1.Biosenzori potentiometriciBiosenzori Potentiometrici

Biosenzorii potentiometrici utilizeaza ca traductori pentru transformarea semnalului

biologic in semnal electric, electrozi ion-selectivi. In cea mai simpla reprezentare, ei sunt

constituiti dintr-o membrana ce contine enzima imobilizata si care inconjoara membrana de sticla

semi-permeabila a unui electrod de pH. Reactiile catalizate de enzima imobilizata genereaza sau

absorb ioni de hidrogen. Aceste reactii care au loc langa membrana subtire de sticla a electrodului

vor permite inregistrarea schimbarii valorii de pH ce se va afisa direct pe ecranul pH-metrului.

Avantajul acestor electrozi este ca potentialul electric determinat este generat cu o viteza lenta

comparativ cu a reactiei enzimatice, ceea ce face sa nu apara nici o interferenta cu reactia

enzimatica.

Exista trei tipuri de electrozi ion-selectivi care sunt utilizati ca biosenzori:

1. Electrozi de sticla pentru cationi (de exemplu electrozii normali de pH) in care elementul

sensibil este o membrana de sticla hidratata foarte subtire care permite generarea unui

potential electric transversal datorat competitiei, dependente de concentratie, dintre

cationii ce se leaga la situsurile specifice enzimei imobilizate. Selectivitatea acestei

membrane este determinata de compozitia sticlei. Senzitivitatea fata de H+ este mai mare

decat fata de cea realizata pentru NH ;

2. Electrozi de pH de sticla inveliti cu membrane selective pentru gaze, CO2, NH3 sau H2S.

Difuzia gazului prin membrana determina o schimbare in pH-ul solutiei sensibile aflata

intre membrana selectiva pentru gaze si electrod, si care este apoi determinat;

3. Electrozi la care membrana de sticla este inlocuita printr-o membrana subtire a unui ion

conductor specific, de exemplu realizata dintr-un amestec de sulfura de argint si o

halogenura de argint (Ag2S/AgX). Astfel electrodul iodura este utilizat pentru

determinarea I- intr-o reactie catalizata de peroxidaza sau cel cianura intr-una catalizata

de β- glucozidaza raspunzand prezentei ionilor de cianura.

Raspunsul unui electrod ion-selectiv este reprezentat de relatia:

unde E este potentialul masurat (in volti), E0 este o constanta caracteristica pentru sistemul ion-

selectiv/electrod extern cunoscuta si ca potentialul standard al sistemului respectiv, R este

constanta gazelor, T este temperatura absoluta (K), z este sarcina ionica, F este constanta Faraday

si [i] este concentratia speciilor ionice necomplexate, libere (in mod strict [i] ar trebui sa fie

activitatea ionului dar la concentratiile normal intalnite in biosenzori, aceasta este efectiv egala cu

concentratia). Aceasta inseamna, de exemplu, ca pentru fiecare decada de crestere in concentratia

H+ la 250C exista o crestere in potentialul electric de 59 mV. Dependenta logaritmica a

potentialului de concentratia ionica este responsabila atat pentru domeniu analitic larg dar si

pentru exactitatea si precizia scazuta a acestor senzori. Domeniul lor normal de detectie este 10-4

– 10-2 M, desi exista cativa care sunt de 10 ori mai sensibili. Timpul necesar pentru un raspuns

tipic este intre 1 si 5 minute permitand pana la 30 de analize per ora.

Biosenzorii care implica utilizarea sau eliberarea de H+ necesita utilizarea unor solutii

tampon foarte diluate (de ex. < 5mM) pentru a se putea determina schimbari semnificative de

potential. Relatia dintre modificarea de pH si concentratia substratului este complexa, incluzand

unele efecte non-lineare ca variatia activitatii de pH si efectul de tamponare a proteinelor. Insa,

adesea conditiile pentru care exista o relatie lineara intre schimbarea aparenta de pH si

concentratia substratului, pot fi stabilite.

Desi s-a obtinut un important progres in realizarea de biosenzori, exista inca o serie de

probleme care trebuie rezolvate. Una dintre cele mai mari probleme este faptul ca performantele

biosenzorului variaza sau se degradeaza in timp relativ scurt, adesea prin forme, modalitati

neasteptate. Acest fenomen impune calibrarea lor regulata sau mai bine de fiecare data inainte de

utilizare pentru o noua serie de analize.

Necesitatea de a rezolva astfel de probleme a condus la realizarea unor biosenzori cu

electrozi ion-selectivi care contin si tranzistori cu efect intr-un camp ion-selectiv (ISFET = Ion

Selective Field). Cand contin si enzima imobilizata cuplata cu campul in care transistorul

actioneaza se numesc Enzyme Field Effect Transistor (ENFET) (fig…).

Principalul avantaj al acestor sisteme este dimensiunea lor extrem de mica (<<0,1 mm2)

ceea ce permite producerea ieftina industriala a acestora folosindu-se tehnologia circuitelor

integrate. In plus sunt mult mai stabile decat cele fara tranzistori.

De exemplu un astfel de sistem construit pentru determinarea la ureei, continand ureaza

legata si un electrod de referinta continand glicina legata, a aratat doar o variatie de 15% in

raspunsul fata de uree (0,05 – 10,0 mg/ml) pe o perioada de activitate de o luna.

Au fost realizati diferiti biosenzori miniaturizati continand dispozitive ISFET si ENFET

pentru determinarea unor analiti. Senzitivitatea sistemelor FET poate fi insa afectata de

compozitie, tarie ionica si concentratiile solutiilor analizate.

Biosenzori Amperometrici

Biosenzorii amperometrici functioneaza prin producerea unui curent electric cand se

aplica un potential intre 2 electrozi. Acestia au in general timpi de raspuns, domenii dinamice si

senzitivitati similare biosenzorilor potentiometrici.

Cel mai simplu biosenzor amperometric aflat pe piata implica un electrod de oxigen

Clark. Acesta consta dintr-un catod de platina la care este redus oxigenul si un electrod de

referinta argint/clorura de argint. In mod normal ambii electrozi sunt scufundati intr-o solutie de

clorura de potasiu saturata si separati de masa de solutie in care se afla analitul printr-o membrana

de plastic, permeabila la oxigen (de exemplu Teflon, politetrafluoroetilena).

Cand un potential de + 0,224 V, corespunzator electrodului de Ag/AgCl, se aplica la

catodul de platina, se produce un curent proportional cu concentratia de oxygen si la electrozi au

loc urmatoarele reactii:

anod de Ag: 4Ag0 + 4Cl- 4AgCl + 4e-

catod de Pt: O2 + 4H+ + 4e- 2H2O

Prin aplicarea unui potential de +1,20 V la electrodul de platina, reciproc fata de

Ag/AgCl, se obtin reactii in sens contrar:

Pt anod:     H2O2 O2 + 2H+ + 2e-

Ag catod:     2AgCl + 2e- 2Ag0 + 2Cl-

Reducerea eficienta a oxigenului la suprafata catodului determina scaderea concentratiei

la electrod chiar pana la zero. De aceea viteza reducerii electrochimice depinde de viteza de

difuzie a oxigenului din masa solutiei, si care este la randul ei dependenta de gradientul de

concentratie si deci de concentratia oxigenului din masa de solutie. Este clar ca o mica, dar

semnificativa, proportie de oxigen prezent in solutie prin dizolvarea oxigenului din aer este

consumata prin acest proces impreuna cu cel eliberat prin reactia enzimatica. Acest lucru

determina ca electrodul de oxigen sa fie mult mai sensibil la schimbarile de temperatura

comparative cu senzorii potentiometrici. De aceea consumul de oxigen in lipsa enzimei, in

conditiile de lucru de referinta, se stabileste pentru diferite temperaturi.

