resumos de enzimologia

Apontamentos de Enzimologia, Licenciatura em Bioquímica

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Aula 2 – Introduçã o ão conceito de enzimã. Breves notãs histo ricãs

Aspectos Históricos

Enzimas

Os enzimas são catalisadores – aceleram a velocidade das reações

sem que eles próprios sofram qualquer alteração permanente. Cada reacção

que tem lugar na célula é catalisada pelo seu próprio enzima, logo, numa dada

célula, existe um grande número de enzimas.

Na ausência de enzimas a maior parte das reacções do

metabolismo celular não ocorreriam, nem mesmo num período

de vários anos e a vida como nós a conhecemos, poderia nem

existir.

Pode-se por a questão:

Quantos enzimas existem numa célula?

1878 in Yeast – Kuhne

1897 Filtrados de extractos cell free – Buchner

1894 Hipótese chave-fechadura – Emil Fischer


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1926 Primeiro enzima (urease) a ser cristalizado – Summer

1920’s Desenvolvimento da ultracentrífuga – Svedberg

1960 Sequência do ribonuclease – enzima que catalisa a hidrólise do

ácido ribonucleico

1965 Estrutura tridimensional (cristalografia de Raio-X) do lisosima –

enzima de clivagem

50’s-60’s Flexibilidade estrutural

1958 “induced-fit” (Teoria do encaixe induzido) – Koshland

1961 Modelo alostéreo (actividade modulada por modificações

fisiológicas) – Monod

1968 (Kempner e Miller) – O meio celular é heterogéneo com elevado

conteúdo em proteínas (100-300mg/ml em eucariotas), abundância de

superfícies membranares e citoesqueleto

1969 síntese química do ribonuclease – Merrifield

1973/74 Kacser e Burns/Heinrich e Rapoport – O estado estacionário

de fluxos metabólicos e de concentrações de metabolitos na célula são

propriedades do sistema


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Aula 3 – Outrãs mole culãs com ãctividãde cãtãlí ticã. Propriedãdes

dos enzimãs.

Moléculas com actividade catalítica

Ribozimas

Molécula de RNA com capacidade autocatalítica. Tal como os enzimas

proteicos, possuem um centro activo que se une especificamente a um

substrato e que facilita a sua conversão num produto. Os ribozimas são menos

versáteis que os enzimas proteicos.

Exemplos:

Ribozimas “cabeças de martelo”

Anticorpos Catalíticos

Anticorpos que podem catalisar uma ampla variedade de reacções

químicas. São caracterizados pela elevada especificidade para os substratos,

compartilhando muitos aspectos mecanísticos com os os enzimas.

Exploram a capacidade de ligação (reconhecimento molecular)

– modulação do substrato (tipo de relação antigénio-anticorpo)

Construção de um análogo do estado de

transição

São bons em reacções simples mas são

limitados por: precisão e separação.

Aplicações: destoxificação por cocaína

Potencial terapêutico

Biossensores

Genómica funcional

Descoberta de genes


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“Enzimas Artificiais”

Servem para reproduzir a função do enzima, mimetizar uma reacção

química:

1. Transformação química – ligação covalente;

2. Reconhecimento molecular – Mimic binding (H, hidrófoba,

iónica)

3. Recriação do centro activo de um enzima.

A ter em conta:

Tem de ser um passo inicial de ligação

Dimensão: importante para a ligação e libertação do produto

Exemplos:

Ciclodextrinas

Criptandos – ligandos multi-dentados que ligam catiões

Anticorpos catalíticos

Propriedades dos Enzimas

Elevado poder catalítico

Grande aumento da velocidade da reacção.

Velocidades na ordem de 1017 em relação à reacção não catalisada.

Especificidade

A maioria dos enzimas são bastante específicos tanto para a natureza

do substrato que utilizam, tanto para a reacção que catalisam.

As reacções catalisadas enzimaticamente raramente dão origem

a produtos alternativos.

A especificidade varia de enzima para enzima. Uma especificidade

mais baixa, por exemplo, é comumente observada em enzimas de degração.


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Existem vários tipos de especificidade:

Especificidade de ligação – baixa (peptidases, fosfatases)

Especificidade de molécula – intermédia (hexocinase)

Especificidade de grupo – absoluta (urease)

Regulação

A actividade catalítica de muitos enzimas pode variar em resposta às

concentrações de outras substâncias que não os seus substratos. Estes

processos regulatórios incluem o controle alostéreo, modificação covalente e

variação da quantidade de enzima utilizado.

Aula 4 – Nomenclãturã e clãssificãçã o de enzimãs. Exemplos.

Nomenclatura

Em geral, adiciona-se o sufixo –ase ao substrato sobre o qual actua (ex:

urease – catalisa a decomposição da ureia), ou ao nome da reacção que o

enzima catalisa (ex: álcool desidrogenase – catalisa a desidrogenação do

álcool).

No entanto existem excepções. Por exemplo pepsina e tripsina –

enzimas digestivos.

Classificação

Os nomes dos enzimas são dados seguindo certas regras bem

definidas.

Os seis tipos principais de reacções catalisadas por enzimas são:

EC 1 – Reacções de oxidação-redução, catalisadas por

oxidoreductases;

EC 2 – Reacções de transferência de grupo, catalisadas por

transferases;

EC 3 – Reacções hidrolíticas, catalisadas por hidrolases;


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EC 4 – Reacções de eliminação nas quais é formada uma dupla

ligação, catalisadas por liases;

EC 5 – Reacções de isomerização, catalisadas por isomerases;

EC 6 – Reacções nas quais duas moléculas se juntam à custa de

energia (normalmente ATP), catalisadas por ligases.

O nome sistemático completo de um enzima não só mostra o tipo de

reacção catalisada, mas descreve se o substrato(s) “adicionou” qualquer outra

informação importante.

Exemplos:

EC 2.3.1.17 (Aspartato N-acetiltransferase)

2 – transferase

2.3. – acetiltransferase

2.3.1. transferência de grupo sem ser aminoacetil

2.3.1.17 – 17º enzima com estas características

EC 1.1.1.1 (Álcool desidrogenase)

1 – Oxidoreductase

1.1 – dador (álcool)

1.1.1 – aceitador (NAD+)

Nome sistemático: Álcool: NAD+ oxidoreductases (dador:aceitador)

Nome trivial (a usar): Álcool desidrogenase

ATP + Glu 6-P-Glucose

Classificação dos enzimas é do tipo EC a.b.c.d. onde:

a) O primeiro número indica o tipo de reacção catalisada e

pode tomar valores entre 1 e 6, de acordo com a classificação feita

anteriormente.

b) O segundo número indica a subclasse, que normalmente

especifica o tipo de substrato ou, mais precisamente, a ligação clivada.

Enzima

ATP: Glucose 6-fosfato transferase


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c) O terceiro número indica a sub-subclasse, permitindo uma

definição ainda mais precisa da reacção catalisada em termos do tipo de

aceitador de electrões (no caso dos oxidoreductases, por exemplo) ou do tipo

de grupo removido (nas liases, por exemplo).

d) O quarto número indica o “serial number” do enzima na

sua sub-subclasse.

Sistemas multienzimáticos

“Multienzimas” são proteínas que exibem mais do que uma actividade

catalítica. Para efeitos de nomenclatura, a recomendação é que, quando está a

ser atribuída mais do que uma única actividade catalítica, deve-se referir a um

sistema multienzimático.

Assim, enzimas multifuncionais terão mais de um número de EC e

posição no esquema de classificação.

Aulas 5 a 8 – Estruturã dos enzimãs.

Estrutura dos enzimas

O principal objectivo de uma investigação é estabelecer a estrutura

tridimensional completa de um enzima a nível atómico (ou quase atómico).

Esta informação fornece as bases necessárias não só para perceber as

propriedades detalhadas do enzima, especialmente a sua actividade catalítica,

mas também para várias aplicações: testar modelos de estruturas

macromoleculares, para propor um mecanismo de catálise, para explorar


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semelhanças entre enzimas, para o desenho racional de drogas e para a

exploração do enzima para fins industriais.

Supondo que está disponível uma fonte de enzima, as principais

etapas de trabalho são:

1. Determinação da massa molecular relativa, Mr;

2. Determinação da estrutura primária e composição em

aminoácidos;

3. Determinação das estruturas secundária e terciária;

4. Determinação da estrutura quaternária.

O termo estrutura primária refere-se à sequência de aminoácidos numa

cadeia polipeptídica. Este tipo de estrutura contém apenas informação

unidimensional e diz-nos pouca coisa acerca da estrutura tridimensional.

Os termos estrutura secundária e terciária referem-se a diferentes

aspectos da estrutura tridimensional: a estrutura secundária refere-se a

elementos regulares da estrutura, tais como a hélice-α e a folha-β, nas quais

estão envolvidas interacções entre regiões próximas. A estrutura terciária

refere-se ao folding de uma cadeia, no qual porções da molécula bem

separadas na sequência são trazidas para mais próximo uma da outra.

O termo estrutura quaternária refere-se ao arranjo de subunidades

individuais num enzima que contém mais do que uma subunidade.

Determinação de Mr

Enzimas são macromoléculas com valores de Mr que estão num

intervalo de cerca de 10 000 até alguns milhões. As determinações dos valores

de Mr dos enzimas nos dias são feitas, hoje em dia, recorrendo a uma destas

técnicas:

1. Ultracentrifugação;

2. Filtração em gel;

3. Electroforese SDS Page;

4. Espectrometria de massa.


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Destes métodos, (2) e (3) são “semi-empíricos” e possíveis

comparações são feitas com moléculas “standard” de massa molecular

conhecidas. No entanto, no método (1), Mr pode ser calculada usando

equações derivadas de princípios prévios. As técnicas recentes da

espectrometria de massa (4) podem fornecer valores de Mr extremamente

precisos.

A massa molecular relativa de um enzima é uma peça de informação

fundamental uma vez que nos permite converter a concentração de uma

solução de unidades de massa por volume (mg.cm-3 por exemplo) para

unidades de molaridade. Esta informação pode então ser utilizada de várias

maneiras, tais como: considerações de composição (quantos aminoácidos de

um dado tipo estão presentes por molécula de enzima?), actividade catalítica

(quantas moléculas de substrato são formadas por uma molécula de enzima

por segundo?), e ligação do ligando (quantas moléculas de ligando estão

ligadas por molécula de enzima?).

