universiteti i tiranËs fakulteti i shkencave …...nuk ka fjalë për të përshkruar se sa...

UNIVERSITETI I TIRANËS FAKULTETI I SHKENCAVE TË NATYRËS

Departamenti i Kimisë Industriale PROGRAMI

TEKNOLOGJIA DHE MIKROBIOLOGJIA USHQIMORE & VLERËSIMI I SIGURISË DHE CILËSISË USHQIMORE

DISERTACION

Kandidati: Lurjana Lila

TEmA: “Studimi i mikrobiologjisë së lëngjeve të frutave dhe i ndikimit të rezistencës ndaj kushteve të stresit të Bifidobacterium spp, për përdorimin e tyre për përftimin e lëngjeve funksionalë

probiotikë” Udhëheqës shkencor: Prof.Dr. Rozana Troja dhe Prof.Dr. Donika Prifti

Mbrohet më dt ....../....../........... para juries:

1. Kryetar.............................................................

2. Anëtar (oponent).............................................

3. Anëtar (oponent).............................................

4. Anëtar .............................................................

5. Anëtar .............................................................

Tiranë, 2014

Falenderime Ky Dizertacion u mundësua nga shumë njerëzve të çmuar të cilët më mbështetën gjatë realizimit

të kësaj pune shkencore.

Së pari dhe mbi të gjithë do të falenderoja Udhëheqësit e mi shkencor Prof.Dr. Rozana Troja dhe Prof.Dr. Donika Prifti për mbështjetjen, inkurajimin, interesimin dhe kohën e kushtuar karshi meje.

Një falenderim i veçantë shkon për Programin e Shkëmbimit Erasmus Mundus Action 2(Joinsee.eu 2012-2013), financuar nga Komuniteti Europian, koordinuar nga Universiteti i Grazit Austri në partneritet me Universitete perëndimore dhe ballkanike, midis tyre edhe Universiteti i Tiranës, me anë të së cilit u mundësua zhvillimi i fazës eksperimentale nëpërmjet një burse Shkëmbimi Doktorature.

Gjithashtu do të doja të falenderoja Prof.Dr. Bruno Biavati, Dr. Monica Modesto, Dr. Samanta Michelini dhe të gjithë stafin e vyer të Laboratorit kërkimor të Departamentit të Shkencave dhe Teknologjive Agro-Mjedisore, Fakulteti Agrar, Universiteti i Bolognës, së cilët me eksperiencën e tyre të vyer dhe me durim më udhëhoqën dhe orientuan në punën time kërkimore.

Falenderime të veçanta dhe vlerësim maksimal ia dedikoj Prof.Dr. Spiro Drushku, i cili më ka ndjekur e këshilluar hap pas hapi, duke u bërë një sistem referifimi i vyer dhe nxitës.

Shpreh mirnjohje dhe falenderime për Prof.Dr. Pandeli Troja, për kohën e dedikuar.

Falenderoj Prof.Dr. Artan Borici, i cili ka qënë për mua mbështetës dhe këshillues i palodhur.

Falenderoj të gjithë kolegët dhe miqtë e mi, veçanërisht një falenderim shkon për Nereida Dalanaj, Sonila Vito, Dhurata Koraj dhe Eldi Lico që më qëndruan pranë dhe më nxitën në këtë mision.

E së fundmi falenderoj përzemërsisht familjen time. Prindrit dhe motrën time të cilët ashtu si kanë treguar deri tani gjatë jetës sime, kanë qënë gjithnjë në krahun tim, duke u shëndruar në një burim energjie të pashtershme dhe duke më dhënë siguri se njeriu duhet vetëm të eci përpara. Nuk ka fjalë për të përshkruar se sa mirnjohëse ju jam…

Flanederim gjithashtu për vajzën time të vogël, Annel Gordani, për durimin e treguar dhe për dritën që i jep jetës sime. Ajo nuk u mërzit për kohën që i “vodha” për tju kushtuar kësaj detyre të shenjtë.

Përmbajtja e lëndës Përmbajtja e lëndës ......................................................................................................................i

LISTA E FIGURAVE .............................................................................................................. vii

LISTA E TABELAVE ............................................................................................................. x

LISTA E GRAFIKËVE ............................................................................................................. xi

LISTA E SIMBOLEVE DHE SHKURTIMEVE ................................................................... xiv

Kapitulli 1. Hyrje ......................................................................................................................... 1

1.2 Korniza e Disertacionit ...................................................................................................... 4

Kapitulli 2. Rishikim i literaturës .............................................................................................. 5

2.1 Probiotikët. ...................................................................................................................... 5

2.1.1 Gjinia Bifidobacterium ...................................................................................... 7

2.1.1.1 Habitati ................................................................................................................. 8

2.1.1.2 Fiziologjia .............................................................................................................. 9

2.1.1.3 Struktura dhe përbërja e murit qelizor ......................................................... 10

2.2 Mekanizmi i veprimit të probiotikëve. ...................................................................... 11

2.3 Efekte pozitive shëndetësore të probiotikëve ............................................................ 11

2.4 Kritere për përzgjedhjen e probiotikëve .................................................................... 12

2.5 Produktet probiotike ....................................................................................................... 12

2.5.1 Produktet bulmetore ........................................................................................... 13

2.5.2 Frutat dhe lëngjet e frutave e perimeve si mjet mbartës për probiotikët. ................ 14

2.5.2.1 Pijet probiotike të fermentuara me bazë lëngu frutash/perimesh ............................. 14

2.5.2.2 Pijet probiotike të pafermentuara me bazë lëngu frutash/perimesh .......................... 16

2.5.2.3 Pranueshmëria e lëngjeve probiotikë. Parametra sensorialë ...................... 18

2.5.3 Produkte të tjera probiotikë ............................................................................... 19

2.6 Mbijetesa e probiotikëve në matricat ushqimore dhe në kushte të ndryshme stresi .. 19

2.6.1 Stresi ...................................................................................................................... 19

2.6.2 Përgjigjia ndaj stresit ............................................................................................ 20

2.6.2.1 Përgjigjia ndaj stresit termik ( nxehtësisë ) .......................................................... 20

2.6.2.2 Përgjigjia ndaj stresit osmotik ............................................................................. 21

2.6.2.3 Përgjigjia ndaj stresit të pranisë së kripërave biliare ......................................... 21

2.6.2.4 Përgjigjia ndaj kushteve gastrike dhe pH-it të ulët ............................................. 21

2.6.2.5 Përgjigjia ndaj stresit të shkaktuar nga oksigjeni .................................................. 21

2.7 Karakteristika të probiotikëve ..................................................................................... 22

i

2.7.1 Toleranca ndaj aciditetit dhe kripërave biliare ................................................... 22

2.7.2 Adezioni ............................................................................................................... 23

2.8 Metoda për të përmirësuar vitalitetin e qelizave ......................................................... 24

2.8.1 Aplikimi i stresit para-letal për të përdorur mekanizmat e përgjigjes ndaj stresit për të përmirësuar performancën teknologjike të Bifidobacterium.spp ................................. 24

2.8.2 Adoptimi ndaj stresit ............................................................................................. 25

2.8.3 Mikroinkapsulimi................................................................................................. 26

2.8.3.1 Metodat e mikroinkapsulimit ............................................................................... 27

2.9 Prebiotikët .................................................................................................................... 27

2.10 Kombinimi i probiotikëve ........................................................................................ 28

2.11 Sinbiotikët .................................................................................................................. 28

2.12 Karakteristikat e Boronicës .......................................................................................... 29

2.12.1 Komponimet bioaktive në boronicë ..................................................................... 30

2.12.1.1 Antocianet .......................................................................................................... 30

2.12.1.2 Polifenolet .......................................................................................................... 32

2.12.1.3 Flavonoidet ........................................................................................................ 32

2.12.2 Aktiviteti antioksidant .......................................................................................... 33

2.14 Efekti i boronicës kombinuar me probiotikë ................................................. 34

PJESA EKSPERIMENTALE ................................................................................................. 35

KAPITULLI 3. Përzgjedhja e metodave për përmirësimin e rezistencës ndaj aciditetit të shtameve të Bifidobacterium.spp ............................................................................................ 35

3.1 Përmbledhje ................................................................................................................... 35

3.2 Hyrje .............................................................................................................................. 35

3.3 Synimi i studimit ......................................................................................................... 37

3.4 Materiale dhe Metoda .................................................................................................... 38

3.4.1 Testimi i rezistencës së shtameve 24 orë/ 37°C, në TPY ( pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5) ................................................................................................................................... 39

3.4.2 Ekspozimi i vazhdueshëm i kulturave për 4 ditë në TPY pH 3.5 ........................... 39

3.5 Rezultate ....................................................................................................................... 40

3.5.1 Mbijetesa e kulturave në TPY pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5. .................................... 40

3.5.2 Ekspozimi i vazhdueshëm i kulturave për 4 ditë në TPY pH 3.5 ........................... 41

3.6 Diskutime ...................................................................................................................... 41

3.7 Konkluzione .................................................................................................................. 42

ii

KAPITULLI 4. Impakti i lëngut të boronicës si një mjedis matriks mbartës në vitalitetin e specieve të probiotikëve të izoluar, potencialisht acido-tolerantë. ........................................ 43

4.1 Përmbledhje .................................................................................................................. 43

4.2 Hyrje ............................................................................................................................. 43

4.3 Materiale dhe Metoda ................................................................................................... 45

4.3.1 Ringjallje e fenotipeve acido rezistente te ruajtura në -80°C ................................ 45

4.3.2 Studimi i rezistencës së fenotipeve probabël “acido-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng boronice ....................................................................................................... 45

4.3.3. Studimi i rezistencës së fenotipeve probabël “lëng-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng ...................................................................................................................... 46

4.4 Rezultate ........................................................................................................................ 47

4.4.1 Rezistenca e fenotipeve probabël “acido-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng ......................................................................................................................................... 47

4.4.2 Rezistenca e fenotipeve probabël “lëng-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng ......................................................................................................................................... 49

4.5 Diskutime ...................................................................................................................... 50

4.6 Konkluzione .................................................................................................................. 51

KAPITULLI 5 Adoptimi i shtameve të Bifidobacterium.spp në matricën model lëng boronice+terren i lëngshëm TPY, për të përftuar fenotipe rezistente në lëng. ................................ 52

5.1 Përmbledhje .................................................................................................................... 52

5.2 Hyrje .............................................................................................................................. 53

5.2.1 Metoda për të përmirësuar vitalitetin e qelizave ................................................... 53

5.2.1.1 Aplikimi i stresit para-letal .................................................................................. 53

5.2.2 pH-i acid si faktor stresi për Bifidobacterium.spp .................................................. 55

5.2.2.1 Targeti molekular i pH-it acid ................................................................................. 56

5.3 Materiale dhe Metoda ...................................................................................................... 57

5.3.1 Testimi i rezistencës së shtameve Bifidobacterium.spp 24 orë në lëng boronice. ......... 57

5.3.2 Parametrat e matricës përzierje Lëng Boronicë +TPY lëng. (Miks) ........................ 58

5.3.3 Adoptimi në matricën përzierje Lëng Boronice+TPY lëng (Miks). ....................... 59

5.3.4 Përfundimi i proçedurës së adoptimit për shtamet dhe vitaliteti i tyre në këtë fazë. ......................................................................................................................................... 60

5.4 Rezultate dhe Diskutime................................................................................................ 61

5.4.1 Përcaktimi i vitalitetit të shtameve 24 orë në lëngun e boronicës: ......................... 61

5.4.2 Krahasimi i vitalitetit dhe vdekshmërisë në përqindje në nivel specieje. ............... 63

5.4.3 Vitaliteti i shtameve përgjatë adoptimit në MIKS-e ............................................... 66

iii

5.4.4 Mbijetesa e shtameve në lëngun e boronicës pas adoptimit në Miks ..................... 74

5.5 Diskutime ...................................................................................................................... 76

5.6 Konkluzione .................................................................................................................. 80

Kapitulli 6. Përcaktimi i vitalitetit dhe rezistencës së fenotipeve pas adoptimit në lëngun e boronicës, inkubuar në dy temperatura ....................................................................................................... 82

6.1 Përmbledhje .................................................................................................................... 82

6.2 Hyrje ............................................................................................................................... 83

6.2.1 Jetëgjatësia e produktit probiotik ......................................................................... 84

6.2.1.1 Kinetika e testimit të jetgjatësisë ......................................................................... 85

6.2.1.2 Kurbat e mbijetesës, parametrat D dhe z. ............................................................ 85

6.3 Materiale dhe Metoda ...................................................................................................... 86

6.3.1. Studimit i vitalitetit në lëng në dy temperatura inkubimi 4°C dhe 37°C të fenotipeve të adoptuara .................................................................................................... 86

6.3.2 Percaktimi i gradës Briks dhe pH-it të lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet në kohë të ndryshme inkubimi ........................................................................................ 87

6.4 Rezultate ......................................................................................................................... 88

6.4.1 Vitaliteti i fenotipeve në lëngun e boronicës ruajtur në 4°C .................................. 88

6.4.2 Vitaliteti i shtameve në lëngun e boronicës ruajtur në 37°C .................................. 89

6.4.3 Krahasimi i kurbave të mbijetesës së shtameve në lëng në 4°C dhe 37°C ............. 93

6.4.4 Vlerat e parametrave D dhe z për shtamet në dy temperaturat e ruajtjes ....................... 97

6.4.5 Grada Briks dhe pH-i i lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet në kohë të ndryshme inkubimi .......................................................................................................... 97

6.4.6 Përcaktimi i jetgjatësisë së lëngut të boronicës me probiotikë .................................... 100

6.5 Diskutime ...................................................................................................................... 101

6.5.1 Ndryshimet në mbijetesën e fenotipeve në lëng boronice në funksion të shtamit dhe temperaturës së ruajtjes ...................................................................... 102

6.5.2 Ndikimi i përbërjes së lëngut të boronicës në mbijetesën e shtameve probiotikë ..................................................................................................................... 104

6.5.3 Ndryshimi i pH-it dhe Briks-it në lëngun e boronicës ...................................... 105

6.5.4 Jetëgjatësia e lëngut të boronicës me probiotikë .................................................... 107

6.6 Konkluzione .................................................................................................................. 107

KAPITULLI 7. Studimi i ndryshimeve probabël gjenetike të shtameve të Bifidobacterium.spp para dhe pas adoptimit. ................................................................................................................... 109

7.1 Përmbledhje ................................................................................................................. 109

7.2 Hyrje ............................................................................................................................ 109

iv

7.2.1 Ekstratktimi i ADN-së gjenomike nga kultura GRAM+ .......................................... 109

7.2.1.1 Pastërtia e ADN-së ............................................................................................ 110

7.2.1.2 Kontaminimi i ADN .......................................................................................... 111

7.2.2 Polimerase Chain Reaction PCR .......................................................................... 111

7.2.2.1 Konsiderata mbi PCR ........................................................................................... 112

7.2.3 Xhel elektroforeza ................................................................................................ 113

7.2.4. Efekti i përftimit të tolerancës acide në karakteristikat biologjike të shtameve të Bifidobacterium.spp....................................................................................................... 114

7.3 Materiale dhe Metoda .................................................................................................. 115

7.3.1 Ekstraktimi i ADN-ve nga kulturë e pastër të shtameve origjinale dhe atyre pas adoptimit në Miks .......................................................................................................... 115

7.3.2 Kuantifikimi i ADN-ve me anë të spektrofotometrit ............................................ 116

7.3.3 Kunatifikimi i ADN-ve me anë të TECAN ............................................................... 117

7.3.4 Polimerase chain reaction (PCR) .......................................................................... 118

7.3.4.1 PCR me primer BOX ......................................................................................... 118

7.3.4.2 PCR me primer ERIC ........................................................................................ 119

7.3.5 XHEL-elektroforeza ............................................................................................. 120

7.4 Rezultate ...................................................................................................................... 122

7.4.1- Kuantifikimi i ADN-ve dhe përcaktimi i pastërtisë së tyre ................................. 122

7.4.2 Krahasimi i profileve fingerprinting të shtameve origjinale me ato të adoptuar .. 123

7.5 Diskutime ...................................................................................................................... 125

7.6 Konkluzione .................................................................................................................. 126

KAPITULLI 8. Mbijetesa në lëng e dy shtameve B.breve të mikroinkapsuluara dhe “të lira” ..... 127

8.1 Përmbledhje .................................................................................................................. 127

8.2 Hyrje ............................................................................................................................ 127

8.2.1 Rezistenca e baktereve të mikroinkapsulura në kushte të ndryshme stresi ...... 128

8.3 Materiale dhe Metoda .................................................................................................... 129

8.3.1 Studimi i vitalitetit të dy shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë” 24 orë në lëngun e boronicës .............................................................................................. 130

8.3.2 Përcaktimi i kurbës së mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50mL lëng ........................................................................................................ 131

8.3.3 Përcaktimi i kurbës së mbijetesës së shtameve B.breve të mikroinkapsuluar në 20 mL lëng në dy temperatura ruajtjeje ............................................................................. 132

8.4 Rezultate dhe diskutime .............................................................................................. 133

v

8.4.1 Vitaliteti i shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë” 24 orë në lëngun e boronicës ....................................................................................................................... 133

8.4.2 Kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50mL lëng në 37°C (anaerobiozë).................................................................................. 134

8.4.3 Kurbat e mbijetesës së shtameve B.breve të mikroinkapsuluar në 20 mL lëng në dy temperatura ruajtjeje (aerobiozë)................................................................................. 134

8.5 Konkluzione .................................................................................................................. 135

Kapitulli 9. Konkluzione përfundimtare dhe tendencat kërkimore për të ardhmen. ............... 137

9.1 Konkluzione përfundimtare ......................................................................................... 137

9.2 Tendenca kërkimore të ardhshme ................................................................................ 143

REFERENCA ......................................................................................................................... 144

vi

LISTA E FIGURAVE Figura 2.1 Struktura e peptidogluaknit të B. Bifidum................................. 10 Figura 2.2 Faktorët kryesorë ndikues mbi vitalitetin e probiotikëve, që nga

prodhimi deri në traktin gastro-intestinal...................................... 20 Figura 2.3 Struktura e Antocianeve........................................................... 30 Figura 2.4 Ndryshime strukturore të antocianeve me ndryshimin e pH-it... 31 Figura 2.5 Struktura e acideve fenolike të pranishme në boronicë.................... 32 Figura 2.6 Disa struktura të flavonoideve të pranishëm në boronicë................. 32 Figura 2.7 Përpunimi i lëngut të boronicës......................................................... 33 Figura 3.1 Mbijetesa e shtameve B1522, B2426 dhe B1958, 24 orë në terren TPY me pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.0.................................................. 40 Figura 5.1 Disa nga shtamet e testuara mbi rezistencën 24 orë në lëngun e

boronicës........................................................................................... 58 Figura 5.2 a) Kalimi i suspensionit Miks + shtam, gjatë adoptimit në tubat

centrifugalë për centrifugim, b) aplikimi i centrifugimit për ndarje biomase.......................................................................................................... 60 Figura 5.3 Krijimi i kushteve anaerobike në kontenitorë me Anaerocult për inkubim në termostat............................................................................... 61 Figura 5.4 Mbijetesa e disa shtameve të ndryshme, 24 orë në lëngun e

boronicës......................................................................................... 62 Figura 5.5 Shtame të cilët nuk mbijetuan 24 orë në lëngun e boronicës.......... 62 Figura 5.6 Mbijetesa e disa shtameve gjatë adoptimit në matricën Miks në stade të

ndryshme të adoptimit.................................................................................. 67 Figura 6.1 Marrja e alikuotës për kryerjen e hollimeve limite për përcaktimin e

vitalitetit të disa shtameve pas adoptimit në lëngun e boronicës në kohë të ndryshme për inkubimin në 37°C dhe 4°C............................................ 88

Figura 6.2 Përcaktimi i gradës Briks për lëngun me inokul të ndryshëm dhe për

lëngun origjinal me anë të refraktometrit ATAGO........................... 89 Figura 6.3 Mbijetesa e shtameve në lëngun e boronicës për kohë të ndryshme

inkubimi për dy temperaturat 4°C dhe 37°C të ruajtjes.......................... 92

vii

Figura 6.4 Format qelizore të shtameve të përdorura në këtë provë në kohë të ndryshme inkubimi nga vëzhgimi i preparateve në mikroskop: a) B.pseudocatenulatum B1279 T1, b) B2339 T2 (37°C); c) B.breve B609 T7, d) B2150 T5; e) B.bifidum B1958 T4, f) B.thermofilum MB16 T7; g) B.animalis.susp.lactis M354 T4, h) RA18 T7, i) MB29 T4 dhe j) P32 T23.................................................................................................... 93

Figura 7.1 Profil i përgjithshëm i cikleve të PCR me tre stade

(skematikisht).................................................................................. 112

Figura 7.2 Ciklet e PCR të ilustruara........................................................................ 113

Figura 7.3 Ndarja e fragmenteve të ADN-ve në bazë të përmasave me anë të xhel elektroforezës........................................................................... 115

Figura 7.4 Ekstraktimi i ADN-së nga kulturë e pastër. a) krijimi i shtjellës së ADN-së pas precipitimit me EtOH b) tharja e ADN-së në ajër pas ekstraktimit.................................................................................................. 117

Figura 7.5 Kuantifikimi i ADN-ve me Spektrofotemetër........................................ 117 Figura 7.6 Kuantifikimi i ADN-ve me TECAN....................................................... 118 Figura 7.7 Karikimi i rezultateve të përqëndrimit dhe raportit gjatë kuantifikimit të ADN-ve me TECAN............................................................................ 118 Figura 7.8 Përgatitja e Miksit të reaksionit për të kryer PCR.................................... 120 Figura 7.9 PCR me primer BOX, kryer në termociklator Veriti.............................. 120 Figura 7.10 PCR me primer ERIC, kryer në termociklator Veriti............................. 121 Figura 7.11 Karikimi i miksit të reaksionit me ADN-të në puset e xhelit për

elektroforezë............................................................................................... 122 Figura 7.12 Migrimi i bandave të ADN-ve me anë të aplikimit të

xhelelektroforezës...................................................................................... 122 Figura7.13 Ngjyrosja e xhelit me Bromur etidi pas migrimit të

bandave.......................................................................................... 122 Figura 7.14 Profilet fingerprinting për 20 kampionet e ADN-ve të shtameve

origjinale dhe atyre të adoptuar; a) B.breve B609 (O), B609 (A), B2150 (O), B2150 (A), B.pseudocatenulatum B1279 (O), B1279(A),

b) B.pseudocatenulatum B2339 (O) B2339 (A), B.bifidum B1958(O), B1958 (A), B.thermofilum MB16 (O), MB16 (A),

viii

c) B.animalis.subsp.lactis M354(O), M354(A), P32(O)/(A), RA18(O), RA18(A), MB29(O) dhe MB29 (A)....................................................... 125

Figura 8.1 Përcaktimi i rezistencës së shtameve të mikroinkapsuluar dhe jo 24

orë në 6ml lëng boronice................................................................. 132

ix

LISTA E TABELAVE Tabela 2.1 Shembuj të disa studimeve bashkëkohore in vivo duke paraqitur

efektin pozitiv shëndetësor të disa shtameve të Bifidobacterium.spp probiotikë komercialë.................................................................................. 8

Tabela 2.2 Kriteret e përzgjedhjes për organizmat probiotikë për përdorim njerëzor.............................................................................................. 12

Tabela 2.3 Shembuj të pijeve probiotike komerciale me bazë lëngu fruti..... 17 Tabela 2.4 Përbërja e Boronicës, (USDA 2004) .............................................. 29 Tabela 3.1 Shtame të liofilizuara dhe origjina e tyre e izolimit......................... 38 Tabela 5.1 Shtamet e marra për testimin e rezistencës 24 orë në lëng boronice........ 57 Tabela 5.2 Parametrat e matricës model (Miks)................................................. 59 Tabela 5.3 Shtamet e përzgjedhura për adoptimin në matricën model Miks............. 59 Tabela 5.4 Rritja mesatare, rritja maksimale, rritja minimale (log CFU/mL),

humbja totale e vitalitetit të shtameve gjatë adoptimit në Miks-e dhe shkalla e tolerancës së shtameve ................................................ 69

Tabela 6.1 Shtamet e përdorura në provën e mbijetesës në lëng në 4°C dhe

37°C................................................................................................................ 87 Tabela 6.2 Parametrat D dhe z për fenotipet në lëng boronice.................................... 98 Tabela 6.3 Ndryshimi i pH-it për lëngun me inokul inkubuar në 4°C dhe

37°C................................................................................................... 99 Tabela 6.4 Ndryshimi i Gradës Briks për lëngun me inokul inkubuar në 4°C

dhe 37°C............................................................................................ 100 Tabela 6.5 Jetëgjatësia e lëngjeve (JT) me probiotikë, në 37°C dhe jetëgjatësia e parashikuar në 4°C....................................................................................... 102 Tabela 7.1 Përqëndrimi dhe raportet e pastërtisë së ADN-ve të ekstraktuara totale,

të shtameve origjinale dhe të adoptuar, sipas përcaktimit nëpërmjet spektrofotometrit.............................................................................. 123

Tabela 7.2 Përqëndrimi dhe raportet e pastërtisë së ADN-ve të ekstraktuara të

shtameve origjinale dhe të adoptuar pas hollimit të parë, sipas përcaktimit nëpërmjet TECAN......................................................... 124

x

LISTA E GRAFIKËVE Grafiku 3.1 Mbijetesa e shtameve 24 orë në TPY lëng pH 3.5............................ 40

Grafiku 4.1 Mbijetesa e fenotipeve probabël acido-rezistente në lëng boronice 24, 48 dhe 62 orë/37°C..................................................................... 47

Grafiku 4.2 Rënija e Vitalitetit (RV%), e fenotipeve probabël acido-rezistente në lëng boronice 24,48 dhe 62 orë/37°C.......................................... 48

Grafiku 4.3 Rënija e vitalitetit mesatar (RVmes) në (%) për tre shtamet për të dyja përqëndrimet fillestare të inokuli a)105dhe b)107, pergjatë 62 orëve të studimit................................................................................ 48

Grafiku 4.4 (I)Mbijetesa e fenotipeve probabël lëng-rezistente në lëng boronice 24 dhe 48 orë/37°C, (II) Rënija e Vitalitetit (RV%), e fenotipeve probabël lëng-rezistente në lëng boronice 24 dhe 48 orë/37°C......... 49

Grafiku 4.5 Krahasimi i Rënijes së Vitalitetit RV(1) e fenotipeve probabël acido-rezistente në lëng boronice 24,48 dhe 62 orë/37°C me Rënijen e Vitalitetit RV(2) e fenotipeve probabël lëng-rezistente në lëng boronice 24,48 dhe 62 orë/37°C......................................................... 49

Grafiku 5.1 Rezistenca e shtameve përpara adoptimit 24 orë në lëng boronice... 61 Grafiku 5.2 Rënia e Vitalitetit në (%) e shtameve përpara adoptimit pas 24 orë në

lëng boronice................................................................................ 63 Grafiku 5.3 Mbijetesa dhe vdekshmëria e shtameve në (%), në nivel specieje

24 orë në lëng boronice, përpara adoptimit. a) B.pseudocatenulatum, b)B. animalis subsp. lactis, c)B. Breve, d)B. thermophilum, e)B. bifidum, f)B. catenulatum, g)B. adolescentis, h) B. longum............ 64

Grafiku 5.4 Mbijetesa në % në nivel specieje, pas 24 orë në lëng boronice për të

gjitha specijet e studjuara.................................................................. 65 Grafiku 5.5 Vdekshmëria në % në nivel specieje, pas 24 orë në lëng boronice

për të gjitha speciet e studjuara......................................................... 65 Grafiku 5.6 Mbijetesa dhe vdekshmëria mesatare në përqindje e të gjithë

shtameve të testuara 24 orë në lëng boronice.................................... 66 Grafiku 5.7 Ecuria e mbijetesës së shtameve gjatë adoptimit në 41 Mikse. Vija

lineare e tendencës. Shmangia nga vija ideale (përqëndrimi qelizor konstant) për shtamet: a) B.bifidum B1958, b) B.thermofilum MB16, c) B.pseudocatenulatum B2339, d) B1279, B.animalis.subsp.lactis, e) MB29, f) RA18, g) M354, h) P32, B.breve i) B2150, j)B609...... 69

Grafiku 5.8 Ecuria e mbijetesës në fazat e fundit të adoptimit nga Miks 30 në

Miks 41.............................................................................................. 70

xi

Grafiku 5.9 Varësia e përqëndrimit qelizor në log CFU/mL, nga tre parametrat e

tjerë të matricës Miks, pH-i, Volumi i TPY dhe Volumi i lëngut, për çdo shtam: a) B.pseudocatenulatum B2339, b) B. pseudocatenulatum B1279, c) B. animalis subsp. lactis MB29, d) B. animalis subsp. lactis RA18, e) B. animalis subsp. lactis M354, f) B. animalis subsp. lactis P32, g) B. breve B2150, h)B. breve B609, i) B. bifidum B1958, j)B. thermofilum MB16............................................................................ 72

Grafiku 5.10 Rënia e vitalitetit në (%) e shtameve në Miks-e në kater vlera

pH-i................................................................................................... 73 Grafiku 5.11 Koha e parë e Reduktimit (KIR), gjatë adoptimit në Miks-e........... 73 Grafiku 5.12 Mbijetesa e shtameve dhe përcaktimi i KIR, në fazat e para të

adoptimit: a)B.pseudocatenulatum B2339, KIR 264 orë; b)B.Breve B2150, KIR 216orë; c)B.breve B609, KIR 192 orë; d) B. animalis. subsp.lactis MB29, KIR 144 orë; e) B. animalis. subsp. lactis M354, KIR 130 orë; f) B.animalis.subsp.lactis P32, KIR 120 orë; g)B.bifidum B1958, KIR 96 orë; h) B1279, KIR 72 orë i) B. thermofilum MB16, KIR 24 orë......................................................................................... 74

Grafiku 5.13 Mbijetesa e shtameve pas adoptimit 24 orë në lëng boronice........... 75 Grafiku 5.14 Krahasimi i Rënies së Vitalitetit (%) të shtameve para dhe pas

adoptimit pas 24 orë në lëng boronice............................................... 75 Grafiku 5.15 Rritja e rezistencës në lëng boronice, e shtameve pas adoptimit në

matricën Miks.................................................................................. 76

Grafiku 6.1 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.pseudocatenulatum (B2339, B1279), B.breve (B2150, B609) dhe B.bifidum (B1958), 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C................................................................. 89

Grafiku 6.2 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.animalis.subsp.lactis (MB29,

RA18, M354, P32), dhe B.thermofilum (MB16), 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C............................................................................... 90

Grafiku 6.3 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.pseudocatenulatum (B2339,

B1279), B.breve (B2150, B609) dhe B.bifidum (B1958), 194 orë në lëngun e boronicës në 37°C.............................................................. 90

Grafiku 6.4 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.animalis.subsp.lactis (MB29,

RA18, M354, P32), dhe B.thermofilum (MB16), 194 orë në lëngun e boronicës në 37°C............................................................................ 91

Grafiku 6.5 Rënija e vitalitetit të fenotipeve në lëngun e boronicës a) 4°C për

194 orë, b) 37°C për 72 orë............................................................. 91

xii

Grafiku 6.6 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të: a) B.pseudocatenulatum B2339, b) B. pseudocatenulatum B1279, 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C............................................................. 94

Grafiku 6.7 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të: c) B.animalis.subsp.lactis MB29,

d) B.animalis.subsp.lactis RA18, 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C..................................................................................... 94

Grafiku 6.8 Kurbat e mbijetesës së fenotipit të: e) B.animalis.subsp.lactis M354,

194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C............................... 95 Grafiku 6.9 Kurbat e mbijetesës së fenotipit të: j) B.animalis.subsp.lactis P32, 491

orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C...................................... 96 Grafiku 6.10 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të: f) B.breve B2150, g) B.breve

B609, 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C.................. 96 Grafiku 6.11 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të: h) B.thermofilum (MB16), i)

B.bifidum (B1958), 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C............................................................................................ 97 Grafiku 6.12 pH-i i lëgut me inokul në kohë të ndryshme inkubimi; (i) 24 orë

inkubim, (ii) 168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në temperaturën e inkubimit 4°C dhe 37°C................................................................... 99

Grafiku 6.13 Grada Briks e lëgut me inokul në kohë të ndryshme inkubimi; (i) 24

orë inkubim, (ii) 168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në temperaturën e inkubimit 4°C dhe 37°C............................................................... 96

Grafiku. 6.14 Raporti i 2D4 me 2D37 për fenotipin B.animalis.subsp.lactis P32.......... 101 Grafiku 8.1 Vitaliteti i shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë” 24 orë

në lëngun e boronicës (anaerobiozë)................................................. 134 Grafiku 8.2 Rënia e Vitalitetit (%) e shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të

lirë” 24 orë në lëngun e boronicës.................................................... 134

Grafiku 8.3 Kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50ml lëng në 37°C/anaerobiozë......................................... 135

Grafiku 8.4 Kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 20ml lëng boronice në a)37°C/aerobiozë dhe b)4°C/aerobiozë............................................................................... 135

Grafiku 8.5 Krahasimi midis kurbave të mbijetesës së shtamit të mikroinkapsuluar B.breve BR03, në 20ml lëng në 37°C anaerobiozë dhe aerobiozë................................................................................... 136

xiii

LISTA E SIMBOLEVE DHE SHKURTIMEVE

ATR Përgjigjia ndaj tolerancës acide

aw Aktiviteti i ujit

CFU Njësi formuese kolonish

CHD Sëmundje e koronareve të zemrës

CoQ10 (benzokinon-1,4) Ko-enzima Q10

D Koha e reduktimit decimal

DISTA “Departamenti i Shkencave dhe Teknologjive Agro-Mjedisore”, Universiteti i Bolonjës, Itali

dNTPs Trifosfati i dezoksiadenozinës, trifosfati i dezoksicitidinës, trifosfati i dezoksiguanizinës, trifosfati i dezoksitimidinës

EtBr Bromur etidi

EtOH Etanol

EDTA (Acidi etilendiaminotetracetik) Etilen Dinitrilo Acetik acid

EPS Ekzopolisaharide

FAO Organizata e Bujqësisë dhe Ushqimit

FM1 Fermentation Medium 1(Terren Fermentues 1)

F6PPK Fosfoketolaza e fruktozë-6-fosfatit

GEM General Edible Medium (Terren i përgjithshëm)

GI Gastro-Intestinal

HTV Humbje totale e vitalitetit

IBD Sëmundje e inflamacionit adominal

IBS Sindroma e adomit të irrituar

KIR Koha e parë e Reduktimit (orë)

LAB Baktere acido laktike

MRS deMan, Rogosa Sharp (Terren ushqyes)

NAG N-acetilglukozaminë ose N-etanoilglukozaminë

NAM Acidi N-acetilmuramik ose acidi N-acetil formik

ng Nanogram xiv

mg ATE miligramë ekuivalent alfa-tokoferol ORAC Oxygenradical absorbance capacity (Kapaciteti absorbues i radikaleve

me oksigjen radikalar) PBS Phosphate Buffer saline (Tretësirë pufer fosfat e kripëzuar)

PCR Polymerase chain reaction

RCMA Reinforced clostridial medium agar Rma Rritja maksimale Rme Rritja mesatare Rmi Rritja minimale

SCFA Short chain fatty acid (acide yndyrore me varg të shkurtër)

SDS Dodecil sulfati i natriumit

SHT Shkalla e tolerancës

TAE Tris acetat

TBE Tris borat

TEAC Trolox equivalent antioxidant capacity (kapaciteti antioksidues ekuivalent Trolox)

TGI Trakti Gastro-Intestinal

TPY Trypticase-Phytone_Yeast Extract UVA Regjioni UV me gjatësi vale 400 nm - 320 nm UVB Regjioni UV me gjatësi vale 320 nm - 290 nm UVC Regjioni UV me gjatësi vale 290 nm - 100 nm WHO World health organization (Organizata Botërore e Shëndetit OBSH) Z Rritja e temperaturës në (° C) e nevojshme për një ulje prej 1log në vlerat

e D-së

µg Mikrogram

µJ Mikroxhaul

xv

Kapitulli 1. Hyrje Duke u mbështetur në përkufizimin aktual të adoptuar, probiotikët janë

“mikroorganizma të gjallë të cilët nëse konsumohen në sasi të përshtatshme sjellin efekte pozitive shëndetësore tek konsumatori” (FAO/WHO, 2001). Në ditët e sotme, probabilisht probiotikët përfaqësojnë ushqimin arketipik funksional, dhe përkufizohen si suplement i gjallë, të cilët i japin efekte pozitive konsumatorit duke përmirësuar balancën mikrobiale intestinale (Kalliomaki et al., 2001; Brown & Valiere, 2004) dhe duke inhibuar bakteret patogjene dhe toksinë-prodhuese (Metchnikoff, 1907). Në më të shumtën e rasteve, marrja e probiotikëve sjell një rritje të numrit të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp në feçe dhe një ulje të pH-it të feçes (Bezkorovainy, 2001; Collado, Isolauri, Salminen, & Sanz, 2009; Gareau et al., 2010).

Raporte të shumfishta kanë përshkruar efektet pozitive të tyre shëndetësore mbi infeksionet gastrointestinale, aktivitetin antimikrobial, përmirësimin e metabolizimit të laktozës, reduktimin e kolesterolit, stimulimin e sistemit imunitar, vetitë antimutagjenike, antikarcinogjenike, antidiarre, përmirësimin e sëmundjeve infalmatore të zorrëve, dhe ndalimin e infeksionit nga Heliobacter pylori, nëpërmjet shtimit të shtameve të përzgjedhura në produktet ushqimore (Gomes & Malacata, 1999; Agerholm-Larsen et al., 2000; Gotcheva et al.,m 2002, Nomoto, 2005; Shah, 2007).

Sipas Sirò et al., (2008), produktet bulmetore probiotike janë produktet kryesore funksionale të gjëndura në treg. Shitja e këtyre produkteve kap shifrën prej 1.35 Milion dollarë amerikan në vitin 1999 (Hilliam, 2000, Ouwehand, 2007) dhe rreth 56% të produkteve ushqimore funksionale totale të shitura në nivel global në 2004 prej 31.1 milion dollarë amerikan (Benkouider, 2005).

Ka evidenca që matrica ushqimore në të cilën inokulohet mikroorganizmi probiotik, luan një rol shumë të rëndësishëm në efektin pozitiv të tij ndaj konsumatorit. Aktualisht kërkimet janë fokusuar paralelisht si në karakterizimin e shtameve specifike probiotike ashtu edhe në mënyrën sesi matricat ushqimore dhe përbërja e tyre dietike ndërvepron me shtamin probiotik më efiçent (Isolauri, 2007).

Lëngu i frutave është sygjeruar gjithashtu si një mjedis i ri, i përshtatshëm për tu fortifikuar me kultura probiotike sepse ky lloj produkti është tashmë i pozicionuar si një produkt ushqimor i shëndetshëm, dhe konsumohet shumë shpesh dhe besnikërisht nga një numër i madh i popullsisë botërore (Tuorila & Cardello, 2002).

Tregu i pijeve funksionale është rritur në mënyrë të qëndrueshme dhjetë vitet e fundit, me një rritje më të ndjeshme dy vitet e fundit. Sipas Datamonitor, tregu global i pijeve jo-alkoolike vlerësohet në 500 milion $ në të gjithë botën, ku Europa përfaqëson pjesën më të madhe me 189 milion $.

Gama e lëngjeve të frutave që i ofrohen sot konsumatorit është totalisht e ndryshme

nga ajo e 10 viteve më parë. Mënyra se si lëngjet e frutave konsumohen është po aq interesante sa edhe përbërësit funksionalë të përfshirë në to. Sot konsumatorët kanë

1

mundësi të zgjedhin midis lëngjeve tradicionalë, miks pudër i shtuar me nutrientë, etj...

Lëngjet e frutave konsiderohen të shëndetshëm dhe si një burim i mirë lëndësh

ushqyese. Krijimi i lëngjeve funksionalë është një mundësi shumë e mirë për të shtuar përbërës funskionalë shtesë të cilët mund të rrisin më shumë interesin e konsumatorit.

Euromonitor raporton se fushat të cilat po zhvillohen së fundmi, përfshijnë produkte

që përmirësojnë shëndetin intestinal, suportin e sitemit imunitar, menaxhimi i peshës, bukuria trupore dhe shëndeti i zemrës. Përbërësit e shtuar të përfshirë në këtë kategori janë acide yndyrore omega 3 dhe CoQ10 për shëndetin e zemrës, fibra dhe probiotikë si për shëndetin intestinal ashtu edhe për menaxhimin e peshës si edhe vitaminë D dhe zink për të rritur imunitetin. Sipas Euromonitor, tregu botëror i lëngjeve të frutave/perimeve të fortifikuar arriti vlerën prej 10 milion $ në 2008 (Fortitech.Inc 2011).

Ka një interes të lartë ndaj efekteve të mundshme pozitive të boronicës dhe

produkteve të saj, për shkak të aftësisë së lartë të saj antioksiduese, e cila është e lidhur fortësisht me përmbajtjen e antocianeve dhe total fenoleve (Kalt & Dufour 1997; Prior et al., 1998; Kalt et al., 2000). Lëngu i boronicës gjithashtu konsiderohet një burim i pasur me vitaminë C. Për më shumë përfshirja e probiotikëve në këtë lëng frutash do të rrisë vlerën ushqyese të këtij produkti si edhe të vërë në dispozicion mikroorganizma probiotikë me fekte pozitive në shëndet për një gamë të gjërë të konsumatorëve.

Duke qënë se pH-i është një nga faktorët inhibues me efekt më të lartë mbi

vitalitetin e kulturave probiotike, studimi i metodave efiçente për të rritur tolerancën e tyre karshi këtij faktori stresi janë të një rëndësie të lartë në nivel aplikues të tyre në industrinë ushqimore. Përveç pH-it, përbërësit kimikë të lëngut të frutave janë konsideruar gjithashtu si faktorë të rëndësishëm mbi ndikimin që kanë mbi mbijetesën e probiotikëve. Në lëngjet e frutave janë të përfshira substanca kimike të cilat mund të rrisin apo të ulin vitalitetin e probiotikëve.

Studimi jonë mbi mbijetesën e shtameve probiotikë në lëngun e boronicës në dy

temepratura ruajtjeje, në të ftohtë dhe në kushtet e jetgjatësisë së përshpejtuar, jep një panoramë të qartë mbi mundësinë e përdorimit të këtyre shtameve në nivel aplikues si edhe të modifikimeve të mundshme që mund të shkaktohen në lëng prej tyre.

1.1 Objektivat e studimit Në këtë studim u përdorën këto shtame probiotikë; B. pseudocatenulatum B2339, B.

pseudocatenulatum B1279, B. pseudocatenulatum B7396, B. pseudocatenulatum B1286, B. pseudocatenulatum B7003, B. animalis subsp. lactis MB29, B. animalis subsp. lactis RA18, B. animalis subsp. lactis M354, B. animalis subsp. lactis P32, B. breve B2150, B. breve B609, B. breve B912, B. Breve B632, B. Breve BR0, B. thermophilum MB16, B. bifidum B1958, B. bifidum B2334, B. bifidum VT181, B. catenulatum B684, B. catenulatum B669, B. catenulatum B1333, B. catenulatum B2120, B. adolescentis MB21, B. adolescentis B7311, B. adolescentis B7329, B. adolescentis B7162, B. longum subsp. longum B2405, B. longum subsp. longum

2

B2356, B. longum B2426, B. longum subsp. infantis B1522, B. infantis B1602, B. infantis B1652, B. longum subsp. longum B2402, B.longum B7231.

Objektivat specifikë të këtij studimi ishin

• Zhvillimi i strategjive efektive për të përmirësuar tolerancën e shtameve të bifidobaktereve ndaj stresit acid më të përshtatshme për të përftuar fenotipe acido rezistente nga shtamet të B.bifidum, B infantis, B.longum, B.breve dhe B. pseudocatenulatum, në mënyrë që të garantohet funksionalitetin i tyre, gjithashtu edhe për të diversifikuar speciet e Bifidobacterium.spp dhe llojet e produkteve të tregëtuar si probiotikë.

• Monitorimi i vitalitetit të shtameve të konfirmuara rezistente (nga studime të mëparshme) në pH 4.0, në kushtet e pH-it 3.5 për 4 ditë, për të përftuar fenotipe acido rezistente me anë të aplikimit të stresit para-letal për një periudhë të gjatë kohore.

• Përcaktimi i ndikimit të lëngut të boronicës, në kushtet e jetgjatësisë së përshpejtuar në fenotipet probabël acido-rezistente të përftuara nga aplikimi i kushteve të pH 3.5 për 4 ditë.

• Monitorimi i vitalitetit të 30 shtameve të Bifidobacterium.spp të specieve të ndryshme, 24 orë në lëngun e boronicës, si teknikë indikuese për rezistencën fillestare të këtyre shtameve ndaj karakteristikave të kësaj matrice ushqimore.

• Aplikimi i adoptimit të vazhduar të ngadaltë në Matricën model miks lëng boronice + TPY lëng, për të përftuar fenotipe lëng rezistente të cilat të mund të ruanin atributin e fituar të rezistencës, për shkak të aktivizimit të mekanizmave të ATR.

• Përcaktimi i ruajtjes së atributeve të rezistencës ndaj lëngut të boronicës të fenotipeve të adoptuara, nëpërmjet monitorimit të kurbave të mbijetesës së tyre në lëng.

• Krahasimi i ndikimit të temperaturës së ruajtjes (kushte frigoriferike dhe jetgjatësi e përshpejtuar) të lëngut inokuluar me fenotipet e adoptuara, duke monitoruar kurbat e mbijetesës së tyre në këto temperatura.

• Përcaktimi i ndryshimeve probabël të karakteristikave fiziko-kimike të lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet lëng rezistente, për të përcaktuar mundësinë e zhvillimit të aktivitetit metabolik të tyre në kushtet e dy temperaturave të ruajtjes.

• Përcaktimi i jetgjatësisë së lëngut të boronicës funksional probiotikë, në funksion të nivelit minimal të përqëndrimit qelizor të fenotipeve të inokuluara në dy temperaturat e ruajtjes.

3

• Përcaktimi i ndryshimeve probabël të profileve fingerprinting të fenotipeve para dhe pas adoptimit në matricën model miks, për të përcaktuar nivelin e ndikimit të kësaj teknike adoptimi.

• Përcaktimi i efektit mbrojtës të mikroinkapsulimit nëpërmjet krahasimit të vitalitetit të dy shtameve B.breve të mikroinkapsuluar dhe jo, në lëngun e boronicës në dy temperatura ruajtjeje.

1.2 Korniza e Disertacionit Ky disertacion përmban 9 kapituj të ndarë. Pas hyrjes së më sipërme e cila paraqet

qëllimin dhe objektivat mbi të cilat është bazuar puna, paraqitet një rishikim i detajuar i literaturës së publikuar mbi mikroorganizmat probiotikë, karakteristikat e tyre, lëngjet e frutave probiotikë dhe mbijetesa e probiotikëve në matricat e ndryshme ushqimore (Kapitulli 2). Nga kapitulli 3-8 përfshihen studimet kryesore të kryera me synim objektivin e kësaj pune kërkimore. Kapitulli 9 paraqet një përmbledhje të përgjithshme të zbulimeve në këtë punë kërkimore, konkluzione si edhe rekomandime mbi fusha studimi të ardhshme.