O aplicatie obisnuita pentru acest tip de biosenzor este determinarea concentratiilor de

glucoza prin utilizarea unei membrane cu glucoz oxidaza imobilizata. Alte oxidaze pot fi utilizate

intr-o maniera similara pentru analiza substratelor lor (de exemplu alcool oxidaza, D- si L –

amino acid oxidaze, cholesterol oxidaza, galactoz oxidaza si urat oxidaza).

Problema majora cu acesti biosenzori este dependenta lor de concentratia oxigenului

dizolvat. Una dintre metodele de rezolvare a acestei probleme este utilizarea unor “mediatori”

care transfera electronii in mod direct la electrod ocolind procesul de reducere a co-substratului

oxigen. Pentru a fi aplicabili, acesti mediatori trebuie sa posede o serie de proprietati:

Trebuie sa reactioneze rapid cu forma redusa a enzimei.

Trebuie sa fie suficient de solubili, atat in forma redusa cat si cea oxidata; Aceasta

solubilitate, nu ar trebui sa fie, insa, prea mare incat sa favorizeze pierderi semnificative a

mediatorului de la micro mediului ce inconjoara membrana biocatalitica, in masa solutiei;

Mediatorul solubil nu trebuie sa fie in mod general toxic.

Sa fie capabili sa difuzeze rapid intre situsul activ al enzimei si suprafata electrodului.

Potentialul suplimentar pentru regenerarea mediatorului oxidat, la electrod, ar trebui sa

fie scazut si independent de pH.

Forma redusa a mediatorului nu ar trebui sa reactioneze rapid cu oxigenul.

O familie de compusi utilizati in mod obisnuit ca mediatori este cea a ferocenilor.

Ferocenul care reprezinta originea numerosilor derivati este fier ε5-bis-ciclopentadienil:

O alta posibilitate este utilizarea unor saruri organice conducatoare de electricitate ca invelis al

membranelor cu biocatalizator sau chiar inclusi in membrane impreuna cu biocatalizatorul

respectiv. Astfel de compusi sunt cationul N-metilfenazin (NMP+, fig..a) si radicalul anionic

tetracianoquinodimetan (TCNQ, fig…b).

Multe flavo-enzime sunt puternic adsorbite de asemenea conductori organici datorita formarii

unor legaturi saline, prin intermediul unor sarcini alternative pozitive si negative, in interiorul

mediului lor hidrofobic.

Asemenea electrozi enzimatici pot fi preparati prin simpla scufundare a electrodului intr-

o solutie de enzima. Chiar daca modul de preparare pare relativ simplu, acestia pot ramane stabili

timp de cateva luni.

Acesti electrozi pot fi de asemenea utilizati pentru reactii implicand dehidrogenaze

NAD(P)+-dependente care permit de asemenea oxidarea electrochimica a formelor reduse a

acestor coenzime.

Cele trei tipuri de biosenzori amperometrici, folosind produsul, mediatorul sau

conductorii organici reprezinta trei generatii de dezvoltare a acestora (fig…).

In cei trei biosenzori, la enzima are loc urmatoarea reactie:

Substrat(2H) + FAD-oxidaza Produs + FADH2-oxidaza

Aceasta este urmata de procesele:

(a)

biocatalizator

FADH2-oxidaza + O2 FAD-oxidaza + H2O2   

E0 = +0,68 VE0 = +0,68 V

E0 = +0,19 VE0 = +0,10 V

electrod

H2O2 O2 + 2H+ + 2e-   

(b)

biocatalizator

FADH2-oxidaza + 2 Ferociniu+ FAD-oxidaza + 2 Ferocen + 2H+   

electrod 

2 Ferocen 2 Ferociniu+ + 2e-   

(c)

biocatalizator/electrod

FADH2-oxidaza FAD-oxidaza + 2H+ + 2e-   

Curentul (i) produs prin asemenea biosenzori amperometrici este legat de viteza de reactie (vA)

prin expresia:

 i = nFAvA           

unde n reprezinta numarul de electroni transferati, A este aria electrodului, si F este numarul lui

Faraday. In mod obisnuit viteza de reactie este influentata mai ales de capacitatea de difuzie a

substraturilor dar si de a produsilor de reactie respectivi. In aceste conditii curentul electric

produs este proportional cu concentratia analitului si independent atat de cinetica enzimatica cat

si electrochimica.

Factori ce influenteaza extractia (tampoane utilizate)Problemele majore care apar pe parcursul extracţiei, purificării unei proteine sunt:

Denaturarea termica;

Fortele de forfecare;

Variatia/scăderea pH-ului mediului;

Dilutia;

Schimbarea structurii conformationale;

Fenomene de oxidare;

prezenţa ionilor metalici;

formarea radicalilor liberi;

prezenţa enzimelor proteolitice în cantităţi mari;

contaminarea cu acizi nucleici, bacterii şi virusuri;

formarea de spuma.

Tampoanele utilizate

Sistemul tampon ales pentru extracţia unei enzime dintr-o anumită sursă biologică poate influenţa

capacitatea de solubilizare şi activitatea catalitică a acesteia prin:

valoarea pH – ului său;

tăria sa ionică şi

compoziţia sa.

Astfel, la alegerea unui tampon pentru extracţia unei enzime trebuie avuţi în vedere următorii

factori:

să aibă solubilitate mare în apă;

să nu fie volatile;

Tăria ionică a tamponului trebuie să corespundă unei capacităţi de tamponare

suficiente şi să determine extracţia optimă a enzimei;

să asigure manifestarea unei activităţi catalitice maxime;

să asigure stabilitatea enzimei (domeniul pe care tamponul menţine pH – ul mediului

constant să corespundă cu cel de stabilitate al enzimei);

Componentele tamponului nu trebuie să manifeste efecte negative asupra activităţilor

enzimatice si să nu interfere în metodele de determinare a concentraţiilor proteice

(tampoanele polianionice de tipul citratului şi fosfatului sunt agenţi de chelatare ai

unor ioni metalici care pot fi esenţiali în acţiunea unor enzime);

să nu interacţioneze cu substraturi, cu cofactori sau cu ioni metalici;

Concentraţia tamponului nu trebuie să interfere în etapele ulterioare extracţiei

(concentraţii mari de tampoane polivalente pot competiţiona cu proteinele în legarea

la situsurile încărcate ale schimbătorilor de ioni).

Majoritatea proteinelor au solubilitate maximă la tării ionice moderate, cuprinse între 0,05 şi 0,1

M, valori care sunt alese dacă capacitatea de tamponare a sistemului tampon este suficientă în

aceste condiţii.

Deoarece solutiile tampon sunt in general solutii destul de diluate, in evaluarea celor mai bune

tampoane pentru extractia unei enzime de interes se utilizeaza legea dilutiei sau

legea lui Ostwald. Aceasta arată dependenţa constantei de disociere, de gradul de disociere şi de

concentraţie:

Extracţia proteinelor din ţesuturi sau celule poate conduce la obţinerea unor soluţii de enzime

foarte concentrate. În unele compartimente celulare, cum ar fi de exemplu matricea

mitocondrială, concentraţia proteinelor este de peste 500 mg/ml. Pentru a putea determina

activitatea enzimelor, concentraţia proteică trebuie redusă la 5 mg/ml în extractele celulare şi la 5

g/ml în soluţia unei enzime pure.

