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XVII Jornadas de Biología Celular y Molecular

MASTER EN BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

PROGRAMA DE DOCTORADO BIOLOGIA CELULAR YMOLECULAR

XVII JORNADAS DE BIOLOGIA CELULAR YMOLECULAR

Málaga, 9 y 10 de Junio de 2015

Salón de Actos del Instituto de Estudios Portuarios. Puerto de Málaga.


HORARIOS


MARTES, 9 JUNIO

09:00-09:15 Bienvenida por el organizador: Salvador Guirado

09:15-10:45 Sesión I. Moderadores: Alicia Rivera y José María Pomares.

Andrea Linares GámezFusión de las crestas conotruncales durante la tabicación del tracto de salida cardíaco embrionario del Hámster sirio (Mesocricetus auratus).

Mª Teresa Soto NavarreteApoptosis en el corazón embrionario y aorta ascendente adulta del hámster sirio.

Miguel Ángel López-Unzu LópezEstudio de la mioarquitectura y del contenido de cadenas pesadas de miosina enel corazón de condrictios.

Lina Molina ArandaRescate experimental del potencial nefrogénico del proepicardio.

Miguel Lorenzale GarcíaCaracterización histoquímica e inmunohistoquímica y aspectos moleculares del tracto de salida de la Arawana (Osteoglossum bicirrhosum; Teleostei).

Sara Cano Ballesteros (D)Mecanismos celulares y moleculares de la fibrosis cardíaca post-infarto.

10:45-11:15 Pausa café

11:15-12:45 Sesión IIa (Máster). Moderadores: MªCarmen Balebona e Ignacio Fajardo.

Alejandro José Cueto SánchezRegulación del metabolismo de PAs durante condiciones de hipoxia en células de neuroblastoma humano.

Paloma Carrillo Fernández Evaluación del potencial antiangiogénico de un alcaloide con actividad antitumoral.

Jose Joaquín Serrano MoralesEvaluación de los efectos de compuestos anti-angiogénicos sobre el estado redox celular

Mª Carmen Ocaña FarfánEstudio de preferencias por sustratos metabólicos y efectos de productos naturales antiangiogénicos en células humanas.


Andrea Nieto QueroEstudio del papel de la proteína YcdX en la replicación y reparación del ADN en Escherichia coli.

Elena Rojano RiveraAnNCR-SNP, a Tool for Annotating SNPs in Non-Coding Genomic Regions.

12:45-13:00 Pausa

13:00-14:00 Sesión IIb (Doctorado). Moderadores: MªDolores Castro y Miguel Ángel Medina

M Rosario Chica ParradoEstudio molecular de la enfermedad residual en cáncer de mama y su implicación en los mecanismos de resistencia

José Miguel Granados LópezCaracterización de PpMyb23, un factor de transcripción regulador del metabolismo secundario en pino.

Rosario Mª Carmona MuñozEstudio bioinformático del transcriptoma reproductivo y semillero de olivo (Oleaeuropaea L.).

14:00-16:00 Comida. Restaurante Kaleido. Muelle 1.

16:00-17:00 Sesión IIIa. Moderadores: Concepción Ávila y Alejandro Pérez

Rocío Leiva RebolloTransmisión vía hídrica del virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV).

Jesús Moriñigo MuñozAnálisis de las interacciones del microorganismo Shewanella putrefaciens Pdp11 con Solea senegalensis.

Francesca R. Aprile ManchaCaracterización del gen fitD en la rizobacteria Pseudomonas chlororaphis PCL1606.

Manuel Martínez OsorioPapel del 2-hexyl, 5-propyl resorcinol en la formación de la biopelícula en Pseudomonas chlororaphis PCL1606.

17:00-17:10 Pausa


17:10-18:10 Sesión IIIb. Moderadores: MªCarmen Alonso y José Luis Urdiales

Carlos Carballo PérezCaracterización genómica de genes implicados en la respuesta defensiva frente a linfocistivirus en lenguado.

Álvaro A. Polonio EscalonaAnálisis del transcriptoma haustorial para el control del oídio de las cucurbitáceas.

Carlos Acosta AndradePapel del inhibidor de antizima-2 en la biosíntesis y contenido de histamina y serotonina en mastocitos de ratón.

MIÉRCOLES, 10 JUNIO

09:30-10:45 Sesión IVa (Máster). Moderadores: José Carlos Dávila y Francisco Cazorla

Pablo Cueto MartínNeuroplasticidad asociada a la adicción a cocaína.

Juan Cristóbal Sánchez GarcíaBases moleculares de la adicción a cocaína y opiáceos.

Noelia del Sol Mateo de la TorreEstudio de los niveles de expresión de proteínas en corteza prefrontal y bulbo olfatorio del ratón modelo del síndrome X frágil.

Eduardo Frías AnayaEstudio de proliferación celular y/o neurogénesis en el modelo animal del síndrome X frágil.

Juan José Fernández ValenzuelaEfecto de la estabilización de los microtúbulos sobre la progresión de la patología en un modelo transgénico APP/PS1 de la enfermedad de Alzheimer.

10:45-11:15 Pausa café

11:15-12:35 Sesión IVb (Doctorado). Moderadores: MªÁngeles Real y Francisco Cantón.

Laura Mª Ariza MedinaEl gen supresor del tumor de Wilms (Wt1) en el desarrollo neural y en la retina adulta.


Cristina Núñez DíazEstudio de la toxicidad de las placas amiloides y su impacto en la progresión de la enfermedad de Alzheimer: identificación de nuevas dianas de interés terapéutico.

María García BonillaCaracterización y administración de células madre mesenquimales en un modeloanimal de hidrocefalia congénita.

Kirill ShumilovEstudio de la existencia y función del heteroreceptor D4R-MOR en los estriosomas del caudado putamen y su implicación en el tratamiento con morfina.

12:45-13:30 Coloquio-reflexión sobre las Jornadas. Clausura.


RESUMENES


Sesión I


Fusión de las crestas conotruncales durante la tabicación del tracto de salida cardíaco embrionario del Hámster sirio (Mesocricetus auratus)

Andrea Linares Gámez

Trabajo dirigido por Francisco de Borja Fernández Corujo. Departamento de Biología animal. Universidad de Málaga.

El tracto de salida cardíaco embrionario de los mamíferos o conotruncus es un cilindro miocárdico, en cuyo interior se desarrollan dos largos cojines mesenquimáticos denominados crestas conotruncales, que recorren longitudinalmente y de forma helicoidal la luz del tracto de salida y otros dos cojines más pequeños, que se intercalan entre las crestas conotruncales. Durante la embriogénesis, el conotruncus se divide en dos tractos de salida independientes mediante el proceso de septación conotruncal, que consiste en lafusión de las crestas conotruncales y la formación del septo conotruncal, compuesto por células procedentes de la cresta neural. Aunque se sabe que estas células juegan un papel clave en la septación conotruncal, aún no se conoce el o los mecanismos celulares implicados en la fusión de las crestas conotruncales. El objetivo principal del presente trabajo consiste en dilucidar este mecanismo de fusión.

La hipótesis principal de este trabajo es que la fusión de las crestas conotruncales tiene lugar gracias a un proceso de transición epitelio mesénquima (TEM) del endocardio que las tapiza. Para contrastar dicha hipótesis, se emplearán técnicas inmunohistoquímicas, usando anticuerpos que reconocen algunas de las moléculas que intervienen de manera específica en el proceso de transición epitelio mesénquima. Algunas de estas moléculas son, la VE-cadherina, presente en los hemidesmosomas que unen las células endoteliales con su membrana basal y que, por tanto, deben desaparecer en las células endocárdicas que tapizan la zona de fusión, donde la membrana basal se disgrega; la alfa actina, que seexpresan en células endocárdicas en migración y TGF-b, molécula inductora principal de latransición epitelio mesénquima.

Otra técnica a realizar es el marcaje celular con CFSE. La inyección de CFSE en el corazón de embriones de 10 días genera una marca fluorescente en todo el endocardio. Siocurre una TEM, las células mesenquimáticas, derivadas del endocardio marcado estarán marcadas. Para comprobar si la transición epitelio mesénquima es un proceso continuo desde que se inicia para formar los cojines hasta que ocurre la fusión, se llevará a cabo unsegundo experimento con CFSE, en este caso, el corazón se marca y se le coloca una púade cactus en el interior del tracto de salida, impidiendo la fusión. Si, tras 24 horas en cultivo, ocurre TEM mesénquima de forma continuada, se verán células mesenquimáticas marcadas, condensadas a ambos lados de la púa.

Los resultados obtenidos hasta el momento parecen secundar esta hipótesis, puesto que se han encontrado evidencias de migración en las células endocárdicas de la zona de fusión de las crestas conotrunacales, una de las características propias de las células que se transorman en mesénqima. En particular, se han encontrado células endocárdicas (CD34+) inmunorreactivas frente anticuerpos contra la alfa actina.


Apoptosis en el corazón embrionario y aorta ascendente adulta del hámster sirio

Mª Teresa Soto Navarrete

Trabajo dirigido por Francisco de Borja Fernández Corujo. Depto. de Biología Animal. Facultad de Ciencias (Universidad de Málaga).

La válvula aórtica bicúspide (VAB) es la malformación cardíaca congénita más común en elhombre. Se caracteriza por presentar una reducción del número de elementos que compone una válvula normal (tricúspide). El defecto morfogenético que conduce a la formación de una VAB consiste en una excesiva fusión de los cojines endocárdicos durante la tabicación del tracto de salida cardiaco. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo celular implicado en la fusión de los cojines endocárdicos. Se ha hipotetizado que la apoptosis de las células endocárdicas que tapizan los cojines puede estar implicadaen el proceso de fusión. En el hombre, la VAB suele presentarse asociada a otras patologías, incluida la dilatación de la raíz aórtica y/o aorta ascendente. La apoptosis de las células musculares lisas de la media aórtica parece constituir uno de los eventos que desencadenan la aortopatía en pacientes con VAB.

La Universidad de Málaga cuenta con el único modelo animal espontáneo de VAB, consistente en una cepa de hámster sirio (Mesocricetus auratus) con una elevada incidencia de VAB asociada a alteraciones de la media aórtica. En el presente estudio, se utiliza el modelo hámster para cumplir con los siguientes objetivos: 1) dilucidar si la apoptosis de las células endocárdicas está implicada en el mecanismo de fusión mediante el cual se tabica el tracto de salida cardiaco embrionario, y 2) determinar si las células musculares lisas de la pared de la aorta ascendente de hámsteres adultos sufren apoptosis, asociada a la edad y/o al fenotipo valvular. Se utilizaron embriones de hámster sirio de estadios de entre 10 y 12 días post-coitum para confirmar el primer objetivo, y secciones de aorta ascendente de hámsteres adultos de edades comprendidas entre los 300 y 500 días para el segundo. Los hámsteres pertenecían a dos cepas distintas: una endogámica, con alta incidencia de VAB, y otra exogámica, que sirvió como control.

Para hacer visibles los núcleos pignóticos se utilizó la tinción de hematoxilina-eosina en secciones histológicas. La técnica TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling) se empleó para determinar la presencia de células apoptóticas en cada caso. Para corroborarque los resultados del TUNEL eran correctos, se aplicaron técnicas inmunohistoquímicas con anticuerpos específicos para la proteína caspasa 3 activa, una de las principales proteínas implicadas en la apoptosis.

