yeni nesil dizileme prensipleri -...
TRANSCRIPT
Yeni Nesil Dizileme Prensipleri
Doç.Dr.Hüseyin Onay
Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD
1 2 3 7 8 9 4 5 6
• Yeni Nesil Dizi Analizi
• Next Generation Sequencing
• Massively Parallel Sequencing
• Second Generation Sequencing
• Paired End Sequencing
NGS
• En yaygın sekanslama teknolojisi – Sanger sekanslama – 1000-1200 bç
• HGP – Shotgun sekanslama
• DNA’ nın enzimatik ya da mekanik olarak fragmanlara ayrılıp sekanslama vektörlerine klonlanması
• Bireysel olarak okunan overlap diziler sayesinde insanın tüm genomu dizilendi
• Massively Parallel Sequencing’ in temeli
Tarihçe
• 1977- Sanger sekanslama • 1990- HPRT geni klonlandı • 1996- ABI 310 piyasaya çıktı • 1998-ABI 3700 piyasaya çıktı
– HGP çoğunlukla bu cihaz ile gerçekleştirildi
• 2001- ilk insan DNA’ sı konsensus dizisi • Sanger • Lander et al., 2001; Venter et al., 2001
• 2004- Roche 454
• 2007- İlk diploid insan genomu • Craig Venter • whole-genome shotgun sequencing • Levy et al., 2007
• 2008- İkinci diploid insan genomu • James D Watson • Roche 454 • Wheeler et al., 2008 • 1,5 milyon $
Tarihçe
Shendure J et al. Nature Biotechnology, 2008
Steinbock LJ et al., Nanotechnology, 2015
NGS-2015
NGS
• Roche GS-FLX 454 Genome Sequencer
– 454 sequencing
• ABI SOLiD analyzer
• Illumina Genome Analyzer
– Solexa technology
İkinci Nesil Sekanslama Teknolojileri
İllumina Solexa Teknolojisi
İllumina Solexa Teknolojisi
İllumina Solexa Teknolojisi
5’
G
T
C
A
G
T
C
A
G
T
C
A
G
T
3’
5’
C
A
G
T
C
A
T
C
A
C
C
T
A
G
C
G
T
A
First base incorporated
Cycle 1: Add sequencing reagents
Remove unincorporated bases
Detect signal
Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
All four labelled nucleotides in one
reaction
High accuracy
Base-by-base sequencing
No problems with homopolymer repeats
Sequencing By Synthesis (SBS)
40 MILLION CLUSTERS
PER FLOW CELL
20 MICRONS
100 MICRONS
Clonal Single Molecule Array™ Technology
1 2 3 7 8 9 4 5 6
T T T T T T T G T …
T G C T A C G A T …
Base Calling
İllumina SBS Teknolojisi
MiSeq
Uygulamalar
• DNA – Targeted Resequencing – De Novo Sequencing – Whole Exome Sequencing (WES) – Whole Genome Sequencing (WGS)
• RNA – Targeted Resequencing – mRNA Sequencing – Small RNA Sequencing – Total RNA Sequencing
• Methylation Sequencing
Hedef Zenginleştirme Metodları
Meldrum C et al. Clin Biochem Rev 2011
MiSeq
MiSeq Örnek Hazırlama
Indeksleme
PCR-Sample Pooling
Havuz 1 Havuz 2 Havuz 3 Havuz 4 Havuz 5
1+2+3+4+5
Pool 1 Grup No GEN ADI
1 BTD
2 HBB
3 PTPN11
4 MEFV
5 SRD5A2
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 CFTR
14 VHL
15 LOXL1
16 HNF1A
17 BCKDHB
18 SLC6A8
19 CD40
20 CD40L
21 BRCA1
22 BRCA2
23 EPM2A
24 RET
25
Pool 2 Grup No GEN ADI1 BTD
2 HBB
3 PTPN11
4 MEFV
5 SRD5A2
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 GBA
14 GDF6
15 LOXL1
16 HNF1A
17 GCDH
18 SLC6A8
19 CD40
20 CD40L
21 BRCA1
22 BRCA2
23 LPL
24 RET
25 WFS1
26
27
Pool 3 Grup No GEN ADI1 BTD
2 AR
3 FGFR2
4 MEFV
5 WFS1
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 CAV3
14 SF1
15 LOXL1
16 HNF1A