În practică s-a constatat insa că multe enzime îşi pierd rapid activitatea dacă sunt păstrate în

soluţii diluate. Acest efect poate fi contracarat prin introducerea unei proteine „inerte”, cum este

albumina serică bovină, în concentraţie de 1 – 10 mg/ml. Introducerea acestei proteine poate

preveni pierderea activităţii enzimatice datorate adsorbţiei pe suprafaţa veselei utilizate sau

degradării prioritare a acesteia de către enzimele proteolitice coprezente. Diluţia extractelor

proteice poate avea ca efect şi disocierea unor cofactori de apoenzimă, fenomen care poate

determina pierderea activităţii catalitice. Pentru ca acest efect să poată fi compensat, se

recomandă introducerea cofactorului în sistemul tampon utilizat pentru extracţie.

Câteva tampoane utilizate pentru extracţia proteinelor sunt prezentate în tabelul Utilizarea unor

tampoane cu capacitate slabă de tamponare pentru cantităţi mari de proteine necesită verificare

pH – ului mediului, întrucât proteinele acţionează ca sisteme tampon. Tampoanele utilizate pentru

extracţia proteinelor au în general concentraţii cuprinse între 20 şi 100 mM (concentraţia unui

tampon se referă la concentraţia tuturor speciilor componente).

Tabel….

Sisteme tampon utilizate pentru extracţia proteinelor

Tampon Valori pKa

Acid acetic/Acetat de sodiu 4,75;

Acid acetic/Acetat de amoniu 4,74; 9,25;

Acid carbonic/Bicarbonat de sodiu 6,50; 10,25;

Acid carbonic/Bicarbonat de amoniu 6,50; 9,25;

Acid citric/Citrat de sodiu 3,09; 4,75; 5,41;

fosfat monosodic/fosfat disodic 7,21;

Tris - HCl 10,25;

Tris - fosfat 1,5; 7,5; 12,0; 8,21;

Tris : Tris (hidroximetil) aminometan

Factori ce influenteaza extractia (prezenta enzimelor proteolitice)

Prezenta enzimelor proteolitice

Una dintre cel mai dificile probleme care apare atât în timpul extracţiei cât şi pe parcursul

purificării enzimelor este controlul degradării acestora de către enzimele proteolitice endogene

mai ales in cazul surselor bogate in enzime proteolitice (de exemplu tesuturile animale ca ficatul,

splina sau rinichii). Degradarea proteolitică a unei enzime este evidenţiată prin următoarele

constatări experimentale :

Enzima este izolată cu un randament scăzut;

Pierderea activităţii enzimatice la incubarea enzimei;

Obţinerea unei rezoluţii slabe prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezenţă de

dodecil sulfat de sodiu (SDS – PAGE), datorată unei heterogenităţi la nivelul masei

moleculare a enzimei;

Discrepanţe între proprietăţile enzimei raportate în alte cercetări şi cele determinate

experimental.

Există o serie de strategii care minimalizează sau suprimă proteoliza nedorită. Acestea includ :

manipulări la temperaturi scăzute la care acţiunea proteazelor este încetinită; alegerea ca sursă

biologică a unor ţesuturi cu puţini lizozomi sau a unor tulpini microbiene deficitare în enzime

proteolitice; extracţia rapidă a omogenatului proaspăt într-o soluţie apoasă a unui polimer în

sistem bifazic; adsorbţia proteazelor pe adsorbanţi prin interacţii hidrofobe. Inhibarea proteazelor

se poate realiza şi prin ajustarea pH – ului mediului la o valoare la care acestea nu acţionează, cu

condiţia ca această valoare de pH să nu afecteze stabilitatea proteinei supusă purificării.

Totusi, cea mai utilizată metodă implică utilizarea, în etapele de extracţie şi în cele ulterioare, de

inhibitori ai enzimelor proteolitice. Inhibitorii reacţionează şi modifică ireversibil unele resturi de

aminoacizi implicate în funcţia enzimelor proteolitice. Câteva exemple de astfel de substanţe sunt

:

Diizopropil fluorofosfatul (DIP), inhibitor ireversibil al serin – proteinazelor la

concentraţii de 1 mM în mediu, substanţă foarte toxică şi instabilă în soluţii apoase:

Fluorură de fenilmetansulfonil (PMSF), inhibă puternic toate serin proteinazele, la

concentraţii cuprinse între 0,1 şi 1 mM, cât şi unele tiol proteinaze. PMSF trebuie

manipulat cu atenţie pentru că este foarte toxic:

EDTA – ul, substanţă solubilă în apă, la concentraţii cuprinse între 1 şi 10 mM inhibă

proteazele activate de metale;

Acidul monoiod acetic sau moniod acetamida ( IAA, IAN), sunt inhibitori ai cistein –

proteinazelor la concentraţii mici, cuprinse între 10 şi 100 M:

E – SH + ICH2- CONH2E – S – CH2- CONH2 + HIIAN

Cistatinele, inhibitori naturali de natură peptidică, se leagă reversibil şi inhibă unele tiol

proteinaze;

Pepstatina A, o substanţă naturală, cu structură asemănătoare unei pentapeptide, secretată

de unele specii de Streptomyces, inhibă la concentraţii de 1 M unele proteaze acide cu

resturi de acid aspartic în centrul catalitic activ.

Pentru a inhiba toate tipurile de enzime proteolitice prezente într-un extract proteic total se

utilizează amestecuri de astfel de inhibitori.

Separarea prin membrane (Dializa)Separarea prin membrane

Procesele de filtrare prin membrane au la bază fenomene de difuziune. Astfel sub

influenţa unui gradient de concentraţie moleculele unei substanţe dintr-o soluţie trec în soluţia

mai diluată datorită mişcărilor de agitaţie moleculară formînd un flux de difuziune (Fig.– a).

Osmoza este o mişcare netă a solventului (apa) prin membrana selectivă datorită diferenţelor de

concentraţie a solutului de cele două părţi ale membranei, adica trecerea apei din partea mai

diluata spre cea mai concentrata pana cand presiunea din ambele parti este echilibrata(Fig.– c). În

procesul de ultrafiltrare sub acţiunea presiunii prin membrană trec atât molecule de solvent cât şi

molecule de mici dimensiuni (Fig.– c). Fenomenul de difuziune al unui solvent într-o soluţie, de

care este separat printr-o membrană semipermeabilă, generează o presiune osmotică, definită ca

presiunea de exces care trebuie aplicată soluţiei, pentru a preveni trecerea solventului în soluţia

mai concentrată

a b c

Fig. Difuzia solventului şi/sau solutului în diferite condiţii prin membrană

.

Aceste fenomene au condus în ultimul timp la dezvoltarea unor proceduri de izolare şi

purificare nu numai ieftine ci şi superioare calitativ.

Separarea prin membrane (dializa)

Dializa

Procesul de dializă se utilizează în biotehnologii în special pentru procese de desalinizare.

Moleculele de solut destul de mici pentru a trece prin porii membranei vor difuza din partea cu

concentraţie ridicată în cea cu concetraţia scăzută. Trăsătura principală a procesului de dializă

este diferenta de concentraţie a solutului care va determina mişcarea acestuia spre egalizarea

concentraţiei, nefiind necesare pompe sau vid pentru a determina această migrare.

Acest procedeu este larg folosit mai ales în laborator deoarece deşi nu este scump

necesită un timp de lucru destul de mare.