Los resultados obtenidos revelan que la apoptosis no es el mecanismo mediante el cual sefusionan los cojines valvulares durante el desarrollo embrionario. Por otro lado, el estudio de la aorta ha revelado que la técnica del TUNEL puede identificar tanto células musculares lisas apoptóticas como necróticas. Aún queda por determinar si la apoptosis dela musculatura lisa se asocia al fenotipo valvular y/o a la senectud en la aorta ascendente del modelo hámster.

Este trabajo ha sido financiado por el proyecto P10 – CTS – 6068.


Estudio de la mioarquitectura y del contenido de cadenas pesadas de miosina en el corazón de condrictios.

Miguel Ángel López-Unzu López

Trabajo dirigido por Ana Carmen Durán Boyero y Francisco de Borja Fernández Corujo. Facultad de Ciencias. Departamento de Biología Animal.

Desde el punto de vista anatómico, el corazón de los condrictios es un órgano tubular, en forma de S. Consta de seis regiones dispuestas en serie que, en sentido caudocefálico, son el seno venoso, el atrio, la región atrioventricular, el ventrículo, el cono arterioso y el bulbo arterioso. Excepto en el caso del bulbo, la pared de estas regiones es de naturaleza miocárdica. Además, se sabe que la organización espacial del miocardio difiere en las distintas regiones cardiacas. En este trabajo se estudia la diversidad estructural y funcionaldel miocardio de los condrictios en comparación con otros vertebrados. Para ello, se han usado dos anticuerpos específicos contra la cadena pesada de miosina (CPM): A4.1025 y MF20. Ambos reconocen todas las isoformas de las CPM que se expresan en la musculatura esquelética y cardiaca de diversos grupos animales. El epítopo que reconoce A4.1025 está próximo a la región de unión al ATP de las CPM, codificado por una secuencia ampliamente conservada en la filogenia. El epítopo que reconoce MF20 se localiza en el extremo C-terminal de las CPM. En el curso de la investigación se han hallado señales diferenciales entre ambos marcadores no descritas con anterioridad en pruebas con otras especies.

Los objetivos principales del presente trabajo son: (1) describir los patrones de organización espacial que presenta el miocardio en las diferentes regiones cardiacas en condrictios, (2) confirmar, identificar y caracterizar las marcas obtenidas con ambos anticuerpos, y (3) valorar estos resultados en su contexto evolutivo.

El material consiste en tres especies de condrictios, en concreto, nueve ejemplares adultosde S. canicula, un ejemplar adulto de Centrophorus uyato y uno de Harriotta raleighana. Además, se ha estudiado un ejemplar adulto del teleósteo Osteoglossum bicirrhosum y tres ejemplares adultos del mamífero Mesocricetus auratus. Metodológicamente, el trabajo ha implicado una puesta a punto de técnicas inmunohistoquímicas con diversos marcadores miocárdicos sobre cortes de parafina, un estudio comparativo de la marca diferencial de estos anticuerpos en las regiones cardiacas a base de métodos colorimétricos estandarizados, y la identificación y semicuantificación de las proteínas reconocida por ambos marcadores mediante técnicas inmunohistoquímicas, dot blot y western blot.

Los resultados preliminares del presente trabajo, obtenidos a base de análisis de imagen ydot blot, muestran que la proteína reconocida por A4.1025 tiene una localización desigual en el corazón de S. canicula. El contenido relativo de la proteína es alto en el atrio, intermedio en el seno venoso y la región atrioventricular y débil en el ventrículo y el cono arterioso. Dicha diferencia no se observa con el otro marcador miocárdico (MF20). Estos resultados sugieren que una CPM, de identidad aún no confirmada, se expresa diferencialmente en las cámaras cardiacas de distintos grupos de vertebrados.

El trabajo ha sido parcialmente financiado por el proyecto CGL 2010-16417.


Rescate experimental del potencial nefrogénico del proepicardio

Lina Molina Aranda

Trabajo dirigido por Ramón Muñoz-Chapuli Oriol. Departamento Desarrollo Cardiovascular y Angiogénesis. Facultad de Málaga.

El proepicardio es el primordio embrionario del epicardio. Está formado por un acúmulo de células mesoteliales y mesenquimáticas situado en el límite entre el hígado y el seno venoso. El proepicardio entra en contacto con la superficie miocárdica y se extiende progresivamente sobre el miocardio formando el epicardio primitivo, fuente a su vez de progenitores vasculares y conectivos esenciales para el desarrollo cardiaco.

Se ha sugerido que el proepicardio es un derivado evolutivo del primordio de un glomérulo pronéfrico externo ancestral, que ha perdido su función excretora original (Cano et al., 2013 y Cano et al en prensa). La hipótesis se basa en el desarrollo del epicardio de lampreas (Petromyzon), que se forma a partir del primordio del glomérulo pronéfrico derecho (Pombal et al., 2008). De hecho, la expresión de marcadores renales aumenta fuertemente en el proepicardio de pollo cuando es cultivado con inductores nefrogénicos, especialmente cuando se trata con ácido retinoico (Cano et al., en prensa). Este rescate parcial en cultivo del potencial nefrogénico del proepicardio no ha sido comprobado in vivo.

El efecto del tratamiento con ácido retinoico es paradójico, ya que el propio proepicardio expresa Raldh2 y por tanto es una fuente de producción de ácido retinoico. El efecto nefrogénico de un aumento de la exposición del proepicardio al ácido retinoico podría explicarse por la existencia de un gradiente anteroposterior de concentración de este morfógeno, que sólo a partir de un umbral induce la expresión de genes reguladores del mesodermo intermedio y la nefrogénesis, como Pax-2 y HoxB4. La pérdida de la función excretora del proepicardio se habría producido por una posteriorización de dicho umbral deconcentración de ácido retinoico. Esta hipótesis implicaría que una aplicación local de ácido retinoico en las proximidades del proepicardio podría rescatar su destino original y provocar su diferenciación glomerular in vivo.

Nuestro proyecto consiste en la colocación, entre el proepicardio y el corazón de embriones de pollo en estadio HH17, de cuentas de resina sintética básica (44324-100G, Dowex 1X8 chrloride form) cargadas con ácido retinoico, de forma que liberen lentamente esta sustancia y provoquen altas concentraciones locales. Los pollos tratados de esta forma y los pollos control serán fijados tras 24 horas de tratamiento y se comprobará en ellos la expresión de podocina por medio de hibridación in situ. La podocina es un marcador específico de podocitos diferenciados, y se expresa en los glomérulos externos que se forman transitoriamente a partir del mesodermo intermedio del pollo. En caso de obtener resultados positivos en el proepicardio, se estudiarán otras evidencias de diferenciación glomerular, tanto moleculares (p.e. Glepp-1, sinaptopodina) como morfológicas (microscopía electrónica).

Cano, E., Carmona, R., and Muñoz-Chápuli, R. 2013. Evolutionary Origin of the Proepicardium. J. Dev. Biol. 1, 3–19.

Pombal, M.A., Carmona, R., Megías, M., Ruiz, A., Pérez-Pomares, J.M., and Muñoz-Chápuli, R. 2008. Epicardial development in lamprey supports an evolutionary origin of the vertebrate epicardium from an ancestral pronephric external glomerulus. Evol. Dev. 10, 210–216


Caracterización histoquímica e inmunohistoquímica y aspectos moleculares del tracto de salida de la arawana (Osteoglossum bicirrhosum; Teleostei)

Miguel Lorenzale García

Trabajo dirigido por Valentín Sans Coma. Tutor: Ramón Muñoz-Chapuli Oriol. Departamento de Biología Animal, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga.

Trabajos recientes han demostrado que el tracto de salida del corazón primitivo de los vertebrados está constituido por dos segmentos cardiacos, el cono arterioso, miocárdico, yel bulbo arterioso, no miocárdico. Esta condición se da actualmente en los Condrictios y entodos los linajes antiguos de Actinopterigios. A lo largo de la evolución de los teleósteos se ha producido una recesión ostensible del cono. Sin embargo, poco se sabe del tracto de salida del corazón de los teleósteos más antiguos. El presente estudio se diseñó con el fin de arrojar luz sobre esta cuestión. El material examinado consistió en corazones de arawana, que pertenece a los Osteoglosomorfos, uno de los grupos de teleósteos más antiguos. El estudio anatómico se realizó por microdiseción y microscopia electrónica de barrido. Para poner de manifiesto los elementos estructurales se utilizaron las siguientes tinciones: hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson-Goldner para una visión general de los tejidos, picrosirio con microscopía de polarizacion para identificar el colágeno, resorcina-fucsina para el reconocimiento de la elastina y el azul alciano para los glucosaminoglucanos. Asimismo, se usaron técnicas inmunohistoquimicas con los siguientes anticuerpos: A4-1025 y MF20 para detectar las cadenas pesadas de la miosina en músculo cardíaco, anti-a-actina para poner de manifiesto la musculatura lisa, bNOS

para identificar las moléculas de óxido nítrico del músculo esquelético y eNOS para las del endotelio, anti-laminina, anti-conexina 43 con el fin de detectar uniones GAP. Los hallazgosanatómicos han demostrado que, en la arawana, existe un cono bien desarrollado y un bulbo, cuya pared luminal es lisa y, por tanto, similar al de los actinopterigios basales. El bulbo está recorrido por arterias coronarias subepicárdicas. El cono soporta dos valvas conales, izquierda y derecha. Las comisuras de estas valvas están ancladas al bulbo arterioso por unos paquetes elásticos que derivan de la pared del bulbo y que no han sido descritos en ninguna especie hasta el momento. El miocardio conal se diferencia del miocardio ventricular porque es compacto; el ventricular es trabeculado. Los anticuerpos A4-1025 y MF20 han identificado el miocardio ventricular, conal y atrial. Dado que los anticuerpos utilizados no se han probado previamente en teleósteos basales, se están llevando a cabo técnicas analíticas de western blot y así verificar que el anticuerpo usado se une a la secuencia proteica específica para la que está diseñado. Así, el anticuerpo A4-1025 ha dado resultados positivos, como ha quedado comprobado a base de controles positivos y negativos. Además de la miosina de la especie control, se han detectado otras proteínas, de elevado peso molecular, que de ser miosinas, abriría el interrogante de si el peso de las cadenas pesadas de miosina en cuestión ha ido disminuyendo en el miocardiode los vertebrados durante la evolución.


Mecanismos celulares y moleculares de la fibrosis cardíaca post-infarto

Sara Cano Ballesteros

Trabajo dirigido por: José María Pérez-Pomares y Juan Antonio Guadix Domínguez. Departamento de Biología Animal. Facultad de Ciencias.

El complejo enfermedad coronaria-infarto de miocardio es la principal causa de muerte en el mundo occidental. La base fisiopatológica de esta enfermedad es la muerte masiva de músculo cardíaco tras episodios sostenidos de isquemia (baja tensión de oxígeno tisular), lo que finalmente reduce la función cardíaca (insuficiencia cardíaca). Como respuesta, se inicia el proceso reparativo de remodelación ventricular, que es seguido por el reclutamiento de fibroblastos cardíacos (FC). Un reciente estudio de nuestro grupo (Ruiz-Villalba et al., 2015) demuestra que el principal origen de los fibroblastos cardíacos en el corazón post-infarto es el epicardio embrionario.