Medições de Mr feitas na ausência e presença de agentes

desnaturantes irão mostrar se o enzima é ou não composto por subunidades e

pode indicar o número de subunidades. Por exemplo, o lactato desidrogenase

da levedura tem uma Mr de 140 000 numa filtração em gel, mas numa

electroforese em SDS-Page a Mr é perto de 35 000, indicando que este enzima

é um tetrâmero (4 subunidades).

Determinação da estrutura primária

A estrutura primária é caracterizada pelo número de aminoácidos

componentes da sua cadeia e a ordem em que eles se encontram. A estrutura

primária é responsável pelas estruturas de ordem superior que a proteína exibe

na sua forma celular ou nativa.

Duas estratégias distintas são empregues para determinar a estrutura

primária de uma proteína ou enzima. O método “directo” opera a nível da

proteína. O método “indirecto” opera ao nível do gene (DNA) e usa o código

genético para traduzir a sequência do ácido nucleico no seu produto

correspondente.


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Determinação da estrutura secundária e terciária

O conhecimento da estrutura primária de um enzima não nos permite

explicar propriedades como poder catalítica e especificidade. Temos também

de considerar como é que a cadeia polipeptídica se “dobra”. A cristalografia de

raio-X tem sido, de longe, a técnica mais utilizada para a determinação da

estrutura tridimensional dos enzimas. No entanto, a técnica de ressonância

magnética nuclear de alta resolução (RMN) tem sido desenvolvida ao longo

dos anos e é agora capaz de fornecer informações acerca da dinâmica das

proteínas, especialmente aquelas com Mr superior a 25 000.

A estrutura secundária é caracterizada por estruturas específicas:

Hélice-α

Consiste num hélice direita formada e estabilizada por

ligações de hidrogénio.

Método “directo” Método “indirecto”

Hélice-α


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Folha-β

Estrutura também mantida por ligações de hidrogénio entre as

unidades peptídicas. Neste caso, as ligações

são estabelecidas entre cadeias

polipeptídicas diferentes, distendidas e

paralelas, ou entre segmentos distantes e

distendidos de uma mesma cadeia.

A estrutura terciária descreve a

conformação tridimensional que a molécula assume

em solução, explicando o dobramento da cadeia

peptídica com os enrolamentos, dobras e voltas que

a compõem e que a levam a uma forma geral

globular.

As interacções responsáveis pela estrutura tridimensional dos enzimas

são todas as forças fracas: ligações de hidrogénio, forças electrostáticas,

forças de Van der Waals e ligações hidrófobas.

Determinação da estrutura quaternária

A estrutura quaternária diz respeito à

organização presente nas proteínas e descreve quantos

e quais monómeros compõem a molécula e como estão

associados.

A maior parte dos enzimas consistem num

número de subunidades mantidas juntas por forças

não covalentes – são oligómeros.

Podem-se fazer várias questões acerca dos enzimas oligoméricos:

1. Quantas subunidades existem? E de que tipo?

2. Como estão as subunidades organizadas?

3. Que forças estão envolvidas?

4. Qual o significado, para o enzima, de ter múltiplas subunidades?

Folha-β

Estrutura terciária

Estrutura quaternária


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1. Quantas subunidades existem? E de que tipo?

a. Estudos de Massa Molecular

Uma indicação de que um enzima consiste em múltiplas

subunidades é fornecido por resultados de massa molecular realizados na

ausência e presença de agentes desnaturantes (exemplo: cloreto de

guanidina). O álcool desidrogenase de levedura, por exemplo, por

ultracentrifugação apresenta um Mr de 145 000. No entanto, sob condições

desnaturantes, é obtido um valor de Mr de 36 000, sugerindo que este enzima

consiste em 4 subunidades (145/36 ~ 4) provavelmente idênticas.

b. Estudos de Cross-Linking

Outro dos métodos é utilizar um agente de cross-linking,

como o dimetilsuberimidato. Este composto reage com os pares de cadeias

laterais de Lisina, que praticamente se encontram à superfície do enzima, para

criar ligações cruzadas que são estáveis na presença de agentes

desnaturantes.

Digamos que

fazemos reagir um enzima com 4

subunidades com um agente de

cross-linking: será formada uma

mistura de espécies que podem

ser separadas por electroforese

em gel de poliacrilamida, dando um


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total de 4 bandas. O número de bandas corresponde ao número de

subunidades.

c. Estudos de ligação de ligandos

O número de sítios de ligação num enzima para um

substrato ou outro ligando pode ser utilizado para indicar o número de

subunidades. Por exemplo, o álcool desidrogenase de levedura liga 4 mol

de NADH, enquanto o de fígado liga 2 mol de NADH, o que indica que o

primeiro é um tetrâmero (4 subunidades) e o segundo um dímero (2

subunidades).

d. Estudos de Simetria

O tipo de simetria de um dado enzima, deduzida por

cristalografia de raio-X pode, por vezes, ser usada para determinar o número

de subunidades num enzima, ou pelo menos, usada para excluir várias

estruturas de subunidade propostas.

2. Como estão as subunidades organizadas?

A disposição das subunidades num enzima oligomérico podem

ser usualmente deduzidas pelo tipo de simetria que as moléculas possuem

(através da cristalografia de raio-X). No geral, o arranjo das subunidades é tal

que permite o máximo de contacto entre subunidades. Assim, para um enzima

tetramérico, como o lactato desidrogenase, o arranjo geométrico preferencial é

o tetraédrico. Para um enzima hexamérico, o arranjo preferido será o

octaédrico.

3. Que forças estão envolvidas?

As forças envolvidas na associação de subunidades são as

fracas (não-covalentes) – ligações de hidrogénio, forças electroestáticas,

forças de van der Waals e forças hidrófobas. As superfícies envolvidas na

associação de subunidades são, na sua grande maioria (+ de 67%) não-

polares.


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"Economia genética" Porque são os enzimas

tão grandes?

Necessidade de múltiplas interações fracas para

dirigir a catálise

O enzima tem de ter área superficial suficiente para se ligar a múltiplos locais

na célula e para se integrar nas suas funões

metabólicas

4. Qual o significado, para o enzima, de ter múltiplas

subunidades?

Há, pelo menos, 4 possíveis razões que explicam que é vantajoso

para um organismo possuir enzimas com múltiplas subunidades:

a) A presença de múltiplas subunidades confere

possibilidades adicionais ao enzima de regulação da actividade catalítica;

b) A combinação de diferentes tipos de subunidades num

largo complexo permite uma variação nas propriedades catalíticas;

c) Aumento da estabilidade;

d) Associações geram grandes estruturas com determinada

simetria que podem dar origem a funções biológicas específicas com

“economia genética” (menos probabilidade de erro).

Flexibilidade estrutural (Enzima em solução)

Fenómeno crucial para função (alosteria e cooperatividade). Esta

mudança conformacional pode ser monitorizada por RMN e outras técnicas,

tais como: CD, Raios-X e fluorescência.


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As rotações ocorrem em torno de ligações simples, levando a

alterações conformacionais que se tornam no “passo limitante”.

Características Estruturais dos Enzimas

Estruturas globulares “empacotadas”;

Poucas cavidades preenchidas com H2O;

Alguns Asp no interior e Leu no exterior;

Múltilplos domínios;

Mr = 30 000 – enzima com uma cadeia polipeptídica ou subunidade

Mr > 50 000 – enzimas com várias cadeias polipeptídicas ou

subunidades

Classificação de Estruturas

Entre os vários sistemas de classificação para os elementos estruturais

em proteínas inteiras ou em domínios individuais, o mais utilizado tem sido o

sistema de quatro classes introduzido por Levitt e Chothia.

As quatro classes de estrutura da proteína são os seguintes:

1. Enzimas α – só têm estrutura em hélice-α (Exemplos: região

variável das imunoglobulinas);

2. Enzimas β – têm, maioritariamente, estrutura em folha-β

(Exemplos: região fixa e variável das imunoglobulinas);


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3. Enzimas α/β – têm segmentos mistos ou alternados de hélice-α

e folha-β (Exemplos: cinases e desidrogenases);

4. Enzimas α+β – têm estruturas em hélice-α e folha-β que estão

separadas ao longo da cadeia polipeptídica (Exemplos:

termolisina, lisozima e ribonuclease).

Famílias de folds Existem 9 superfolds (30% das proteínas)

Dependendo da função, os cinases têm um arranjo de folds

característicos.

Folding e Unfolding

Unfolding de Enzimas

A forma enrolada compacta de um enzima é geralmente

termodinamicamente mais estável que um enzima modificado (diferença de 20-

60 kJmol-1).


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Assim, a maioria dos enzimas podem ser facilmente desenrolados

(“unfolded”) e dissociados (no caso de enzimas com múltiplas subunidades)

por uma variedade de condições: valores de pH extremos, calor, adição de

solventes orgânicos, agentes caotrópicos e altas concentrações de ureia

e cloreto de guanidina.

A perda da estrutura tridimensional de um enzima enrolado é

conhecida como desnaturação. A desnaturação de um enzima pode ser

seguida pela perda de actividade, ou alteração de parâmetros-CD e

fluorimetria.

Folding de Enzimas

Em 1960, Anfinsen realizou uma experiência importante que mostrou

que um enzima desnaturado podia ganhar de volta a sua estrutura “folded”

quando o agentes desnaturante era removido – experiência com β-

mercaptoetanol (para quebrar ligações persulfureto) e ureia (enzima reduzido).

Esta experiência levou à conclusão de que a estrutura primária de um

enzima contém toda a informação necessária para o “levar” à estrutura

tridimensional.

Dogma de Anfinsen – nas condições ambiente (temperatura,

concentração de solvente…) às quais ocorre o folding, a estrutura nativa é

estável e cineticamente acessível com um mínimo de energia livre.

O folding de enzimas explica a especificidade de ligandos.

Deficiência de folding leva ao estudo da 2ª metade do código

genético


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Mr = 50 000 massa elevada interações adicionais

estarão ligadas à

regulação

Canalisação ("channeling") de substratos

Cofactores

Orgânicos

derivados de vitaminas

flavina

heme

Inorgânicos Iões metálicos Mg2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+

Enzimas em Sequência (e Regulação)

Aula 9 – Cofãctores. Mecãnismos de Cãtã lise Enzimã ticã.

Cofactores

Muitos enzimas requerem um componente não-proteico para

apresentarem actividade – esse componente denomina-se cofactor.

Channeling – processo de transferência

directa de um intermediário metabólico entre os

centros activos dos enzimas que catalisam duas

reacções sequenciais numa via biossintética: o

produto de uma reacção serve de substrato para a

reacção seguinte.