17 RMRP
18 TACİ
19 CTSK
20 BRCA1
21 BRCA2
22 SERPİNA1
23 EPM2A
24 ELA2
25 RET
P
o
o
l
1
P
o
o
l
2
P
o
o
l
3
Pool 1 Grup No GEN ADI
1 BTD
2 HBB
3 PTPN11
4 MEFV
5 SRD5A2
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 CFTR
14 VHL
15 LOXL1
16 HNF1A
17 BCKDHB
18 SLC6A8
19 CD40
20 CD40L
21 BRCA1
22 BRCA2
23 EPM2A
24 RET
25
Pool 2 Grup No GEN ADI1 BTD
2 HBB
3 PTPN11
4 MEFV
5 SRD5A2
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 GBA
14 GDF6
15 LOXL1
16 HNF1A
17 GCDH
18 SLC6A8
19 CD40
20 CD40L
21 BRCA1
22 BRCA2
23 LPL
24 RET
25 WFS1
26
27
Pool 3 Grup No GEN ADI1 BTD
2 AR
3 FGFR2
4 MEFV
5 WFS1
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 CAV3
14 SF1
15 LOXL1
16 HNF1A
17 RMRP
18 TACİ
19 CTSK
20 BRCA1
21 BRCA2
22 SERPİNA1
23 EPM2A
24 ELA2
25 RET
P
o
o
l
1
P
o
o
l
2
P
o
o
l
3
Pool 1 Grup No GEN ADI
1 BTD
2 HBB
3 PTPN11
4 MEFV
5 SRD5A2
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 CFTR
14 VHL
15 LOXL1
16 HNF1A
17 BCKDHB
18 SLC6A8
19 CD40
20 CD40L
21 BRCA1
22 BRCA2
23 EPM2A
24 RET
25
Pool 2 Grup No GEN ADI1 BTD
2 HBB
3 PTPN11
4 MEFV
5 SRD5A2
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 GBA
14 GDF6
15 LOXL1
16 HNF1A
17 GCDH
18 SLC6A8
19 CD40
20 CD40L
21 BRCA1
22 BRCA2
23 LPL
24 RET
25 WFS1
26
27
Pool 3 Grup No GEN ADI1 BTD
2 AR
3 FGFR2
4 MEFV
5 WFS1
6 OXT
7 OXT
8 OXTR
9 NPC1
10 GCK
11 MC4R
12 NPC2
13 CAV3
14 SF1
15 LOXL1
16 HNF1A
17 RMRP
18 TACİ
19 CTSK
20 BRCA1
21 BRCA2
22 SERPİNA1
23 EPM2A
24 ELA2
25 RET
P
o
o
l
1
P
o
o
l
2
P
o
o
l
3
MiSeq Örnek Yükleme
Sekanslama Görüntü işleme Okuma
Alingment Varyant deteksiyonu Filtreleme
NGS Akış Şeması
Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013
Wangs S et al. Genomics and Informatics , 2013
NGS Dosya Türleri
• FASTAQ – NGS raw datası
– FASTA sekans+kalite datası
– Wellcome Trust Sanger tarafından bulundu
• SAM/BAM – Sequence Alignment/Map
– FASTAQ’ nun align edilmiş hali
– Varyant saptama algoritmalarına hazır format
– Kodlama şekilleri farklı
NGS Dosya Türleri
• VCF
– Variant Calling Format
– Align edilmiş dizideki varyantları gösterir
– Manifest dosyaya göre
NGS Dosya Türleri
MiSeq Kalite Kontrol
MiSeq Kalite Kontrol
MiSeq Kalite Kontrol
MiSeq Analiz
MiSeq Analiz
MiSeq Analiz
BRCA2 Geni K2729N
BTD Geni c.617_619delTTG
Sistemik Artefakt
Booycott et al. Nat Rev Genet, 2013
NGS ve Nadir Hastalıklar
• WES
– Ortalama 12.000 varyant
• %90 veritabanlarında kayıtlı
• WGS
– Ortalama 5 milyon varyant
• 144.000 yeni
Varyant Saptama Oranı
Pabinger S et al. Briefings in Bioinformatics, 2013
Boycott et al. Nat Rev Genet, 2013
Kalıtılan Mutasyon Algoritması
www.omictools.com
• Helicos
– HeliScope
• Dünyadaki ilk DNA mikroskobu
• Pacific Biosciences
– SMRT (Single Molecule Real Time) sequencer
– DNA polimeraz flow cell’ e bağlı
– Her nükleotid eklenmesinde ışıma
Üçüncü Nesil Sekanslama
Ku CS et al. Expert Rev. Med. Devices, 2013
• Nanopore DNA sequencer
• Nükleotid etiketleme ve tespiti yok
• Ekzonükleazla kesilen baz nanopordan geçer
• Polimerizasyon yok
• 15 dakikada WGS
• Çok düşük maliyet
Dördüncü Nesil Sekanslama
Oxford Nanopore Technologies