El epicardio es la lámina de tejido que cubre el músculo cardíaco (miocardio); se desarrollaen el embrión a partir de una masa mesodérmica, de progenitores multipotentes localizadaen el polo venoso del corazón embrionario (el proepicardio, PE). Las células pro-epicárdicas se adhieren a la superficie del corazón y forman el primitivo epicardio embrionario. Algunas de estas células epicárdicas sufren un proceso de transición epitelio-mesénquima (EMT) y se transforman en una población mesenquimal de células derivadas de epicardio (epicardial-derived cells, EPDC) que se diferencian en múltiples tipos celulares (endotelio, células musculares lisas, fibroblastos, adipocitos) (Pérez-Pomares et al., 1997, 1998; Dettman et al.,1998; Vrancken-Peeters et al., 1999; Ruiz-Villalba et al., 2015; Yamaguchi et al., 2015). Durante la diferenciación embrionaria de las EPDC en distintos tipos celulares, varios morfógenos, como las proteínas secretadas de la familia delos WNT (Zamora et al., 2007), parecen jugar un papel clave.

Los Wnts constituyen una amplia familia de moléculas secretadas (19 en humanos) que señalizan a través de diferentes receptores Frizzled (Fzd1-10) y de distintas cascadas de transducción celular, y que tienen funciones cruciales en la regulación del desarrollo embrionario y en la función celular en el organismo adulto (Dawson et al.,2013).

Nuestro grupo de investigación estudia también el papel que juega la proteína S100A4, también conocida como FSP1, durante la fibrosis cardíaca post-infarto. FSP1 fue descrita por primera vez como un marcador de fibroblastos (Strutz et al., 1995), pero ahora sabemos que hay otros tipos celulares (incluyendo derivados de la médula ósea) que pueden expresar la proteína Fsp1 (Österreicher et al., 2011). FSP1 es una diana directa del complejo de transcripción ß-catenin/TCF, efector de la vía canónica de los WNT (Stein et al., 2006) y está relacionada con otras moléculas importantes para la progresión fibróticacomo TGFb. El objetivo principal de nuestro trabajo es estudiar la función de todas estas

vías de señalización y moléculas en los procesos celulares que tienen lugar durante la remodelación ventricular post-infarto.


Sesión IIa


Regulación del metabolismo de PAs durante condiciones de hipoxia en células de neuroblastoma humano

Alejandro Cueto Sánchez

Tutor: José Luis Urdiales Ruiz. Director : Maria Victoria Ruiz Pérez .

El neuroblastoma es un tumor maligno que se origina a partir de las células derivadas de lacresta neural que dan origen al sistema nervioso simpático. Representa el 10% de los tumores sólidos de niños menores de 15 años. El desarrollo de este tipo de tumor está relacionado con alteraciones en genes que intervienen en funciones vitales para la célula. Entre ellos destacan MYCN, ALK, TRKA, TRKB y CD44. Se ha descrito que MYCN estimula la actividad de la ornitina descarboxilasa (ODC), una de las enzimas clave en la síntesis de poliaminas (PAs). Las PAs son moléculas catiónicas de bajo peso molecular que tienen la capacidad de interactuar con los ácidos nucéicos, algunas proteínas y con membranas biológicas por lo que intervienen en la modulación de numerosos procesos biológicos, como el crecimiento celular, la proliferación y la supervivencia. Niveles bajos dePAs se asocian a estados post- mitóticos y a células senescentes, mientras que incrementos en los niveles intracelulares se correlacionan de forma positiva con un mayor riesgo de cáncer y algunas enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y el Alzheimer. En tumores sólidos hay ciertas zonas en las cuales el nivel de oxígeno es limitante, produciéndose la expresión de los factores inducibles por hipoxia (HIF), factores de transcripción que se encargan de inducir la expresión de genes que facilitan la adaptación celular a hipoxia. En diversos estudios con células tumorales, ninguna de ellas de neuroblastoma, se ha observado que bajo condiciones de hipoxia se producen alteraciones del metabolismo de PAs, incluyendo un incremento de la captación de PAs exógenas, de los niveles de ODC y de la síntesis de PAs endógenas. La inhibición de la actividad ODC en condiciones de hipoxia con el inhibidor DFMO conduce a un incremento en los niveles de apoptosis, lo que sugiere que las PAs podrían tener un efecto protector frente a la apoptosis en dichas condiciones. También se ha descrito que la expresión del factor inducible por hipoxia HIF1α se correlaciona positivamente con la amplificación de MYCN tanto en líneas celulares como en tumores primarios de neuroblastoma. Basándonos en estos datos previos, proponemos la existencia de una modulación cruzadaentre MYCN, hipoxia y PAs en células de neuroblastoma humano. Nos planteamos como objetivo determinar si las condiciones de hipoxia tienen un impacto sobre el metabolismo de PAs, comparando ese efecto en células con y sin amplificación de MYCN.

Financiación del proyecto: SAF2011-26518 P10-CV1-6585


Evaluación del potencial anti-angiogénico de un alcaloide con actividad antitumoral

Paloma Carrillo Fernández

Trabajo dirigido y tutorizado por Miguel Ángel Medina Torres. Departamento de Biología Molecular y Bioquímica. Facultad de Ciencias.

Introducción: La angiogénesis es el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de un lecho vascular preexistente. Una angiogénesis desregulada y persistente se relaciona con numerosas patologías, incluido el cáncer. Por ello, el uso de terapias anti-angiogénicas se ha propuesto como un enfoque novedoso y alternativo para el tratamientode dichas patologías. De aquunaas endoteliales humanas onablnti-angiogiguiente hips anti-angiogsomerasa II y el promover la parada del ciclo celular en faseí el interés que reviste el identificar nuevos compuestos moduladores de angiogénesis. Este trabajo se ha centrado en analizar el potencial angiogénico y antitumoral del compuesto boehmeriasina A (BA), un alcaloide presente en la urticácea Boehmeria siamensis. El estudio se enmarca dentro de una colaboración (propiciada por una Acción COST de la UE) con el grupo de investigación dirigido por el Dr. Daniele Passarella de la Universidad de Milán , que nos ha suministrado muestra de los dos estereoisómeros y la mezcla racémica de BA, sintetizados en su laboratorio.

Hipótesis: Entre las actividades biológicas descritas para BA se encuentran el ser inhibidora de la topoisomerasa II y el promover la parada del ciclo celular en fase G1. Dadoque en la literatura hay descritos compuestos anti-angiogénicos con actividad inhibidora sobre la topoisomerasa Il (vg.: genisteína y razoxane) y otros que paran el ciclo celular en la fase G1 (vg.: MPT0G013), parece razonable formular la siguiente hipótesis de trabajo: El alcaloide boehmeriasina A puede ser un nuevo compuesto anti-angiogénico.

Objetivos: 1) Determinar si la BA presenta actividad anti-angiogénica sobre células endoteliales humanas y compararla con su potencial actividad antitumoral frente a una línea celular de cáncer humano. 2) Evaluar las posibles diferencias de actividad biológica entre los isómeros (R)- y (S)- de la BA, comparándolos entre sí y con la mezcla racémica.

Plan de trabajo: Se emplearán dos líneas celulares diferentes: la línea celular del endoteliomicrovascular humano HMEC-1 y la línea de cáncer de mama no sensible a estrógenos MDA-MB-231. Para cubrir el objetivo primero se realizarán diversos ensayos in vitro, incluyendo los de proliferación y supervivencia celular con MTT, de análisis del ciclo celularpor citometría de flujo, de migración celular en cicatrización de herida ( Wound healing), asícomo zimografías de gelatina para metaloproteinasas de matriz extracelular 2 y 9. Además, en el caso de la línea endotelial también se realizará el ensayo de tubulogénesis sobre Matrigel. Con el fin de cubrir el segundo objetivo, se realizarán los ensayos mencionados tanto con las formas (R)- y (S)- como con la mezcla racémica de BA.

Financiación: Proyectos BIO2014-56092-R (MINECO y FEDER) y P12-CTS-1507 (Junta de Andalucía y FEDER).


Evaluación de los efectos de compuestos anti-angiogénicos sobre el estado redox celular

Jose Joaquín Serrano Morales

Director y Tutor: Dr. Miguel Ángel Medina Torres. Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga.

Introducción: El estado redox celular parece jugar un papel importante en la aparición de determinadas señas de identidad del cáncer 1. Nuestro grupo de investigación tiene un extenso historial de trabajo relacionado con la angiogénesis tumoral; en particular, identificando y caracterizando compuestos con actividad anti-angiogénica. El punto de partido de éste trabajo de investigación es comprobar si dichos compuestos también afectan al estado redox celular y poder establecer una conexión con el proceso de angiogénesis tumoral.

Hipótesis: Nuestras hipótesis de trabajo pueden enunciarse como sigue: 1) La alteración del equilibrio redox puede suponer un mecanismo esencial tanto en la transformación y progresión tumoral como en la angiogénesis. 2) Ciertos compuestos anti-angiogénicos pueden afectar al equilibrio redox celular.

Objetivos: Este estudio se marca los siguientes objetivos: 1) Aportar nuevos datos sobre la relación que existe entre el estado redox celular y la función vascular. 2) Comprobar que compuestos, anteriormente descritos por nuestro grupo como anti-angiogénicos pueden comportarse también como compuestos que modifican el balance redox celular. 3) Comprobar si existen diferencias en los efectos causados por dichos compuestos sobre el balance redox en células endoteliales y tumorales.

Plan de trabajo: Para cumplir nuestros objetivos se llevarán a cabo diversos procedimientos metodológicos basados fundamentalmente en el uso de métodos espectrofotométricos y en análisis de citometría de flujo. Los experimentos se realizarán endos líneas celulares distintas, una línea de células tumorales humanas de cáncer de mama(MDA-MB231) y una línea de células endoteliales microvasculares humanas (HMEC). Los ensayos espectrofotométricos van a permitirnos determinar la capacidad de nuestros compuestos para modificar la producción de varios tipos de especies reactivas de oxígeno (producción de óxido nítrico, anión superóxido, etc.), así como la actividad de enzimas implicadas en el control del balance redox (superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa), y la concentración de glutatión (oxidado, reducido y unido a proteínas). Mediante citometría de flujo se va a determinar la concentración de ROS totales. De cada ensayo se realizarán al menos tres experimentos distintos e independientes para valorar laconsistencia de los datos obtenidos y poder realizar sencillos análisis estadísticos para evaluar diferencias significativas entre tratamientos.

[1] Fiaschi, T., & Chiarugi, P. (2012). Oxidative stress, tumor microenvironment, and metabolic reprogramming: a diabolic liaison. International journal of cell biology Volume 2012, Article ID 762825, 8 pages



Estudio de preferencias por sustratos metabólicos y efectos de productos naturales anti-angiogénicos en células humanas

Mª Carmen Ocaña Farfán

Trabajo dirigido por Miguel Ángel Medina Torres. Departamento de Biología Molecular y Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga.

Introducción: El "redescubrimiento" del efecto Warburg y de la dependencia del crecimientode muchos tumores en el suministro de glutamina ha contribuido al renovado interés de la Oncología en el metabolismo tumoral en el presente milenio. De hecho, la "reprogramaciónmetabólica" ha sido identificada como una de las características comunes a los distintos tipos de cáncer. Por otra parte, más de 25 años de investigación candente sobre angiogénesis (el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir del lecho vascular preexistente) han permitido profundizar mucho en el conocimiento del papel que dicho proceso juega en la salud y la enfermedad. Nuestro grupo de investigación tiene unaexperiencia de 20 años en la identificación y caracterización de compuestos capaces de inhibir la angiogénesis con un potencial farmacológico. Sin embargo, poco se sabe sobre los procesos metabólicos asociados a la angiogénesis. En este trabajo nos proponemos estudiar ciertos aspectos metabólicos de las células endoteliales y la angiogénesis, así como los efectos de compuestos anti-angiogénicos descritos por nuestro grupo sobre el metabolismo endotelial y tumoral.

