yemas de piÑa trabajo paola y smith.docx

INDUCCIÓN DE BROTES MÚLTIPLES A PARTIR DE LA SIEMBRA DE YEMAS DE PIÑA (Anannas comosus L)EN CONDICIONES IN VITRO

SMIT JAIMES LEONPAOLA RICARDO CAMPOS

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

ROGREAMA DE INGENIERIA AGRONÓMICA BARRANCABERMEJA

2014

INDUCCIÓN DE BROTES MÚLTIPLES A PARTIR DE LA SIEMBRA DE YEMAS DE PIÑA (Anannas comosus L) EN CONDICIONES IN VITRO

SMIT JAIMES LEONPAOLA RICARDO CAMPOS

DOCENTEDARIO GARAVITO GARAVITO

Ingeniero Agrónomo

Trabajo presentado como requisito parcial para optar una nota en asignatura de Cultivo de Tejidos In Vitro – VIII Semestre

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZESCUELA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA

ROGREAMA DE INGENIERIA AGRONÓMICA BARRANCABERMEJA

2014

CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN

La forma tradicional de propagación de la mayoría de las especies vegetales es por medio de semillas, aunque algunas especies también se propagan vegetativamente. Sin embargo, en la actualidad, con el uso de la diversidad de técnicas del cultivo de tejidos vegetales, a partir de diferentes tipos de explantes se han establecido diversos tipos de cultivos (callos, suspensiones celulares, protoplastos, embriones, yemas axilares, meristemos, inflorescencias, etc) y en muchos casos se han logrado regenerar plantas completas in vitro y escalar dichos procesos para multiplicar en forma masiva (micro propagación) algunas especies1.

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas). 2

Esta actividad tiene diferentes métodos de propagación entre las que se encuentra la reproducción por cultivo de yemas,método que se desarrollara en este trabajo.

2. OBJETIVOS

1Godoy , Gregorio,et al. Progrado en Ciencias y Biotecnología de plantas. Centro de Investigación Científica de Yucatán. http://www.cicy.mx/Documentos/CICY/Posgrados/CB/UBBMP/PlanEstCB/4_CURSO_CULTIVO_DE_TEJIDOS_VEGETALES_GGH_NSB_Y_VMLV_%20menos%20profesores.pdf

2 Disponible en http://natalymosquera.blogspot.com/

http://natalymosquera.blogspot.com/

2.1 OBJETIVO GENERAL

Inducir la formación de brotes múltiples a partir de la siembra de yemas de piña Anannas comosus Len condiciones in vitro

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Formular el medio de cultivo adecuado para la instalación de yemas de piña Anannas comosus Lprocedentes de la corona.

Formular un protocolo de desinfección de las yemas de piña Anannas comosus L Formular un medio de cultivo adecuado para la formación de brotes múltiples de

yemas de piña Anannas comosus L Recoger y procesar la información obtenida por las observaciones periódicas de

los ensayos. Tabulación de la información obtenida.

3. ANTECEDENTES

In Vitro

El primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares y levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por tres vitaminas del grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina.

Harrison fue el primer autor que empleó técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo, realizando cultivos de médula espinal embrionaria de anfibios. Pudo observar el crecimiento de los axones de los neuroblastos, y estableció que el axón se formaba por expansión a partir del cuerpo neuronal y no por fusión de una cadena de células. El cultivo se realizaba en una gota de linfa del anfibio que colgaba de un cubreobjetos sobre una cámara sellada.

La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado. Burrows (1910) empleó plasma de pollo para nutrir los explantes de tejidos embrionarios de pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido nervioso, corazón y piel.

Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos. Demostraron que la vida del cultivo se puede prolongar mediante subcultivo. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de embrión.

Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina para disociar las células de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo celular. Uno de los mayores problemas que describen para el establecimiento de los cultivos celulares es la aparición de múltiples contaminaciones, por lo que desarrollaron numerosos métodos de manipulación en condiciones de asepsia que aún hoy día se utilizan.

Ya hasta 1934 Gautheret quien logró la proliferación celular in vitro en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 también trabajo (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos. Dando despegue a las técnicas de cultivo.

En 1939, trabajando en laboratorios diferentes, Nobecourt y Gautheret en Francia y White en Estados Unidos, crecieron tejidos de raíz y observaron formación de callos en medio semisólido.

Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).

4. METODOLOGÍA

4.1 MATERIALES

Material vegetal (yemas de piña): se obtuvieron a partir de los colinos de la corona apical del fruto de la piña.

4.2 materiales de laboratorio 5. Equipos

1 Estufa eléctrica. 1 balanza de precisión Ollas de acero inoxidable Estantería de iluminación para el control de fotoperiodo Vidriería 1 Vaso precipitado de 200ml 1 Vaso precipitado de 500ml 8 Pipetas de 10ml 1 Agitador 1 caja de Petri 20 frascos de compota

5.1 Reactivos Macro y micro elementos (solución madre) Azúcar Agar Hipoclorito de sodio NaClo. Agua destilada estéril. Alcohol.