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Cofactores

Orgânicos

Grupos prostéticos

Coenzimas

Um enzima contendo um cofactor ou grupo prostético é denominado

holoenzima. Quando o cofactor é removido, passa a denominar-se

apoenzima.

Metalo-enzima – enzima que inclui na sua estrutura proteica, iões

metálicos. Neste caso o metal, com funções catalíticas e/ou estruturais, está

geralmente no centro catalítico.

Mecanismos de Catálise Enzimática

O que é?

É uma sequência de complexos com enzima durante a conversão de

substratos a produtos.

Grupo prostético – componente de origem

não proteica essencial para a actividade do enzima.

É parte integrante do enzima (não saem: ligam-se

permanentemente).

Coenzimas – complexos orgânicos ou

metalo-orgânicos que participam realmente na

catálise. Podem ser dadores ou aceitadores de

protões ou agentes nucleófilos que participam em

reacções de transferência de grupo. Ligam-se fraca

e não permanentemente aos enzimas.


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Estratégias de Catálise

Efeito de proximidade

Permite interações entre os substratos e

grupos funcionais para a reacção

Há um aumento de velocidade

cerca de 5 vezes

Efeito de orientação

Permite sobreposição de

orbitais electrónicas

Há um aumento de velocidade cerca de 100

vezes

Uma cinética de conversão entre esses produtos.

Tem de se ter em conta a estrutura de cada um dos complexos.

Catálise:

Ácido-base: resíduos de aminoácidos intervenientes dependem

do pKa da cadeia lateral. Este pKa no microambiente do centro activo pode ser

diferente do aminoácido isolado.

Covalente: há um complexo intermediário com ligação covalente

entre o enzima e o substrato. As cadeias laterais funcionam como nucleófilos.

Por estabilização do Estado de Transição: interacções

electroestáticas, ligações de hidrogénio e organização geométrica do centro

activo podem favorecer associação com estado de transição (mais forte do que

com substratos). Exemplo: anticorpos catalíticos.


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Aula 10 e 11 – Purificãçã o de Enzimãs. Exemplo

Porquê purificar enzimas?

A compreensão detalhada do comportamento de um enzima num

sistema complexo (num organelo subcelular ou na célula) passa pelo estudo

das suas propriedades num sistema mais simples.

A purificação de enzimas pode ter desvantagens em alguns enzimas,

como por exemplo os que se encontram ligados à membrana e que na

ausência de fosfolípidos ou detergente ficam inativos.

Os estudos com enzimas purificados permitem estudar:

A especificidade para o substrato;

Os parâmetros cinéticos da reação;

Modos de regulação da atividade enzimática;

E determinar a estrutura;

O mecanismo de catálise;

Aplicações em medicina, indústria e investigação (por ex.

desenho de drogas).

Objectivos da purificação de Enzimas

Máximo rendimento (baseado na percentagem de atividade do enzima

purificado comparada com a atividade total do extrato inicial)

Máximo de atividade catalítica (o enzima não deverá estar inativo ou

degradado)

Máximo de pureza (não deve conter outros enzimas ou

macromoléculas)

Antigamente pensava-se que a cristalização era uma prova da pureza do enzima. Hoje sabe-se que alguns enzimas, mesmo na forma cristalina, não se encontram puros. Na maior parte dos processos de purificação, a cristalização não é incluída, a não ser que se pretenda determinar a estrutura tridimensional do enzima.


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Estratégia

O procedimento a ser adotado para um dado enzima envolve escolhas como:

i) A fonte do enzima

ii) Métodos de homogeneização

iii) Métodos de separação

O progresso de purificação deve ser registado numa tabela.

i) Fonte do enzima

(Tecidos animais; Plantas; Microrganismos – bactérias, leveduras; Células em

cultura; Frações subcelulares – mitocôndrios, membranas, entre outros)

a. Abundância do enzima

A fonte deve possuir o enzima em grandes quantidades. Se não for

possível obter grandes quantidades pode-se manipular as condições de uma

dada cultura de forma que a produção do enzima seja aumentada. Apesar de

em alguns casos ser necessário utilizar a espécie WT, também se pode utilizar

tecnologias de DNA recombinante e produzir o enzima pretendido,

independentemente da fonte.

A produção de enzimas de células eucariotas em células procariotas

pode apresentar problemas, uma vez que as células procariotas não têm a


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maquinaria necessária para que ocorra transformações pos-traducionais.

Assim, o ideal será produzir o enzima numa célula eucariota mais simples,

como as leveduras, que apresentam crescimento rápido e não precisam de

muitos nutrientes.

b. Disponibilidade

Uma fonte com abundancia razoável de enzima pode não existir e

portanto, nestes casos é necessário haver um compromisso entre a

disponibilidade e a abundância do enzima.

c. Estudos comparativos

Pode-se estudar o enzima numa espécie diferente da pretendida. Para

tal é necessário o conhecimento das propriedades dos isoenzimas.

d. Localização subcelular

Se a reação catalisada por um dado enzima apenas ocorrer numa dada

localização da célula é necessário haver, na purificação desse enzima, um

passo de homogeneização ou de extração. Quando o enzima existe em mais

do que um lugar na célula é necessário proceder a um fracionamento celular. O

fracionamento celular é normalmente conseguido através de centrifugações

sucessivas (velocidade de rotação cada vez maiores), em que os organitos

maiores (núcleo, mitocôndrio,…) sedimentam primeiro

ii) Métodos de homogeneização

Existem diversos métodos para homogeneizar células e libertar o

seu conteúdo;

Dependem do tipo de tecido ou organismo utilizado como fonte de

enzima;

A utilização de uma solução tampão é de extrema importância.


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a. Tecidos de mamíferos

A falta de uma parede celular rígida permite uma fácil

homogeneização do tecido que é utilizado como fonte do enzima.

A extração tem de ser efetuada com uma solução isotónica

(quando é importante evitar a rotura de organelos, como os vacúolos) ou com

uma solução hipotónica.

Em alguns casos pode ser necessário adicionar inibidores de

proteases ou agentes redutores como o ditiotreitol.

b. Plantas, fungos e bactérias

As células têm uma parece celular rígida e portanto são

necessários métodos mais abrasivos como areia, congelação/ descongelação,

pressão mecânica prolongada (com ou sem esferas de vidro). Também podem

ser utilizados enzimas hidrolíticos

Nas plantas a homogeneização pode criar alguns problemas

pois, durante este processo, pode ocorrer a libertação do conteúdo dos

vacúolos (que são acídicos e contêm proteases), que poderá danificar o

enzima pretendido. A adição de um tampão apropriado e de inibidores de

proteases pode evitar tal danificação.

iii) Métodos de separação

As principais propriedades dos enzimas que podem ser exploradas

nos métodos de separação são:

Tamanho ou massa

Polaridade (carga ou hidrofobicidade)

Solubilidade (pH, força iónica)

Locais de ligação específica a outras moléculas


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Como avaliar o processo de purificação?

Análise da pureza do enzima

Avalia-se o processo de separação através de métodos de separação,

mas numa escala analítica. Exemplos: eletroforese, cromatografia (HPLC),

espectrometria de massa, cristalografia,…

Análise da atividade catalítica

o Testar a atividade do enzima nas diferentes frações;

o Testas cofatores e inibidores

o Construir uma tabela de purificação: em cada passo da

purificação, medir o volume da solução de enzima, a concentração de

proteínas e a atividade do enzima (velocidade de conversão do substrato em

produto em condições ótimas de temperatura e pH, com concentrações

saturantes de substrato e cofatores necessários). Exemplo:


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A bioinformática no planeamento da purificação de um

enzima

i) A informação na sequência de aminoácidos

a. Massa molecular do enzima

b. Carga versus pH, ponto isoelétrico (Importante na escolha do

tampão, da resina numa cromatografia de troca iónica ou numa precipitação no

ponto isoelétrico)

c. Coeficiente de absorção molar (a 280 nm, a absorvência de uma

proteína é devida à absorção dos seus resíduos de Trp, Tyr e Cys; método

utilizado na determinação da concentração de uma proteína purificada (ɛ(280nm)

= (Trp x 5500) +(Tyr x 1490) +(Cys x 125))

d. Conteúdo em cisteínas (enzima com muitas Cys adição de DTT

nos tampões previne a formação de ligações persulfureto, intra- e

intermoleculares

e. Estabilidade (é possível estimar o tempo de semivida de uma

proteína in vivo e o índice de instabilidade in vitro: se um enzima é

previsivelmente instável in vitro necessário baixas temperaturas e inibidores

na sua purificação

f. Hidrofobicidade e regiões membranares (a previsão de regiões

membranares num enzima afeta a estratégia de purificação do mesmo)

g. Semelhança na sequência sugere homologia e possível afinidade

para cofatores (a semelhança do enzima em estudo com outros já

caracterizados permite inferir a homologia com membros da mesma família e a

dependência de determinados substratos e cofatores)

h. Potenciais locais de modificações pós-traducionais (PTM) - Há

motivos conhecidos de PTM: glicosilação (NXS ou NXT); biotinilação (AMKM);

zinc finger (lig. metais) (F/YXCX2-4CX3 FX5 LX2HX3-4HX5)... Se um enzima é

glicosilado (ex. invertase) pode ser purificado por afinidade com uma coluna de

lectina

i. Solubilidade na sobre-expressão em E. coli (Alguns estudos

propõem a previsão da solubilidade de um enzima após sobre-expressão em E.


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coli; no entanto, manipulação das condições de crescimento permitem alterar

esta solubilidade)

ii) O que (ainda) não se pode prever a partir da sequência de

aminoácidos

a. Multi-subunidades; homomultímeros, heteromultímeros? Mesmo

com previsão da estrutura do enzima é impossível prever se o mesmo existe

em solução como monómero ou como um multímero (ex. hexâmero). Muitos

enzimas existem na célula como multi-complexos e a sua purificação depende

em muito da ligação aos seus interatuantes

b. Propriedades de precipitação (Ainda não é possível prever que

concentração de sulfato de amónio deve ser utilizada na precipitação de

determinada proteína)

iii) Recursos bioinformáticos. Exemplo: ProtParam, do ExPASy

(Expert Protein Analysis Software)

Como selecionar o método de purificação?

Cada enzima necessita de uma estratégia específica de purificação. O

método a utilizar depende da escala de preparação, do rendimento exigido, do

tempo disponível (e custos associados) e do equipamento e recursos

disponíveis.