Hipótesis: Nuestras hipótesis de trabajo son: 1) La "reprogramación metabólica" puede afectar de forma diferente a las preferencias por sustratos metabólicos exhibidas por células endoteliales y tumorales. 2) Los compuestos anti-angiogénicos podrían afectar al metabolismo de las células endoteliales y tumorales.

Objetivos: 1) Estudio de las preferencias metabólicas por glucosa, glutamina o palmitato encélulas endoteliales y tumorales. 2) Análisis del efecto de distintos compuestos anti-angiogénicos sobre el metabolismo de células endoteliales y tumorales.

Metodología y plan de trabajo: Para el cumplimiento del primer objetivo se medirán las tasas de consumo de oxígeno y acidificación del medio extracelular utilizando cultivos celulares en presencia de distintos sustratos metabólicos mediante un analizador de flujo (Seahorse Bioscience), y además se realizarán ensayos enzimáticos clásicos tras incubar las células con estos sustratos metabólicos. Para cumplir el segundo objetivo, se llevarán acabo los ensayos enzimáticos anteriores tras incubar las células con compuestos anti-angiogénicos.



Estudio del papel de la proteína YcdX en la replicación y reparación del ADN en Escherichia coli

Andrea Nieto Quero

Trabajo dirigido por: Enrique Viguera Mínguez. Área de Genética. Depto. de Biología Celular, Genética y Fisiología. Facultad de Ciencias (UMA).

Las ADN polimerasas, se encuentran clasificadas en seis familias (A, B, C, D, X e Y) segúnsu estructura molecular, y con ello, su función. Comúnmente, las ADN polimerasas están formadas por un dominio de polimerización, con función análoga en las distintas familias de ADN polimerasas, y un dominio que generalmente tiene asociada una actividad nucleolítica. En este trabajo fin de máster nos centraremos más en una de las familias de polimerasas, la familia X. Esta familia se encuentra en distintos grupos evolutivos; desde mamíferos (Pol β, Pol λ, Pol μ y TdT) hasta arqueas, bacterias e incluso virus. En este estudio nos centraremos sobre las ADN polimerasas de la familia X, identificadas en bacterias y arqueas. Como todos los componentes de la familia X, poseen un core catalítico tipo β, formado por un dominio N-terminal de 8 kDa y un dominio de polimerización. Además, poseen un dominio específico en el C-terminal conocido como dominio PHP (dominio histidinol fosfato fosfatasa asociado a polimerasas). A este dominio PHP se le ha asignado una función exonucleasa 3’-5’, atribuida a la vía de reparación por escisión de bases (BER) y a rutas de reparación de roturas de la doble cadena de ADN (como la NHEJ).

A pesar de que en el genoma de la bacteria Escherichia coli no se han descrito ADN polimerasas de la familia X, hemos identificado que un gen, ycdX, cuyo producto proteico YcdX presenta una alta similitud con el dominio PHP de las ADN polimerasas de la familia X de bacterias y arqueas, que presenta residuos conservados fundamentales para llevar a cabo la función exonucleasa 3’-5’. La proteína YcdX ha sido clasificada dentro de la superfamilia PHP pero su función aún es desconocida. Así, en este trabajo se plantea la hipótesis de que YcdX pueda tener una función en rutas de reparación del ADN, como las rutas BER y la NHEJ.

Financiación del proyecto: BFU2007-64153


AnNCR-SNP, a tool for annotating SNPs in non-coding genomic regions

Elena Rojano Rivera

Directed by: James R. Perkins and Juan A. García-Ranea.

Genome wide association studies (GWAS) have been successful in finding genetic variantsassociated with disease, such as single nucleotide polymorphisms (SNPs). Almost 90% of these variants have been found in non-coding genomic regions, and are likely to be involved in the regulation of gene expression (Edwards et al, 2013). For example, enhancerregions found upstream of genes, influence gene expression levels through transcription factor binding. Therefore, genetic variation in these regions can affect expression levels by changing binding affinity. Thus, a tool able to identify and annotate such variants, assigning putative functions, is necessary in order to explain the effects of SNPs in non-coding regions.

We have built a workflow that looks at SNPs in noncoding regions of genes, and the 5' upstream regions of the transcription start site. It ascribes putative function for these SNPs by using data on eQTL, chromatin modifications, DNA methylation and transcription factor binding motifs. It also looks at SNPs in linkage with disease associated SNPs using the NHGRI GWAS catalogue and the 1000 Genomes data.

The workflow was used to analyse histamine related genes including the histamine receptor family. We found a number of SNPs that affect transcription factor binding and gene expression, as well as SNPs associated with traits in previous experiments, such as IgG glycosylation (Lauc et al, 2013). We are collaborating with Dr. Ralf Gutzmer from the Medizinische Hochshule in Hannover to further characterise the role of some of these genes in chronic inflammatory skin diseases and to prioritise potentially interesting SNPs for validation.

This tool can be used for a variety of potential functions, including target prioritization, the analysis of GWAS data, and to find out more about a gene or pathway of interest. We have applied it to the analysis of histamine genes and found potential new insights into their regulation. Future work includes making the workflow publicly available in the Bioconductor repository and applying it to the analysis of more genes and datasets through collaboration.

Project funded in part by the 7th Framework Programme PEOPLE-Marie Curie Actions- IAPP Mr.SymBioMath and by SAF2012-33110 and CTS-486 (Spanish Ministry of Economy and Competitiveness, Andalusian Government and Fondos Europeos de Desarrollo Regional).


Sesión IIb


Estudio molecular de la enfermedad residual en cáncer de mama y su implicación en los mecanismos de resistencia

M Rosario Chica Parrado

Director de tesis: Dr. Emilio Alba Conejo. Dpto. de Medicina, Facultad de Medicina, director del grupo de oncología traslacional del instituto de investigación biomédica de Málaga (IBIMA). Tutor de tesis: Dr. Francisco Cánovas Ramos.

Las pacientes con cáncer de mama en estadio avanzado se tratan con quimioterapia antesde la cirugía. Esta quimioterapia, denominada quimioterapia neoadyuvante ( neoadjuvant chemotherapy-NAC) tiene el objetivo de reducir el tamaño del tumor para facilitar su completa extirpación durante la cirugía. Los fármacos que suelen utilizarse en la NAC son antraciclinas (agentes intercalante del DNA) y taxanos (agente inhibidor de la despolimerización de microtúbulos) Es posible que tras la NAC el tumor desaparezca por completo. Para determinar si sigue habiendo tumor tras la NAC se estudia la respuesta completa patológica (pathologic complete response-pCR) a la NAC, que se define como la existencia de células tumorales en la mama o en un ganglio axilar. A estas poblaciones celulares las denominamos enfermedad residual. La importancia del estudio molecular de estas poblaciones celulares viene dada por su estrecha relación con una recidiva local del tumor (reaparición del tumor en la mama tras su extirpación por cirugía) cuando éstas están presentes y su teórica relación con las células diseminadas que dan lugar a la primera metástasis.

La hipótesis de esta tesis es que las células resistentes a la quimioterapia poseen determinados perfiles mutacionales y de expresión génica que son distintos a los que se encuentran en el tumor antes de ser tratado, perfiles que posiblemente también serán diferentes en cada uno de los subtipos de cáncer de mama. Además, estas células resistentes pueden ser las precursoras de las células diseminadas que dan lugar a metástasis.

Este estudio se realizará con muestras de 200 pacientes con cáncer de mama en estadio precoz. El análisis se realizará a partir de DNA y RNA extraído de tejido tumoral incluido enparafina tanto de la biopsia pre-tratamiento como de la post-tratamiento, así como de la primera metástasis (si la hubiese). Para estudiar la expresión génica utilizaremos el equiponCounter (Nanostring), analizando la expresión de 770 genes que se encuentran en 13 vías principales involucradas en cáncer, como la vía Notch, Wnt, Hedgehog, TGFB, MAPK,STAT, PI3K, RAS, etc. Para el perfil mutacional utilizaremos el secuenciador MiSeq (Illumina) para secuenciar de forma específica 52 genes involucrados, también, en cáncer.

Los objetivos de esta tesis son 1) comparar el perfil mutacional y de expresión génica de tumores primarios antes y después de ser tratados con quimioterapia, es decir, con la enfermedad residual y 2) comparar el perfil mutacional y de expresión génica de la enfermedad residual con la primera metástasis.

Esto nos permitiría identificar de forma diferencial alteraciones moleculares que nos permitan profundizar en el conocimiento de la biología molecular de los distintos subtipos de cáncer de mama en distintas etapas de su evolución, así como identificar dianas potencialmente explotables desde el punto de vista terapéutico.


Caracterización de PpMyb23, un factor de transcripción regulador del metabolismo secundario en pino

José Miguel Granados López

Trabajo dirigido por: Concepción Ávila y Rafael A. Cañas. Fisiología Molecular de Plantas. Dpto. Biología Molecular y Bioquímica. Facultad de Ciencias.

El pino marítimo (Pinus pinaster L. Aiton) es una de las especies de coníferas más importantes en el suroeste mediterráneo debido a su importancia económica y ambiental. Esta especie de pino tiene una elevada plasticidad fenotípica y está adaptada a diversas condiciones ambientales, por lo que es un excelente modelo para estudiar la adaptación al ambiente. En un trabajo previo de nuestro laboratorio, hemos caracterizado el metabolismoanual de las acículas de árboles adultos del pino marítimo en condiciones naturales mediante el análisis de redes de co-expresión de genes (WGCNA) (Cañas et al. 2015). Gracias a este análisis se pudo identificar un nuevo factor de transcripción Myb R2R3 de coníferas, que ha sido nombrado como PpMyb23, asociado al desarrollo de las acículas y al metabolismo de los flavonoides.

El análisis de su secuencia muestra que no pertenece al Subgrupo 4 de factores Myb R2R3 que han sido propuestos como los principales responsables de la regulación del metabolismo de los flavonoides en coníferas (Bedon et al. 2010). Se ha caracterizado su expresión génica a lo largo del desarrollo plantular mostrando que la acción de PpMyb23 se encuentra ligada fundamentalmente a los tejidos aéreos, principalmente a los cotiledones. De acuerdo con esto se ha observado que su expresión se reduce de manera significativa en plantas cultivadas en completa oscuridad respecto a plantas que han sido cultivadas en condiciones lumínicas normales. Para una caracterización fina de su expresión génica se han realizado RT-qPCR de muestras de tejidos obtenidos mediante microdisección láser. Este análisis ha mostrado que los transcritos de PpMyb23 se acumulan especialmente en células pertenecientes al mesófilo del cotiledón lo que se encuentra en la misma línea que los resultados anteriores. Además se ha estudiado la variación en los niveles de transcripción de PpMyb23 empleando diferentes niveles de radiación ultravioleta incidentes sobre la planta.

Cañas et al. (2015) J Exp Bot. doi: 10.1093/jxb/erv118

Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (proyecto BIO2012-33797).


Estudio bioinformático del transcriptoma reproductivo y semillero de olivo (Olea europaea L.)

Rosario Mª Carmona Muñoz

Trabajo dirigido por Juan de Dios Alché Ramírez, Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Estación Experimental del Zaidín (CSIC), Granada, y Manuel Gonzalo Claros Díaz, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Málaga.