De exemplu în procesele de purificare a proteinelor adeseori se utilizează precipitarea cu

săruri neutre. Pentru îndepărtarea sărurilor proteinele precipitate sunt introduse în saci de dializă,

formaţi din membrane specifice, aceştia sunt închişi etanş şi apoi scufundaţi în volume mari de

apă distilată sau soluţii tampon adecvate. Moleculele mari de proteine nu trec prin porii

membranei, rămân în interiorul sacului, în timp ce moleculele mici de sare difuzează în apă sau

tampon până la atingerea unui echilibru. Se observă că sărurile nu au fost eliminate complet din

sacul de dializă dar concentraţia lor a scăzut foarte mult. Pentru eliminarea practic totală a

sărurilor sacul de dializă se pune în soluţii proaspete de tampon sau apă până se ajunge la

purificarea dorită (fig.).

Fig. Proces de dializă.

În prezent există şi sisteme, comerciale, care conţin o membrană între două spaţii, un

spaţiu pentru proba ce se va dializa şi un spaţiu pentru tamponul faţă de care se face dializa şi

care este mai mare deoarece tamponul (apa) faţă de care se dializează se află într-un volum de

200-300 ori mai mare (fig.).

Pe lângă desalifiere, este necesar ca în procesele de purificare să fie îndepărtate şi alte

molecule. De exemplu în lucrul cu proteine şi acizi nucleici este adeseori necesar să fie

îndepărtaţi agenţii reducători (ditiotreitol, 2-mercaptoetanol), liganzi care nu au reacţionat,

reactivi de marcare sau conservanţi.

De asemenea acest procedeu se foloseşte şi atunci când este necesar să se schimbe

tamponul în care se află proba.

Separarea prin membrane (ultrafiltrarea)

Ultrafiltrarea

Prin ultrafiltrare, un proces asemanator dializei rezultat din diferente de presiune, se

separă compuşii în funcţie de greutatea lor moleculară.

În procesele de ultrafiltrare fluidele sunt trecute dintr-un tanc de prelucrare în modulul de

ultrafiltrare care conţine membrana specifică prin care moleculele mari nu pot trece. Soluţia ce

conţine moleculele ce nu trec prin membrană se numeşte reject sau retentat. Soluţia apoasă care a

trecut prin membrană se numeşte permeat. Modul în care are loc un proces de ultrafiltrare este

prezentat în fig.

Fluxul solventului este proportional cu presiunea/forta ce se aplica asupra lui. Ecuatia care reda

aceasta curgere este:

jv= Lp∆p (1)

unde jv este volumul de solvent pe unitatea de suprafata si pe unitatea de timp, Lp este

permeabilitatea membranei, iar ∆p este scaderea presiunii pe membrana. Fluxul solventului este

acelasi cu viteza solventului dar se foloseste termenul de flux pentru a se accentua paralelismul cu

ecuatiile de transport pentru procesele de difuzie si electroforeza. Aceasta ecuatie este o alta

forma a legii lui Darcy care exprima viteza de curgere intr-un process de filtrare printr-un pat

poros:

v = (2)

unde k este constanta de proportionalitate ce defineste permeabilitatea patului poros, l grosimea

patului poros, µ vascozitatea solutiei, iar ∆p este scaderea presiunii pe patul poros.

De fapt ecuatia (1) este un artifact istoric reflectand evolutia ultrafiltrarii de la membrane

de separare si nu de la filtrarea conventionala. In general aceasta nu reprezinta o ecuatie exacta

deoarece neglijeaza presiunea osmotica existenta. Forta reala ce se aplica solutiei deriva din

variatia de presiune ce se aplica din care se scade presiunea osmotica si efectul datorat trecerii

prin membrana a unei cantitati de solut. Deci o ecuatie mai aproape de realitate este:

jv= Lp(∆p-σ∆Π) (3)

unde σ este “coeficient de reflectie”, iar ∆Π este diferenta de presiune osmotica. Atunci cand

membrana reflecta toti solutii σ=1, iar daca prin membrane trec usor si solutii si solventul σ=0.

Aceasat ecuatie este ecuatia fundamentala pentru procesele de ultrafiltrare.

Membranele disponibile in prezent pentru procese de ultrafiltrare au diametrul porilor de

la 1Å la 100Å şi pot separa particule cu greutăţi moleculare de la 1.000 la 1.000.000 daltoni. Ca

o regula membranele utilizate sunt anizotropice, {proprietatea de a fi omogen doar intr-o directie;

fenomen opus izotropiei care inseamna omogen in toate directiile – acest fenomen poate fi definit

ca o diferenta intr-o proprietate fizica (absorbanta, indexul de refractie, densitatea etc.), care

pentru anumite materiale se masoara de-a lungul a diferite axe. Un exemplu este lumina ce trece

prin lentile polarizate} formate dintr-un strat subtire de 0,1 – 0,5 µ si reprezinta un filtru care se

ataseaza pe o substructura, relativ, groasa (20 µm – 1mm), poroasa care imbunatateste rezistenta

mecanica a filtrului.

Filtrele extrem de subtiri permit realizarea unor viteze mari ale fluxului ceea ce permite

virtual ca blocajul membranei sa poata fi evitat. Totusi adeseori la suprafata membranei se

formeaza un strat secundar de molecule care poate conduce la considerabile schimbari in vitezele

de curgere. Pentru a se pastra un strat de grosime minima posibila, solutia este pompata cu o

viteza inalta in curent laminar sau turbulent pe langa si prin membrana astfel incat sa se asigure

transportul inapoi in solutie a moleculelor colectate la suprafata membranei. Aceasta viteza

conduce insa la o crestere considerabila a fortelor de forfecare care pot eventual inactiva enzimele

sensibile. S-a constatat insa ca pierderile de activitate sunt totusi relativ scazute mai ales daca

concentratiile de proteine sunt destul de scazute.

Aplicaţiile ultrafiltrării pot fi grupate în procese de fracţionare, concentrare sau

desalifiere.

Fracţionarea reprezintă separarea particulelor mari de cele mici.

În concentrare solventul este trecut prin filtru, iar solutul este concentrat la suprafata

membranei. Se reduce astfel volumul iniţial al probei şi speciile cu greutate moleculară mare sunt

concentrate in asa numitul retentat.

În desalifiere sărurile cu greutate moleculară mică sunt îndepărtate din probă în permeat.

Acest process este denumit si diafiltrare. Indepartarea sarurilor sau inlocuirea lor cu altele se

realizeaza prin inlocuirea permeatului permanent cu apa sau un tampon adecvat. Ecuatiile

utilizate pentru evaluarea concentratiilor de sare din solutia ce se prelucreaza sunt:

pentru eliminarea sarurilor : ln = ; unde C0 este concentratia initiala de sare, Cf

concentratia finala de sare in solutia proteica, V0 volumul initial si Vf volumul final al

lichidului de schimb;

pentru inlocuirea unei sari cu alta: ln = ; unde C este concentratia de sare in

solutia prelucrata, iar Cf este concentratia de sare in solutia de alimentare.

Ecuatiile de mai sus se utilizeaza doar in cazul in care schimbul de solutii are loc intr-un

mod continuu. Exista evident si alte modalitati de schimb ca de exemplu in trepte discrete.

Eficienţa îndepărtării unui contaminant este adesea considerată folosindu-se procentul de

rejecţie, care este procentul contaminantului particular care nu trece prin membrană sau este

rejectată de către membrană.

Principiul ultrafiltrării este simplu, eficace, nepoluant şi economic. Aceste calităţi fac din

ultrafiltrare una dintre cele mai convenabile metode de purificare şi concentrare în biotehnologii.