4

Kapitulli 2. Rishikim i literaturës

2.1 Probiotikët. Duke u mbështetur në përkufizimin aktual të adoptuar, probiotikët janë

“mikroorganizma të gjallë të cilët nëse konsumohen në sasi të përshtatshme sjellin efekte pozitive shëndetësore tek konsumatori” (FAO/WHO, 2001). Në ditët e sotme, probabilisht probiotikët përfaqësojnë ushqimin arketipik funksional, dhe përkufizohen si suplementë të gjallë, të cilët i japin efekte pozitive konsumatorit duke përmirësuar balancën mikrobiale intestinale (Kalliomaki et al., 2001; Brown & Valiere, 2004) dhe duke inhibuar bakteret patogjene dhe toksinë-prodhuese (Metchnikoff, 1907). Në më të shumtën e rasteve, marrja e probiotikëve sjell një rritje të numrit të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp në feçe dhe një ulje të pH-it të feçes, një ulje të aktivitetit të atyre enzimave bakteriale që janë të lidhura me zhvillimin e kancerit në zorrë dhe gjithashtu dhe efekte pozitive kundër shumë sëmundjeve (Bezkorovainy, 2001; Collado, Isolauri, Salminen & Sanz, 2009; Gareau et al., 2010).

Kryesisht probiotikët i takojnë gjinive Lactobacillus dhe Bifidobacterium, megjithatë edhe mikroorganizma të tjerë duke përfshirë Propionibacteria, Leuconostoc, Pediococci, Enterococci dhe Escherichia coli janë konsideruar gjithashtu si kultura probiotike. Kulturat probiotike për përdorim, mund të përfshijnë një ose më shumë shtame mikrobiale (Champagne & Møllgaard, 2008; Gardiner et al., 2002).

Raporte të shumfishta kanë përshkruar efektet pozitive të tyre shëndetësore mbi infeksionet gastrointestinale, aktivitetin antimikrobial, përmirësimin e metabolizimit të laktozës, reduktimin e kolesterolit, stimulimin e sistemit imunitar, vetive antimutagjenike, antikarcinogjenike, antidiarre, përmirësimin e sëmundjeve infalmatore të zorrëve, dhe ndalimin e infeksionit nga Heliobacter pylori nëpërmjet shtimit të shtameve të përzgjedhura në produktet ushqimore (Gomes & Malacata, 1999; Agerholm-Larsen et al., 2000; Gotcheva et al., 2002, Nomoto, 2005; Shah, 2007). Bakteret acido-laktike (LAB) dhe bifidobakteret, janë bakteret më të studjuara dhe të aplikuara gjërësisht në fushën e probiotikëve, ato janë përbërës të zakonshëm të mikroflorës intestinale dhe paraqesin një traditë të hershme dhe të sigurt në industrinë ushqimore. Duhet pasur parasysh se kur ndërpritet marrja e probiotikëve, ato nuk gjënden më të pranishme në feçe, gjë e cila tregon se edhe pse nuk kolonizojnë, këto baktere vazhdojnë të qëndrojnë metabolikisht aktive, duke sjellë kështu efekte pozitive tek konsumatori. Si rrjedhim për të siguruar efektin pozitiv, rekomandohet marrja e tyre e vazhdueshme, edhe pse të dhëna të veçanta mbi qëndrueshmërinë e kulturave të caktuara, nuk japin një parashikim të mjaftueshëm mbi funksionalitetin probiotik në kushte të ndryshme (psh, mbijetesa në stres acid apo në prani të kripërave biliare). Edhe pse nuk ka një marrveshje të mirfilltë mbi dozën efektive, shumë autorë kanë sygjeruar një dozë optimale midis 106-109 CFU/ditë për të siguruar një efekt terapeutik (Vasiljevic & Shah, 2008).

Mikrorganizmat probiotikë kanë një zhvillim të kënaqshëm në kushte anaerobike në 37°C, dhe mund të numërohen pas 48-72 orë inkubim. Bakteret më gjerësisht të përdorura në produktet probiotike përfshijnë specie të Lactobacillus dhe Bifidobacterium. Konkretisht mikroorganizma të përdorur si probiotikë janë; për gjininë Lactobacillus; Lb.acidophilus, Lb.plantarum, Lb.casei, Lb.rhamnosus,

5

Lb.debrueckii.subsp.bulgaricus, Lb.fermentum, Lb.johnsonni, Lb.gasseri, Lb.salivarious, Lb.reuteri, Lb.brevis, Lb.helveticus, Lb.lactis, Lb.paracasei, Lb.amylovorus. Për gjininë Bifidobacterium: B. bifidum, B. infantis, B. adolescentis, B.longum, B.breve B. lactis e të tjerë si Sacccaromayces boularddi E. faecium, etj... (adoptuar nga Brunser & Gottel, 2010; Farnworth, 2001; Gorbach, 2002; Holzapfelet.,al 1998).

Shtame të Lb. acidofilus kanë paraqitur aktivitet të mirë në traktin tretës njerëzor, duke shëruar konstipacionin kronik (Rettger, 1935). Në studime të mëvonshme janë përfshirë speciet e mëposhtme të LAB intestinale të cilat paraqesin veti pozitive shëndetësore, duke i paraqitur ato si probiotikë, Lb.rhamnosus, Lb.casei, dhe Lb. johnsonii (Tannock, 2003). Shtamet e Lactobacillus janë përdorur gjërësisht në produkte të ndryshme e të shumta komerçiale. Shtamet kryesore të përdorura janë Lb. acidophilus, Lb. amylovorus, Lb. bulgaricus, Lb. casei, Lb. fermentum, Lb. gasseri, Lb. johnsonii, Lb. lactis, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. reuteri, Lb. rhamnosus dhe Lb. salivarius.

Kohët e fundit është shtuar përdorimi i specieve të Bifidobacterium në treg. Shtamet kryesore komerciale janë, B. adolescentis, B. animalis, B. bifidum, B. brevis, B. infantis, B. lactis dhe B. longum. Siaps Espinoza dhe Navarro (2010), kryesisht probiotikët janë shtuar në kos dhe në produkte të tjera bulmeti të fermentuara. Megjthatë produktet e bulmetit mund të paraqesin jo përshtatshmëri për disa konsumatorë për shkak të përmbajtjes në to të laktozës dhe kolesterolit. Si rrjedhim kërkesa për produkte probiotike vegjetariane është duke u shtuar vazhdimisht (Ray & Sivakumar, 2009). Ky fakt ka çuar drejt zhvillimit të produkteve probiotike nga disa matrica ushqimore duke përfshirë frutat (Prado et al., 2008) dhe perimet (Yoon, et al., 2006). Përparimet teknologjike kanë bërë të mundur ndryshimin e disa karakteristikave strukturale të matricave të frutave dhe perimeve duke modifikuar në këtë mënyrë komponentët e ushqimit në një drejtim të kontrolluar (Betoret et al., 2003). Një gjë e tillë mund t’i bëjë ato substrate ideale për kulturat probiotike duke qënë se ato përmbajnë edhe komponentë të tjerë me efekt pozitiv ushqyes si minerale, vitamina, fibra dietike dhe antioksidantë (Yoon et al., 2004) dhe nuk kanë në përbërje të tyre komponentë alergjenë bulmetor dhe mund të parandalojnë konsumin e këtyre të fundit nga një segment i caktuar konsumatorësh (Luckow & Delahunty, 2004). Ka një interes xhenuin në zhvillimin e pijeve funksionale probiotike me bazë fruti, sepse profili i tyre shijor është tërheqës për të gjithë grupet e konsumatorëve dhe sepse ato ruhen si produkte ushqimore të shëndetshme dhe freskuese (Tuorila & Cardello 2002; Yoon et al., 2004; Sheehan et al., 2007).

Sipas Sirò et al., (2008), produktet bulmetore probiotike janë produktet kryesore funksionale të gjëndura në treg. Shitja e këtyre produkteve kapi shifrën prej 1.35 Milion dollarë amerikanë në vitin 1999 (Hilliam, 2000; Ouwehand, 2007) dhe rreth 56% të produkteve ushqimore funksionale totale të shitura në nivel global në 2004 prej 31.1 milion dollarë amerikanë (Benkouider, 2005). Tregjet kryesore të produkteve bulmetore probiotike janë vendet Skandinave, Hollanda, Svicra, Kroacia dhe Estonia. Greqia, Franca dhe Spanja konsiderohen si tregje në zhvilllim (Mäkinen-Aakula, 2006). Gjermania, Franca, Mbretëria e Bashkuar dhe Hollanda përfaqësojnë 2/3 e të gjithë shitjeve të produkteve bulmetore funksionale në të gjithë Europën (Hilliam, 2000). Këto produkte kanë paraqitur një rritje të konsiderueshme, duke e çuar volumin e tregut në Gjermani në rreth 5milion dollarë Amerikanë në vitin 1995, 419 milion

6

dollarë amerikanë në vitin 2000, prej të cilave 301 million dollarë amerikanë i atribuohen kosit pro-prebiotike si dhe koseve të tjerë funksionalë dhe rreth 118 milion dollarë amerikanë i atribuohen pijeve bulmetore funksionale (Menrad, 2003).

Megjithatë paraqitet një kërkim shumë i gjërë si dhe një aktivitet zhvillues në lidhje me probiotikët, gjë e cila ka sjellë në treg një numër më të madh produktesh të reja të veçanta bulmetore si Kefir i lëngët Synbiofir, kosi i lëngët Synbioghurt, pije e fementuar Hun Cult, salcë kosi Milli Premium, ëmbëlsirë QUARK Aktivit, krem gjalpi New Partz dhe krem djathi Probios (Szakály, 2007; Sirό et al., 2008).

Lëngu i frutave është sygjeruar gjithashtu si një mjedis i ri, i përshtatshëm për tu fortifikuar me kultura probiotike sepse ky lloj produkti është tashmë i pozicionuar si një produkt ushqimor i shëndetshëm, dhe konsumohet shumë shpesh dhe besnikërisht nga një numër i madh i popullsisë botërore (Tuorila & Cardello, 2002). Megjithatë kërkimet kanë treguar se janë hasur shije dhe aromë tipike si ato të produkteve të bulmetit, të medikamenteve dhe shije pikante të lidhura me lëngun e portokallit probiotik (Luckow & Delahuntz, 2004; Luckow et al., 2006) fakte që mund të jenë kufizuese për konsumimin e këtij produkti.

2.1.1 Gjinia Bifidobacterium Baketert acido-laktike kanë një histori të gjatë në përdorimin e tyre në ushqimet e

fermentuara. Megjithatë shpesh është drejtuar pyetja pse Bifidobacterium u bashkuan me Lactobacillus si një target për kërkimin probiotik dhe aplikimin komercial. Nisur nga një prespektivë historike, pati disa arsye shkencore dhe teknologjike për zhvillimin fillestar në interes të kësaj gjinie. E para midis këtyre arsyeve ishte se dihej se ato përbënin grupin e popullatës më të madhe midis mikroflorës intestianle (Mitsuoka,1982). Interesi për të përforcuar numrin e këtyre baktereve në traktin intestinal, buroi nga studime që treguan që Bifidobacterium.spp përbënin popullatën mikrobiale dominante në numër në traktin intestinal të infantëve të cilët ishin ushqyer me gji krahasuar me ato të ushqyer me qumësht lope (Benno et al., 1984, Balmer & Wharton., 1990). Fakt tjetër i rëndësishëm është, që niveli i Bifidobacterium.spp është treguar se ulet me kalimin e moshës, dhe zëvendësohet me baktere putrifikuese, në veçanti me Clostridia dhe Enterobacteria. Si Lactobacillus, edhe Bifidobacterium janë konsideruar të dëshirueshme, si baktere promovuese të shëndetit, me një fiziologji saharolitike dhe acidogjenike, dhe pa përfshirjen e reaksioneve putrifikuese, toksikogjenike ose patogjenicitet (Ross, 2004).

Gjithashtu faktorë teknologjikë thjeshtësuan adoptimin e Bifidobacterium.spp si probiotikë. Bifidobacterium.spp prodhojnë laktate dhe acetate gjatë fermentimit të sheqernave, pa formim gazi, dhe shumica e shtameve nuk kompromentojnë cilësitë organo-leptike të produkteve të fermentuara bulmetore. Shumë specie rriten mirë duke përdorur laktozën si një burim karboni, si rrjedhim ato mund të përdoren në produkte bulmetore të fermentuara, të cilat janë edhe mjeti tradicional ushqimor i përdorur për Lactobacillus probiotik. Me teorinë se dy është më mirë se një, Bifidobacterium.spp probiotikë tani paraqiten përkrah Lactobacillus.spp në një proporcion të gjërë produktesh funksionalë probiotikë.

Bifidobacterium.spp u përshkruan fillimisht nga Tissier në (1899). Ai izoloi bakteret nga feçet e foshnjave të ushqyera me gji. Që nga ajo kohë taksonomia e Bifidobacterium.spp ka ndryshuar. Në vitin 1974, ato u njohën si gjinia Bifidobacterium, emër fillimisht i përzgjedhur nga Orla-Jensen në 1924 (Gardiner

7

et al., 2002). Brënda gjinisë së Bifidobacterium, sipas (Turroni et al., 2011), janë përshkruar 37 specie. Vetëm gjashtë specie janë konsideruar si probiotikë (Tamime, 2002).

Bifidobacterium.spp karakterizohen si baktere Gram-pozitive, katalazë negative, cilindrike polimorfike të degëzuara, të palëvizshme dhe josposporoformuese, anaerobike, heterofermentative (Dellaglio & Felis, 2005; Tannock, 2002a). Morfologjia e Bifidobacterium.spp varet nga shtami/specia si edhe nga kushtet e kulturës së përdorur (Gardiner et al., 2002). Morfologjia qelizore jep një ndihmë të vogël në identifikimin e izolateve si Bifidobacterium, megjithatë ajo mund të jetë një mënyrë për të dalluar një specie bifidobakteriale (Biavati & Mattarelli, 2006; Tannock, 2002b). Metoda më e vlefshme dhe më e besueshme jo molekulare për identifikimin e Bifidobacterium.spp është përcaktimi i fruktozë-6-fosfat fosfoketolazës (F6PPK). F6PPK është enzima kyçe e metabolizmit të hekzozës nga Bifidobacterium.spp quajtur “bifidus shunt” (Biavati & Mattarelli, 2006). Fermentimi i glukozës nëpërmjet kësaj rruge metabolike prodhon acid acetik dhe laktik në një raport teorik 3:2 (Scardovi, 1986). Diferencimi i specieve të Bifidobacterium mund të arrihet duke përdorur disa teste biokimike si fermentimi i karbohidrateve, lloji i strukturës së murit qelizor si edhe testet elektroforetike të proteinave qelizore, megjithatë teknikat molekulare (si analiza e sekuencës së gjenit 16S rRNA) janë testet më të vlefshme në identifikimin e specieve të Bifidobacterium (Dellaglio & Felis, 2005; Tannock, 2002b). Në Tabelën 2.1 paraqiten shembuj të efekteve pozitiveve klinike të dy specieve Bifidobacterium probiotikë të disponueshëm zakonisht në treg.

Tabela 2.1 Shembuj të disa studimeve bashkëkohore in vivo duke paraqitur efektin pozitiv shëndetësor të disa shtameve të Bifidobacterium.spp probiotikë komercial.

Shtami i Bifidobacterium Efekti shëndetësor Referenca probiotik B. animalis.subsp.lactis BB-12® (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, Denmark)

Lehtësimin e simptomave të egzemës atopike, ulja e frekuencës dhe kohëzgjatjes së diarresë tek foshnjat, reduktimin e incidencës së infeksioneve respiratore tek foshnjat

(Fukushima et al., 1998; Isolauri et al.,2000; Taipale et al., 2011; Weizman et al., 2005)

B. lactis HN019 (tregëtuar si DR10 nga Fonterra, New Zeal & HOWARU Bifido nga Danisco, USA)

Ulja e numrit të parashkollorëve hekur-defiçent, ndryshime të dëshiruara në mikroflorën intestinale tek të rriturit njerëzor, fuqizim i imunitetit tek të rriturit, reduktim i agresivitetit të infeksioneve nga E. coli O157: H7, Rritje të rezistencës ndaj infeksioneve orale nga Salmonella typhimurium, etj...

(Ahmed et al., 2007; Gill, Rutherfurd, Cross, et al., 2001; Prescott et al., 2008; Sazawal et al., 2010; Shu & Gill, 2001; Shu et al., 2000)

Moussavi (2012).

2.1.1.1 Habitati Habitati i Bifidobacterium.spp është kryesisht trakti intestinal i kafshëve me

gjak të ngrohtë. Ato ndonjëhëre përfshihen në ndonjë proçes infeksioni tek

8

njerzit (në më të shumtën karies së dhëmbëve) por ato zakonisht konsiderohen jo-patogjenë (Biaviati & Mattarelli 2001). Zakonisht, speciet e Bifidobacterium janë specifike për mbartësin human apo mbartësin kafshë, përjashtimi i vetëm është rasti i specieve të gjetura në mikroflorën intestinale si të viçit në gji ashtu edhe tek foshnja e ushqyer me gji. Gjithashtu Bifidobacterium.spp janë gjetur në ujra të zeza dhe në produktet e qumshtit të fermentuar.

Studime të kryera kanë treguar se Bifidobacterium.spp përbëjnë deri në 75 % të mikroflorës totale të foshnjave të ushqyer me formulë dhe deri në 91 % të foshnjave të ushqyer me gji (Harmsen et al., 2000).

2.1.1.2 Fiziologjia • Metabolizmi i karbohidrateve

Bifidobacterium.spp janë kemorganotrof ( organizma të cilët përdorin komponime organike si burim energjie) dhe kanë një metabolizëm të tipit fermentativ. Ato prodhojnë acide nga një seri karbohidratesh, kryesisht acid laktik dhe acetik në një raport teorik 1.0:1.5 dhe pa gaze. Specie të ndryshme prodhojnë sasi të ndryshme acetati, laktati, etanoli dhe formate në të njëtat kushte. Katabolizmi i hekzozave tek speciet e Bifidobacterium përfshin një rrugë karakteristike e njohur me emrin rruga fruktozë 6-fosfate (F6P) (Scardovi, 1964; Scardovi & Trovatelli, 1969; De Vries et al., 1968). Enzima kyçe e kësaj rruge metabolike është F6PPK (Biavati & Mattarelli 2001) që katalizon dekompozimin (shpërbërjen) e monofosfatit të pentozit, në fosfat acetili dhe aldehid fosfo-3-glicerik.

Bifidobacterium.spp janë në gjëndje të rriten në një gamë të gjërë burimesh karboni duke përfshirë mono-, di-, tri- dhe oligo-saharide. Ky fakt i jep Bifidobacterium.spp një avantazh ekologjik në mjedisin intestinal ku janë të pranishme karbohidrate komplekese edhe si pasojë e prodhimit nga epiteli i njeriut ashtu edhe nëpërmjet marrjes nga djeta.

Aftësia e një shtami për të fermentuar sheqerna të veçanta është një nga testet e para të përdorura për të identifikuar speciet. Janë testuar sheqerna të ndryshëm dhe rezultatet e marra janë karahasuar me tabelat identifikuese të prodhuara nga (Mitsuoka 1982, 1984) dhe (Scardovi, 1986).

• Temperatura dhe pH-i optimal i rritjes

Meqënëse Bifidobacterium.spp janë baktere intestinale të kafshëve me gjak të ngrohtë, temperatura optimale e rritjes varjon nga 37°C deri 41°C dhe pH-i optimal në fillim të rritjes është midis 6.5 dhe 7.0 (Biavati & Mattarelli 2001). Pjesa më e madhe e specieve nuk rriten nën 20°C dhe mbi 46°C dhe në pH më të ulët se 4.5 ose më të lartë se 8.5 me përjashtim të B. thermacidophilum, i cili është i aftë të rritet në pH 4.0 dhe temperaturë 49°C (Dong et al., 2000).

• Ndjeshmëria ndaj oksigjenit

Bifidobacterium.spp janë mikroorganizma strikt anaerobë dhe të ndjeshëm ndaj oksigjenit. Megjithatë ndjeshmëria ndaj oksigjenit ndryshon midis specieve dhe shtameve (Biavati & Mattarelli 2001). Për disa shtame të Bifidobacterium.spp

9

është përshkruar se janë rritur në terren të lëngshëm në prani të oksigjenit. Psh, B. lactis toleron 10 % oksigjen në atmosferën mbi terrenin e lëngshëm (Meile et al., 1997). Maxwell et al., (2004) kanë treguar se B. boum DSM 20432T u rrit me të njëjtin densitet optik në ajër krahasuar me kushtet anaerobike. B. thermophilum ka treguar të jetë tolerant ndaj ekspozimit në ajër dhe u rrit në atmosferë me oksigjen të reduktuar (Beerens et al., 2000; von Ah et al., 2007) dhe gjithashtu një Bifidobacterium i izoluar rishtaz, B. psychraerophilum, u zbulua se është aerotolerant (Simpson et al., 2004).

2.1.1.3 Struktura dhe përbërja e murit qelizor Muri qelizor i Bifidobacterium.spp ka strukturën tipike të baktereve Gram

pozitive, dhe përbëhet nga një zarf i trashë peptidoglukani që përmban polisaharide, proteina dhe acid teikoik. Përbërësi kryesor i murit qelizor është mucopeptide, peptidoglukan, ose murein. Ky përbërës është një makromolekulë që konsiston në zinxhirë linearë polisaharidesh të cilët janë të lidhur me njëri-tjetrin me anë të urave tetrapeptide shoqëruar me peptide. Zinxhiri polisaharidik përbëhet nga alternime të N-acetilglukozaminë (NAG) (N-etaoilglukozaminë) dhe acidi N-acetilformik (NAM). Tetrapeptidet janë të lidhura me mbetjet NAM dhe me njëri-tjetrin nëpërmjet peptideve ndërmjetëse (Fig.2.1). Amino acidet që përbëjnë pëptidet e ndryshme janë alaninë, acid glutamik, ornitinë (acidi diamino -2,5- pentanoik) ose lizinë (acidi diamino -2,6- hekzanoik), shoqëruar me një ose dy nga komponimet e mëposhtme: acidi aminoacetik, serinë (acidi amino-2-hidroksi-3-propanoik), acidi aspartik (acidi amino-2-butandioik 1,4), ose treoninë (acidi amino-2-hidroksi-3-butanoik) ( Cummins et al., 1957, Veerkamp et al., 1965).

- - - - - NAG - NAM NAG NAM - - - - - L-Alaninë L-Alaninë D-Glutamik acid D-Glutamik acid L-Ornitinë L-Ornitinë L-Serinë L-Serinë L-Aspartic acid D-Alaninë D-Alaninë

Figura 2.1 Struktura e peptidogluaknit të B. Bifidum (Ballongue, 1989)

Amino acidet mund të jenë të njëjta ose të ndryshme nga një shtam tek tjetri, por edhe pse mund të jenë të njëjtë, sekuenca e tyre në tetrapeptide dhe tipi i tyre i lidhjes-kryq mund të ndryshojë (Kandler et al., 1974) psh., mund të përbëhet nga një aminoacid i thjeshtë, nga një dipeptid ose nga një tripeptid. B. longum, për shëmbull, zotëron një tetrapeptid të tipit ornitinë dhe peptidi i lidhur është L-Ser–L-Ala–L-Thr–L-Ala (Rasic et al., 1983). Ky makropeptid është i lidhur me lidhje kovalente me makromolekula të tjera, si psh (a) poliozide: glukozë, galaktozë dhe ramnozë duke pëbërë porcionin polisaharidik të murit, dhe (b) acide teikoik, të

10

cilët janë polimere të glicerol fosfatit. Këto acide teikoik janë të lidhur me skeletin NAG-NAM të peptidoglukanit. Studime imunokimike kanë indikuar që acidet lipoteikoike janë një antigjen i zakonshëm në gjininë Bifidobacterium; për më shumë, proteinat dhe acidet lipoteikoike përcaktojnë karakterin hidrofobik të sipërfaqes së baktereve (Op Den Camp et al., 1985). Studime mbi natyrën e enzimave hidrolizuese të murit qelizor të Bifidobacterium spp. kanë treguar një numër të ndryshëm të këtyre enzimave me peshë molekulare të ndryshme për sejcilin shtam (Lee & Yoon, 1998).

2.2 Mekanizmi i veprimit të probiotikëve.

Probiotikët kanë një funksion të tipit barrierë intestinale, i cili është një mekanizëm indirekt mbrojtjeje, i arritur duke konkuruar me patogjenët për të pushtuar zona adezioni intestinal dhe për të marrë nutrientë të rritjes. Këto mekanizma parandalojnë aderencën, poliforimin dhe invadimin nga bakteret patogjene. (Taylor et al., 2011; Geoffrey et al., 2009).

Mikroorganizmat probiotikë ushtrojnë gjithashtu mekanizma mbrojtës të drejtpërdrejtë duke fermentuar polisaharide të patretshme brënda zorrës dhe duke prodhuar komponime që; 1) kanë një efekt antimikrobial psh, acide yndyrore me varg të shkurtër (SCFAs) si acidet laktike, acetike, propionike dhe butirrike që ulin pH-in e zorrës, 2) modifikojnë ekspresionin gjenik në mikroorganizmat e mbetur dhe reduktojnë potencialin e tyre për tu rritur dhe shumuar, 3) alterojnë metabolizmin e lipideve tek konsumatori, ulin nivelet e lipoproteinave në plazëm dhe stimulojnë glikolizën (Taylor et al., 2011).

Shtame të ndryshme probiotikësh ushtrojnë aftësi adezioni intestinal të ndryshme si edhe aftësi prodhuese të komponimeve acide dhe komponimeve bioaktive të ndryshme. Nivele të shumfishta veprimi shkaktojnë një efekt të përgjithshëm mbi sasinë e baktereve patogjene që ndodhen në brëndësi të zorrës. Si rrjedhim nuk mundet që një mekanizëm i vetëm të jetë përgjegjës për të gjithë efekti pozitiv shëndetësor sistemik të siguruar nga probiotikët (Geoffrey et al., 2009).

2.3 Efekte pozitive shëndetësore të probiotikëve Probiotikëve i janë atribuar një numër i madh efektesh pozitive shëndetësore,

edhe pse deri sot vetëm disa nga këto efekte pozitive janë vërtetuar nga studime klinike. Duhet theksuar se efektet pozitive shëndetësore të probiotikëve janë shtam specifike (Sanders, 2008; Shah, 2007). Disa nga efekte pozitive shëndetësore të deklaruara përfshijnë parandalimin dhe/ose trajtimin e infeksioneve, e sindromës së adomit të irrituar (IBS), çrregullimeve kronike të zorrës si sëmundjeve të inflamacionit adominal (IBD) dhe kancerit në zorrë, sëmundjeve të koronareve të zemrës (CHD), skuqjes vaginale të përsëritur, problemeve të lëkurës dhe alergjive ushqimore, lehtësimin e intolerancës ndaj laktozës, trajtimin e sëmundjeve të ndryshme të diarreve, uljen e serumit të kolesterolit dhe nivelit të triglicerideve, modulimin e sistemit imunitar, intensifikimin e biodisponueshmërisë minerale, efekte kemoparandaluese, përmirësimin e konstipacionit, përmirësimin e dermatitit dhe sëmundjeve të mëlçisë.

11

2.4 Kritere për përzgjedhjen e probiotikëve Nga shumë kërkues janë konsideruar një seri parametrash për të klasifikuar

shtamet potenciale probiotike (Salminen et al., 1998). Probiotikët duhet të përmbushin një numër parametrash sigurie, parametrash funksionalë dhe teknologjikë si edhe karakteristika që të mund të përdoren në produktet probiotike ushqimore (Tabela 2.2).

Tabela 2.2 Kriteret e përzgjedhjes për organizmat probiotikë për përdorim njerëzor

Mbi Sigurinë - Mundësisht me origjinë nga trakti GI i njeriut të shëndetshëm - Jo-patogjenë dhe jo i lidhur me sëmundje psh. infektive endokarditis ose ç’rregullime të GI - Jo-promovues i inflamacioneve - I paaftë për të zbërthyer apo dehidroksiluar kripërat biliare - Jo i aftë për të mbartur gjene të transmetueshme rezistente ndaj antibiotikut - Të mos ketë efekte anësore klinike

Mbi Funksionalitetin - Rezistent ndaj pH-it të ulët, lëngut gastrik, acidit, kripërave biliare dhe lëngut pankreatik - Adezion në qelizat intestinale dhe kolonizim në zorrë - Modulim i sistemit imunitar - Antagonist karshi patogjenëve nëpërmjet konkurencës në adezion dhe prodhimi i metabolitëve antimikrobialë - Veti antimutagjenike dhe antikarcinogjenike - Potencial për transportin e proteinave të rikombinuara dhe peptideve në traktin GI njerëzor

Teknologjike - Parametra të pranueshëm sensorial - Rezistent ndaj fageve - Vitalitet gjatë prodhimit dhe ruajtjes së produktit

Adoptuar nga (Champagne & Møllgaard, 2008; Collins et al., 1998; Gardiner et al., 2002; Havenaar & Huis In’t Veld, 1992; Lee & Salminen, 1995; Saarela et al., 2000)

2.5 Produktet probiotike Të gjitha efekte pozitive shëndetësore të lidhura me bakteret probiotike siç u analizua

edhe më sipër kanë çuar në rritje përfshirjen e këtyre probiotikëve në produkte ushqimore, në mënyrë që të zhvillohen “produktet ushqimore funksionalë” të cilët përkufizohen si “produkte ushqimore që deklarojnë se kanë efekt pozitiv në shëndet” (Champagne et al., 2005; Stanton et al., 2001).

Produkti probiotik mund të realizohet në tre mënyra:

1- Produkte probiotike të fermentuara: kultura probiotike inokulohet në produktin ushqimor dhe lejohet të fermentojë ushqimin dhe të sigurojë ndryshime në aromë dhe në karakteristikat organoleptike.

12

2- Produkte probiotike jo të fermentuara: probiotikët i shtohen produktit final në nivele të përshtatshme, pa i dhënë mundësi kulturës të rritet e të realizojë fermentim.

3- Suplemente dietike: kulturat probiotike përdoren si qeliza të thara të përqëndruara në trajtën e pudrave, kapsulave apo tabletave (Mattila-Sandholm et al., 2002; O'Sullivan et al., 1992; Svensson, 1999).

Që të mund të jenë të sukseshëm në tregun komercial, produktet probiotikë duhet të jenë të sigurta, të kenë karakteristika të mira organo-leptike dhe të ruajnë një numër të përshtatshëm të baktereve të gjalla në momentin e konsumimit (Farnworth, 2001; Mattila-Sandholm & Saarela, 2000).

Faktorë që ndikojnë cilësinë e produkteve probiotike përfshijnë:

1. Aftësia e produktit probiotik në dhënien e baktereve vitale probiotike me efekte pozitive shëndetësore të dëshiruara në një nivel të përshtatshëm tek konsumatori deri në kohën e konsumimit.

2. Përzgjedhja e shtamit nisur nga reaksioni i tij në matricën/përbërësit e ushqimit ku synohet të shtohet

3. Karakteristikat sensoriale të produktit 4. Materialet e paketimit 5. Kushtet e ruajtjes të ushqimit probiotik

(Champagne et al., 2005; Hamilton-Miller et al., 1999; Hull et al., 1992; Mattila-Sandholm et al., 2002; Saxelin et al., 1999; Stanton et al., 1998).

Në mënyrë që të realizohet efekti pozitiv shëndetësor i probiotikëve, nevojitet konsumim i lartë i baktereve probiotike në mënyrë të vazhduar. Është sygjeruar se minimumi i numrit të qelizave të gjalla bakteriale duhet të jetë më i lartë se 106 CFU për gramë ose mililitër të produktit probiotik (Agrawal, 2005; Tamime et al., 1995). Si përfundim përkufizimi i numrit efektiv specifik të mikroorganizmave probiotikë, varet nga tipi i shtamit si edhe nga sistemi/mjedisi i përdorur për të mbartur mikroorganizmin probiotik (Champagne et al., 2005; Gardiner et al., 2002; Salminen & Playne, 2001).

2.5.1 Produktet bulmetore

Përgjatë dekadave të fundit, probiotikët janë shtuar shumë në përbërjen e produkteve bulmetore komeraciale, si psh në qumshtin e fermentuar dhe në kos. Produktet bulmetore konsiderohen të jenë një sistem i dëshiruar ushqimor për mbartjen e probiotikëve për konsum njerëzor. Kapaciteti i lartë puferik i produkteve bulmetore mbron bakteret probiotike nga nivelet e larta të aciditetit në stomak dhe suporton vitalitetin e këtyre mikroorganizmave (Salminen & Playne, 2001).

Disa shembuj të produkteve bulmetore që përmbajnë probiotikë janë: kosi, kosi i ngrirë, qumshti i fermentuar, djathi, akullorja, ëmëbëlsirat dhe qumshti i pa-fermentuar me kulturë të shtuar (Hekmat & McMahon, 1992; Lourens-Hattingh & Viljoen, 2001; Ross et al., 2002).

13

2.5.2 Frutat dhe lëngjet e frutave e perimeve si mjet mbartës për probiotikët. Ka evidenca që matrica ushqimore në të cilën inokulohet mikroorganizmi

probiotik, luan një rol shumë të rëndësishëm në efektin pozitiv të tij ndaj konsumatorit. Aktualisht kërkimet janë fokusuar paralelisht si në karakterizimin e shtameve specifike probiotike ashtu edhe në mënyrën sesi matricat ushqimore dhe përbërja e tyre dietike ndërvepron me shtamin probiotik më efiçent (Isolauri, 2007). Tradicionalisht produktet probiotike janë produkte me bazë bulmetore si qumshti i fermentuar, kosi dhe djathrat. Megjithatë për shkak të rritjes së numrit të konsumatorëve me alergji ushqimore si edhe me disa tipe intolerancash karshi produkteve të bulmetit, këto 10 vitet e fundit janë studjuar disa mjete transportuese (mbartëse) alternative për probiotikët. Është sygjeruar se lëngu i frutave është një mjedis ideal për mbartjen e përbërësave fusnksionalë të ushqimeve si psh probiotikët. Njëra nga arsyet është se koha e qëndrimit në stomak të lëngjeve të frutave është e shkurtër, kështu që bakteret nuk janë të ekspozuara për kohë të gjatë ndaj kushteve acide të pafavorshme të stomakut. Këto produkte janë të përshtatshëm për ato konsumatorë të cilët nuk mund të konsumojnë produkte me bazë bulmeti ose thjeshtë për ato konsumatorë që parapëlqejnë freskinë e lëngjeve të frutave. Konsumimi i rekomanduar për mikroorganizmat probiotikë është 7.00 log CFU/mL (Vinderola & Reinheimer, 2000; Pereira et al., 2011).

Sipas Salminen dhe Von Wrigh, (1993), disa shtame probiotike kanë kapacitet për tu rritur në matrica me bazë fruti. Kërkuesit kanë raportuar se vitaliteti i qelizave varet nga shtami i përdorur, karakteristikat e substratit, përmbajtjes së oksigjenit, dhe aciditetit final të produktit (Shah, 2001).

2.5.2.1 Pijet probiotike të fermentuara me bazë lëngu frutash/perimesh Shtimi i probiotikëve në lëngje është shumë më kompleks sesa formulimi i

produkteve të bulmetit, sepse bakteret kërkojnë mbrojtje ndaj kushteve acide të lëngut të frutave. Megjithatë, disa studime aktuale kanë vërtetuar se disa shtame janë në gjëndje të rriten dhe të mbijetojnë në nivele probiotike në lëngjet e frutave. Megjithatë përdorimi i lëngjeve të frutave si mjet mbartës për probiotikët është rritur së fundmi.

Vinderola et al., (2002) vëzhguan se lëngje frutash natyrale ( mollë jeshile, kiwi, ananas, pjeshkë dhe luleshtrydhe) të shtuara në terrenet ushqyes të lëngshëm ushtruan një efekt inhibues tek S. thermophilus. Lëngu i luleshtrydhes inhiboi të gjithë shtamet probiotike me përjashtim të Lb. casei, ndërsa lëngu i ananasit dhe kiwit patën një efekt negativ në rritjen e shtameve të Lb. acidophilus. Për më shumë lëngu i mollës jeshile inhiboi rritjen e Lactococcus lactis, ndërsa lëngu i pjeshkës nuk pati ndonjë efekt në asnjë nga probiotikët (Vinderola et al., 2002).

Yoon et al., (2005) të cilët vlerësuan vitalitetin e Lb. plantarum dhe Lb. delbrueckii në lëngun e panxharit të kuq të fermentuar në (30°C për 72 orë) përgjatë ruajtes në të ftohtë për 28 ditë, raportuan se edhe pse kulturat laktike në lëng panxhari të kuq të fermentuar humbën vitalitetin e tyre gradualisht përgjatë ruajtjes në të ftohtë, numri i qelizave vitale në të gjithsesi mbeti në nivelin 6.00–8.00 log CFU/mL pas 28 ditë ruajtjeje në të ftohtë në 4°C.

Sheehan, Ross & Fitzgerald (2007), duke testuar vitalitetin e disa shtameve të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp në lëngjet e fermentuara të portokallit,

14

ananasit dhe të boronicës së kuqe, vëzhguan se Lb. casei, Lb. rhamnosus dhe Lb.paracasei paraqitën ndjeshmëri më të ulët ndaj mjedisit acid të lëngjeve, ndërkohë që të gjithë probiotikët paraqitën numër të lartë qelizash në lëngjet e portokallit dhe ananasit krahasuar me lëngun e boronicës së kuqe.

Charernjiratrakul et al., (2007) kanë raportuar se Lb. plantarum në 30°C dhe Pediococcus pentosaceus u rritën mirë në lëngun e karrotës me një pH optimal prej 6.4.

Wang et al., (2009) kanë studjuar fizibilitetin e frutit noni (Morinda citrifolia) si një substrat i papërpunuar fillestar për prodhimin e lëngut noni probiotik me anë të LAB (Lb. Casei dhe Lb. plantarum) dhe Bifidobacterium.spp (B. longum). Gjatë fermentimit u monitoruan ndryshimet në pH, aciditet, në përmbajtjen e sheqernave, mbijetesën e qelizave, si edhe në vetitë antioksiduese. Të gjithë shtamet e testuar u rritën mirë në lëngun noni, duke mbërritur vlera të përafërta me 109 CFU/mL pas 48 orë fermentim. Pas 4 javë ruajtje në të ftohtë në 4°C, B. longum dhe Lb. plantarum mbijetuan në lëngun noni të fermentuar në kushte pH-i të ulët. Ndërsa Lb. casei paraqiti një mungesë të plotë vitaliteti pas 3 javësh. Për më shumë lëngu noni i fermentuar me B. longum kishte një kapacitet të lartë antioksidues dhe nuk ndryshonte në mënyrë të ndjeshme nga ai i kultivuar me LAB. Sipas autorëve, B. longum dhe Lb. plantarum janë probiotikë optimal për fermentim në lëng noni.

Studime mbi lëngu e domates dhe panxharit, treguan se këto lëngje mund të ishin substrate potenciale për bakteret acido laktike probiotike si Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. plantarum d h e Lb.brevis, meqënëse të gjithë këto mikroorganizma ishin në gjëndje të prodhonin acid laktik dhe të mbanin një numër të dëshiruar qelizash vitale mbi 106 CFU/mL gjatë jetgjatësisë së produktit (Yoon, Woodams, & Hang, 2004, 2005), (Klewicka, Zdunczyk, & Juskiewicz, 2009). Për më shumë lëngu i panxharit i fermentuar nga Lb. casei dhe Lb. brevis ka treguar efekte pozitive mbi aktivitetitn e mikroflorës së apandesistit tek brejtësit. U vërejt se ushqimi probiotik i dhënë, rriti paralelisht sasinë e acideve yndyrore me varg të shkurtër si edhe numrin e baktereve pozitive si Lactobacillus spp., Bifidobacterium s pp . , Bacteriodes sp p . ,d he Enterococcus s p p . , dh e reduktoi popullatën e Enterobacteriaceae (Klewicka et al., 2009).

Fonteles et al., (2011) optimizuan pH-in, temperaturën e fermentimit si edhe kohën e fermentimit për përftimin e një pijeje probiotike të re (lëng pjepri të verdhë) të fermentuar. Lëngu i fermentuar ju nënshtrua një studimi përgjatë ruajtjes për 42 ditë në 4°C. pH-i fillestar dhe temperatura influencuan në rritjen e Lb. casei në lëngun e pjeprit të verdhë. Kushtet optimal për një rritje të kënaqshme të Lb. casei në lëngun e pjeprit të verdhë ishin: pH 6.1 dhe temperaturë 31°C. Koha e fermentimit prej 8 orësh u përzgjodh si koha optimale e fermentimit për të përgatitur lëngun probiotik të pjeprit të verdhë. Vitaliteti i qelizave në fund të fermentimit ishte 8.3 log CFU/mL. Ky nivel qelizash u ruajt përgjatë gjithë periudhës së ruajtjes në të ftohtë për 42 ditë. Rritja e vazhdueshme dhe vitaliteti i mikroorganizmave probiotikë në lëngun e pjeprit të verdhë përgjatë fermentimit dhe ruajtjes sygjeron që lëngu i pjeprit të verdhë është një mjet i përshtatshëm për mbartjen e Lb. casei.

Mousavi et al., (2011) vlerësuan prodhimin e lëngut të shegës probiotik nëpërmjet fermentimit me katër shtame LAB: Lb. plantarum, Lb. delbrueckii, Lb. paracasei, dhe Lb. acidophilus. Popullata mikrobiale e Lb. paracasei dhe Lb. acidophilus u

15

ul afërsisht me 3 shkallë logaritmike gjatë javës së parë të ruajtjes në të ftohtë dhe e humbi vitalitetin e saj pas 2 javësh. Qeliza të gjalla të Lb. delbrueckii dhe Lb. acidophilus qëndruan në nivele të pranueshme brënda 2 javëve (~5 log CFU/mL). Por për të gjithë shtamet e studjuar, vitaliteti i qelizave ra dramatikisht në zero (nuk u vërejt asnjë qelizë e gjallë) pas 2 javëve.

Është shumë e rëndësishme që të ketë një numër të konsiderueshëm të qelizave vitale LAB në produkte për të përftuar efekte pozitive maksimale shëndetësore. (Shah, 2001).

2.5.2.2 Pijet probiotike të pafermentuara me bazë lëngu frutash/perimesh Hapat kryesorë në prodhimin e lëngut të frutave probiotikë janë: pasterizimi i

lëngut të frutave, ftohja në < 6°C dhe shtimi i kulturës probiotike (1010 - 1011 CFU për litër pije). Më pas lëngu paketohet në kontenitorë të përshtatshëm dhe ruhet në temperaturë ftohëse. Numri minimal i qelizave vitale të baktereve probiotike sipas standarteve përkatëse përcakton jetgjatësinë e produktit (Post, 2002).

Në Tabelën 2.3 jepen shëmbuj të pijeve probiotike komerciale me bazë lëngu fruti.

Janë kryer disa studime në lidhje me sjelljen e kulturave probiotike të shtuara në lëngjet e frutave pa fermentim: U vlerësua vitaliteti i nëntë shtameve të Lactobacillus.spp të shtuara në një lëng frutash komercial ( i përbërë nga një përzierje frutash) përgjatë 80 ditë ruajtjeje në të ftohtë, gjithashtu u studjua edhe rezistenca e katër prej tyre ndaj kushteve të stimuluara gastro-intestinale (Champagne & Gardner, 2008). Vitaliteti probiotik rezultoi që varej nga shtami, në përgjithësi, L. rhamnosus ishte më rezistent se Lb. acidophilus. Të dhënat gjithashtu sygjeruan se një muaj ruajtje e lëngut të frutave të përzjera nuk pati ndonjë efekt të konsidrueshëm mbi ndjeshmërinë e probiotikëve ndaj kripërave biliare apo enzimave pankreatike.

Sipas Bialonska, Kasimsetty, Schrader, & Ferreira, (2009), edhe pse është shqyrtuar, ndikimi i tanineve të shegës mbi vitalitetin e baktereve probiotike të pranishme në mikroflorën intestinale, u vëzhgua se Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp nuk u ndikuan nga ellagitanninet. Për më shumë shtimi i një nënprodukti përbërës të lëngut të shegës stimuloi në mënyrë të ndjeshme rritjen e B. breve d h e B.infantis.

Lëngu i frutave i përbërë nga përzierje karrote, selino dhe mollë tregoi gjithashtu se është një matricë e përshtatshme për rritjen e Lb. acidophilus (Nicolescu & Buruleanu, 2010). Lëngu i karrotës i vetëm tregoi se ishte një bazë e mirë për shtamet e B.lactis dhe B.bifidum, por u shfaq një rënie prej 45% në përmbajtjen e karotenoideve për shkak të pranisë të këtyre mikroorganizmave (Kun, Rezessy-Szabo, Nguyen, & Hoschke, 2008). Megjithatë shtamet e, Lb. rhamnosus dhe Lb. bulgaricus të shtuara në lëngun e karrotës, në prani apo në mungesë të inulinës dhe fruktooligosaharideve, treguan vitalitet të mirë pavarësisht prebiotikut të shtuar (Nazzaro, Fratianni, Sada, & Orlando, 2008). Gjithashtu sasia e β-karotenit dhe aktiviteti antioksidant u ruajt përgjatë një muaji

16

ruajtjeje në të ftohtë, duke treguar kështu që këta komponentë nutricionalë nuk metabolizohen nga Lactobacillus spp.

Tabela 2.3 Shembuj të pijeve probiotike komerçiale me bazë lëng fruti

Prodhue-si

Shteti Marka Përbërja e lëngut të frutave

Përmbajtja e frutit %

Shtami probiotik

Zotëruesi i shtamit

Skåneme--jerier

Suedi Pro Viva Luleshtrydhe, Ribes i zi Boronicë Ekzotik (përzierje banane, rrush, kajsi, Lime dhe limon)

≈ 20 Lb. plantarum vv

Probi AB (Suedi)

Skåneme--jerier

Suedi Pro Viva Active

Exotic (si më sipër) pasuruar me vitamina dhe minerale

12 Lb. plantarum vv

Probi AB (Suedi)

Skåneme--jerier

Mbretëria e Bashkuar

SHOT Mana, ribes i zi dhe rrush

? Lb. plantarum 299v

Probi AB (Suedi)

Valio Finlandë/ Suedi

Gefilus/ Gfilac

Pije me hirrë me lëng kajsie dhe pjeshke

17 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi/

Finlandë) Valio Finlandë/

Suedi Gefilus/ Gfilac

Portokall/ lëng pjeshke + prebiotik + Vit. C

60 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi

Finlandë) Valio Finlandë/


Ananas dhe Karrotë + Ca++ + β-karoten

50 dhe 10 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi/

Finlandë ) Valio Finlandë/


Shumë frutësh (Portokall, Rrush, Pjeshkë, Mango dhe Frut pasioni)

80 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi/

Finlandë)

Valio Suedi/ Finlandë

Gefilus/ Gfilac

Mollë dhe rrush 100 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi/

Finlandë)

Tine BA Norvegji Biola Portokall-Mango > 95 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi/

Finlandë)

Tine BA Norvegji Biola Mollë-Dardhë > 95 Lb.rhamnosus GG

Valio (Suedi/

Finlandë)

Ingman Suedi/ Finlandë

Rela Portokall ? Lb. reuteri Biogaia Biologics (Suedi)

Ingman Suedi / Finlandë

“R” Portokall-Ananas + Ca++

? Lb. reuteri Biogaia Biologics (Suedi)

Pete & Johney

UK “Its Alive” Pjeshkë-Banane ? Bif. lactis Të ndryshëm

Arla Foods

Suedi Cultura Boronicë ? ? ?

