cinetica enzimatica 2013 enzimologia

CINETICA CINETICA ENZIMATICAENZIMATICA

Dr. Ronald Navarro OviedoDr. Ronald Navarro Oviedo

Departamento Académico de Departamento Académico de Biología Biología

U.N.S.AU.N.S.A

1. IMPORANCIA DE LA 1. IMPORANCIA DE LA CINETICA ENZIMATICACINETICA ENZIMATICA

Conocer la velocidad de la reacciónConocer la velocidad de la reacción Conocer el mecanismo de acción variando las Conocer el mecanismo de acción variando las

condiciones de la reaccióncondiciones de la reacción Conocer las mejores condiciones para la Conocer las mejores condiciones para la

acción de la enzima y el efecto de varios acción de la enzima y el efecto de varios factores sobre esta. factores sobre esta.

Ayuda a entender muchos fenómenos Ayuda a entender muchos fenómenos biológicosbiológicos

Sin un conocimiento de la cinética de una Sin un conocimiento de la cinética de una enzima no se puede saber cómo trabaja en enzima no se puede saber cómo trabaja en términos químicos o cómo funciona en la términos químicos o cómo funciona en la célulacélula

2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA 2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN

ENZIMÁTICAENZIMÁTICA

Son varios y determinan las curvas Son varios y determinan las curvas de progreso de las reacciones de progreso de las reacciones enzimáticasenzimáticas

Por tanto, es difícil derivar las Por tanto, es difícil derivar las ecuaciones cinéticas que ecuaciones cinéticas que representan las curvas de progresorepresentan las curvas de progreso

[E], [S], pH, Temperatura, [E], [S], pH, Temperatura, inhibidores, activadores, fuerza inhibidores, activadores, fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.iónica, constante dieléctrica, etc.

EFECTO DE LA ( E)EFECTO DE LA ( E) La velocidad es proporcional a la [ E]) v = k[ E]La velocidad es proporcional a la [ E]) v = k[ E] Esto se da en la gran mayoría de casos (caso normal)Esto se da en la gran mayoría de casos (caso normal) Pero hay desviaciones en algunos casosPero hay desviaciones en algunos casos

v

[E]

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ARRIBA: hay dos CURVATUTRA HACIA ARRIBA: hay dos

posibles causasposibles causas

a)a) Presencia de pequeñas cantidades Presencia de pequeñas cantidades de alguna impureza altamente tóxica de alguna impureza altamente tóxica en uno de los componentes de la en uno de los componentes de la mezcla, pero no en la solución mezcla, pero no en la solución enzimática mismaenzimática misma

Ejm. Iones metálicos pesados, Ejm. Iones metálicos pesados, presencia de pequeñas de Cu en el presencia de pequeñas de Cu en el buffer o en el agua destilada usadabuffer o en el agua destilada usada

Efecto de las impurezas tóxicas en los Efecto de las impurezas tóxicas en los reactivos, pero no en la solución reactivos, pero no en la solución

enzimáticaenzimática

v

[E]Proporcional a la impureza tóxica

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ARRIBACURVATUTRA HACIA ARRIBA

b)b) Presencia de un activador disociable o Presencia de un activador disociable o coenzima en la preparación enzimáticacoenzima en la preparación enzimática

E + A EAE + A EA Por tanto el porcentaje de la enzima que Por tanto el porcentaje de la enzima que

está en la forma activa aumenta conforme está en la forma activa aumenta conforme aumenta la concentración del activador en aumenta la concentración del activador en la mezcla de incubación (el activador está la mezcla de incubación (el activador está siendo añadido junto con la enzima, por siendo añadido junto con la enzima, por tanto una cantidad creciente de la enzima tanto una cantidad creciente de la enzima estará en la forma activa)estará en la forma activa)

Efecto de un activador o coenzima que Efecto de un activador o coenzima que está en la preparación enzimática. está en la preparación enzimática.

