Ciclo infeccioso de los virus

Los virus requieren clulas intactas para multiplicarse. En este sentido, las envolturas del virin deben visualizarse como un dispositivo para: 1) proteger al genoma viral durante la fase extracelular del virus, 2) garantizar la entrega del genoma viral a la maquinaria biosinttica celular apropiada. Una vez dentro de la clula, el virus usurpa esta maquinaria para replicar su genoma y producir las protenas del virin. Como consecuencia, la clula, privada de materiales esenciales y expuesta a productos virales potencialmente txicos, muere, al tiempo que la progenie viral es liberada. Este esquema tpico de multiplicacin viral ha sido analizado al detalle en cultivos celulares infectados. En la fig. 1 se muestran las tres etapas tpicas del crecimiento viral en cultivos celulares. Durante un tiempo luego de la inoculacin con el virus parental1

, solo pequeas cantidades de virus pueden detectarse. Este periodo, denominado fase de eclipse, dura unas horas dependiendo del tipo de virus, y en ese lapso el virus parental se adhiere y penetra las clulas. Luego le sigue un intervalo en el cual la progenie viral comienza a acumularse exponencialmente en las clulas o fuera de ellas. Es la fase de maduracin y liberacin. A medida que la cantidad de virus de progenie aumenta, las clulas comienzan a morir y, con ello, decrece la produccin viral (fase de decaimiento). El ciclo descripto describe el comportamiento de virus lticos (e.g que inducen la muerte celular) durante una infeccin productiva, esto es, que resulta en la produccin y liberacin de progenie. La cantidad de virus producido vara con el tipo de virus pero puede oscilar entre 20.000 y 100.000 partculas por clula infectada.

Figura 1. Ciclo infectivo de los virus en cultivos celulares 1 En oposicin al virus de la progenie, producto de la multiplicacin en el cultivo.

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tiempo

fase de eclipse

fase de madura-cin y liberacin

fase de decaimiento

No todos los virus son lticos ni todas las infecciones son productivas, lo cual sugiere que la modalidad del ciclo infectivo es variable. Es ms, algunos virus resultan lticos para algunos tipos celulares y no lticos en otros. El tipo o tipos celulares infectados por un virus se conoce como rango de husped2

La infeccin de clulas susceptibles puede ser productiva, abortiva, restrictiva o latente. La infeccin productiva ocurre en clulas permisivas. Aunque la clula sea susceptible puede no ser permisiva para el virus: el virus puede entrar en la clula pero ningn gen o solo unos pocos genes virales pueden expresarse. En este caso estamos frente a una infeccin abortiva. En otros casos, las clulas pueden ser permisivas transitoriamente y las consecuencias son que el virus permanece en las clulas hasta que las mismas se vuelvan permisivas, o bien solo una fraccin de las clulas de la poblacin producen virus en un momento determinado. Este tipo de infeccin se conoce como restrictiva. En la infeccin latente, el genoma viral persiste pero no existen partculas virales dentro de la clula. En algunos casos de persistencia viral, los genes virales interfieren con las funciones celulares que controlan el crecimiento resultando en la transformacin celular. No solo la clula no se muere como producto de la infeccin sino que la misma se multiplica descontroladamente.

. Existen virus con rangos de husped amplios, mientras que otros solo pueden infectar un tipo celular (o especie animal). La capacidad de un tipo celular (o especie animal) de ser infectado por un virus viene especificado por el trmino susceptibilidad. As, podemos decir que las clulas epiteliales son susceptibles al virus influenza A, o que el ratn no es susceptible al herpesvirus bovino. Que un tipo celular sea susceptible a un virus no implica necesariamente que produzca y libere progenie viral. La capacidad de un tipo celular de garantizar la multiplicacin completa del virus se indica con el trmino permisividad.

La cadena de eventos que ocurren desde que un virus toma contacto con una clula, hasta la progenie viral la abandona, se denomina ciclo infeccioso celular y, para su estudio, se ha dividido en las siguientes fases: 1. Adhesin/Anclaje: Las protenas de cpside o envoltura del virus establecen su primer interaccin con una molcula celular.

2 Tambin se usa el trmino para indicar la especie o especies animales infectadas por el virus.

2. Entrada: Componentes del virin cruzan la barrera de la membrana citoplasmtica. 3. Denudamiento: Liberacin del cido nucleico en el sitio de replicacin 4. Replicacin: Produccin de nuevas protenas y cidos nucleicos virales para formar nuevos viriones 5. Ensamble o ensamblaje: Reunin y ordenamiento de todos los componentes virales neosintetizados para la formacin de nuevos viriones 6. Maduracin: Reorganizacin de algunos componentes del virin para que se convierta en infectivo 7. Egreso/Salida: Liberacin de los nuevos viriones al espacio extracelular Adhesin Receptor: Molcula a la que el virus se une para ingresar a una clula. Para algunos virus el receptor es la nica molcula con la que necesita interactuar para entrar en la clula. Para otros, solo la unin al receptor no es suficiente para desencadenar el ingreso, en estos casos requieren la interaccin con otras molculas de la superficie celular, a las cuales se las denomina Correceptores. La susceptibilidad de una clula a la infeccin depende de la disponibilidad de receptores (y correceptores) en la superficie celular. Las clulas de pollo no son susceptibles a la infeccin con el virus de la polio (RNA, Picornaviridae) porque no poseen receptores para el virus. Pero si se inyecta el genoma viral dentro de estas clulas, se produce progenie viral en gran cantidad. Por lo tanto, las clulas de pollo son permisivas a la infeccin. Evolutivamente los virus parecen haber seleccionado como receptores molculas que son muy abundantes en las clulas del husped (incluyendo las permisivas y las no permisivas) o aquellas que solo estn presentes en determinado tipo celular (a pesar de que otros tipos celulares puedan ser permisivos). Por ejemplo, el virus de influenza utiliza como receptor una molcula de cido silico la cual esta ampliamente distribuida por el organismo, sin embargo no todas las clulas del cuerpo son permisivas, en este caso el tropismo esta determinado por factores intracelulares. En las cepas altamente patgenas de influenza aviar, uno de los principales factores