Desenhar uma estratégia de purificação

i) Definir objetivos (pureza, atividade, quantidade – rendimento);

ii) desenvolver ensaios de atividade (para rápida deteção do enzima

recuperado em cada passo);

iii) Minimizar o uso de aditivos (podem requerer um passo adicional de

remoção ou interferir com a atividade);

iv) Remover (atempadamente) contaminantes que possam degradar ou

inativar os enzimas, por exemplo, proteases;


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v) Utilizar técnicas diferentes em cada passo (tirar partido das

características da proteína para a purificação (tamanho, carga,

hidrofobicidade, especificidade para ligandos...)

vi) Minimizar o nº de passos (evitar perda de rendimento)

vii) Combinar passos de maneira lógica (reduz o tempo de purificação, sem

comprometer a qualidade do produto final)

Exemplo

A purificação de enzimas é um processo dispendioso e nem todos os

enzimas podem ser purificados. É necessário, portanto, uma investigação

básica sobre a biologia celular e as vias metabólicas em que os enzimas

participam, a identificação do gene (e da sua sequência) que codifica para o

enzima.


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Aula 12 – Cine ticã Enzimã ticã. Introduçã o.

Classificação de uma Reacção

Molecularidade: define o número de moléculas que são alteradas na

reação, ou seja, o número de moléculas que reagem.

o Reação unimolecular AP

o Reação biomolecular A+ B P

o Reação trimolecular (raro) A+ B +C P

Ordem: descrição cinética da reação que define o número de termos de

concentração que devem ser multiplicados para obter a velocidade da

reação

o Reação de 1ªordem: a velocidade é apenas proporcional a uma

concentração (V α [A]);

o Reação de 2ª ordem: a velocidade é proporcional à multiplicação

de duas concentrações ou ao quadrado de uma concentração (V

α [A][B] ou V α [A]2);

o Reação de 3ª ordem: (…) V α [A][B][C].

Para uma reação que ocorre num único passo, a ordem, geralmente, é

igual à molecularidade. Numa reação que ocorre em vários passos, a ordem é

igual à molecularidade em cada passo.


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Cinética de Reações de 1ª ordem

A velocidade, , de uma reação de 1ª ordem ( → ) pode ser

expressa por:

[ ]

[ ]

[ ]

[ ]

Integrando:

∫

[ ] [ ]

∫

Obtém-se:

[ ] [ ] ou [ ]

[ ]

Como [A]0 = constante ⇨ [ ]

Representando [ ] em função de :

[ ] [ ]

o Vida média, ⁄: tempo necessário para reduzir a concentração de

reagente a 50%

[ ]

[ ]

Cinética de Reações de 2ª ordem

A velocidade, , de uma reação de 2ª ordem ( → ) pode ser

expressa por:

[ ]

[ ]

[ ]

[ ][ ]

Se [ ] [ ] esta reação é complicada.

Assim, considera-se [ ] , logo [ ] [ ] e [ ] [ ]


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A velocidade é dada, então, por:

[ ]

[ ][ ] [ ] [ ]

[ ] [ ]

Integrando:

[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ]

[ ]

[ ] em função do tempo é uma reta com coeficiente angular [ ]

[ ]

Casos especiais

o [ ] [ ] cinética de pseudo – 1ªordem

o [ ] [ ] →

[ ]

[ ]

[ ][ ] [ ]

Integrando:

[ ]

[ ]

[ ]

[ ] em função do tempo é uma reta com coeficiente

angular

Reações reversiveis

Por exemplo:

No inicio, t=0, [ ] [ ] e [ ]

Quando t=t, [ ] [ ] e [ ]

[ ] [ ] [ ]

[ ]

Integrando:

[ ]

[ ]


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No equilíbrio, a velocidade global é nula, logo [P]t é constante, ou seja:

[ ] [ ]

A constante de equilíbrio (“global”) é:

[ ] [ ]

[ ] [ ] (

)

Combinando as equações anteriores, obtém-se:

Velocidade para uma reação de 1ª ordem

Pode determinar-se :

representando

em função do tempo;

e atraves de [ ] (

)

Pré-equilibrio

Trata-se de uma cinética complexa, a menos que se admita que [A·B] é constante

durante um período suficientemente longo da reacção (aproximação de estado-estacionário)

[ ]

⇨ [ ][ ] [ ] [ ] [ ]

A velocidade de reação é dada por:

[ ] [ ][ ]

Existem duas possibilidades:

Quebra rápida de , e [ ][ ]

Obtém-se duas

equações com duas

incógnitas

Sistema possível e

determinado!


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Quebra lenta de , e [ ][ ]

[ ][ ] [ ][ ]

Influência da Temperatura na velocidade de reação

A temperatura deve ser sempre controlada em ensaios cinéticos, no

entanto a sua variação pode ser informativa.

Equação de Arrhenius

Cada reação deverá ultrapassar uma barreira de eneria: o estado de transição (TS, X‡). Quando a temperatura é elevada, o

número de moléculas que ultrapassam essa barreira é maior. Resolvendo a equação em ordem a k:

Para determinar Ea, basta medir a duas temperaturas

(

(

))

(

)

Teoria da Colisão

(

)

Onde P é o factor de probabilidade (uma vez que nem todas as

colisões são eficazes) e Z o número de colisões por segundo.


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Teoria do estado de transição

Para determinar os parâmetros de ativação:

Determinar k a diferentes temperaturas;

Através do gráfico ln(k/T) em função de 1/T obtém-se ΔH‡;

Através da expressão:


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Obtém-se ;

Sabendo e , calcula-se .

Interpretação dos parâmetros de ativação

, Energia livre de ativação de Gibbs: determina a que velocidade uma certa

reacção ocorrerá a uma dada temperatura;

Medida da quantidade de energia de ligação que é perdida no estado de transição em relação ao estado fundamental (incluindo efeitos de solvente)

Medida da diferença na (des) ordem entre o estado de transição e o estado fundamental

o Para reações monomoleculares:

o Para uma reação bimolecular (duas partículas tem de encontrar-se no estado de transição para formar uma partícula, o que exige muito maior grau de ordem)

Cinética enzimática

A cinética enzimática não prova nada em termos de mecanismos. No

entanto, não precisa de enzima puro. Estes estudos fornecem informações

sobre grupos ativos e tipos de intermediários envolvidos na reação.

Os estudos cinéticos devem ser anteriores a quaisquer outros no estudo

do mecanismo.

Mecanismos de catálise enzimática – representações

Ex. Transferência de grupos

Wong e Hanes (1962)

A espécie que entra para a reação

encontra-se por cima da seta, a espécie

que sai encontra-se por baixo da seta.


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Cleland (1963) – mais utilizada

A linha horizontal representa o enzima; as espécies que entram para a

reação apresentam uma seta no sentido do enzima, as que saem apresentam

uma seta no sentido oposto.

Ainsworth (1975)

Esta forma de representação não mostra os intermediários formados. O

numero 1 corresponde ao enzima e o numero 11 corresponde a isomerização.

O simbolo ⁼ significa que a reação é reversível.

Mecanismo Theorell-Chance (1951)

Utiliza-se este mecanismo quando o composto intermediário não é

detetado experimentalmente.

Aula 13 a 16 – Cine ticã Enzimã ticã (cont.)

Michaelis e Menten (Hipótese do Equilíbrio Rápido)


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Van Slyke e Cullen (hipótese do estado estacionário para [EA])

Briggs e Haldane (hipótese do estado estacionário para [EA])

Equação comum

[ ] [ ]

[ ]

Sendo que [ ] [ ] [ ].

Como os ensaios são realizados em concentrações saturantes de

substrato, [ ] [ ] , no inicio a concentração de produto é insignificante em

relação à concentração de substrato, portanto, inicialmente [ ] [ ] . Obtém-

se então:

[ ] [ ] [ ]

Como geralmente a concentração de enzima inicial não é conhecida,

sabendo que a velocidade limite, V, é dada por:

[ ]


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Pode obter-se a seguinte equação:

[ ]

[ ]

Pode determinar-se os parâmetros cinéticos realizando um gráfico de

velocidade inicial em função da concentração de substrato:

Grandezas e unidades

[ ] ⇨Velocidade limite (mM s-1);

⇨ Constante catalítica ou número turnover (min-1)

⇨ Constante de Michaelis – concentração de substrato para a

qual a velocidade inicial é metade da velocidade máxima (mM)

⇨ Constante de especificidade (mM-1 min-1), determina a

“preferência” do enzima para os diferentes substratos, é uma medida da

eficiência catalitica

Unidades enzimáticas

U ⇨ quantidade de enzima que catalisa a formação de 1µmol de

produto por minuto (µmol min-1)

Katal (kat) ⇨ quantidade de enzima que catalisa a formação de 1

mol de produto por segundo (mol s-1)


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Formas alternativas da equação de Michaelis Menten

Pode-se variar a equação de Michaelis Menten de forma a obter as

constantes que pretendemos calcular:

Efeito da concentração do enzima

Quanto maior a concentração de enzima mais difícil será medir a

velocidade inicial da reação

Gráficos de 2 fases cinéticas

Nestes gráficos observa-se a diminuição da concentração de substrato

e de enzima livre, o aumento da concentração de produto e da concentração

do complexo enzima substrato. Observa-se um tempo inicial que corresponde

ao estado de pré-equilíbrio, e posteriormente a este tempo observa-se o estado

estacionário.

Para se observar o estado estacionário a diferença de concentração

entre o enzima e o substrato deverá ser da ordem 102.


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Eficiência

A razão

(unidade: s-1mM-1) permite saber a eficiência do enzima em

relação a um substrato. Quanto maior a razão, maior a eficiência. Quando a

razão é da ordem 108 (que é a velocidade de difusão dos metabolitos da célula)

o enzima denomina-se “wonderful enzyme”

Significado de Km

O valor de Km depende do substrato particular e das condições do

meio, como o pH, força iónica, temperatura, entre outros. O Km indica a

afinidade do complexo EA quando for maior que .

Km é dado por:

Enquanto a constante de dissociação, Kd é dada por:

[ ][ ]

[ ]

Km é igual a Kd se for menor que . Um Km elevado indica “weak

binding”, enquanto um Km baixo indica “strong binding”


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Parâmetros cinéticos

Os parâmetros cinéticos são:

Kcat

Km

Qual o substrato mais especifico?

Um maior

indica uma reação mais rápida para baixas concentrações

de substrato

Um maior Kcat indica uma reação mais rápida quando a concentração de

substrato é elevada

Constante de especificidade,

É o melhor parâmetro para comparar substratos que competem.