Suntary Japoni Bikkle Frut + minerale hirre+prebiotikë+ fibra dietike

? Bifidobacteri-um. spp

?

17

Adoptuar nga ([Anon], 2005; Post, 2002; Searby, 2005a; Stanton et al., 2001)

2.5.2.3 Pranueshmëria e lëngjeve probiotikë. Parametra sensorialë Një studim i kryer nga Luckow & Delahunty (2004a) mbi influencën

sensoriale të probiotikut Lb. rhamnosus GG dhe prebiotikut oligosaharid në lëngun e portokallit tregoi se, mesatarisht konsumatorët mundën të dallonin një diferencë sensoriale midis lëngjeve të portokallit probiotikë dhe lëngjeve konvencionalë dhe preferuan karakteristikat sensoriale të lëngjeve konvencionalë. Megjithatë, 11% e konsumatorëve preferuan karakteristikat sensoriale të lëngjeve probiotikë. Në një studim tjetër Luckow & Delahunty (2004b) vlerësuan pranueshmërinë e konsumatorëve ndaj karakteristikave sensoriale (pamjes së jashtme, aromës, konsistencës dhe shijes) të lëngut probiotik të Ribes nigrum (ribesit të zi) që përmbante Lb. plantarum 299v. Ato konkluduan se mosha dhe gjinia e konsumatorit janë faktorë të rëndësishëm në pranueshmërinë e lëngjeve të frutave probiotikë. Megjithatë, duke u nisur nga baza të përgjithshme, konsumatorët nuk preferuan njërin lëng në krahasim me tjetrin por ato preferuan në mënyrë të ndjeshme pamjen e jashtme të lëngut probiotik. Luckow et al., (2006) kryen kërkime të mëtejshme për të përcaktuar nëse teknikat e mëposhtme përmirësojnë pranueshmërinë sensoriale të lëngut të portokallit që përmban Lb. paracasei ssp. paracasei:

1. Shtimi i lëngjeve të frutave tropikale duke përfshirë ananasin, mangon dhe frutin e pasionit për të maskuar shijen e huaj shkaktuar nga probiotikët.

2. Ekspozimi i përsëritur i anëtarëve të paneleve sensorialë ndaj lëngjeve të frutave probiotikë.

3. Paraqitja e informacionit shëndetësor të përbërësave të lëngut të frutave si edhe të kulturave probiotike.

A.Lasson - -de Inc.,

Kanada Oasis

Health BreakTM

Koncentrate lëngu frutash (ananas, mollë, portokall, dardhë dhe rrush, frut pasioni, limon), pure (pjeshkë, luleshtrydhe, mango dhe kiwi)

? Lb. rhamnosus R0011

Lallem

Lidl Gjermani Pianola Lëng portokalli ? Lb. casei ?

NextFoods USA GoodBelly Shegë-man i zi, boronicë e kuqe, shalqi, mango, boronicë, luleshtrydhe ose limon, xhinxher

100 Lb.plantarum 299v

Probi AB (Suedi)

Kerry Group

Danisco

Irlandë Danim--arkë

Dawn Howaru

Lëng portokalli 100

B. animalis subsp lactis Bb-12 B. lactis HN019

Chr Hansen (Danimar-

kë) Danisco

18

Rezultatet e tyre treguan se këto tre strategji mund të ndikojnë pozitivisht pranueshmërinë sensoriale të lëngjeve probiotike.

2.5.3 Produkte të tjera probiotikë Përveç qumshtit të fermentuar, frutave dhe lëngjeve të frutave, një seri e gjërë

produktesh ushqimore janë testuar për tu përdorur si mjete mbartëse për shtame të ndryshme të kulturave probiotike. Produkte të tjera të cilat janë vlerësuar për potencialin e tyre si mbartës të probiotikëve përfshijnë produktet e Sojës (Champagne et al., 2005; Heenan et al., 2004; Shimakawa et al., 2003), ullinjtë e tavolinës (Lavermicocca et al., 2005), formulat e foshnjeve (Fukushima et al., 1998; Langhendries et al., 1995), ëmbëlsira (Mattila - Sandholm et al., 2002), shufra drithërash (Ouwehand et al., 2004), fruta të thata (Betoret et al., 2003), çokollatë (Possemiers et al., 2010) dhe çimçakëz (Caglar et al., 2007; Twetman et al., 2009). Akullorja e Malpighia emarginata (acerola) e fermentuar ka treguar se suporton vitalitetin e baktereve probiotike duke paraqitur një numër qelizash për B.longum dhe B. lactis mbi vlerën 106 CFU/g përgjatë 15 javë ruajtjeje edhe në produkte acide (pH 4.5) (Favaro-Trindade, Bernardi, Bodini, Balieiro, & De Almeida, 2006). Pureja e dardhës e fermentuar nga Leuconostoc mesenteroides ishte në gjëndje të mbante konstant numrin e qelizave probiotike rreth vlerës 109 CFU/g për 14 ditë (Kim, Chae, & In, 2010). Pureja e bananes e fermentuar nga Lb. acidophilus i mikroinkapsuluar rezultoi një produkt i pëlqyeshëm nga konsumatori dhe me një nivel vitaliteti qelizash të pranueshëm (Tsen, Lin & King, 2004). Djathi ofron gjithashtu një sistem mbartës ushqimor atraktiv për kulturat probiotike si edhe për peptidet bioaktive. Krahasuar me ushqime të tjera të fermentuara, djathi ka pH relativisht të lartë dhe përmbajtje yndyrash të lartë, një konsistencë solide si edhe një kapacitet më të lartë puferik (Hayes et al., 2006). Possemiers, Marzorati, Verstraete, dhe Van De Wiele (2010) vlerësuan çokollatën si një mjet potencial mbrojtës për marrjen nga goja të një përzierjeje të mikroinkapsuluar të Lb. helveticus CNCM I-1722 dhe B.longum CNCM I-3470. Të dhëna tregojnë se shtresa mbështjellëse e mikroinkapsulimit të probiotikëve në çokollatë është një zgjidhje ekselente për t’i mbrojtuar ata nga kushtet stresuese mjedisore dhe për një mbartje optimale.

2.6 Mbijetesa e probiotikëve në matricat ushqimore dhe në kushte të ndryshme stresi

Faktorët që ndikojnë në vitalitetin e probiotikëve në matricat ushqimore përgjatë përpunimit dhe ruajtjes, përfshijnë pH-in, praninë e oksigjenit, temperaturën si edhe praninë e mikroorganizmave konkurues dhe inhibitorëve. Nisur nga fakti se ushqimi probiotik duhet të përmbajë kulturën probiotike vitale në një nivel të përshtatshëm në momentin e konsumimit, përdorimi i disa teknikave për të përmirësuar stabilitetin e shtameve probiotike në sistemet ushqimore është e një rëndësie shumë të lartë (Champagne et al., 2005; Dave & Shah, 1997; Mattila-Sandholm et al., 2002). Disa nga këto metoda listohen më poshtë: - Adoptimi ndaj stresit- Mikroinkapsulimi- Përfshirja e prebiotikëve - Modulimi i kushteve të paketimit (Champagne et al., 2005; Mattila-Sandholm et al., 2002).

2.6.1 Stresi Bifidobacterium.spp duhet t’i mbijetojnë disa kushteve të ashpra për të mbërritur

në GIT në një sasi të caktuar në mënyrë që të jenë efektivë si probiotikë (Figura

19

2.2). Disa nga këto kushte hasen menjëherë që gjatë fermentimit. Përbërja e terrenit ushqyes dhe prodhimi i nënprodukteve toksike mund të kenë influencë në vitalitetin e shtameve probiotikë. Për më shumë, proçeset industriale, gjatë menaxhimit të kulturës starter, proçeset rrjedhëse dhe ruajtja, duke përfshirë tharje-ngrirjen, ngrirjen dhe tharjen spary, shkaktojnë stres mekanik dhe fiziologjik (De Dea Lindner et al., 2007; Lacroix & Yildirim 2007). Për më shumë, gjatë marrjes nëpërmjet ushqimit funksional, kushte si pH-i acid në stomak dhe kriprat biliare në zorrën e hollë influencojnë mbi numrin e bifidobaktereve dhe zonën target të tyre (Sanchez et al., 2008). Mbijetesa e Bifidobacterium.spp gjatë këtyre hapave dhe gjithashtu edhe funksionaliteti i tyre si probiotikë, varet nga kapaciteti i tyre i adoptimit dhe rezistencës ndaj këtyre kushteve të ashpra.

Figura 2.2 Faktorët kryesorë ndikues mbi vitalitetin e probiotikëve, që nga prodhimi deri në GIT (Lacroix & Yildirim 2007)

2.6.2 Përgjigjia ndaj stresit Shumë përmbledhje janë publikuar vitet e fundit në lidhje me përgjigjen ndaj

stresit të Bifidobacterium.spp (Ventura et al., 2006; De Dea Lindner et al., 2007; Sanchez et al., 2008). Për më shumë, analiza të sekuencës së plotë të genomit të B. longum kanë treguar praninë e disa mekanizmave të ndryshëm rregullatorë me anë të të cilave qelizat mbrojnë vetveten ndaj streseve të ndryshme (Klijn, 2005b).

2.6.2.1 Përgjigjia ndaj stresit termik ( nxehtësisë ) Në mënyrë që Bifidobacterium.spp të mund të bëhen pjesë e ushqimit,

kërkohet një mbijetesë e këtyre mikroorganizmave gjatë proçeseve që përfshijnë shok termik si psh tharja spray. Si rrjedhim, të mund të kuptohet baza gjenetike e përgjigjes ndaj stresit termik mund të jetë një faktor kyç për përzgjedhjen e shtameve të reja me veti probiotike (De Dea Lindner et al., 2007). Temperaturat e larta kryesisht inuduktojnë denatyrim proteinik por gjithashtu edhe membranat dhe acidet nukleike janë identifikuar si zona qelizore të dëmtuara nga nxehtësia. Kur qelizat ekspozohen ndaj stresit me nxehtësi, përgjigjet kryhen nëpërmjet shtimit të sintezës së “chaperones”, të cilët promovojnë mbështjelljen e duhur të polipeptideve të rinj (në formim), asemblimin

20

e komplekseve proteinike, degradimin dhe translokimin e proteinave (De Angelis & Gobbetti 2004).

2.6.2.2 Përgjigjia ndaj stresit osmotik Rritja e presionit osmotik në mjedis provokon aktivizimin e

sistemeve osmorregullatore për të parandaluar rrudhosjen dhe plazmolizën eventuale të qelizës (Chung et al., 2006). Akumulimi i komponimeve jo-toksike me peshë molekulare të ulët duke përfshirë sheqernat, poliolet, aminoacidet dhe derivatet aminike, e lejon qelizën që të ruajë presionin turgor pozitiv, të rrisë stabilitetin e enzimave në aw të ulët, dhe të ruajë integritetin e membranës qelizore gjatë tharjes (Girgis et al., 2002). Për më shumë, stresi osmotik, krahasuar me stresin me nxehtësi, çon drejt induktimit të sintezës së proteinave.

2.6.2.3 Përgjigjia ndaj stresit të pranisë së kripërave biliare Aftësia për të rezistuar ndaj stresit të kripërave biliare është ekstremisht variabël

(De Dea Lindner et al., 2007). Kripërat biliare janë substanca biologjike të ngjashme me detergjentët, që shkëpusin strukturën lipidike dy-shtresore të membranave qelizore dhe shkaktojnë dëme oksiduese tek qelizat (Payne et al., 1998). Analiza proteomike të Bifidobacterium.spp, kanë treguar një rritje në sintezën e “chaperone-ve” si një përgjigje apo një adoptim ndaj kripërave biliare (Sanchez et al., 2005; Sanchez et al., 2007b).

2.6.2.4 Përgjigjia ndaj kushteve gastrike dhe pH-it të ulët Njerzit prodhojnë një lëng gastrik me pH 1.5, kjo vlerë pH-i rritet gjatë

ushqyerjes në një interval 3.0 deri në 5.0. Për të arritur në zorrën e hollë, bakteret duhet t’i mbijetojnë këtij kushti shumë të fortë acid. Nëse acido-toleranca tek bakteret patogjene konsiderohet si një faktor virulence, tek shtamet potencialisht probiotikë ajo është një veti e dëshirueshme (Cotter & Hill 2003). Kushtet acide kanë një ndikim negative tek bakteret duke reduktuar pH-in citoplazmik, i cili mund të shkaktojë humbje të aktivitetit të enzimave glikolitike relativisht acido-sensitive dhe dëmtim struktural të membranës qelizore si edhe të makromolekulave si ADN dhe proteina. Mekanizma për tju kundërvënë efektit të pH-it të ulët, përfshijnë; nxjerrjen e protoneve (H+), alkalinizimin e mjedisit të jashtëm, ndryshimin e përbërjes së murit qelizor, prodhimin e proteinave dhe “chaperones” të shokut të përgjithshëm, dhe përgjigje ndaj ndryshimeve të densitetit qelizor (Cotter & Hill 2003). Pompa protonike F1F0-ATPase është njëri nga mekanizmat kryesorë për mbijetesën e mikroorganizmave gram pozitivë në mjedise acide dhe si rrjedhim luan një rol kyç edhe tek bifidobakteret. Në Bifidobacterium.spp roli i kompleksit F1F0-ATPase në pH të ulët është përmendur në B. animalis dhe B. longum (Ventura et al., 2004; Sanchez et al., 2006). Qeliza të B. longum të adoptuara ndaj aciditietit ruajtën pH-in e tyre intraqelizor afër me vlerat e përshtatshme fiziologjike krahasuar me qelizat e pa-adoptuara në kushte acide (Sanchez et al., 2007a).

2.6.2.5 Përgjigjia ndaj stresit të shkaktuar nga oksigjeni Bifidobacterium.spp janë anaerobë strikt (Biavati & Mattarelli 2001). Ekspozimi i

theksuar ndaj oksigjenit shakton akumulimin kryesisht të peroksidit të hidrogjenit, i cili çon në vdekjen e qelizave të Bifidobacterium.spp të ndjeshme ndaj oksigjenit (Kawasaki et al., 2006). Reactive oxygen species (ROS) përfshijnë superokside (O2

-), peroksid 21

hidrogjeni (H2O2), dhe radikale hidroksil (#OH). Probabilisht prania e tyre shkakton dëmtime të ADN-së dhe oskidim të proteinave. Katalazat, NADH peroxidazat dhe reduktazat mund t’i eleminojnë këto ROS. Klijn (2005a) tregoi se përgjigjia ndaj stresit me oksigjen e B. longum NCC2705 përfshin përveç të tjerash akumulim brënda-qelizor të manganit. Për më shumë në përgjigjen ndaj stresit me oksigjen është për tu përcaktuar roli specifik i proteinave si BL1626 (një klasë e familjes së disulfurit të piridin nukleotid oksidoreduktazës), BL0460 (një rregullator i mundshëm i OxyR-type) dhe BL0409 (një transportues i supozuar i manganit).

2.7 Karakteristika të probiotikëve

2.7.1 Toleranca ndaj aciditetit dhe kripërave biliare Për të pasur efekte pozitive ndaj shëndetit të konsumatorit, mikroorganizmat

probiotikë duhet të mbijetojnë në mënyrë të përshtatshme kushteve të egra të mjedisit, të hasura gjatë kalmit në GIT dhe që të persistojnë në zorrë (Saarela et al., 2000). Pra si rrjedhim, është e domosdoshme që një probiotik potencial të egzaminohet për tolerancën e tij ndaj GIT dhe për persistencën e tij në zorrë (Saarela et al., 2000).

Mjedisi fortësisht acid i stomakut si edhe aktiviteti proteolitik i pepsinës vepron si një barrierë natyrale fortësisht mbrojtëse karshi mikroorganizmave të dëmshëm të marrë gjatë konsumimit të ushqimeve dhe lëngjeve. Ekspozimi karshi kushteve ekstreme të stomakut mundet gjithashtu të shkaktojë një humbje të vitalitetit të probiotikëve të marrë (Muller et al., 2009). Ndërkohë që pH-i normal i brëndshëm i stomakut të njeriut varjon nga 2.5 në 3.5 (Holzapfel et al., 1998), kjo vlerë mund të ndryshojë në varësi të natyrës dhe të përbërjes së ushqimit apo pijes së konsumuar. Një faktor tjetër i rëndësishëm është koha e qëndrimit të ushqimit që hyn në stomak, e cila varet shumë nga vetitë fiziko-kimike të tij. Si psh lëngjet që e kalojnë stomakun shumë më shpejt sesa produktet solide (Rogers, 2011), mund të duan më pak se 20 minuta për ta lënë stomakun, ndërkohë që një vakt i përzjerë mund të qëndrojë në stomak deri në 4 orë (GastroNetAustralia, 2010).

Më pas probiotikët përballen me kripërat biliare dhe pankreatinën në zorrë, të cilat janë një sfidë tjetër për vitalitetin e probiotikëve (Muller et al., 2009). Roli primar i kripërave biliare në tretje është emulsifikimi dhe tretja e yndyrnave. Ky rol realizohet në saj të natyrës hidrofilike dhe lipofilike njëkohësisht të kripërave biliare. Në fakt kripërat biliare veprojnë si një detergjent, duke ulur tensionin sipërfaqësor të yndyrnave dietike dhe duke i ndarë ato në pikëza të vogla, në mënyrë që të rritet sipërfaqja e kontaktit për të ndihmuar aktivitetin e lipazave. Në të njëjtën mënyrë kripërat biliare mund të dëmtojnë në mënyrë letale bakteret përmes ndërveprimit me lipidet membaranore (Begley et al., 2005; Begley et al., 2006).

Për më shumë, është vërtetuar që matrica ushqimore mund të influencojë aftësinë e mbijetesës së probiotikëve ndaj mjedisit GI, dhe përfshirja e tyre në matricat mbartëse si qumësht, qumësht i fermentuar, djathë, qumësht soje dhe mish mund të rrisë aftësinë e baktereve probiotike për t’i mbijetuar kalimit përgjatë GI (Ganzle et al., 1999; Huang & Adams, 2004; Leverrier et al., 2005; Saarela et al., 2006;

22

Stanton et al., 1998; Zarate, Perez Chaia, et al., 2000). Gjithashtu është supozuar se për shkak të kohës së shkurtër të qëndrimit në GIT të lëngjeve të frutave, përfshirja e probiotikëve në këto mbartës mund të reduktojë ekspozimin e probiotikëve ndaj mjedisit të ashpër të GI dhe si rrjeshim të rrisë efektivitetin e tyre (Post, 2002).

Saarela et al., (2006), kanë raportuar se toleranca acide dhe ndaj kripërave biliare e B. animalis subsp lactis E-2010 (Bb12) në trajtë të ngrirë të tharë, i inokuluar në qumësht ishte shumë më e lartë sesa ajo në pijen e frutave komerciale (pH 3.7, një përzierje portokalli, rrushi dhe fruti pasioni). Kur u krahasua në PBS, Bb12 i inokuluar në pijen e frutave u pa që ishte shumë më tolerant ndaj lëngut gastrik të stimuluar në pH 2.5 në mungesë të pepsinës, por shumë më pak tolerant në pH 3.0 në prani të pesinës.

Champagne & Gardner (2008), kanë treguar se 35 ditë ruajtje në të ftohtë për Lb.acidophilus LB3, Lb.rhamnosus LB11, Lb. reuteri LB38 dhe Lb. plantarum LB42 të kaluara veçmas në një pije fruti komerciale (një përzierje e 10 lëngjeve të frutave dhe pureve, pH 4.2) përmirësoi mbijetesën e tyre kur u ekzpozuan në kushtet e lëngut të stomakut (pH 2.0) krahasuar me kulturat e freskëta. I njëjti studim tregoi gjithashtu se 35 ditë ruajtje të probiotikëve në lëngun e frutave, nuk e ndikoi tolerancën e tyre ndaj kripërave biliare (0.3%) ose pankreatinës.

2.7.2 Adezioni Është shprehur, që për të ushtruar efekte pozitive promovuese ndaj shëndetit të

konsumatorit, mikroorganizmat probiotikë duhet të mbijetojnë në një numër mjaftueshmërisht të lartë dhe të kolonizojnë GIT. Një atribut për kolonizimin intestinal është aderenca në mukozën epiteliale intestinale (Alander et al., 1999; Beachey, 1981; Boyle et al., 2006). Adezioni në mukozën epiteliale intestinale është njëri nga kriteret kryesore me anë të të cilit një mikroorganizëm mund të përzgjidhet si probiotik (Salminen et al., 1996). Adezioni bakterial në mukozën epiteliale intestinale është një proçes i komplikuar, i ndërmjetësuar nga parametrat biofizikë dhe biokimikë të shumështresave si të baktereve ashtu edhe të mukozave epiteliale si psh forcat pasive, ndërveprimet elektrostatike, hidrofobiciteti dhe më e rëndësishmja, komponentët specifikë të sipërfaqes qelizore (Servin & Coconnier, 2003).

Adezioni në mukozën epiteliale intestinale nga probiotikët varet nga shumë faktorë si shtami bakterial, përqëndrimi bakterial, formulimi probiotik (kombinimet), përbërja e terrenit ushqyes bakterial, terreni (mjedisi) i kulturave qelizore dhe bashkë-qelizore, pH-i i mjedisit bashkë-qelizor, stadi i zhvillimit/rritjes së baktereve, kushtet e rritjes së kulturës qelizore intestinale, koha e inkubimit, specificiteti i konsumatorit, sektori intestinal, tretja dhe përbërja e mikroflorës intestinale (Collado et al., 2007; Deepika et al., 2009; Greene & Klaenhammer, 1994; Kankaanpaa et al., 2001; Moussavi & Adams, 2010; Ouwehand et al., 2000; Ouwehand & Salminen, 2003; Tallon et al., 2007; Van den Abbeele et al., 2009).

Gjithashtu është e mundur që matricat mbartëse ndikojnë në karakteristikat e adezionit të probiotikëve, megjithatë deri sot pak është studjuar për efektin e matricave ushqimore mbi aftësinë e adezioni të probiotikëve (Ouwehand & Salminen, 2003; Sanders & Marco, 2010). Një studim i kryer mbi efektin e matricave ushqimore nga Ouwehand et al., (2001), ku paratrajtimi i probiotikëve me

23

qumësht tregoi se adezioni i probiotikut në glikoproteinat e mukusit intestinal u ul në mënyrë të konsiderueshme krahasuar me kontrollin (HEPES-Hanks' pufer, pH 7.4). Megjithatë ka pak raportime mbi efektin e komponentëve ushqimorë si karbohidrate/polisaharide (Lee & Puong, 2002; Parkar et al., 2010; Van den Abbeele et al., 2009), etanol (Tuomola et al., 2000), acide yndyrore (Kankaanpaa et al., 2001) dhe minerale si kalçium (Marcinakova et al., 2010) mbi aftësinë për adezion të probiotikëve në mukozën epiteliale intestinale.

2.8 Metoda për të përmirësuar vitalitetin e qelizave

Aspekti më i rëndësishëm i funksionalitetit të kulturave probiotike është aftësia e tyre për të promovuar shëndetin njerëzor. Edhe pse disa studime tregojnë se edhe qeliza probiotike të vdekura mund të ndërmjetësojnë efekte pozitive fiziologjike, shumica e studimeve me qeliza probiotike janë kryer me qeliza të gjalla dhe të dhëna për kultura jo-vitale janë të limituara (Ouwehand & Salminen 1998). Efekti probiotik i qelizave të vdekura është probabilisht i limituar për shkak të mungesës së lëshimit të komponentëve antimikrobialë dhe stimulimit të sistemit imunitar (Ouwehand & Salminen 1998; van Baarlen et al., 2009). Për më shumë, bazuar në përkufizimin më gjerësisht të pranuar për probiotikët dhënë nga një grup pune i bashkuar i FAO/WHO (2002), probiotikët duhet të jenë të gjallë. Gjithashtu është faktor kyç që qelizat t’i mbijetojnë kushteve acide të stomakut dhe ekspozimit ndaj kripërave biliare në zorrën e hollë në numër të mjaftueshëm në mënyrë që të jenë efektive. Mbartja dhe dhënija efiçente e kulturave të gjalla në vendin e tyre të veprimit paraqet një sfidë të madhe në zhvillimin e produkteve probiotike.

Standartet industrialë kërkojnë që; produktet që deklarojnë efekte pozitive shëndetësore duhet të përmbajnë një minimum prej 106 qeliza të gjalla bakteresh probiotike për gramë produkt kur konsumohen në mënyrë që të arrijnë një efekt shëndetësor specifik dhe/ose për të siguruar përqëndrim bakterial që të jetë teknologjikisht i përshtatshëm dhe kosto efektiv (Lacroix & Yildirim 2007).

Megjithatë prodhimi në shkallë të lartë industriale dhe ruajtja e më pasme e Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp probiotike përfaqëson një “ngushtim rruge” në realizimin e potencialit të tyre komercial, për shkak të humbjeve të larta në vitalitetin e tyre për shkak të përballjes me strese të ndryshme (Ross et al., 2005). Për më shumë, pjesa më e madhe e probiotikëve janë izolate intestinale dhe si rrjedhim anaerobë obligatë dhe të vështirë për tu kultivuar. Për të gjitha këto arsye, aftësia e probiotikëve për të toleruar nxehtësinë, pH-in e ulët, stresin me oksigjen dhe stresin osmotik, është një veti e rëndësishme për përfshirjen e suksesëshme të baktereve probiotike në ushqimet funksionalë.

2.8.1 Aplikimi i stresit para-letal për të përdorur mekanizmat e përgjigjes ndaj stresit për të përmirësuar performancën teknologjike të Bifidobacterium.spp

Përpjekje kërkimore të kohëve të fundit janë fokusuar për të kuptuar mekanizmat e përgjigjes ndaj stresit të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp në mënyrë që të përmirësojnë kapacitetin e tyre për të mbijetuar dhe funksionuar nën kushte prodhimi industrial dhe pas gëlltitjes.

Toleranca acide e bifidobaktereve varjon gjerësisht, por mund të rritet në mënyrë të ndjeshme me anë të aplikimit të stresit para-letal. B. lactis shfaqi një

24

acido-tolerancë të rritur (në pH 3.5 në lëng gastrit sintetik) pasi pH-i u ul në pH 5.2 në fazën fillestare stacionare dhe qelizat hasën kushte kequshqyerje (Maus & Ingham 2003). Megjithatë stresi para-letal mundet gjithashtu të shkaktojë ulje të mbijetesës së qelizave, psh, paratrajtimi me acid dhe nxehtësi ulën acido-tolerancën e B. longum (Saarela et al., 2004).

Në një studim tjetër qelizat e B. animalis toleruan më shumë kripërat biliare kur u paratrajtuan në 47°C ose në pH 3.5 dhe B. longum paraqiti një efekt të ngjashëm, megjithëse rezistenca e përmirësuar ndaj kripërave biliare nuk ishte shumë e ndjeshme në këtë shtam, duke treguar kështu se aftësia optimizuese është shtam-specifike (Saarela et al., 2004).

Mikroorganizmat të ekspozuar ndaj një trajtimi të moderuar me nxehtësi mund të përvetësojnë aftësinë e përkohëshme për të përballuar sfida të mëpasëshme para-letale nxehtësie (Girgis et al., 2002) dhe kontrolli i kësaj rezistence tek bakteret probiotike ka efekte pozitive potenciale praktike për proçese industriale në të cilat kërkohen baktere probiotike me termotolerancë të lartë (Ross et al., 2005). B. adolescentis ishte në gjndje të mbijetonte në të njëjtën temperaturë para-letale kur ju nënshtrua një paratrajtimi stresi nxehtësie dhe një paratrajtimi stresi kripe (Schmidt & Zink 2000). Në formë të ngjashme, qeliza nga faza stacionare e B. longum të paratrajtuara në 47°C toleruan qartësisht më mirë temperaturën 55°C krahasuar me kulturat e trajtuara në kushte jo-para-letale (Saarela et al., 2004).

Adoptimi ndaj stresit osmotik tek bifidobakteret apo baketer acido-laktike është studjuar në një farë mënyre. Tek B. adolescentis pratrajtimi me kripë rezultoi në rritje të tolerancës pas cikleve të ngrirje-shkrirjes ose stresit me nxehtësi letale, megjithatë nuk u vërtetua e njëjta gjë për B. longum (Schmidt & Zink 2000). Kohët e fundit është vëzhguar se stresi osmotik induktuar nga kripa rriti mbijetesën gjatë liofilizimit të Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis (Koch et al., 2007).

Një tjetër stres që probiotikët hasin gjatë përgatitjes dhe ruajtjes të ushqimeve funksionalë është stresi me oksigjen. Vitaliteti i mikroorganizmave në ushqime të fermentuara bulmetore është i ndikuar fortësisht nga përmbajtja e oksigjenit në produkt si edhe nga përshkrueshmëria e materialit paketues (Talwalkar & Kailasapathy 2004).

2.8.2 Adoptimi ndaj stresit Organizmat probiotikë ekspozohen ndaj kushteve të ndryshme të stresit

(nxehtësisë, stresit oksidues, pH-it të ulët, kushteve osmotike, kripërave biliare, rritjes në mjedis të varfër ushqyes, etj...) si në habitatin e tyre natyral ashtu edhe gjatë përpunimit indusrial, ruajtjes si edhe kalimit përgjatë GI (Jan et al., 2000; Kosin & Rakshit, 2006; Sanders et al., 1999). Një metodë alternative për të përmirësuar vitalitetin e probiotikëve në këto kushte të vështira është aplikimi i stresit para-letal tek qelizat. Adoptimi i mundshëm ndaj stresit mund të rrisë rezistencën e kulturave ndaj kushteve të mundshme të ardhshme të stresit (Champagne et al., 2005; Saarela et al., 2004; van de Guchte et al., 2002).

Park et al., (1995), kanë raportuar se adoptimi ndaj aciditetit (në pH 5.2 për 2 orë) përmirësoi mbijetesën e B. breve në kushte të ndryshmë stresi si (pH 2-5, kripëra biliare 0.2-1.0 % dhe H2O2 100–1000 ppm ). Rezultatet e një studimi të kryer nga Broadbent et al., (1997) kanë treguar se paratrajtimi me shok termik (50ºC), rriti

25

në mënyrë të konsiderueshme aftësinë e qelizave të Lb. acidophilus në fazën eksponenciale për të toleruar një temperaturë të mëtejshme të lartë prej 63ºC. Në një studim tjetër, është treguar se Lb. acidophilus nga log faza i nënshtruar stresit acid (pH 3.8-6.0) është i aftë të durojë vlera pH-i më të ulta (Lorca et al., 1998).

Schmidt & Zink (2000), vëzhguan se B. adolescentis nga log faza i ekspozuar karshi stresit para-letal me nxehtësi (45ºC dhe 47ºC) ose stresit para-letal me kripë (1.5 dhe 2.0% NaCl), tregoi një rritje të konsiderueshme të rezistencës ndaj temperaturës letale prej 55ºC. Lorca & de Valdez (2001) zbuluan se Lb. acidophilus i rritur në një fermentim me pH të pakontrolluar (pH final 4.5) tregoi rezistencë më të lartë ndaj stresit acid si edhe kushteve të tjera të stresit (duke përfshirë praninë e etanolit, peroksidit të hidrogjenit, ngrirjen dhe ngrirje-tharjen) krahasuar me qelizat e zhvilluara në kushte pH-i të kontrolluar (pH 6.0).

Saarela et al., (2004), egzaminuan përmirësimin e vitalitetit të shtameve të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp të trajtuar në kushte stresi para-letal me aciditet të lartë dhe nxehtësi (pH 3.0-4.0 dhe 47ºC për 30 min – 1 orë) në kushtet e mëtejshme para-letale (pH 2.5, 1.5 % kripëra biliare dhe temperaturë 55ºC për 1-3 orë). Ato zbuluan se adoptimi ndaj stresit rriti vitalitetin e shtameve të Lactobacillus.spp më shumë sesa të shtameve të Bifidobacterium.spp si në shkallën laboratorike ashtu edhe në fermentator. Disa nga teknikat e ndryshme te adoptimit janë: - Aplikimi i stresit acid; - Adoptimi në matrica të ndryshme ushqimore; - Adoptimi i kombinuar ndaj faktorëve të ndryshëm të stresit; - UV-mutagjeneza

2.8.3 Mikroinkapsulimi Mikroinkapsulimi përkufizohet si “një teknologji për paketimin e solideve, likuideve,

ose të substancave të gazta në miniaturë, kapsula të vulosura që mund të lëshojnë jashtë përbërjen e tyre në nivele të caktuara në kushte specifike” (Shahidi & Han, 1993). Është një proçes me anë të të cilit një matricë e brëndshme e paqëndrueshme mbështillet nga lëndë mbështjellëse të përshtatshme për stabilitet dhe mbrojtje më të lartë ndaj mjedisit rrethues të pafavorshëm (pH i ulët dhe oksigjen i tretur) (Kailasapathy, 2002). Mikroinkapsulimi i organizmave probiotikë është me interes të lartë për industrinë e ushqimeve probiotike, sepse është mënyra më e mirë për të ruajtur fuqinë e mikroorganizmave probiotike për tu lëshuar më pas në GI (Siuta-Cruce & Goulet, 2001).

Arsyet kryesore për përdorimin e kësaj metode janë si më poshtë: përmirësimi i vitalitetit dhe stabilitetit të kulturave probiotike gjatë prodhimit, ruajtjes dhe kalimit përgjatë GIT (Kailasapathy, 2002; Krasaekoopt et al., 2003; Sultana et al., 2000), për të siguruar një lëshim të kontrolluar dhe efiçent të baktereve probiotike në GIT (Crittenden et al., 2006; Kailasapathy, 2002), për një menaxhim më të lehtë të kulturës (Picot & Lacroix, 2003b), efekt i limituar mbi parametrat sensorialë të produktit që përmban mikrokapsulat (Picot & Lacroix, 2003b)

Ka disa metoda mikroinkapsulimi për probiotikët, duke përfshirë tharjen spray, ngrirjen spray, tharjen me shtrat fluid, emulgimi, ekstrusionin (shtrydhjen), ndarjen fazore (Kailasapathy, 2002). Megjithatë dy nga teknikat më gjerësisht të përdorura për inkapsulim janë ektrusioni dhe emulgimi (Krasaekoopt et al., 2003). Për mikroinkapsulimin e probiotikëve përdoren një seri e gjërë susbstancash inkapsuluese, duke përfshirë, kripë të acidit alginik (alignat), amidon, alignat-amidon,

26

ftalat acetoili i celulozës, κ-carrageenan, xhelatinë, xhel me bazë ksantani, kitosan dhe proteina hirre (Doleyres & Lacroix, 2005; Krasaekoopt et al., 2003).

2.8.3.1 Metodat e mikroinkapsulimit

• Tharja spray Në këtë metodë substanca “bërthamë” dispergohet në një solucion polimer në mënyrë

që të formohet një emulsion ose dispersion i cili më pas homogjenizohet, atomizohet dhe lëshohet brënda dhomës së tharjes. Nxehtësia e ushtruar në këtë dhomë bën avullimin e tretsit apo të mjedisit ujor dhe formon kështu grimca të vogla të cilat mbartin mikrokapsulat (Jackson & Lee, 1991). Dëmtimi i qelizave për shkak të temperaturës së lartë të përdorur në këtë proçes konsiderohet një dizavantazh i kësaj metode (Kailasapathy, 2002).

• Ekstrusioni (Shtrydhja) Ekstrusioni përfshin përgatitjen e suspensionit të qelizave probiotike me

anë të shtimit të mikroorganizmave probiotikë në një solucion të përshtatshëm hidrokoloidal (zakonisht alignat natriumi), më pas kryhet ekstrudimi i suspensionit nëpërmjet një shiringe me “gjilpërë” për të formuar pikëza të cilat bien në një solucion ngurtësues (klorur kalçiumi). Ky proçes çon në formimin e mikrokapsulave, ku përmasa, forma dhe sfericiteti i tyre kontrollohet me anë të diametrit të gjilpërës, viskozitetit të solucionit hidrokoloidal dhe distancës midis gjilpërës dhe solucionit ngurtësues (Krasaekoopt et al., 2003; Smidsrod & Skjakbraek, 1990). Ekstrusioni është teknika më e zakonshme për prodhimin e mikrokapsulave me hidrokoloidë sepse ajo siguron kushte jo agresive të cilat garantojnë vitalitet të lartë të qelizave (Krasaekoopt et al., 2003).

• Emulgimi Kjo teknikë përfshin shtimin e qelizave probiotike në një solucion hidrokoloid për të

formuar një suspension qelizor-polimer (ujor apo me faza jo të vazhdueshme), dhe më pas shtimi i këtij suspensioni në një vaj vegjetal të ngrënshëm (organik ose me fazë të vazhduar) më pas kryhet homogjenizimi i përzierjes për të prodhuar një emulsion ujë në vaj. Në këtë hap mund të shtohen emulgues si Tween 80 për të formuar mikrokapsula më të vogla. Më pas, hidrokoloidi i tretshëm në ujë duhet të tretet me anë të ftohjes, lidhjeve kryq, ose nëpërmjet një reaksioni kimik për të formuar mikrokapsula nëpër fazën yndyrore. Më pas mikrokapsulat mblidhen nëpërmjet filtrimit. Përmasa e mikrokapsulave varet nga shpejtësia e përzierjes dhe nga tipi i emulguesit. Pozitiviteti i kësaj metode është se prodhohen mikrokapsula me diametër më të vogël se 25 μm deri në 2 mm, krahasur me ato që formohen me anë të teknikës së ekstrusionit (2-5 mm). Dizavantazhi i kësaj teknike është kostoja e lartë e operimit dhe mbetjet vajore në mikrokapsula, gjë që nuk është e përshtatshme për të prodhuar produkte me përmbajtje të ulët yndyre (Kailasapathy, 2002; Krasaekoopt et al., 2003).

2.9 Prebiotikët Përkrah produkteve probiotike, gjënden gjithashtu edhe produktet ushqimore

funksionale prebiotike, për të cilat kohët e fundit ka pasur një zhvillim në rritje. Një prebiotik është një përbërës specifik i cili lejon ndryshime, si në përbërjen dhe/ose në aktivitetin e mikroflorës intestinale dhe paraqet efekte pozitive mirqënieje dhe efekte

27

pozitive shëndetësore tek konsumatori (Roberfroid, 2007). Në përgjithësi prebiotikët janë oligosaharide, por përkufizimi i tyre mund të përfshijë edhe jo-karbohidrate. Format mbizotëruese të prebiotikëve klasifikohen në mënyrë të natyrshme si fibra të tretshme. Prebiotikët nuk metabolizohen në stomak dhe mbërrijnë në zorrën e trashë ku ato metabolizohen në mënyrë selektive nga bifidobakteret dhe LAB.

Nisur nga këndvështrimi teknologjik, fibrat dietike janë përdorur si përbërës funksionalë për shkak të aktivitetit të tyre prebiotik. Midis katër fibrave të ndryshme prebiotike, inulina, krundet e tërshërës, mielli i bananes dhe fibrat e mollës, u përdorën për të imobilizuar Lb. Casei. Krundet e tërshërës ishin ato që promovuan vitalitet më të lartë të këtij probiotiku gjatë ruajtjes në të ftohtë (Guergoletto et al., 2010). Në një studim tjetër me fibra të tretshme, oligosaharidi i frutit të dragoit (Pitaya, Hylocereus undatus) tregoi të ishte rezistent ndaj hidrolizimit nga lëngu gastrik dhe nga α-amilaza dhe tregoi një efekt prebiotik ndaj shtameve të B. bifidum dhe Lb. delbrueckii (Wichienchot, Jatupornpipat, & Rastall, 2010).

Pra konkludohet se prebiotikët duhet të rrisin numrin dhe/ose aktivitetin e specieve probiotike në zorrën e trashë. Efektet pozitive shëndetësore nga konsumimi i prebiotikëve në fakt janë të lidhura me zhvillimin e mikroflorës probiotike. Prebiotikët mund të gjënden në mënyrë natyrale në disa ushqime si në rrënjët e çikores së gjallë, në karçiofin e gjallë të Jeruzalemit, në hudhrën e gjallë ose ato mund të përftohen duke përdorur enzima si glikoziltranferazat, inulinazat, pektinazat dhe enzima të tjera.

2.10 Kombinimi i probiotikëve

Organizmat probiotikë ndryshojnë nga tipi si edhe nga niveli i efektit pozitiv ndaj organizmit. Si rrjedhim, përdorimi i kombinimeve apo kokteileve të probiotikëve mund të jetë një strategji e përshtatshme për të realizuar një rang të gjërë efektesh pozitive shëndetësore tek konsumatori. Nga anën tjetër, efektiviteti i kombinimeve të probiotikëve mund të jetë i ndryshëm krahasuar me shtamet e përfshira kur ato përdoren të vetëm. Studime In vitro dhe studim in vivo kanë treguar se kombinimi i probiotikëve mund të jetë më efektiv në kuadër të efektit pozitiv probiotik krahasuar me shtamet që e përbëjnë, veçmas.

Projektime efektive të ushqimeve funksionale që përmbajnë kombinime probiotikësh, duhet me patjetër të marrin në konsideratë mundësinë e ndodhjes dhe impaktin e ndërveprimeve potenciale sinergjike dhe antagoniste midis shtameve individuale brënda një kombinimi të propozuar, gjithashtu edhe ndërveprimet e tyre me matricat mbartëse përgjatë ruajtjes mbi performancën e tyre funksionale.

2.11 Sinbiotikët Sinbiotikët i referohen suplementeve nutricionalë duke kombinuar probiotikët dhe

prebiotikët në formën e sinergjizmit (Holzapfel & Schillinger, 2002). Kombinimi i probiotikëve dhe prebiotikëve në një produkt ushqimor është shumë interesant për arsye sepse së bashku me proçesin e ofrimit të organizmave me efekt pozitiv të gjallë drejt për drejtë, ofrohet edhe një rritje e numrit të specieve të baktereve pozitive si Bifidobacterium.spp dhe Lactobacillus.spp në mikroflorën intestinale me anë të përdorimit të prebiotikëve (Gibson et al., 2004; Cardarelli et al., 2008).

28

2.12 Karakteristikat e Boronicës Boronicë është një emër i zakonshëm për grupin e bimëve që i takojnë gjinisë

Vaccinium. Në Amerikën e Veriut rritet boronica me shkurre të lartë, të ulët dhe “sy lepuri”. Shkurrja e lartë e boronicës, quajtur ndryshe edhe boronica e kultivuar rritet në 35 shtete dhe dy provinca në Kanada (Girard et al., 2006). Këto lloj boronicash kanë fruta të mëdha në përmasa dhe shiten si të freskëta ashtu edhe të ngrira.

Tabela 2.4 Përbërja e Boronicës, (USDA 2004) Vlerat ushqyese Boronicë (100 g)

Energji (Kcal) 57.00

Proteina (g) 0.74

Total Lipide (yndyrë) (g) 0.33

Karbohidrate (g) 14.49

Fibra dietike (g) 2.40

Hi (g) 0.24

Ujë(g) 84.21

Minerale Kalçium (mg) 6.00

Bakër (mg) 0.06

Hekur (mg) 0.28

Magnez (mg) 6.00

Mangan (mg) 0.34

Fosfor (mg) 12.00

Kalium (mg) 77.00

Selen (mg) 0.10

Natrium (mg) 1.00

Vitamina Vitaminë C (mg) 7.70

Tiaminë (mg) 0.04

Riboflavin (mg) 0.04

Niacin (mg) 0.42

Acid Pantotenik (mg) 0.12

Vitaminë B-6 (mg) 0.05

Folate (mg) 6.00

Vitaminë A (IU) 54.00

Vitaminë E (mg ATE*) 0.57

*mg ATE - miligram ekuivalent alfa-tokoferol Përbërja e boronicës paraqitet në Tabelën 2.4. Specia Vaccinium corymbosum është

specia më e kultivuar zakonisht. Boronicat e shkurreve të larta janë të mëdha në përmasa me një ngjyrë të fortë blu të errët e cila rrit vlerën e tregtimit në trajtë të

29

frutit të freskët si edhe të përshtatshmërisë për përpunim. Amerika e Veriut është prodhuesi lider botëror i boronicave ku 60% e frutave shitet në trajtë të freskët dhe 40% përpunohet (Trehane 2004).

2.12.1 Komponimet bioaktive në boronicë Ka një opinion pozitiv në rritje mbi efektet pozitive shëndetësore të boronicave, të

cilat jane burime të pasura me komponentë bioaktivë të ndryshëm të cilët mendohet se zotërojnë aktivitete biologjike të posaçme (Svarcova, Heinrich, & Valentova, 2007). Si paraqitet edhe në Tabelën 2.4 të mësipërme, ato janë të pasura në fibra, vitamina, minerale, folate dhe veçanërisht në komponime fenolike (Mullen et al., 2002; Tulipan et al., 2008; Vourinen, Määtä, Törrönen, 2000) si edhe në acide organike (Viljakainen, Visti & Laakso, 2002). Mendohet se komponimet fenolike veprojnë si komponime mbrojtëse kundër patogjenëve të bimëve dhe zakonisht induktohen si pasojë e kushteve të ndryshme të stresit (Puupponen-Pimia, Nohynek, Alakomi & Oksman-Caldentey, 2005). Më tipikët për boronicat janë, flavonoidet, acidet fenolike, përbërjet me bazë linaloli dhe polimerët kompleksë fenolikë (taninet polimerike) (Häkkinen, Kärenlampi, Heinonen, Mykkänen, & Törrönen 1999). Antocianinet (glikozide të grupit të antocianidinës) janë grupi mbizotërues i flavoniedeve të pranishëm tek boronica. Gjithashtu edhe acidet fenolike të thjeshta si acidet hidroksicinaminik dhe acidet hidroksibenzoik janë të zakonshme në shumë boronica (Herman & Nagel, 1989). Flavonoidet dhe acidet fenolike formojnë bllokun ndërtues për taninet polimerike, të cilat mund të klasifikohen si tanine të hidrolizueshme dhe të kondensuara. Taninet e hidrolizueshme janë si gallotannine ashtu edhe ellagitannie, kur hidrolizohen gallotanninet prodhojnë glukozë dhe acid galik (Häkkinen, Kärenlampi, Heinonen, Mykkänen, & Törrönen 2000; Mullen et al., 2002). Sipas Viljakainen et al., (2002), acidet kryesore të lëngut të boronicës janë acidi malik dhe acidi citrik edhe pse përqëndrimet e tyre varjojnë shumë nga njëri tek tjetri. pH-i i shumicës së lëngjeve të boronicës është i ulët (pH 2.4-3.5), si rrjedhim një faktor avantazhues në parandalimin e kontaminantëve mikrobialë, por probabilisht një faktor stresi për mikroorganizmat probiotikë.