implicados en la patogenia, es la capacidad de estas cepas de aumentar su tropismo, e infectar productivamente rganos que comnmente no son afectados por las cepas de baja patogenicidad, que slo tienen tropismo respiratorio y digestivo. En otros casos, como el Virus de Hepatitis B (HBV) o los Virus de Inmunodeficiencia Humana (HIV) y Felina (FIV), los receptores solo estn presentes en un determinado tipo celular (hepatocitos y clulas de sistema inmune respectivamente) lo cual no implica que sean las nicas clulas permisivas. Vemos entonces que el tropismo de un virus por determinado tejido no es solamente causa de la presencia o ausencia de receptores en la membrana celular. Debido a que los receptores son molculas con variada funcin celular, la unin a ellas no solo permite la entrada del virus sino que, en muchos casos, desencadena una cascada de seales citoplasmticas que favorecen la infeccin. La interaccin virus-receptor, puede ser de tres tipos:

A. Receptor simple: un solo receptor es el mayor responsable del ingreso a la clula. Es el caso del receptor Pvr de Poliovirus, y el cido silico para Influenza (Fig 2)

Figura 2. Estructura del Acido Silico. Molcula utilizada como receptor por el virus Influenza

B. Co-receptor: hay un receptor principal pero se requiere de otra molcula para asegurar la entrada. En HIV la protena gp 120 se une al receptor CD4 en todas la clulas que infecta. Pero aquellas cepas que infectan macrofagos requieren de la interaccin con Ccr5 para poder ingresar al citoplasma. Las cepas que infectan linfocitos T utilizan tambien gp120 como receptor pero un correceptor distinto (CXCr4). (ver fig.3)

Figura 3. Receptores y Correceptores utilizados por distintas variantes de HIV

C. Receptores alternativos: Un virus puede utilizar ms de un receptor en

el animal o en diferentes especies animales. El virus rbico se une al receptor de la acetilcolina en la placa neuromuscular, pero tambin utiliza las NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) para ganar acceso al SNC. Tambin es posible que algunos virus que poseen baja afinidad por un receptor que no es el habitualmente utilizado, muten sus protenas de superficie hasta alcanzar una afinidad igual o mayor a la que tenan por su receptor original. Esto puede lograrse en el laboratorio infectando clulas que normalmente no son susceptibles luego de varios pasajes ciegos o muchas veces es lo que ocurre cuando los virus saltan de especie e infectan huspedes que no eran susceptibles con anterioridad.

Los virus tambin pueden ingresar a clulas que no posean receptores especficos mediante dos procesos: por fusin de clulas sanas con clulas infectadas y por medio de la formacin de complejos antgeno-anticuerpo que luego son fagocitados por clulas permisivas.( ver fig. 4) Fig. 4. Vias de entrada alternativas. ADEV (entrada mediada por anticuerpos) FMDV (Virus de Fiebre Aftosa) EBV ( Virus Epstein Barr ) Entrada En algunos casos la entrada y el denudamiento pueden estudiarse como eventos diferentes, pero en otros, puede considerarse que ocurren en simultaneo. Es ampliamente aceptado que la membrana plasmtica no es permeable a partculas del tamao de los virus, sin embargo los virus deben atravesarla sin producir dao en la misma, y de esta forma, mantener la integridad celular. Para esto, utilizan mecanismos de transporte que la clula normalmente utiliza para incorporar grandes molculas.

La clula posee mecanismos inespecficos (fagocitosis, pinocitosis) y especficos (endocitosis mediada por receptor) para ingresar partculas al citoplasma. Todos estos procesos no son pasivos sino que requieren un gasto de energa e involucran procesos fisiolgicos de la clula como endocitosis, fusin de membranas, transporte al ncleo, etc. La mayora de los virus ingresan en las clulas por mecanismos especficos, especialmente endocitosis mediada por receptor. Virus Envueltos Todos los virus envueltos deben fusionar su envoltura con alguna membrana celular para poder ingresar a la clula. En algunos casos la fusin ocurre a nivel de la membrana citoplasmtica (fig. 5a y b) y en otros puede ocurrir a nivel endosomal o lisosomal (fig. 5c). Pero la fusin de membranas no es un proceso que ocurre al azar. Ocurre todo el tiempo dentro de las clulas o incluso entre clulas y por lo tanto esta finamente regulado. De otro modo las clulas constantemente se fusionaran entre s, las organelas celulares se fusionaran y la clula sera un caos. Incluso los virus envueltos se fusionaran entre s y perderan infectividad. Todas las membranas (celulares y envolturas virales) contienen protenas integrales que pueden interactuar con protenas de otras membranas. Alguna de estas protenas portan lo que se conoce como pptido de fusin, una porcin hidrofbica capaz de anclarse a otra membrana y permitir el acercamiento estrecho de las mismas. El pptido de fusin no esta siempre expuesto y listo para ejercer su funcin, sino que se encuentra oculto o enmascarado dentro de la protena hasta que algn estimulo especifico (cambio de PH, accin enzimtica, interaccin con otras protenas) produzca un cambio conformacional y lo exponga. Muchas de las reacciones de fusin de membrana que ocurren normalmente dentro de la clula, fueron esclarecidas a partir de estudios con protenas de fusin virales. En algunos casos el pptido de fusin puede estar en la misma protena que el virus utiliza para su anclaje y en otros estar en una protena distinta (tambin de envoltura), veremos ejemplos de estas variantes a continuacin.

Figura 5. Diferentes mecanismos de entrada a la clula. Entrada por fusin a nivel de membrana plasmtica Protenas de anclaje y fusin separadas: El ejemplo mas estudiado de medicina veterinaria son los Paramixoviridae (Distemper, Newcastle). La protena HN es la encargada de proveer el anclaje a la clula y la protena F es la portadora del pptido de fusin. Como puede verse en la Fig. 6a, F tiene dos subunidades F1 y F2. El pptido de fusin se encuentra en el extremo de la porcin F1 oculto por la porcin F2. Para algunos paramixovirus, la sola interaccin de HN con su receptor parece ser suficiente para provocar un cambio conformacional de F de modo que el pptido de fusin puede insertarse en la membrana celular. En otros paramixovirus, esta comprobada la necesidad de una segunda protena celular que interacta con F y es responsable del reordenamiento proteico que conlleva a la fusin. Este proceso ocurre siempre a PH neutro por lo tanto debe estar muy bien regulado para que ocurra en tiempo y lugar correcto.