5.2 Otros(fungibles) Papel aluminio Guantes Mangos para bisturí Cuchillas número 11 y 22 Marcadores de punta fina 4 mecheros Alcohol

6. Procedimientos

La práctica de laboratorio fue elaborada el martes 2 de septiembre del 2014, la primera labor que se realizó fue el aseo a la infraestructura del laboratorio , se trapeó todo el laboratorio (Teniendo en cuenta que en un laboratorio no se debe barrer debido que las partículas de polvo se esparcen ocasionando problemas en el éxito de la práctica y que este polvo dura aproximadamente en descender a la superficie del suelo entre 8 y 10 horas lo cual contaminaría todo el procedimiento a realizar).luego se procedió a limpieza general de todas las partes del laboratorio incluyendo las lámparas que se encontraban en malas condiciones (no servían), y se continua a barrer el laboratorio y continuar con trapeando de nuevo con desinfectante.

Los mesones del laboratorio se desinfectaron con una solución de Hipoclorito de sodio (NaClO) al 1% (cálculos que se realizaron previamente) utilizando toallas de trapo para la esterilización de todos los materiales inertes presentes en el laboratorio como la vidriería e instrumentos.

La vidriería se lavó con agua y jabón, luego se esterilizaron sumergiéndolos en agua caliente previamente calentada en una estufa.

De las soluciones madres se sacaron 1ml y 2 ml de 2 soluciones de cada una, estos cálculos fueron sacados previamente, en las que se especifican de la siguiente manera.

2 ml de NH4NO3 Nitrato de amonio 2 ml de MgSO47H2O Sulfato de magnesio 2 ml de CaCL2H2O Cloruro de calcio 1 ml de KH2PO4 Fosfato de potasio 1 ml PNA AC Nadio acético 2 ml 2,P 2 ml Tiamina

Se pesó la cantidad de sacarosa a utilizar. 6 gr sacarosa.

Se pesó la cantidad de agar a utilizar.7.3 gr de agar

Se procedió a agregar los 6 gr en el agua destilada y se aforo procediendo a colocarla en la estufa aforando hasta hervir la solución para colocar el agar

Con respecto al pH no se pudo hacer una medición exacta ya que se presentaron inconvenientes con el préstamo del medidor de pH pero se promedió de un % de 5,5.

Luego se agregó 0.5 ml de la hormona AIA que se encontraba en la botella ámbar a una concentración de 60 ppm. .

Una vez listo el medio, este se colocó a hervir. Cuando se inició este proceso, se agregó el agar y se mezcló constantemente hasta quedar totalmente homogenizado.

Mientras el medio hervía, se procedió a desinfectar la vidriería para lo cual fue necesario bajar la concentración del NaClO al 1%. se realizó la conversión de la siguiente forma:

6.1 ESTERILIZACIÓN

Para saber la cantidad de agua destilada para la solución desinfectante:

V1 x C1= V2 x C2

Se remplazan los datos.

V1= 2000ml x 1%

90% 2000 ml – 2.22 =197.78 de agua

Antes de añadir el medio a los frascos era importante tener el papel aluminio cortado a la medida de la abertura del frasco.

Luego se implementaron los 15 frascos escogidos para la esterilización, se pasan por hipoclorito al 1% y se colocaron boca abajo para evitar contaminación de los frascos.

= 2.22 hipoclorito

Luego se adicionaron los reactivos (micro-macro-nutrientes) y se aforo.

se agregó el azúcar y se agita hasta diluirse

se pasa a la estufa y se coloca en alto para que el medio ebullicione.En ese momento se le adiciona el agar. y se procedió a bajarlo de la estufa para adicionarlo a los frascos ya listos.aqui tambien

Una vez añadido el medio se sella con papel aluminio de manera inmediata flameándolo con los mecheros.

Una vez listos los frascos fueron separados para que se solidificara durante unos minutos y luego se procedió a preparar el material vegetal para la siembra.

7. PREPARACIÓN DE MEDIOS7.1 Reactivos

Fuente: Autor Propio Fuente: Autor Propio Fuente: Autor Propio

Fuente: Autor Propio Fuente: Autor Propio Fuente: Autor Propio

7.2 ESTERILIZACIÓN DE VIDRIERÍA

Fuente: Autor Propio Fuente: Autor Propio

Para la siembra del material vegetal se realizaron los siguientes pasos:

7.3 IMPRIMACIÓN

Se desinfecto el material vegetal en este caso la corona de la piña con una concentración de alcohol al 70% con 2 variables (tratamientos)

Alcohol al 70% por 2 minutos NaCLO al 2% con los 2 tratamientos

T1= 15 minutos

T2 = 20 minutos

Las cantidades apropiados para el hipoclorito fueron de la siguiente forma en la que se reemplazan los datos:

V1 x V2 =

V1 = T1= 400ml de H2O x 2% NaClO

5.25 NaClO

400 ml de H2O – 152.3 de NaClO= 247.7 de agua

T2 = 150 ml de H2O x 2% NaClO

5.25 NaClO

FORMULA PARA ALCOHOL AL 70%

V1 x C1 = V2 x C2

V1= 2000ml de H2O x 70% alcohol

96% Alcohol

2000 ml de H2o – 145 de alcohol

= 152.3 de NaClO

= 57 de NaClO

= 145 de alcohol

7.4 IMPRIMACIÓN DE MATERIAL VEGETAL


8. Preparación de medios con hormonas El día 7 de octubre se hizo la preparación de los medios con BAP y AIA

(hormonas de crecimiento) que se dejaron por un periodo de 20 minutos para que el medio se solidifique y proceder a la sub cultivación de las yemas de piña (Anannas comosus L).teniendo acceso restringido en el área de trabajo.