2.12.1.1 Antocianet Antocianet janë pigmente natyralë të tretshëm. Antocianet ndryshojnë ngjyrë në

varësi të pH-it të mjedisit. Në solucione acide, ngjyra e tyre ndryshon në të kuqe, në mjedise bazike ngjyra e tyre ndryshon në blu, ndërsa në kushte neutrale antocianet kanë ngjyrë vjollcë. Ngjyra e kuqe në blu e boronicave është kryesisht për shkak të pranisë së antocianeve.

Figura 2.3 Struktura e Antocianeve

30

Ka pesëmbëdhjetë antocianine të ndryshme të pranishme në frutin e boronicës. Ato janë galaktozide, glukozide, dhe arabinozide të delfinidinës, cianidinës, peonidinës dhe malvidinës (eter dimetilik i delfinidinës) (Kalt & Dufour 1997; Girardin et al., 1996; Haluk et al., 1998).

Figura 2.4 Ndryshime strukturore të antocianeve me ndryshimin e pH-it (McGhie & Walton

2007)

Statusi struktural luan një rol të rëndësishëm në bioaktivitetin e antocianeve. Në tretësira antocianet egzistojnë në forma të ndryshme në varësi të pH-it të tretësirës dhe këto forma janë në ekuilibër (Harborne et al., 1975; Clifford 2000; McGhie & Walton 2007). Fillimisht njiheshin vetëm 3 forma, më pas u bënë 4 dhe së fundmi njihen 8 struktura të ndryshme (McGhie & Walton 2007). Në pH 2 ose më të ulët, forma mbizotëruese është ajo semiacetal, e cila me rritjen e pH-it, konvertohet në formën kinonoide blu. Gjithashtu përmes një proçesi hidratimi të ngadaltë, kationi flavuliumit konvertohet në formën semiacetale pa ngjyrë, e cila më pas tautomerizohet (protonotropizohet, dezmotropizohet) në formën e saj kalkone si në konfigurimin cis ose edhe në atë trans (Clifford 2000; McGhie & Walton 2007).

Antocianet kanë karakteristika antioksiduese të cilat luajnë një rol të rëndësishëm në parandalimin e sëmundjeve kardiovaskulare, kancerit dhe diabetit. Ka disa faktorë që ndikojnë në stabilitetin e antocianeve si pH-i, temperatura, drita, oksigjeni, enzimat, acidi askorbik, sheqernat, kriprat sulfite (sulfur diokside), jonet e metaleve dhe ko-pigmentet. Intesiteti i nxehtësisë dhe temperatura kanë efekt më të madh në stabilitetin e antocianeve (Brunton et al., 2010a; Erdman et al., 2005).

31

2.12.1.2 Polifenolet Pjesa më e madhe e acideve fenolike të pranishme në boronicë janë derivate të acidit

benzoik dhe acidit cinamik. Këto acide fenolike njihen gjithashtu si jo- flavonoide. Acidi Vanillik, acidi surinxhik, acidi galik, acidi protokatekik, acidi m-hidroksibenzoik, acidi p-hidroksibenzoik dhe acidi ellagik janë derivate të acidit benzoik (Sellappan et al., 2002; Häkkinen et al., 1999; Amakura et al., 2000), ndërkohë që acidet klorogjenik, acidi kafeik, acidi ferulik, acid kuinik, acidi p-kumarik, acid o-kumarik dhe acidi m-kumarik janë derivate të acidit cinamik (Sellappan et al., 2002; Häkkinen et al., 1999). Acidet fenolike më shumë të pranishme në boronicë janë acidet klorogjenik (Kalt et al., 2000; Wang & Zheng 2003).

Acidi Cinamik Acidi Benzoik

Acid Klorogjenik Acidi kuinik Figura 2.5 Struktura e acideve fenolike të pranishme në boronicë

Përbërja e acideve fenolike ndryshon midis kultivarëve të boronicës. Strukturat e

acideve fenolike paraqiten në Figurën 2.5.

2.12.1.3 Flavonoidet Boronicat janë të pasura me flavonoide, antociane, flavanole, flavonole (Fig 2.6) edhe

flavan-3-ole. Flavonoidet ushtrojnë veti antioksidante dhe anti-karcinogjenike. Bazuar në studime të mëparshme epidemiologjike, konsumimi i lartë i flavonoideve siguron mbrojte kundër sëmundejeve të koronareve të zemrës dhe kancerit në mushkri. Kuercitina, kemferoli dhe miricelina janë disa flavonole të pranishme në boronicë (Sellappan et al., 2002; Azar et al., 1987).

Flavanole Flavonole

Figura 2.6 Disa struktura të flavonoideve të pranishëm në boronicë

32

2.12.2 Aktiviteti antioksidant Boronicat kanë aktivitet të lartë antioksidant krahasuar me shumë fruta të

tjera. Aktivieti antioksidant i boronicave varjon nga 8.1-38.3 µmol TEAC/g. Bazuar në “USDA Human Nutrition Research Center”. Boronicat e freskëta renditen pothuaj në majë të klasifikimit meqënëse kanë aktivitet shumë të lartë antioksidues (2400 njësi ORAC)/ 100g krahasuar me shumë fruta dhe perime (Chien & Su 2007). Faktorët më të rëndësishëm për aktivitetin antioksidues në boronicë janë kryesisht përmbajtja e antocianineve, përmbajtja e fenoleve, pjekuria e frutit dhe kushtet e ruajtjes pas vjeljes.

2.12.3 Efekte pozitive nutricionale dhe shëndetësore të boronicës Dieta të pasura me fruta dhe perime njihen se reduktojnë disa tipe kanceri, si edhe

sëmundje kardiovaskulare dhe kronike (Donner et al., 2000). Pjesa më e madhe e këtyre efekteve pozitive është e lidhur me substancat fitokimike të pranishme në fruta dhe perime të cilat kontribojnë në aktivitetin e tyre antioksidues. Antioksidantët natyralë të pranishëm në fruta dhe perime si antocianinet, polifenolet, vitamina C, vitamina E dhe karotenoidet tregohet se kanë një veprim parandalues ndaj sëmundjeve kronike. Komponimet antioksiduese reduktojnë dëmin oksidativ me anë të neutralizimit të radikaleve të lira. Radikalet e lira mund të prodhohen në trupin e njeriut për shkak të funksioneve trupore si frymëmarrja, dhe mund të induktohen përmes disa kushteve mjedisore si rrezatimi UV, ndotja e ajrit, si edhe vese si konsumimi i ushqimeve të skuqura dhe duhanpirja (Erdman et al., 2005). Rëndësia e boronicës duhet të theksohet sepse ajo ka kapacitetin më të lartë oksidue krahasuar me 42 fruta dhe perime të vlerësuara. Boronicat njihen gjithashtu se janë një burim i mirë i firbrave dietike, kalçiumit, hekurit, vitaminës A dhe vitaminës C.

2.13 Skema e prodhimit të lëngut të boronicës Lëngu i boronicës është një nga produktet e përpunuara të boronicës. Lëngu i

boronicës komerçial përfshin hapat e mëposhtëm të përpunimit si, blansherimi, trajtimi enzimatik, qartësimi dhe pasterizimi (Figura 2.7).

Figura 2.7 Përpunimi i lëngut të boronicës (Durst et al., 2002)

33

2.14 Efekti i boronicës kombinuar me probiotikë Osman et al., (2008) studjuan aktivitetin anti-inflammator të boronicës dhe disa

shtameve probiotike tek brejtësit. Autorët raportuan se numri i qelizave Enterobacteriaceae në zorrë ra në mënyrë të ndjeshme tek grupi i brejtësve të cilët morën boronicë me dhe pa probiotikë. Për më shumë kombinimi i boronicës me L. plantarum ose L. fermentum pati aftësi të reduktonte inflamacionet intestinale (Osman et al., 2008).

Polifenolet si flavonoidet janë të kudogjendur në fruta dhe perime. Parkar, Stevenson & Skinner (2008) kanë raportuar se flavonoidet- naringin (izohesperidinë), rutin (eldrin), florizidin dhe kuercitin – mund të kenë efekte në mikroflorën intestinale midis të tjerave: a) një rritje të numrit të baktereve pozitive si L. rhamnosus, b) rritje të aderencës të këtyre baktereve në murin intestinal dhe c) inhibim të poliforimit të eneteropatogjenëve si S. aureus ose Salmonella typhimurium.

Nga ana t jetër flavonidet mund të vuajnë disa modifikime strukturale kur i nënshtrohen fermentimit . Psh Bisakowski, Atwal, Gardner, & Champagne (2007) vlerësuan profilin flavonoidik të qepëve të kuqe të fermentuara nga L. plantarum dhe gjetën një alterim/ndryshim në profilin e kuercitin glukozide. Pas fermentimit, sasia e kuercetin diglukozide dhe monoglukozide u rrit në mënyrë të ndjeshme, gjë e cila u theksua si një avantazh nga autorët, meqënëse këto glikozide kanë aktivitet antioksidues të mirnjohur.

34

PJESA EKSPERIMENTALE

KAPITULLI 3. Përzgjedhja e metodave për përmirësimin e rezistencës ndaj aciditetit të shtameve të Bifidobacterium.spp

3.1 Përmbledhje Qëllimi i kësaj faze studimi ishte testimi dhe përzgjedhja e teknikave të stresit acid

më të përshtatshme për të përftuar fenotipe acido rezistente. Nisur nga studime të mëparshme të laboratorit DISTA, u përzgjodhën kultura për të cilat ishin kryer studime mbi rezistencën e tyre në kushte pH-i 4.0. Kushtet e stresit acid u krijuan në terren TPY me pH të rregulluar pH 3.5, pH 4.0 dhe pH 4.5 ku u inokuluan 10 shtame në trajtë të liofilizuar nga koleksioni i “DISTA”, Universiteti i Bolonjës, Itali: B.bifidum B1958, B.bifidum B2334, B.infantis B1522, B.infantis B1602, B.infantis B1652, B.longum B2402, B.longum B2426, B.longum B7231, B.breve B609, B.pseudocatenulatum B7396, të cilët u rivitilazuan dhe u çuan në kushte normale zhvillimi duke i rinfreskuar 2 herë në TPY lëng pH 7.0. Më pas biomasat e kulturave u inokuluan në TPY pH 3.5, pH 4.0 dhe pH 4.5, inkubim në anaerobiozë në termostat 37°C/24 orë. Pas kësaj prove u vu re që kishte një nivel të lartë mbijetese të këtyre kulturave në të tre terrenet me vlerat e mësipërme të pH-eve. U përcaktua vitaliteti i të 10 shtameve vetëm për pH-in më të ulët, pH 3.5 duke kultivuar në pjatë Petri me derdhje me terren TPY pH 7.0. Pas inkubimit u vërejt që shtamet kishin reaguar në forma të ndryshme ndaj këtij stresi, ku më rezistentët rezultuan shtamet B.bifidum B1958, B.breve B609, B.longum B2402 dhe B.bifidum B2334. Nisur nga ky rezultat, u aplikua një teknikë adoptimi 4 ditë në TPY pH 3.5 duke e rinfreskuar terrenin çdo 24 orë vetëm për 7 shtame. Nuk u përfshinë në këtë fazë studimi vetëm 3 shtame të cilët humbën totalisht vitalitet pas provës së parë B.infantis B1652, B.infantis B1602, B.longum B2426. Në fund të kësaj teknike adoptimi u synua të izoloheshin fenotipet acid rezistente. Pas këtij adoptimi në kushte stresi acid, u konservuan në kriovial në -80°C, fenotipet acido rezistente për të gjithë shtamet. Nga këto fenotipe u përgjodhën për fazën pasardhëse studimore, ato të cilët do të vazhdonin provën e rradhës mbi rezistencën drejt për drejtë në lëng boronice (Kapitulli 4).

3.2 Hyrje Bifidobakteret janë baktere gram pozitive, anaerobike, të palëvizshme,

josporoformuese, me formë jo të rregullt ose të degëzuara, cilindrike, fermentative, në të cilat sjellja karshi aciditetit varet nga shtami (Mättö, J et al., 2004). Ashtu si edhe baktere të tjera intestinale, ato kanë treguar se paraqesin mbrojtje karshi shqetësimeve gastro-intestinale, por gjithashtu është propozuar se ato ushtrojnë edhe aktivitete të tjera që promovojnë shëndetin, si psh inhibimi i mikroorganizmave patogjenë, aktivitet antimutagjenik dhe antikarcinogjenik, parandalimin e diarresë, modulimin e imunitetit, si dhe reduktimin e nivelit të kolesterolit (Salminen & Gueimonde. 2004, Tannock, G. W. 2002). Për arsye të këtyre vetive, shumë specie që i takojnë gjinisë Bifidobacterium konsiderohen probiotikë, dhe aplikohen gjërësisht në produktet e bulmetit dhe në produkte të tjera (Masco et al., 2005).

35

Toleranca karshi aciditetit është e një rëndësi të veçantë për probiotikët, sepse kjo veti është e lidhur ngushtë me mundësinë e përdorimit të tyre në produktet ushqimore për njerzit. Përgjithësisht mund të thuhet se bifidobakteret kanë një tolerancë të ulët karshi aciditetit me përjashtim të Bifidobacterium animalis (Maus & Ingham. 2003), i cili mund të mbijetojë në pH acid më mirë sesa specie të tjera (Jayamanne & Adams. 2006). Bifidobacterium.spp të izoluar nga foshnja përshtaten më mirë ndaj kushteve të traktit intestinal sesa ato të izoluar nga të rriturit (Collado & Sanz, 2006a). Sipas (Collado & Sanz, 2006a), B. breve dhe B. adolescentis janë specie të bifidobaktereve prej foshnjave dhe të rriturve përkatësisht, të cilët kanë paraqitur aftësi më të lartë për tu përshtatur në pH acid.

Së fundmi edhe, B. breve është njohur gjithashtu si specia humane me nivelin më të

lartë të mbijetesës në qumësht të skremuar të acidifikuar (Jayamanne & Adams, 2006). Është sygjeruar gjithashtu se shtame që prodhojnë ekzopolisaharide (EPS) mund të paraqesin tolerancë më të mirë ndaj stresit (Stack et al., 2010), ndaj si rrjedhim mund të përzgjidhen shtame prodhuese të EPS për aplikim në këto kushte. Në kontrast, B. bifidum dhe B. catenulatum kanë rezultuar tipi i species bifidobakteriale nga foshnja dhe të rritur përkatësisht që kanë paraqitur ndjeshmërinë më të lartë karshi kushteve acide (Collado & Sanz, 2006a).

Gjithashtu tolerancën karshi kushteve acide e studjoi LI et al., (2010) për

Bifidobacterium.spp të ekspozuar ndaj dy faktorëve të stresit të ndryshëm, pH-it të ulët dhe kriprave biliare. U studjua mbiejetesa e shtameve për 4 specie të Bifidobacterium në pH midis 3.0 dhe 4.5 dhe ox-bile (ekstrakt bile) midis 0.15 % dhe 0.60 % për një kohë deri në 41 orë. Renditja e rezistencës ndaj aciditeti dhe kriprave biliare rezultoi, B. bifidum > B. infantis > B. longum > B. adolescentis.

Pasi gëlltiten këto baktere duhet të mbijetojnë kalimin/tranzitin në mjedisin me pH

të ulët të stomakut. Si përfundim këto baktere duhet të përballen me stersin acid që nga ruajtja fillestare e tyre që nga shpërndarja dhe deri tek konsumimi i tyre përfundimtar, i gjithë ky zinxhir përgjithësisht mund të shkaktojë humbje të vitalitetit të tyre dhe për më tepër reduktim të efektit potencial probiotik (Champagne et al., 2005; O'May et al., 2005).

Strategji për të përmirësuar mbijetesën e baktereve probiotike bazuar në

adoptimin ndaj stresit dhe mekanizmave të mbrojtjes-kryq janë gjithashtu nën studim. Këto kërkime paraqesin një përqasje të bazuar kryesisht në ekspozimin e për kohë të shkurtër të qelizave bifidobakteriale ndaj faktorëve të ndryshëm të stresit (pH i ulët, nxehtësi, kripra biliare ose kequshqyerje) për të induktuar tolerancë ndaj kushteve të ardhshme letale të stresit. Disa nga studimet listohen më poshtë:

Park et al., (1995) kanë raportuar që adoptimi karshi aciditetit (në pH 5.2 për 2 orë) përmirësoi mbijetesën e B. breve në kushte stresi të ndryshëm (pH 2-5, kripra biliare 0.2-1.0 % dhe H2O2 100–1000 ppm).

Lorca et al., (1998) kanë treguar se Lb. acidophilus i nënshtruar stresit acid (pH 3.8-6.0), gjatë log fazës, është në gjëndje të përballojë vlera pH-i më të ulta.

Lorca & de Valdez (2001) kanë zbuluar se Lb. acidophilus i rritur në fermentim me pH të pakontrolluar (pH final 4.5) ka treguar rezistencë më të lartë karshi stresit acid dhe faktorëve të tjerë të stresit (duke përfshirë praninë e etanolit, peroksidit,

36

ngrirjes dhe ngrirje-tharjes) më shumë sesa qelizat e rritura në kushte pH-i të kontrolluar (pH 6.0).

Maus & Ingham, (2003) kanë konkluduar se acido-toleranca e B. lactis është rritur nga ekspozimi ndaj trajtimeve multi-adoptuese, por e njëjta strategji dështoi me shtame të përzgjedhura të B.longum.

Saarela et al., (2004) kanë egzaminuar përmirësimin e mbijetesës të shtameve të Lactobacillus dhe Bifidobacterium të trajtuar në kushte para-letale me acdiditet të lartë dhe nxehtësi (pH 3.0 - 4.0 dhe temperaturë 47ºC për 30 min – 1 orë) dhe në vazhdim në kushte letale (pH 2.5, kripra biliare 1.5 % dhe temperaturë 55ºC për 1-3 orë). Ato zbuluan se adoptimi karshi stresit rriti mbijetesën e shtameve të Lactobacillus.spp më shumë sesa ato të Bifidobacterium.spp në të dy nivelet si atë laboatorik ashtu edhe në fermentator. Para-trajtimi në pH 3.5 të disa shtameve të B. longum E1884 pati madje efekt të kundërt duke ulur acido-tolerancën.

Maus & Ingham, 2003; Saarela et al., (2004), kanë konkluduar se ekspozim i shkurtër ndaj trajtimeve të stresit jo ekstrem, nuk ka rezultuar gjithmonë në përftimin e fenotipeve të qëndrueshëm dhe në rezultate të riprodhueshme në shkallë indusriale.

Sipas Collado & Sanz (2007), toleranca ndaj stresit të shtameve të B. longum dhe B. catenulatum u përmirësua me anë të ekspozimit të zgjatur ndaj kushteve të stresit acid. Disa nga shtamet e gjeneruara treguan parametra metabolikë të përforcuar me rëndësi për aplikimin e probiotikëve.

3.3 Synimi i studimit

Meqënëse nga literatura është treguar se në përgjithësi Bifidobacterium.spp janë të ndjeshëm ndaj pH-it të ulët me përjashtim të shtameve të species B.animalis (Jayamanne & Adams, 2006; Mãttö, Alakomi, Vaari, Virkajãrvi, & Saarela, 2006), në mënyrë qe të rritet gama e përdorimit të tyre në produkte funksionale (edhe në ato produkte me aciditet të lartë) e shtameve probiotike të Bifidobacterium.spp. Në këtë studim u përfshinë disa specie të bifidobaktereve si, B.bifidum 2 shtame, B infantis 3 shtame, B.longum 3 shtame, B. breve 1 shtam dhe B. pseudocatenulatum 1 shtam. Megjithatë të gjithë probiotikët duke përfshirë këtu edhe ato më rezistentët, kanë barriera teknologjike si edhe kufizime në aplikimin e tyre në ushqime (Mattila Sandholm et al., 2002; Mãttö, Alakomi, Vaari, Virkajãrvi, & Saarela, 2006). Si rrjedhim zhvillimi i strategjive efektive për të përmirësuar tolerancën e shtameve të Bifidobacterium.spp ndaj stresit acid është synim primar i këtij studimi, në mënyrë që të garantohet funksionalitetin i tyre, gjithashtu edhe për të diversifikuar speciet e bifidobaktereve dhe llojet e produkteve të tregëtuar si probiotikë.

Hipotezat e kësaj faze studimi:

- Shtamet e përzgjedhura të rezistuara paraprakisht mirë në pH 4 (në 4°C) të mund të rezistonin gjithashtu mjaftueshëm edhe në pH 3.5 (në 37°C).

- Përzgjedhja e shtameve nëpërmjet provës së rezistencës 24 orë në TPY pH 3.5, të mund të ishte efikase për përzgjedhjen e etapës së adoptimit të vazhdueshëm në TPY pH 3.5 për 4 ditë.

37

- Adoptimi i zgjatur 4 ditë në TPY pH 3.5 të mund të prodhonte fenotipe acido-rezistente ndaj këtij pH-i.

3.4 Materiale dhe Metoda

Në këtë fazë studimi u përdorën shtamet e paraqitur në Tabelën 3.1

Tabela 3.1 Shtame të liofilizuara dhe origjina e tyre e izolimit

Nr Shtami Specia Origjina nga ku është izoluar

1 B1958 Bifidobacterium bifidum Feçe foshnjore 2 B2334 Bifidobacterium bifidum Feçe foshnjore 3 B1522 Bifidobacterium infantis Feçe foshnjore 4 B1602 Bifidobacterium infantis Feçe foshnjore 5 B1652 Bifidobacterium infantis Feçe foshnjore 6 B2402 Bifidobacterium longum Feçe foshnjore 7 B2426 Bifidobacterium longum Feçe foshnjore 8 B7231 Bifidobacterium longum Feçe adulti 9 B609 Bifidobacterium breve Feçe foshnjore 10 B7396 Bifidobacterium pseudocatenulatum Feçe adulti

• Solucione dhe terrene

-Terren Trypticase PhytoneYeast Extract Lëng (TPY), me përbërje: [Tripton (trypticase) 10g/L, Phytone 5g/L, Glukozë 15g/L, Ekstrakt majaje 2.5g/L, Tween 80 (C64H124O26) 0.5g/L, Cisteinë 0.5g/L, K2HPO4 1.5g/L, MgCl2x6H2O 0.5g/L, Agar 15g/L], -solucion fiziologjik, (tretësirë NaCl 0.9%), - tretësirë PBS, -qumësht i skremuar (Skimed milk).

• Rivitalizimi i kulturave të Bifidobacterium.spp të liofilizuara

U krye rivitalizimi në TPY lëng për dhjetë shtamet e Bifidobacterium.spp të liofilizuara në ampula individuale qelqi, nga koleksioni i krijuar në vite i laboratorit DISTA. Konkretisht B1958, B2334, B1522, B1602, B1652, B2402, B2426, B7231, B609, B7396, pas kalimit në TPY u vendosën në kontenierët e anaerobiozës, inkubim në termostat 37°C për 24 orë. Rinfreskim i kulturave pas 24 orësh në tuba me terren të ri TPY lëng, për zhvillim më të mirë.

• Përgatitja e terreneve me pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5

U krye përgatitja e terrenit TPY i lëngshëm pH 7.0. Rregullimi i pH-it u krye duke shtuar me pika HCl 5M, duke matur paralelisht me pH- metër me elektrodë të zhytur në terrenin në përzjerje të vazhdueshme. U shpërnda në tuba dhe u sterilizua në autoklavë në 121°C për 20 min.

- U krye kalibrimi i pH-metrit, dhe kontrolli i pH-it të terreneve pas sterilizimit.

38

3.4.1 Testimi i rezistencës së shtameve 24 orë/ 37°C, në TPY ( pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5)

Pasi u zhvilluan mirë, shtamet u nxorën nga termostati. Nga sejcili tub me suspension TPY lëng pH 7.0 me kulturë, u kalua i gjithë suspensioni në epruvetën me fund konik (tuba centrifugalë) me volum 10mL, nën flakë pas përzierjes. Të gjitha epruvetat me nga 9mL suspension u vendosën në centrifugë 6000 xhiro/min për 20 minuta, për veçimin e biomasës. U derdh terreni i kthjellët (surnaktanti) i mbetur në pjesën e sipërme të epruvetës ku u shtua 1mL solucion fiziologjik, përzierje për shpëlarje të qelizave dhe ricentrifugim, derdhje e surnaktantit të shpëlarjes dhe mbi biomasën qelizore u shtua nga 6mL solucion fiziologjik, përsëri përzierje. U pipetua nga 1mL nga çdo suspension fiziologjik me kulturë dhe u kalua në 2 tuba paralelë me TPY lëng me pH 4.5; pH 4.0; pH 3.5. Inkubim në anaerobiozë në termostat në 37°C/24 orë.

Duke qënë se u vërejt zhvillim qelizor në terrenet në të trija vlerat e pH-it (pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5), për të përcaktuar shtamet që i rezistuan 24 orë mjedisit me vlerën e pH-it më të ulët, u vendos që përcaktimi i vitalitetit të kryhej vetëm për suspensionet nga tubat me TPY agar pH 3.5. U aplikua metoda e hollimeve limite në tretësirë fiziologjike 0.9%, dhe kultivimi në TPY agar pH 7.0. Inkubim në anaerobiozë në termostat në 37°C/24 orë.

3.4.2 Ekspozimi i vazhdueshëm i kulturave për 4 ditë në TPY pH 3.5 Nisur nga rezultatet e provës së mëparshme për këtë provovë u zgjodh të aplikohej

ekspozimi i zgjatur për shtamet: B1958, B1522, B2426, B2334, B7396, B7231, B609, B1602, B2402. Nga çdo pjatë që kishte si kulturë origjinë kulturën e zhvilluar pas 24 orë në TPY lëng pH 3.5 u morën nga 5 koloni/shtam dhe u kultivuan në tuba me TPY lëng pH 7.0, inkubim në termostat në 37°C/24 orë.

U aplikuan 2 metoda paralele ekspozimi të zgjatur.

Metoda 1 - Pas 24 orë inkubim, centrifugim 6000 xhiro/min për 20 min, shpëlarje e biomasës me solucion fiziologjik 0.9%, centrifugim 6000 xhiro/min për 20 min, kalim i të gjithë biomasës në TPY pH 3.5 të freskët, inkubim në termostat në kushte anaerobike në 37°C/24 orë. Përsëritje e kësaj proçedure (kalimit në TPY pH 3.5 të freskët) për 4 ditë me rradhë çdo 24 orë.

Metoda 2 - Pas 24 orë inkubim, centrifugim 6000 xhiro/min për 20 min, shpëlarje e biomasës me solucion fiziologjik 0.9%, centrifugim në të njëjtat kushte. Shtim i 5mL solucion fiziologjik, pipetim i 1mL suspension nga ky i fundit dhe kalimi i tij në tub me 9mL TPY lëng pH 3.5, inkubim në termostat në kushte anaerobike në 37°C/24 orë. Përsëritje e kësaj proçedure (kalimit në TPY pH 3.5 të freskët) për 4 ditë me rradhë çdo 24 orë.

• Konservim në kriostat -80°C, i shtameve “rezistente” të ekspozuara 4 ditë në TPY pH 3.5

Pas 4 ditë ekspozim në TPY pH 3.5 u krye izolim i fenotipeve probabël acido-rezistente pas 4 pasazheve rinfreskimi në TPY lëng pH 7.0 të freskët. Ruajtje në skimed milk në -80°C.

39

3.5 Rezultate

3.5.1 Mbijetesa e kulturave në TPY pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5. Të 10 shtamet pas inkubimit në termostat në 37°C/24 orë në TPY lëng me pH 4.5;

pH 4.0; pH 3.5, paraqitën një zhvillim qelizor të lartë sepse në tuba u vërejt turbulli e lartë dhe precipitim i biomasës. Nga përckatimi i mbijetesës së tyre në këto vlera pH-i u morën rezultatet të paraqitura në Figurën 3.1, ku për vlerat e pH 4.0 dhe pH 4.5 të TPY rezultoi nivel i panumërueshëm kolonish. Në Grafikun 3.1 paraqiten rezultatet e mbijetesës të shtameve të rezistuar 24 orë në TPY pH 3.5, përcaktuar nëpërmjet numërimit të kolonive të zhvilluara në pjatat e Petrit me terren TPY agar pH 7.0 pas 24 orë inkubim.

Figura 3.1 Mbijetesa e shtameve B1522, B2426 dhe B1958, 24 orë në terren TPY me pH 4.5, pH 4.0

dhe pH 3.5

Grafiku 3.1 Mbijetesa e shtameve 24 orë në TPY lëng pH 3.5

Shtamet reaguan në mënyra të ndryshme. Meqënëse nuk dihej përqëndrimi qelizor fillestar i inokuluar nuk mund të përcaktohej saktësisht rënija e vitalitetit. Gjithsesi duke marrë parasysh që të gjitha kulutrat vijnë nga të njëjtat kushte, pra kaluan nga trajta e liofilizuar, u rinfreskuan në TPY lëng pH 7.0, probabilisht përqëndrimi fillestar duhet të varjonte në intervalin 107-109 CFU/mL. Duke marrë parasysh këtë të dhënë supozohet që me rezistencë të mirë, pra me një ulje minimale të numrit të qelizave paraqiten B.bifidum B1958, B.breve B609, B.longum B2402 dhe B.breve B2334. Një ulje të konsiderueshme të numrit të qelizave kanë paraqitur shtamet B. pseudocatenulatum B7396, B. longum B7231 dhe B. infantis B1522. Shtamet B.longum B2426, B.infantis B1602 dhe B.infantis B1652 nuk kanë rezistuar aspak në kushtet e pH 3.5 duke shkuar numri i qelizave të tyre pas 24 orësh 101 deri në 0

0123456789

logc

fu/m

l

40

CFU/mL. Renditja sipas shkallës së rezistencës: B.breveB609 > B.bifidum B1958 > B.longum B2402.

3.5.2 Ekspozimi i vazhdueshëm i kulturave për 4 ditë në TPY pH 3.5 Nga shtamet të cilat rezistuan 24 orë në TPY pH 3.5 u aplikua ekspozimi i

vazhdueshëm në TPY pH 3.5 për 4 ditë, duke e rinfreskuar terrenin çdo 24 orë dhe duke e kaluar të gjithë biomasën në terrenin e ri. U vendos të kryhej kjo proçedurë në mënyrë që të evitohej maksimalisht humbja e qelizave nga njëri kalim tek tjetri dhe krijimi i një biomase sa më të dendur në mënyrë që të kishim një probabilitet më të lartë për të izoluar fenotipin acido-rezistent.

Me këtë metodë u synua të krijoheshin fenotipe rezistente midis të cilave u përzgjodhën për tu përdorur në provën e rradhës të mbijetesës në lëng boronice. Për shtamet që u aplikua adoptimi nuk u krye kultivimi për të përcaktuar vitalitetin e tyre sepse u synua vetëm përftimi i fenotipeve acid rezistente pas 4 ditësh. Pergjatë 4 ditëve të adoptimit në këto kushte në tuba pas inkubimit vërehej turbullirë gjë që tregonte mbijetesë të shtameve.

3.6 Diskutime Synimi i kësaj pjese studimi ishte zhvillimi i strategjive efektive për të

përmirësuar tolerancën e shtameve të Bifidobacterium.spp ndaj kushteve mjedisore të ashpra (pH-it të ulët). Hap i parë ishte analizimi i zhvillimit të shtameve të Bifidobacterium.spp në terren TPY pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5 (24 orë) në anaerobiozë 37°C. Ashtu si edhe është përmendur edhe në përmbledhjen e këtij kapitulli, shtamet e përzgjedhura për tju nënshtruar kësaj etape studimi, ishin shtame për të cilat është vërtetuar nga studime të mëparshme të (Biavati et.al., 1992) se kanë paraqitur rezistencë të lartë në pH 4.0 në kushte frigoriferike 4°C dhe anaerobiozë për 15-30 ditë. Nga ky studim shtamet më rezistente kanë rezultuar B.bifidum B1958 dhe B. breve B609 (30 ditë rezistencë në kushtet e përmendura më sipër). U vendos që të ishin këto shtame për tju nënshtruar teknikave të ekspozimit të zgjatur ndaj kushteve të pH-it acid, duke qënë se probabilisht mund të reagonin mirë krahasuar me shtame të tjera të ndjeshme.

Testimi i mbijetesës së shtameve që është vërtetuar se janë rezistente në pH 4.0, u krye jo në kushte frigoriferike por në temperaturë 37°C (jetëgjatësi e përshpejtuar) gjithnjë në kushte anaerobike. U përzgjodh që të aplikohej inkubimi në temperaturë 37°C dhe jo në kushte frigoriferike duke qënë se kjo etapë do të vlente si një filtrim i përshpejtuar i shtameve më rezisente apo jo. Nga kjo etapë duke vërejtur nivelin e turbullirës dhe precipitatit në të gjithë tubat me kulturë (pra në të tre terrenet me vlera pH-i të ndryshme; pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5), si edhe duke kontrolluar pastërtinë e kulturës me anë të preparateve për vëzhgim në mikroskop, u konkludua që në këto kushte shtamet mbijetuan. Si rrjedhim i këtij rezultati u vendos të përcaktohej saktësisht niveli i mbijetesës së këtyre shtameve 24 orë vetëm për TPY pH 3.5 në 37°C, duke kryer kultivim të kulturave në pjatë petri me TPY agar. Nga rezultate pas inkubimit u vërejt se me rezistencë të mirë, pra me një ulje minimale të numrit të qelizave, paraqiten B.bifidum B1958, B.breve B609, B.longum B2402 dhe B.breve B2334. Ndërsa shtamet B.longum B2426, B.infantis B1602 dhe B.infantis B1652 nuk kanë rezistuar aspak në kushtet e këtij pH-i duke shkuar numri i qelizave të tyre pas 24 orësh nga 101 deri në 0 CFU/mL.

Këto të dhëna përkojnë gjithashtu me përfundimet e nxjerra edhe nga (Biavati et.al., 1992). Gjithashtu me anë të këtyre rezultateve rikonfirmohet fakti i

41

konkluduar se Bifidobacterium.spp të izoluar nga infantë përshtaten më mirë ndaj kushteve të pH-it të ulët sesa ato të izoluar nga adultët (Collado & Sanz, 2006a) sepse në studimin tonë të tre shtamet që rezistuan më mirë në TPY pH 3.5 (B.bifidum B1958, B.breve B609, B.longum B2402 dhe B.breve B2334) janë izoluar nga feçe foshnjore. Gjithashtu nga Collado & Sanz, (2006a) është vërtetuar se shtame të B. breve, specie prej infantëve kanë paraqitur aftësinë më të lartë për tu përshtatur në pH acid. Megjithatë vërehet që edhe pse shtamet B.infantis B1602 dhe B.infantis B1652 janë specie të izoluara nga feçe foshnjore kanë paraqitur sensibilitet të lartë karshi kushteve të aciditetit, duke vërtetuar kështu se aftësia toleruese është atribut edhe i vetë shtamit dhe jo vetëm i origjinës së izolimit. Sipas (Collado & Sanz, 2006a), B. bifidum janë tipi i species bifidobakteriale nga infantë që kanë paraqitur ndjeshmëri më të lartë karshi kushteve acide (pH 2.0), në studimin tonë B. bifidum B1958 paraqet një rezistencë relativisht të mirë karshi ekspozimit 24 orë në pH 3.5. Pra siç është vërtetuar edhe nga studime të mëparshme, duket qartë që toleranca karshi një faktori stresi (pH-it acid) është në varësi të origjinës nga izolohet shtami, species por, varet edhe nga shtami.

Ekspozimi në pH 3.5 (4 ditë). Kjo metodë ekspozimi u përzgjodh me synim krijimin e fenotipeve acido-rezistente nga 10 shtamet e bifidobaktereve për tu testuar më pas në lëngun e boronicës. U vendos që të izoloheshin nga 5 koloni nga sejcili shtam të cilat rezistuan 24 orë në TPY pH 3.5 për tju nënshtruar adoptimit të vazhdueshëm në TPY pH 3.5 për 4 ditë, duke e rinfreskuar terrenin çdo 24 orë dhe duke e kaluar të gjithë biomasën në terrenin e ri, 37°C në anaerobiozë. Përzgjedhja e 5 kolonive për sejcilin shtam rezistuar në pH 3.5 u krye që të rritje sa më shumë probabiliteti i izolimit të shtamit me veti rezistuese të mira. Rinfreskimi i terrenit TPY pH 3.5 çdo 24 orë synoi të krijonte kushte të favorshme zhvillimi në mënyrë që faktori i vetëm i stresit të ishte pH-i i ulët i terrenit.

Kjo metodë u mbështet në studime të kryera nga (Collado & Sanz, 2006b), ku aplikimi i teknikave të adoptimi ku qelizat bifidobakteriale ekspozohen për një kohë të gjatë ndaj pH-it të ulët ka rezultuar të jetë një strategji efektive për të gjeneruar shtame derivate me një fenotip acido-rezistent të qëndrueshëm të specieve të Bifidobacterium.spp. Për të kryer ekspozimin e zgjatur u aplikuan dy metoda paralele, për të kuptuar se cila mund të ishte më efikase. Metoda e parë, në të cilën kalohej për rinfreskim në terrenin e ri e gjithë biomasa rezultoi efikase. Pas mbarimit të 4 ditëve adoptimi, shtamet u rinferskuan 4 herë çdo 24 orë në TPY të lëngët pH 7.0, dhe u ruajtën në kriovial me skimed milk në kriostat -80°C për tu përdorur për fazën e studimit të rradhës. Me metodën e dytë u vërejt që sasia e biomasës së pipetuar ishte e pamjaftueshme për të vazhduar proçedurën (sepse u vërejt kthjelltësi, mungesë e pranisë së qelizave, që pas ditës së 2-të të ekspozimit në këto kushte).

3.7 Konkluzione - Nga kjo fazë studimi u konkludua se shtamet e përzgjedhura të deklaruara rezistente ndaj pH-it 4.0 në (4°C), rezultuan gjithashtu rezistente në TPY pH 3.5 (37°C). - U krijua gama e shtameve shumë rezistente dhe mesatarisht rezistente në pH 3.5, nga specie të ndryshme të Bifidobacterium, si B.bifidum, B.breve, B.infantis, B.longum dhe B.pseudocatenualtum për tju nënshtruar proçedurës së ekspozimit të zgjatur në stres acid. - U izoluan probabilisht fenotipe acido-rezistente në pH 3.5, nëpërmjet ekspozimit të zgjatur në këto kushte për 4 ditë.

42

KAPITULLI 4. Impakti i lëngut të boronicës si një mjedis matriks mbartës në vitalitetin e specieve të probiotikëve të izoluar, potencialisht acido-tolerantë.

4.1 Përmbledhje Qëllimi i kësaj faze studimi ishte testimi i rezistencës të fenotipeve probabël

rezistente (përftuar nga faza e parë Kapitulli 3), drejt për drejtë në lëngun e boronicës komercial (me bazë fruti 25% dhe pH 2.9) në dy përqëndrime fillestare inokuli, 107 dhe 105 CFU/mL lëng. Nisur nga rezultatet e testimit të rezistencës 24 orë në TPY lëng pH 3.5, për këtë fazë të dytë studimi u përzgjodhën shtamet të cilat reaguan më mirë, konkretisht B. bifidum B1958, B. breve B609, B.longum B2402. Për këto shtame u përcaktua fillimisht aftësia e zhvillimit të tyre në kushte normale për të realizuar saktësisht inokulin me përqëndrimin fillestar të dëshiruar. Më pas shtamet u inokuluan në dy përqëndrimet e sipërpermendura në 400 mL lëng boronice në kontenitorë qelqi sterilë me tapë. Inkubim në termostat në kushte aerobike, 37°C/24 orë.

Për 62 orë në vazhdim pas ditës së parë të inokulimit të kulturave në lëng, u krye vlerësimi i vitalitetit të tyre çdo 24 orë. Pas 48 orë në lëng nga pjatat e petrit u izoluan koloni të shtameve dhe për to u përsërit e njëjta proçedurë e provës së rezistencës në lëng po në të njëjtat kushte dhe u testua vitaliteti i tyre për 48 orët në vazhdim. Nga rezultatet mbi mbijetesën e shtameve u konkludua se:

- Shtamet që vinin nga faza e adoptimit (4 ditë në TPY pH 3.5) si fenotipe probabël rezistente, pësuan një rënie të vitalitetit pas 24 orëve që varjonte në intervalet nga 32-64%, pas 48 orëve nga 35-100% dhe pas 62 orësh shtamet ishin të githë në nivelin 0 CFU/mL.

- Ndërsa në rastin e mbijetesës së kulturave të marra nga izolimi i kolonive të shtameve të rezistuara 48 orë në lëng, rënia e vitalitetit pas 24 orësh varjonte në intervalet nga 42-77% dhe pas 48 orësh shtamet ishin të githë në nivelin 0 CFU/mL.

4.2 Hyrje Ka evidenca që matrica ushqimore në të cilën inokulohet mikroorganizmi

probiotik luan një rol shumë të rëndësishëm në efektin pozitiv të kulturës probiotike ndaj konsumatorit. Aktualisht kërkimet janë fokusuar paralelisht si në karakterizimin e shtameve specifike probiotike ashtu edhe në mënyrën sesi matricat ushqimore dhe përbërja e tyre dietike ndërvepron me shtamin probiotik më efiçent (Isolauri, 2007). Është sygjeruar se lëngu i frutave është një mjedis ideal për mbartjen e përbërësave fusnksionalë të ushqimeve si psh probiotikët.

Njëra nga arsyet është se koha e qëndrimit në stomak të lëngjeve të frutave është e shkurtër, kështu që bakteret nuk janë të ekspozuara për kohë të gjatë ndaj kushteve acide të pafavorshme të stomakut. Këto produkte janë të përshtatshëm për ato konsumatorë të cilët nuk mund të konsumojnë produkte me bazë bulmeti ose thjeshtë për ato konsumatorë që parapëlqejnë freskinë e lëngjeve të frutave. Konsumimi i rekomanduar për mikroorganizmat probiotikë të gjalla është 107

43

CFU/mL (Vinderola & Reinheimer, 2000; Pereira et al., 2011) dhe ai minimal është 106 CFU për gramë ose mililitër të produktit probiotik (Agrawal, 2005; Tamime et al., 1995).

Pra rrjedhimisht është e rëndësishme që vitaliteti dhe aktiviteti i probiotikëve të qëndrojë optimal përgjatë jetëgjatësisë së parashikuar dhe të deklaruar të produkteve (Mattila-Sandholm et al., 2002). Për më shumë, lloji i lëngut të frutave, përfshin parametra si pH-in dhe praninë e përbërsave të veçantë (si psh acid benzoik, laktone) gjithashtu edhe faktorë të jashtëm si, temperatura e ruajtjes, kohëzgjatja e ruajtjes, materialet paketuese si edhe sasia e oksigjenit të tretur, të gjithë këto janë konsideruar si faktorë vendimtarë në përcaktimin e mbijetesës së probiotikëve në lëngun e frutave (Champagne & Gardner, 2008; Champagne et al., 2008; Sheehan et al., 2007).

Hapat kryesorë në prodhimin e lëngut të frutave probiotikë janë: pasterizimi i lëngut të frutave, ftohja në < 6°C dhe shtimi i kulturës probiotike (1010 - 1011 CFU/litër pije). Më pas lëngu paketohet në kontenitorë të përshtatshëm dhe ruhet në temperaturë ftohëse. Numri minimal i qelizave vitale të baktereve probiotike sipas standarteve përkatëse përcakton jetgjatësinë e produktit (Post, 2002).

Janë kryer disa studime në lidhje me sjelljen e kulturave probiotike të shtuara në lëngjet e frutave pa fermentim. Kryesisht këto studime janë fokusuar në sjelljen e Lactobacillus.spp karshi kushteve të matricës, lëng fruti, e më pak janë përqëndruar në shtamet e Bifidobacterium.spp. Disa nga studimet e kohëve të fundit mbi mbijetesën e shtameve të Bifidobacterium.spp në lëngjet e ndryshme të frutave janë listuar më poshtë:

Në një studim të Sheehan et al., (2007), u raportua vitalitet më i lartë i 5 shtameve të Lactobacillus dhe një Bifidobacterium në lëngun e portokallit (pH 3.65) dhe lëngun e ananasit (pH 3.40) sesa në lëngun e boronicës së kuqe (pH 2.50). Humbja e vitalitetit të probiotikëve ndodhi më ngadalë në lëngun e boronicës së kuqe me pH më të lartë të rregulluar (pH 4.50 dhe 5.50) sesa në vlera më të ulta pH-i (pH 2.50 dhe 3.50). Për më tepër, shtame të ndryshme probiotike kanë paraqitur nivele të ndryshme mbijetese në të njëjtin lëng frutash përgjatë kohës së ruajtjes.

Në një studim të Nicolescu & Buruleanu, (2010) rezultoi se lëngu i frutave i përbërë nga përzierje karrote, selino dhe mollë është një matricë e mirë për rritjen e Lb. acidophilus. Lëngu i karrotës rezultoi se ishte një bazë e mirë për mbijetesën e shtameve të B.lactis dhe B. bifidum, por për shkak të parnisë së këtyre mikroorganizmave, u shfaq një rënie prej 45% në përmbajtjen e karotenoideve (Kun, Rezessy-Szabo, Nguyen, & Hoschke, 2008).

Edhe pse në disa studime është shqyrtuar ndikimi i tanineve të shegës mbi vitalitetin e baktereve probiotike të pranishme në mikroflorën intestinale, është vëzhguar se Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp nuk u ndikuan nga ellagitaninet. Për më shumë shtimi i një nënprodukti përbërës të lëngut të shegës stimuloi në mënyrë të ndjeshme rritjen e B.breve d h e B.infantis (Bialonska, Kasimsetty, Schrader, & Ferreira, 2009).

44


4.3.1 Ringjallje e fenotipeve acido rezistente te ruajtura në -80°C Nga shtamet e marrë në studim u përjashtuan për tu përfshirë në këtë fazë shtamet që

paraqitën rezistencë të ulët dhe mesatare 24 orë në TPY pH 3.5, paraqitur në Grafikun 3.1, si B2426, B1652, B1602, B1522, B7231,B7396 dhe B2334.

Studimi në këtë fazë u krye mbi shtamet që paraqitën rezistencë më të lartë: U morën nga kriovial shtamet B1958, B609, B2402 fenotipet probabël acido-rezistente dhe u kaluan sejcili për zhvillim në një tub me TPY pH 7.0. Inkubim në termostat 37°C/24 orë në anaerobiozë. Pas çdo 24 orë inkubim u krye rinfreskimi i kulturave, në TPY lëng të ri pH 7.0 dhe u përcaktua vitaliteti pas çdo rinfreskimi për të përcaktuar aftësinë shumëzuese të shtameve. Inkubim në termostat 37°C/24 orë.