Figura 6. Mecanismos de fusin a nivel de membrana citoplasmtica. Una nica protena como mediadora de anclaje y fusin: un ejemplo de virus que utilizan esta estrategia es el de los Retroviridae. (fig. 6b) La glicoprotena Env est formada por 2 subunidades, SU y TM (portadora del pptido fusin). Reconoce su receptor a travs de SU y en ese momento se produce un desplazamiento de las subunidad TM que permite acercar el pptido de fusin a la membrana celular. Este modelo se aplica, por ejemplo, al Virus del sarcoma y luecosis aviar (ASLVs) mientras que los virus FIV y HIV necesitan que la SU interacte, adems, con un correceptor (CCR) para que se produzcan los cambios en la TM. Entrada por va endoctica Otros virus envueltos entran por endocitosis mediada por receptor y por lo tanto deben traspasar, en este caso, la membrana endosomal para ingresar al citoplasma (fig. 5c). El caso mas ampliamente estudiado y que tomaremos como ejemplo es el del virus Influenza.

Este virus interacta con su receptor (Acido Silico) por medio de su principal glicoprotena de envoltura, la hemoaglutinina (HA) (fig. 7). Esta protena fue una de las primeras protena de fusin descubiertas y por ende fue estudiada en detalle. La HA se encuentra en la envoltura del virus formando un homotrmero (tres protenas idnticas), en el cual cada monmero presenta dos subunidades (HA1 y HA2) unidas por un puente disulfuro. HA1 forma una cabeza globular y contiene el sitio de reconocimiento para el receptor, es la porcin genticamente ms variable de la protena y sus mutaciones son las responsables de las variantes antignicas que ao tras ao escapan a la inmunidad adquirida por la poblacin. HA2 tiene forma fibrilar, uno de sus extremos contiene una porcin de trasmembrana responsable de la unin a la envoltura y el otro contiene el pptido de fusin en una regin que se encuentra oculta por HA1 cuando el virus se encuentra fuera de la clula.

Fig. 7. Estructura de la protena HA de Influenza.

Cuando HA1 toma contacto con el receptor se produce una cascada de sealizacin intracelular que desencadena la endocitosis (fig. 8). Una vez formado el endosoma, el mismo se acidifica por importacin de iones H+ y este cambio de PH produce un cambio conformacional de la HA dejando expuesto el pptido de fusin lo que desencadena la entrada de las Ribonucleoprotenas virales (vRNPs) al citoplasma. En este caso se produce en simultaneo el denudamiento que tambin es dependiente de PH. La envoltura viral contiene una protena M2 que es un canal de iones (el ms pequeo descripto hasta el momento) por lo tanto a medida que se acidifica el endosoma tambin lo hace el interior del virin y como consecuencia las vRNPs se disocian de la protena de matriz M1 quedando libres para poder ingresar al ncleo.

Figura 8. Mecanismo de fusin de virus Influenza Virus No Envueltos Los virus carentes de envoltura deben traspasar las membranas celulares sin la posibilidad de utilizar un proceso de fusin. Deben romper estas barreras sin comprometer la integridad de la clula de la cual depende para su posterior replicacin. Se reconocen entonces dos mecanismos principales para sortear este obstculo, producir pequeos poros en las membranas o desintegrar

algn componente membranoso que no sea vital para la clula (p.e. el endosoma). Para graficar estos mecanismos presentaremos algunos ejemplos. Ruptura de la membrana endosomal: Un caso bien estudiado de virus que utilizan esta estrategia es el de los Adenoviridae. Recordemos que la cpside de los mismos se caracterizan por poseer protenas que protuyen de la misma en forma de fibras (protena IV) (ver fig. 9). El extremo de dichas fibras es el encargado del reconocimiento del receptor, mientras que la parte basal se encuentra anclada a un pentmero de una segunda protena que recibe el nombre de base pentamrica (protena III). Esta ultima es responsable del reconocimiento del correceptor, evento indispensable para desencadenar la endocitosis del complejo. Una vez dentro del endosoma, y como consecuencia del descenso de PH, la cpside se disgrega parcialmente y alguna/s protena/s que se desprenden (aparentemente la III) tedran una funcin ltica de membrana activada por cido. De esta forma el endosoma pierde su integridad y es resto del virin gana el acceso al citoplasma.

Figura 10. Mecanismo de entrada utilizado por Picornaviridae

Figura 9. Entrada de Adenovirus

Poro en la membrana plasmtica: Otros virus desnudos como es el caso de los Picornaviridae (virus de Poliomelitis y Fiebre Aftosa) utilizan este tipo de estrategias un poco mas conservadoras(fig. 10). La interaccin de la protena VP1 con el receptor altera la estructura del virin exponiendo regiones de la cpside que hasta entonces se encontraban ocultas. Se pierde la VP4 que es una protena de cpside interna con funciones de estabilizacin y quedan expuestas regiones de VP1 que son altamente hidrofbicas y tienen capacidad de insertarse en la membrana. De esta manera se forma un poro por el cual puede ingresar el vARN unido solo a la protena VPg. Como puede deducirse en este caso tambin entrada y denudamiento son simultneos. Para el caso de Poliovirus esta reorganizacin de la cpside parece ser independiente de PH y por lo tanto puede llevarse a cabo a nivel de la membrana citoplasmtica sin necesidad de endocitosis. Sin embargo, para el Virus de Fiebre Aftosa, los cambios estructurales de VP1 solo se produciran a PH cido una vez dentro del endosoma. Denundamiento a nivel del lisosoma: Como vimos en ejemplos anteriores, muchos virus entran a la clula utilizando la va endoctica, y la mayora abandonan la misma antes de llegar al compartimento lisosomal. Esto es lgico ya que los lisosomas portan proteasas y nucleasas que degradaran el material viral. Contrariamente, otros, como los Reovirus (p.e. Virus de Lengua Azul) toman provecho de estas enzimas lisosomales. Este virus se caracteriza por tener una doble cpside muy resistente y por lo tanto tambin bastante difcil de desacoplar. La cpside es atacada parcialmente por proteasas lisosomales, quedando entonces expuestas regiones que antes no lo estaban (fig. 11). Las protenas que resisten la accin del lisosoma protegen al ARN de la accin de las nucleasas y junto con el mismo conforman lo que se conoce como partcula subviral infecciosa (ISVP), que por mecanismos aun no aclarados es capaz de atravesar la membrana del lisosoma. Experimentos realizados con partculas subvirales aisladas demuestran que las mismas son capaces de permeabilizar membranas y permitir el paso de distintas toxinas o incluso traspasar directamente la membrana citoplasmtica y ser infectivas (aunque este no es su mecanismo natural de infeccin).