Quando esta constante é muito semelhante para dois substratos

coloca-se os dois substratos a competir experimentalmente.

Método de Lineweaver-Burk

Faz-se a inversão da equação de Michaelis Menten, obtendo-se:

[ ]

Representando

em função de

[ ] obtém-se uma

reta que, através do coeficiente angular, ordenada na

origem e abcissa na origem permite calcular os

parâmetros cinéticos.


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Método de Hanes

Método a utilizar em caso de

dúvida, pois é o mais correto.

Obtém-se a equação de Hanes

multiplicando a equação de Lineweaver-

Burk (que é o inverso da equação de MM)

por [A].

[ ]

[ ]

Método de Eadie-Hofstee

Caso o gráfico obtido seja linear, o enzima segue uma cinética

Michaeliana.

Método da Regressão Não Linear

Método iterativo;

Ajuste direto à equação da hipérbole, sem transformação dos erros;

Requer estimativas iniciais;

Requer meios computacionais.

Este método, no gráfico seguinte sobrepõe-se ao do método de

Hanes.


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Método da Regressão Hiperbólica

Aplicação do critério dos mínimos quadrados à equação da hipérbole,

tal como a regressão não linear, mas deduzindo fórmulas explícitas.

Critério dos mínimos quadrados

Fornece as melhores estimativas (menor variância), se:

1. Os erros nas medidas estão distribuídos segundo uma normal;

2. Só uma variável (variável dependente) está sujeita a erro (em cinética

enzimática é a velocidade);

3. Os pesos adequados são conhecidos;

4. Os erros não estão correlacionados, ou seja, a grandeza ou sinal de um

erro não tem influência na grandeza ou sinal de outro erro.

5. Erro sistemático pode ser ignorado, ou seja, a curva de distribuição para

cada erro tem média 0.

Métodos não paramétricos

Na prática, não é possível verificar a satisfação das condições de 1 a 5:

pouco se sabe sobre a distribuição dos erros.

Os métodos da estatística não paramétrica (ou "independentes da

distribuição") só exigem a satisfação da condição 5.

A regressão não paramétrica é baseada na generalização da noção de

mediana a espaços n-dimensionais. (2D no caso da equação de

Michaelis-Menten)


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Método direto (Eisenthal e Cornish-Bowden)

Não requer nenhum modelo do erro;

É um método simples e direto pois

não requer cálculos, requer apenas o gráfico

baseado nas retas do tipo:

[ ]

Experimentalmente, não se obtém uma

única interseção devido aos erros experimentais

associados aos valores. Faz-se então uso da

mediana das interseções

As interseções fora do primeiro quadrante não são consideradas.

Vantagens

Não requer cálculos;

Não implica ideias abstratas ou difíceis como distribuição normal

do erro;

Não necessita de saber qual o número de observações que se

deve fazer para cada concentração utilizada;

Insensível a outliers.

Mecanismo reversível de Michaelis Menten

No estado estacionário, a variação de x (concentração do complexo

EA) ao longo do tempo é nula:

A velocidade global da reação é dada pela equação:

E para quando a concentração de produto é igual a 0:


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A equação pode ser particularizada para quando a concentração de

substrato é igual a 0 (tem sinal negativo porque foi definido em termos de

variação de produto ao longo do tempo):

Comparando esta equação com a do sentido direto:

Obtém-se assim uma nova equação de velocidade geral, reversível:

Relação de Haldane

Sabe-se que no equilíbrio a velocidade de reação é nula, a

concentração de substrato variou desde o tempo inicial bem como a

concentração de produto, e que a constante de equilíbrio é a razão entre a

concentração de produto e a concentração de substrato:

Assim, da equação de velocidade geral reversível obtem-se:

A relação de Haldane é uma relação entre as constantes de

especificidade e constantes de equilíbrio:


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“One way enzymes”

Se o centro ativo do enzima for feito para complementar estritamente o

estado de transição, isto otimizará o enzima como catalisador para ambas as

direções. Contudo, se só uma direcção tiver significado fisiológico, a eficiência

nessa direção pode ser aumentada à custa da outra, desenvolvendo um centro

catalítico que reconheça melhor um reagente em detrimento do estado de

transição.

Aula 17 – Inibiçã o dã ãtividãde enzimã ticã (inibidores reversí veis e irreversí veis)

O melhor inibidor é o que tem como alvo o estado de transição do

enzima, ou seja, o complexo enzima-substrato.

Inibidores reversíveis: substancias que formam complexos dinâmicos

com o enzima

Inibição completa ou inibição linear: os parâmetros variam

linearmente com o inibidor.

Inibição hiperbólica ou inibição parcial: o complexo enzima-

substrato tem sempre atividade residual e os parâmetros cinéticos variam de

forma não linear com o inibidor

Classificação da inibição reversível

Competitiva (ou específica)

A velocidade limite mantém-se constante, o Km aumenta

(diminui a afinidade ao substrato) e a razão ⁄ diminui.

O enzima liga-se ao substrato (formando EA) ou ao inibidor

(EI) mas não a ambos (EAI)

O inibidor é estruturalmente semelhante ao substrato. A inibição

pode desaparecer aumentando a concentração de substrato.

Neste tipo de inibição o complexo enzima-substrato-inibidor (EAI)

não se dissocia no complexo enzima-substrato (EA), por isso a

constante de dissociação de EAI é infinita (Kii=∞)


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Mista

A velocidade limite diminui, o Km mantém-se

constante e a razão ⁄ diminui.

A inibição mista é em geral a inibição por produto.

Neste modelo não existem equilíbrios.

o Inibição não competitiva pura mista: é um tipo de inibição

mista, rara, em que a constante de inibição, Ki, é igual à

constante de dissociação de EAI, Kii.

Anti-competitiva (catalítica)

A velocidade limite diminui e o Km diminui (aumenta a

afinidade ao substrato) e a razão ⁄ mantém-se constante.

Neste tipo de inibição o inibidor só se liga a uma espécie

de enzima modificada, como por exemplo o complexo EA.

Na presença de inibidor o enzima passa a apresentar uma maior

afinidade para o substrato.


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O inibidor ao ligar-se ao EA impede a saída de

substrato uma vez que este não se liga ao enzima

diretamente (só à sua forma modificada). Assim, como a

espécie enzimática EI não existe, não há libertação de

substrato e portanto a constante de inibição é infinita (, Ki=∞)

Equações de velocidade da inibição reversível

Análise da Inibição (e cálculo de Ki e Kii)

Na determinação do tipo de inibição, os vários métodos de linearização

podem ser usados.

Gráfico de Hanes

Com inibidor, numa componente competitiva, aumenta o valor da

ordenada na origem. Numa componente anti-competitiva, aumenta o declive da

reta traçada.


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Gráfico linear direto

Num tipo de inibição

competitiva, no gráfico observa-se o

aumento de Km através da abcissa

dos pontos de interseção.

Na inibição mista

observa-se tanto o aumento do Km

como a diminuição da velocidade

limite. No caso da inibição não

competitiva pura (caso particular da inibição mista), o Km mantém-se constante

enquanto a velocidade limite diminui.

Na inibição anti-competitiva observa-se uma diminuição tanto do

Km como da velocidade limite.

Cálculo de K i e K i i

Os gráficos de Dixon e de Cornish-Bowden complementam-se na

determinação do tipo de inibição. Através do gráfico de Dixon pode-se

determinar o Ki, enquanto pelo gráfico de Cornish-Bowden pode-se determinar

Kii.


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Inibição pelo substrato

A utilização de concentrações elevadas de substrato pode levar à

inibição do enzima. A ligação do substrato a um segundo centro resulta em

inibição mista.

Para que o substrato não iniba o enzima, a concentração deste

deve estar entre 1/3 Km e 3 Km.

Inibição e ativação de enzimas

Inibição irreversível ou veneno catalítico: o inibidor liga-se

covalentemente ao enzima e a atividade deste diminui até ser nula. Este tipo de

inibição permite elucidar sobre grupos funcionais de centros ativos.

Reagentes com especificidade de grupo

Reagem com as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos.

Exemplo: Diisopropilfluorfosfato, iodoacetamida.

Marcadores de afinidade

Apresentam uma semelhança estrutural com o substrato e são

mais específicos que os reagente com especificidade de grupo. Exemplo: Tosil-

L-fenilalaninil clorometilcetona, que é análogo ao substrato para o

quimiotripsina.

Inibidores suicidas

Mecanismo de ação: são substratos modificados que inicialmente

seguem o mecanismo catalítico normal, mas depois há a formação de um

intermediário reativo que inativa o enzima por modificação covalente. Assim, o

enzima participa na sua própria inibição irreversível.


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Inibição – Base do desenho de drogas

A maior parte das drogas não são inibidores competitivos apesar de ser

aparentemente fácil desenhá-los.

A inibição deve ser comparada a velocidades constantes e não a

concentrações de substrato constantes;

O efeito do inibidor competitivo é facilmente retirado por pequenas

concentrações de substrato. O anticompetitivo é potenciado

Molécula “drug-like”

Regras dos 5 de Lipinski: resumo do que faz uma molécula

atravessar uma membrana por difusão passiva.

1. Não ser grande (massa molecular inferior a 500 Da);

2. Não ser lipófila (coef. partição etanol/agua 105)

3. Não ter grande capacidade de formar lig de H (máximo: 5 H dadores e

10 OH aceitadores)

O transporte mediado não deve ser considerado uma exceção!

Inibidor tight-binding – molécula que se liga fortemente mas de forma

reversível

Inibidor irreversivel – molécula que reage irreversivelmente levando à

perda de atividade do enzima

Inibidor mechanism-based ou inibidor suicida – “substrato” que leva

o enzima a reagir formando um estado inativado irreversível em vez de

produtos

Aula 18 – Deduçã o dã equãçã o de velocidãde de estãdo estãcionã rio

(me todo de King e Altmãn)

As concentrações das diversas espécies enzimáticas não variam ao

longo do tempo no estado estacionário, ou seja:


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Sendo , Concentrações das diversas formas enzimáticas do

mecanismo de catálise (incluindo a forma “livre” do enzima, ,

que é o somatório de todas as espécies enzimáticas envolvidas).

Pelo método de King e Altman obtêm-se expressões para , , …,

em função das constantes de velocidade dos vários passos do mecanismo.

Nestas expressões os denominadores são iguais em todas as espécies

enzimáticas e são a soma de todos os numeradores (de todas as espécies

enzimáticas).