• Përgatitja e suspensioneve për inokul në lëng me përqëndrim qelizor 105 dhe 107 CFU/mL

Në bazë të aftësisë shumëzuese të sejcilit shtam u përgatitën suspensionet për inokul me përqëndrim qelizor 105 dhe 107 CFU/mL lëng për inokulat që do të kaloheshin në 400 mL lëng boronice.

Duke nisur nga tubat me suspension në TPY lëng pH 7.0 duhej të krihojeshin suspensionet në solucion fiziologjik me përqëndrim të duhur të qelizave 109 dhe 107

CFU/mL për të tre shtamet në mënyrë që në lëng (400 mL) të kishim mbas inokulimit përqëndrimin qelizor 107 dhe 105 CFU/mL lëng.

Nga 1.1mL suspension i krijuar, 1mL u inokulua në lëng, ndërsa 100µl u përdorën për përgatitjen e hollimeve në mënyrë që të bëhej përcaktimi me anë të kultivimit në pjatë Petri me derdhje ne TPY pH 7.0 i numrit të saktë të qelizave të inokuluara në 400 mL lëng për të gjithë shtamet për të gjithë përqëndrimet e inokulave.

4.3.2 Studimi i rezistencës së fenotipeve probabël “acido-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng boronice

• Inokulimi i suspensionit bakterial në lëngun e frutave:

U përdor lëng Boronice komercial, në amballazh Tetra pak, volum 1L, përqëndrim të bazës natyrale të frutit 25 % dhe pH 2.9. U kalua 400 mL lëng në kontenierë qelqi sterilë me tapë. Nga çdo kulturë përgatitur sipas përshkrimit mësipër u bë inokulimi i kulturave në lëng duke kodifikuar kontenierët në këtë mënyrë:

a) B609, 105 qel/mL, b) B609, 107 qel/mL

a) B2402, 105 qel/mL, b) B2402, 107 qel/mL

a) B1958, 105 qel/mL, b) B 1958, 107 qel/mL

Pas inokulimit të kulturës në lëng u bë përzierja e mirë e lëngut me suspensionin. Nga suspensioni lëng boronice+kulturë u përgatitën përsëri hollime në solucion fiziologjik 0.9% deri në rendin 10-9, për të përcaktuar rënien probabël të numrit të

45

qelizave të kulturave menjëherë pas inokulimit në lëng. Më pas në pjatë u kalua për sejcilin hollim 3x10µl me pikim mbi sipërfaqen e ngurtësuar të terrenit TPY agar pH 7.0. Kontenierët me 400mL lëng dhe inokulin e kulturave u inkubuan në termostat në kushte aerobike, 37°C/24 orë. Pjatat e Petrit për përcaktimin e inokulit para dhe pas proçedurës së kalimit të kulturës në lëng u inkubuan në kontenierë anaerobioze 37°C/24 orë.

• Vlerësimi i vitalitetit të fenotipeve probabël acido-rezistente të inokuluara në lëng çdo 24 orë

Për 62 orë në vazhdim pas ditës së parë të inokulimit të kulturave në lëng, u krye vlerësimi i vitalitetit të tyre duke, nxjerrë kontenierët me lëng+kulturë nga termostati, përzierje e vrullshme, pipetim i 1mL suspension, aplikim i metodës së hollimeve limite, kultivim i 300µL nga çdo hollim në pjatë Petri me derdhje në terren TPY pH 7.0, inkubim i pjatave të Petrit në termostat në anaerobiozë 37°C/24 orë, rikthim i kontenierëve me lëng e kulturë në inkubim në termostat në kushte aerobike, 37°C/24 orë.

Gjithashtu u përcaktua edhe Rënia e Vitalitetit (RV %) në kushtet përkatëse e përllogaritur me ekuacionin (4.1) (Bevilacqua et al., 2012).

RV= (1 − 𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙 𝑇𝑇𝑛𝑛𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑇𝑇0)𝑥𝑥100� (4.1)

Ku: Tn është logaritmi i numrit të qelizave në kohën T=n

T0 është logaritmi i numrit të qelizave në kohën T=0

Ky parametër i shprehur në përqindje jep shkallën e zvogëlimit të numrit të qelizave në lëngun e boronicës, pas 24, 48, etj.... orë inkubim.

4.3.3. Studimi i rezistencës së fenotipeve probabël “lëng-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng

• Inokulimi i suspensionit bakterial në lëngun e frutave:

U aplikua prova e rezistencës në 400mL lëng e shtameve B609, B2402 dhe B1958. Në këtë provë për secilin shtam, u morrën qeliza nga kolonitë e rezistuara pas 48 orësh në lëng boronice, të izoluara nga pjatat e Petrit me TPY agar. U përdor i njëjti lëng si në provën e parë, lëng Boronice komercial, në amballazh Tetra pak, volum 1L, përqëndrim të bazës natyrale të frutit 25 % dhe pH 2.9. U kalua 400 mL lëng në kontenierë qelqi sterilë me tapë.

U krye e njëjta proçedurë si në provën e parë, vetëm se në këtë rast u përgatit solucion nga kulturat vetëm në përqëndrimin më të lartë qelizor, konkretisht:

b) B609, 107 qel/mL, b) B2402, 107 qel/mL, b) B1958, 107 qel/mL,

• Vlerësimi i vitalitetit të fenotipeve probabël lëng-rezistente të inokuluara në lëng çdo 24 orë

Për 48 orë në vazhdim pas ditës së parë të inokulimit të kulturave në lëng, u krye vlerësimi i vitalitetit të tyre duke nxjerrë kontenitorët me lëng e kulturë nga termostati, përzierje e vrullshme, pipetim i 1mL suspension, aplikim i metodës së

46

hollimeve limite, kultivim i 300µL nga çdo hollim në pjatë Petri me derdhje në terren TPY pH 7.0, inkubim i pjatave të Petrit në termostat në anaerobiozë 37°C/24 orë, rikthim i kontenierëve me lëng e kulturë në inkubim në termostat në kushte aerobike, 37°C/24 orë.

4.4 Rezultate

4.4.1 Rezistenca e fenotipeve probabël “acido-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng

Si u përmend edhe tek materiale dhe metoda për të tre shtamet B. bifidum B1958, B. breve B609, B.longum B2402 me përqëndrime fillestare inokuli 107 dhe 105 CFU/mL lëng, u krye vlerësimi i mbijetesës në 400 mL lëng boronice, 37°C, aerobiozë.

Grafiku 4.1 Mbijetesa e fenotipeve probabël acido-rezistente në lëng boronice 24, 48 dhe 62 orë/37°C

[*a) 105 qel/mL, b) 107 qel/mL,]

Nga rezultate e paraqitura në Grafikun 4.1 për inokulin me përqëndrim qelizor 105CFU/mL lëng pas 24 orë inkubim, vërehet rënie e numrit të qelizave për B.bifidum B1958 me 2.3 shkallë log, B.breve B609 me 3.1 shkallë log dhe B.longum B2402 me 1.9 shkallë log; pas 48 orëve inkubim rënia krahasuar me përqëndrimin fillestar të qelizave të inokuluara, për B.bifidum B1958 është 5.5 shkallë log dhe pëqëndrimi qelizor është 0 CFU/mL, B.breve B609 është 3.5 shkallë log dhe B.longum B2402 është 2.9 shkallë log dhe pëqëndrimi qelizor është 0 CFU/mL. Pas 62 orësh të gjithë shtamet kanë paraqitur përqëndrim qelizor 0 CFU/mL lëng. Nga rezultate për inokulin me përqëndrim qelizor 107CFU/mL lëng pas 24 orë inkubim, vërehet rënije e numrit të qelizave për B.bifidum B1958 me 2.8 shkallë log, B.breve B609 me 2.2 shkallë log dhe B.longum B2402 me 2.3 shkallë log, pas 48 orëve inkubim rënia krahasur me përqëndrimin fillestar të qelizave të inokuluara është për B.bifidum B1958 me 4 shkallë log, B.breve B609 me 2.4 shkallë log dhe B.longum B2402 me 4.9 shkallë log. Pas 62 orësh të gjithë shtamet kanë paraqitur përqëndrim qelizor 0 CFU/mL lëng.

Në Grafikun 4.2, është paraqitur përkatësisht Rënija e Vitalitetit (RV), për çdo shtam, pas 24, 48 dhe 62 orësh në lëng. Futja e këtij parametri mundëson një krahasim më konkret dhe të saktë mbi mënyrën se si shtamet kanë reaguar në këto kushte.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

B1958 (a) B1958 (b) B609 (a) B609 (b) B2402 (a) B2402 (b)

log

cfu/

ml

T0

T24

T48

T62

47

Grafiku 4.2 Rënija e Vitalitetit (RV%), e fenotipeve probabël acido-rezistente në lëng boronice 24,48

dhe 62 orë/37°C [*a) 105 qel/mL, b) 107 qel/mL,]

Me anë të Grafikut 4.2, është e mundur të bëhet krahasimi midis nivelit të mbijetesës së shtameve. Konkretisht në funksion të përqëndrimit të inokulit fillestar më poshtë janë listuar shkalla e rezistencës së shtameve.

Ajo që dallohet qartë nga rezultatet e paraqitura është që fenotipet paraqesin një nivel tolerance relativisht të ulët karshi matricës lëng boronice, ku pavarësisht përqëndrimit qelizor të inokulit të tyre fillestar, ato pas 62 orësh në lëng boronice në 37°C janë totalisht të vdekur.

Në grafikun 4.3 është paraqitur mesatarizimi i Rënies së Vitalitetit të shtameve në % pavarësisht përqëndrimit fillestar të inokulit të tyre, për kohën e studimit në lëng dhe rezulton se renditja e rezistencës është si më poshtë:

Grafiku 4.3 Rënija e vitalitetit mesatar në (%)(RVmes) për tre shtamet për të dyja përqëndrimet fillestare të inokuli a)105dhe b)107, pergjatë 62 orëve të studimit.

Në total B.longum B2402 ka humbur 76.2% të vitalitetit të tij, B.bifidum B1958 ka humbur 72.1% të vitalitetit të tij dhe shtami më rezisten në këto kushte, B.breve B609 ka humbur 66.8% të vitalitetit të tij. Rradha e rezistencës B.breve > B.bifidum> B.longum. Ajo që dallohet është se shkalla e rezistencës në lëng, ruhet po njësoj si tek shtamet origjinale (Kapitulli 3) nga të cilët janë përftuar këto fenotipe probabël acido-rezistent.

37 40

64

3238

48

100

56

71

35

100

71

100 100 100 100 100 100

0

20

40

60

80

100

B1958 (a) B1958 (b) B609 (a) B609 (b) B2402 (a) B2402 (b)

RV (%

)RV 24

RV 48

RV 62

62

64

66

68

70

72

74

76

78

B2402 B1958 B609

RV m

es (%

)

RVmes

48

4.4.2 Rezistenca e fenotipeve probabël “lëng-rezistente” drejt për drejtë në 400mL lëng

Nga prova e rezistencës së kulturave të izoluara nga kolonitë e shtameve B. bifidum B1958, B. breve B609, B.longum B2402, pas 48 orë në lëng me një përqëndrim fillestare inokuli 107 CFU/mL lëng, u krye vlerësimi i mbijetesës në 400 mL lëng boronice, 37°C, aerobiozë.

(I) (II)

Grafiku 4.4. (I)Mbijetesa e fenotipeve probabël lëng-rezistente në lëng boronice 24 dhe 48 orë/37°C, (II) Rënija e Vitalitetit (RV%), e fenotipeve probabël lëng-rezistente në lëng boronice 24 dhe 48

orë/37°C [*b) 107 qel/mL,]

Nga rezultate e paraqitura në Grafikun 4.4 (I), për inokulin me përqëndrim qelizor 107CFU/mL lëng pas 24 orë inkubim, vërehet rënije e numrit të qelizave për B.bifidum B1958 me 2.85 shkallë log, B.breve B609 me 3.2 shkallë log dhe B.longum B2402 me 4.82 shkallë log, pas 48 orësh të gjithë shtamet kanë paraqitur përqëndrim qelizor 0 CFU/mL, rënia krahasur me përqëndrimin fillestar të qelizave të inokuluara është për B.bifidum B1958 me 6.85 shkallë log, B.breve B609 me 6.9 shkallë log, dhe B.longum B2402 me 6.3 shkallë log.

Grafiku 4.5 Krahasimi i Rënijes së Vitalitetit RV(1) e fenotipeve probabël acido-rezistente në lëng

boronice 24,48 dhe 62 orë/37°C me Rënijen e Vitalitetit RV(2) e fenotipeve probabël lëng-rezistente në lëng boronice 24,48 dhe 62 orë/37°C.

Në Grafikun 4.4 (II) paraqitet RV(%) në këto kushte. Pas 24 orë inkubim, vërehet për B.bifidum B1958 RV 42%, B.breve B609 RV 46% dhe B.longum B2402 RV 77%,

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

B1958 (b) B609 (b) B2402 (b)

log

cfu/

ml

T0

T24

T48

42 46

77

100 100 100

0

20

40

60

80

100

B1958 (b) B609 (b) B2402 (b)RV

(%)

RV24

RV48

0

20

40

60

80

100

B1958 B609 B2402

RV (%

)

RV 24 (1)

RV24 (2)

RV 48 (1)

RV48 (2)

RV 62 (1)

RV 62 (2)

49

pas 48 orësh të gjithë shtamet kanë paraqitur përqëndrim qelizor 0 CFU/mL pra RV 100.

Nga Grafiku 4.5 vërtetohet përsëri renditja e shkallës së rezistencës së shtameve, por ajo që vihet re është se fenotipet probabël lëng rezistete të izoluara pas 48 orë në lëng kanë paraqitur një nivel mbijetese më të ulët se sa fenotipet acido-rezistente.

4.5 Diskutime Synimi i kësaj faze studimi ishte testimi i rezistencës të fenotipeve probabël

rezistente (përftuar nga faza e parë Kapitulli 3), drejt për drejtë në lëngun e boronicës (me bazë fruti 25% dhe pH 2.9) në dy përqëndrime fillestare inokuli, 107 dhe 105 qel/mL lëng. Nisur nga rezultatet e testimit të rezistencës 24 orë në TPY lëng pH 3.5, për këtë fazë të dytë studimi u përzgjodhën shtamet të cilat reaguan më mirë në fazën e parë (Kapitulli 3), konkretisht B. bifidum B1958, B. breve B609, B.longum B2402.

Nisur nga fakti se shtame të ndryshme kanë aftësi të ndryshme për tu zhvilluar në kushte normale, për këto shtame u përcaktua fillimisht aftësia e zhvillimit të tyre në kushte normale për të realizuar saktësisht inokulin me përqëndrimin fillestar të dëshiruar. Kultivimi i shtameve në dy përqëndrime të ndryshme inokuli synonte të gjente ndonjë ndërlidhje të mundshme midis përqëndrimit fillestar të inokulit dhe shkallës së rezistencës në lëng. Inokulimi i tyre në 400 mL lëng boronice në kontenitorë qelqi sterilë me tapë dhe inkubim në termostat në kushte aerobike, u përzgjodh në mënyrë të tillë që të imitoheshin kushtet e produktit tregëtar të ardhshëm. Përzgjedhja e temperaturës 37°C për inkubim synonte aplikimin e konceptit të jetgjatësisë së përshpejtuar.

Studimi i rezistencës në lëng u krye për dy kategori të fenotipeve:

1) Shtame probabël acido-rezistente të marra nga faza e parë e studimit (Kapitulli 3) inokuluar në lëng në dy përqëndrime qelizore 105dhe 107 CFU/mL lëng;

2) Shtame probabël lëng rezistente të marra nga izolimi i kolonive të shtameve (1) të rezistuara 48 orë në lëng nga prova e parë, të inokuluara në një përqëndrim qelizor 107 CFU/mL lëng.

U konceptua kështu për të mundësuar krahasimin e metodave të aplikuara dhe efiçencës së tyre në lidhje me rezistencën e fenotipeve të përftuara në lëng.

Nga kategoria (1) e fenotipeve u dallua gjithsesi një mbijetesë relativisht e ulët në kushtet e lëngut të boronicës, probabilisht sepse metodika e aplikuar në Kapitullin 3, synoi të përftonte fenotipe acido-rezistente, ku pH-i i terrenit ushqyes TPY u rregullua me shtim të HCl (acid inorganik), ndërsa në lëngun e frutave ku u krye studimi i rezistencës ka prani të acideve organike, kryesisht acid citrik. Nga studime të ndryshme si psh Saarela et al, 2010, të cilët studjuan përmirësimin e stabilitetit gjatë ruajtjes të Bifidobacterium breve në lëngjet e frutave me pH të ulët, u konkludua se proçeset e seleksionimit të përshpejtuara psh. inkubim për kohë të shkurtër në HCl pH 2.5, në vënd të një inkubimi në kohë të gjatë në lëng frutash, ishte një proçes i papërshtatshëm për seleksionimin e fenotipeve të shtameve që do të ishin të qëndrueshëm në produkte ushqimore me pH të ulët të cilët përmbajnë acide organike.

50

Dihet që acidet organike si psh acidi malik, acidi citrik, etj…të cilët janë të zakonshëm në lëngjet e frutave janë më inhibues karshi qelizave bakteriale sesa acidet inorganike (HCl) për të njëjtën vlerë pH-i (Saarela et al., 2009).

Nga kategoria (2) e fenotipeve u dallua një nivel mbijetese akome edhe më i ulët në lëng, meqënëse mbërritën nivelin 0 CFU/mL pas 48 orësh. Ky rezultat mund të shpjegohet nga fakti se shtamet origjinë nga të cilët u përftuan kategoria (2) e fenotipeve ishin përshtatur në një teknikë adoptimi si u përmend më sipër, për më shumë i ishin nënshtruar edhe një trajtimi tjetër në kushte letale (pra prova 48 orë në lëng boronice me pH 2.9).

4.6 Konkluzione - Renditja e shkallës së rezistencës së shtameve u ruajt e njëjtë gjatë të trija provave të rezistencës (Provës së Kapitullit 3 dhe provave të Kapitullit 4).

- Përqëndrimi fillestar i inokulit në vlera të ndryshme nuk ndikoi në shkallën e rezistencës së shtameve.

- Metoda e parë e aplikuar në Kapitullin 3 prodhoi probabilisht shtame acido-rezistente në kushtet e pranisë së acideve inorganike

- Metoda e dytë vërtetoi faktin se për të përftuar fenotipe të qëndrueshme rezistente në lëng, duhet të aplikohet një metodë adoptimi e vazhduar ndaj komponentëve të lëngut dhe jo vetëm vlerës së ulët të pH-it.

51

KAPITULLI 5 Adoptimi i shtameve të Bifidobacterium.spp në matricën model lëng boronice+terren i lëngshëm TPY, për të përftuar fenotipe rezistente në lëng.

5.1 Përmbledhje

Synimi i kësaj faze studimi ishte përfshirja e një game të gjërë speciesh të Bifidobacterium.spp, në një adoptim gradual të vazhduar në një matricë model përbërë nga TPY dhe lëng boronice, me synim përftimin e fenotipeve rezistente ndaj mjedisit të ofruar nga lëngu i boronicës.

Fillimisht u krye proçedura e provës së rezistencës 24 orë/lëng boronice, në 37°C, aerobiozë, për 30 shtame:

(3) B.bifidum, (3) B.longum.subsp.longum, (1) B. longum.subsp.infantis, (5)B.breve, (5)B.pseudocatenulatum, (4)B.catenulatum, (4)B.adolescentis, (4)B.animalis subsp.lactis, (1)B.thermofilum. Nga kjo provë u synua të përzgjidheshin për të vazhduar adoptimin shtame të cilat do të rezistonin në këto kushte, pra të mos shkonte numri i qelizave në 0 CFU/mL. Shtamet pasi u morën nga kriovial -80°C, u sollën në zhvillim normal pas dy rinfreskimeve në TPY lëng, pH 7.0. Më pas biomasat qelizore të shtameve u kaluan në tuba centrifugalë steril me 6mL lëng boronice. Suspensionet për çdo shtam u kultivuan për të përcaktuar saktë përqëndrimin qelizor të inokulit në kohën T0 në lëng boronice. Pas 24 orë inkubim 37°C/anerobiozë, u kryen hollimet dhe kultivimet përkatëse për të përcaktuar vitalitetin. Shtamet u ndanë në dy kategori, shtame jo rezistente (ato të cilët pas 24 orë në lëng nuk u zhvillua asnje koloni në pjatën me TPY agar dhe shtame rezistente për të cilat numri i kolonive ishte të paktën >1CFU/mL lëng). Nga këto të fundit u krye përcaktimi i vitalitetit të shtameve rezistente si edhe u izoluan kolonitë e zhvilluara në pjatë për sejcilin shtam. U përzgjodhën midis 30 shtameve të marra në fazën fillestare, vetëm 10 prej tyre. U krye kultivimi i tyre në TPY lëng pH 7.0, inkubim për 24 orë, 37°C/anerobiozë, për zhvillim më të mirë, rinfreskim në të njëjtat kushte pas 24 orë inkubim. U përgatitën tubat me përzierjen model të quajtur “MIKS” e përbërë nga lëng boronice + TPY lëng pH 7.0. Për çdo shtam, u përckatua përqëndrimi qelizor në suspension për të përcaktuar saktë inokulin fillestar që do të fillonte adoptimin. Biomasat përkatëse u inokuluan në “Miks 1” i përbërë konkretisht nga [Lëng boronice 0.25 mL, pH 2.9, TPY 8.55mL, pH6.9, (Totali) Miks 8.8mL, pH 6.8] në dy tuba paralelë. Inkubim në 37°C/24 orë, anaerobiozë. U vazhdua proçedura e adoptimit në këtë matricë e cila çdo 24 orë pas inkubimit pësonte një rritje të vazhdueshme të volumit të lëngut në masën 200µl, duke zëvendësuar të njëjtin volum të TPY lëng. Kjo proçedurë u vazhdua derisa i gjithë volumi i TPY lëng pH 7.0 u zëvendësua totalisht nga volumi i lëngut të boronicës. Kjo proçedurë zgjati mesatarisht 44 ditë (1050 orë). Pas çdo kalimi në Miks u përcaktua për çdo shtam, vitaliteti në Miks-in përkatës. Për të mbyllur proçedurën e adoptimit u krye hallka e fundit të saj që ishte kalimi në MIKS 41 i cili përbëhej vetëm nga lëng boronice 8.6 mL. Që nga ky moment u mbyll proçedura e adoptimit në matricën miks. Pas 24 orëve në MIKS-in e fundit u krye rinfreskimi në TPY lëng pH 7.0 me 3 pasazhe, çdo 24 orë, inkubim në 37°C, anaerobiozë. Duke marrë në fund për gjithsejcilin shtam nga 9 tuba me biomasë të shtamit të adoptuar të zhvilluar mirë. Këto tuba u përdorën si më poshtë:

- 1 tub kriovial me skimed milk -80°C (ruajtje në kriostat e fenotipit lëng rezistent).

52

- 6 tuba për provën në lëng në 4°C dhe 37°C ( për kryerjen e testimeve mbi mbijetesën e shtameve lëng rezistente, në lëngun e boronicës në dy temperatura inkubimi, Kapitulli 6).

- 2 tuba për ekstraktim ADN-je (për kryerjen e testimeve për ndryshimet probabël gjenotipike pas periudhës së adoptimit, Kapitulli 7).

5.2 Hyrje

5.2.1 Metoda për të përmirësuar vitalitetin e qelizave Faktorët që ndikojnë në vitalitetin e probiotikëve në matricat ushqimore përgjatë

përpunimit dhe ruajtjes, përfshijnë pH-in, praninë e oksigjenit, temperaturën si edhe praninë e mikroorganizmave konkurues dhe inhibitorëve. Nisur nga fakti se ushqimi probiotik duhet të përmbajë kulturën probiotike vitale në një nivel të përshtatshëm në momentin e konsumimit, përdorimi i disa teknikave për të përmirësuar stabilitetin e shtameve probiotikë në sistemet ushqimore është e një rëndësie shumë të lartë (Champagne et al., 2005; Dave & Shah, 1997; Mattila-Sandholm et al., 2002). Disa nga këto metoda janë: - Adoptimi ndaj stresit, - Mikroinkapsulimi, - Shtimi i prebiotikëve, - Modulimi i kushteve të paketimit, etj... (Champagne et al., 2005; Mattila-Sandholm et al., 2002). Mbijetesa e Bifidobacterium.spp dhe gjithashtu edhe funksionaliteti i tyre si probiotikë, varet nga kapaciteti i tyre i adoptimit dhe rezistencës ndaj kushteve të ashpra.

5.2.1.1 Aplikimi i stresit para-letal Ky stres është përdorur për të induktuar mekanizmat e përgjigjes ndaj stresit (ATR)

për të përmirësuar performancën teknologjike të Bifidobacterium.spp. Përpjekjet kërkimore të kohëve të fundit janë fokusuar për të kuptuar mekanizmat e përgjigjes ndaj stresit të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp në mënyrë që të përmirësojnë kapacitetin e tyre për të mbijetuar dhe funksionuar nën kushte prodhimi industrial dhe pas gëlltitjes.

Park et al., (1995), kanë raportuar se adoptimi ndaj aciditetit (në pH 5.2 për 2 orë) përmirësoi mbijetesën e B. breve në kushte të ndryshmë stresi si (pH 2-5, kripëra biliare 0.2-1.0 % dhe prani të H2O2 100–1000 ppm).

Lorca et al., (1998), kanë treguar se Lb. acidophilus nga log faza i nënshtruar ndaj stresit acid (pH 3.8-6.0) është i aftë të durojë vlera pH-i më të ulta (Lorca et al., 1998).

Lorca & de Valdez (2001), zbuluan se Lb. acidophilus i rritur në një fermentim me pH të pakontrolluar (pH final 4.5) tregoi rezistencë më të lartë ndaj stresit acid si edhe kushteve të tjera të stresit (duke përfshirë praninë e etanolit, peroksidit të hidrogjenit, ngrirjen dhe ngrirje tharjen) krahasuar me qelizat e zhvilluara në kushte pH-i të kontrolluar (pH 6.0).

Maus & Ingham (2003), treguan se B. lactis shfaqi një acido-tolerancë të rritur (në pH 3.5 në lëng gastrit sintetik) pasi pH-i u ul në pH 5.2 në fazën fillestare stacionare dhe qelizat provuan kushte kequshqyerje.

Saarela et al., (2004), treguan se stresi para-letal mundet gjithashtu të shkaktojë ulje të mbijetesës së qelizave, psh, paratrajtimi me acid dhe nxehtësi uli acido-tolerancën e B. longum. Në një studim tjetër të tyre vërejtën qelizat e B.

53

animalis toleruan më shumë kriprat biliare kur u paratrajtuan në 47°C ose në pH 3.5 dhe B. longum paraqiti një efekt të ngjashëm, megjithëse rezistenca e përmirësuar ndaj kripërave biliare nuk ishte shumë e theksuar në këtë shtam, duke treguar kështu se aftësia optimizuese është shtam-specifike.

Saarela et al., (2004), egzaminuan përmirësimin e vitalitetit të shtameve të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp të trajtuar në kushte stresi para-letal me aciditet të lartë dhe nxehtësi (pH 3.0-4.0 dhe temperaturë 47ºC për 30 min – 1 orë) në kushtet e mëtejshme para-letale (pH 2.5, kripëra biliare 1.5 % dhe temperaturë 55ºC për 1-3 orë). Ato zbuluan se adoptimi ndaj stresit rriti vitalitetin e shtameve të Lactobacillus.spp më shumë sesa të shtameve të Bifidobacterium.spp.

Saarela et al., (2010a), studjuan teknika si UV mutagjeneza e vetme apo e kombinuar me një hap seleksionimi specifik, të mund të gjeneronte shtame me acido-rezistencë më të lartë nga shtami B.animalis.subsp.lactis Bb-12, me vitalitet të përmirësuar në matrica ushqimore me pH të ulët. U aplikua UV-mutagjeneza në suspension qeliozor në një pjatë Petri në UV crosslinker (Stratalinker 2400, Stratagene, CA, USA) në 0-700 µJ cm2 -1. Pas trajtimit me UV- qelizat u kaluan në terren të lëngët GEM (vol. 200 µl, pH 3.5, 3.7, 3.9, 4.1, 4.3, 4.5 or 6.3) në një pjatë mikrotitri dhe u inkubuan në kushte anaerobike në 37°C për 3 ditë dhe rrjedhimisht në temperaturë ambjenti për 3 javë. Izolatet e përzgjedhura (ato të zhvilluar më mirë në terrenin me vlera pH-i më të ulta) u kultivuan në RCMA dhe u riinokuluan në terren të lëngët GEM si më sipër. Mbijetesa e UV-mutantëve dhe i Bb-12-ës (kontrollit) u testua në lëng molle pH 3.5, lëng molle pH 3.8 (për 6 javë) dhe HCl pH 2.5 (për 2 orë). Për mutantët me aftësi të përmirësuara, reduktimi i përqëndrimit qelizor pas 6 javësh qëndroi nën 1 shkallë logaritmike, ndërsa për Bb-12 (kontrolli ose origjinali) rënija varjoi midis -2.0 dhe -4.3 shkallë logaritmike në lëng molle pH 3.5 në 4°C. Në lëng molle me pH 3.8, 14 muantë patën stabilitet më të lartë (për 6 javë) sesa Bb-12 (reduktim i pëqëndrimit qelizor nën 2 shkallë logaritmike, ndërsa për Bb-12 ishte 2.7 ± 0.6). Përgjatë testimeve u izoluan përafërsisht 20 mutantë B. animalis subsp. lactis që patën stabilitet më të mirë në lëngun e mollës me pH 3.5 sesa shtami origjinal. Kur mutantët u testuan për tolerancën ndaj kriprave biliare, fermentimit të karbohidrateve, ndjeshmërisë ndaj antibiotikëve, dhe fingerprintingut gjenetik, u vërejtën fare pak ose aspak ndryshime.

Saarela et al.,( 2010 b), kanë kryer një studim tjetër mbi përmirësimin e stabilitetit të ruajtjes të B.breve në lëng frutash me pH të ulët. Qëllimi i studimit ishte të investigohej nëse vetëm një hap përzgjedhjeje në bazë të pH-it apo i kombinuar me mutagjenezë UV, mund të përmirësojë vitalitetin e një shtami acido-sensibël si B.breve 99, në matrica ushqimore me pH të ulët si psh lëngjet e frutave. Për gjenerimin e fenotipeve acido-tolerante të B.breve u përdorën tre metoda: 1-) inkubimi i qelizave në një lëng të përzjerë frutash me pH 3.8 (portokall, rrush, frut pasioni), inkubim në temperaturë dhome anaerobiozë për 5 ditë dhe disa javë në 4°C; 2-)rritja dhe inkubimi i vazhduar në terren ushqyes FM1 (pH 4.0, 4.5, 5.0 dhe 6.5) inkubim anaerobiozë, 1-3 ditë në 37°C, vazhdimisht transferim në temperaturë ambjenti 7-14 ditë; 3-) mutagjeneza UV, në UV crosslinker për 0-700 µJ cm2 -1, kalim në miks lëngu frutash ose FM1 (pH 4.0 ose 4.5). Dymbëdhjetë izolatet më premtuese u kaluan në 10 mL lëng miks frutash me pH 3.8 dhe 4.5, në 4°C, në errësisrë 14 ditë. Nga këto mutantë, 3 prej tyre treguan vitalitet më të lartë në kushte pH-i të ulët sesa fenotipet e tjera të shtamit origjinal. U konkludua se UV mutagjeneza për B.breve e kombinuar me inkubim në terren me pH të ulët mund të

54

përmirësojë tolerancën e shtameve ndaj acideve organike dhe stabilitetin në lëng frutash me pH të ulët.

Shah et al., (2010) studjuan influencën e shtimit të vitaminave [B2 0.0072% (w/v), B3 0.0008% (w/v), B6 0.001% (w/v) , C 0.001%] dhe antioksidantëve si ekstrakt nga farat e rrushit 0.00056% (w/v) dhe ekstrakt nga çaji jeshil 0.001% (w/v), mbi vitalitetin e baktereve probiotike si HOWARU Lb. rhamnosus HN001, HOWARU B. lactis HN001 dhe Lb. paracasei Lpc nga Danisco (Madison, Wis., U.S.A), në një model lëngu, për të kuptuar rolin e këtyre përbërësave në mbijetesën e kulturave pobiotike. Konkluduan se shtimi në lëngjet e frutave e përbërësave si ekstrakt çaji jeshil, vitaminë C dhe ekstrakt farash rrushi, të cilët përmbajnë nivele të larta antioksidantësh dhe kanë aftësi largimi-oksigjeni, mund të promovojnë një mjedis më të favorshëm për bakteret probiotike.

5.2.2 pH-i acid si faktor stresi për Bifidobacterium.spp

Në përgjithësi mund të konsiderohet se rezistenca e Bifidobacterium.spp ndaj pH-it acid është e dobët, me përjashtim të B.animalis (Msasco., et al 2007). Përkrah rezistencës së ulët të specieve të tjera të Bifidobacterium.spp ndaj pH-it acid, disa shtame janë gjithashtu të afta të induktojnë ATR (Acid Tolerance Response), përgjigje ndaj tolerancës acide. Për këtë arsye në këtë fazë studimi u morrën në shqyrtim shtame të 8 specieve të ndryshme të Bifidobacterium.spp.

Mjediset acide karakterizohen nga përqëndrim i lartë protonesh. Acidet e padisocijuara mund të difuzojnë pasivisht përmes membranës citoplazmike duke ndjekur një gradient elektrokimik. Në mungesë të mekanizmave korrektues, ato acidifikojnë citoplazmën, që shkakton falimentim të mekanizmit të metabolizmit, duke çuar konkretisht në vdekje të qelizave. Si rrjedhim egzistenca e mekanizmave molekularë që lejojnë ruajtjen e pH-it citoplazmik në vlerat fiziologjike është faktor kyç në mbijetesën e baktereve në mjedis acid (Mayo & Van Sinderen, 2010). Në rastin e Bifidobacterium.spp, ekspozimi ndaj pH-it acid, tregohet se është më dëmtues sesa strese të tjera si psh prania e kriprave biliare (Kheader et al., 2007). Për shkak të metabolizmit të tyre, Bifidobacterium.spp acidifikojnë mjedisin rrethues përmes fermentimit të karbohidrateve me formim acidi acetik dhe laktik. Pra aktiviteti i tyre metabolik përfaqëson një stres acid në fazën e tyre stacionare të rritjes (Saarela., et al 2004). Lidhur me këtë fakt, studime të fundit sygjerojnë se stresi acid mesatar (jo ekstrem) do të induktonte qelizat të hynin në një status vital por jo të kultivueshëm duke ulur vitalitetin e tyre (Lahtinen et al., 2008).

Tek bakteret mekanizmi që induktohet për shkak të ekspozimit ndaj aciditeti, i cili çon në një adoptim ndaj vlerave të mëtejshme të pH-it, njihet me emrin si pergjigjia ndaj tolerancës acide (ATR), (Davis et al., 1996, Samelis et al., 2003). Tek bifidobakteret ashtu si edhe tek baktere të tjera, ky proçes mund të induktohet thjeshtësisht nga futja e shtameve në fazën e tyre stacionare të rritjes, për shkak të prodhimit fermentues të acideve organike (Buchanan & Edelson, 1996). Në fakt kjo mund të jetë edhe një nga arsyet që shpjegon pse qeliza të marra në këtë fazë rritjeje, janë më rezistente ndaj kushteve acide letale (Samelis et al., 2003). Ashtu si është përmendur edhe më parë, mbijetesa e Bifidobacterium.spp në kushte ekstreme acide mund të rritet nëse qelizat paraprakisht ekspozohen ndaj vlerave para-letale të pH-it nëpërmjet induktimit të ATR (Maus & Indgham, 2003). Për më shumë mutantë

55

rezistentë ndaj pH-it acid me një fenotip të qëndrueshëm mund të përftohen pas një ekspozimi të gjatë ndaj kushteve acide ektreme (Collado & Sanz 2006).

Ashtu si është përmendur edhe më parë në këtë studim, Bifidobacterium.spp kryesisht tolerojnë pak kushtet ekstreme acide, me përjashtim të B.animalis.subsp.lactis, ashtu si rezulton dhe nga studimi ynë. Gjithashtu duke marrë në konsideratë aplikimet aktuale të kulturave të Bifidobacterium.spp të përdorura në lëngjet e frutave, i vetmi i përdorur është B.animalis.subsp.lactis, në lëngjet e portokallit dhe në lëngun e pjeshkë+banana. Ndryshe nga specie të tjera, B.animalis.subsp.lactis është i aftë të mbajë në nivel të lartë vitalitetin e tij në këto kushte. Sipas Matsumoto et al., (2004) nisja e aktivitetit të lartë të ATPase në membranë i vëzhguar për këtë specie, mund të jetë përgjegjëse për rezistencën e tij të lartë ndaj aciditetit, aktivitet i cili nuk induktohet tek speciet e tjera jo rezistente.

Përkrah rezistencës së ulët të specieve të tjera të Bifidobacterium.spp ndaj pH-it acid, disa shtame janë gjithashtu të afta të induktojnë ATR. Për shembull B.longum BH1 ishte i aftë të mbante një pH citoplazmik të lartë krahasuar me shtame të tjera jo rezistente në një studim të Takahashi et al., (2007).

Si përfundim përftimi i rezistencës ndaj aciditetit mund të induktojë ndryshime në parametrat e sipërfaqes të bifidobaktereve. Në këtë kuptim, disa shtame acido-rezistente, kanë paraqitur një aftësi më të mirë për të aderuar në GI njerëzor, dhe disa të tjerë kanë paraqitur një aftësi të shtuar për të inhibuar aderencën e disa patogjenëve, apo për të zëvendësuar patogjenë të aderuar (Collado et al., 2006). Duhet pasur kujdes se adoptimi ndaj aciditetit mund të shaktojë ndryshime të thella në ndjeshmërinë ndaj antibiotikëve të shtameve Bifidobacterium.spp (Collado & Sanz, 2007). Në një studim të Kheadr et al., (2007), është treguar se është rritur rezistenca e Bifidobacterium.spp që i mbijetuan ekspozimit ndaj kushteve acide ekstreme, karshi aminoglikozide, kloramfenikolit, eritromicinës dhe tetraciklinës (pH 2.0 për 60 min).

5.2.2.1 Targeti molekular i pH-it acid Acidifikimi citoplazmik mund të jetë letal nëse pH-i bie nën vlerat fiziologjike. Pjesa më

e madhe e enzimave metabolike kanë aktivitet optimal në pH-e lehtësisht acide, kështu që ulja e fortë e pH-it do të ndalojë plotësisht metabolizmin e baktereve. Tek bakteret, ATR është një proçes i komplikuar, duke përfshirë ndryshime në transkriptimin e disa gjeneve dhe në sintezën e një numri të madh proteisnash (Bore et al., 2007, Davis et al., 1996, Len et al., 2004). Për Bifidobacterium.spp, studimet molekulare mbi ATR janë shumë të pakta, por aktualisht dihet se ky proçes është ekstremisht i varur nga shtami dhe nga specia, dhe në përgjithësi nuk është e thjeshtë të induktohet (Saarela et al., 2004).

Dy mekanizmat kryesorë të përfshirë në rezistencën ndaj pH-it, janë ektrusioni (nxjerrja, përjashtimi) aktiv i protoneve dhe alkalinizimi i citoplazmës. Në bakteret anaerobike dihet se sasia e madhe e protoneve të shfaqura në mjedise acide, kundërveprohet nëpërmjet veprimit të F0–F1 ATPase, në një mënyrë të varur nga energjia (Cotter & Hill, 2003, Matsumoto et al., 2004). Kjo enzimë katalizon hidrolizën e ATP-së, e cila aktivizon spostimin e protoneve përmes membranës citoplazmike kundër një gradienti elektrokimik. Pra veprimi i F0–F1 ATPase, mban pH-in citoplazmik në vlera fiziologjike, kur Bifidobacterium.spp hasin kushte ekstreme pH-i acid. Përveç aktivitetit të enzimës F0–F1 ATPase, një mekanizëm i zakonshëm mbi tolerancën ndaj pH-it, i përhapur gjërësisht tek

56

mikroorganizmat është formimi i amonit, duke qënë një komponim bazik ai mund të kapë një proton duke lëshuar një jon amoniumi dhe duke buferifikuar citoplazmën në pH-e të ulta (Cotter dhe Hill, 2003).

Pra ashtu si u theksua, aktiviteti i F0–F1 ATPase është i lidhur drejt për drejtë me ATR tek Bifidobacterium.spp, ashtu si edhe tek anaerobë të tjerë apo aerobë fakultativë (Miwa et al., 1997). Kjo rritje e aktivitetit të kësaj enzime është mbështetur nga studime me të dhëna molekulare, të cilat tregojnë se si kodimi i gjenit për enzimën si edhe sasia e proteinës është balancuar/mbiprodhuar tek B.animalis dhe B.longum (Sanchez et al., 2008). Deri më sot të vetmet të dhëna proteomike, mbi përgjigjen nga adoptimi i B.longum ndaj pH-it acid, janë marrë përmes izolimit të një mutanti acid-rezistent, nga shtami i ndjeshëm ndaj aciditetit B.longum NCIM B8809 (Sanchez et al., 2007a). Krahasimi i profileve të marra nga elektroforeza dy dimensionale, treguan se F0–F1 ATPase u shtua në kushte acide.


5.3.1 Testimi i rezistencës së shtameve Bifidobacterium.spp 24 orë në lëng boronice. Për të bërë një studim krahasues midis kulturave, për të përcaktuar dhe

individualizuar shtamet më rezistente në lëngun e boronicës u aplikua proçedura e “seleksionimit” duke inokuluar shtamet në lëng boronice dhe duke testuar vitalitetin e tyre pas 24 orësh në këtë lëng në 37°C anaerobiozë. U morën 30 shtame origjinale nga kriovial, të listuar në Tabelën 5.1.

Tabela 5.1 Shtamet e marra për testimin e rezistencës 24 orë në lëng boronice

Nr Shtami Specia

Nr Shtami Specia 1 B2339 B. pseudocatenulatum

16 B1958 B. bifidum

2 B1279 B. pseudocatenulatum

17 B2334 B. bifidum


18 VT181 B. bifidum


19 B684 B. catenulatum



6 MB29 B. animalis subsp. lactis


7 RA18 B. animalis subsp. lactis


8 M354 B. animalis subsp. lactis

23 MB21 B. adolescentis

9 P32 B. animalis subsp. lactis

24 B7311 B. adolescentis

10 B2150 B. breve


11 B609 B. breve


12 B912 B. breve

27 B2405 B. longum subsp. longum

13 B632 B. Breve


14 BR03 B. Breve

29 B1522 B. longum subsp. linfantis

15 MB16 B. thermophilum


57

• Ringjallja e kulturave: U krye ringjallja e kulturave të ruajtura në kriostat në -80°C, duke i kaluar në 2 tuba paralelë me 9mL TPY lëng pH 7.0 për çdo kulturë. Inkubim në anaerobiozë 37°C/24 orë. Pas 24 orë inkubim, rinfreskim i kulturave përsëri në TPY lëng pH 7.0, inkubim në anaerobiozë 37°C/24 orë.

• Testimi i rezistencës në 6mL lëng boronice: Pas 24 orë inkubim dhe pas dy pasazheve rinfreskimi një pas një, në TPY lëng, u krye shpëlarja e biomasës me solucion fiziologjik dhe përcaktimi i përqëndrimit qelizor të inokulit fillestar. Më pas, shtimi i 6mL lëng boronice në tubin centrifugal ku ndodhej biomasa. Inkubim në anaerobiozë në 37°C/24 orë.

• Përcaktimi i vitalitetit të shtameve pas 24 orë inkubim: Për të vlerësuar rezistencën e shtameve karshi lëngut të boronicës dhe për të izoluar koloni nga qeliza që kishin rezistuar në lëng pas 24 orëve, u kryen, centrifugimi i lëngut të boronicës me inokul (Figura 5.1), shpëlarja, hollimet dhe kultivimi në TPY agar me derdhje në pjata Petri. Inkubim në anaerobiozë në termostat 37°C/24 orë.

Pas inkubimit u bë numërimi i kolonive të zhvilluara në pjata duke përcaktuar sasinë e qelizave të rezistuara pas 24 orësh në 6mL lëng boronice. Më pas u izoluan nga pjatat koloni të shtameve të rezistuar, kalim i tyre në terren TPY lëng pH 7.0, inkubim në termostat në anaerobiozë 37⁰C/24 orë.

Pas 24 orë inkubim këto kultura u rinfreskuan përsëri në tuba me terren të ri TPY lëng pH 7.0, inkubim në termostat 37⁰C/24 orë.

Figura 5.1 Disa nga shtamet e testuara mbi rezistencën 24 orë në lëngun e boronicës

5.3.2 Parametrat e matricës përzierje Lëng Boronicë +TPY lëng. (Miks)

Përzierja Miks Lëng Boronicë+TPY lëng, u përgatit çdo 24 orë në tuba duke përzjerë komponentët në volumet e paraqitura në Tabelën 5.2 dhe për çdo Miks u përcaktua paralelisht pH-i përkatës (me pH-metër Hana, Singapore). Në Tabelën 5.2 janë paraqitur parametrat e Miks-eve që u përdorën përgjatë aplikimit të adoptimit të ngadaltë.

58

Tabela 5.2 Parametrat e matricës model (Miks) Miks nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 pH 6.33 6.26 5.88 5.63 5.62 5.44 5.2 5.08 5 4.86 Volumi TPY(mL) 8.55 8.3 8.05 7.8 7.55 7.3 7.05 6.95 6.8 6.55 Volumi lëng (mL) 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 1.85 2 2.25

Miks nr 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

pH 4.82 4.84 4.67 4.59 4.47 4.4 4.34 4.34 4.18 4.08 Volumi TPY(mL) 6.4 6.2 5.95 5.8 5.5 5.2 4.9 4.8 4.6 4.4 Volumi lëng (mL) 2.4 2.6 2.85 3 3.3 3.6 3.9 4 4.2 4.4

Miks nr 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

pH 4.07 4.03 3.91 3.87 3.85 3.75 3.65 3.69 3.68 3.51 Volumi TPY(mL) 4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2 3 2.8 2.6 2.4 Volumi lëng (mL) 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4

Miks nr 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

pH 3.46 3.36 3.35 3.31 3.23 3.25 3.19 3.13 2.97 2.92 Volumi TPY(mL) 2.2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 Volumi lëng (mL) 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4

5.3.3 Adoptimi në matricën përzierje Lëng Boronice+TPY lëng (Miks). Në bazë të rezultateve të marra nga prova e rezistencës 24 orë në lëng, shtamet e

përzgjedhura për tju nënshtruar proçedurës së adoptimit në matricën Miks janë paraqitur në Tabelën 5.3

Tabela 5.3 Shtamet e përzgjedhura për adoptimin në matricën model Miks







7 B2150 B. breve

8 B609 B. breve


10 B1958 B. bifidum

• Inokulim i shtameve në Miksin e parë. Kolonitë e rezistuara pas 24 orë në 6mL lëng boronice për çdo shtam, të izoluara nga pjatat e Petrit, u rinfreskuan pas 2 pasazheve në nga dy tuba paralelë TPY lëng për zhvillim të mirë të biomasave: - shpëlarja e tyre me solucion fiziologjik 0.9%. - kalimi i tyre në Miks 1 (me parametra të dhënë në Tabelën 5.2), në dy tuba paralelë. - për të

59

përcaktuar përqëndrimin qelizor të inokulit në Mks 1, u kryen hollimet dhe kultivimet në pjatë Petri me TPY agar, inkubim në termostat në anaerobiozë 37⁰C/24 orë. - tubat me kulturat në Miks 1, inkubim në termostat në anaerobiozë 37⁰C/24 orë.