Figura 11. Entrada de reovirus a nivel del lisosoma.

Transporte hacia el ncleo Para aquellos virus de replicacin citoplasmtica hemos visto como acceden directamente al lugar indicado sin necesidad de pasos adicionales. La mayora de los virus ADN y algunos ARN como Retrovirus e Influenza requieren adems que sus cidos nucleicos ingresen al ncleo para su replicacin, comportndose la membrana nuclear como una nueva barrera semipermeable que cruzar.

Para cumplir este objetivo pueden sencillamente esperar que la membrana nuclear se disgregue como ocurre durante el proceso de mitosis de la clula (p.e. Oncoretrovirus). Como consecuencia de ello, esto virus solo podrn replicar en clulas en divisin. Pero la mayora de estos virus que deben llegar al ncleo utilizan un mecanismo mucho mas especfico que, una vez mas, es propio de la fisiologa de la clula. Recordemos que la estructura de la membrana nuclear esta conformada por una doble bicapa lipdica interrumpida por poros, los cuales permiten el paso selectivo de determinadas macromolculas hacia un lado u otro de la membrana mediante mecanismos finamente regulados. Todas las protenas celulares son sintetizadas en el citoplasma pero algunas cumplen su funcin en el ncleo (p.e DNA polimerasa) y por lo tanto deben ser importadas dentro del mismo. Para ello estas protenas portan seales de localizacin nuclear(NLS), regiones de aprox. 20 aminocidos de carga bsica, que van a ser reconocidas por otras protenas (importinas) encargadas de transportarlas dentro del ncleo. (ver Fig. 12)

Figura 12. Entrada al ncleo. Complejo del poro nuclear.

Muchos virus tienen entre sus protenas (p.e, NP de Influenza), motivos que imitan a las NLSs y que permanecen unidas al cido nucleico u a otras protenas virales que deben ingresar al ncleo. De esta forma la importinas celulares ingresan esta protena (y todo lo que permanezca unido a ella) al ncleo. Otros retrovirus, los Lentivirus, no requieren clulas en divisin sino que tambin poseen protenas estructurales con NLSs (en este caso la integrasa) Tambin hay virus que tienen un mecanismo propio, independiente de los celulares, para colonizar el ncleo. El ejemplo tpico es el de los Adenovirus en los cuales alguna protena de cpside tiene afinidad por protenas que conforman el poro nuclear, se unen al mismo y el genoma es inoculado en el interior del ncleo. (ver Fig. 9) Replicacin

Cualquiera sea el virus que se trate, todos deben ser capaces de ofrecer sus mRNAs al aparato de traduccin celular. Recordando la variabilidad genmica viral, tenemos que tener en cuenta que 1) las clulas carecen de las enzimas para producir mRNA a partir de RNA, por lo tanto, los virus RNA deben poseer alguna estrategia para suplir el dficit, 2) las clulas no pueden replicar DNA en el citoplasma. Por lo tanto, solo los virus DNA que replican en el ncleo (y la mayora lo hacen) pueden aprovechar la maquinaria celular para generar mRNA. 3) el aparato celular de traduccin solo es capaz de operar con transcriptos monocistrnicos ya que no reconoce sitios internos de iniciacin de la traduccin. Por lo tanto, los virus deben sintetizar un mRNA individual para cada protena. De lo contrario, como ocurre en muchos virus RNA, se sintetiza un solo mRNA que sirve para la sntesis de una poliprotena la cual es luego clivada para generar las protenas virales individuales. 4) las clulas tienen sus propios mRNAs. En la infeccin los virus deben imponer sus propios mRNAs ya sea otorgndoles una ventaja competitiva o selectivamente bloqueando los mRNAs celulares.

Los virus RNA pueden ser de dos tipos: de polaridad positiva (+) y de

polaridad negativa (-). Los genomas de polaridad (+), una vez dentro de la clula, operan directamente como mRNA, esto es, se unen a los ribosomas y son traducidos a protena. Los de polaridad (-) no pueden ser ledos directamente por los ribosomas y deben ser primero copiados a mRNA. Un corolario de esta diferencia es que, cuando se introduce el genoma purificado de un virus RNA (+) en clulas, el mismo es infeccioso, generando progenie

viral. Por el contrario, siguiendo el mismo procedimiento, los genomas de virus RNA (-) no son infecciosos. Esto sucede porque las enzimas necesarias para transformar RNA (-) en (+) se encuentran en el virin y son excluidas cuando se introduce el genoma purificado.