A equação de velocidade é derivada a partir destas expressões,

considerando a formação do produto a partir de algumas das formas

enzimáticas.

Tome-se como exemplo o seguinte mecanismo:

1º passo Desenhar o padrão principal, onde

cada espécie de enzima corresponde ao

vértice de um polígono (como no exemplo

apenas existem 3 espécies enzimáticas, o

polígono obtido é um triângulo). Neste passo

também se deve identificar os processos que

levam à transformação entre cada espécie enzimática (por

exemplo para transformar E em EA o processo é k1A).

2º passo Desenhar todos os padrões possíveis contidos no

padrão principal. Regras:

i. Têm de conter todas as formas enzimáticas;

ii. Não existem ciclos (ou seja, os lados do polígono, n, são

reduzidos para n-1);

iii. Não têm em consideração a reversibilidade da

interconversão entre as duas formas.

Para o exemplo em estudo:


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Assim, para chegar à espécie enzimática E, os caminhos possíveis são:

EP EA E, o que corresponde a k-2k-1

EP E EA, o que corresponde a k-1k3

EAEPE, o que corresponde a k2k3

Logo a equação será:

∑

Para chegar à espécie enzimática EA, os caminhos possíveis são:

EP EA E, o que corresponde a k-1Ak-2

EP E EA, o que corresponde a k1Ak3

EEPEA: não existe porque a via EEP é irreversível


∑

Para chegar à espécie enzimática EP, os caminhos possíveis são:

E EA EP, o que corresponde a k1Ak2

E EP EA, não existe porque a via EEP é irreversível

EAEEP: não existe porque a via EEP é irreversível


∑

3º passo Escrever a equação de velocidade, tendo em conta os

passos da formação do produto. Neste caso o produto só se

forma a partir da espécie enzimática EP, na reação de k3:

Dividindo toda a equação pela concentração de E0, obtém-se:

Como

já é conhecido, substituindo obtém-se:


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∑

Concluindo:

Esta equação está na forma de Michaelis-Menten reversível

4º passo Agregar constantes, aplicando símbolos apropriados.

Sabendo que:

Obtém-se a seguinte equação:

Aula 19 – Cine ticã com 2 substrãtos (ou mãis)

Introdução

As reacções multi-substratos seguem equações complexas que

descrevem como se ligam os substratos e em que sequência.

A análise destas reacções é muito mais simples se a concentração de

um substrato A for mantida constante e a concentração de um substrato B for

variada. Nestas condições, o enzima comporta-se como um enzima de um só

substrato e o gráfico de v vs. [S] fornece o Km e V aparentes para o substrato

B.

Se for realizado um conjunto destas medições a diferentes

concentrações fixas do substrato A, estes dados podem ser utilizados para

descobrir qual é o mecanismo da reacção.

A maioria das reacções inclui 2 substratos e dois produtos (reacções bi-bi):

As reacções bi-bi podem ser descritas cineticamente pelo modelo michaeliano aplicado

às reacções uni-uni, considerando a concentração de um dos substratos constantes

(saturante).


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Mecanismos Reaccionais com 2 substratos

Podemos dividir as reacções com dois substratos em duas categorias

principais:

1. Aquelas que envolvem um complexo ternário

Neste caso a reacção → , prossegue via complexo

ternário do tipo EAB e EPQ, onde: → e → .

Esta categoria pode também ser dividida:

a. Reacções onde o complexo ternário é formado por um

mecanismo sequencial, ou seja, reacções onde o substrato B só se pode ligar

ao enzima depois do substrato A já estar ligado. Segue-se um exemplo:

b. Reacções onde o complexo ternário é formado por um

mecanismo random, ou seja, qualquer um dos substratos se pode ligar

primeiro. Segue-se um exemplo:


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c. Mecanismo de Theorell-Chance, onde existe uma ligação

ordenada de substratos e libertação ordenada de produtos. No entanto, o

tempo de vida do complexo ternário é extremamente curto, pelo que se torna

cineticamente insignificante.

2. Aquelas que não envolvem um complexo ternário

a. Mecanismo ping-pong, onde é formada uma forma

modificada do enzima, E’, juntamente com o primeiro produto, antes do

secundo substrato se ligar:

Elucidação do mecanismo

1. Estudos na ausência de produtos (mantendo alternadamente

um dos substratos constantes);


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a. Sequencial, com B constante e A a variar

b. Não sequencial, com B constante e A a variar


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2. Estudos de inibição por um dos produtos (supondo

mecanismos reversíveis).

A adição de um só dos produtos só altera as equações de

velocidade por adição de termos ao denominador. O produto actua como

inibidor: pelo tipo de inibição elucida-se o mecanismo.


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Equação de Dalziel

Em Enzimologia, é a equação formal para reacções com 2 substratos.

Mecanismos Reaccionais com 3 ou mais substratos

Estes mecanismos são raros, mas importantes.

Um exemplo de enzimas que apresentam este tipo de mecanismos são

os aminoacil-tRNA sintetases. No entanto, 3 substratos não implicam 3

produtos (em geral TerBi).


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Exemplo de mecanismo TerTer

BiUniUniBi

Aula 20 – Simulãçã o de mecãnismos enzimã ticos

Simulação do mecanismo

Objectivo:

Obter as variações das concentrações ao longo do tempo.

- Todas: A, P, E, EA, mesmo aquelas que são difíceis de medir.

- Com as concentrações podem-se calcular velocidades

Motivação:

Explorar diferentes cenários: mudar o mecanismo, mudar constantes

cinéticas, mudar concentrações iniciais.

Vantagem:

Não se parte de hipóteses sobre a variação dos complexos EA, EP

(equilíbrio ou estado estacionário)

Verificamos à posteriori se essas hipóteses são razoáveis.

Princípios da simulação cinética

Relação fundamental entre as velocidades

das reações e as variações das concentrações ao

longo do tempo:

Por aplicação da lei de conservação da massa durante um intervalo Δt

e passagem ao limite quando Δt 0, obtém-se a Equação diferencial ordinária

(ODE).


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Onde os fatores que levam ao consumo de A têm sinal negativo e os

que levam à sua formação têm sinal positivo.

Estado estacionário e período pré-estado estacionário

Cinética de estado-estacionário (steady-state)

* concentração das espécies intemediárias EXi é constante

* velocidade de formação é aproximadamente a velocidade de

conversão

* podem ser feitas medidas em espectrofotométricas convencionais

Cinética de pre-steady-state

* Período inicial da reação durante o qual a formação de um

intermediário específico excede a sua conversão

* Medidas com espectrofotometria stopped-flow com dispositivo

mistura-rápida e um dead time para análise de dados de ~1 ms

Aula 21 – Enzimologiã in situ.

Determinações

In situ – significa no lugar. Em termos de Enzimologia in situ refere-se

ao estudo de enzimas no local onde eles se encontram (no seu habitat natural);

In vivo – refere-se à experimentação feita dentro ou no tecido vivo de

um organismo vivo, em oposição a um parcialmente ou totalmente morto.


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A concentração de proteína,

dissolvida, in vivo é de 100 mg/mL !

In vitro – processos biológicos que têm lugar fora dos sistemas

vivos, no ambiente controlado e fechado de um laboratório.

Enzimologia in situ

O objectivo desta área é estudar enzimas no seu habitat natural.

In vitro:

↓[proteína]

↑[substrato]

In vivo:

↑[proteína]

↓[substrato]

Utilizando-se NMR consegue medir-se a concentração de quase tudo.

É necessário preservar a concentração celular dos enzimas.

Como permeabilizar a célula de um modo suave? É necessário ter

em conta a concentração de proteína exposta ao meio reaccional.

O azul de Comassi é constituído por três espécies principais e por

nove espécies secundárias.

A digitonina é insolúvel em água à temperatura ambiente. Também é

um composto termoestável. Assim, na preparação da digitonina deve

aquecer-se a água e adicionar-se a digitonina em água quente para

que seja solúvel. Tem de se utilizar agitação. Caso contrário, há

sedimentação da levedura na cuvette.

http://pt.wikipedia.org/wiki/Biologia


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Aula 22 e 23 – Biocãtãlisãdores & Enzimãs ãmbientãis

Biocatálise:

Área fundamental da biotecnologia

É a utilização de um catalisador biológico (biocatalisador) numa

reacção química específica

Biocatalisador – inclui não só enzimas, mas também células,

organitos celulares, ribozimas, ou anticorpos catalíticos

Cooperação interdisciplinar:

Enzimas como biocatalisadores

1. A tecnologia de enzimas é uma alternativa mais “limpa” que os

processos químicos, que são menos “amigos do ambiente”

2. Usados diretamente no tratamento de desperdícios

3. Ferramentas analíticas na monitorização ambiental – biossensores

4. Transformam substratos naturais em produtos de elevado valor

acrescentado

5. Os enzimas podem ser naturais ou recombinantes, livres ou

imobilizados


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Células intactas como biocatalisadores

1. Não requerem regeneração de cofatores

2. Podem ocorrer reações secundárias

3. Necessitam de equipamento dispendioso, tempo de otimização das

condições operacionais, controlo preciso do metabolismo

4. Podem ser usadas células intactas livres ou imobilizadas

Enzimas ou células?

Vantagens do uso de enzimas como biocatalisadores


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Custo (elevado?) dos enzimas

Preços dependem de:

• Pureza

• Do tipo de enzima

• Próprio custo de produção do enzima, mas também da sua

contribuição para o produto final

• Não diferem muito do custo de outros catalisadores

O preço do enzima deve ser comparado com o valor do produto final.

Estabilidade de um enzima:

Muitos são instáveis a temperaturas elevadas ou valores

extremos de pH

Outros em solução podem perder actividade à temperatura

ambiente

É fundamental que o enzima seja estável nas condições de

operacionais do processo de fabrico.

Regeneração de cofactores em sistemas com enzimas:

• Cofatores como o NAD(P) ou NAD(P)+ nem sempre são fáceis de

regenerar

• Se o enzima for dependente de cofatores, tem que existir no meio um

sistema de regeneração dos cofatores, de forma económica e eficiente.

Exemplos de como regenerar os cofatores:

1. Usar uma reação acoplada! - O NADH necessário na reação de

redução é regenerado com o enzima álcool desidrogenase e

etanol (um reagente barato, logo o processo é económico)

2. Usar um cofator macro-molecularizado num reator de

membrana! - O NADH é ligado ao PEG (NADH-PEG),

aumentando a massa molecular do cofator. Isto permite que o

cofator fique retido dentro do reator (dentro da membrana) com

os enzimas, enquanto que o substratos e os produtos passam

pela membrana livremente.