ArilsulfatasaArilsulfatasa

Concentración constante y óptima de ClNa o.o5 M

Arilsulfatasa parcialmente purificada y dializado frente a ClNa

B

A

ml enzima (dializada frente a ClNa)

g p

-NO

2

/hora

Efecto de un activador o Efecto de un activador o coenzima disociable. Ficinacoenzima disociable. Ficina

Bv

C

A

[E]

Con activador cianuro

Sin activador

Con activador tioglicolato

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ARRIBACURVATUTRA HACIA ARRIBA

Un caso interesante se da cuando la Un caso interesante se da cuando la enzima ctiva consiste en un complejo enzima ctiva consiste en un complejo de subunidades que son inactivas de subunidades que son inactivas individualmente. Al aumentar la individualmente. Al aumentar la concentración se favorece la concentración se favorece la agregaciónagregación

Efecto de la asociación de Efecto de la asociación de subunidades. subunidades.

FosfofructoquinasaFosfofructoquinasa

C

A B

200 µMATP + 200 µM AMP + 500 µM

ATP

500 µM ATP + 500 µM citrato

V (

µm

ole

s p

or

min

uto

[E] µg por ml

El AMP se une a la forma agregada, y empuja el equilibrio hacia la forma activadaEl citrato se une a la forma inactivaEl ATP se une a ambas formas, pero a altas concentraciones favorece la disociación

CASOS EN LOS QUE HAY UNA CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ABAJOCURVATUTRA HACIA ABAJO

Es mas común que el caso anterior; hay Es mas común que el caso anterior; hay varias causas posibles.varias causas posibles.

a)a) Hay una limitación en la capacidad del Hay una limitación en la capacidad del método para estimar la actividad de la método para estimar la actividad de la enzima en lugar de una disminución de la enzima en lugar de una disminución de la actividad de la enzimaactividad de la enzima

Ejm. Cuando el método depende de la Ejm. Cuando el método depende de la adición de una segunda enzima, la adición de una segunda enzima, la actividad de esta última pone un límite a actividad de esta última pone un límite a la primerala primera

Limitación de la velocidad por el método de prueba

A

Bv

[E]


b)b) Puede haberse añadido una Puede haberse añadido una enorme cantidad de enzimaenorme cantidad de enzima

P. ej. Si la enzima tiene alta afinidad P. ej. Si la enzima tiene alta afinidad por una coenzima, toda estará unida por una coenzima, toda estará unida a la enzima y no estará disponible a la enzima y no estará disponible para reaccionar con las otras para reaccionar con las otras enzimas u otras moléculas enzimas u otras moléculas enzimáticas. Ejm. Lactato enzimáticas. Ejm. Lactato deshidrogenasadeshidrogenasa

Efecto de una cantidad muy grande de Efecto de una cantidad muy grande de enzima en un sistema complejo. Ejm. enzima en un sistema complejo. Ejm.

Lactato deshidrogenasaLactato deshidrogenasa

Lactato + lactato deshidrogenasa + NAD+ + flavoproteína + azul de metileno + O2

[E] log de los mg de deshidrogenasa

Velo

cidad (

µM

de O

2 e

n 1

0

min

uto

s)


cc) Se ha medido el cambio en un ) Se ha medido el cambio en un periodo de tiempo dado, en lugar de periodo de tiempo dado, en lugar de las velocidades inicialeslas velocidades iniciales

Se debe al agotamiento del S y Se debe al agotamiento del S y formación de inhibidores.formación de inhibidores.