• Inokulim i shtameve në miksin e dytë. Pas 24 orë në Miks 1, biomasa e shpëlarë u kalua në Miks 2. Për këtë Miks u veprua identik si në Miks 1, ku u kryen hollimet për të përcaktuar vitalitetin e qelizave të shtameve pas 24 orë në Miks 1, dhe biomasat u kaluan në Miksin e rradhës, më pas inkubim në termostat në anaerobiozë 37⁰C/24 orë.

Në të njëjtën formë u proçedua progresivisht për të gjithë matricat Miks me rradhë për një përiudhë kohore prej 1050 orësh deri në kalimin tek Miks-i i fundit i përbërë nga 8.6mL lëng boronice [Figura 5.2 a) dhe b)]. Nga numërimi i drejtpërdrejtë i bërë në pjatat mbi vitalitetin e kulturave në Miks-et përkatëse, rezultati u konvertua në CFU /mL në bazë të volumit të alikuotës së përdorur për kultivim. Për të vërtetuar pastërtinë e kulturave të kaluara dhe hapave të njëpasnjëshëm të proçesit, u përgatitën për seicilin shtam preparate me pikë të shtypur për vëzhgim në mikroskop.

a)

b)

Figura 5.2 a) Kalimi i suspensionit Miks + shtam, gjatë adoptimit në tubat centrifugalë për centrifugim b) aplikimi i centrifugimit për ndarje biomase

5.3.4 Përfundimi i proçedurës së adoptimit për shtamet dhe vitaliteti i tyre në këtë fazë.

Pas çdo kalimi në Miks u përcaktua për çdo shtam, vitaliteti në Miks-in

përkatës. Për të mbyllur proçedurën e adoptimit ku hallka e fundit të saj ishte kalimi në MIKS 41 i cili përbëhej vetëm nga lëng boronice 8.6 mL, u kryen njësoj hollimet dhe që nga ky moment u mbyll proçedura e adoptimit në matricën miks. Pas 24 orëve në Miks-in e fundit u krye rinfreskimi në TPY lëng pH 7.0 me 3 pasazhe, çdo 24 orë, inkubim në 37°C, anaerobiozë (Figura 5.3). Duke marrë në fund për gjithsejcilin shtam nga 9 tuba me biomasë të shtamit të adoptuar të zhvilluar mirë.

60

Këto tuba u përdorën si më poshtë: - 1 tub kriovial me skimed milk -80°C (ruajtje në kriostat e fenotipit lëng rezistent). - 6 tuba për provën në lëng në 4°C dhe 37°C ( për kryerjen e testimeve mbi

mbijetesën e shtameve lëng rezistente, në lëngun e boronicës në dy temperatura inkubimi, Kapitulli 6).

- 2 tuba për ekstraktim ADN-je (për kryerjen e tesimeve për ndryshimet probabël gjenotipike pas periudhës së adoptimit, Kapitulli 7).

Figura 5.3 Krijimi i kushteve anaerobike në kontenitorë me Anaerocult për inkubim në termostat.

5.4 Rezultate dhe Diskutime

5.4.1 Përcaktimi i vitalitetit të shtameve 24 orë në lëngun e boronicës: Të tridhjetë shtamet u inokuluan në 6mL lëng boronice në përqëndrimin qelizor të

paraqitur në Grafikun 5.1, si log T0 dhe pas 24 orë inkubim, numri i qelizave të tyre paraqitet në grafik me log T24. Në Grafikun 5.2 paraqitet për sejcilin shtam rënia e vitalitetit të qelizave (RV në %) në këto kushte përkatëse e përllogaritur me ekuacionin (4.1) paraqitur në Kapitullin 4 (Bevilacqua et al., 2012).

RV= (1 − 𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙 𝑇𝑇24𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑇𝑇0) × 100� (4.1)

Ky parametër i shprehur në përqindje jep shkallën e zvogëlimit të numrit të qelizave në lëngun e boronicës, pas 24 orë inkubim në 37°C në anaerobiozë.

Grafiku 5.1 Rezistenca e shtameve përpara adoptimit 24 orë në lëng boronice

0

2

4

6

8

10

B233

9M

B29

RA18

B215

0B1

279

MB1

6B6

09B1

958

M35

4P3

2B6

84B9

12B6

69B1

333

B233

4B7

396

MB2

1B7

311

B732

9VT

181

B128

6B7

003

B212

0B2

405

B235

6B7

162

B152

2B2

402

B632

BR03

logc

fu/m

l

log T0

log T24

61

Nga grafiku vërehet se shtame të të njëjtave specie në të njëjtat kushte kanë paraqitur rezistencë të ndryshme. Pra aftësia për të mbijetuar varet nga shtami. Rezistencë më të lartë paraqesin shtame të gjinisë B. animalis subsp.lactis P32, MB29, RA18, të cilët pas 24 orë në lëngun e boronicës kanë humbur më pak se 1shkallë log CFU/mL. Në Figurën 5.4 paraqitet mbijetesa e disa prej shtameve, pas inkubimit 24 orë/37°C në lëng boronice.

Si paraqitet edhe në grafik, përqëndrimi qelizor i inokulit për të gjitha shtamet që kanë kaluar provën e rezistencës në lëng ka qënë i përafërt në një interval nga 107CFU/mL në 1010CFU/mL. Pavarësisht përqëndrimit qelizor të inokulit fillestar, qelizat kanë paraqitur rezistencë të ndryshme, pra konkludohet që rezistenca nuk varet nga përqëndrimi i inokulit fillestar por nga aftësia e vetë shtamit për të mbijetuar. Në Figurën 5.5, paraqiten shtamet të cilët humbën totalisht vitalitetin pas 24 orësh në lëngun e boronicës. Kjo provë u përsërit 2 herë për sejcilin shtam dhe u morën rezultate shumë të përafërta në të dyja rastet. Grafiku 5.1 paraqet vlerat mesatare të mbijetesës.

Figura 5.4 Mbijetesa e disa shtameve të ndryshme, 24 orë në lëngun e boronicës

Figura 5.5 Shtame të cilët nuk mbijetuan 24 orë në lëngun e boronicës

62

Grafiku 5.2 Rënia e Vitalitetit në (%) e shtameve përpara adoptimit pas 24 orë në lëng boronice

Në Grafikun 5.2 jepet Rënia e Vitalitetit (%) e shtameve përpara adoptimit, pas 24 orë në lëng boronice. Futja e parametrit të Rënies së Vitalitet RV(%) jep qartazi mënyrën se si ka reaguar çdo shtam në këto kushte. Konkretisht nga 30 shtamet e testuara, 19 shtame humbën totalisht vitalitetin duke rezultuar në RV 100%, pas 24 orësh në lëngun e boronicës, në inkubim 37°C/ anaerobiozë, konkretisht; 3 nga 5 të testuar B. pseudocatenulatum, 3 nga 5 të testuar B. Breve, 1 nga 1 i testuar B. thermophilum, 2 nga 3 të testuar B. bifidum, 2 nga 4 të testuar B. catenulatum, 4 nga 4 të testuar B. adolescentis, 4 nga 4 të testuar B. longum.

Nga 30 shtamet e testuara, 11 shtame mbijetuan duke rezultuar në RV në intervalin nga 5.4 % në 81.5%, pas 24 orësh në lëngun e boronicës, në inkubim 37°C/ anerobiozë, konkretisht; 2 nga 5 të testuar B. pseudocatenulatum, 4 nga 4 të testuar B. animalis subsp. Lactis, 2 nga 5 të testuar B. Breve, 1 nga 3 të testuar B. bifidum, 2 nga 4 të testuar B. catenulatum.

5.4.2 Krahasimi i vitalitetit dhe vdekshmërisë në përqindje në nivel specieje.

Në Grafikun 5.3 paraqitet më qartë përqindja e mbijetesës dhe vdekshmërisë në nivel specieje, në këto kushte. Këto parametra janë përcaktuar për sejcilën specie në funksion të totalit të numrit të shtameve të studjuara.

a) b)

0

20

40

60

80

100

B233

9M

B29

RA18

B215

0B1

279

MB1

6B6

09B1

958

M35

4P3

2B6

84B9

12B6

69B1

333

B233

4B7

396

MB2

1B7

311

B732

9VT

181

B128

6B7

003

B212

0B2

405

B235

6B7

162

B152

2B2

402

B632

BR03

RV (%

)

40%60%

B. pseudocatenulatum

Shtame te mbijetuara

Shtamete vdekura

100%

0%

B. animalis subsp. lactis


Shtamete vdekura

63

c) d)

e) f)

g) h)

Grafiku 5.3 Mbijetesa dhe vdekshmëria e shtameve në (%), në nivel specieje 24 orë në lëng boronice, përpara adoptimit. a)B.pseudocatenulatum, b)B. animalis subsp. lactis, c)B. Breve, d)B. thermophilum,

e)B. bifidum, f)B. catenulatum, g)B. adolescentis, h) B. longum.

Ashtu si tregohet edhe në grafikët e mësipërm, në funksion të numrit total të shtameve të marrë në studim për çdo specie është shprehur përqindja e mbijetesës dhe e vdekshmërisë. Vërehet se nga të 8 speciet e marra në studim, vetëm specia B.animalis.supsb.lactis ka paraqitur përqindje mbijetese në masën 100%, pra rikonfirmohet fakti që shtamet e kësaj specieje kanë aftësi të larta për të mbijetuar në kushte stresi acid. Më pas në vënd të dytë renditet specia B. catenualtum me përqindje mbijetese në masën 50%, më pas vijnë B.pseudocatenulatum, B.breve dhe B.bifidum me përqindje mbijetese përkatësisht, 40%, 40% dhe 33%. Speciet të cilat kanë paraqitur ndjeshmëri shumë të lartë karshi kushteve të aciditetit janë B.adolescentis, B.longum, B.thermofilum me përqindje mbijetese në masën 0%.

40%

60%

B. breve


Shtamete vdekura

0%

100%

B. thermofilum


Shtamete vdekura

33%

67%

B. bifidum


Shtamete vdekura

50%

50%

B. catenulatum


Shtamete vdekura

0%

100%

B. adolescentis


Shtamete vdekura

0%

100%

B. longum subsp. longum


Shtamete vdekura

64

Grafiku 5.4 Mbijetesa në % në nivel specieje, pas 24 orë në lëng boronice për të gjitha speciet e

studjuara

Grafiku 5.5 Vdekshmëria në % në nivel specieje, pas 24 orë në lëng boronice për të gjitha speciet e

studjuara

Nga Grafikët 5.4 dhe 5.5 ku janë paraqitur krahasimisht mbijetesa dhe vdekshmëria në përqindje për çdo specie, mund të bëjmë një renditje në bazë të rezistencës të paraqitur në kushtet e pH 2.9 në funksion të species. Aftësia toleruese ndaj këtyre kushteve rezultoi:

B.animali.supsb.lactis >B. catenualtum >(B.pseudocatenulatum, B.breve) > B.bifidum > (B.adolescentis, B.longum, B.thermofilum).

Ashtu si është përmendur edhe më parë në këtë studim, Bifidobacterium.spp kryesisht tolerojnë pak kushtet ekstreme acide, me përjashtim të B.animalis.subsp.lactis, ashtu si rezulton edhe nga studimi ynë. Gjithashtu duke marrë në konsideratë aplikimet aktuale të kulturave të Bifidobacterium.spp të përdorura në lëngjet e frutave, i vetmi i përdorur është B.animalis.subsp.lactis, në lëngjet e portokallit dhe në lëngun e pjeshkë+banane. Ndryshe nga specie të tjera, B.animalis.subsp.lactis është i aftë të mbajë në nivel të lartë vitalitetin e tij në këto kushte. Sipas Matsumoto et al., (2004), futja e aktivitetit të lartë të enzimës ATPase të membranës i vëzhguar për këtë specie, mund të jetë përgjegjëse për rezistencën e tij të lartë ndaj aciditetit, aktivitet i cili mund të mos induktohet tek speciet e tjera jo rezistente.

B. pseudocatenula

tum (40)

B. animalis subsp. lactis

(100)

B. breve (40)

B. thermofilum (0)

B. bifidum (33)

B. catenulatum (50) B. adolescentis

(0) B. longum subsp. longum

(0)

% e Mbijetesës

B. pseudocatenula

tum (60) B. animalis subsp. lactis

(0)

B. breve (60)

B. thermofilum (100)

B. bifidum (67)B. catenulatum

(50)

B. adolescentis (100)

B. longum subsp. longum

(100)

% e Vdekshmërisë

65

Grafiku 5.6 Mbijetesa dhe vdekshmëria mesatare në përqindje e të gjithë shtameve të testuara 24 orë

në lëng boronice

Në Grafikun 5.6, jepet mbijetesa dhe vdekshmëria mesatare në përqindje e të gjithë shtameve të testuara 24 orë në lëng boronice. Vlera mesatare e vdekshmërisë për të 30 shtamet e testuara është në masën 67%, duke konfirmuar kështu faktin se Bifidobacterium.spp janë kryesisht pak tolerantë ndaj kushteve të pH-it acid. Megjithatë përqindja e mbijetesës nuk është indiferente, duke kapur shifrën 33%. Këto të dhëna japin orientimin që ka një probabilitet të kënaqshëm për të përdorur shtame të Bifidobacterium.spp nga specie të ndryshme si suplement në lëngjet e frutave. Gjithashtu për shtamet e ndjeshme probabilisht egzistojnë aletrnativa për përmirësimin e tolerancës së tyre ndaj aciditetit për të përftuar shtame lëng rezistente, ashtu si do të përshkruhet edhe në studimin tonë në fazën e mëposhtme, në adoptimin e tyre në matricën model Miks.

Ky testim i shtameve 24 orë në lëng, u konsiderua si një etapë e ekspozimit të shtameve në kushte para-letale duke pasur 2 synime: 1- nëpërmjet kësaj prove u bë e mundur të zgjidheshin e të veçoheshin shtamet me tolerancë më të lartë nga shtamet me ndjeshmëri më të lartë ndaj këtyre kushteve; 2- aplikimi i këtij ekspozimi synoi aktivizimin e ATR (përgjigjes ndaj tolerancës acide) për shtamet, në mënyrë që ato të mund të përballonin duke paraqitur rezistencë më të lartë gjatë fazës së mëpasëshme të adoptimit gradual në matricën model lëng boronice + TPY (MIKS).

5.4.3 Vitaliteti i shtameve përgjatë adoptimit në MIKS-e Nga rezultatet e provës së 30 shtameve 24 orë në lëng boronice, u përzgjodhën për

fazën e adoptimit vetëm 10 prej tyre, ku 9 ishin shtame që rezultuan me rezistencë mesatare e të lartë: B.bifidum B1958, B.pseudocatenulatum (B2339, B1279), B.animalis.subsp.lactis, (MB29, RA18, M354, P32), B.breve (B2150, B609), ndërsa njëri shtam u përzgjodh B. thermofilum MB16 i cili e humbi totalisht vitalitetin, duke paraqitur një ndjeshmëri të lartë ndaj këtyre kushteve. Nga 9 shtamet rezistente u përzgjodhën ato që paraqitën RV në % më të ulët. Nuk u futën në studim dy shtame të species B. catenulatum (B669 dhe B1333) edhe pse kjo specie paraqiti përqindje mbijetese më të lartë, sepse rënia e vitalitetit specifikisht për këto shtame ishte (79.7% dhe 81.5%) përkatësisht, dhe ishte më e lartë krahasuar kjo me dy shtamet e species B. pseudocatenulatum (B2339, B1279) që paraqitën një rënie të vitalitetit në masën (21.9% dhe 68.7%) përkatësisht (Grafiku 5.2).

Nëntë shtamet rezistente u përzgjodhën që t’i nënshtroheshin proçedurës së adoptimit të zgjatur për të përftuar fenotipe të qëndrueshme lëng rezistente, ndërsa shtami me ndjeshmëri të lartë u përzgjodh për të krahasuar mënyrën se si do të reagonin ndaj kësaj proçedure, shtame rezistente dhe shtami i ndjeshëm, duke synuar

% e vdekshmërisë

67%

% e mbijetesës33%

Mbijetesa dhe Vdekshmëria mesatare

66

përftimin prej tij të fenotipit me rezistencë më të lartë në lëngun e boronicës. Në Figurën 5.6 janë parqitur mbijetesa për shtame të ndryshme në momente të ndryshme të adoptimit në Miks.

Figura 5.6 Mbijetesa e disa shtameve gjatë adoptimit në matricën Miks në stade të ndryshme të adoptimit (M mbi pjatë shoqëruar nga një numër tregon numrin e Miksit në të cilin është kryer përcaktimi i vitalitetit të

shtamit)

67

Në Grafikët 5.7, është paraqitur ecuria e vitalitetit për sejcilin shtam gjatë gjithë periudhës së adoptimit.

a) b)

c) d)

e) f)

g) h)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (B1958)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (MB16)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (B2339)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (B1279)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (MB29)0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (RA18)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (M354)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (P32)

68

i) j) Grafiku 5.7 Ecuria e mbijetesës së shtameve gjatë adoptimit në 41 Mikse. Vija e tendencës lineare.

Shmangia nga vija ideale (përqëndrimi qelizor konstant) për shtamet: a)B.bifidum B1958, b)B.thermofilum MB16, c)B.pseudocatenulatum B2339, d)B1279, B.animalis.subsp.lactis,e) MB29,

f)RA18, g)M354, h)P32, B.breve i)B2150, j) B609.

Për sejcilin shtam është ndërtuar një vijë ideale teorike (vija blu) e cila përfaqëson një përqëndrim qelizor konstant i cili i korespondon përafërsisht vlerës së inokulit fillestar. Gjithashtu është ndërtuar dhe një vijë tendence lineare (vija e kuqe) mbi ecurinë e mbijetesës së shtameve gjatë adoptimit. Këto vija janë ndërtuar në mënyrë që të bëhet krahasimi konkret i devijacionit për çdo shtam nga vija ideale, meqënëse synimi i kësaj faze adoptimi ishte mbajtja e përqëndrimit qelizor konstant gjatë të gjithë proçedurës, dhe duke e konsideruar këtë si sfidë për shtamet.

Parametrat krahasues mbi ecurinë e mbijetesës për shtamet, janë paraqitur në Tabelën 5.4, ato janë: - Rritja minimale log CFU/mL (përqëndrimi qelizor minimal i arritur gjatë adoptimit). - Rritja mesatare log CFU/mL (përqëndrimi qelizor mesatar gjatë adoptimit). - Rritja maksimale log CFU/mL (përqëndrimi qelizor maksimale i arritur gjatë adoptimit). - Humbja Totale e Vitalitetit, nëse ka ndodhur gjatë adoptimit. - Miksin në të cilin është shfaqur rritja minimale. - Shkalla e tolerancës e përllogaritur me një sistem pikëzimi në funksion të parametrave të lartëpërmendur. Konkretisht në tabelën e mëposhtme jepen këto vlera për sejcilin shtam:

Tabela 5.4 Rritja mesatare, rritja maksimale, rritja minimale (log CFU/mL), humbja totale e vitalitetit të shtameve gjatë adoptimit në Miks-e dhe shkalla e tolerancës.

Shtami Rme*

log CFU/mL Rma*

log CFU/mL Rmi*

log CFU/mL HTV* Miksi /Rmi

SHT *

B2339 8.1 10.0 6.8 (-) 38 3+4+7=14 MB29 7.6 10.5 1.8 (-) 41 2+7+2=11 RA18 9.3 10.5 7.8 (-) 41 9+7+8=24 B2150 8.7 9.7 2.8 (-) 41 7+2+3=12 B1279 6.2 9.7 0.0 (+) 35 1+2+1=3 MB16 8.4 10.4 3.8 (-) 41 4+6+4=14 B609 8.5 9.9 0.0 (+) 35 5+3+1=9 B1958 8.8 10.2 6.3 (-) 38 8+5+5=18 M354 8.1 9.6 0.0 (+) 39 3+1+1=5 P32 8.6 9.9 6.4 (-) 40 6+3+6=15

* Rme – Rritja mesatare, * Rma – Rritja maksimale, * Rmi – Rritja minimale, * HTV – Humbje totale e vitalitetit, *SHT – shkalla e tolerancës

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (B2150)

0

2

4

6

8

10

12

0 10 20 30 40 50

log

cfu/

ml

Miks

ideale

Linear (B609)

69

Nga vlerat e Rme dhe SHT, vërehet se shtamet më të ndjeshme janë B. pseudocatenulatum B1279, B. animalis. susbsp. lactis MB29 dhe B.animalis. susbsp. lactis M354 me vlerë Rme përkatësisht 6.2 log CFU/mL, 7.6 log CFU/mL dhe 8.1 log CFU/mL dhe SHT përkatësisht 3, 11, 5. B.animalis.subsp.lactis RA18 paraqet Rme më të lartë se të nëntë shtamet e tjera me një vlerë prej 9.3 log CFU/mL. Vlerat e Rma i takojnë kryesisht fazës fillestare të adoptimit, ku sasia e lëngut të shtuar ishte minimale dhe vlerat e pH-it nuk ndryshonin shumë nga ajo e terrenit TPY, kështu që këto vlerat i korespondojnë fazës logaritmike të rritjes dhe janë në varësi të karakteristikave të shtamit, pavarësisht se në këtë rast shtamet kanë qënë në kushte optimale për zhvillim maksimal, vërehet gjithsesi e njëjta tendencë e zhvillimit më të pakët, për B.pseudocatenulatum(B1279) me Rma(9.7) dhe B. animalis. susbsp. lactis M354 me Rma 9.6, më të ulët se shtamet e tjera.

Rmi tregon minimumin e përqëndrimit qelizor të arritur gjatë periudhës së adoptimit dhe është në fakt parametri vendimtar i cili përcakton shkallën e tolerancës së shtameve në kushtet e ekspozimit ndaj lëngut. Në këtë rast shtamet të cilët e humbën totalisht vitalitetin e tyre ishin B. pseudocatenulatum B1279, B.breve B609, dhe B.animalis.susbsp.lactis M354, gjithashtu B.animalis.susbsp.lactis MB29 paraqet një Rmi shumë të ulët, prej 1.8 log CFU/mL, e më pas vjen B.breve B2150 me Rmi 2.8. Duke i lidhur këto të tre parametra u krye renditja e shtameve në bazë të tolerancës ndaj këtyre kushteve, duke përdorur një sistem pikëzimi, ku numri më i lartë i pikëve paraqet tolerancën më të lartë ndaj këtyre kushteve. Në bazë të përllogaritjes së ndjeshmërisë për sejcilin nga parametrat e analizuar më sipër, konkretisht renditja rezultoi:

RA18>B1958>P32>(B2339, MB16)>B2150>MB29>B609>M354>B1279

B.animalis.susbsp.lactis>B.bifidum>B.pseudocatenulatum,B.thermofilum>B.breve> B.animalis.susbsp.lactis>B.breve> B.animalis.susbsp.lactis> B.pseudocatenulatum

Duke qënë se vitaliteti i shtameve në Miks-e tregoi mënyrën se si shtamet mbijetuan në kushtet e adoptimit të zgjatur, është ndërtuar një vijë lineare e cila përfaqëson mesatarizimin e vlerave duke dhënë vijën tendencë për mbijetesën. Devijacion më të theksuar nga kjo vijë, kanë shtamet më sensibël si MB29, B1279 dhe B609.

Në Grafikun 5.8 paraqitet ecuria e mbijetesës së shtameve vetëm në 10 Mikset e fundit, ku duket qartazi tendenca e rezistencës së ndryshme të tyre.

Grafiku 5.8 Ecuria e mbijetesës në fazat e fundit të adoptimit nga Miks 30 në Miks 41

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

logc

fu/m

l

Miks 31 -41

B2339

MB29

RA18

B2150

B1279

MB16

B609

B1958

M354

P32

70

Gjatë gjithë periudhës së adoptimit, kryesisht shtamet më sensibël si B1279, M354, B609 karakterizohen nga rënie e përqëndrimit qelizor gjatë adoptimit në më shumë se një herë gjatë ciklit të adoptimit në vlera të ulta, gjithashtu ashtu si edhe tregohet në Grafikun 5.8, gjatë fazës së fundit të adoptimit në 10 mikset e fundit, ato kanë filluar ta humbasin vitalitetin e tyre ndjeshëm që pas Miks 30 (pH 3.5, Vol TPY 2.4mL, Vol lëng boronice 6.4mL). Kjo vlerë pH-i përbën një vlerë para-letale e cila ndikon dukshëm në vitalitetin e këtyre shtameve të ndjeshëm. Ndërkohë po në 10 mikset e fundit dallohen për rezistëncë të lartë pavarësisht vlerave të ulta të pH-it, që varjojnë nga (pH 3.5- pH 2.9), shtamet si RA18 dhe P32.

a) B. pseudocatenulatum B2339 b) B. pseudocatenulatum B1279

c) B. animalis subsp. lactis MB29 d) B. animalis subsp. lactis RA18

e) B. animalis subsp. lactis M354 f) B. animalis subsp. lactis P32

71

g) B. breve B2150 h) B. breve B609

i) B. bifidum B1958 j) B. thermofilum MB16

Grafiku 5.9 Varësia e përqëndrimit qelizor në log CFU/mL, nga tre parametrat e tjerë të matricës Miks, pH-i, Volumi i TPY dhe Volumi i lëngut, për çdo shtam: a)B.pseudocatenulatum B2339, b)B.

pseudocatenulatum B1279, c)B. animalis subsp. lactis MB29, d)B. animalis subsp. lactis RA18, e)B. animalis subsp. lactis M354, f)B. animalis subsp. lactis P32, g)B. breve B2150, h)B. breve B609, i)B.

bifidum B1958, j)B. thermofilum MB16

Në Grafikun 5.9 (i-j) paraqitet varësia e përqëndrimit qelizor në log CFU/mL, nga tre parametrat e tjerë të matricës Miks, pH-i, Volumi i TPY dhe Volumi i lëngut, për çdo shtam në tre momente të periudhës së adoptimit, konkretisht;

1-) përqëndrimi qelizor në Miks 1, që në më të shumtën i takon fazës logaritmike të

rritjes së mikroorganizmave ku ato kanë arritur edhe vlerën maksimale Rma, për shkak të parametrave të përshtatshme të këtij miksi, i cili përmban vetëm 0.25 mL lëng boronice dhe pH-i është 6.3,

2-) përqëndrimi qelizor në fazën e parë të adoptimit (përfaqësuar nga Miks1-Miks 10) aty ku qelizat kanë hasur për herë të parë rënien e konsiderueshme të vitalitetit dhe së fundmi,

3-) përqëndrimi qelizor në fund fare të adoptimit.

72

Grafiku 5.10 Rënia e vitalitetit në (%) e shtameve në Miks-e në kater vlera pH-i

Në Grafikun 5.10 paraqitet rënia e vitalitetit RV në (%) e shtameve në Miks-e në kater vlera pH-i. Nëse vërehet faza e parë e adoptimit, ajo ku vlera e pH-it është 6.3, tre nga 10 shtame kanë paraqitur rritje të vitalitetit duke treguar se faza e tyre e përshtatjes ka zgjatur më shumë, duke rezultuar pas 24 orësh në fazën stacionare të rritjes pas fazës logaritmike, ndërsa shtamet e tjera lag fazën e kanë pasur më të shkurtër dhe pas 24 orësh në Miksin 1 ato kanë nisur të reduktojnë numrin e tyre të qelizave.

Ajo që spikat është se pasi vlera e pH-it ka rënë me 1, pra në pH 5.2, shtamet kanë pësuar një rënie të konsiderueshme vitaliteti, ndërsa me vazhdimin e adoptimit, në vlerën e pH 3.9 ato duket sikur janë përshtatur ndaj këyre kushteve duke paraqitur një RV me vlerë më të ulët se faza e mëparshme, shenjë kjo e induktimit probabël të ATR. Faza e fundit ajo që i takon fundit të adoptimit me vlerë pH 2.9, diferencon dukshëm shtamet sensibël nga ato rezistente, meqënëse kjo fazë e ka një pH në vlera letale për këto mikroorganizma (pH 2.9).

Grafiku 5.11 Koha e parë e Reduktimit (KIR), gjatë adoptimit në Miks-e

Parametër tjetër i krahasueshëm për shtamet gjatë periudhës së adoptimit në Miks-e paraqitur në Grfikun 5.11, është edhe Koha e parë e Reduktimit (KIR) ose quajtur ndryshe koha e reduktimit decimal D, e cila tregon kohën nw (orë) që i është dashur mikroorganizmit për të humbur një shkallë logaritmike në përqëndrimin e tij qelizor. Ky parametër është përcaktuar për fazën e parë të adoptimit ku vlerat e pH-it ishin ende në nivele të pranueshme për mikroorganizmat. Këtu spikat shtmai RA 18 i cili

-40

-20

0

20

40

60

80

100

6.33 5.2 3.9 2.9

RV (%

)

pH i Miks

B2339

MB29

RA18

B2150

B1279

MB16

B609

B1958

M354

0100200300400500600700800900

Koha

(Orë

)

Shtamet

KIR (orë)

73

ka paraqitur një përqëndrim qelizor pothuajse totalisht konstant gjatë gjithë periudhës së adoptimit. Ndërsa shtame me KIR më të shkurtër janë shtamet sensibël si B1279, MB16, B1958. Kjo fazë është indikuese për të treguar se sa e shpejtë është rënia e vitalitetit pas fazës stacionare.

Renditja sipas ndjeshmërisë së parashikuar ndaj këtyre kushteve në bazë të KIR

RA18>B2339>B2150>B609>MB29>M354>P32>B1958>B1279>MB16

a) b) c)

d) e) f)

g) h) i) Grafiku 5.12 Mbijetesa e shtameve dhe përcaktimi i KIR, në fazat e para të adoptimit: a)B.pseudocatenulatum B2339, KIR 264 orë; b)B.Breve B2150, KIR 216 orë; c)B.breve B609, KIR 192 orë; d)B.animalis.subsp.lactis MB29, KIR 144 orë; e) B.animalis.subsp.lactis M354, KIR 130 orë; f) B.animalis.subsp.lactis P32, KIR 120 orë; g)B.bifidum B1958, KIR 96 orë; h) B1279, KIR 72 orë i)B.thermofilum MB16, KIR 24 orë

Nga studimi i fazës fillestare të adoptimit, paraqitur në Grafikun 5.12, vërehet se

B.pseudocatenulatum B2339 me KIR 265 orë, B.breve B2150 me KIR 216 orë, paraqesin një fazë fillestare rritjeje me përqëndrim qelizor në rënie të ngadaltë me kalimin e kohës, kjo kinetikë vdekjeje në trajtën e “shpatullës” jep indikacion për një kinetikë vdekjeje në vazhdimësi jo të theksuar, duke indikuar një nivel mbijetese më të lartë. Kinetikë të theksuar vdekjeje japin B.thermofilum MB16 me KIR 24 orë, B.pseudocatenulatum B1279 me KIR 72 orë, B.bifidum B1958 me KIR 96 orë, indikacion për mbijetesë të ulët në këto kushte. Duhet theksuar se në këtë fazë ku është përcaktuar parametri KIR, kushtet në Miks janë afër kushteve optimale të zhvillimit të Bifidobacterium.spp dhe presupozohet se kushtet para-letale fillojnë pas Miks-it 22, me vlerë pH 4.03 dhe kohë adoptimi prej 648 orësh. Pra rezultatet e KIR i takojnë shtameve para adoptimi në kushte para-letale, pra është atribut i shtamit të pa adoptuar.

5.4.4 Mbijetesa e shtameve në lëngun e boronicës pas adoptimit në Miks Në Grafikun 5.13 jepet mbijetesa e shtameve 24 orë në lëng boronice, në 37°C

anaerobiozë pas poçedurës së adoptimit. Dallohet se kryesisht shtamet kanë paraqitur tolerancë të lartë ndaj mjedisit lëng boronice, në këtë rast prova u krye 24 orë në lëng boronice, 37°C/aerobiozë.

74

Grafiku 5.13 Mbijetesa e shtameve pas adoptimit 24 orë në lëng boronice

Me anë të Grafikut 5.14 është bërë krahasimi i rezistencës 24 orë në lëng boronice

të shtameve, duke paraqitur RV në % përllogaritur nga vlera mesatare e log CFU/mL për sejcilin shtam para dhe pas proçedurës së adoptimit. Kjo proçedurë adoptimi synonte të ekspozonte shtamet ndaj kushteve të pH-it para-letal dhe letal, duke bërë një kalim gradual nga njëra fazë tek tjetra me synim aktivizimin e ATR.

Shtamet pas përfundimit të adoptimit në Miks, u rivitalizuan në TPY pH 7.0, për të

arritur një përqëndrim qelizor fillestar në nivel të pranueshëm, për tu inokuluar në lëng (për provën e rradhës). Ajo që vihet re nga grafiku i mësipërm është se ndryshim të ndjeshëm në nivelin e mbijetesës kanë paraqitur kryesisht shtamet sensibël, të cilët në fazën e parë të testimit përpara adoptimit humbën vitalitetin në nivele të larta.

Grafiku 5.14 Krahasimi i Rënies së Vitalitetit (%) të shtameve para dhe pas adoptimit pas 24 orë në

lëng boronice

Në Grafikun 5.15, paraqitet Rritja e Rezistencës në % për sejcilin shtam pas

adoptimit në Miks. Konkretisht, B.thermofilum MB16 i cili në fazën e parë të testimit humbi 100% vitalitetin e tij, pas adoptimit RV rezultoi 4.3%, duke e rritur rezistencën e tij në këto kushte në masën 95%, B.pseudocatenulatum B1279 pësoi një rritje rezistence prej 68.5%, B.breve B2150 pësoi një rritje rezistence prej 64.6%. Gjithashtu rritje të rezistencës paraqesin edhe B.pseudocatenulatum B2339 dhe B.breve B609 përkatësisht 20.6% dhe 23.1%. Vihet re që shtamet e paraqitur si

0123456789

logc

fu/m

l

Shtametlog T0log T24

0

20

40

60

80

100

RV (%

)

RV para adoptimit

RV pas adoptimit

75

rezistentë në fazën e parë (përpara adoptimit), ju është rritur pak rezistenca si në rastin e B.animalis.subs.lactis RA18 dhe P32 të cilët pësuan një rritje rezistence përkatësisht prej 9.5% dhe 3.8%.

Grafiku 5.15 Rritja e rezistencës në lëng boronice, e shtameve pas adoptimit në matricën Miks

Për disa shtame proçedura e adoptimit të ngadaltë e aplikuar, ka kryer efektin e kundërt, duke ulur rezistencën, si në rastin e B.bifidum B1958 i cili ka një ulje të rezistencës në masën 12.3%, B.animalis.subsp.lactis MB29 dhe M354 një ulje të rezistencës përkatësisht në masën 1.6%, dhe 0.7%. Ky është një reagim i hasur edhe në studime të tjera. Saarela et al., (2004) kanë egzaminuar përmirësimin e mbijetesës të shtameve të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp të trajtuar në kushte para-letale me aciditet të lartë dhe nxehtësi (pH 3.0-4.0 dhe temperaturë 47ºC për 30 min – 1 orë) dhe në vazhdim në kushte para-letale (pH 2.5, kripra biliare 1.5 % dhe temperaturë 55ºC për 1-3 orë). Ato zbuluan se adoptimi karshi stresit rriti mbijetesën e shtameve të Lactobacillus.spp më shumë sesa ato të Bifidobacterium.spp. Para-trajtimi në pH 3.5 të disa shtameve të B. longum E1884 pati madje efekt të kundërt duke ulur acido-tolerancën.

5.5 Diskutime

Synimi i kësaj faze studimi ishte përfshirja e një game të gjërë speciesh të Bifidobacterium.spp (30 shtame nga 8 specie), në një adoptim gradual të vazhduar në një matricë model përbërë nga TPY dhe lëng boronice, me synim përftimin e fenotipeve rezistente ndaj mjedisit të ofruar të këtij lëngu. Përzgjedhja e shtameve për tju nënshtruar testimit të rezistencës 24 orë në lëng boronice, në 37°C, anaerobiozë u bë rastësore duke përfshirë në të si shtame me historik rezistence ashtu edhe shtame të ndjeshëm, nisur nga fakti se shumë studime janë kryer mbi asistimin e tolerancës së shtameve rezistente ndaj kushteve të stresit si (Saarela et al., 2010, Sheehan et al., 2007, Carmen et al., 2010, Sawaminee et al., 2011, Shah et al., 2010), studime kryesisht të përqëndruara tek B.animalis.subsp.lactis dhe B.longum. Nga ana tjetër shumë studime të tjera janë kryer mbi përmirësimin e tolerancës së shtameve sensibël pra përftimin e fenotipeve rezistente prej tyre (Saarela et al., 2010b, Ding & Shah 2008).

Testimi i shtameve 24 orë në lëng, u konsiderua si një etapë e ekspozimit të shtameve në kushte para-letale duke pasur 2 synime: 1- nëpërmjet kësaj prove u bë e mundur të zgjidheshin e të veçoheshin shtamet me tolerancë më të lartë nga shtamet

21

-29

65 69

96

23

-12 -14

-20

0

20

40

60

80

100

RR(%

)

76

me ndjeshmëri më të lartë ndaj këtyre kushteve; 2- aplikimi i këtij ekspozimi synoi aktivizimin e ATR për shtamet, në mënyrë që ato të mund të përballonin duke paraqitur rezistencë më të lartë gjatë fazës së mëpasëshme të adoptimit gradual në matricën model lëng boronice + TPY, (MIKS).

Në këtë fazë studimi u përfshinë edhe dy shtame nga provat e para të Kapitullit 3 dhe Kapitullit 4 (B.bifidum B1958 dhe B.breve B609) në mënyrë që të bëhej e mundur edhe krahasimi i efiçencës së metodikave të përzgjedhura për përmirësimin e rezistencës.

Përzgjedhja e kryerjes së provës së rezistencës në lëng 24 orë në anaerobiozë, ishte për të vënë shtamet karshi vetëm njërit faktor stresi (pH-it) dhe jo pranisë së oksigjenit, për tu rritur gama e përzgjedhjes dhe duke qënë se adoptimi në Miks-e do të kryhej në anaerobiozë.

Nga rezultatet e rezistencës 24 orë në lëng boronice u konkludua se shtame të të njëjtave specie në të njëjtat kushte paraqitën rezistencë të ndryshme. Pra aftësia për të mbijetuar varet nga shtami. Rezistencë më të lartë paraqitën shtame të gjinisë B. animalis subsp.lactis P32, MB29, RA18, të cilët pas 24 orë në lëngun e boronicës humbën më pak se 1log CFU/mL, rezultat i cili edhe pritej. Përqëndrimi qelizor i inokulit për të gjitha shtamet që kaluan provën e rezistencës në lëng ishte i përafërt në një interval nga 1010CFU/mL në 107CFU/mL. Pavarësisht përqëndrimit qelizor të inokulit fillestar, qelizat paraqitën rezistencë të ndryshme pra konkludohet që rezistenca nuk varet nga përqëndrimi fillestar i inokulit por nga aftësia e vetë shtamit për të mbijetuar.

Vërehet se nga të 8 speciet e marra në studim, vetëm specia B.animali.supsb.lactis ka paraqitur përqindje mbijetese në masën 100%, pra rikonfirmohet fakti që shtamet e kësaj specieje kanë aftësi të larta për të mbijetuar në kushte stresi acid. Më pas në vënd të dytë renditet specia B. catenualtum me përqindje mbijetese në masën 50%, më pas vijnë B.pseudocatenulatum, B.breve dhe B.bifidum me përqindje mbijetese përkatësisht, 40%, 40% dhe 33%. Speciet të cilat kanë paraqitur ndjeshmëri shumë të lartë karshi kushteve të aciditetit janë B.adolescentis, B.longum, B.thermofilum me përqindje mbijetese në masën 0%. Këto vlera mbi përqindjen e mbijetesës dhe vdekshmërisë në këto kushte për shtamet e marra në studim, kanë nivel indikues duke qënë se numri i shtameve për specie nuk ka qënë i njëjtë por, përcaktimi i këtyre parametrave është bërë në funksion të numrit total të shtameve të marra në studim për çdo specie. Pavarësisht këtij fakti, rezultati jep orientim të drejtë mbi nivelin e rezistencës së specieve.

Proçedura e adoptimit në Miks-e u krye për nëntë shtame mesatarisht dhe fortësisht rezistente si edhe për një shtam sensibël që të mund të bëhej krahasimi mbi fitimin e aftësive toleruese pas adoptimit, konkretisht; B.bifidum B1958, B.pseudocatenulatum (B2339, B1279), B.animalis.subsp.lactis, (MB29, RA18, M354, P32), B.breve (B2150, B609), ndërsa shtami sensibël u përzgjodh B. thermofilum MB16. Përzgjedhja e adoptimit në matricën Miks, me një proçedurë ku çdo 24 orë pas inkubimit, matrica miks pësonte një rritje të vazhdueshme të volumit të lëngut në masën 200µl, duke zëvendësuar të njëjtin volum të TPY lëng, u krye e tillë në mënyrë që ekspozimi i shtamit ndaj lëngut (kushteve para-letale) të ishte sa më gradual që të ishte e mundur, duke i dhënë shtameve mundësi përshtatjeje më të lartë. Shtimi i volumit pas ardhës të lëngut pas 24 orë inkubim, synonte

77

që qelizat të ekspozoheshin ndaj kushteve të reja (të Miks-it me volum lëngu 200µl më të lartë), në fazën e tyre stacionare të rritjes. Shumë studime janë kryer kryesisht për teknika adoptimi ndaj kushteve ektreme me qeliza të marra nga faza logaritmike e rritjes, megjithatë shtamet probiotike starter tipikisht merren ose në fazën logaritmike të vonët të rritjes ose nga faza stacionare e rritjes, për të arritur zhvillim qelizor dhe vitalitet maksimal (Heckly 1985; Beal & Corrieu 1994; Saxelin et al., 1999; Peter & Reichart 2001). Të tjera studime janë kryer pikërisht mbi diferencimin e aftësive toleruese më të larta të qelizave të marra nga faza stacionare e rritjes, ku Saarela et al., (2004), kanë studjuar nëse trajtimi para-letal i 3 shtameve të Lactobacillus.spp dhe 2 të Bifidobacterium.spp marrë nga faza stacionare e rritjes, mund të rrisë mbijetesën e tyre gjatë trajtimeve letale. U vërejtën përmirësime të mbijetesës për të dy shtamet, megjithatë përmirësimi ishte më i theksuar tek shtamet e Lactobacillus.spp sesa tek ato të Bifidobacterium.spp.

Në studimin tonë, përcaktimi i vitalitetit të shtameve gjatë periudhës së adoptimit në Mikse synonte të mbante nën kontroll gjëndjen e qelizave karshi këtyre kushteve, në mënyrë që të evitohej vdekja e tyre totale, për këtë; pas një cikli 5 ditor trajtimi në Miks-et përkatëse kryhej kalimi i kulturave për 3 ditë në TPY lëng pH 7.0. Gjatë kësaj periudhe adoptimi, qelizat u ekspozuan vazhdimisht karshi një pH-i gjithmonë në ulje (Miks 1, pH 6.33 deri Miks 41, pH 2.9), si edhe karshi një volumi gjithnjë në rritje të lëngut të boronicës [Miks1, (Vol lëng 0.25 mL) deri Miks 41, (Vol lëngu 8.6mL)]; e gjithë kjo për një peiudhë kohore prej 1050 orësh, (44 ditësh). Shtimi i volumit të lëngut të boronicës në Miks ekspozonte shtamet karshi një sasie gjithnjë e në rritje edhe të përbërësave kimikë të tij me aktivitet (si nxitës ashtu edhe probabilisht inhibues të saharozës, acidit citrik, acidit askorbik apo total fenoleve). Nga përdorimi i lëngut të boronicës si matricë ushqimore, faktorë ndikues në mbijetesën e shtameve probiotike, konsiderohen në rradhë të parë pH-i acid (2.9), konservantët ushqimorë, prania e acideve organike, si dhe e polifenoleve.

Për efektin e pranisë së acideve organike apo edhe total fenoleve që gjënden në lëngjet e frutave mbi vitalitetin e kulturave probiotike ka studime me rezultate konfliktuale, ku Sawaminee et al., (2011), kanë konkluduar në lidhje me rolin e acidit citrik; bazuar në rezultatet e studimit të kryer prej tyre, acidi citrik i pranishëm në lëngun model pati një efekt pozitiv veçanërisht në përqëndrimin 8 dhe 15 g/l. Ku shpjegohet se probabilisht ky efekt pozitiv mund të jetë si shkak i metabolizimit të tij nga qelizat përgjatë ruajtjes, apo të pranisë të ndonjë mekanizmi bufer nga acidi citrik brënda në qelizë. Saarela et al., (2009) kanë treguar se acidet organike janë më të dëmshëm karshi qelizave mikrobiale sesa acidet inorganike për të njëjtat vlera pH-i.

Përsa i përket përqindjes së komponimeve fenolike sipas (Bialonska, Kasimsetty, Schrader & Ferreira, 2009) ato nuk konsiderohen si faktorë inhibues, përkundrazi konsiderohen si faktorë nxitës të rritjes. Nga studime të kryera prej tyre ku është shqyrtuar ndikimi i tanineve të shegës mbi vitalitetin e baktereve probiotike të pranishme në mikroflorën intestinale, u vëzhgua se Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp nuk u ndikuan nga ellagitanninet. Për më shumë shtimi i një nënprodukti përbërës të lëngut të shegës stimuloi në mënyrë të ndjeshme rritjen e Bifidobacterium breve d h e Bifidobacterium infantis. Parkar, Stevenson & Skinner (2008), kanë kryer studime mbi polifenolet si flavoniedet dhe kanë raportuar

78

se flavonoidet- naringinë, rutin, florizidin dhe kuercitin – mund të kenë efekte në mikroflorën intestinale midis të tjerave: a) një rritje të numrit të baktereve pozitive, b) rritje të aderencës të këtyre baktereve në murin intestinal dhe c) inhibim të poliforimit të eneteropatogjenëve si S. aureus apo Salmonella typhimurium. Sawaminee et al., (2011), në një studim të kryer mbi mbijetesën e Bifidobacterium longum NCIMB 8809 në lëngun e shegës e të luleshtrydhes, që kishin vlera shumë të përafërta pH-i (pH 3.3) por kishin diferencë të madhe në nivelet e acidit citrik (21.3 dhe 6.7 g/l), dhe total fenoleve (6.2 dhe 3.3 g/l), përkatësisht, u konkludua se përqindja e lartë e total fenoleve në lëngun e shegës probabilisht shpjegoi faktin e rënies së vitalitetit të qelizave brënda një jave ruajtjeje, ndërsa në rastin e lëngut të luleshtrydhes qelizat humbën totalisht vitalitetin për 4 javë.