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Fonte dos enzimas

Plantas

Animais

Microrganismos

Enzimas recombinantes

Imobilização de enzimas

Limitação do movimento, através de processos químicos ou físicos:

• Método eficiente, fácil, barato e universalmente aceite para aplicações

na indústria alimentar e em medicina

• A velocidade de reacção e o rendimento dependem de vários

parâmetros: tipo de suporte, pH, temperatura, concentração de substratos

• Optimização empírica

• Método mais comum: ligação a suportes (carriers) porosos

• É necessário o conhecimento das propriedades na superfície do

enzima: hidrofobicidade, grupos iónicos, grupos funcionais

• Pode ser necessário fazer engenharia da superfície do enzima

• Introdução de grupos funcionais de forma a aumentar as ligações, a

estabilidade e a actividade

• Alteração do ponto isoeléctrico

Vantagens da imobilização de enzimas

Reutilização do enzima após remoção dos produtos (reduz os custos)

Facilidade de isolamento do produto

Uso em processo contínuo (devido à reutilização)

Aumento da estabilidade do enzima

Limitações da imobilização de enzimas

Custo dos carriers e da imobilização

Alterações das propriedades

Problemas com a regeneração de cofatores

A produção poderá não conseguir

responder às necessidades de mercado


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Problemas com sistemas multienzimáticos

Perda de atividade durante a imobilização

A imobilização de enzimas pode ser feita de várias formas:

1. Cross-link

Método barato, mas não muito usado na imobilização de enzimas

solúveis com objetivo de biocatálise:

São poucos os enzimas imobilizados que apresentam

elevada atividade

Os agentes de cross-link podem desnaturar o enzima

Usado com sucesso em cristais de enzimas

Cross-link de proteínas com glutaraldeído:

2. Ligação a um suporte (carrier)

Método bastante utilizado na imobilização de enzimas

O suporte deve ser inerte e estável

Classificação do carrier (material de que é feito, origem ou

estrutura):


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o Inorgânico (Ex. sílica, vidro, argilas)

o Orgânico de fontes naturais (Ex. derivados da

celulose, dextrano, polisacáridos, agarose)

o Orgânico de materiais sintéticos (Ex. poliestireno,

polímeros acrílicos)

Características do carrier:

o Químicas - hidrofobicidade, estabilidade química e

microbiológica

o Morfológicas - diâmetro da partícula, tamanho do poro,

capacidade da superfície para adsorção

o Mecânicas - resistência à pressão e

compressibilidade, elasticidade

o Gerais - custo, food or pharma grade

Métodos mais utilizados – Adsorção

Os enzimas são adsorvidos à superfície (interna ou externa)

de um suporte através de interacções fracas (electrostáticas,

iónicas, de hidrogénio, van der Waals)

Com o passar do tempo os enzimas podem perder-se, uma

vez que as interacções envolvidas são fracas

Como se processa:

• Misturar o enzima com o material adsorvente, em

condições adequadas de pH e força iónica

• Incubar

• Lavar os enzimas não adsorvidos ou fracamente ligados

Métodos mais utilizados – Ligação covalente

Os enzimas são ligados covalentemente a uma matriz

É utilizada em gamas alargadas de pH, força iónica e outras

condições variáveis, por ser muito estável

Os grupos mais reativos no enzima são: amina e hidroxilo. No

entanto, os resíduos de lisina são os mais utilizados

o Elevada abundância à superfície da proteína

o Elevada reatividade


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o Geralmente não estão envolvidos no centro ativo dos enzimas

o Elevada estabilidade da ligação com o suporte

As ligações dependem do suporte e do grupo envolvido na reação.

Os enzimas podem ser inativados se a ligação promover alterações no

centro ativo. O sucesso deste método para a biocatálise depende da correta

conformação do enzima e acessibilidade do centro ativo

Este método pode ser combinado com um cross-linker, como o

glutaraldeído, de forma a formar agregados de proteína:

3. Entrapment ou encapsulamento

Entrapment:

Os enzimas são misturados com o precursor do

gel ou com os monómeros de gel; o gel forma-se (ou polimeriza

a partir do monómero) e o enzima fica preso no seu interior

O tamanho do poro do gel é crucial e depende do

tamanho do enzima que se pretende imobilizar

Encapsulamento:

A solução contendo os enzimas é encapsulada no

interior de uma estrutura que contém uma membrana

semipermeável (cápsula)

A membrana geralmente é de nitrato de celulose

ou nylon

Método barato e fácil, mas a sua eficácia depende da estabilidade

do enzima.


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Aplicações com enzimas imobilizados

Biorreatores – produção de L-aminoácidos por amino ciclases

(catalisam a desacetilação dos aminoácidos);

Biossensores – deteção e quantificação de diversos compostos em

amostras complexas;

Biorremediação – remoção e desintoxicação de contaminantes;

Imobilização de células

• Alternativa à imobilização de enzimas

• A característica mais importante é a atividade e estabilidade dos

enzimas de interesse

• Não é relevante se as células estão vivas ou mortas (permeabilizadas),

desde que os enzimas estejam ativos

• Os métodos utilizados são os mesmos descritos para a imobilização de

enzimas:

• Adsorção

• Ligação covalente

• Cross-link de células

• Encapsulamento ou aprisionamento (entrapment)

Aula 24 – Engenhãriã de proteí nãs

O catalisador ideal:

Maior estabilidade

Maior seletividade

Maior gama de substratos

Como obter novos e melhores biocatalisadores?

Screening clássico

o A partir de coleções de culturas

o Recolha de amostras de ambientes

Biblioteca ambiental de genes (environmental gene library)


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o Metagenoma ambiental: genomas combinados de todos os

microrganismos de um dado meio ambiente

o Screening das bibliotecas (ex. procurar clones com determinada

atividade)

Pesquisa em bases de dados

o Projectos de sequenciação de genomas e de sequenciação

massiva

o Muitos enzimas (ainda) não caracterizados

Melhoramento de um biocatalisador conhecido

o Desenho racional (engenharia baseada na estrutura, site-directed

mutagenesis)

o Evolução dirigida (mutagénese aleatória, gene shuffling)

Aula 25 – Engenhãriã de viãs metãbo licãs

Bioengenharia

Uma estirpe que produz um determinado produto de interesse pode ser

manipulada para produzir mais e novos produtos:

a. Combinação de substratos naturais com análogos do substrato

(precursor-directed biosynthesis);

b. Manipulação genética do enzima para utilizar análogos do substrato

com maior rendimento;

c. Engenharia de vias metabólicas, expressando genes heterólogos

para a obtenção de um novo produto;

d. Engenharia de vias metabólicas através da combinação de

diferentes vias biosintéticas (de diferentes organismos) num único organismo,

dando origem a um híbrido e novos produtos naturais

e. Síntese enzimática a partir de enzimas purificados, manipulados

geneticamente ou não, livres ou imobilizados, utilizando diferentes substratos;


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Engenharia de vias metabólicas

Envolve a construção e a manipulação do metabolismo celular através

da alteração das actividades e níveis de enzimas, endógenos ou heterólogos,

para atingir a biosíntese ou a biocatálise dos compostos de interesse.

Vantagens:

Aumento do rendimento

o Novos enzimas mais eficientes

o Utilização de menor quantidade de matéria-prima

o Menor produção de desperdícios

o Aumento dos níveis de produção

Maior eficiência relativamente aos processos químicos

Menor dependência de recursos naturais

Técnicas analíticas mais utilizadas:

Genómica

Transcriptómica

Proteómica

Metabolómica

Depende ainda da engenharia

de enzimas, da descoberta de novos

enzimas, da biologia e bioquímica de

sistemas (cataloga novas vias, novas

redes metabólicas e as estratégias de regulação de diferentes organismos -

com interesse para desenvolver novas funções celulares) e da biologia sintética

(desenvolve novas estratégias para perturbar as redes metabólicas endógenas,

permitindo a obtenção de dados de sistemas em condições de celulares não

fisiológicas).


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Simulação combinatória (in silico)

Análise in silico (simulação cinética) na optimização de vias

metabólicas:

Depende de modelos, o mais próximos possível da realidade,

baseados em parâmetros obtidos experimentalmente

Permite perceber os circuitos moleculares que controlam sistemas

biológicos complexos

Permite reduzir o tempo e os custos associados com os métodos

tradicionais experimentais

Permite simular o comportamento de determinados sistemas

metabólicos por alteração dos componentes do sistema

Passos que envolvem a simulação:

1º passo Abstração do modelo: Seleção de vias metabólicas que

incluam os principais componentes que controlam os fluxos metabólicos.

2º passo Construção do modelo: Desenvolvimento de um modelo

computacional (de referência) das vias metabólicas selecionadas, baseado no

conhecimento existente dos parâmetros do sistema (concentração de enzimas,

parâmetros dos enzimas,…).

3º passo Otimização do modelo: Perturbação do modelo de referência

(por ex. a deleção do gene ou a sobre-expressão do enzima) em posições

selecionadas (únicas ou múltiplas) de forma a aumentar a produção de um

determinado composto.

4º passo Teste experimental: Desenho de novas experiências (novas

estirpes, melhoradas) com base nos resultados das simulações.

5º passo Iteração do modelo: Otimização do modelo até o

comportamento experimental do sistema ser satisfatório, num processo cíclico.

6º passo Produção industrial: Scale-up das culturas com o objetivo de

produção do composto à escala industrial


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Biologia sintética e engenharia genética

Envolve a engenharia genética das vias biossintéticas naturais para a

produção de novos compostos utilizando vias metabólicas de outros

organismos.

A estratégia mais utilizada é a produção de pequenas moléculas em

hospedeiros microbianos através da expressão de vias biossintéticas

heterólogas.

Produção de proteínas recombinantes

Há uma grande procura de elevados níveis de produção de proteínas

por parte das indústrias farmacêutica e biotecnológica.

As culturas de células de mamíferos são ideais para a expressão e

produção de proteínas humanas, mas:

São caras

Não permitem a produção de proteínas em larga escala

Produção de proteínas recombinantes em células de insetos, fungos ou

bactérias com maior rendimento e baixo custo.

Utilização da via secretória de forma à proteína sair da célula à medida

que é expressa (facilidade de isolamento)


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Aulã 26 e 27 – Regulãçã o dã ãtividãde enzimã ticã

Porquê que é necessário haver regulação?