Separarea prin membrane (Osmoza inversa)

Osmoza inversă

Osmoza inversă se bazează pe procesul de osmoză. Pentru a intelege procesul de osmoza

sa consideram doua solutii de macromolecule, una concentrata cealalta diluata separate printr-o

membrana semipermeabila. Osmoza implică mişcarea selectivă a solventului (apa) din partea mai

diluată spre latura mai concentrată. Ca rezultat solventul ce trece in solutia mai concentrata o va

dilua si nivelele din cele doua capilare se vor diferentia , mai inalt fiind cel in care a trecut

solventul. Cresterea nivelului in capilar va determina o crestere a presiunii in aceasta solutie si va

incetini procesul de dilutie pana la echilibrarea presiunilor cand trecerea solventului se opreste.

Aceasta presiune ce poate fi masurata experimental se numeste presiune osmotica. În procesul de

osmoză inversă prin aplicarea unei presiuni asupra soluţiei mai concentrate se forţează trecerea

apei în sens invers spre soluţia diluată (fig.).

Fig. Schema de funcţionare a procesului de osmoză inversă

Desi procesul de osmoza inversa era folosit doar in industria vinului in prezent este

inteles si larg folosit in diferite domenii.

Prin osmoză inversă pot fi concentraţi toţi compuşii care au o greutate moleculară mai

mare de 150 – 250 Daltoni aşa cum sunt: bacteriile, săruri organice, glucide, proteine, coloranţi,

săruri etc.

Deoarece cei mai mulţi dintre contaminanţi nu trec prin membrane specifice o dată cu

apa, prin acest procedeu se poate obţine apă pură. Membranele utilizate în mod obişnuit în acest

scop sunt realizate din celuloză – triacetat, celuloză – diacetat sau membrane realizate din

poliamide aromatice.

Membranele utilizate pentru osmoza inversă sunt mult mai restrictive decât cele utilizate

pentru ultrafiltare.

Prin particularităţile sale osmoza inversă este deosebit de importantă pentru purificarea

apei fiind utilizată în tehnicile moderne aplicabile în acest scop..

Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu un substratEchilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu un substrat.

Daca consideram o simpla reactie ce implica un echilibru intre un reactant A si un produs

B, Kw reprezinta constanta de echilibru (Keq) a acestei reactii in apa:

            (I)

Daca aceasta reactie are loc intr-un sistem bifazic constand dintr-un amestec de apa si un

solvent organic, atat substratul A cat si produsul B vor fi repartizati intre cei doi solventi, avand

coeficientii de partitie PA respective PB si o diferita constanta de echilibru ce se stabileste intre A

si B pentru faza organica (Korg).

(II)

Datorita naturii ciclice a acestui echilibru numai trei din acesti parametri sunt variabile

independente si anume Kw PA si PB in timp ce Korg depinde de acestia. De aceea in discutarea

echilibrului bifazic vom lua in calcul in special parametrii Kw PA si PB, desi in anumite conditii de

concentratie foarte scazuta a apei se vor folosi mai degraba parametrii Korg, PA si PB. Constanta

generala de echilibru a acestui sistem (Kbifazic) poate fi definita ca:

Kbifazic = (5)

unde t se refera la total, adica la solutia totala formata din apa si solventul organic, substratul total

respectiv produsul total din cele doua faze. Daca notam cu V volumele implicate atunci vom

avea:

[At]Vt = [Aw]Vw + [Aorg]Vorg (6)

[Bt]Vt = [Bw]Vw + [Borg]Vorg (7)

Vt = Vw + Vorg (8)

Substituind din ecuatiile 6 si 7 in 5 obtinem:

Kbifazic = = (9)

Kbifazic = = (10)

Substituind coeficientii de partitie din ecuatiile 3 si 4 se obtine relatia simplificata:

Kbifazic = Kw (11)

unde este raportul volumelor de faza organica si faza apoasa:

= (12)

Constanta generala, globala, de echilibru (Kbifazic) variaza cu volumele relative ale fazelor

organice si apoase si evident cu coeficientii de partitie respectivi; creste cand substratul este

partitionat mai eficient in faza apoasa in comparatie cu comportarea produsului (PA<PB) si

descreste cand are loc fenomenul in sens invers. Daca exista diferente suficiente intre coeficientii

de partitie, si atat substratul cat si produsul sunt relativ non-polari, atunci au loc importante

deplasari in echilibru chiar la continuturi relativ inalte de apa. O crestere importanta a constantei

de echilibru se poate obtine cand atat substratul cat si produsul au coeficienti de partitie mai mici

decat 1 si raportul dintre acestia este potrivit.

In mod evident daca este foarte mic, Kbifazic tinde spre valoarea constantei de echilibru in

solutie apoasa Kw. Insa, daca este suficient de mare ecuatia 11 se simplifica la:

Kbifazic = Kw (13)

In consecinta substituind din ecuatiile 2 – 5, vaorile coeficientilor de partitie, se obtine:

Kbifazic = = Korg (14)

Prin urmare Kbifazic tinde spre valoarea Korg, constanta de echilibru a reactiei in lichidul

organic pur.

Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi.

Multe reactii enzimatice sunt bimoleculare, fiind de aceea in mai mare masura influentate

de sistemele bifazice. Procesele pot fi reprezentate intr-o maniera similara celei utilizate pentru

sistemele monomoleculare:

(III)

Folosind acelasi rationament ca in cazul reactiilor monomoleculare, din constantele de

echilibru se obtine ecuatia:

Kbifazic = Kw (15)

Ca si in cazul reactiilor monomoleculare, cand constanta corespunzatoare pentru apa este

foarte mica (de ex. este foarte mare) constanta echilibrului tinde spre valoarea constantei in

solventul organic Korg. Insa, ecuatia 16 contine valoarea de patru ori si la valori intermediare

poate produce o valoare maxima sau minima a constantei de echilibru care este diferita atat fata

de Kw cat si Korg de cateva zeci de ori. De exemplu constanta generala de echilibru poate fi mai

mare decat constanta de echilibru al aceleiasi reactii in una din fazele pure. In unele circumstante

aceasta poate determina ca productivitatea reactiei in sistemul bifazic sa fie mai mare decat cea

atinsa in oricare din fazele pure.

Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi. Cazul hidrolazelor

Cazul hidrolazelor.

Un caz special si important al sistemelor bimoleculare este cel in care unul dintre

reactanti este apa (de exemplu cazul hidrolazelor). Schema acestor reactii poate fi scrisa in mod

similar cu schema (III):

(IV)

Directia normala pentru reactia in solutia apoasa procesul hidrolitic de la dreapta la

stanga. Insa, constanta generala de echilibru poate fi deplasata in solutiile bifazice, asa cum am

aratat mai sus, si poate permite hidrolazei sa actioneze mai degraba intr-o maniera sintetica decat

hidrolitica (de exemplu de la stanga la dreapta in schema IV). Asemenea reactii des intalnite in

procesele tehnologice care utilizeaza enzime, ca si reactiile sintetice sunt, in general, mult mai

dificil a se realiza in bune conditii prin chimia organica clasica decat reactiile hidrolitice. Ca unul

din reactantii participanti [(H2O)t] poate fi obtinuta din balanta materialelor:

[(H2O)t](Vw + Vorg) = [(H2O)w]Vw + [(H2O)org]Vorg (16)

unde [(H2O)w] este concentratia molara a apei pure ( = 1000/18 = 55,5 M). Substituind Pw pentru

[(H2O)org]/ [(H2O)w], obtinem:

[(H2O)t] = (17)

Kbifazic = (18)

Substituind Kbifazic cu valorile din ecuatia 16 (inlocuind PD cu Pw) si rearanjand termenii se

obtine:

[Ct] = Kw (19)

Aceasta reprezinta o relatie foarte complexa dar pot fi facute cateva generalizari. Daca

produsul C este mai putin polar decat oricare dintre reactanti (A si B) atunci productia creste in

general cu concentratia corespunzatoare a fazei organice () pana la atingerea unei valori

constante, un platou. Daca are loc fenomenul invers atunci la valori inalte va fi o productie

scazuta in diagarma - productie. In functie de parametrii de lucru se pot obtine atat valori

maxime cat si minime.