El olivo (Olea europaea, L.) es una importante planta de cultivo en España y en la cuenca mediterránea, no solo en cuanto a producción de fruto y obtención de aceite, sino también por tratarse de una destacada fuente de alérgenos. Los transcriptomas de olivo publicadoshasta la fecha se basan principalmente en tejido vegetativo; no obstante, las peculiaridades del tejido reproductivo (estigma y grano de polen) y la presencia demostrada de transcritos específicos de estos tejidos, han motivado la generación de un transcriptoma exclusivamente reproductivo. Se han obtenido secuencias Sanger y lecturas Roche/454 correspondientes a distintos estadios de desarrollo de ambos tejidos. El diseño de un flujo de trabajo automatizado gracias a la herramienta Autoflow (Seoane et al., en prensa) ha permitido el preprocesamiento, ensamblaje y anotación de un transcriptoma reproductivo (72,846 transcritos), así como la creación de una base de datos de libre acceso llamada ReprOlive (http://reprolive.eez.csic.es) para navegar y descargar información de cualquier secuencia o conjunto de secuencias. Se recogen descripciones, términos GO, InterPro, códigos EC, así como la localización gráfica de enzimas en rutas metabólicas KEGG, ORFs, SSRs y sus correspondientes ortólogos en Arabidopsis thaliana en las bases de datos TAIR y RefSeq. También contiene datos de expresión, y, además de búsqueda por BLAST, es posible una búsqueda de carácter semántico (basadaen RDF) para extraer información más actualizada referente a enzimas, interacciones, alérgenos y estructuras. Igualmente están disponibles para ser explorados y descargados los transcriptomas parciales de polen y estigma. En el caso particular del transcriptoma parcial de polen, las anotaciones funcionales no solo han permitido identificar nuevas variantes de los alérgenos previamente ya descritos, sino también obtener una lista nuevoscandidatos a alérgenos mediante una comparación por BLAST entre los transcritos de polen de ReprOlive y los incluidos en bases de datos específicas como ALLERGOME (http://www.allergome.org). Estamos intentando localizar los epítopos relevantes para la inducción alergénica.

En relación a la semilla de olivo, su interés en la industria agroalimentaria ha ido en aumento en los últimos años, por ser fuente de valiosos componentes, tales como proteínas de almacenamiento y triacilglicéridos. Además, puede ser considerada como modelo para el estudio de la germinación y el crecimiento en plantas dicotiledóneas. Por ello se ha llevado a cabo un protocolo similar al anterior partiendo de lecturas Roche/454 de diferentes etapas de desarrollo de la semilla, con la obtención de un transcriptoma de semilla (67,162 transcritos) que será importado a la base de datos. Sus implicaciones y posibles aplicaciones biológicas están siendo analizadas en este momento.


Sesión IIIa


Supervivencia del virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV) en agua

Rocío Leiva Rebollo

Directora: Dr. Dolores Castro López. Universidad de Málaga, Facultad de Ciencias, Departamento de Microbiología.

El virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV), género Lymphocystivirus, familia Iridoviridae, es el agente etiológico de la enfermedad de linfocistis (LCD), patología con una amplia distribución geográfica que afecta a más de 140 especies de peces, tanto marinos como dulceacuícolas. En la acuicultura marina mediterránea, ésta es una enfermedad muy frecuente, siendo la única patología viral descrita en dorada.

El principal síntoma de la LCD es la aparición de pequeños nódulos blanquecinos localizados en la superficie del cuerpo y aletas, que frecuentemente aparecen agrupados en racimos con aspecto de tumores y pueden llegar a cubrir todo el cuerpo del animal. La enfermedad suele presentar una elevada morbilidad en las piscifactorías, ocasionando pérdidas económicas relacionadas con una desfiguración de los animales que impide su comercialización. Además, se han descrito episodios de elevada mortalidad, sobre todo en juveniles de pequeño tamaño, asociados tanto a infecciones bacterianas secundarias como a la afectación severa que puede ocasionar muerte por asfixia o inanición.

Las vías de transmisión del LCDV no se han dilucidado completamente, pero generalmente se asume que la transmisión ocurre por contacto directo o por exposición al virus en el agua, siendo la piel y las branquias las principales vías de entrada. Aunque el LCDV puede transmitirse por vía hídrica, al menos de forma expermiental, no existen datosreferentes a su capacidad de supervivencia y persistencia en agua de mar, lo que sería esencial para conocer la importancia del agua como vehículo transmisor del virus en las piscifactorías marinas.

En este trabajo se pretende determinar la supervivencia del LCDV en agua de mar, analizando el efecto de factores bióticos y abióticos sobre dicha superviencia.

Los ensayos se realizarán con un stock vírico de la cepa de colección ATCC VR-342, utilizando agua de mar sin tratar y sometida a diferentes tratamientos tendentes a eliminar microorganismos presentes en el agua (filtración, esterilización en autoclave, etc.). Todos los ensayos de superviciencia se realizarán a dos temperaturas (18 y 22 ºC). A distintos tiempos (0, 1, 2, 7, 15 y 30 días) se determinará en paralelo la carga viral total, mediante cuantificación del número de copias de genoma viral por PCR a tiempo real, y el título infectivo, mediante ensayo en cultivos celulares utilizando la técnica de ICC-RT-PCR (Integrated Cell Culture-RT-PCR).


Análisis de las interacciones del microorganismo Shewanella putrefaciens Pdp11 con Solea senegalensis

Jesus Miguel Moriñigo Muñoz

Directora: Mª Carmen Balebona Accino. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga.

Solea senegalensis es un pez plano con un elevado interés para la acuicultura por su elevado valor económico, lo que le convierte en una prometedora especie de cultivo. Sin embargo, la producción de juveniles de alta calidad es un cuello de botella para el despegue definitivo de su cultivo.

Hay distintos factores a los que puede achacarse esto y una adecuada nutrición constituyees una de las fundamentales. En comparación con los adultos, las larvas de los peces marinos tienen una mayor tasa de crecimiento y una menor capacidad para digerir y/o absorber nutrientes complejos. Por ello, las larvas tienen mayores requerimientos energéticos de aminoácidos, fosfolípidos y ácidos grasos altamente saturados. Este hace que la digestión sea un proceso muy relevante en su nutrición para la biodisponibilidad de nutrientes. A todo se une el que las larvas de peces están expuestas a desórdenes asociados con la microbiota intestinal, por comenzar a alimentarse cuando el digestivo y el sistema inmune no están completamente desarrollados.

En este contexto es donde la aplicación de los probióticos puede contemplarse como una estrategia más que deseable, facilitando una estabilización de la microbiota intestinal. El grupo en el que se desarrollará este trabajo aisló y caracterizó una cepa denominada Shewanella putrefaciens Pdp11 (SPPdp11), que mostró tener características beneficiosas para el lenguado senegalés. En trabajos previos se ha podido constatar que (1) la administración de SpPdp11 a larvas de S. senegalensis incrementó las tasas de crecimiento y de utilización del alimento; y (2) la existencia de diferencias significativas entre los patrones de ácidos grasos y la microbiota intestinal entre juveniles de S. senegalensis que recibieron una dieta control y otra suplementada con SpPdp11. Sin embargo, esta última relación no se ha estudiado aún en el caso de las larvas de esta especie.

En orden a obtener información sobre este aspecto, y de esta forma ampliar la perspectiva sobre el conocimiento de la interacción entre SpPdp11 y S. senegalensis, el objetivo de este trabajo será evaluar el efecto de la administración de SpPd11 sobre la microbiota intestinal y los niveles de ácidos grasos de las larvas de S. senegalensis.

Para lograr este objetivo se dispondrá de muestras de larvas cultivadas según los protocolos estándares, empleando dos regímenes de alimentación, uno el control y otro con el probiótico SpPdp11. Se procederá a tomar muestras en diferentes días del estadio larvario, analizando la composición de la microbiota intestinal y de los ácidos grasos de laslarvas, empleando para ello la técnica de la DGGE y la cromatografía gaseosa, respectivamente.


Caracterización del gen fitD en la rizobacteria Pseudomonas chlororaphis PCL1606

Francesca R. Aprile Mancha

Trabajo dirigido por Francisco M. Cazorla López. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias dela Universidad de Málaga.

La rizobacteria Pseudomonas chlororaphis PCL1606 se caracteriza por presentar capacidad antagonista frente a diversos hongos fitopatógenos de suelo. Además, P. chlororaphis PCL1606 es capaz de colonizar tanto las raíces de la planta como las hifas del hongo fitopatógeno, permitiendo así una actividad de biocontrol (Calderón et al., 2014).Recientemente la secuenciación del genoma de esta cepa ha permitido localizar una serie de genes de especial interés en P. chlororaphis PCL1606, destacando entre ellos el clusterde genes fit que codifican proteínas implicadas en una actividad insecticida (Pechy-Tarr et al., 2008; Calderón et al., 2015). El objetivo de este trabajo es poder caracterizar la actividad insecticida del gen biosintético fitD en nuestra cepa de estudio P.chlororaphis PCL1606. Para ello, se ha construido un mutante por inserción en el gen fitD, defectivo en una proteína citotóxica, se ha caracterizado molecularmente la inserción y se ha valorado la actividad insecticida comparando la cepa mutante con la cepa silvestre. Finalmente, la construcción de un complementante que restaura el fenotipo silvestre permitirá asignar la funcionalidad de este gen en P. chlororaphis PCL1606.

Este trabajo ha sido financiado por el proyecto AGL2011-30354-C02-01


Papel del 2-hexil, 5-propil resorcinol en la formación de la biopelícula en Pseudomonas chlororaphis PCL1606

Manuel Martínez Osorio

Trabajo dirigido por Francisco M. Cazorla López. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias dela Universidad de Málaga.

Pseudomonas chlororaphis PCL1606 es una bacteria con actividad de biocontrol frente a hongos fitopatógenos de suelo. Su actividad antagonista es debida a la producción del compuesto antifúngico, el 2-hexil, 5-propil resorcinol (HPR), principal metabolito responsable de la actividad de biocontrol. El uso de mutantes derivados de la cepa silvestre, afectados en los genes de biosíntesis del HPR, revela que la producción defectiva de este antibiótico influencia negativamente la colonización de las raíces del aguacate (Calderón, Claudia E., et al 2014). Por ello en este trabajo se profundizará en la posible relación de la producción de HPR con la formación de la biopelícula por parte de PCL1606 y su implicación en la colonización de la raíz del aguacate. Se estudiaran distintos parámetros relacionados en la formación de la biopelícula, su movilidad, adhesión, crecimiento en medio sólido específicos o la producción de acil-homoserinas lactona. Para estos experimentos se ensayaran mutantes en la producción de HPR y se compararan con la cepa silvestre. Resultados preliminares ya muestran el cambio en la morfología de las colonias en los mutantes defectivos en la producción de HPR.

Este trabajo ha sido financiado por el proyecto AGL2011-30354-C02-01


Sesión IIIb


Caracterización genómica de genes implicados en la respuesta inmune frente a linfocistivirus en lenguado

Carlos Carballo Pérez

Trabajo dirigido por Manuel Manchado Campaña, IFAPA centro “el Toruño”, Cádiz, y Juan José Borrego García, Depto. Microbiología, UMA.

La enfermedad de linfocistis (LCD) es una patología de origen vírico que afecta a más de 140 especies de teleósteos, incluyendo numerosas especies de importancia en la acuicultura marina de nuestro entorno geográfico como la dorada ( Sparus aurata) o el lenguado senegalés (Solea senegalensis). Su agente etiológico es el virus de la enfermedad de linfocistis (LCDV), miembro de la familia Iridoviridae.

