Enzimologa de la Replicacin

Aspectos generales de la replicacin1. La replicacin es semiconservativa. 2. Es ordenada y secuencial 3. Utiliza desoxirribonucleosidos-5-trifosfatos (dNTPs). 4. Catalizado por la DNA Polimerasa. 5. Es discontinua. 6. Es un proceso exacto. 7. Es bidireccional.

Modelo de replicacin semiconservativa del ADN

Requerimientos en la replicacin 1. Un molde de ADN de cadena simple 2. Un cebador o primer. 3. dNTPs y Mg 4. Enzimas de la replicacin

Enzimas involucradas en la replicacin del ADN

Enzimas involucradas en la replicacin (procariotas)Topoisomerasa Inicia el desenrrollamiento del ADN introduciendo cortes en el ADN. (E.coli - DNA girasa). Desenrrolla la doble hebra Sintetiza el primer de ARN y lo une a la hebra de ssDNA. Estabiliza las regiones de ssDNA.

Helicasa Primasa SSB DNA POL III DNA POL I DNA Ligasa

Sintetiza DNA (holoenzima- 10 protenas) Remueve primers y rellena espacios. Une los extremos de DNA

DNA Polimerasa I (POL I) de E. coli Primera enzima aislada que sintetiza la polimerizacin de nucletidos. Una sola cadena polipeptdica Mr: 103 KD; 1000 aa; 300-400 unidades/clula Presenta varias actividades: Polimerasa (5' 3'); ~ 10 nucletidos/sg 3' 5' exonucleasa, prueba de error 5' 3' exonucleasa, remueve primers

Fragmentos del ADN PolI: Klenow

ADNPol I 109 KDa

Proteasa Tripsina Subtilisina

Fragmento de 76 KDa: fragmento Klenow Actividad Polimerasa 5 3 /Exonucleasa 3 5

Fragmento de 33 Actividad Exonucleasa 5

Kda 3

Importancia del fragmento de Klenow

Sntesis ADN eucaritico. Marcaje de ADN (Random primer meted) Marcaje con Random primer Desnaturalice ADN p Mezcle con Oligonucleotido (Random Primer + ssADN) Aada Klenow frag + E 32P dNTPs

Random

DNA Polimerasa III de E. coli Complejo multiprotenico, muchas subunidades (E, F, , , , M, K, H). Sintetiza ADN adicionando nucletidos al extremo 3 de la hebra en crecimiento. Presenta dos actividades: Polimerasa 5' a 3'; ~ 700 nucletidos/sg, adiciona nucletidos en direccin 5 a 3. Exonucleasa 3' a 5, remueve nucletidos en la direccin 3 a 5.

DNA Polimerasa III Nucleo EnzimaticoDefinicion: consiste solo de aquellas subunidades que son requeridas para la actividad enzimtica bsica Consiste de tres subunidades: Alfa ( ) Actividad 5 3 polimerasa epsilon ( ) actividad 3 5 exonucleasa (prueba de lectura) Theta ( )

DNA Polimerasa III Holo EnzimaDefinicion: Tiene todas las subunidades requeridas para la actividad enzimtica completa y su regulacin. Consiste de: El nucleo enzimatico- , , La proteina deslizante El complejo - , , , Un switch de la procesividad -

DNA Polimerasa III

Es capaz de sintetizar las dos hebras en forma simultanea.

Cmo es esa sntesis simultanea?

Actividad de las ADN polimerasas

A pesar de sus diferencias: Todas necesitan un molde de ADN. Sintetizan en direccin 5 a 3. Utilizan dNTPs Requieren un primer para iniciar la sntesis. Catalizan la formacin de enlaces fosfodiester.

Polimerasas eucariticas

Replicacin Recombinacin Reparacin

Polimerasas eucariticas Polimerasa Actividad primasa Primer de ARN seguido de unos pocos nucletidos de ADN Polimerasa Completa la replicacin en la hebra lder y retrazada. Polimerasa No participa en la replicacin Asociada con reparacin y recombinacin.

Polimerasas eucariticas Polimerasa Replica ADN mitocondrial Una polimerasa similar tambin replica ADN cloroplstico. Similar en estructura y funcin a la polimerasa Polimerasa Parece tomar parte de la replicacin nuclear Replicacin de hebra lder y retrazada. El papel preciso no es an claro.