Në studimin tonë, nga përpunimi i të dhënave të marra gjatë fazës së adoptimit në Miks-e për sejcilin shtam, u synua të kuptohej sjellja e shtameve në këto kushte. Nga vlerat e Rme dhe SHT (Tabela 5.3) vërehet se shtamet më të ndjeshme janë B. Pseudocatenulatum B1279, B.animalis.susbsp.lactis MB29, dhe B. animalis. susbsp. lactis M354 me vlerë Rme përkatësisht 6.2 log CFU/mL, 7.6 log CFU/mL dhe 8.1 log CFU/mL dhe SHT përkatëisht 3, 11, 5. B.animalis.subsp.lactis RA18 paraqet Rme më të lartë se të nëntë shtamet e tjera me një vlerë prej 9.3 log CFU/mL. Vlerat e Rma i takojnë kryesisht fazës fillestare të adoptimit, ku sasia e lëngut të shtuar ishte minimale dhe vlerat e pH-i nuk ndryshonin shumë nga ajo e terrenit TPY, kështu që këto vlera i korespondojnë fazës logaritmike të rritjes dhe janë në varësi të karakteristikave të shtamit, pavarësisht se në këtë rast shtamet kanë qënë në kushte optimale për zhvillim maksimal, vërehet gjithsei e njëjta tendencë e zhvillimit më të pakët, për B. pseudocatenulatum B1279 me Rma 9.7 dhe dhe B.animalis.susbsp.lactis M354 me Rma 9.6, më të ulët se shtamet e tjera. Shtamet të cilët e humbën totalisht vitalitetin e tyre ishin B. pseudocatenulatum B1279, B.breve B609, dhe B.animalis.susbsp.lactis M354, gjithashtu B.animalis.susbsp.lactis MB29 paraqet një Rmi shumë të ulët, prej 1.8 log CFU/mL, e më pas vjen B.breve B2150 me Rmi 2.8.

Në bazë të renditjes së ndjeshmërisë për sejcilin nga parametrat e analizuar më sipër, konkretisht renditja rezultoi:

RA18>B1958>P32>(B2339, MB16)>B2150>MB29>B609>M354>B1279

B.animalis.susbsp.lactis>B.bifidum>B.pseudocatenulatum,B.thermofilum>B.breve> B.animalis.susbsp.lactis>B.breve> B.animalis.susbsp.lactis> B.pseudocatenulatum

Në fund të fazës së adoptimit në Miks, në rastin kur kulturat në Miksin e fundit rezistuan, biomasat e tyre u rinfreskuan tre herë në TPY lëng pH 7.0, përpara ruajtjes për ngrirje në -80°C, ndërsa në rastin kur kulturat e humbën totalisht vitalitetin e tyre në njërin nga Mikset e fundit, atëherë u izoluan koloni nga pjatat e përcaktimit të vitalitetit në këtë Miks dhe u kaluan në TPY lëng pH 7.0 për zhvillim përpara ruajtjes për ngrirje në -80°C si fenotipe të adoptuara. - Pikë delikate e proçedurës së zgjatur të adoptimit në kushte para-letale e më pas letale, është qëndrueshmëria e fenotipeve acido rezistente pas kësaj proçedure. Atributi i fituar gjatë adoptimit që të mund të ruhet teorikisht duhet që trajtimi në kushtet sfiduese të jetë i zgjatur, por pavarësisht kësaj duket qartazi edhe nga studimi ynë se ruajtja e atributit rezistent është karakteristikë e shtamit.

79

- Tendencë për përmirësim të karakteristikave rezistuese paraqitën kryesisht shtame sensibël.

5.6 Konkluzione - Lidhur me mbijetesën e shtameve të testuar për rezistencën e tyre 24 orë në lëngun

e boronicës përpara adoptimit u vërejt se shtame të të njëjtave specie në të njëjtat kushte paraqitën rezistencë të ndryshme.

- Aftësia për të mbijetuar varet nga shtami.

- Rezistencë më të lartë paraqesin shtame të gjinisë B. animalis subsp.lactis P32, MB29, RA18, të cilët humbën më pak se 1shkallë log CFU/mL.

- Rezistenca nuk varet nga përqëndrimi i inokulit fillestar por nga aftësia e vetë shtamit për të mbijetuar.

- Në lidhje me përqindjen e mbijetesës dhe vdekshmërisë në nivel specieje, nga të 8 speciet e marra në studim, vetëm specia B.animalis.supsb.lactis ka paraqitur përqindje mbijetese në masën 100%, pra rikonfirmohet fakti që shtamet e kësaj specieje kanë aftësi të larta për të mbijetuar në kushte stresi acid.

-Përqindje mbijetese mesatare paraqitën speciet B. Catenualtum, B.pseudocatenulatum, B.breve dhe B.bifidum.

- Speciet të cilat paraqitën ndjeshmëri shumë të lartë rezultuan B.adolescentis, B.longum, B.thermofilum me përqindje mbijetese në masën 0%.

- Mbijetesa dhe vdekshmëria mesatare në përqindje e të gjithë shtameve të testuara 24 orë në lëng boronice tregon se vlera mesatare e vdekshmërisë për të 30 shtamet e testuara është në masën 67%, duke konfirmuar kështu faktin se Bifidobacterium.spp janë kryesisht pak tolerante ndaj kushteve të pH-it acid.

- Përqindja e mbijetesës rezultoi 33%. Konkludohet që ka një probabilitet të kënaqshëm për të përdorur shtame të Bifidobacterium.spp nga specie të ndryshme si suplement në lëngjet e frutave. Gjithashtu për shtamet e ndjeshme probabilisht egzistojnë aletrnativa për përmirësimin e tolerancës së tyre ndaj aciditetit dhe për të përftuar shtame lëng rezistente.

- Vlerat e Rma pavarësisht se në këtë rast shtamet kanë qënë në kushte optimale për zhvillim maksimal, vërehet gjithsei e njëjta tendencë e zhvillimit më të pakët, për B. pseudocatenulatum B1279 dhe B.animalis.susbsp.lactis M354 me Rma më të ulët se shtamet e tjera.

- Shtamet të cilët e humbën totalisht vitalitetin e tyre në fund të adoptimit në miks ishin B. pseudocatenulatum B1279, B.breve B609, dhe B.animalis.susbsp.lactis M354, gjithashtu B.animalis.susbsp.lactis MB29 paraqet një Rmi shumë të ulët e më pas vjen B.breve B2150 me Rmi 2.8.

- Gjatë gjithë periudhës së adoptimit, shtamet më sensibël si B1279, M354, B609 u karakterizuan nga një rënie e përqëndrimit qelizor në më shumë se një herë gjatë ciklit të adoptimit në vlera të ulta.

80

- Gjatë fazës së fundit të adoptimit në 10 mikset e fundit, Miks 30 (pH 3.5, Vol TPY 2.4mL, Vol lëng boronice 6.4mL), shtamet sensibël kanë filluar ta humbasin vitalitetin e tyre ndjeshëm, pra vlera të pH-it para-letale ndikojnë dukshëm në vitalitetin e këtyre shtameve të ndjeshëm.

- Ndërkohë po në 10 mikset e fundit dallohen për rezistencë të lartë pavarësisht vlerave të ulta të pH-it, që varjojnë nga (pH 3.5- pH 2.9), shtamet si RA18 dhe P32.

- Duke analizuar RV në (%) të shtameve në Miks-e në kater vlera pH-i, pasi vlera e pH-it ka rënë me 1 (në pH 5.2), shtamet kanë pësuar një rënie të konsiderueshme vitaliteti, ndërsa me vazhdimin e adoptimit, në vlerën e pH 3.9 ato duket sikur janë përshtatur ndaj këyre kushteve duke paraqitur një RV me vlerë më të ulët se faza e mëparshme, shenjë kjo e induktimit probabël të ATR.

- Faza e fundit ajo që i takon fundit të adoptimit me vlerë pH 2.9, diferencon dukshëm shtamet sensibël nga ato rezistente, duke hyrë kjo fazë e cila ka një pH në vlera letale (pH 2.9).

- Nga studimi i fazës fillestare të adoptimit dhe përcaktimit të KIR e cila i takon kushteve para-letale, pra është atribut i shtamit të pa adoptuar, u vërejt se paraqesin një fazë fillestare rritjeje me përqëndrim qelizor në rënie të ngadaltë me kalimin e kohës, shtamet B.pseudocatenulatum B2339, B.breve me një kinetikë vdekjeje në trajtën e “shpatullës” e cila jep indikacion për një kinetikë vdekjeje në vazhdimësi jo të theksuar, duke indikuar një nivel mbijetese më të lartë.

- Kinetikë të përshpejtuar vdekjeje paraqesin B.thermofilum MB16 me KIR 24 orë, B.pseudocatenulatum B1279, B.bifidum B1958, indikacion për mbijetesë të ulët në këto kushte. Ky parametër i përcaktuar në fazën fillestare të adoptimit dha informacion të saktë mbi ndjeshëmrinë e shtameve në këto kushte deri në fund të adoptimit.

- Nga krahasimi i mbijetesës së shtameve pas adoptimit, vihet re se ndryshim të ndjeshëm në nivelin e mbijetesës kanë paraqitur kryesisht shtamet sensibël, të cilët në fazën e parë të testimit përpara adoptimit humbën vitalitetin në nivele të larta.

- Rritje të lartë të Rezistencës në lëng në % pas adoptimit në Miks, parqitën B.thermofilum MB16 95%, B.pseudocatenulatum B1279 68.5%, B.breve B2150 64.6%.

- Shtamet e paraqitur si rezistentë në fazën para adoptimit, ju është rritur pak rezistenca si në rastin e B.animalis.subs.lactis RA18 dhe P32 të cilët pësuan një rritje rezistence përkatësisht prej 9.5% dhe 3.8%.

- Për disa shtame proçedura e adoptimit të ngadaltë e aplikuar, ka kryer efektin e kundërt, duke ulur rezistencën, si në rastin e B.bifidum B1958 i cili ka një ulje të rezistencës në masën 12.3%, B.animalis.subsp.lactis MB29 dhe M354 një ulje të rezistencës përkatësisht në masën 1.6%, dhe 0.7%.

81

Kapitulli 6. Përcaktimi i vitalitetit dhe rezistencës së fenotipeve pas adoptimit në lëngun e boronicës, inkubuar në dy temperatura

6.1 Përmbledhje Në këtë fazë u studjua paralelisht, efiçenca e adoptimit në Miks-e (Kapitulli 5) si edhe

qëndrueshmëria e fenotipeve probabël lëng rezistente. Rezistenca e shtameve u provua duke inokuluar fenotipet e adoptuar të 10 shtameve (Tabela 6.1) në lëng boronice, në dy temperatura inkubimi, 4°C dhe 37°C, në aerobiozë. Për këtë; fenotipi i adoptuar për çdo shtam, u kalua në lëng boronice. U përcaktua përqëndrimin qelizor i inokulit për çdo fenotip në kohën T0 nëpërmjet kultivimit të hollimeve limite. Tre tuba konikë paralelë (me vëllim 50mL) me lëng boronice të inokuluar për sejcilin nga të 10 fenotipet e adoptuara u inkubuan në errësirë në kushte aerobike në 37°C dhe 3 tuba konikë të tjerë u vendosën në ruajtje në 4°C.

Për fenotipet inkubuar në temperaturën 37°C dhe 4°C, u krye përcaktimi i vitalitetit menjëhere pas 4 orëve të para dhe më pas çdo 24 orë për të gjithë kohën në vazhdim, deri në 194 orë (8 ditë), inkubim në lëng. Për fenotipin e shtamit P32, inkubuar në kushte frigoriferike 4°C përcaktimi i vitalitetit vazhdoi çdo 24 orë për 491 orë (20 ditë), inkubiminë lëng në total. Numërimi i kolonive të zhvilluara u krye pas 48 orësh inkubim të pjatave në 37°C anaerobiozë. U përcaktuan grada Briks dhe pH-i i lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet lëng rezistente për kohë të ndryshme inkubimi, në 37°C dhe në 4°C. U krye përcaktimi i Briks-it dhe pH-it të lëngut të pahapur (origjinal pa inokul) në amballazhin e tij origjinal ruajtur në 4°C i cili shërbeu si provë kontrolli për të krahasuar parametrat. Nga rezultatet e marra u vërejt se lëngu me inokul me fenotipet probiotikë ruajtur në 4°C, paraqiti një qëndrueshmëri të lartë, sepse pothuajse të gjithë shtamet për kohën e studimit prej 194 orësh (8 ditë), mbajtën një përqëndrim qelizor relativisht konstant. Për P32 për të cilin ky studjim u zgjat deri në 491 orë(20 ditë), u vërejt se në fund të kësaj faze studimi, ky shtam kishte një nivel qelizor pak mbi minimumin e lejuar të qelizave vitale të probiotikëve >106. Ndërsa në lëngun e boronicës inkubuar në 37°C, shtamet paraqitën nivele të ndryshëm rezistence, ku shtami më rezistent rezultoi B.animalis.subsp.lactis RA18 me një kohë mbijetese prej 194 orësh, ndërsa ai më i ndjeshëm rezultoi B.bifidum B1958 me një kohë mbijetese prej 72 orësh.

Nga rezultatet e mbijtesës të marra në 37°C u parashikua mbijetesa për sejcilin shtam në 4°C nëpërmjet aplikimit të konceptit të raportit midis kohëve të reduktimit decimal me 2 log (2D) kur përqëndrimi qelizor arriti vlerën minimale për të dyja temperaturat e ruajtjes 106CFU/mL. Për rastin në studim u përcaktua raporti i kohës së reduktimit decimal 2D për P32 në lëng ruajtur në temperaturë 37°C dhe 4°C, duke marrë si faktor cilësie të matshëm dhe të ndryshueshëm përqëndrimin qelizor të shtamit inokuluar në lëng, ky raport rezultoi 8, që do të thotë se jetgjatësia e lëngut të boronicës me këtë shtam ruajtur në 4°C është 8 herë më e lartë se jetgjatësia e tij i ruajtur në 37°C. Shtamet e tjerë paraqitën një jetgjatësi të parashikuar në nivele të ndryshme, ku lëngu me B.animalis.subsp.lactis RA18 u parashikua të kishte një jetgjatësi prej afro 7 javësh në 4°C. Ndërsa shtamet e tjera paraqitën një jetgjatësi mesatare dhe të ulët. Gjithashtu nga të njëjtat kurba të mbijetesës në lëng boronice të fenotipeve në të dyja temperaturat u përcaktua për sejcilin shtam, parametri D dhe z. Përckatimi i këtyre parametrave mbështeti objektivisht rezultatet mbi nivelin e rezistencës së shtameve në kushtet e sipërpërmendura.

82

6.2 Hyrje

Është sygjeruar se lëngu i frutave është një mjedis ideal për mbartjen e përbërësave fusnksionalë të ushqimeve si psh probiotikët. Njëra nga arsyet është se koha e qëndrimit në stomak të lëngjeve të frutave është e shkurtër, kështu që bakteret nuk janë të ekspozuara për kohë të gjatë ndaj kushteve acide të pafavorshme të stomakut. Këto produkte janë të përshtatshëm për ato konsumatorë të cilët nuk mund të konsumojnë produkte me bazë bulmeti ose thjeshtë për ato konsumatorë që parapëlqejnë freskinë e lëngjeve të frutave. Konsumimi i rekomanduar për mikroorganizmat probiotikë të gjallë është 107 CFU/mL (Vinderola & Reinheimer, 2000; Pereira et al., 2011) dhe ai minimal është 106 CFU/gramë ose mililitër të produktit probiotik (Agrawal, 2005; Tamime et al., 1995).

Sheehan et al., (2007), studjuan stabilitetin e kulturave probiotike si suplemente në lëngjet e frutave, duke egzaminuar tolerancën e tyre karshi aciditetit dhe rezistencën e tyre teknologjike. U monitorua mbijetesa e shtameve të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp për 12 javë në 4°C në lëngun e portokallit (LP) pH 3.65, lëngun e ananasit (LA) pH 3.4, dhe lëngun e boronicës së kuqe (LB) pH 2.5. Të gjithë mikroorganizmat e studjuar mbijetuan më gjatë në LP dhe LA krahasuar me LB. B. lactis Bb-12 nuk paraqiti ulje të ndjeshme në vitalitet përgjatë katër javëve të para në LP dhe pati një vitalitet mbi 106 CFU mL−1 për të paktën gjashtë javë.

Ding & Shah (2008), studjuan mbijetesën e 5 shtameve Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium longum, B. lactis type Bi-04 dhe B. lactis type Bi-07 të mikroinkapsuluara dhe jo, në lëng portokalli (pH 2.81) dhe molle (2.97) në 4°C deri në 6 javë. Shtamet jo të mikroinkapsuluara e humbën vitalitetin e tyre brënda 5 javëve. Për të dy lëngjet rezultatet ishin të ngjashme. Megjithatë shtamet e Lb. acidophilus dhe B. longum paraqitën mbijetesë më të lartë sesa gjithë shtamet e tjera, probabilisht për shkak të tolerancës së tyre ndaj mjedisit acid. Rezultoi një vitalitet >105 CFU/mL ende pas javës së gjashtë. U studjua edhe ndryshimi i pH-it dhe Briksit, ku u vërejtën ndryshime të papërfillshme në vlera për të gjithë kohën e studimit.

Shah et al., (2010), të cilët midis probiotikësh të tjerë përdorën edhe B lactis HN001, inokuluar në një model lëngu pH 3.8 për 6 javë në 4°C. Studimi i mbijetesës së tij tregoi, rënie me 1 shkallë logaritmike pas javës së parë, me 3.1 shkallë logaritmike pas javës së dytë, dhe me nga 1 shkallë logaritmike tjetër për javët në vazhdim, pas javës së gjashtë ishte <10 CFU/mL. pH-i i lëngut model në javën e parë mbeti konstant dhe deri pas javës së gjashtë ra me 0.4 nga pH-i fillestar. Briksi i lëngut model në javën e parë ra me 0.7 dhe deri në javën e fundit ra me 2.7 nga Briksi fillestar.

Sawaminee et al., (2011), studjuan mbijetesën e Bifidobacterium longum NCIMB 8809 përgjatë ruajtjes në të ftohtë për 6 javë në një matricë model, bazuar në të u ndërtua një model matematikor duke përshkruar mbijetesën e qelizave në funksion të pH-it (3.2–4), acidit citrik (2–15 g/l), proteinave (0–10g/l) dhe fibrave dietike (0–8 g/l). Nëpërmjet koefiçentit të regresionit u konkludua se të katër faktorët patën një efekt negativ mbi uljen e numrit të qelizave [log10N0 (inokuli fillestar) — log10N6 (java e gjashtë)], ku pH-i dhe acidi citrik ishin ato që ndikonin më shumë.

Moussavi (2012), studjoi mbijetesën e Lactobacillus rhamnosus GG (LG), Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (LR), Bifidobacterium animalis subsp lactis

83

Bb12 (Bb) dhe Propionibacterium jensenii 702 (PJ), në lëng portokalli në 4°C si edhe ujë të pijshëm në 4°C dhe 23°C. Përqëndrimi qelizor i Bb inokuluar në lëng portokalli në 4°C, qëndroi i pandryshueshëm deri në 4 javë e më pas ra me 10% për 8 javë, ndërsa në ujë të pijshëm në 4°C, përqëndrimi i tij qelizor qëndroi konstant për 56 ditët e studimit. Në rastin e ujit në 23°C vitaliteti ra në mënyrë të theksuar deri në nivelin limit të pranueshmërisë 106 CFU/mL pas javës së parë të ruajtjes. Nga katër kulturat probiotike të studjuara vetëm Bb mbajti një vitalitet të lartë në të dy produktet si lëng portokalli ashtu edhe ujë të pijshëm përgjatë 8 javëve studim. Përgjatë periudhës së studimit u konkludua se si vlerat e pH-it ashtu edhe të Briksit si të lëngut me inokul ashtu edhe të kontrollit ishin të qëndrueshme.

6.2.1 Jetëgjatësia e produktit probiotik

Për ushqimet probiotike, në mënyrë që ato të ushtrojnë efektin pozitiv të dëshiruar, numri i qelizave të gjalla probiotike, të pranishme në ushqim duhet të mbahet në një nivel të përshtatshëm përgjatë jetgjatësisë së produktit si i vetëm. Niveli minimal i pranishëm në momentin e konsumimit të ushqimit probiotik duhet të jetë 106 CFU/mL. Konsumatorët gjithnjë e më shumë kërkojnë cilësi të lartë të qëndrueshme të produkteve ushqimore, si edhe kanë pritshmërinë se kjo cilësi do të mbahet në nivel të lartë gjatë periudhës nga blerja deri në konsumim. Kjo pritshmëri nuk lidhet vetëm me faktin që ushqimi duhet të qëndrojë i sigurt, por gjithashtu edhe me nevojën për të minimizuar ndryshime të padëshirueshme në parametrat sensorialë.

Jetë-gjatësia përkufizohet si koha gjatë së cilës produkti ushqimor do të:

(i) Qëndrojë i sigurt; (i i ) Të jetë i tillë që të ruaj disa karakteristika të dëshiruara sensoriale, kimike,

fizike dhe mikrobiologjike; (i i i ) Të përputhet me deklarimin në etiketë mbi vlerat ushqyese;

Kur ruhet në kushtet e rekomanduara.

Për jetëgjatësinë janë shumë të rëndësishme dhe kushtet e ruajtjes së një produkti. Përgjatë zinxhirit të transportimit është i zakonshëm abuzimi termik, ndërsa në nivel shtëpiak ky abuzim është shumë i zakonshëm. Për këtë është shumë e rëndësishme të përcaktohet reagimi i produktit gjatë ruajtjes në kushte të ndryshme, dhe duhet të përcaktohet mirë mekanizmi i proçeseve të degradimit të produktit, të cilat mund të jenë shumë komplekse në pjesën më të madhe të ushqimeve, veçanërisht në ato ushqime me përbërje shumë komponentëshe.

Në fund të jetëgjatësisë produkti ushqimor probabilisht shfaq ndryshime të karakteristikave si në shije, aromë, teksturë ose pamje të cilat janë të papranueshme ose të padëshirueshme (Winger, 2000; Smittle & Cirigliano, 2001). Singh, (2000) ka shpjeguar se faktorët që shkaktojnë ndryshime mund të përfshijnë, reaksione kimike, kryesisht për shkak ose të oksidimit ose reaksioneve Maillard (Owusu-Apenten, 2005), reaksione mikrobiale (Jay et al., 2005), si edhe reaksione bio-kimike të shkaktuara prej reaksioneve katalitike nga enzima endogjene mbi humbjen e cilësisë si psh errësimi enzimatik. Shkaqe të tjera mund të jenë lipoliza, proteoliza (van Boekel & Walstra, 1995; van Boekel, 2007), reaksione biokimike dhe fizike duke shkaktuar agregim, sedimentim e si rrjedhim humbje cilësie (Walstra, 2003).

84

6.2.1.1 Kinetika e testimit të jetgjatësisë Bazuar në njohuritë mbi mekanizmat e degradimit të ushqimit, shkencëtarët kanë

zhvilluar metoda për të kundërvepruar mbi këto humje cilësie (Winger, 2000). Rendi në të cilin ndodhin këto reaksione, efekti i temperaturës, ujit dhe moria e parametrave të tjerë, janë bërë faktorë karakterizues duke kontribuar në shkencën e studimeve të jetëgjatësisë së përshpejtuar. Në të tilla studime, rendi i ndryshimeve varet nga temperatura dhe rritet në temperatura më të larta ngjashmërisht me shumicën e reaksioneve fiziko-kimike.

Parashikimi i jetgjatësisë për produktet ushqimore mund të bazohet mbi aplikimin e

principeve të kinetikës së reaksioneve kimike të varur nga temperatura lidhur me përbërjen e produktit si edhe faktorëve mjedisorë si, temperatura, lagështia, atmosfera, etj… Baza e përdorimit parashikues të kinetikave të reaksioneve, është se varësia midis parametrit të ndryshueshëm të matshëm dhe kohës duhet të jetë varësi lineare ose të ndjekë një model të përkufizuar qartë. Labuza, (1979) ka raportuar se humbja e cilësisë ndjek ekuacionin (6.0):

dQ/dt = k(QA )n (6.0)

ku dQ/dt është ndryshimi i faktorit cilësor të matshëm A, me kohën, k është

konstantja e shpejtësisë së reaksionit në njësitë përkatëse, dhe n është rendi i reaksionit kimik të faktorit të cilësisë A. Rendi i reaksionit për pjesën më të madhe të atributeve cilësore në produktet ushqimore është ose zero, ose i rendit të parë ose të dytë. Në reaksione të rendit zero, shpejtësia e humbjes së faktorit të cilësisë është konstante ose lineare dhe kurba do të rezultojë lineare. Reaksionet e rendit të parë nuk janë linear por varen nga sasia e faktorit të cilësisë që mbetet në produkt në kohë. Në këto tipe reaksionesh të strukturuar, një kurbë lineare parashikuese është me koordinata kosinusoidale semilogaritmike. Tipikisht reaksione të rendit të parë janë: (1) rancidimi, (2) rritja dhe vdekja mikrobike, (3) produktet e prodhimit mikrobial, (4) humbja e vitaminave në produktet e thata dhe (5) humbja e cilësisë së proteinave. Humbja e vitaminës C në preparate të lëngshme është quajtur reaksion i rendit të dytë sepse varet nga niveli si i acidit askorbik ashtu edhe i oksigjenit.

6.2.1.2 Kurbat e mbijetesës, parametrat D dhe z.

Në literaturë egzistojnë shumë raporte eksperimentale dhe teori mbi konceptin e parametrave D dhe z. Zakonisht ky koncept është aplikuar në funksion të rezistencës termike. Koha e reduktimit decimal (vlera-D), njëri nga parametrat që përcakton shkatërrimin e mikroorganizmave, përkufizohet si koha në minuta e nevojshme për të shkatërruar 90% të qelizave në një temperaturë të dhënë, ose thënë ndryshe koha e nevojshme për të humbur në përqëndrimin qelizor një shkallë logaritmike për mikroorganizmin në një temperaturë të dhënë. Nga ana tjetër, vlera-z e një mikroorganizmi përkufizohet si rritja e temperaturës në (° C) e nevojshme për një ulje prej 10 herësh (1log) në vlerat e D-së.

Së fundmi këto koncepte janë aplikuar në presionin hidrostatik për inaktivizimin e

kontaminimit mikrobial në djathë (O’Reilly et al., 2000) si edhe në mekanizma të inaktivizimit me nxehtësi të Campylobacters thermofil (Nguyen et al., 2006).

85

Gjithashtu në një studim tjetër të (Li et al., 2010), është studjuar një mekanizëm se si probiotikët mbijetonin në kushtet e GIT. Koncepti i Dacid-, Dbile-, dhe vlerat e tyre respektive të parametrit (z), u aplikuan për të vlerësuar shtame të ndryshme të Bifidobacterium.spp në lidhje me rezistencën e tyre ndaj pH-it dhe pranisë së kriprave biliare, përkatësisht. Përcaktimi i këtyre parametrave u përdor edhe në studimin tonë sepse jep mundësinë për të kryer përcaktim objektiv të rezistencës së bifidobaktereve në lëngun e boronicës në 37°C dhe 4°C.

Parametri D mund të shprehet si:

𝐷𝐷 = 𝑡𝑡𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙0−𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑡𝑡

(6.1)

ku t; është koha në të cilin ndodh reduktimi i numrit të qelizave me 1log, log N0 dhe logNt janë përkatësisht logaritmi i përqëndrimit qelizor në kohën t0 dhe t.

Parametri z mund të shprehet:

𝑧𝑧 = 𝑇𝑇2−𝑇𝑇1

𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙10𝐷𝐷2𝐷𝐷1 ose 𝑧𝑧 = (𝑇𝑇2−𝑇𝑇1)

log𝐷𝐷1−𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝐷𝐷2 (6.2)

Ku T2 dhe T1 janë përkatësisht temperaturat për të cilat është kryer paraprakisht përcaktimi i kohës së reduktimit decimal D2 dhe D1

6.3 Materiale dhe Metoda Provës së mbijetesës në lëngun e boronicës në dy temperatura inkubimi 4°C dhe 37°C ju

nënshtruan fenotipet e adoptuara nga proçedura e përshkruar në Kapitullin 5 që janë paraqitur në Tabelën 6.1.

Tabela 6.1 Shtamet e përdorura në provën e mbijetesës në lëng në 4°C dhe 37°C







7 B2150 B. breve

8 B609 B. breve


10 B1958 B. bifidum

6.3.1. Studimit i vitalitetit në lëng në dy temperatura inkubimi 4°C dhe 37°C të fenotipeve të adoptuara

• Inokulimi i fenotipeve në lëngun e boronicës koha T0 Pas inkubimit në 37°C anaerobiozë, për 6 tuba me 10mL TPY + fenotip i adoptuar

për çdo shtam, u krye centrifugimi 6000rpm dhe shpëlarja e biomasës me solucion fiziologjik 0.9%, kalimi i biomasës së 6 tubave në 6mL lëng boronice, më pas kalimi i

86

këtij suspensioni homogjen në 6 tuba konikë me 50mL lëng boronice. U kryen hollimet limite nga 100 deri në 10-8 dhe kultivim me derdhje në TPY agar pH 7.0. Pjatat e Petrit u inkubuan në 37°C në anaerobiozë, për të përcaktuar saktësisht përqëndrimin qelizor të inokulit për çdo fenotip në kohën T0. Tre tuba konikë paralelë me lëng boronice të inokuluar për sejcilin nga të 10-të fenotipet e adoptuara, u inkubuan në kushte aerobike në 37°C dhe 3 tuba konikë të tjerë u vendosën në 4°C.

• Përcaktimi i vitalitetit për kohët e ndryshme të inkubimit në lëng boronice

Për fenotipet inkubuar në temperaturën 37°C dhe 4°C , përcaktimi i vitalitetit u

krye menjëhere pas 4 orëve të para, T1=4 orë, dhe më pas çdo 24 orë për të gjithë kohën në vazhdim, konkretisht ky përcaktimi u krye me anë të hollimeve limite nga tubat konikë përkatës dhe kultivimit në pjatë Petri me derdhje në TPY pH 7.0, për kohët T2=24 orë, T3=48 orë, T4=72 orë, T5=96 orë, T6=120 orë, T7=144 orë, T8=170 orë, dhe T9=194 orë (8 ditë), inkubimi në lëng ( Figura 6.1).

Për fenotipin e shtamit P32, inkubuar në kushte frigoriferike 4°C përcaktimi i

vitalitetit vazhdoi çdo 24 orë për 491 orë (20 ditë), inkubimi në lëng në total. Numërimi i kolonive të zhvilluara u krye pas 48 orësh inkubim të pjatave në 37°C anaerobiozë.

Figura 6.1 Marrja e alikuotës për kryerjen e hollimeve limite për përcaktimin e vitalitetit të disa shtameve pas adoptimit në lëngun e boronicës në kohë të ndryshme për inkubimin në 37°C dhe 4°C

6.3.2 Percaktimi i gradës Briks dhe pH-it të lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet në kohë të ndryshme inkubimi

Për të përcaktuar parametrat e lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet lëng

rezistente për kohë të ndryshme inkubimi, u morën tubat konikë nga inkubimi në 37°C dhe nga ruajtja në kushte frigoriferike në 4°C.

• Përcaktimi i gradës Briks. Për të përcaktuar gradën Briks u përdor refraktometër elektronik (ATAGO) Figura 6.2. U krye përcaktimi i Briks-it të lëngut të pahapur (origjinal pa inokul) në amballazhin e tij origjinal ruajtur në 4°C i cili shërbeu si provë kontrolli për të krahasuar parametrat. U ndez refraktometri, me pas u krye tarimi i tij me ujë të distiluar. U bë paraprakisht matja e temperaturës së

87

mostrave dhe përcaktimi u krye në 20°C. Konkretisht u bë, pipetimi i 1mL lëng nga kampionet me lëng+fenotip nga tubat konikë përkatës dhe u krye leximi i vlerës. Pas çdo matjeje u krye proçedura e tarimit me ujë të distiluar. Për një mostër u kryen tre përcaktime paralele të pavarura nga njëra tjetra. Kjo proçedurë u krye për të gjitha kampionet, konkretisht: B1279 (T1=24 orë), B2339 (T1=24 orë), B609 (T5=168 orë), B2150 (T5=168 orë), MB16 (T5=168 orë), B1958 (T7=194orë), RA18 (T7=194orë), M354 (T7=194orë), MB29 (T7=194orë), P32 (T27=491orë), Temperatura e Inkubimit, 37°C dhe 4°C.

Figura 6.2 Përcaktimi i gradës Briks për lëngun me inokul të shtameve të ndryshme dhe për

lëngun origjinal me anë të refraktometrit ATAGO • Percaktimi i pH-it. U krye përcaktimi i pH-it të lëngut të pahapur (origjinal pa

inokul) në amballazhin e tij origjinal ruajtur në 4°C i cili shërbeu si provë kontrolli për të krahasuar parametrat. Gjithashtu për të gjitha mostrat nga të njëjtat tuba konikë që u krye përcaktimi i gradës Briks, u krye edhe matja e pH-it me pH-metër (Hana, Singapore) sipas proçedurës së zakonshme.

6.4 Rezultate 6.4.1 Vitaliteti i fenotipeve në lëngun e boronicës ruajtur në 4°C

Në grafikun 6.1 dhe 6.2 është paraqitur ecuria e mbijetesës së fenotipeve inokuluar në lëngun e boronicës, në 4°C aerobiozë, për një periudhë kohore prej 194 orësh (8 ditësh). Përcaktimi i vitalitetit u krye pas 4, 24, 48, 53, 72, 96, 120, 144, 146, 170 dhe 194 orësh.

Grafiku 6.1 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.pseudocatenulatum (B2339, B1279), B.breve

(B2150, B609) dhe B.bifidum (B1958), 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C.

0123456789

10

(T0) 4 24 48 53 72 96 120 144 146 170 194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

B2339B1279B2150B609B1958

88

Nga grafiku 6.1, rezulton se fenotipet kanë mbijetuar në lëngun e boronicës në 4°C në një mënyrë relativisht të ngjashme. Konkretisht përqëndrimi qelizor i tyre ka rënë për B.pseudocatenulatum B2339 dhe B1279 përkatësisht me 0.3 dhe 0.9 shkallë logaritmike pas 194 orësh, për B.breve B2150 dhe B609 ka rënë përkatësisht me 0.3 dhe 0.85 shkallë logaritmike pas 194 orësh dhe për B.bifidum (B1958), ka rënë përkatësisht me 0.64 shkallë logaritmike pas 194 orësh ruajteje në lëng boronice në 4°C.

Grafiku 6.2 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.animalis.subsp.lactis (MB29, RA18, M354, P32),

dhe B.thermofilum (MB16), 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C.

Në grafikun 6.2 paraqitet mbijetesa për pesë fenotipet e tjera në të njëjtat kushte ku vërehet se për B.animalis.subsp.lactis MB29 përqëndrimi qelizor ka rënë me 0.5 shkallë logaritmike, për RA18 me 0.4 shkallë logaritmike, për M354 me 1 shkallë logaritmike, për P32 me 0.4 shkallë logaritmike, për B.thermofilum MB16 përqëndrimi qelizor ka rënë me 0.4 shkallë logaritmike, për 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C. 6.4.2 Vitaliteti i shtameve në lëngun e boronicës ruajtur në 37°C

Në grafikun 6.3 dhe 6.4 është paraqitur ecuria e mbijetesës së fenotipeve inokuluar

në lëngun e boronicës, në 37°C aerobiozë, për një periudhë kohore prej 194 orësh (8 ditësh). Përcaktimi i vitalitetit u krye pas 4, 24, 48, 53, 72, 96, 120, 144, 146, 170 dhe 194 orësh.

Grafiku 6.3 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.pseudocatenulatum (B2339, B1279), B.breve

(B2150, B609) dhe B.bifidum (B1958), 194 orë në lëngun e boronicës në 37°C.

0123456789

10

(T0) 4 24 48 53 72 96 120 144 146 170 194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

MB29RA18M354P32MB16

0123456789

(T0) 4 24 48 53 72 96 120 144

log

cfu/

ml l

ëng

Koha orë

B2339B1279B2150B609B1958

89

Nga grafiku 6.3 dhe 6.4, ku është paraqitur mbijetesa e fenotipeve në lëngun e boronicës në 37°C për 194 orë, ndryshe nga rezultatet në 4°C, këtu fenotipet kanë reaguar relativisht ndryshe për sa i përket rënies së përqëndrimit qelizor të tyre. Konkretisht fenotipi i cili ka rezistuar më pak se të 10 fenotipet e studjuar është B.bifidum (B1958) i cili ka pësuar një rënije të përqëndrimit qelizor me 8.4 shkallë logaritmike pas 72 orësh, më pas vijën B.breve B609 dhe B2150 me një rënije përkatësisht prej 5.0 dhe 4.5 shkallë logaritmike pas 72 orësh dhe përqëndrimi i tyre qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 120 orësh. Për B.pseudocatenulatum B2339 dhe B1279 rënija e përqëndrimit qelizor rezultoi përkatësisht me 4.3 dhe 1.8 shkallë logaritmike pas 72 orësh, dhe përqëndrimi i tyre qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 144 orësh në lëng boronice në 37°C.

Grafiku 6.4 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të B.animalis.subsp.lactis (MB29, RA18, M354, P32),

dhe B.thermofilum (MB16), 194 orë në lëngun e boronicës në 37°C. Në Grafikun 6.4, paraqitet mbijetesa për pesë fenotipet e tjera në të njëjtat kushte.

Konkretisht B.animalis.subsp.lactis M354 ka pësuar një rënije të përqëndrimit qelizor prej 6.3 shkallë logaritmike pas 72 orësh dhe përqëndrimi i tij qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 96 orësh; më pas vjen B.thermofilum MB16 me një rënije prej 3.6 shkallë logaritmike pas 72 orësh dhe përqëndrimi i tij qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 120 orësh; për B.animalis.subsp.lactis MB29 dhe P32 rënija e përqëndrimit qelizor rezultoi përkatësisht me 2.9 dhe 2.8 shkallë logaritmike pas 72 orësh, dhe përqëndrimi i tyre qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 144 orësh; për B.animalis.subsp.lactis, RA18 rënija e përqëndrimit qelizor rezultoi 0.15 shkallë logaritmike pas 72 orësh dhe përqëndrimi i tij qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 194 orësh në lëng boronice në 37°C.

a) b) Grafiku 6.5 Rënija e vitalitetit të fenotipeve në lëngun e boronicës a) 4°C për 194 orë, b) 37°C për 72

orë

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

(T0) 4 24 48 53 72 96 120 144 146 170 194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

MB29RA18M354P32MB16

3 4 5 5 5 7 8 11 11 13

0

20

40

60

80

100

B215

0B2

339

MB1

6P3

2RA

18M

B29

B195

8B6

09B1

279

M35

4

RV(%

)

2

2236 36

4458 59

6977

100

0

20

40

60

80

100

RA18

B127

9M

B29

P32

MB1

6B2

150

B233

9B6

09M

354

B195

8

RV (%

)

90

Në Grafikun 6.5 a), paraqitet rënija e vitaliteti për çdo fenotip pas 194 orësh në 4°C në lëngun e boronicës në aerobiozë. Vihet re se kryesisht fenotipet kanë paraqitur një përqëndrim konstant me rënije vitaliteti relativisht të ulët. Rënije më të lartë të vitalitetit në këto kushte, kanë paraqitur fenotipet e B.animalis.subsp. lactis M354 prej 13 %, B.breve B609 dhe B.pseudocatenulatum B1279 prej 11%.

Shtamet e tjera kanë një rënije vitaliteti të ngjashme që varjon nga 3-8%. Në Grafikun 6.5 b), paraqitet rënija e vitaliteti për çdo fenotip pas 72 orësh në 37°C në lëngun e boronicës në aerobiozë. Në të kundër nga reagimi në 4°C, rënija e vitaliteti për shtamet në temperaturën e inkubimit në 37°C është shumë e ndryshme.

Rënije më të lartë të vitalitetit në këto kushte ka paraqitur B.bifidum B1958 prej 100 % pas 72 orësh, më pas vijën B.animalis.subsp. lactis M354 prej 77%, B.breve B609 prej 69%, B.pseudocatenulatum B2339 prej 59%, B.breve B2150 prej 58%, B.thermofilum MB16 prej 44 %, B.animalis.subsp. lactis P32 dhe MB29 me një rënije vitaliteti të njëjtë prej 36%, B.pseudocatenulatum B1279 prej 22% dhe B.animalis.subsp. lactis RA18 prej 2%.

Në Figurën 6.3 paraqiten rezultatet e marra nga mbijetesa e shtameve në lëngun e boronicës për kohë të ndryshme inkubimi për dy temperaturat 4°C dhe 37°C të ruajtjes

Figura 6.3 Mbijetesa e shtameve në lëngun e boronicës për kohë të ndryshme inkubimi për dy temperaturat 4°C dhe 37°C të ruajtjes

Në figurën 6.4 paraqiten format qelizore të shtameve të përdorura në këtë provë në kohë të ndryshme inkubimi të marra nga vëzhgimi i preparateve të tyre me mikroskop.

91

a) b)

c) d)

e) f)

g) h)

i) j) Figura 6.4 Format qelizore të shtameve të përdorura në këtë provë në kohë të ndryshme inkubimi nga

vëzhgimi i preparateve në mikroskop: a) B.pseudocatenulatum B1279 T1, b) B2339 T2 (37°C); c) B.breve B609 T7, d) B2150 T5; e) B.bifidum B1958 T4, f) B.thermofilum MB16 T7; g) B.animalis.susp.lactis M354

T4, h) RA18 T7, i) MB29 T4 dhe j) P32 T23

92

6.4.3 Krahasimi i kurbave të mbijetesës së shtameve në lëng në 4°C dhe 37°C

a) b) Grafiku 6.6 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve të: a) B.pseudocatenulatum B2339, b) B.

pseudocatenulatum B1279, 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C

Në Grafikun 6.6, paraqiten kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C për fenotipet; a) B.pseudocatenulatum B2339 dhe b) B. pseudocatenulatum B1279).

a) B.pseudocatenulatum B2339, pas 4 orë inkubim në 4°C paraqet një rritje të numrit të qelizave me 1 shkallë logaritmike, ndërsa në 37°C numri i qelizave pothuajse qëndron konstant me një ulje fare të lehtë. Pas 24 orë inkubim për të dyja temperaturat përqëndrimi qelizor është shumë i ngjashëm. Diferenca e mbijetesës fillon dhe shfaqet pas 48 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re rënije e numrit të qelizave. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të theksuar të numrit të qelizave pas 53 -72 orë inkubim dhe më pas ndjek një kinetikë vdekjeje në formën e shkallëve për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 144 orë.

b) B.pseudocatenulatum B1279, për 24 orët e para për të dyja temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C, fenotipi paraqet një përqëndrim qelizor konstant të njëjtë me atë të inokulit fillestar. Diferenca e mbijetesës fillon dhe shfaqet pas 53 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re rënije shumë e vogël e numrit të qelizave prej 0.1 shkallë logaritmike. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C pas 72 orëve pëson një rënije graduale prej 1 shkallë logaritmike për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije graduale të numrit të qelizave pas 53 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht graduale për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 144 orë.

c) d) Grafiku 6.7 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve: c) B.animalis.subsp.lactis MB29, d)

B.animalis.subsp.lactis RA18, 194 orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

B2339

(4°C)(37°C)

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

B1279

(4°C)(37°C)

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

MB29

(4°C)

(37°C)

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

RA18

(4°C)(37°C)

93

Në Grafikun 6.7, paraqiten kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C për fenotipet; c) B.animalis.subsp.lactis MB29 dhe d) B.animalis.subsp.lactis RA18.

a) B.animalis.subsp.lactis MB29, të dyja kurbat e mbijetesës si ajo e 4°C ashtu edhe kurba e 37°C, për 48 orët e para të inkubimit paraqesin rrjedhë identike. Diferenca e mbijetesës fillon dhe shfaqet pas 53 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re rënije e numrit të qelizave prej 1 shkalle logaritmike. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të theksuar të numrit të qelizave pas 48 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht graduale për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 144 orë.

b) B.animalis.subsp.lactis RA18, të dyja kurbat e mbijetesës si ajo e 4°C ashtu edhe kurba e 37°C, për 96 orët e para të inkubimit paraqesin rrjedhë identike duke mbajtur përqëndrimin qelizor thuajse konstant. Diferenca e mbijetesës fillon dhe shfaqet pas 120 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re rënije e numrit të qelizave prej 1 shkalle logaritmike. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh duke paraqitur një rënije të lehtë të përqëndrimit qelizor. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të theksuar të numrit të qelizave pas 144 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht graduale për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 194 orë.

e) Grafiku 6.8 Kurbat e mbijetesës së fenotipit: e) B.animalis.subsp.lactis M354, 194 orë në lëngun e

boronicës në 4°C dhe 37°C

Në Grafikun 6.8, paraqiten kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C dhe

37°C për fenotipin; e) B.animalis.subsp.lactis M354. Të dyja kurbat e mbijetesës si ajo e 4°C ashtu edhe kurba e 37°C, për 4 orët e para të inkubimit paraqesin rrjedhë identike. Diferenca e mbijetesës fillon dhe shfaqet menjëherë pas 24 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re një rënije e menjëhershme e numrit të qelizave prej 1.6 shkallësh logaritmike. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante duke pësuar një rënije prej 1 shkalle logaritmike për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të theksuar të numrit të qelizave pas 24 orësh inkubim, duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht të përshpejtuar për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 96 orë.

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120144146170194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

M354

(4°C)(37°C)

94

Grafiku 6.9 Kurbat e mbijetesës së fenotipit: j) B.animalis.subsp.lactis P32, 491 orë në lëngun e

boronicës në 4°C dhe 37°C.

Në Grafikun 6.9 paraqiten kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C për fenotipin; j) B.animalis.subsp.lactis P32. Për këtë fenotip studimi i kurbës së mbijetesës në 4°C është kryer për një kohë më të gjatë prej 491 orësh (20 ditë). Të dyja kurbat e mbijetesës si ajo e 4°C ashtu edhe kurba e 37°C, për 24 orët e para të inkubimit paraqesin një rrjedhë të ngjashme. Diferenca e mbijetesës fillon dhe shfaqet pas 53 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re një rënije e e numrit të qelizave prej 1 shkalle logaritmike. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante duke pësuar një rënije prej 1 shkalle logaritmike për kohën prej 297 orësh dhe një rënije prej 2 shkallësh logaritmike pas 491 orësh ruajtjeje në 4°C. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të theksuar të numrit të qelizave pas 53 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht të përshpejtuar për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 144 orë.

f) g) Grafiku 6.10 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve: f) B.breve B2150, g) B.breve B609, 194 orë në lëngun

e boronicës në 4°C dhe 37°C.