Existe escasa información sobre la respuesta inmune del hospedador a las infecciones porel LCDV, por lo que es necesario determinar y caracterizar genéticamente los mecanismos implicados en la defensa frente a este virus, con el fin de desarrollar medidas profilácticas para el control de la LCD en el cultivo del lenguado senegalés.

Durante la realización de la presente tesis doctoral se pretende determinar y caracterizar genéticamente los genes implicados en la respuesta inmune, tanto innata como adquirida, del lenguado senegalés frente a la infección por el LCDV, así como evaluar una vacuna DNA frente a este virus.

En primer lugar, se estudiará el curso de una infección por LCDV en lenguados y su relación con la expresión de genes de inmunidad. Así, se establecerán modelos experimentales tanto in vitro (explantes primarios) como in vivo (larvas y juveniles de distinto tamaño) para analizar la infección por LCDV en lenguado senegalés y determinar los inmunogenes implicados en la respuesta defensiva frente a este virus. Además, los modelos in vivo permitirán determinar el curso de la infección y los órganos diana para la multiplicación y persistencia del virus. La expresión de inmunogenes se analizará medianteRT-qPCR, utilizando las metodologías de Open Array y qPCR basada en SYBR green, mientras que la determinación de los órganos diana se realizará mediante detección de genomas y transcritos virales por qPCR y RT-qPCR, y/o hibridación in situ.

Una vez identificados los inmunogenes diferencialmente expresados en lenguados infectados por LCDV, se procederá a la caracterización genómica de los mismos, estudiando su estructura y buscando polimorfismos de nucleótido, asociándolos a los niveles de expresión.

Finalmente, se evaluará una vacuna DNA contra el LCDV en lenguados, determinándose la inducción del sistema inmune tras administración intramuscular de la vacuna en animales juveniles.


Análisis funcional del transcriptoma haustorial de Podosphaera xanthii

Álvaro A. Polonio Escalona

Trabajo dirigido por Dr. Alejandro Pérez García. Depto. de Microbiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga.

El cultivo de las cucurbitáceas en España se ve afectado, entre otros, por el hongo biotrofoPodosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas. Este patógeno, que requiere células vegetales vivas para completar su ciclo de vida asexual, desarrolla unas estructuras especializadas denominadas haustorios. Los haustorios se desarrollan dentro de las células epidérmicas y son responsable de la relación íntima entreel patógeno y el huésped a través de la absorción de los nutrientes de la planta y la liberación de efectores relacionados con la patogénesis.

En este trabajo se pretende proporcionar información sobre las bases moleculares de la patogénesis de P. xanthii que pueda ser de utilidad para el desarrollo racional de nuevas herramientas de fitoprotección contra P. xanthii y otros oídios. Para lograr este objetivo, en primer lugar se obtendrá y analizará el transcriptoma haustorial de P. xanthii y a partir de éste se definirá el secretoma haustorial. En segundo lugar, a partir del pool de proteínas secretadas por el haustorio intentaremos identificar proteínas del hongo con un papel claveen la patogénesis a través del análisis funcional de dichas proteínas mediante silenciamiento génico inducido por hospedador (HIGS) y sobreexpresión, utilizando para ello Agrobacterium tumefaciens como vector para la expresión transitoria de ambos tipos de construcciones en las células vegetales. Por último, se identificarán en melón, las dianas de las proteínas de P. xanthii que pudieran estar implicadas en la modulación de la inmunidad del hospedador, con el fin de descubrir genes de susceptibilidad a la enfermedad (genes S). El objetivo final de este trabajo es identificar proteínas esenciales para la patogénesis de P. xanthii que pudieran ser dianas para la intervención química o el desarrollo de cultivares resistentes.

Este trabajo está siendo realizado en el marco del proyecto del Programa Estatal de I+D+I Orientada a los Retos de la Sociedad del Ministerio de Economía y Competitividad titulado: “Explotación de la genómica para el control del oídio delas cucurbitáceas” (AGL2013-41939-R). Álvaro Polonio trabaja en este proyecto con un Contrato Predoctoral del mismoMinisterio.


Papel del inhibidor de antizima-2 en la biosíntesis y contenido de histamina y serotonina en mastocitos de ratón

Carlos Acosta Andrade

Directores: Ignacio Fajardo Paredes y José Luis Urdiales Ruiz. Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias

Las poliaminas (putrescina, espermidina y espermina, PAs) son necesarias para la supervivencia y desarrollo de la mayoría de células vivas. Las antizimas (AZ) e inhibidores de antizima (AZINs) son proteínas reguladoras en los niveles intracelulares de PAs, mediante la acción sobre la ornitina descarboxilasa, la enzima limitante en la biosíntesis y transporte de PA (Murakami et al, 1992). Además de las PAs, los mastocitos (MC) sintetizan y acumulan en sus gránulos secretores otras aminas biógenas, como histamina (Hia) y serotonina (5-HT) (Wernersson & Pejler, 2014) las cuales son de vital importancia para la función de los mismos. Anteriormente, hemos realizado algunos estudios en este tipo celular relacionados con la interconexión de los metabolismos de PAs y otras aminas biógenas. Nuestros resultados mostraron que las PAs afectan a la síntesis de Hia durante etapas tempranas de la diferenciación de células de la médula ósea hasta mastocitos derivados de la medula ósea (BMMCs) inducida por IL-3 (García-Faroldi et al., 2009). Además, demostramos que las PAs están presentes en los gránulos de los MC y que son importante para la homeostasis de dichos gránulos, incluyendo el almacenamiento de Hia y 5-HT (García-Faroldi et al.,2010). Hace algunos años, se describió un nuevo inhibidor para antizima (AZIN2) (Pitkanen et al., 2001). Al contrario que su homólogo AZIN1, AZIN2 se expresa únicamente en algunos tejidos y tipos celulares, como cerebro, testículos y MC (López- García et al., 2013). En este último, se describió recientemente que AZIN2 podía actuar como un regulador local de la síntesis de PAs asociada al contenido de 5-HT de los gránulos y su liberación (Kanerva et al, 2009). Actualmente, nuestro objetivo es aumentar el conocimiento sobre el papel que AZIN2 tiene en la biosíntesis, almacenamiento y liberación de Hia y 5-HT en los gránulos de MC. En el presente estudio, hemos generado BMMCs a partir de ratones “wild-type” e hipomórficos para el gen Azin2, y hemos analizado los contenidos de PAs, Hia y 5-HT, así como algunos elementos de sus metabolismos. Como resultado, hemos observado que los niveles de PA y 5-HT están reducidos en los BMMCs hipomórficos para Azin2 comparados con sus controles, así como un aumento en las concentraciones de Hia. Análogamente, los niveles de triptófano hidroxilasa (la enzima clave en la biosíntesis de 5-HT) están disminuidos, mientras que la actividad enzimática histidina descarboxilasa (la enzima responsable de la biosíntesis de Hia) está aumentada en los BMMCs hipomórficos para Azin2. En resumen, los resultados obtenidos muestran evidencias de que AZIN2 posee un importante papel en la regulación de la biosíntesis tanto de Hia como de 5-HT, así como su almacenamiento en Mcs.

Este trabajo ha sido financiado por el SAF2011-26518 (MINECO) y el P10-CVI-6585 y Bio-267 (Junta de Andalucía). CIBERER es una iniciativa del Instituto de Salud Carlos III.

G. Garcia-Faroldi et al. (2009) J Cell Biochem. 108:261-71.

G. Garcia-Faroldi et al. (2010) PLoS One 5, e15071. K. Kanerva et al. (2009) PLoS One 4, e6858 C. Lopez-Garcia et al., PLoS One (2013) 12, e69188.


Sesión IVa


Neuroplasticidad asociada a la adicción a la cocaína

Pablo Cueto Martín

Trabajo académico dirigido por Alicia Rivera Ramírez. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología. Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga (UMA).

La cocaína es una droga de abuso que consumen millones de personas en todo el mundo y que origina serios problemas de salud, sociales y económicos. Durante el desarrollo de adicción a cocaína se producen cambios celulares y moleculares estables en diversas áreas del cerebro, entre ellas las regiones límbicas relacionadas con el sistema de recompensa. Estas alteraciones están relacionadas con el desarrollo de una necesidad muy fuerte de tipo emocional, psicológica y física para consumir la droga, y que en última instancia condicionan el comportamiento del sujeto. En definitiva, la adicción a cocaína se considera un fenómeno de aprendizaje que implica cambios fisiológicos y estructurales en las neuronas y sus conexiones, de forma que se alteran las sinapsis existentes, se forman nuevas o desaparecen.

El objetivo del presente trabajo es realizar una revisión bibliográfica sobre la plasticidad neuronal y sináptica en el cerebro producida por el consumo de cocaína y su relación con el comportamiento adictivo.

A partir de una serie de artículos científicos y revisiones recomendados por la directora del trabajo, se comenzó por la adquisición de un conocimiento básico general sobre la adicción, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes y los fenómenos de plasticidad. Para entender correctamente los circuitos cerebrales sobre los que actúa la cocaína se utilizó el atlas del cerebro de rata de George Paxinos y Charles Watson (1998).

El segundo paso fue centrar el estudio de la adicción a la cocaína. Debido a la gran cantidad de artículos publicados sobre este tema, hubo que restringir el trabajo a la teoría dopaminérgica en el sistema de recompensa, en concreto en el núcleo accumbens, debidoa que es la diana principal donde actúa la cocaína y es una pieza clave en el aprendizaje de conductas adictivas dentro del circuito de recompensa. Se realizó una búsqueda bibliográfica usando los motores de búsqueda de artículos PubMed y Google Scholar. Se utilizaron operadores booleanos como AND o NOT, junto con palabras clave como cocaine, accumbens, neuroplasticity, behaviour, medium spiny neuron,…

Finalmente, con la información obtenida se ha organizado el trabajo estudiando la plasticidad neuronal a lo largo del desarrollo de la adicción. Se ha dividido en los siguientes capítulos: 1) La cocaína induce un aumento de dopamina en el núcleo accumbens 2) El consumo continuo de cocaína produce neuroadaptaciones en las vías dopaminérgicas y glutamatérgicas 3) La neuroplasticidad producida por el consumo de cocaína es responsable de las alteraciones en el comportamiento.

Dado el impacto negativo de la cocaína en los individuos que la consumen y en la sociedad, es vital continuar investigando la relación existente entre las neuroadaptaciones inducidas por esta droga en el cerebro y los cambios de conducta característicos de la adicción, de manera que se puedan desarrollar tratamientos más efectivos.

Paxinos, G., & Watson, C. (1998). The rat brain in stereotaxic coordinates (Fourth Edition). Academic Press.


Bases Moleculares de la Adicción a Cocaína y Opiáceos

Juan Cristóbal Sánchez García

Trabajo académico dirigido por Alicia Rivera Ramírez. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga.

El objetivo del presente trabajo es realizar una revisión bibliográfica sobre las bases moleculares subyacentes a la adicción a drogas de abuso, en especial de la cocaína y los opiáceos.