A continuacin, describiremos las principales estrategias replicativas de los

virus, basndonos para ello en la clasificacin de Baltimore, lo cual permitir un estudio mas ordenado. El fundamento de la clasificacin de Baltimore se basa en como los virus generan su mARN. Por lo tanto recordando a que grupo pertenece cada virus se podra tener una idea de cmo ser su replicacin. Clasificacin de Baltimore Grupo I : Virus ADN doble cadena Grupo II: Virus ADN simple cadena Grupo III: Virus ARN de doble cadena Grupo IV: Virus ARN de polaridad (+) Grupo V: Virus ARN de polaridad (-) y de doble sentido Grupo VI: Retrovirus

cadena (+)RNA parental

sntesis depoliproteina

cadena (-) de RNA

cadena (+) de RNA

progenie

clivaje

cadena (+)RNA parental

cadena (-) de RNA

cadena (+) deRNA progenie

progenie

proteinas no estructuralesdel extremo 5del genoma

cadena (+) de RNA

proteinas codificadasen el extremo 3del RNA genmico

1) Virus RNA (+), Clase IV Cuando estos virus se desnudan, el genoma es directamente traducido a protena en los ribosomas. O sea que el primer paso en la replicacin es la TRADUCCIN (Fig. 13). El producto de la traduccin es siempre 1 (una) protena, ya que el aparato de traduccin celular, como ya mencionramos, solo produce una protena de un mensajero (monosistrnico). Picornavirus y Flavivirus: En estas flias, en realidad, lo que se traduce directamente del mRNA es una poliprotena que es luego clivada en protenas individuales. Para el aparato de traduccin es una sola protena ya que solo tiene un codn de inicio y uno de stop y por lo tanto se traduce de corrido. Pero, por autoclivaje, la misma genera fragmentos cada uno con funcionalidad distinta (enzimas, cpside) (Fig. 14) El RNA es, adems, utilizado como templado para la sntesis de RNA (-) complementario, por accin de la polimerasa viral, uno de los productos de clivaje de la poliprotena. El RNA (-) sirve a su vez de templado para generar copias de RNA (+) (RNA genmico). El RNA (+) se usa: 1) para sintetizar ms poliprotena, 2) de templado para producir ms RNA (-), 3) como genoma viral para su encapsidacin (Fig. 15) Figura 13 . Diagrama de la replicacin de virus RNA (+). A la izquierda se muestra el caso de los virus RNA (+) que codifican un nico mRNA de tamao genmico. A la derecha se muestra la replicacin de aquellos que codifican para un mRNA de tamao genmico y, adems, uno o ms mRNAs subgenmicos.

Fig. 14. Mapa gentico y clivaje de la poliprotena de Picornaviridae.

Figura 15. Replicacin del genoma de Picornaviridae

Togavirus, coronavirus y calicivirus usan una estrategia distinta. El genoma de estos virus en realidad mRNA polisistrnico, o sea, contiene varios codones de inicio con sus respectivos stops. Es decir, contiene varios marcos abiertos de lectura (ORFs). Al denudarse las partculas, solo el codn de inicio ms cercano al extremo 5`, podr ser reconocido como tal y por ende ser traducido. Los productos de este primer round de sntesis copian (transcriben) el RNA genmico en un RNA (-) el cual sirve de templado para formar dos tipos de molculas RNA (+): a) mRNAs de largo subgenmico que codifica para los genes no traducidos en el primer round de sntesis, nuevamente, cada uno utilizado como mRNA monosistrnico b) RNA (+) de largo genmico que es empaquetado en viriones (Fig 13 y 16). En el caso de los Togavirus, solo contienen 2 ORFs pero los Coronavirus, por ejemplo, contienen varios mas. (fig. 17) Este tipo de estrategia permitira al virus una produccin mas secuencial de los distintos tipos de protenas, retrasando, por ejemplo, la sntesis de protenas de cpside o envoltura (reconocidas por el sistema inmune) hasta tanto haya garantizado la replicacin del genoma.

Figura. 16. Replicacin de Togavirus

Fig. 17. Organizacin Genmica y transcriptos de Coronavirus 2 Virus RNA (-), Clase V Los virus RNA (-) poseen genomas RNA de simple cadena, monopartito (una sola molcula) o segmentado (mas de una molcula). Cuando un virus RNA (-) penetra en la clula, debe transcribirse para generar RNAs (+). Como adelantbamos, las clulas carecen de enzimas para copiar RNA a partir de RNA. Por lo tanto, la enzima viene incorporada en el virin como una protena estructural ms (RNA pol RNA dependiente). El primer paso en la

replicacin de estos virus es la transcripcin mediada por una enzima viral. La transcripcin genera varios mRNAs (subgenmicos) que son traducidos. Tambin se forman cadenas (+) de longitud genmica que sirven de templados para generar nuevos RNAs (-) . (Fig 18)

Figura 18. Replicacin de virus RNA (-).

Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), es el prototipo de virus RNA (-) monopartito, dentro de los cuales se encuentran muchos virus de inters veterinario y zoontico. Como, a pesar de pertenecer a flias distintas, tienen estrategias replicativas similares, se los ha agrupado bajo el Orden Mononegavirales. Dentro de la clula, la RNApol de VSV comienza a sintetizar RNA de polaridad +, partiendo siempre desde el extremo 3` del RNA genmico (ver Fig. 19). Cuando la enzima llega a la regin intergnica encuentra una secuencia que la hace tartamudear y de esta manera genera un poliA, con la liberacin de un mRNA y, al azar, puede continuar con la generacin del prximo mRNA o liberarse y empezar de nuevo del extremo 3`. Esto genera mRNAs y por ende protenas en las siguientes proporciones N>NS>M>G>L. Cuando hay una concentracin alta de N en el citoplasma la misma se va complejando con el vRNA y evita que la RNApol tartamudee. De esta manera no se generan poliAs ni interrupciones y comienza a producir RNA

enzimas del virin

cadena (-)RNA parentalsegmentado

(+) mRNAs proteinas

segmentosde RNA (+)

Cadena (-)RNA progenie

progenie viral

(+) de lago genmico que servirn como molde para los RNAs () genmico que sern parte del virin. Figura 19. Estructura y replicacin de VSV Virus de Influenza, es el virus RNA (-) segmentado de mayor importancia. Cada segmento contiene un gen, por lo tanto al ingresar en la clula cada uno es transcripto por la RNApol viral en un RNA (+) que funciona como mRNA. Dos de los ocho mensajeros generados deben sufrir splicing para poder expresar todas las protenas virales (8 segmentos dan origen a 10 protenas). Como el virus no porta ni codifica ningn factor de splicing se ve obligado a ingresar al ncleo para tener acceso a la maquinaria de splicing celular, a pesar de ser un virus RNA. (ver Fig. 20)

Figura 20. Orthomyxovirus Replicacin nuclear De virus Influenza 3 Virus RNA de doble sentido, Clase V Los arenavirus (dos segmentos de RNA (-)) y unos pocos miembros de los bunyavirus (tres segmentos RNA (-)) contienen RNA de doble sentido. Ntese que a pesar de que parte de su genoma es de polaridad (+) y podra ser traducido directamente, se encuentran agrupados con los RNA (-) porque el primer paso en la replicacin es la transcripcin dependiente de una enzima viral. (Fig. 21) Primero se forma RNA (+) de tamao subgenmico, a partir de la regin de polaridad (-) que se utiliza como mRNA para la sntesis de ciertas protenas. Estas protenas se encargan de sintetizar RNA de largo genmico, el cual sirve de mensajero para la sntesis de las protenas que estn codificadas en la regin (+) y como RNA progenie. (Fig. 22)

Figura 21. Esquema replicativo de virus ARN doble sentido.