Polimerasas eucariticas

Polimerasas ( , , , , , ) Replicacin de ADN daado Reparacin del ADN La mayora de las ADN polimerasas tienen mltiples papeles en la replicacin y reparacin del ADN

ADN Polimerasa 4 subunidades. 167 kDa con actividad polimerasa Baja posesividad. No tiene prueba de lectura. Inicia la sntesis del primer (primasa)

- Primer de ARN + ADN Sintesis en la hebra retrazada principalmente

ADN Polimerasa1. involucrada en la reparacin del ADN. 2. Es mas mas pequea ~ 40 Kda 3. No es muy activa, no presenta actividad exonucleasa. 4. Protenas asociadas la activan. 5. Se presenta mayor cantidad de polimeros en clulas tratadas con agentes que daan el ADN. Ejemplo: virus.

ADN Polimerasa1. 2. 3. Polimerasa de Levaduras, enzima del ncleo. Es una protena de 125 KDa. Depende para aumentar su actividad de una protena de 36 KDa la PCNA (antgeno celular de proliferacin nuclear), aumentando su actividad unas 50 veces. Replica ssADN del fago en presencia de un primer. Presenta actividad exonucleasa 3 a 5. Esencial para replicacin, sntesis de ambas hebras. Protenas accesorias potencian su actividad (PCNA)

4. 5. 6. 7.

Polimerasa1. Polimerasa 2 de las levaduras. 2. Tiene un tamao de 255 KDa, muy activa (no necesita PCNA). 3. Juega un papal muy importante en la Replicacin y reparacin del ADN.

El replisoma eucaritico Polimerasa primer. Polimerasa ADN. para la sntesis del

para la sntesis de

El factor C de replicacion desplasa pol y atrae PCNA (Proteina deslizante). PCNA (proteina deslizante) para la procesividad. Rnasa H para remover el primer de ARN

El replisoma eucaritico

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin en procariotes Comienza en un origen de replicacin, en bacterias OriC. Protenas iniciadoras se unen a OriC. Provocan un desenrollamiento de un pequeo segmento de ADN. Se da la unin de las helicasas y las protenas de unin a cadena sencilla (SSB).

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin: Origen de replicacin

El lugar de inicio de la sntesis es bastante inestable helicoidalmente

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin DnaA-ATP se une a uno de los sitios de DnaA de alta afinidad Cooperativamente la unon de DnaA-ATP ocurre el posicionamiento de DnaA a travs de la regin de desenrrollamiento El ADNss es estabilizado por la DnaA-ATP El ATP es lentamente hidrolizadopor la DnaA. La recarga de la DnaA con ATP es importante en el control de la tasa de replicacin en E. coli.

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacinDnaB helicasa es un hexmero DnaC es requerida para abrir el hexamero para que este pueda unirse al ADN pero la DnaC tambin bloquea la actividad de la helicasa DnaC tambin une ATP Una vez el ATP es hidrolizado, DnaC se disocia y la funcin de la DnaB helicasa es desenmascarada

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin 30 moleculas de DnaA forman un complejo. Facilitado por la proeina HU y por IHF (Factor de integracion del huesped) dos proteinas que ayudan a la estructura del ADN en bacterias El complejo DnaA progresivamente separa las repeticiones de 13 pb para formar un complejo abierto de 45 pb. El ATP es requerido para est proceso Un complejo formado por la DnaB y la DnaC se une a la region separada para formar un complejo de preiniciacion. La DnaC es liberada. Posterioremente en la presencia de SSB (Single strand binding protein) y la ADN girasa, la DnaB continua con desenrrollamiento

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin

La helicasa (DnaB) recluta DnaG primasa que sintetiza un primer o cebador DNA pol III interactua con la unin DNA molde-Primer

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacinLa protena deslizante se ensambla sobre el primer La polimerasa de la hebra lder es engarzada El primer de la hebra retrasada es sintetizado La protena deslizante es ensamblada sobre el primers de las hebra retrasada La polimerasa es engarzada en la hebra retrasada Se forman as dos horquillas de replicacin