A pesar de que existe una gran variedad de drogas de abuso, con diferentes estructuras químicas y dianas moleculares sobre las que actúan, todas generan un mismo efecto en elSistema Nervioso Central: un incremento en la liberación de dopamina en las vías dopaminérgicas del sistema límbico. Dicho incremento se produce principalmente en la víamesolimbica, que está involucrada en la motivación y en la recompensa. La cocaína y los opiáceos inducen el aumento de dopamina por mecanismos distintos. Mientras que la cocaína actúa bloqueando a los transportadores de dopamina presinápticos, los opiáceos actúan inhibiendo a las interneuronas GABAérgicas que ejercen un control negativo sobre las neuronas dopaminérgicas. La dopamina liberada por las drogas se une a receptores dopaminérgicos localizados en las neuronas del núcleo accumbens. Los receptores dopaminérgicos son receptores acoplados a proteínas G activadoras (familia D1) o inhibidoras (familia D2), lo que produce una activación o inhibición de diferentes cascadas de señalización intracelular que finalmente conduce a la alteración en la expresión de una gran variedad de genes. Tanto la cocaína como los opiáceos producen un aumento en la expresión de los factores de transcripción CREB y Fos, produciendo una respuesta celular transitoria. El consumo repetido de ambas drogas produce la acumulación de estos factores de transcripción, produciendo cambios estables en la expresión de genes y que seconsideran la base molecular de la adicción.

Para construir una base de conocimiento relacionado con la acción general de las drogas de abuso en el Sistema Nervioso Central, en primer lugar se consultaron revisiones y artículos científicos recomendados por la directora. A continuación, para profundizar en los mecanismos moleculares de la drogadicción, se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica mediante el uso de Google Scholar y PudMed. Debido a la gran diversidad de drogas de abuso y al gran número de estructuras a las que afectan, se limito la búsqueda a la cocaína y los opiáceos, como ejemplo de dos mecanismos de acción distintos. El núcleo accumbens fue la region de estudio elegida. Algunos términos usados en la búsqueda fueron: drug addiction, molecular mechanisms, nucleus accumbens, cocaine, opioids, DAT,opioids receptors, cAMP pathway, CREB y ΔFosB . Otras herramientas utilizadas fueron la base de datos KEGG Drug y el atlas: The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates de George Paxinos y Charles Watson. Con los datos recopilados se estructuró el trabajo de la siguiente forma: 1) Introducción; 2) Mecanismos generales de acción de las drogas de abuso; 3) Mecanismos moleculares; 4) CREB y ΔFosB.


Estudio de los niveles de expresión de proteínas en la corteza prefrontal yel bulbo olfatorio del ratón modelo del Síndrome X Frágil

Noelia del Sol Mateo de la Torre

Trabajo dirigido por Salvador Guirado Hidalgo y Mª Ángeles Real Avilés. Dpto. de Biología Celular, Genética y Fisiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga.

El síndrome X frágil (SXF) es la forma más común de retraso mental hereditario. Es una enfermedad causada por una mutación en la región promotora de gen FMR1, ligado al cromosoma X, que produce una expansión del trinucleótido CGG (>200 repeticiones) (Koukoui et al., 2007). Como resultado de la mutación se produce la hipermetilación de la región promotora y el consiguiente silenciamiento del gen, dando lugar a una expresión reducida de la proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). FMRP es una proteína reguladora del transporte y traducción de múltiples ARN mensajeros, desempeñando un importante papel en la función y maduración sináptica, y cuya falta da lugar al cuadro clínico de la enfermedad. Además de deficiencia intelectual, el SXF se caracteriza por alteraciones en el comportamiento y capacidades cognitivas así como por problemas en el aprendizaje y la memoria (Koukoui et al., 2007; McLennan et al., 2011). Estudios recientes han demostrado que FMRP puede tener una contribución más general a las funciones del cerebro, incluyendo la plasticidad y la modulación sináptica dentro de lacorteza prefrontal (Mercaldo et al., 2009), y que modelos animales para la enfermedad hanpresentado una disminución significativa en la sensibilidad olfativa en comparación con controles de tipo silvestre (Schilit Nitenson et al., 2015).

Debido a la posible implicación de estas regiones cerebrales en el SXF, este estudio se centra en la corteza prefrontal, que es la parte anterior de los lóbulos frontales del cerebro y está relacionada con funciones como la anticipación, la elección de objetivos o la planificación, además de una implicación en el comportamiento y expresión de la personalidad, y en el bulbo olfatorio que es la región más anterior del sistema nervioso y cuyas células presentan gran cantidad de proteína FMRP.

El objetivo principal de este trabajo es estudiar si existen diferencias en la expresión de proteínas ligadoras de calcio como calbindina y calretinina, proteínas transportadoras de glutamato y GABA, y la sintasa del óxido nítrico (nNOS) en la corteza prefrontal y bulbo olfatorio en el modelo animal de ratón nulo para el gen Fmr1 (Fmr1-KO) en comparación con el animal silvestre durante el desarrollo postnatal (P0, P7, P14 y P21) hasta el adulto (2, 4, 6 y 8 meses). Para determinar si existen diferencias de expresión proteica en el ratónFmr1-KO se realizaron técnicas de “Western blot” para la cuantificación de proteínas, y técnicas inmunohistoquímicas para la visualización de las mismas.

Resultados preliminares indican que existen diferencias significativas en la expresión de ciertas proteínas, como la calbindina y nNOS. En ambos casos se observa una menor concentración de proteína en el bulbo olfatorio de animales Fmr1-KO adultos mientras que en la corteza prefrontal no se aprecian diferencias significativas.

Financiado por FC 14-BFU-04. UMA.


Estudio de proliferación celular y/o neurogénesis en el modelo animal del síndrome X frágil

Eduardo Frías Anaya

Trabajo dirigido por Mª Ángeles Real Avilés y Margarita Pérez Martín. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología; Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga.

El síndrome X frágil (SXF) es la causa más común de discapacidad intelectual. Se caracteriza por la expansión de un triplete CGG en el extremo 5’-UTR del gen FMR1, provocando su metilación y su consiguiente silenciamiento transcripcional. Esta mutación lleva a la pérdida funcional de la proteína FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein). FMRP es una proteína de unión a ARNm que regula la traducción de determinadas proteínas y cuya falta da lugar a los síntomas característicos del SXF. Su función es importante en la plasticidad sináptica y en el desarrollo dendrítico tanto en etapas embrionarias como en postnatales. Estudios previos han demostrado que la falta de FMRPtambién provoca alteraciones en la neurogénesis hipocampal adulta de ratones nulos para el gen Fmr1 (Fmr1-KO), generando cambios en los patrones de proliferación y diferenciación celular, defectos en el desarrollo dendrítico y déficits en el aprendizaje y la conducta (Luo et al., 2010). La neurogénesis adulta ocurre en determinadas zonas del sistema nervioso central (SNC) de mamíferos: la capa subgranular del giro dentado y la zona subventricular de los ventrículos laterales. Las nuevas células generadas en dichas zonas se integran en los circuitos neuronales preestablecidos y contribuyen a la regulaciónde la plasticidad neuronal. Recientemente se han encontrado evidencias de una tercera zona neurogénica en el parénquima hipotalámico circundante al tercer ventrículo (Pierce and Xu, 2010; Pérez-Martín et al., 2010). El hipotálamo alberga un conjunto de núcleos implicados en la regulación endocrina y una amplia gama de procesos homeostáticos como la ingesta, los ciclos circadianos o el comportamiento reproductivo y parental. A este respecto, la neurogénesis hipotalámica parece intervenir en la regulación del equilibrio energético (Pierce and Xu, 2010).

Con este estudio se busca analizar posibles alteraciones en la proliferación celular y/o neurogénesis hipotalámica en ratones Fmr1-KO. Con el fin de estudiar la implicación de FMRP en estos procesos se compararán los resultados obtenidos con los animales silvestres. Para ello, se realizarán ensayos inmunocitoquímicos usando un anticuerpo contra fosfohistona H3 (anti-Php3), marcando las células en fase de división. Al mismo tiempo, se realizará un estudio conjunto de proliferación y supervivencia empleando el marcador bromodeoxiuridina (BrdU), análogo estructural de la timidina, inyectado vía intraperitoneal en los animales y detectado mediante inmunocitoquímica. Además se llevarán a cabo dobles marcajes, combinando el marcador BrdU con anticuerpos contra βIII-tubulina y GFAP, para así determinar si las nuevas células son neuronas o astrocitos. Para complementar estos estudios, se analizarán igualmente las dos regiones neurogénicas clásicas, el hipocampo y los ventrículos laterales, empleando una cepa de ratones diferentes a la de Luo et al., con el fin de comprobar que sus resultados son independientes de la base genética de la población de ratones.

Este trabajo está financiado por FC 14-BFU-04 UMA.


Efecto de la estabilización de los microtúbulos en la progresión de la patología en un modelo transgénico APP/PS1 de la enfermedad de Alzheimer

Juan José Fernández Valenzuela

Directoras: Dras. Antonia Gutiérrez Pérez y Raquel María Sánchez Varo. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología (Área de Biología Celular), Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. IBIMA. CIBERNED.

La progresiva pérdida de memoria, hasta llegar a la demencia, que tiene lugar en los pacientes de la enfermedad de Alzheimer (AD) se relaciona con una pérdida sináptica en las fases iniciales y posteriormente con muerte neuronal masiva, en regiones cerebrales superiores implicadas en los procesos de memoria y aprendizaje. En los pacientes con AD,la hiperfosforilación de la proteína tau conlleva la desestabilización de los microtúbulos y fallos en el transporte axonal. En consecuencia, se da una acumulación de vesículas, principalmente autofágicas, con formación de axones distróficos, contribuyendo todo ello a la aparición de fallos a nivel sináptico. Nuestra hipótesis de trabajo establece que una estabilización de la red microtubular protegería del daño axonal/sináptico induciendo una mejora cognitiva. El objetivo principal de este estudio ha sido, por tanto, analizar el efecto de un agente estabilizador de microtúbulos sobre la progresión de la patología a nivel cognitivo y tisular en un modelo transgénico APP/PS1 de esta enfermedad. Para ello, ratones APP751SL/PS1M146L de 3 meses de edad (fase pre-patológica) fueron tratados con inyecciones intraperitoneales de 2 mg/kg de Epotilona D (Epo-D) cada semana durante un periodo de tres meses. Como controles se emplearon animales PS1/APP inyectados con la solución vehículo. Al final del tratamiento, se evaluó la capacidad cognitiva de los animales mediante las pruebas del laberinto acuático de Morris ( MWM), laberinto en Y (Y-maze) y de reconocimiento de objetos. La carga de beta-amiloide (Abeta) extracelular y el área ocupada por las neuritas distróficas en la región del hipocampo fueron cuantificadas mediante análisis de imagen tras marcaje inmunohistoquímico con anticuerpos anti-Abeta 42,anti-proteína precursora amiloide (APP) y anti-ubiquitina. Los animales tratados con Epo-Dmostraron una mejora significativa en la realización de las pruebas conductuales que evalúan aspectos cognitivos asociados al hipocampo. Además, la recuperación de memoria espacial y episódica correlacionó con una reducción de la patología amiloidea y axonal/sináptica en el hipocampo. Los niveles de Abeta, APP y ubiquitina disminuyeron significativamente en los animales tratados en comparación con los animales controles. Por tanto, el tratamiento con Epo-D resultó en una sustancial mejora sináptica y cognitiva, al reducir la acumulación extracelular de Abeta y la formación de distrofias asociadas a las mismas en el hipocampo de este modelo transgénico APP/PS1. Finalmente, el uso terapéutico de agentes estabilizadores de microtúbulos podría ser considerado como una posible terapia para ralentizar la progresión de la enfermedad Alzheimer.

Este trabajo ha sido financiado por el proyecto FIS PI12/01431 y CIBERNED.