Figura 22. Replicacin de Arenavirus

4 Virus RNA de doble cadena, Clase III Este grupo est integrado por los Reovirus y los Birnavirus cuyos genomas poseen 10 a 12 segmentos de doble cadena. A pesar de que cada segmento posee una hebra de polaridad (+), la estabilidad de este tipo de molculas impide la separacin completa de las hebras, lo cual sera necesario para que cumpla funcin de mRNA. Entonces necesitan generar RNAs simple cadena (+) para comenzar a producir protenas. Esta accin solo puede ser llevada a cabo por una RNApol incluida en el virin. En el caso particular de los Reovirus, esto ocurre dentro de la cpside que nunca se desensambla totalmente. (ver Fig. 23) Los mRNAs resultantes son traducidos a protenas y/o se ensamblan parcialmente con las protenas de la cpside y all sirven de templados para la sntesis de la cadena complementaria. El resultado es la formacin de segmentos de doble cadena.

Figura 23. Ciclo replicativo de Reovirus

5 Virus DNA, Clase I y II La mayora de los virus DNA se replican en el ncleo. Como estos virus hacen uso de la maquinaria de transcripcin celular, el DNA viral purificado introducido en las clulas suele ser infeccioso (aunque no esta muy claro como son dirigidos al ncleo). Los virus DNA simple cadena, como los Parvovirus, pueden portar la cadena de polaridad (+) o (-) indistintamente, ya que una vez en el ambiente nuclear son reparados por enzimas celulares transformndose en doble cadena. Como regla general, cuanto ms corto sea el genoma del virus ms dependiente ser de la replicacin celular. Siguiendo con el ejemplo de los Parvovirus, requieren infectar clulas que estn en divisin ya que ni siquiera codifican una DNA polimerasa entre sus genes. Otro rasgo comn a muchos virus DNA, es la expresin temporal de genes, es decir, 2 o mas ciclos de transcripcin de protenas virales. En los primeros ciclos se transcriben genes relacionados con el control de la expresin gnica viral, el control del ciclo celular o la replicacin del genoma viral. En fases mas tardas de transcripcin se originan los mRNAs para las protenas estructurales del virin. (Figs. 24 y 25)

Fig. 24. Ciclo replicativo de Herpes Simplex Humano

Fig. 25 Los genes expresados en forma temprana suelen estar bajo el control de promotores muy potentes y utilizar factores de transcripcin celulares mientras que los tardos, dependen de la presencia de alguna protena viral (temprana) como factor para permitir su transcripcin. Una importante excepcin dentro de los virus DNA la constituyen los Poxvirus, los cuales se replican en el citoplasma. Por lo tanto, estos virus codifican para todos los factores necesarios para la transcripcin y replicacin del genoma. No sorprende entonces que los poxvirus posean los genomas ms grandes dentro de los virus animales. 6 Retrovirus, Clase VI Los retrovirus contienen un genoma bipartito de RNA, dos segmentos idnticos de simple cadena. Por lo tanto, el genoma de los retrovirus es

diploide. Las partculas de estos virus contienen una enzima, la transcriptasa reversa (RT), capaz de sintetizar DNA a partir de RNA. Luego de la infeccin, el RNA viral es convertido en DNA lineal de doble cadena (DNA Copia (cDNA)) por la RT en el citoplasma (ver Fig. 26). El DNA viral es luego traslocado al ncleo donde se integra en los cromosomas celulares tambin por accin de una enzima estructural (integrasa). A partir del genoma integrado se sintetizan RNAs de largo genmico as como mRNAs mas cortos (por splicing) que son traducidos a poliprotenas y protenas virales como si fuera cualquier gen celular. Las poliprotenas son luego clivadas por proteasas virales (fig. 27). Algunos retrovirus codifican sus propios factores de transcripcin que regulan el orden temporal de expresin y la abundancia de las protenas virales.

Figura 26. Replicacin en Retroviridae. 7 Hepadnavirus (fig. 28) La estrategia replicativa de esta familia se aclar recientemente, es por eso que ha quedado fuera de la clsica clasificacin de Baltimore. El genoma de este virus esta compuesto por DNA lineal con una cadena de polaridad (-) completa y otra de polaridad (+) incompleta. Se dice que es doble cadena parcial. Adems, porta en el virin una enzima retrotranscriptasa parecida a la de los retrovirus. Pero siendo un virus DNA, para qu necesitar una RT para replicar?. Una vez dentro de la clula el DNA ingresa al ncleo donde enzimas celulares se encargan de completar la hebra (+). Luego la molcula se circulariza pero no se integra al genoma celular. Puede

quedar como episoma dentro del ncleo por mucho tiempo produciendo infecciones persistentes. A partir de esta molcula doble cadena circular de DNA se generan los 4 mRNAs que son exportados al citoplasma para ser traducidos a protenas virales. Uno de estos mRNAs, llamativamente, tiene un largo mayor al genmico y se lo denomina pregenmico ya que va a ser retrotranscripto a DNA por la RT. Este DNA sintetizado en el citoplasma puede reingresar al ncleo para generar nuevos mRNAs o ensamblarse con el resto de los componentes del virin para salir de la clula.