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin

Mecanismos de la replicacin de ADNIniciacin de la replicacin

Replicacin en eucariotes

Menos entendida que en procariotas Algunas diferencias Mltiples orgenes de replicacin, secuencias de replicacin autnoma (ARSs), 100 200 pb. Mas tipos de ADN polimerasas Los nucleosomas se despus de la replicacin

ensamblan

inmediatamente

Iniciacin de la replicacin en eucariotes

Iniciacin de la replicacin en eucariotesLa molcula de ADN es sintetizada una vez y solo una vez a lo largo del ciclo celular

Iniciacin de la replicacin en eucariotes

Seleccin del replicador (Fase G1) Formacin del complejo Pre-RC Complejo de reconocimiento del origen (ORC) Protenas de unin a helicasa (Cdc6 y Cdt1) Helicasa

Iniciacin de la replicacin en eucariotes Activacin del origen (Fase S) Activacin de las protein kinasas (Ddk, Cdk) Fosforilacin de las protenas de unin a helicasas (Cdc6 y Cdt1) Reclutamiento ordenado de pol y pol seguida por pol (Primasa)

Iniciacin de la replicacin en eucariotes

Activacin del origen (Fase S) Reclutamiento pol (Primasa) Reclutamiento protena deslizante y complejo engarzante de proteina deslizante Inicio de la sintesis

Control de la Iniciacin

Iniciacin de la replicacin en eucariotes

Terminacin de la replicacin

La terminacin de la replicacin en E. coli se da en una regin de 350 Kb flanqueada por 10 sitios terminadores idnticos de 23 pb Los sitios ter son reconocidos por la protena Tus (Terminator Utilization Sustance) Tus Le permite al replisoma pasar en una direccion pero no en la otra Tus es una contrahelicasa, directamente la accion de DnaB. bloquea

Terminacin de la replicacinProblemasSi el genoma es circular: Los cromosomas terminan enredados. Si el genoma es lineal: Los cromosomas gradualmente se acortan.

Terminacin de la replicacinProblemas

El problema del genoma circular es resuelto por las topoisomerasas

Problemas del genoma lineal

El problema de los genomas linealesSi el genoma es lineal entonces se acortara progresivamente en cada ronda de replicacin.

La ADN polimerasa requiere un primer de ARN. El primer de ARN debe ser removido El primer del extremo no puede sr reemplazado porque la ADN polimerasa solo trabaja en 5 3

Problemas del genoma lineal

Cromosoma mas corto

Solucin a los problema de los genomas lineales Circularizacin del genoma Bacteriofago Bacteriofago M13 Uso de concatameros lineales Bacteriofago T7 Uso de una Protena Adenovirus Uso de ARN para extender los extremos de los cromosomas Eucariotes

Circularizacin del genoma lineal: Fago

Circularizacin del genoma lineal: Fago M13

Concatmeros lineales: Fago T7

El ADNss en el extremo izquierdo puede alinear con el ADNss en el extremo derecho Los espacios faltantes son llenados por la ADN polimerasa (gp5) y ligados por la ADN ligasa T7 (gp1.3) El concatamero es cortado en generando dos mleculas con los extremos 5 completos.

Uso de una protena: AdenovirusUso de una protena iniciadora

Problema de la finalizacin la replicacin en eucariotes Si el ADN se acortara Eliminacin eventual del telmero Desestabilizacin del cromosoma Muerte celular. Los extremos de los telmeros pueden ser extendidos por una enzima especial la TELOMERASA. Telomerasa = Componente protenico + un componente ARN (Ribonucleoprotena)

Telomerasa

La telomerasa contiene una parte protenica y una de ARN Parte de ARN El ARN contiene una secuencia que es complementaria las repeticiones de los telomeros Los ARN de las telomerasas varian en longitud -Tetrahymena 146nt -Candida albicans 1544 nt Ellos adoptan una estructura 2ria (y 3ria) caracterstica

La Telomerasa es una transcriptasa inversaLa telomerasa es una ADN polimerasa

La telomerasa usa un molde de ARN

Es una ADN polimerasa dirigida por RNA

El telmeroLos telmeros consisten de Aprox. 1000 copias de una secuencia repetida en tandem

Y una region 3 de ADNss 300 nt en mamferos

El telmeroLa unin de una protena (o un complejo) lo protege de la degradacin cuando no esta siendo replicado