Manter homeostase;

Adaptação a mudança ambientais (de nutrientes…);

Catalisar vias metabólicas em sentidos diferentes (ciclos de substrato);

Capacidade de grandes mudanças de fluxos metabolitos com pequenas

variações de concentração dos metabolitos envolvidos.

Cinética Michaeliana é insuficiente

Se a concentração de substrato for muito superior ao Km, ao

variar a concentração de substrato a atividade do enzima não

vai ser alterada.

Se a concentração de substrato for igual ou inferior ao Km, a

variação da concentração de substrato leva a uma variação

moderada da atividade enzimática.

Para que a velocidade da reação varie de 10% para 90% da

velocidade máxima da reação, a concentração de substrato tem

de aumentar 81 vezes.

Modos de regulação

Quantitativos (escala de tempo lenta) – coarse control

– Regulação da síntese proteica (em vários passos possíveis)

– Regulação da proteólise

Neste tipo de regulação existe uma modificação na espécie enzimática

inicial.

[ ]

[ ]


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Qualitativos (escala de tempo rápida) – fine control

– Modificação covalente irreversível

– Modificação covalente reversível

– Modificação conformacional induzida por ligando

Neste tipo de regulação pode ocorrer uma modificação covalente que

leva à alteração da constante de velocidade, , ou modificações de

conformacionais que alteram a função do enzima.

Modificações covalentes irreversíveis

Proteína precursora inactiva (zimógeno)

Activada por acção de proteases

Comum em proteases com actividade extracelular

Digestão/coagulação sanguínea/resposta imune (sistema do

complemento)

Modificações covalentes reversíveis

Fosforilação/desfosforilação (muito comum): integradas em vias de

sinalização – amplificação de sinal

o Cinases de proteína fosforilam resíduos de:

– Serina/Treonina (geralmente ‐ regulação de metabolismo)

– Tirosina (geralmente – crescimento e diferenciação celular)

– mais raras: histidina, lisina, arginina, glutamato e aspartato

Outras modificações:

– Adenilação

– Ribosilação…

Modificações Conformacionais

Observações experimentais:

– Muitos enzimas do primeiro passo da via eram inibidos por produtos

do final da via estruturalmente distintos dos seus substratos e produtos;


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– Cinéticas sigmoidais;

– Oligómeros;

– Era possível interferir com ligação do inibidor sem afectar ligação de

substratos.

Alosteria

• Propuseram que inibidores (ou activadores, efectores) se ligassem

noutro local do enzima que não o centro activo;

• Este centro poderia estar distante do centro activo e ter forma

diferente – centro alostéreo;

• Ligação do efector poderia induzir modificações conformacionais que

teriam impacto no centro ativo.

O centro alostéreo pode ativar ou inibir o enzima:

Cooperatividade

Propriedade de enzimas e proteínas que respondem com grande

sensibilidade a variações de concentração de substratos ou efetores

Variação de velocidade com concentração de substrato (ou efector) não

hiperbólica – maioria dos casos apresentam cinéticas sigmóides


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A cooperatividade pode ser:

o Homotrópica (se o ligando for semelhante para todos os centros

ativos) ou heterotrópica (se os ligandos tiverem naturezas

diferentes)

o Pode ser positiva (se a ligação de um ligando promove a ligação

dos outros – o enzima pode deixar de apresentar sigmoicidade),

negativa (se a ligação de

um ligando impede a

ligação dos outros) ou

mista (se a ligação de

um ligando promove ou

impede a ligação dos

outros dependendo da

concentração a que se

encontra).

Exemplo mais conhecido: hemoglobina.

Proteína oligomérica com cooperatividade homotrópica positiva

Ligação do substrato a uma subunidade induz aumento de

afinidade nas restantes subunidades

Alosteria≠Cooperatividade ≠Oligomeria

Um enzima pode:

– Ter centros alostéreos sem apresentar cooperatividade e sem

ser oligomérico

– Ter cooperatividade sem ser oligomérico e sem ter centros

alostéreos

– Ser oligomérico sem ter alosteria nem cooperatividade


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Para ajustar ligação da hemoglobina ao oxigénio, Hill formulou a

seguinte equação:

[ ]

[ ]

Em que Y é a fração de proteína ligada, [A] é a concentração de

substrato, é a constante de semi-saturação, e é o coeficiente de Hill.

Para enzimas a equação é a seguinte:

[ ]

[ ]

Na equação de Michaelis Menten o coeficiente de Hill é igual a 1, ou

seja, não existe cooperatividade.

Quando a cooperatividade é positiva, h > 1; quando a cooperatividade é

negativa, h < 1.

Modelos explicativos

Modelo de Hill

No modelo de Hill a cooperatividade é extrema, ou seja, ou não há

ligação de substrato ou todos os centros têm substrato ligado.

O índice de cooperatividade apenas indica o número de centros de

ligação para o ligando na situação limite.

O gráfico de Hill obtém-se através da seguinte equação:

(

) [ ]

Onde h é o declive da reta e é a ordenada na origem.

Índice de cooperatividade ( ) – Razão entre as concentrações de

ligando para as quais e

Quando o h diminui, o aumenta e tem-se cooperatividade negativa.

Quando o h aumenta, o diminui e tem-se cooperatividade positiva.


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Modelo de Adair

Supõe-se que existem dois centros de ligação no enzima.

É um modelo geral para interação entre proteína e múltiplos ligandos,

assumindo associação/dissociação em equilíbrio.Este modelo soluciona o

problema do modelo de Hill, ou seja, a cooperatividade não é extrema.

São as constantes de cooperatividade intrínseca que ao variarem

permitem explicar a cooperatividade.

Se o valor de K, constante de dissociação microscópica, aumentar,

tem-se cooperatividade negativa.

Se o valor de K diminuir, tem-se cooperatividade positiva.

As definições de cooperatividade por Hill e Adair não são totalmente

equivalentes mas são quantitativamente idênticas (ambos definiram um índice

de cooperatividade: se se observar cooperatividade positiva pela equação de

Hill também se observará em Adair mas o valor será diferente, consoante a

equação que se aplique). A equação de Adair (quando aplicável) tem maior

significado físico dado que é mais adequado pensar-se que os ligandos se

ligam a tempos diferentes, mas não permite calcular .

Induced-fit

Surge o conceito de flexibilidade e desaparece o conceito de

proximidade. Segundo este modelo à uma alteração conformacional no enzima

e posteriormente ocorre a ligação do ligando: o centro ativo tem o potencial


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para ligar o substrato mas só adota a conformação correta quando este se liga

(alteração conformacional conseguida pela ligação dos diferentes grupos do

substrato com o enzima).

Este modelo permitiu explicar a alosteria e a cooperatividade como

efeitos à distância.

Modelos modernos de cooperatividade

Modelo MWC – Monod, Wyman,Changeux(1965)

Modelo Concertado ou Simétrico:

Enzimas oligoméros em que, na ausência de ligando, cada

subunidade pode estar em duas conformações: R (relaxada –

representada por um circulo) e T (tensa – representada por um

quadrado)

Substrato tem maior afinidade para a forma relaxada (Kr<Kt)

No oligómero, todas as subunidades têm a mesma conformação,

ou estão todos na forma relaxada ou todos na forma tensa.

Aforma tensa, Tn, está em equilíbrio com a forma relaxada, Rn,

com constante de equilíbrio

– constante alostérea.

A equação para geral é dada por:


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Casos particulares:

1. Quando n=1, apenas existe um centro de ligação por enzima,

logo:

2. L= 0, da equação

retira-se que T=0, ou seja, não existe a

forma tensa do enzima. Não existe cooperatividade. A equação

é dada por:

3. L→∞, da equação

retira-se que R=0, ou seja, não existe

a forma relaxada do enzima. Não existe cooperatividade. A

equação é dada por:

Resumindo, segundo este modelo:

Para haver cooperatividade são necessárias 2 conformações

(pelo menos)

Essas formas tem de ser funcionalmente diferentes (KR ≠ KT )

Explica modificadores alostéreos (efeitos heterotrópicos):

o Ativador – tem maior afinidade pela forma relaxada

o Inibidor – tem maior afinidade pela forma tensa.


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Modelo KNF‐Koshland, Némethy,Filme r

A proteína só pode ter diferentes conformações na presença de

ligandos.

Assim, as diferentes conformações não estão implícitas na proteína e só

ocorrem se houver ligandos.

A presença de ligandos induz uma alteração conformacional que é

perpetuada às outras subunidades.

Este modelo permite ultrapassar os problemas do modelo MWC, pois

admite a existência de formas híbridas e permite explicar a cooperatividade

negativa.

Quando A se liga ao enzima na forma T, a forma T passa à forma R.

Este modelo permite explicar diferentes tipos de fenómenos de

cooperatividade das ciências da vida.

Ambos os modelos existem porque admitem que as proteínas são

oligómeros. No entanto, pode haver cooperatividade em proteínas só com uma

subunidade.

Resumindo, este modelo:

Gera expressões de y vs a complexas, por exemplo:

A forma da curva é determinada pela relação entre KR:R e KR:T

K0.5 depende de KT, KA e KR:R

Consegue explicar cooperatividade positiva e negativa consoante

relação entre KR:R e KR:T

o

– Cooperatividade positiva (R:R mais estável que R:T)

o

– Cooperatividade negativa (R:T mais estável que R:R)

O enzima encontra-se

inicialmente na sua forma tensa e vai

passando para a forma ativa, relaxada,

conforme seja necessário.


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Modelos de associação‐dissociação

Cooperatividade pode resultar de equilíbrio entre formas de proteína

em diferentes estados de agregação (não há relação entre cooperatividade e

alterações conformacionais)

O ligando tem afinidades diferentes para as diferentes formas

Semelhanças com o modelo de simetria mas nas equações aparece

concentração de proteína (o que constitui uma vantagem prática)

Modelos cinéticos

Modelo de Ferdinand e Rabin

A cooperatividade pode surgir por motivos cinéticos.

Consequentemente, uma única cadeia pode ter cooperatividade sem ter uma

estrutura quaternária.

Modelo de Rabin

É o substrato que provoca alterações conformacionais no enzima (E’’A)

e é só assim que vai ser possível dar o produto.

‘’O enzima tem memória’’ e ‘’lembra-se’’ da conformação que tinha

quando o substrato estava em baixas concentrações. A este fenómeno

designa-se por histerese (tendência de um material ou sistema de conservar

suas propriedades na ausência de um estímulo que as gerou)

resumos de enzimologia

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