In vederea obtinerii unor conversii inalte, apa produsa trebuie indepartata din sistemul

bifazic. Daca nu este indepartata, atunci apare o continua scadere in valoarea care va determina

scaderea intinderii echilibrului favorabil procesului. Nu exista nici o modalitate simpla de

indepartare a apei dar reactoare care permit adaugarea constanta de catalizator proaspat si faza

organica reduce dimensiunea problemei.

Echilibre in sisteme bifazice apa-solvent organic cu doua substraturi. Cazul acizilor si bazelorCazul acizilor si bazelor

Folosirea sistemelor bifazice influenteaza de asemenea procesul de ionizare a gruparilor

acide si bazice. Considerand ionizarea unui acid HA, cand numai formele neionizate ale acidului

sunt solubile in faza organica in timp ce speciile ionice sunt solubile numai in faza apoasa:

(V)

Ka,w = (20)

pKa,w = pH + log10 (21)

Concentratia ionului de hidrogen, asa cum se stie, este caracteristica fazei apoase:

pKa,bifazic = pH + log10 (22)

Evaluarea balantelor de masa pentru A- si HA conduce la:

[A ]Vt = [A ]Vw (23)

[HAt]Vt = [HAw]Vw + [HAorg]Vorg (24)

inlocuind valoarea de pH din ecuatia 22 in ecuatia 23 se obtine:

pKa,bifazic = pKa,w + log10 (25)

Substituind din ecuatiile 24 si 25 relatia de mai sus se simplifica obtinandu-se:

pKa,bifazic = pKa,w + log10(1 + PHA) (26)

In mod similar se pot obtine ecuatiile pentru protonarea unei baze:

(VI)

pKb,bifazic = p Kb,w log10(1 + PBaza) (27)

O evaluare calitativa a schemelor de reactie V si VI arata ca cresterea coeficientului de

partitie pentru acid sau baza neutra va determina impingerea reactiei departe de formarea de

specii ionice. Din ecuatiile 26 si 27 reiese ca valorile pK pentru acizi cresc in sistemele bifazice in

timp ce acelea ale bazelor descresc. Aceste schimbari pot fi foarte bine de cateva unitati de pH,

depinzand de coeficientii de partitie si fractia de solvent organic prezenta. Modificari de crestere

ale valorilor pKa apar in plus si datorita scaderii constantelor dielectrice ale fazelor apoase in

prezenta unor solventi organici. Aceasta este in mod particular relevanta in conditiile de stare

aproape anhidre (de exemplu cand este mare) care tind sa “inghete” ionii de hidrogen scazand

activitatea lor. Utilitatea unei deplasari in valorile pKa pot fi aratate folosind de exemplu sinteza

unui ester catalizata de catre -chimotripsina:

(VII)

unde RCOOH si RCOO- reprezinta formele neionizate si ionizate ale N-benzoil-L-fenilalanina,

RCOOR' reprezinta esterul N-benzoil-L-fenilalanin etil si R'OH reprezinta etanolul. Desi reactia

non-ionica din solutia apoasa este chiar balansata (Knonionic,w= 7), reactia globala decurge spre

stanga, in apa la pH neutru, datorita impingerii de catre ionizarea acidului (pKa = 3,4). In sistemul

bifazic cloroform-apa ( = 20, PHA = 100), Ka se deplaseaza cu trei unitati pentru a da un pKa

aproape de 7. Aceasta, impreuna cu o deplasare a constantei de echilibru datorata efectelor de

partitie, produce o deplasare globala a constantei de echilibru la pH-ul optim al enzimei (pH =

7,5)(figura …). Utilizarea unui sistem bifazic permite ca reactiile sa aibe loc la un pH care este

favorabil atat din punct de vedere termodinamic pentru orientarea reactiei in directia dorita cat si

pentru o eficienta catalitica optima a enzimei.

Imobilizarea prin legare covalenta. Metode de activare: glutaraldehida, punti disulfuriceImobilizarea prin legare covalenta. Metode de activare: bromcian, triazineImobilizarea prin legare covalenta. Metode de activare: azotura, carbodiimida

3.1 Imobilizarea enzimelor prin legare covalentă de un suport.

În acest caz se urmăreşte stabilirea modalităţilor de legare covalentă prin intermediul unor

grupări funcţionale ale enzimei de unele grupări funcţionale ale suportului astfel încât activitatea

catalitică a enzimei să fie conservată.

Grupările funcţionale enzimatice sunt destul de puţin reactive, fapt ce determină

necesitatea existenţei unor grupări funcţionale suficient de active pe suport astfel încât legarea să

se facă în condiţii blânde pentru enzimă.

Există posibilitatea de activare a grupărilor funcţionale ale enzimelor, dar aceste studii

au avut loc mai ales la nivel de laborator ca cercetări ştiinţifice şi nu au fost aplicate la scară

deoarece în general condiţiile de activare sunt puţin compatibile cu conservarea activităţii

enzimatice.

Astfel există unele cercetări originale care utilizează activarea grupărilor funcţionale ale

enzimelor. De exemplu printre primele experimente de imobilizare a enzimelor prin legare

covalenta si activarea enzimelor ii apartin omului de stiinta Zaborsky (Zaborsky O.R., 1974,

Immobilized enzymes., C.R.C. Press, new York) care a studiat imobilizarea glucoz-oxidazei, a

cărei fracţie glucidică reprezintă 16 % din masa enzimei, pe diferite suporturi aminate (p-amino-

stiren, amino-etil-celuloză, sticlă aminată, carboximetil-celuloză activată cu hidrazidă...)

Se poate de asemenea să se mărească densitatea de grupari reactive pe moleculă prin

grefarea pe acestea de lanţuri de politirozină sau de polilizină sau, de a se introduce grupări

vinilice în molecula enzimei, prin alchilarea funcţiilor aminice, după care enzima este

copolimerizată prin intermediul grupărilor vinilice cu acrilamidă şi bisacrilamidă.

În marea majoritate a cazurilor însă, nu enzima se activează ci suprafaţa suportului.

Metode principale de activare

Pentru stabilirea metodei de activare se iau în consideraţie pe de o parte grupările

funcţionale care participă la legătura covalentă din partea enzimei, iar pe de alta grupările

funcţionale implicate în legătură din partea suportului. În acest context principalele metode de

activare sunt:

Activarea cu ajutorul glutaraldehidei este una dintre cele mai utilizate metode atât pentru legarea

unei enzime de un suport cât şi pentru reticularea moleculelor unei enzime sau a unor celule

întregi. Glutaraldehida nu reacţionează sub formă sa de dialdehidă cu funcţiunile aminice ale

suportului sau enzimei, ci sub forma de polimer rezultat în urma condensării aldolice a

moleculelor de reactiv. Cu cât valoarea de pH este mai ridicată polimerizarea este mai mare.