En el transcurso de 8 días se realizaron observaciones a las yemas sembradas.paola aquí realice cambios tambien

Sub cultivo de yemas con BAP Y AIA

Fuente: Autor Propio


9. ResultadosEl dia 26 agosto del presente año se inició la preparación del medio y seguimientos los días 27, 28, 29, en los cuales no se presentaron ningunos cambios ni contaminaciones.El dia 2 de septiembre del presente año se realizó la primera siembra, sin presentar cambios haciendo seguimientos los días posteriores.Al hacer revisión del material el dia 9 de septiembre se observaron cambios significativos en 2 de 10 frascos sembrados

2 de las 10 muestras presentaron contaminación por hongos(T 2R 4) en la parte superficial del medio del cultivo observándose una esporulación de color blanco, partiendo de esto se puede decir que hubo un descuido en el protocolo establecido al momento de la siembra ya que solo se presentó este problema en 2 y los 8 mostraron resultados significativos, o que pudo ser un contaminante del ambiente dentro del laboratorio ya que el aire se encontraba encendido y es un principal contaminante ,y se inoculo al momento de la siembra.

Los 8 frascos restantes los que no presentaron ningún problema se dejaron en la estantería ordenadamente respetando el espacio de los demás grupos dejándolos en proceso de fotoperiodo para su proceso evolutivo.

El 16 de septiembre se observaron inicios de brotes en los 8 frascos de la que se encontraban en la estantería teniendo en cuenta que se encontraban en proceso de fotoperiodo

Haciendo nuevamente otra siembra el 24 de septiembre del presente año de la cual 3 de 10 presentaron contaminación nuevamente y 7 de estos no presentan contaminación colocando en estantería junto con los demás en proceso de fotoperiodo haciéndole seguimiento y subcultivando posteriormente a un medio con hormonas (BAP Y AIA)para inducción de brotes laterales y enraizamiento, suministrando horas luz con el fotoperiodo instalado haciendo seguimiento durante todo el semestre.

Fuente: Autor Propio

10 discusiones de resultados

Fue posible observar brotes de hasta 1 cm en 2 de los 15 frascos que dieron como resultado y los demás con brotes que no alcanzaban al centímetro ,ya que estos se encontraban en la estantería sin presencia de patógenos ,sim embargo cabe resaltar que algunos de estos en algún momento de la subcultivacion al medio con hormonas entraron patógenos en 1 de los 15 y se procedió en ese mismo momento hacer una nueva subcultivacion.

Las características de los medios contaminados se puede decir que:

Al momento de hacer la limpieza al sitio de trabajo no fue el adecuado

Los instrumentos de trabajo no se flamearon muy bien Se habló mucho durante la siembra los materiales asépticos no eran la prioridad

11 conclusiones

El desarrollo de la práctica en el laboratorio de inducción de múltiples brotes de yemas de piña podemos concluir que:

Si se tiene en cuenta los conceptos de asepsia en el laboratorio de agronomía del centro de investigación santa lucia del instituto universitario de la paz, es posible realizar prácticas de siembra de yemas de piña, obteniendo medios libres de patógenos y con la ayuda de los macro y micro nutrientes para la inducción de multiples brotes de yema de piña por medio de la propagación masiva, es posible y es viable este tipo de prácticas.

A lo anteriormente mencionado hay q tener en cuenta la garantía de ejecutar un procedimiento rápido por la falta de destreza por parte de los estudiantes, asi mismo contar un material de procedencia sana, para garantizar muchas plantas igual de sanas.

Cabe resaltar que se logro una alta comprensión en el procedimiento y la importancia de cada uno de los pasos para la realización de practicas con el fin de la observación de multiples brotes laterales con yemas de piña

12 recomendaciones

Utilizar todos y correctamente los elementos de protección personal (EPP), favoreciendo así en primer lugar el bienestar del personal y el éxito de la práctica reduciendo los índices de contaminación.

Tener claridad y precisión en el momento de pesar cada una de las sustancias como agar azúcar y la hormona.

para futuras practicas con yemas de piña para inducción de brotes laterales en el laboratorio de agronomía en el instituto universitario de la paz se debe mejorar el protocolo de siembra ya que el proceso de desinfección debe ser el mejor para prevenir patógenos de carácter exógeno como lo fue en este caso y por ende de carácter endógeno, de lo cual depende un excelente resultados.

ANEXOS

SIEMBRA DE YEMAS DE PIÑA (ANANNAS COMOSUS L)


BIBLIOGRAFÍAS

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