Figura 27. Ciclo replicativo de Retroviridae

Figura 28. Replicacin de Hepadnavirus Ensamblaje Ya sea en el ncleo o en el citoplasma, un virus debe generar todos los componentes de los nuevos viriones. Pero tambin debe ser capaz de asegurar la correcta reunin de todos sus componentes que estn diseminados dentro de la clula y, adems, entremezclados con protenas, cidos nucleicos y membranas celulares. Estos componentes virales, son procesados por la clula mimetizados como elementos propios de la misma y es as que sufren modificaciones y siguen las rutas normales de cualquier molcula celular.

Vemos, entonces que el proceso de ensamblaje tambin depende de la maquinaria celular, no solo para la sntesis sino tambin para transportar todas las partes hacia el sitio indicado y de esta forma generar un microambiente favorable (altas concentraciones de todos los componentes del virin en el mismo sitio y al mismo tiempo). Formacin de envoltura Los virus envueltos deben utilizar como envoltura alguna membrana de origen celular, ya que ningn virus posee maquinaria biosinttica de lpidos. Todas aquellas protenas virales que formen parte de la envoltura, y que tendrn, entonces, como destino final una membrana, debern ingresar al sistema reticuloendoplsmico cuando sean traducidas (fig. 29). Para ello, al igual que las protenas celulares de membrana, las mismas debern portar un pptido seal (20 aa, hidrofbico) que indica a la clula que la protena naciente debe continuar su traduccin en el retculo endoplsmico rugoso. Una vez dentro de este compartimento podr sufrir todas las modificaciones postraduccionales que caracterizan a una protena celular como glicosilacin, formacin de puentes disulfuro, plegamiento, oligomerizacin (muchas protenas virales son oligomeros), etc. Una vez que salen del RE viajan por la clula a travs del sistema de transporte vesicular, pasando por el golgi en donde son direccionadas al compartimento adecuado. En la mayora de los virus la membrana citoplasmtica es el sitio de formacin de la envoltura. En algunos casos (p.e. herpesvirus) la envoltura se adquiere a partir de membranas internas. Esto traera aparejada la ventaja de no exponer las protenas de envoltura en la superficie celular donde podran ser reconocidas por el sistema inmune. Ensamblaje de la cpside La cpside es una estructura metaestable, debe tener la suficiente robustez para proteger el material gentico viral en el medio ambiente extracelular y tambin tener la suficiente debilidad para ser desensamblada rpidamente una vez dentro de la clula. En algunos casos, la formacin de la cpside esta coordinada con la asociacin de ciertas protenas virales al cido nucleico (Ensamble coordinado). En otros, se forma primero una estructura enteramente proteica que luego va a incorporar al cido nucleico (Ensamble Secuencial).Comparado con otros pasos del ciclo replicativo, la formacin de la cpside es relativamente simple.

Las unidades estructurales (capsmeros) tienen un numero limitado de protenas (entre 2 y 6 para la mayora de los virus) que

Figura 29. Trfico de protenas virales dentro de la clula

deben asociarse correctamente. Luego estos capsmeros deben asociarse entre s. Sin embargo, en algunos casos, protenas adicionales son necesarias para asistir estas asociaciones. Ensamblaje a partir de protenas individuales: Esta estrategia es

utilizada por muchos virus. Las protenas de cpside intecatan entre si al azar, sin necesidad de interactuar con otras protenas. De esta forma la estructura ms probable de dicha interaccin es la que corresponde a la cpside. Este tipo de cspides puede ser reconstituido in vitro si ponemos todas las protenas constitutivas en un mismo tubo. Las protenas virales sintetizadas individualmente deben encontrarse dentro del espacio intracelular donde tambin hay altas concentraciones de protenas celulares. Entonces, la probabilidad de que ocurran interacciones inespecficas es alta, por lo que las protenas virales deben generarse en

exceso, es decir, se sintetiza mucha mas protena de cspide que la que sale de la clula. Un ejemplo claro de esto, es el de Adenovirus (fig 30A). La protena IV y la protena III se sintetizan independientemente en el citoplasma. Luego 3 protenas IV se renen y forman un trmero y 5 protenas III forman un pentmero, ambos caspsmeros luego se encuentran para formar parte de la cpside del virin. Los acmulos de este tipo de protenas en el interior de las clulas es lo que comnmente se visualiza en el microscopio como cuerpos de inclusin.

Figura 30. Distintas estrategias de ensamblado de cpsides Ensamblaje a partir de poliprotenas: Este tipo de ensamblaje es menos

dependiente del azar que el anterior, ya que cada capsmero se forma a partir de una poliprotena. De este modo las interacciones no ocurren entre protenas distintas que dependen del azar para encontrarse, sino que la interaccin es intramolecular. La poliprotena interacciona consigo misma en sus diferentes dominios y luego, es clivada en las distintas protenas para permitir la correcta conformacin del capsmero. (ver Fig. 30B)

El caso mas estudiado es el de los Picornavirus donde las protenas constitutivas de la cpside (VP1, VP2, VP3 y VP4) se sintetizan como un precursor poliproteico (P1) que, luego de plegarse por afinidad entre las distintas partes, es clivado por otra protena viral (3LCDpro)