Astfel la pH mai mare de 10,5 are loc precipitarea polimerilor de glutaraldehidă care au funcţiuni

aldehidice α, β – nesaturate. Aceste funcţiuni reacţionează cu grupările aminice ale

suportului/enzimei conducând la formarea unor legături iminice care se stabilizeaza prin

rezonanţă cu legăturile etilenice prezente (legături duble conjugate). Aceste structuri explică

stabilitatea derivaţilor obţinuţi prin activare cu glutaraldehidă. Astfel aceşti compuşi rezistă, de

exemplu, la atacul unei soluţii de acid clorhidric 6N la temperatura de 1100C timp de 24 de ore.

La modul general imobilizarea unei enzime pe un suport activat cu glutaraldehidă are loc

în două etape. În prima etapă suportul aminat este activat prin punerea în contact cu o soluţie de

glutaraldehidă (1% - 5%) la un pH cuprins între 7,0 şi 8,6 şi temperatura ambiantă. După spălarea

cu un tampon corespunzător pentru îndepărtarea excesului de glutaraldehidă enzima este

menţinută în contact cu suportul la temperatura de 40C. Deci condiţiile de imobilizare ale enzimei

sunt blânde

Glutaraldehida, utilizată de asemenea ca agent de fixare în histochimie sau pentru

ameliorarea proprietăţilor mecanice ale pieilor în tăbăcării, oferă avantajul de a fi un produs

disponibil la nivel industrial.

Bromcianul este utilizat pentru activarea suporturilor care au grupări de tipul α-glicolice

cum sunt suporturile de natură poliozidică ( dextran, agaroză, celuloză, amidon...). Tratarea

acestor suporturi cu bromcian conduce la obţinerea de imidocarbonaţi care vor reacţiona cu

grupările aminice ale proteinelor pentru a da izo-uree N- substituită.

Această metodă este una dintre cele mai utilizate la nivel de laborator pentru imobilizarea

enzimelor sau a moleculelor aminate (de exemplu în cromatografia de afinitate). În acest context

suporturi preactivate cu bromcian sunt disponibile pe piaţă.

Triazinele sunt utilizate pentru activarea suporturilor care au grupări funcţionale hidroxil

(fig..). Cele mai utilizate triazine sunt : 2,4,6 – tricloro – S – triazina (clorura de cianuril), 2-

amino- 4,6-dicloro – S –triazina, coloranţii Procion M etc. Triazinele fiind produse industriale

este convenabil a fi utilizate pentru prepararea de cantităţi importante de suporturi active în

special de celuloză activă.

Imobilizarea prin legare covalenta. Metode de activare: azotura, carbodiimida

Azotura permite activarea eficace a suporţilor ce posedă grupări de acizi carboxilici.

Metoda de activare cu azotură are loc în câteva etape: esterificarea grupărilor carboxilice cu

metanol în mediu acid, reacţia esterilor formaţi cu hidrazină rezultând hidrazide, tratarea acestora

cu azotit de sodiu pentru a rezulta azotura şi apoi prin reacţia compusului format cu grupările

aminice ale enzimei se obţine imobilizarea enzimei prin legare covalentă de tip amidic.

Carbodiimida este de asemenea un reactiv utilizat pentru imobilizarea unor enzime prin

legarea grupărilor aminice de o grupare carboxil activată de pe suport. Modul de imobilizare este

similar cu cel aplicat pentru sinteza legăturilor peptidice între aminoacizi în prezenţa

carbodiimidei (fig. ). Această reacţie decurge în mediu acid . Dacă se doreşte a se opera în

mediu bazic se poate folosi reactivul K al lui Woodward (N – etil– 5-fenil – izoxazoliu – 3’

sulfat).

Sărurile de diazoniu se pot obţine uşor la suporturile care au grupări funcţionale amine

aromatice prin adăugarea de azotit de sodiu în mediu acid (fig..). Sărurile de diazoniu care se

obţin pot reacţiona cu nucleul fenolic al restului tirozinic sau cu imidazolul din restul histidinic

pentru a forma legături de tip azoic.

Punţi disulfurice se pot stabili între grupările tiol ale suportului şi grupările tiol din

resturile de cisteină ale enzimei. Pentru aceste cazuri suportul, este cel mai adesea activat, prin

intermediul reacţiilor cu dipiridil – 2,2’ – disulfură după care este pus în contact cu enzima de

interes (fig..).

Această metodă reprezintă una dintre puţinele metode de imobilizare prin legare covalentă care

oferă posibilitatea de regenerare a enzimei după dezactivarea sa. Astfel este suficient ca punţile

disulfurice să fie reduse, de exemplu cu ajutorul cisteinei, pentru regenerarea grupărilor tiol ale

suportului şi ale enzimei, după care se poate din nou proceda la imobilizare.

Utilizarea unor substraturi ‘nenaturale’Utilizarea unor substraturi ‘nenaturale’.

Multe enzime sunt mai mult sau mai putin nespecifice pentru substraturile lor naturale. S-

a demonstrat ca unele enzime pot cataliza reactii complet diferite fata de cele considerate ca

reactiile lor normale si reflectate in denumirea si numarul lor dat de EC (Enzymology

Commission). Uneori este necesar ca enzima sa fie plasata intr-un mediu neobisnuit pentru ca ea

sa-si etaleze noi activitati. De exemplu, lipazele in medii ne-apoase actioneaza ca transesteraze.

De asemenea in unele cazuri, aceste schimbari de mediu nu sunt necesare pentru a se descoperi

noi proprietati.

Imobilizarea prin incluziune (polimerizareaIncluziunea constă în includerea mecanică, de obicei ireversibilă, a moleculelor de enzimă într-o

matrice insolubilă. Modalităţile prin care este inclusă enzima într-un suport insolubil pot fi

grupate în două categorii principale : includerea în reţeaua tridimensională a suportului sau

delimitarea, printr-o membrană semipermeabilă, enzimei în interiorul unui volum. Prima

categorie este cunoscută ca polimerizarea enzimei, iar cea de-a doua încapsularea enzimei.

2.1 Imobilizarea prin polimerizare.

În această metodă preparatul enzimatic este dispersat în soluţia de monomeri pentru a

forma un amestec omogen (soluţie sau emulsie). Polimerizarea monomerilor conduce la formarea

unor reţele în interiorul cărora este prinsă enzima.

Prin procese de polimerizare şi/sau copolimerizare se pot obţine produşi cu forme geometrice diferite a purtătorului: granule mici de genul unor bile poroase, tuburi, fibre, filtre poroase, membrane semipermeabile etc Polimerizarea moleculelor de enzimă, în prezenţa unui agent corespunzător, permite obţinerea unui produs cu masă moleculară mare şi solubilitate mică. De exemplu Sumner a obţinut urează insolubilizată prin adăugarea unor cantităţi mici de NaCl la o soluţie de enzimă în alcool 30% şi menţinerea amestecului la 00C timp de 1 – 2 zile. S-a arătat că preparatul rezultat conţine un număr de punţi disulfurice intermoleculare.

Una dintre cele mai cunoscute metode de obţinere a unei enzime incluse prin

polimerizare într-o reţea tridimensională este cea de copolimerizare a acrilamidei cu N,N-metilen-

bis-acrilamida, ultima servind ca agent de înreţelare (fig. ) realizându-se aşa numitul proces de

reticulare a polimerului.

În acest caz reacţia de polimerizare, care se realizează prin intermediul radicalilor, este

iniţiată prin adiţia de persulfat de potasiu (K2S2O8), riboflavină, radiaţii ultraviolete, radiaţii X sau

gama şi accelerată prin adăugarea de N,N,N’,N’ – tetrametiletilendiamină (TEMED). Pentru

limitarea denaturărilor este bine ca această reacţie să se realizeze în absenţa oxigenului şi la

temperaturi scăzute (00 – 250C). Porozitatea şi proprietăţile mecanice ale pot fi controlate prin

varierea concentraţiilor de bisacrilamidă.