Ejm. AldolasaEjm. Aldolasa

v

[E]


dd) La preparación enzimática ) La preparación enzimática contiene un I irreversible que se contiene un I irreversible que se combina con la E para dar un combina con la E para dar un complejo inactivo EI:complejo inactivo EI:

E + I EIE + I EI Por lo tanto, el % de enzima inactiva Por lo tanto, el % de enzima inactiva

aumenta conforme aumenta la [I] en aumenta conforme aumenta la [I] en la mezcla de incubaciónla mezcla de incubación

Efecto del inhibidor reversible en la Efecto del inhibidor reversible en la preparación enzimática. Arilsulfatasapreparación enzimática. Arilsulfatasa

Sustrato: p-nitrofenilsulfato

Con extracto dializado (se elimina el fosfato)

B

AHidrólisis por un extracto no dializado (inhibición por fosfato)

ml de enzima (extracto crudo de hígado)

µ

g d

e p

-nit

rofe

nol por

hora

Efecto del inhibidor reversible Efecto del inhibidor reversible añadido a la preparación añadido a la preparación

enzimática. Tripsinaenzimática. TripsinaA

B

Solución pura de tripsina

Solución de tripsina + inhibidor de tripsina

ml de solución de tripsina

Unid

ades

de t

ripsi

na

enco

ntr

adas

EFECTO DE LA EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL CONCENTRACION DEL

SUSTRATOSUSTRATO

El estudio de la cinética enzimátic se inició en El estudio de la cinética enzimátic se inició en 19021902 con el con el trabajo de trabajo de Adrian Brown Adrian Brown acerca de la hidrólisis de la sacarosa acerca de la hidrólisis de la sacarosa por la invertasa de levadura (hoy por la invertasa de levadura (hoy -fructofuranosidasa)-fructofuranosidasa)

Sacarosa + HSacarosa + H22O Glucosa + FructosaO Glucosa + Fructosa A altas concentraciones de sacarosa la velocidad es A altas concentraciones de sacarosa la velocidad es

independiente de la sacarosa, por eso propuo que la reacción independiente de la sacarosa, por eso propuo que la reacción total está compuesta de dos etapas en las cuales el S forma total está compuesta de dos etapas en las cuales el S forma un complejo con la E, el cual se descompone en productos y un complejo con la E, el cual se descompone en productos y EE

E + S ES P + EE + S ES P + E

V = d[P]/dt = kV = d[P]/dt = kpp[ES][ES] Velocidad total d producción de [ES]Velocidad total d producción de [ES] d[ES]/dt = kd[ES]/dt = k11[E][S] - k[E][S] - k-1-1[ES] - k[ES] - kpp[ES][ES]

k1

k-1

kp

Sin embargo, esta ecuación no puede ser Sin embargo, esta ecuación no puede ser integrada explícitamente sin hacer integrada explícitamente sin hacer simplificaciones. Hay 2 posibilidadessimplificaciones. Hay 2 posibilidades

1. Suposición del equilibrio 1. Suposición del equilibrio (1913) Leonor Michaelis (1913) Leonor Michaelis y Maude Menten, usando los datos de Victor y Maude Menten, usando los datos de Victor Henry, asumieron que kHenry, asumieron que k-1-1 k kpp, de modo que la , de modo que la primera etapa de la reacción alcanza el equilibrioprimera etapa de la reacción alcanza el equilibrio

Ks = kKs = k-1-1/k/k11 =[E][S]/[ES] =[E][S]/[ES] 2. Suposición del estado estable2. Suposición del estado estable (1925) Briggs y (1925) Briggs y

HaldaneHaldane d[ES]/dt = 0d[ES]/dt = 0

1. Ecuación de Henri, 19031. Ecuación de Henri, 1903

V = K[S]/1 + [S]/KsV = K[S]/1 + [S]/Ks

Ks = kKs = k-1-1/k/k11 = [E][S]/[ES] = [E][S]/[ES]

La derivación de la ecuación de Henri La derivación de la ecuación de Henri en las suposiciones que:en las suposiciones que:

Suposiciones de Henri 1. La enzima es un catalizador (propuesto por Berzelius en 1833 –

1837) 2. La enzima y el sustrato reaccionan rápidamente para formar un

copmplejo ES (propuesto en 1902 por Brown) 3. Un solo S y un solo complejo ES están implicados y el complejo