Sesión IVb


El gen supresor del tumor de Wilms (Wt1) en el desarrollo neural y en la retina adulta

Laura Ma Ariza Medina

Director, Ramón Muñoz-Chápuli Oriol. Departamento de Biología Animal. Facultad de Ciencias.

El tumor de Wilms es una variedad de nefroblastoma causada por un fallo en la diferenciación de progenitores renales, y representa la segunda causa de cáncer abdominal más frecuente en niños. El gen supresor del tumor de Wilms ( Wt1) es un regulador clave en el desarrollo del riñón y codifica para un factor de transcripción del tipo dedos de zinc C2H2, que se presenta en múltiples isoformas, aunque las principales se distinguen por la presencia o ausencia del exón 5 y del motivo KTS, entre los dedos de zinc 3 y 4. Las isoformas –KTS son reguladores transcripcionales, mientras que las +KTS intervienen en splicing e interacciones proteína-proteína. Mutaciones en el locus Wt1 estánrelacionadas también con los síndromes WAGR, Denys-Drash y Frasier, que incluyen defectos genitourinarios. La falta de función de Wt1 en ratones causa anomalías en el desarrollo de diferentes órganos, en concreto riñones, gónadas, corazón, bazo y retina.

A pesar de que el gen Wt1 se expresa en el sistema nervioso central durante el desarrollo, son muy pocos los estudios que se han hecho acerca de su función en dicho sistema. Sólose ha descrito, en mutantes sistémicos de Wt1, una menor supervivencia de las neuronas ganglionares de la retina (1), pero la letalidad temprana de este modelo impide ver si hay funciones en etapas posteriores y/o en adultos.

El objetivo de nuestro trabajo será analizar la expresión de la proteína WT1 en ratones, concretamente en neuronas del sistema nervioso central durante el desarrollo, y en la retina tanto de embriones como de adultos. Para ello se emplearán ratones derivados del cruce de la línea transgénica Wt1 loxP cruzados con ratones NestinCreERT2, con los que induciremos la represión condicional de Wt1 en progenitores neuronales y neuronas embrionarias, y Wt1CreERT2, que nos permitirá silenciar Wt1 de forma sistémica en ratones adultos mediante tratamiento con tamoxifeno. También se utilizarán ratones Wt1Cre;RosaYFP, en los que las células del linaje Wt1 expresan de manera constitutiva la proteína fluorescente YFP y Wt1GFP/+ que informa de la expresión de Wt1 en tiempo real a través de la proteína verde fluorescente GFP. Mediante ambos modelos trazaremos no sólo la expresión real de Wt1 en el sistema nervioso central y retina sino también el destinodel linaje celular que expresa este factor durante el desarrollo.

(1) Wagner et al., 2002. The Wilm´s tumor gene Wt1 is required for normal development of the retina. EMBO J 21, 1398-1402.


Estudio de la toxicidad de las placas amiloides y su impacto en la progresión de la enfermedad de Alzheimer: identificación de nuevas dianas de interés terapéutico

Cristina Núñez Díaz

Directores: Antonia Gutiérrez Pérez, Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología, Facultad deCiencias, Universidad de Málaga. IBIMA CIBERNED, y Javier Vitorica Ferrández, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla. IBIS. CIBERNED.

La enfermedad de Alzheimer es un proceso neurodegenerativo progresivo que se manifiesta con un severo deterioro cognitivo y que afecta a más de 35 millones de personas en todo el mundo. Actualmente es incurable y los escasos fármacos disponibles sólo afectan marginalmente a los síntomas. Las principales lesiones histopatológicas son: i) acumulación de proteínas agregadas en forma de placas extracelulares de péptido beta-amiloide (Aβ) y de ovillos neurofibrilares intraneuronales compuestos por la proteína tau hiperfosforilada, ii) activación microglial y astroglial con producción de citoquinas, y iii) pérdida de sinapsis y muerte neuronal selectiva. Los péptidos Aβ tienden a agregarse dando lugar a oligómeros solubles altamente tóxicos y a estructuras fibrilares insolubles, que a su vez dan lugar a las placas amiloides. La gravedad del deterioro cognitivo en los pacientes se correlaciona con los niveles de oligómeros solubles cerebrales y no con la carga total de Aβ. Nuestra hipótesis de trabajo propone que las placas amiloides actúan como reservorio de formas oligoméricas solubles de Aβ y que la glía regula la liberación deoligómeros desde las placas. De comprobarse esta hipótesis, las placas (hasta ahora consideradas como estructuras inertes) tendrían una participación activa importante en la progresión de la enfermedad. Los objetivos y la metodología son: 1) caracterizar la heterogeneidad de las placas amiloides durante la progresión de la patología en el hipocampo y la corteza entorrinal de animales transgénicos APP/PS1 de distintas edades yde muestras postmortem de pacientes en estadios Braak II-VI (técnicas histológicas e inmunohistoquímicas, microscopía óptica convencional, microscopía láser confocal, estereología y análisis de imagen); 2) determinar el papel tóxico de placas aisladas (microdisección láser) de ratones transgénicos y de muestras postmortem de pacientes en diversos estadios, así como de las fracciones solubles S1, tanto in vivo, mediante inyección estereotáxica en el cerebro de ratones silvestres (estudios conductuales, inmunohistoquímica, estereología, RT-PCR y western blots), como in vitro utilizando cultivos de neuroblastoma N2a, cultivos primarios de neuronas y de microglía (RT-PCR, western blots, citometría de flujo, inmunocitoquímica); y 3) analizar el perfil funcional de la glía que se encuentra alrededor de las placas amiloides de modelos y de pacientes durante la progresión de la patología (citometría de flujo, microdisección láser, RT-PCR, inmunohistoquímica y análisis morfométrico). Los resultados obtenidos en este trabajo podrán ser utilizados en futuros estudios preclínicos destinados a ver el efecto de nuevas terapias sobre la toxicidad de las placas y que permitan prevenir estos cambios y el daño neurotóxico.

Financiación: Proyecto FIS PI12/01431 y CIBERNED.


Caracterización y administración de células madre mesenquimales en un modelo animal de hidrocefalia congénita

María García Bonilla

Trabajo dirigido por Antonio Jesús Jiménez y tutorizado por Alicia Rivera. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga.

Las células madre mesenquimales de la médula ósea se consideran una herramienta terapéutica factible para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Sus mecanismos de reparación implican, al menos, su habilidad de migrar hacia los tejidos degenerados o dañados y la producción de factores neuroprotectores. La hidrocefalia es una enfermedad caracterizada por una acumulación neta de líquido cefalorraquídeo que provoca una dilatación de las cavidades ventriculares. En su desarrollo tiene lugar una degeneración del parénquima cerebral periventricular y de la sustancia blanca. En el presente trabajo, llevado a cabo en un modelo animal de hidrocefalia congénita, el ratón hyh, se ha estudiado la capacidad de dichas células madre de alcanzar las regiones degeneradas donde aparecen reacciones gliales y su probable efecto neuroprotector.

Las células madre mesenquimales se aislaron de la médula ósea a partir de dos fuentes diferentes: a) ratones transgénicos que expresan la proteína monomérica roja fluorescente (mRFP1); b) ratones silvestres. Antes de su aplicación, las células se analizaron por citometría de flujo y microscopia óptica y confocal. Una vez caracterizadas, las células madre mesenquimales se inyectaron en el ventrículo lateral de los ratones hyh de 20 días de edad. Después de 24 o 96 horas tras la administración, se detectaron bajo microscopia confocal y electrónica. Como controles se usaron ratones hyh de la misma edad inyectados solo con la solución vehículo.

Las células madre mesenquimales inyectadas alcanzaron las regiones periventriculares degeneradas. Se detectaron cubriendo las superficies ventriculares en contacto con los astrocitos reactivos periventriculares y las células ependimarias. También se observaron células madre mesenquimales profundamente en el parénquima nervioso, alrededor de los vasos sanguíneos y en las meninges ventrales. Se encontró que la mayoría de las células aplicadas expresaban el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) al igual que los astrocitos reactivos. Estos resultados muestran la capacidad de las células madre mesenquimales de migrar hacia zonas degeneradas, donde pueden tener un posible efecto neuroprotector y sobre la reacción astrocitaria.

Financiado por FIS PI12/0631-FEDER a AJJ.


Estudio de la existencia y función del hetroreceptor d4r-mor en los estriosomas del caudado putamen y su implicación en el tratamiento con morfina

Kirill Shumilov

Directora y Tutora: Alicia Rivera Ramírez. Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología Animal.(Área de Biología Celular).

La morfina es un potente analgésico que se utiliza en el ámbito clínico para el tratamiento paliativo del dolor. Se prescribe de forma rutinaria y efectiva para el tratamiento del dolor agudoy severo. Sin embargo, la administración prolongada de morfina debe estar estrictamente controlada por producir importantes efectos adversos, como el desarrollo de tolerancia a los efectos analgésicos y dependencia. Al igual que otras drogas de abuso, la morfina activa las vías dopaminérgicas mesolímbica y nigroestriada. La activación de la vía mesolímbica o circuitode recompensa provoca un incremento de liberación de dopamina en el núcleo accumbens y es responsable de las propiedades de refuerzo de la droga. La activación de la vía nigroestriada, que produce un incremento de dopamina en el caudado putamen (CPu), promueve el aprendizaje de hábitos de conducta relacionados con la adicción. En el CPu la morfina incrementa la liberación de dopamina al interaccionar con receptores m opioides (MOR)

localizados en las interneuronas GABA de la sustancia negra reticular (SNr), lo que provoca el cese de la inhibición tónica que ejercen sobre las neuronas dopaminérgicas de sustancia negracompacta (SNc). La actividad de las neuronas dopaminérgicas de SNc también está regulada por proyecciones GABA directas procedentes de los estriosomas del CPu. Recientemente se ha descrito que el MOR de los estriosomas tiene una función relevante en la recompensa asociada al consumo de morfina1.

Los estudios previos del grupo de investigación han demostrado que los receptores de dopamina D4 (D4R) y MOR interaccionan funcionalmente de forma antagónica, de manera que la administración de un agonista D4R durante el tratamiento agudo y crónico de morfina evita las cambios adaptativos a nivel molecular, celular y de comportamiento inducidos por esta droga, sin afectar la analgesia2,3,4. Se ha propuesto que esta interacción entre D4R y MOR se produce por la formación de heterodímeros en los estriosomas, donde ambos receptores colocalizan5. El primer objetivo de este trabajo es determinar la existencia de heterodímeros D4R-MOR en los estriosomas del CPu mediante ensayos de PLA (in situ proximity ligation). En segundo lugar se estudiará si la interacción funcional entre D4R y MOR en los estriosomas regula la actividad de las neuronas dopaminérgicas y su efecto durante la adicción a morfina. Se utilizarán diferentes estrategias con el fin de bloquear o activar la interacción D4R-MOR específicamente en los estriosomas: 1) ablación selectiva de los estriosomas; 2) inhibición de laexpresión de MOR o D4R en los estriosomas mediante siRNA (knockdown); 3) estimulación local de D4R y MOR del CPu. Se emplearán técnicas farmacológicas, bioquímicas y neuroanatómicas, así como diferentes pruebas de comportamiento para estudiar la repercusiónde la interacción D4R–MOR en los estriosomas en las conductas adictivas.

1. Cui et al. (2014) Nature Neuroscience.

2. Gago et al. (2011) Brain Research.

3. Suárez-Boomgaard et al. (2014) International Journal of Molecular Science.

4. Rivera et al. (2015) International Journal of Neuropsychopharmacology.

5. Rivera et al. (2002) Journal of Neurochemestry.

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