Adeseori proteina, pentru copolimerizare cu acrilamida şi N,N-metilen-bis-acrilamida,

este funcţionalizată adică este activată prin adăugarea în structura ei a unor funcţiuni cu capacitate

ridicată de a copolimeriza. De exemplu, în molecula enzimei pot fi introduse duble legături prin

acilare cu clorură de acriloil (CH2=CH–CO–Cl), iar preparatul obţinut este introdus în amestecul

de copolimerizare.

Metoda conduce la un gel activ enzimatic, a cărui activitate creşte cu scăderea dimensiunilor

particulelor de gel datorită creşterii suprafeţei de contact.

Enzime ‘artificiale’

Exista astazi o serie de posibilitati pentru constructia unei enzime artificiale.

Acestea sunt in mod general polimeri sau oligomeri naturali (modificati) sau sintetici cu

activitati asemanatoare enzimelor, fiind cunoscute in general ca sinzime.

Aceste sinzime sunt construite astfel incat pot poseda doua entitati structurale, un situs

pentru substrat si un situs cu activitate catalitica efectiva. Ambele situsuri pot fi proiectate

separat. Experientele au aratat ca producerea situsului pentru legarea substratului este relativ

simpla in timp ce situsurile catalitice sunt oarecum mult mai dificil de realizat. Totusi se pare ca,

daca sinzima poate fi construita cu un situs pentru starea de tranzitie a reactiei, acesta poate

realiza adeseori ambele functii.

Majoritatea sinzimelor asculta de cineticile de saturatie Michaelis-Menten. Pentru o

reactie cu un substrat secventa reactiilor va fi:

sinzima + S (complex sinzima-S) sinzima + P

Unele sinzime sunt simple proteine derivatizate. (Enzimele imobilizate covalent nu intra

in aceasta categorie.) Un exemplu este derivatizarea mioglobinei, transportorul de oxigen din

muschi, prin atasarea ionului (Ru(NH3)5)3+ la trei resturi histidinice de pe suprafata proteinei.

Acest proces converteste mioglobina de la transportor de oxigen la o oxidaza, care catalizeaza

oxidarea acidul ascorbic folosind ca oxidant oxigenul molecular. Aceasta sinzima este aproape la

fel de eficace ca si ascorbat oxidazele naturale.

Este imposibil sa se proiecteze protein-sinzime pornind de la zero, adica direct din

aminoacizi liberi, cu oarece probabilitate de succes, intrucat in prezent doar din structura lor

primara nu pot fi prezise conformatiile lor. In plus, asemenea proteine vor avea suplimentar si

neajunsurile enzimelor naturale, fiind sensibile la denaturare, oxidare si hidroliza.

De exemplu polilizina leaga coloranti anionici ca si albumina serica, dar numai 10% sunt

la fel de puternic legati ca in cazul proteinei naturale, in ciuda faptului ca exista multe sarcini si

lanturi laterale incarcate pozitiv.

Acidul poliglutamic insa arata proprietati sinzimice mult mai apropiate de a unei enzime

naturale. Acesta actioneaza ca o esteraza, in mare masura ca si proteazele acide. De exemplu

pentru hidroliza acetatului 4-nitrofenil, prezinta o frumoasa curba pentru relatia pH-activitate cu o

activitate optima la circa pH = 5,3 si cinetica Michaelis-Menten cu o Km de 2mM si vmax de 10-4 la

10-5 s-1.

Ciclodextrinele (dextrinele Schardinger) sunt compusi ce exista in natura si sunt

reprezentate de molecule toroidale formate din sase, sapte, opt, noua sau zece unitati de D-

glucoza legate -1,4 si unite cap-coada intr-un cerc [-, β-, -, - si ε- ciclodextrine respectiv: ele

pot fi sintetizate din amidon prin intermediul ciclomaltodextrin glucanotransferaza (EC 2.4.1.19)

obtinuta din Bacillus macerans]. Ciclodextrinele difera in diametre si cavitati (ce au valori in jur

de 0,5 – 1 nm) dar toate au in jur de 0,7 nm adancime.

Ciclodextrinele sinzimice sunt in mod obisnuit derivatizate in scopul de a se introduce grupari

eficiente din punct de vedere catalitic. Au fost realizati si analizati numerosi astfel de derivati. De

exemplu, o β-ciclodextrina a fost derivatizata prin legarea covalenta a piridoxal coenzimei

activate de o grupare hidroxil C-6. Sinzima rezultata nu numai ca actioneaza ca o transaminaza

(schema de reactie de mai jos) dar arata de asemenea si o stereoselectivitate pentru L-aminoacizi.

Totusi nu a fost la fel de activa ca si transaminazele naturale.

Polietilenimina este formata prin polimerizarea etileniminei formand o matrice

tridimensionala inalt ramificata. Circa 25% dintre aminele rezultate sunt primare, 50% secundare

si 25% tertiare.

Aminele primare pot fi alchilate rezultand o serie de derivati. Daca 40% din aceste sunt

alchilate cu 1-iodododecan pentru a da situsuri legate hidrofobic si restul sunt alchilate cu 4(5)-

clorometilimidazol pentru a da situsuri catalitice, in general acido-bazice, sinzima rezultata are

27% din activitatea -chimotripsinei fata de esterii 4-nitrofenil. Asa cum s-a putut astepta din

structura sa aparent intamplatoare, ea are o foarte scazuta specificitate esterazica. Alte sinzime

pot fi create in maniere similare.

Anticorpii aflati in starea de tranzitie ceruta de reactia lor specifica, pot actiona ca

sinzime. De exemplu, esterii fosfonati cu formula generala (R-PO2-OR’)- sunt analogi stabili ce

apar in starea de tranzitie a hidrolizei esterilor carboxilici. Astfel anticorpii monoclonali

dezvoltati pentru imunizarea proteinelor conjugate, atasati covalent acesti esteri fosfonati,

actioneaza ca esteraze. Specificitatile acestor anticorpi catalitici (de asemenea numiti abzime)

depind de structura lanturilor laterale [de exemplu R si R’ din (R-PO2-OR’)-] a antigenilor.

Valorile Km si vmax sunt in general destul de joase. Astfel Km sunt majoritar in regiunea

micromoleculara, iar vmax sunt mai mici de 1 s-1, fiind totusi de 1000 de ori mai mari comparativ

cu vitezele de hidroliza determinate doar prin ionii hidroxil neesterificati din mediu.

Cromatografia covalenta -Cromatografia covalentă utilizează interacţiile dintre grupe funcţionale specifice. Metoda se aplică în special pentru purificarea proteinelor şi peptidelor care conţin resturi de cisteină şi/sau metionină. Grupările tiol, unele dintre cele mai reactive grupări din proteine, pot participa la un număr mare de reacţii. Procesul redox prin care grupările tiol trec

reversibil în grupări disulfidice stă la baza purificării proteinelor prin reacţii covalente. Interacţiile dintre compuşii de separat şi faza staţionară sunt de tip covalent. Un material cromatografic utilizat frecvent în această metodă este Tiol-Sepharose 4B care are ataşat la matricea de agaroză grupări de tip tiopiridil prin intermediul glutationului în calitate de grupare de distanţare:

Resturile de cisteină din proteină reacţionează, în prima etapă, cu gruparea tiopiridil formând o

disulfură mixtă. În etapa a doua, la tamponul de eluţie se adaugă un agent tiolic în stare redusă ca

de exemplu 2-mercaptoetanolul sau ditioeritriolul :