ES se rompe directamente para formar E libre y producto 4. La E, el S y el complejo ES están en equilibrio; es decir, la

velocidad con que se disocia ES a E + S es mucho mayor que la velocidad a la que ES se rompe para formar E + P (suposición del cuasi equilibrio o equilibrio rápido; k-1 >> kp)

5. La [S] >> [E], de modo que la formación de un complejo ES no altera la [S]

6. La velocidad total de la reacción está limitada por la descomposición del complejo ES para formar E libre y producto

7. La velocidad se mide durante los estadíos muy tempranos de la reacción, de modo que la reacción inversa es insignificante ( se mide velocidad inicial)

2. Ecuación de Michaelis-Menten (1913); Briggs-

Haldane (1925)

Km [S]

vVmax

Vmax/2

3. Ploteo de v frente a pS (=-log S) Kuhn (1923)

Vmax/2

Vmaxv

pSpKm

4. Ecuación de Hanes-Woolf (1932): 4. Ecuación de Hanes-Woolf (1932): multiplicando todo la ecuación anterior por multiplicando todo la ecuación anterior por

[S][S]

Km/Vmax

[S]/v

[S]

1/Vmax

-Km

5. Ecuación de Woolf – Augustinsson – Hofstee 5. Ecuación de Woolf – Augustinsson – Hofstee (1932): a partir de la ecuación de Michaelis (1932): a partir de la ecuación de Michaelis

dividiendo numerardor y denominador por [S] dividiendo numerardor y denominador por [S] y simplificandoy simplificando

Vmax

Vmax/Km

-Km

v

v/[S]

6. Ecuación de Lineweaver – Burk (1934): 6. Ecuación de Lineweaver – Burk (1934): dobles inversasdobles inversas

1/Vmax

1/v

1/[S]-1/Km

Vmax/Km

7. Ecuación de Eadie – Scatchard (1949): a) 7. Ecuación de Eadie – Scatchard (1949): a) dividiendo numerador y denominador por [S]; dividiendo numerador y denominador por [S];

b) dividiendo ambos miembros por Kmb) dividiendo ambos miembros por Km

Vmax/ Km

Vmax

-1/Km

v/[S]

v

8. Método de Dixon (1972)8. Método de Dixon (1972)

Km Km KmS1S0 S2 S3 S4 S5

[S]

v

eT

Vmax

9. Método de Eisenthal, Cornish-9. Método de Eisenthal, Cornish-Bowden (1974)Bowden (1974)

Km [S]

v

Vmax

Figura 8 Efecto de la concentración del sustrato pNPP sobre la actividad de la Fac-IV de trigo (Triticum aestivum L.) var. Gavilán. Representación gráfica de Michaelis-Menten Las condiciones de ensayo se indican en 2.6 y 2.8.3 (Tasis Salvador Galdos Galvan, 2002)

Figura 9 Efecto de la concentración del sustrato pNPP sobre la actividad de la Fac-IV de trigo (Triticum aestivum L.) var. Gavilán. Representación gráfica de dobles recíprocas de Lineweaver-Burk. Las condiciones de ensayo se indican

en 2.6 y 2.8.3 (Tasis Salvador Galdos Galvan, 2002)

Efecto de la concentración de sustrato sobre la Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de la fosfatasa acida de quinua (Faq-I)actividad de la fosfatasa acida de quinua (Faq-I)

En este gráfico se representa la ecuación v = Vmax [S] / KM + [S], según la cinética de Michaelis-Menten, la cual muestra la variación de la velocidad de reacción en función de la concentración de sustrato. Tesis: José Arce Flores, 2002)

La figura muestra la gráfica de dobles inversas, en la que se representa 1/v frente a 1/[S], según la ecuación 1/v = KM/Vmax[S] + 1/Vmax. La extrapolación de los datos nos permite calcular los valores de Vmax y KM. (Tesis: José Arce Flores, 2002)

Representación gráfica de Lineweaver-BurkRepresentación gráfica de Lineweaver-Burk

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