรุประดับปริมาณโปรตีนที่วัดไดโดยวิธีนี้ 4. หาขอสรุปวาสารละลายโปรตีนตัวอยางสามารถวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนดวยวิธีนี้โดยไมตองเจือจาง

เลยไดหรือไม ถาวิเคราะหไดจงหาวาปริมาณโปรตีนเปนเทาใด การทดลองที่ 4.8 การวิเคราะหปริมาณโปรตีนดวยวิธีแบรดฟอรด (Bradford assay) สารเคมีที่ใช 1. สารละลายแอลบูมินไขขาว 4 ความเขมขน จาก 10 mg/mL ถึง 10 μg/mL 2. สารละลายโปรตีนตัวอยาง หมายเลข PC............... 3. น้ํายาแบรดฟอรด วิธีทดลอง 1. เติมน้ํายาแบรดฟอรดลงในหลอดทดลองทุกหลอด ๆ ละ 5 มิลลิลิตร 2. ผสมเขาดวยกันและอานคาการดูดแสงที่ 595 นาโนเมตรทันที

ขอพึงระวัง 1. ใหรีบวัดคาการดูดแสงใหเสร็จสิ้นภายใน 30 นาทีหลังการเติมน้ํายา หากทิ้งไวนานอาจเกิดการตก

ตะกอนของสารประกอบเชิงซอนของสีและโปรตีน 2. เนื่องจากสีที่ใชติดกับผิวแกวภายในหลอดคิวเวตไดงาย เม่ือวัดคาการดูดแสงเรียบรอยแลวใหรีบเท

สารละลายในคิวเวตออกและลางสีที่ติดอยูออกอยางระมัดระวังดวยกรดไฮโดรคลอริกเขมขนหรือเมทธา

นอล

3. สรุประดับปริมาณโปรตีนที่วัดไดโดยวิธีนี้ 4. หาขอสรุปวาสารละลายโปรตีนตัวอยางสามารถวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนดวยวิธีนี้โดยไมตองเจือจาง

เลยไดหรือไม ถาวิเคราะหไดจงหาวาปริมาณโปรตีนเปนเทาใด

51

คําถาม 1. จากการทดสอบตางๆ เจลาตินมีปริมาณกรดอะมิโนที่จําเปนตอรางกาย (essential amino acids) เปนอยางไรเมื่อเปรียบเทียบกับแอลบูมินไขขาว 2. การวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนเจลาตินดวยวิธีวัดคาการดูดแสงที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตรกระทํา

ไดหรือไม จงใหเหตุผล 3. จงเปรียบเทียบวิธีวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนวิธีตาง ๆในหัวขอตอไปนี ้ ก. ความไวของวิธีวิเคราะห ข. สภาพธรรมชาติของโปรตีนหลังการวิเคราะห ค. ขอจํากัดของการวิเคราะห ง. ความสะดวกของการวิเคราะห

ฉบับปรับปรุง 2556 15 กค. 56