Ensamblaje asistido por protenas chaperonas celulares o virales: En

algunos casos existen protenas que direccionan a las protenas de cpside para que se produzca su correcta reunin. Este tipo de protenas denominadas chaperonas en algunos casos son protenas propias de la clula que los virus utilizan a su favor, y en otros, son protenas especficas codificadas en el genoma del virus. Algunos virus, tambin codifican protenas scaffolding o de andamiaje. La funcin de estas protenas es generar una especie de esqueleto alrededor del cual se van a ensamblar las protenas de cpside. Una vez conformada la misma, estas protenas de andamiaje son removidas y no forman parte del virin. Es lgico pensar que este tipo de protenas solo est presente en virus grandes que poseen cpsides complejas y que tienen capacidad gentica suficiente como para codificarlas. Parte del ensamblaje de los Adenovirus requiere de protenas chaperonas, en este caso de origen viral (L4), que se encargan de reunir tres protenas (protena II) para formar un trmero que luego va a encontrarse con el resto de los componentes de la cpside. Este trmero no puede formarse eficientemente en ausencia de L4 (fig. 30C) Los Herpesvirus (fig. 31) requieren, para ensamblar sus cpsides, de la accin de protenas de andamiaje (VP22a, VP21). Estas inteactan entre si y con las protenas estructurales de cpside para organizar el proceso de ensamble. Una vez constituida esta procpside, las protenas de andamiaje son removidas por una proteasa viral (VP24) y la cpside vaca queda disponible para recibir el ADN del virus. Empaquetamiento Se denomina empaquetamiento a la incorporacin del genoma en partculas ensambladas. Este proceso requiere el reconocimiento, por parte de algn elemento del virin, de seales especficas dentro de la molcula de cido nucleico (seales de empaquetamiento). El empaquetamiento puede ocurrir de 2 formas. Para algunos virus el empaquetamiento ocurre conjuntamente con el ensamblaje, es decir, el cido nucleico debe asociarse a las protenas de cpside para que se forme correctamente la cobertura proteica. Este es el caso, por ejemplo, de los Rhabdovirus (fig. 32), en los cuales el ARN de conformacin helicoidal

sirve de esqueleto para ir incorporando las subunidades proteicas de la cpside. Figura 31. Ensamblado de la cpside de Herpesvirus utilizando protenas de andamiaje. En otros virus, en cambio, primero se forma la cpside y luego es incorporado el cido nucleico. Un caso interesante de virus que usan este mecanismo es el de los Herpesvirus (fig. 33). Los nuevos genomas se sintetizan como una molcula de ADN larga que contiene genoma tras genoma en forma continua. Al reconocer la seal de empaquetamiento, el extremo de la molcula es ingresado a la cpside, hasta que reconoce una segunda seal de empaquetamiento que indica el comienzo de otro genoma. En este momento la molcula es cortada, de modo que una molcula de largo genmico queda dentro de la cpside y otra que contiene mltiples genomas continuos queda libre para ingresar a otras cpsides ya formadas.

Figura 32. Empaquetamiento y ensamblaje de Rhabdovirus. Figura 33. Empaquetamiento del ADN de Herpesvirus

Egreso La mayora de los virus abandonan la clula infectada por 1 de los siguientes 2 mecanismos. 1. Son liberados al espacio extracelular (por lisis o por brotacin) 2. Son transferidos directamente a una nueva clula. Es correcto pensar que la mayora de los virus desnudos deben inducir la lisis celular para poder liberar su progenie. De esta forma pueden cruzar nuevamente la membrana de la clula pero esta vez, sin la necesidad de garantizar la supervivencia de la misma. Pero esto no es regla para todos los virus desnudos. Por ejemplo, el virus polio es extremadamente citoptico y puede producir lisis celular en aproximadamente 8 horas. Sin embargo, cuando se lo cultiva en clulas polarizadas, por ejemplo, epitelio intestinal, es capaz de salir por la membrana apical sin destruir la clula utilizando, para ello, las vas secretorias propias de la misma. Tambin es correcto pensar que los virus envueltos salen de las clulas infectadas por brotacin a partir de la membrana citoplasmtica (fig 34). Esto implica que no es necesario que la clula muera para que el virus pueda salir. Sin embargo, muchos virus envueltos tambin producen lisis celular. Aunque la muerte de la clula no es necesaria en estos casos, la misma suele ocurrir como consecuencia de la brutal inhibicin de su metabolismo. Existen virus que pueden salir de diferentes formas en distintas situaciones o en distintas clulas. Un caso particular, y que cabe mencionar, es el de los Poxvirus. El mas estudiado de ellos es el virus Vaccinia (ver Fig.35). Este, adquiere una doble membrana en aparato de Golgi. Comnmente se lo denomina en este estadio como virin inmaduro (IV). Luego de sufrir alguno cambios conformaciones se transforma en un virin intracelular maduro (IMV). El IMV slo puede salir de la clula cuando ocurra la destruccin de la misma, pero una vez en el espacio extracelular es infectivo. Sin embargo, una proporcin de los IMVs adquiere una cudruple envoltura en un sitio posterior al golgi (obviamente antes de la muerte celular). La ms externa de estas envolturas es capaz de fusionarse con la membrana citoplasmtica y permitir la liberacin de un virin con triple envoltura. Ambos tipos de viriones liberados tienen envolturas con distinta composicin proteica y pueden reconocer distintos receptores, lo que aumenta el rango de clulas a infectar. Pero Vaccinia posee un tercer mecanismo por el cual abandonar la clula infectada. El IMV tiene la capacidad de reorganizar el citoesqueleto de

Figura 34. Egreso de virus Influenza. actina y generar de esta forma prolongaciones de la membrana que penetran en clulas vecinas. Este mecanismo permite a este virus infectar clulas que ni siquiera poseen los receptores necesarios. Maduracin El proceso de maduracin consiste en el clivaje de alguna/s protena/s estructural/es del virin ensamblado. Ocurre siempre como un paso posterior al ensamblaje. Puede ser antes, durante, o despus del egreso y siempre es llevado a cabo por protenas virales. Sin mediar este proceso, los viriones son inmaduros e incapaces de infectar otra clula. No todos los virus requieren de un paso de maduracin. Los caso mas conocidos los constituyen el HIV e Influenza

Figura 35. Distintos mecanismos de egreso del virus Vaccinia.

En HIV la poliprotena Gag debe ser clivada una vez en el espacio extracelular, caso contrario, el virin no podr desesamblarse al ingresar en una nueva clula susceptible (Fig. 36). En el caso de Influenza, la enzima neuraminidasa se encarga de remover los residuos de cido silico presentes en las glicoprotenas de envoltura. Como sabemos, el cido silico funciona como receptor para este virus y, por lo tanto si este no fuera removido de la superficie de los viriones, los mismos agregaran entre s y perderan infectividad.

Figura 36. Ensamblado, egreso y maduracin de Retroviridae

2. Entrada: Componentes del virin cruzan la barrera de la membrana citoplasmtica.3. Denudamiento: Liberacin del cido nucleico en el sitio de replicacinAdhesinEntradaEntrada por fusin a nivel de membrana plasmticaEntrada por va endoctica