Në Grafikun 6.10, paraqiten kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C për fenotipet; f) B.breve B2150, g) B.breve B609.

f) B.breve B2150, ky fenotip dallon menjëherë sepse edhe pse përqëndrimi qelizor i

inokulit fillestar në lëng për të dyja temperaturat e ruajtjes ka qënë i njëjtë, kurbat e tij si ajo 4°C ashtu edhe kurba e 37°C ndahen menjëherë që në 4 orët e para të inkubimit, ku për kurbën e 4°C vihet një rritje e lehtë e numrit të qelizave, ndërsa për kurbën e 37°C vihet re një përqëndrim konstant krahasuar me T0. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit

0123456789

10

T0 4 24 29 48 53 72 77 96 120

144

146

170

194

207

225

231

249

258

273

282

297

303

323

347

371

443

467

491

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

P32

(4°C) (37°C)

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

B2150

(4°C)

(37°C)

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

B609

(4°C)(37°C)

95

37°C paraqet një rënije graduale të numrit të qelizave që pas 4 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht graduale për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 120 orë.

g) B.breve B609, vërehet i njëjti fenomen si tek B.breve B2150, kurbat e tij si ajo

4°C ashtu edhe kurba e 37°C ndahen menjëherë që në 4 orët e para të inkubimit, ku për kurbën e 4°C vihet një rritje e lehtë e numrit të qelizave, ndërsa për kurbën e 37°C vihet re një rënije e lehtë e numrit të qelizave prej 0.1 shkallësh logaritmike. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është relativisht variabël dhe ka një rënije prej 1 shkalle logaritmike për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije në formën e shkallëve të numrit të qelizave që pas 24 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje relativisht të përshpejtuar, për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 120 orë.

h) i) Grafiku 6.11 Kurbat e mbijetesës së fenotipeve: h) B.thermofilum (MB16), i) B.bifidum (B1958), 194

orë në lëngun e boronicës në 4°C dhe 37°C. Në Grafikun 6.11, paraqiten kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C

dhe 37°C për fenotipet; h) B.thermofilum (MB16) dhe i) B.bifidum (B1958). h) B.thermofilum (MB16), për 48 orët e para për të dyja temperaturat e ruajtjes 4°C

dhe 37°C, fenotipi paraqet një përqëndrim qelizor lehtësisht variabël. Diferenca e mbijetesës midis dy kurbave bëhet e dukshme pas 48 orë inkubim, ku për kurbën e 37°C vihet re një rënije prej 2 shkallësh logaritmike nga 48-53 orë. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C pëson një rënije graduale prej < 1 shkallë logaritmike për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të shpejtë të numrit të qelizave pas 48 orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje të përshpejtuar, për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 120 orë.

g) B.bifidum (B1958), tek ky fenotip vërehet një rënije e menjëhershme tek kurbat e

tij si ajo 4°C me 0.3 shkallë logaritmike, ashtu edhe kurba e 37°C me 0.5 shkallë logaritmike, që pas 4 orëve të para. Në vazhdim kurba e mbijetesës për temperaturën e ruajtjes 4°C është pothuajse konstante dhe ka një rënije prej 1 shkalle logaritmike për të gjithë kohën e studimit prej 194 orësh. Kurba e mbijetesës për temperaturën e inkubimit 37°C paraqet një rënije të menjëhershme të numrit të qelizave që pas 4

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

MB16

(4°C)(37°C)

0123456789

10

T0 4 24 48 53 72 96 120

144

146

170

194

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

B1958

(4°C)(37°C)

96

orësh inkubim duke ndjekur një kinetikë vdekjeje të përshpejtuar për të humbur më pas vitalitetin total në kohën e inkubimit 72 orë.

6.4.4 Vlerat e parametrave D dhe z për shtamet në dy temperaturat e ruajtjes Nga grafikët e kurbave të mbijetesës (Grafikët 6.6 deri 6.11), për të gjithë fenotipet u

përllogaritën vlerat e parametrave D për të dyja temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C si dhe z, sipas ekuacioneve (6.1) dhe (6.2). Nuk qe e mundur të përllogariteshin këto parametra për fenotipet B.animalis.subsp.lactis RA18 dhe B.thermofilum MB16, sepse në ruajtjen në 4°C për kohën e studimit prej 194 orësh, nuk u vërejt rënije me një shkallë logaritmike.

Tabela 6.2 Parametrat D dhe z për fenotipet në lëng boronice

Shtami D4 ( min) log D4 D37 (min) log D37 z °C B2339 7140 3.854 3300 3.519 98.453 B1279 9960 3.998 3660 3.563 75.901 MB29 8760 3.943 3150 3.498 74.292 RA18 Pa p Pa p 7140 3.854 Pa p M354 10140 4.006 1020 3.009 33.085 P32 17820 4.251 1740 3.241 32.662 B2150 8520 3.930 1440 3.158 42.742 B609 4080 3.611 2040 3.310 109.624 MB16 Pa p Pa p 2784 3.445 Pa p B1958 8760 3.943 690 2.839 29.901

* Pa p – i pa përcaktuar

Nga vlerat e marra për parametrat D4 dhe D37 në Tabelën 6.2, konfirmohen më objektivisht të dhënat mbi rezistencën e paraqitur të fenotipeve në dy temperaturat e ruajtjes në lëngun e boronicës. Konkretisht D4 e cila paraqet kohën në minuta që i është nevojitur shtameve të inokuluara në lëng ruajtur në 4°C për të humbur një shkallë logaritmike, ashtu si tregohet dhe në kurbat e mbijetesës, Graf 6.6- graf 6.11, ky parametër ka vlera relativisht të larta, nisur edhe nga fakti se në këtë temperaturë ruajtjeje ato kanë paraqitur një qëndrueshmëri të lartë. Për fenotipet e ndryshme D37 rezulton e ndryshme dhe në vlera të konsiderueshme të ulta krahasuar me D4 respektive për sejcilin fenotip. Vlerat e marra të z, janë vlera indikuese, sepse ato shprehin në fakt rezistencën karshi trjatimit termik të mundshëm, dhe këtu spikat vlera e ulët prej 29.9°C për shtamin më të ndjeshëm, B.bifidum B1958. 6.4.5 Grada Briks dhe pH-i i lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet në kohë të ndryshme inkubimi

Në Grafikun 6.12, paraqitet pH-i i lëngut me inokul në kohë të ndryshme inkubimi;

(i) 24 orë inkubim, (ii) 168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në të dyja temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C.

97

Grafiku 6.12 pH-i i lëngut me inokul në kohë të ndryshme inkubimi; (i) 24 orë inkubim, (ii) 168 orë,

(iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në temperaturën e ruajtjes 4°C dhe 37°C.

Nga rezultatet e Grafikut 6.12, vërehet që pavarësisht kohës së inkubimit dhe shtamit të përdorur për inokul, për periudhën e studimit, maksimumi 491 orë (20 ditë), pH-i i lëngut nuk ndryshon. Ndryshimi në vlerë është relativisht i papërfillshëm dhe është i paraqitur në detaj në Tabelën 6.3.

Tabela 6.3 Ndryshimi i pH-it për lëngun me inokul inkubuar në 4°C dhe 37°C

Shtamet pH

(Kontrolli) pH

37°C Diferenca

(37°C) pH 4°C

Diferenca ( 4°C)

B1279 (i) 2.9 2.79 -0.11 2.89 -0.01 B2339 (i) 2.9 2.89 -0.01 2.92 0.02 B609 (ii) 2.9 2.92 0.02 2.96 0.06 B2150 (ii) 2.9 3 0.1 2.92 0.02 MB16 (ii) 2.9 2.9 0 2.97 0.07 B1958 (iii) 2.9 2.93 0.03 3 0.1 RA18 (iii) 2.9 2.78 -0.12 2.95 0.05 M354 (iii) 2.9 2.84 -0.06 2.92 0.02 MB29 (iii) 2.9 2.83 -0.07 2.91 0.01 P32 (iiii) 2.9 2.91 0.01 2.94 0.04 Mesatare 2.9 2.88 -0.021 2.938 0.038

(i) 24 orë inkubim, (ii) 168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në temperaturën e ruajtjes 4°C dhe 37°C. Nga tabela ajo që vihet re është vlera mesatare e mostrave të marra në të dyja

temperaturat e inkubimi. Për mostrat e inkubuara në 37°C vërehet një ulje e lehtë e pH-it në vlerë mesatare -0.021, ndërsa për mostrat e inkubuara në 4°C vërehet një rritje e lehtë e pH-it në vlerë mesatare +0.038 për të dhjeta mostrat e lëngut. Në Grafikun 6.13, paraqitet Briksi i lëngut me inokul në kohë të ndryshme inkubimi; (i) 24 orë inkubim, (ii) 168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në të dyja temperaturat e inkubimit 4°C dhe 37°C.

2.62.65

2.72.75

2.82.85

2.92.95

33.05

B1279(i)

B2339(i)

B609(ii)

B2150(ii)

MB16(ii)

B1958(iii)

RA18(iii)

M354(iii)

MB29(iii)

P32(iiii)

pH i

lëng

ut

37°C

4°C

98

Grafiku 6.13 Grada Briks e lëngut me inokul në kohë të ndryshme inkubimi; (i) 24 orë inkubim, (ii)

168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në temperaturën e ruajtjes 4°C dhe 37°C. Nga rezultatet e Grafikut 6.13 vërehet pak a shumë i njëjti fenomen si në rastin e

pH-it, që pavarësisht kohës së inkubimit dhe shtamit të përdorur për inokul, për periudhën e studimit, maksimumi 491 orë (20 ditë), vlerat e Briksit të lëngut nuk ndryshojnë. Ndryshimi në vlerë është relativisht i papërfillshëm dhe është i paraqitur në detaj në Tabelën 6.4.

Tabela 6.4 Ndryshimi i Gradës Briks (%) për lëngun me inokul inkubuar në 4°C dhe 37°C

Shtamet Briksi

(Kontrolli) Briksi 37°C

Diferenca (37°C)

Briksi 4°C*

Diferenca ( 4°C)

B1279 (i) 10.8 11.1 0.3 10.9 0.1 B2339 (i) 10.8 10.8 0 10.9 0.1 B609 (ii) 10.8 10.7 -0.1 10.8 0 B2150 (ii) 10.8 10.7 -0.1 10.8 0 MB16 (ii) 10.8 10.7 -0.1 10.8 0 B1958 (iii) 10.8 10.8 0 10.8 0 RA18 (iii) 10.8 10.7 -0.1 10.8 0 M354 (iii) 10.8 10.8 0 10.9 0.1 MB29 (iii) 10.8 10.9 0.1 10.9 0.1 P32 (iiii) 10.8 10.8 0 10.9 0.1 Mesatare 10.8 10.8 0 10.85 0.05

(i) 24 orë inkubim, (ii) 168 orë, (iii) 194 orë, (iiii) 491 orë, në temperaturën e ruajtjes 4°C dhe 37°C.

Nga tabela ajo që vihet re është se për mostrat e inkubuara në 37°C Grada Briks

ndryshon pak nga njëra mostër tek tjetra nga -0.1 në 0.3, por vlera mesatare për të 10 mostrat është e njëjtë me atë të lëngut të freskët pa inokul. Për mostrat e inkubuara në 4°C vërehet një rritje e lehtë e Briksit në vlerë mesatare +0.05 për të dhjeta mostrat e lëngut.

10.310.410.510.610.710.810.9

1111.111.2

B1279(i)

B2339(i)

B609(ii)

B2150(ii)

MB16(ii)

B1958(iii)

RA18(iii)

M354(iii)

MB29(iii)

P32(iiii)

Grd

a Br

iks (

%)

37°C

4°C*

99

6.4.6 Përcaktimi i jetgjatësisë së lëngut të boronicës me probiotikë Nisur nga fakti se një produkti probiotik i përckatohet jetëgjatësia në funksion të numrit

të qelizave të gjalla mbi limitin e vlerës minimale të lejuar për to, që është 106 CFU/mL, deri në fund të jetgjatësisë së tij si i vetëm, atëherë për fenotipin B.animalis.subsp.lactis u përcaktua raporti i kohës së ndryshimit të faktorit të cilësisë së ndryshueshëm por të matshëm që është përqëndrimi qelizor i fenotipit. Nga rezultatet e mbijetesës në lëngun e boronicës për këtë fenotip në 4°C dhe 37°C, u përcaktua raporti i kohëve të reduktimit decimal me dy shkallë logaritmike 2D4 dhe 2D37 për të dy temperaturat e ruajtjes në të cilat ishte arritur përqëndrimi qelizor në vlerën minimale të lejuar prej 106 CFU/mL. Në Grafikun 6.14, janë paraqitur kurbat e mbijetesës përkatëse në dy temperaturat e ruajtjes si edhe vlerat e 2D përkatëse.

Grafiku 6.14 Raporti i 2D4 me 2D37 për fenotipin B.animalis.subsp.lactis P32

𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑙𝑙𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅𝑅 𝑇𝑇 = 2𝐷𝐷42𝐷𝐷37� (6.3)

Ku:

2D4 - është koha për të cilën përqëndrimi qelizor ka rënë me 2 shkallë logaritmike dhe ka arritur vlerën 106 CFU/mL për lëngun ruajtur në 4°C.

2D37 - është koha për të cilën përqëndrimi qelizor ka rënë me 2 shkallë logaritmike dhe ka arritur vlerën 106 CFU/mL për lëngun ruajtur në 37°C.

Duke aplikuar ekuacioni (6.3), raporti T rezultoi 8, që do të thotë se lëngu i boronicës inokuluar me shtamin probiotik të B.animalis.subsp.lactis P32, nëse ruhet në 4°C ka një jetëgjatësi 8 herë më të lartë sesa nëse ruhet në 37°C. Në këtë fazë u hodh një hipotezë për të aplikuar këtë raport edhe për shtamet e tjera. Kjo vlerë e raportit u aplikua edhe për shtamet e tjera në mënyrë që të parashikohej jetgjatësia e përafërt e lëngut inokuluar me gjithsejcilin shtam në 4°C. Për sejcilin fenotip nga grafikët e mbijetesës së tyre në temperaturën 37°C (Grafiku 6.6 deri Grafiku 6.11) u përcaktua koha 2D37, në të cilën fenotipet arritën përqëndrimin qelizor minimal të lejuar 106 CFU/mL në këtë temperaturë dhe u parashikua përafërsisht koha 2D4 në të cilën do ta arrijnë këtë përqëndrim nëse lëngu i boronicës inokuluar me to do të ruhej në 4°C. Vlerat e marra paraqiten në Tabelën 6.5.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

T0 4 24 29 48 53 72 77 96 120

144

146

170

194

207

225

231

249

258

273

282

297

303

323

347

371

443

467

491

log

cfu/

ml l

ëng

Koha (orë)

P32

(4°C) (37°C)

2D37 2D4

100

Tabela 6.5 Jetëgjatësia e lëngjeve (JT) me probiotikë, në 37°C dhe jetëgjatësia e parashikuar në 4°C

Shtami 2D37 (orë) 2D4 (orë) JT (Ditë) JT (Javë) B2339 57 456 19.0 2.7 MB29 63 504 21.0 3.0 RA18 145.7 1165.6 48.6 6.9 B2150 49.2 393.6 16.4 2.3 B1279 74 592 24.7 3.5 MB16 53 424 17.7 2.5 B609 38 304 12.7 1.8 B1958 26 208 8.7 1.2 M354 49 392 16.3 2.3 P32 61.4 491.2 20.5 2.9

Nga këto rezultate vërehet se jetgjatësi më të lartë prej afro 7 javësh në 4°C, ashtu si edhe parashikohej nga rezultatet, paraqet B.animalis.subsp.lactis RA18. Fenotipet e tjera renditen B1279 (3.5 javë), MB29 (3.0 javë), P32 (2.9 javë), B2339 (2.7 javë), MB16 (2.5 javë), M354 dhe B2150 (2.3 javë), B609 (1.8 javë) dhe B1958 (1.2 javë).

6.5 Diskutime

Në këtë fazë u synua të studjohej efiçenca e adoptimit në Miks-e si edhe qëndrueshmëria e fenotipeve probabël lëng rezistente duke studjuar mbijetesën e fenotipeve të adoptuar të 10 shtameve (Tabela 6.1) në lëng boronice në dy temperatura ruajtjeje 4°C dhe 37°C, në errësirë në aerobiozë. Inkubimi u krye në dy temperatura që të mund të bëhej krahasimi i mbijetesës për çdo fenotip në këto kushte, duke evidentuar ndikimin e temperaturës së ruajtjes në mbijetesën e tyre. Gjithashtu me anë të kësaj faze u realizua edhe përcaktimi i jetgjatësisë së lëngut probiotik, me anë të raportit të kohës, lidhur me ndryshimin e faktorit të cilësisë (që në këtë rast është përqëndrimi qelizor i shtameve) në funksion të kohës në dy temperatura të ndryshme ruajtjeje 37°C dhe 4°C. U përcaktuan parametrat D dhe z për fenotipet në lëng boronice. U përcaktuan grada Briks dhe pH-i i lëngut të boronicës origjinal (pa inokul) dhe i lëngut të boronicës inokuluar me fenotipet lëng rezistente për kohë të ndryshme inkubimi, në 37°C dhe në 4°C, në mënyrë që të përcaktoheshin ndryshimet probabël të këtyre parametrave të lëngut, në funksion të shtameve të përdorura, temperaturës së ruajtjes si edhe kohës së inkubimit.

Nga rezultatet e marra u vërejt se lëngu me inokul me fenotipet probiotikë ruajtur në 4°C, paraqiti një qëndrueshmëri të lartë, sepse pothuajse të gjithë shtamet për kohën e studimit prej 194 orësh (8 ditë), mbajtën një përqëndrim qelizor relativisht konstant, ndërsa në lëngun e boronicës inkubuar në 37°C, shtamet paraqitën nivel të ndryshëm rezistence, ku shtami më rezistent rezultoi B.animalis.subsp.lactis RA18 me një kohë mbijetese prej 194 orësh, ndërsa ai më i ndjeshëm rezultoi B.bifidum B1958 me një kohë mbijetese prej 72 orësh. Nga rezultatet e mbijtesës të marra në 37°C u parashikua mbijetesa për sejcilin shtam në 4°C me anë të raportit të kohëve të reduktimit decimal 2D4 dhe 2D37 kur përqëndrimi qelizor në lëngun e boronicës arriti minimumin e vlerës së lejuar prej 106 CFU/mL për lëngun në 4°C dhe 37°C. Ky

101

raport rezultoi 8, që do të thotë se jetgjatësia e lëngut të boronicës me këtë shtam ruajtur në 4°C është 8 herë më e lartë se jetgjatësia e tij i ruajtur në 37°C. Shtamet e tjerë paraqitën një jetgjatësi të parashikuar në nivele të ndryshme, ku lëngu me B.animalis.subsp.lactis RA18 u parashikua të kishte një jetgjatësi prej afro 7 javësh në 4°C. Ndërsa shtamet e tjera paraqitën një jetgjatësi mesatare dhe të ulët.

6.5.1 Ndryshimet në mbijetesën e fenotipeve në lëng boronice në funksion të shtamit dhe temperaturës së ruajtjes

Përzgjedhja e dy temperaturave të inkubimit, kushte frigoriferike 4°C dhe jetëgjatësi e përshpejtuar 37°C, u krye për të përcaktuar diferencën e jetgjatësisë së produktit indirekt si edhe për të studjuar mbijetesën e shtameve në këto kushte. Përzgjedhja e temperaturës së ruajtjes së produktit jep edhe shkallën e ndjeshmërisë së tij në degradim. Për produktet funksionale jetgjatësia e tyre përcaktohet deri në pikën kur kultura probiotike është vitale në nivelin e përqëndrimit qelizor minimal, sipas standarteve prej 106 CFU/mL brënda jetgjatësisë së produktit si i vetëm.

Lëngjet e frutave duhet të ruhen në temperatura frigoriferike nga 0 në 8°C, meqënëse temperatura e ulët, ngadalëson rritjen dhe aktivitetitn e mikroorganizmave në matricat ushqimore (Fellows, 2009 ). Mekanizmi i veprimit të temperaturës së ulët në zhvillimin dhe aktivitetin mikrobiologjik përfshin alterime të strukturës së membranës qelizore, ulje e sasisë së substratit të marrë përmes membranës si edhe ulje e nivelit të aktivitetit enzimatik duke përfshirë edhe frymëmarrjen (Herbert, 1989). Bifidobacterium spp. zhvillohen në temperatura midis 25 dhe 45°C me një rritje optimal midis 37 dhe 4l°C (Ray, 2004).

Shumë studime kanë treguar se vitaliteti i probiotikëve në një mjedis mbartës është shumë i ndryshëm dhe i varur nga shtami. Vlera e ulët e pH-it në lëngjet e frutave është identifikuar si faktori determinant mbi mbijetesën e probiotikëve të përfshirë në këtë produkt (Saarela et al., 2006; Sheehan et al., 2007).

Ruajtja e lëngut në 4°C: Nga rezultatet e marra në këtë fazë, duke qënë se mjedisi mbartës (lëngu i boronicës), ishte i njëjtë për të gjithë fenotipet, mbijetesa e tyre u ndikua nga toleranca probabël e fituar e fenotipeve në fazën parardhëse si edhe nga shtami origjinal. Vërehet në përgjithësi se në temperaturën e ruajtjes 4°C shtamet kanë paraqitur përqëndrim qelizor relativisht konstant duke mbajtur përafërsisht vlerën e inokulit fillestar. Konkretisht përqëndrimi qelizor i tyre ka rënë shumë pak pas 194 orësh ruajteje në lëng boronice në 4°C, B.pseudocatenulatum B2339 dhe B.breve B2150 me (0.3) shkallë log, për B.animalis.subsp.lactis RA18, P32 dhe B.thermofilum MB16 me (0.4) B.animalis.subsp.lactis MB29 me (0.5), B.bifidum B1958 me (0.64), B609 me (0.85), B1279 me (0.9) dhe M354 me 1 shkallë logaritmike.

Ruajtja e lëngut në 37°C: Ndryshe nga rezultatet në 4°C, në temperaturën e ruajtjes 37°C shtamet kanë paraqitur kurba mbijetese të ndryshme. Konkretisht fenotipi me rezistencë më të lartë ka rezultuar B.animalis.subsp.lactis RA18, rënija e përqëndrimit qelizor të tij rezultoi 0.15 shkallë logaritmike pas 72 orësh dhe përqëndrimi i tij qelizor mbërriti në 0 CFU/mL pas 194 orësh, ndërsa fenotipi i rezistuar më pak se të 10 fenotipet e studjuar është B.bifidum B1958, i cili ka pësuar një rënije të përqëndrimit qelizor me 8.4 shkallë logaritmike pas 72 orësh dhe për të nëjtën kohë ka humbur totalisht vitalitetin. Më pas të renditur sipas kohës kur kanë humbur totalisht vitalitetin vijnë; B.animalis.subsp.lactis M354 arriti 0 CFU/mL pas 96 orësh, B.breve B609 dhe B.pseudocatenulatum B2339 arritën 0 CFU/mL pas 120 orësh,

102

B.animalis.subsp.lactis MB29, P32 dhe B.pseudocatenulatum B1279 arritën 0 CFU/mL pas 144 orësh, në lëng boronice në 37°C. Shprehur në termat e rënijes së vitalitetit pas 72 orësh për shtamet në temperaturën e inkubimit në 37°C vërehet se; rënijen më të lartë të vitalitetit në këto kushte e ka paraqitur B.bifidum B1958 prej 100 % pas 72 orësh, më pas vijën B.animalis.subsp. lactis M354 prej 77%, B.breve B609 prej 69%, B.pseudocatenulatum B2339 prej 59%, B.breve B2150 prej 58%, B.thermofilum MB16 prej 44 %, B.animalis.subsp. lactis P32 dhe MB29 me një rënije vitaliteti të njëjtë prej 36%, B.pseudocatenulatum B1279 prej 22% dhe B.animalis.subsp. lactis RA18 prej 2%.

- Krahasimi për temperaturat e ruajtjes (4°C dhe 37°C). Nga krahasimi i kryer mbi kurbat e mbijetesës në dy temperaturat e ruajtjes 4°C dhe 37°C, për të gjithë fenotipet vërehet se kurba e mbijetesës në 37°C ndahet nga ajo në 4°C në kohë të ndryshme për shtame të ndryshme si edhe kinetika e vdekjes e ndjekur në 37°C është herë graduale e herë e përshpejtuar. Nga analizimi i kurbave vërehet se faktor diferencues për mbijetesën është jo vetëm koha fillestare për të cilën kurbat e mbijetesës si ajo e 4°C ashtu edhe ajo e 37°C qëndrojnë paralel e më pas koha në të cilën kurba e 37°C ndahet duke pësuar rënije të numrit të qelizave, por faktor shumë i rëndësishëm është edhe shpejtësia që ndjek rënija ose më mirë kinetika e përshpejtuar apo graduale që ndiqet pas rënies së parë të numrit të qelizave. Nga rezultatet në kurbën e 37°C, vërehet se kryesisht fenotipet më rezistente kanë paraqitur një kohë rënijeje fillestare të numrit të qelizave më të vonët dhe një kinetikë vdekjeje më graduale.

Fakti që fenotipet e studjuara në këtë fazë, praqitën qëndrueshmëri në përqëndrimin e tyre qelizor në 4°C pavarësisht rezistencës së tyre të pakët në 37°C, mbështetet edhe nga studime të tjera të ngjashme, si më poshtë:

Sheehan et al., (2007), monitoruan mbijetesën e shtameve të Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium.spp për 12 javë në 4°C në lëngun e portokallit (LP) pH 3.65, lëngun e ananasit (LA) pH 3.4, dhe lëngun e boronicës së kuqe (LB) pH 2.5. Të gjithë mikroorganizmat e studjuar mbijetuan më gjatë në LP dhe LA krahasuar me LB. Rezultoi se shtamet e Lb. salivarius UCC118 dhe UCC500 rezultuan si shtamet më të ndjeshme. Në të kundërt B. lactis Bb-12 nuk paraqiti ulje të ndjeshme në vitalitetit përgjatë katër javëve të para në LP dhe pati një vitalitet mbi 106 CFU mL−1 për të paktën gjashtë javë. Ndersa në LA (pH 3.4) për B. lactis Bb-12 numri i qelizave mbi nivelin kritik 106 CFU mL−1 u shfaq për të paktën 4 javë, më pas qelizat e gjalla ranë në një mënyrë të ndjeshme me 3.5 shkallë logaritmike midis javës së 4 dhe të 6. Në LB (pH 2.5), të gjithë shtamet paraqitën një humbje drastike në vitalitetin e tyre për pak ditë ekspozimi ndaj këtij lëngu. Dy ditë pas inokulimit u shfaq një rënije prej 4 shkallësh logaritmike për B.animalis.

Në studimin tonë Bb-12 i përmendur më sipër është B.animalis.subsp.lactis M354, ku tregohet se në lëngun e boronicës (pH 2.9) në 37°C, Grafiku 6.8, ky shtam ka humbur 2 shkallë logaritmike pas 48 orësh dhe 6 shkallë logaritmike pas 72 orësh, ndërsa në 4°C ai ka humbur 1 shkallë logaritmike pas 170 orësh dhe ka mbajtur këtë përqëndrim konstant edhe për 24 orët në vazhdim, deri në fund të kohës së studimit prej 8 ditësh.

Ding dhe Shah (2008), studjuan mbijetesën e 5 shtameve Lactobacillus.spp dhe

Bifidobacterium longum, B. lactis type Bi-04 dhe B. lactis type Bi-07 të mikroinkapsuluara dhe jo, në lëng portokalli (pH 2.81) dhe molle (2.97) në 4°C deri në 6 javë. Shtamet jo të mikroinkapsuluara e humbën vitalitetin e tyre brënda 5

103

javëve. Për të dy lëngjet rezultatet ishin të ngjashme. Megjithatë shtamet e L. acidophilus dhe B. longum paraqitën mbijetesë më të lartë sesa gjithë shtamet e tjera, probabilisht për shkak të tolerancës së tyre ndaj mjedisit acid. Rezultoi një vitalitet >105 CFU/mL ende pas javës së gjashtë.

Moussavi et al., (2102), studjuan mbijetesën e Lactobacillus.spp, Bifidobacterium animalis subsp lactis Bb12 (Bb) dhe Propionibacterium jensenii 702 (PJ), në lëng portokalli (pH 3.83), në 4°C si edhe ujë të pijshëm në 4°C dhe 23°C. Përqëndrimi qelizor i Bb inokuluar në lëng portokalli në 4°C, qëndroi i pandryshueshëm deri në 28 ditë (4 javë) e më pas ra me 10% për 56 ditë (8 javë), ndërsa në ujë të pijshëm në 4°C, përqëndrimi i tij qelizor qëndroi konstant për 56 ditët e studimit. Nga katër kulturat probiotike të studjuara vetëm Bb mbajti një vitalitet të lartë në të dy produktet si lëng portokalli ashtu edhe ujë të pijshëm përgjatë 8 javëve studim.

Në këtë fazë në studimin tonë, ashtu si edhe pritej nga rezultatet e marra nga Kapitulli 5, shtami më i ndjeshëm me rezistencën më të ulët rezultoi B.bifidum B1958, tek i cili proçesi i adoptimit të vazhduar në matricën Miks ndikoi negativisht duke e ulur rezistencën e tij karshi lëngut të boronicës, ky rezultat mbështetet edhe tek studime të tjera ku, sipas (Collado & Sanz, 2006a), B. bifidum janë shfaqur të jenë tipi i species bifidobakteriale nga infantë që kanë paraqitur ndjeshmërinë më të lartë karshi kushteve acide. Sipas (Saarela et al., 2004), paratrajtimi në pH 3.5 i disa shtameve si psh B. longum E1884 pati një efekt të kundërt në lidhje me rezistencën ndaj aciditetit, duke e ulur atë.

6.5.2 Ndikimi i përbërjes së lëngut të boronicës në mbijetesën e shtameve probiotikë

Përveç pH-it, përbërësit kimikë të lëngut të frutave janë konsideruar gjithashtu si faktorë të rëndësishëm mbi ndikimin që kanë mbi mbijetesën e probiotikëve në to. Në lëngjet e frutave janë të përfshira substanca kimike të cilat mund të rrisin apo të ulin vitalitetin e probiotikëve. Komponentë të cilët ndihmojnë në mbijetesën e probiotikëve dhe luajnë rol mbrojtës për qelizat janë komponime si sheqeri, vitamina C dhe mineralet të pranishme në lëngun e boronicës. Lëngu i boronicës komercial i përdorur deklarohej se përmbante sheqerna, kryesisht saharozë dhe glukozë (10.8-10.9%). Studime të mëparshme kanë treguar se sheqerna si glukoza kanë rritur mbijetesën e disa shtameve të Lactobacillus në kushte acide (Corcoran et al., 2005). Lëngu i boronicës është gjithashtu një burim i rëndësishëm Vitamine C e cila është cilësuar si një nga antioksidantët më të fuqishëm. Në bimën e boronicës përmbahen rreth 6.3 mg Vitaminë C/g boronicë (Harb et al., 2010). Dihet që Vitamina C (acidi askorbik), mund të ketë gjithashtu një efekt mbrojtës mbi qelizat probiotike përgjatë ruajtjes, probabilisht sepse ajo është një “konsumuese oksigjeni”, duke promovuar kështu një mjedis më të përshtatshëm anaerobik (Teixeira et al., 1995; Dave & Shah 1997). Vitamina C është raportuar se kontribuon 65-100% në kapacitetin antioksidues të lëngut të qitros (Gardner et al., 2000). Një studim i kohëve të fundit (Shah et al., 2010) ka treguar se shtimi i vitaminës C në një model lëngu frutash i përbërë nga tricitrat natriumi, acid citrik pudër, saharozë dhe ujë i distiluar (pH 3.8) rriti mbijetesën e probiotikëve Lactobacillus.spp dhe B.lactis HN001, krahasuar me lëngun kontroll dhe lëngje me vitamina të tjera si B2, B3, B6, E, përgjatë ruajtjes në të ftohtë për 6 javë (Shah et al., 2010). Mendohet se Vitamina C “konsumon” oksigjenin e pranishëm në lëng, duke gjeneruar kështu një mjedis më të përshtatshëm anaerobik (Dave & Shah, 1997; Shah et al., 2010).

104

Komponentë të tjerë shumë të rëndësishëm me veti antioksiduese janë edhe polifenolet e pranishme në lëngun e boronicës. Flavonoidet dhe antocianet e pranishme në lëngun e boronicës janë në sasi të konsiderueshme. Në frutin e boronicës përmbahen rreth 2.8mg/g komponime fenolike dhe 3.6 mg/g antociane. Në lëngun e boronicës, kuptohet që këto vlera variojnë në funksion të varietetit të boronicës si edhe proçesit të prodhimit të përzgjedhur (tipi i presimit, temperatura e pasterizimit, etj...). Vlerat në përgjithësi janë; total antociane ekuivalent (cian-3-glukozid) 80 mg/L lëng, total fenole ekuivalent (acid galik) 2.3mg/mL GAE (ekuivalent acid galik) (Navindra et al., 2008). Në një lëng me gradë Briks 10, përqëndrimi i Total antocineve është rreth 18.1mg/l, total komponime fenolike 41.5mg/L. Këto komponentë mund të kontribojnë gjithashtu në krijimin e kushteve anerobike më të favorshme për probiotikët (McGill et al., 2004; Wilmsen et al., 2005).

Sipas Shah et al, (2010), u studjua mbijetesa e B.lactis HN001, inokuluar në një model lëng i përbërë nga 0.1 g tricitrat natriumi, 0.135 g acid citrik pudër dhe 9.268 g saharozë dhe ujë i distiluar, pH 3.8 duke përdorur HCl 2.0 M. Studimi i mbijetesës i kryer për 6 javë në 4°C, tregoi, rënie me 1 shkallë logaritmike pas javës së parë, me 3.1 shkallë logaritmike pas javës së dytë, dhe me nga 1 shkallë logaritmike tjetër për javët në vazhdim, pas javës së 6 ishte <10 CFU/mL.

Sawaminee et al., (2011), studjuan efektin e përbërjes kimike të lëngut të frutave, përgjatë ruajtjes në të ftohtë për 6 javë në një matricë model, duke përshkruar mbijetesën e qelizave në funksion të pH-it (3.2–4), acidit citrik (2–15 g/l), proteinave (0–10g/l) dhe fibrave dietike (0–8 g/l). Mbijetesë të mirë paraqiti B.longum me një rënije në shkallë logaritmike <0.4 e cila u arrit në solucionin model ku pH-i ishte >3.7 dhe përqëndrimi i acidit citrik 8-15g/l. Mbi rolin e acidit citrik pritej që acidet organike të kishin një efekt negativ në mbijetesën e qelizave, por nga rezultatet e këtij modeli solucioni, u vërejt se acidi citrik pati një efekt të konsiderueshëm pozitiv në mbijetesë, sidomos kur ishte i pranishëm në përqëndrime nga 8-15g/l. Shpjegime të mundshme mund të jenë se acidi citrik është metabolizuar nga qelizat gjatë ruajtjes ose në qeliza kishte ndonje efekt bufer nga acidi citrik brënda qelizës. U konkludua se të katër faktorët patën një efekt negative mbi uljen e numrit të qelizave, ku pH-i dhe acidi citrik ishin ato që ndikonin më shumë. Mbijetesa më e lartë qelizore (rënije më pak se 0.4 shkallë logaritmike) pas 6 javë ruajtje u vërejt në lëngun e portokallit dhe ananasit, të cilët kishin të njëjtin pH 3.8.

6.5.3 Ndryshimi i pH-it dhe Briks-it në lëngun e boronicës

Përgjatë periudhës së studimit u monitoruan si grada Briks ashtu edhe pH-i për mostrat me inokul të ndryshëm të lëngut të boronicës, për të dedektuar dhe krahasuar aktivitetin potencial metabolik të probiotikëve përgjatë ruajtjes në të ftohtë 4°C dhe në 37°C.

Krahasimi midis vlerës të pH-it të lëngut të boronicës pa inokul si edhe të atij me inokul me fenotipe të ndryshme, në të dyja temepraturat dhe në kohë të ndryshme ruajtjeje, tregoi që pavarësisht kohës së inkubimit dhe shtamit të përdorur për inokul, për periudhën e studimit, maksimumi 491 orë (20 ditë), pH-i i lëngut ndryshoi shumë pak (me një vlerë mesatare ndryshimi prej -0.021) në 37°C dhe 0.038 në 4°C. Ulja e lehtë apo edhe mos ndryshimi në vlerat e pH-it dhe Briksit të

105

lëngut të boronicës probiotik, tregon një aktivitet shumë të dobët apo mungesë totale të aktivitetit metabolik të shtameve të përdorura. Probabilisht bakteret probiotike mund të kenë përdorur karbohidratet duke prodhuar sasi të vogla të acideve organike duke ulur rrjedhimisht pH-in e lëngut përgjatë ruajtjes. Edhe pse pjesa më e madhe e baktereve mund të mos jenë të gjalla gjatë fazës së fundit të rritjes, qelizat e vdekura probiotike mund të lëshojnë enzima duke hidrolizuar kështu sheqernat në lëngun e frutit, e si rrjeshim të ulin pH-in. Ulja e pakët e vlerës së pH-it është edhe si rrjedhim i kohës së shkurtër të studimit (8 ditë). Megjithatë ky ndryshim në vlerë është relativisht i ulët e i papërfillshëm. Këto rezultate tregojnë se kulturat probiotike të inokuluara në lëng kanë efekt shumë të ulët në pH-in e lëngut të frutit.

Edhe vlerat e Briksit ishin shumë të qëndrueshme për gjithë kohën e monitorimit. Për lëngun e boronicës inkubuar në 37°C, grada Briks mesatare për të dhjetë shtamet është e njëjtë me atë të lëngut të freskët pa inokul. Për mostrat e inkubuara në 4°C vërehet një rritje e lehtë e Briksit në vlerë mesatare +0.05 për të dhjeta mostrat e lëngut.

Këto rezultate janë të ngjashme edhe me studime të kohëve të fundit në të cilët vlerat e pH-it të testuara në disa lëngjesh frutash komercial, si; Oasis Health BreakTM (një përzierje midis ananasit, mollës, portokallit, dardhës dhe/ose rrushit, frutit të pasionit, limonit, pjeshkës, luleshtrydhes, mangos dhe kivit), lëngut Health Vision Sante Tradition® (një përzierje mollë, dardhë, mjedër) dhe lëngut Valio (një përzierje portokalli, rushi dhe fruit pasioni) me kultura probiotike të përfshira qëndruan të pandryshuar ose paraqitën ndryshime të papërfillshme (deri në 0.1 njësi në vlerën e pH-it) përgjatë ruajtjes në të ftohtë (Champagne & Gardner, 2008; Champagne et al., 2008; Saarela et al., 2006).

Edhe vlerat e Briksit në mënyrë të ngjashme kanë rezultuar të pandryshuara përgjatë periudhës së studimit. Ding & Shah (2008), studjuan mbijetesën e 5 shtameve Lactobacillus.spp dhe Bifidobacterium longum, B. lactis type Bi-04 dhe B. lactis type Bi-07 të mikroinkapsuluara dhe jo, në lëng portokalli (pH 2.81) dhe molle (2.97) në 4°C deri në 6 javë. Në lidhje me ndryshimin e pH-it e njëjta tendencë e uljes së pH-it u vërejt tek të dy lëngjet për të tetë shtamet e testuara. Pas javës së parë nuk pati ndryshim, pas javës së dytë ra me 0.05, dhe pas javës së tretë ra me 0.13. Në fund të javës së gjashtë pH-i ra në 2.57. Në lidhje me ndryshimin e Briksit; deri në javën e dytë vlera e briksit pësoi një rënije prej <0.5%, në javën e tretë ra me 0.5%. Mesatarisht për lëngun e mollës Briksi ra me 2.6% në fund të javës së gjashtë. Ky ndryshim në vlerën e Briksit tregon se bakteret probiotike të lira mund të përdorin më lehtësisht sheqernat e pranishme në lëng. Edhe në l ëngun e po r toka l l i t u vu re u l j e e gradës Br iks edhe më e la r t ë s e në l ëngun e mol l ës . Për lëngun pa inokul kryesisht vlerat e pH-it (për portokallin) fillojnë e bien pas javës së dytë, kurse për mollën pas javës së katërt (me 0.02). Ndërsa Briksi për të dy lëngjet pa inokul fillon e bie pas javës së katërt dhe pas javës së gjashtë bie me (0.01).

Sipas Sawaminee et al., (2011), në lidhje me ndryshimet kimike gjatë ruajtjes në lëng inokuluar me B.longum: për 6 javë në 4°C, për të gjithë lëngjet, portokalli, rrushi, etj.., pH–i nuk ndryshoi pothuajse fare, duke treguar se aftësia buferike e lëngjeve ishte e lartë.

106

Sipas Shah et al, (2010), për lëngun inokuluar me B.lactis HN001, u vërejt se pH-i i lëngut model në javën e parë mbeti konstant (3.8), në javën e dytë ra me 0.2, javën e tretë ra me 0.3, tre javët e fundit mbeti konstant me rënije 0.4 nga pH-i fillestar. Briksi i lëngut model në javën e parë ra me 0.7 nga vlera e Briksit fillestar (11.8), në javën e dytë ra me 1.8, javën e tretë ra me 2.3 nga Briksi fillestar.

Sipas Moussavi (2012), përgjatë periudhës së studimit u konkludua se si vlerat e pH-it ashtu edhe të Briksit si të lëngut me inokul ashtu edhe të kontrollit ishin të qëndrueshme për mostrat me inokul të ndryshëm të lëngut të portokallit. pH-i rezultoi me një diferencë prej 0.01 dhe Briksi ra me 0.1 për 56 ditët e studimit.

6.5.4 Jetëgjatësia e lëngut të boronicës me probiotikë

Sipas prodhuesit, lëngu i frutave të boronicës i përdorur në këtë studim kishte një jetgjatësi prej 365 ditësh në 23°C, ndërsa lëngu i frutave eksperimental probiotik i boronicës ruajtur në 4°C në të cilin niveli minimal efektiv 106 CFU/mL, i mikroorganizmave të gjalla u mbajt për 20 ditë (për lëngun inokuluar me B.animalis.subsp.lactis P32) dhe në 37°C ky nivel i qelizave të gjalla u mbajt maksimumi për 8 ditë (për lëngun inokuluar me B.animalis.subsp.lactis RA18).

Nga përcaktimi i raportit të 2D4 me 2D37 i cili rezultoi 8, për B.animalis.subsp.lactis P32, u konkludua se ky lëng nëse ruhet në 4°C ka një jetëgjatësi 8 herë më të lartë sesa në 37°C. Në këtë fazë u hodh hipoteza që të mund të aplikohej i njëjti raport edhe për shtamet e tjera. Duke aplikuar parashikimin e jetgjatësisë nëpërmjet aplikimit të të njëjtit faktor konvertues 8, rezultoi se jetgjatësi më të lartë prej afro 7 javësh në 4°C, ashtu si edhe parashikohej nga rezultatet paraqet B.animalis.subsp.lactis RA18. Fenotipet e tjera renditen B1279 (3.5 javë), MB29 (3.0 javë), P32 (2.9 javë), B2339 (2.7 javë), MB16 (2.5 javë), M354 dhe B2150 (2.3 javë), B609 (1.8 javë) dhe B1958 (1.2 javë).

6.6 Konkluzione

- Lidhur me mbijetesën e fenotipeve të adoptuara në lëngun e boronicës në dy temperatura ruajtjeje, në të ftohtë dhe në kushtet e jetgjatësisë së përshpejtuar, u vunë re diferenca të mëdha midis tyre sidomos në ruajtjen në 37°C. Si edhe dihej lëngu i boronicës ndikoi ndjeshëm në mbijetesën e fenotipeve kryesisht për shkak të pH-i të tij të ulët.

- Proçedura paraprake e adoptimit në matricën Miks (Kapitulli 5), ndikoi në forma të ndryshme në shtame të ndryshëm. Kjo fazë rezultatesh vërtetoi se atributet e fituara gjatë adoptimit mbi rezistencën karshi kushteve të lëngut të boronicës u ruajtën për një periudhë më afatgjatë.

- Konkretisht, në lëngun e boronicës ruajtur në kushtet e jetgjatësisë së përshpejtuar në 37°C shtamet pësuan një rënije të konsiderueshme edhe për një kohë të shkurtër në numrin e qelizave, por gjithsesi u vunë re diferenca të ndjeshme midis shtameve rezistente dhe atyre të ndjeshme. Spikatën si më rezistentët B.animalis.subsp.lactis RA18 i cili rezistoi 8 ditë në lëng. Ndërsa shtami më i ndjeshëm me një jetgjatësi prej vetëm 72 orësh rezultoi B.bifidum B1958.

107

- Konkretisht, në lëngun e boronicës ruajtur në të ftohtë 4°C, qoftë nga përcaktimi drejt për drejtë i vitaliteti të B.animalis.subsp.lactis P32, qoftë edhe nga jetgjatësia e parashikuar për fenotipet e tjera në këto kushte, rezultoi se, B.animalis.subsp.lactis RA18 do të qëndronte mbi nivelin minimal të lejuar për një peiudhë prej 7 javësh, ndërsa fenotipe të tjerë si B.pseudocatenulatum B1279 prej 3.5 javë, B.animalis.subsp.lactis. P32 dhe MB29 prej 3 javësh. Shtamet të cilët u parashikua të rezistojnë më pak se 2 javë në këto kushte rezultuan B.bifidum B1958 me 1.2 javë, B.breve B609 me 1.8 javë. Shtamet e tjerë si B. pseudocatenulatum B2339, B. breve B2150, B. thermofilum MB16, B. animalis. subsp. lactis. M354 patën një rezistencë nga 2.3 - 2.7 javë.

- Lidhur edhe me rezultatet e Kapitullit 5, ku u testua përmirësimi i rezistencës së shtameve pas adotptimit (Grafiku 5.15), vërehte se shtami B.pseudocatenulatum B1279, i ka ruajtur atributet e tij të rezistencës edhe për një periudhë kohore më të gjatë se 24 orë në lëng, duke u renditur në këtë fazë si një nga shtamet më rezistente. Gjthashtu edhe shtame të tjera të cilët paraqitën përmirësim të rezistencës pas fazës së adoptimit në vlera të konsiderueshme si B.thermofilum MB16 dhe B.breve B2150 kanë paraqitur një rezistencë mesatare deri të lartë krahasuar me fenotipet e tjerë. Ruhet e njëjta linjë me përfundimet e marra nga Kapitulli 5, edhe për B.bifidum B1958 i cili paraqiti në të kundërt një rënije të rezistencës dhe kjo u vërtetua edhe në këtë fazë të studimit ku ky fenotip rezultoi më i ndjeshmi nga të dhjetë fenotipet.

- Si përfundim këto rezultate konfirmojnë faktin se është e mundur të përmirësohen vetitë toleruese karshi pH-it apo faktorëve të tjerë të stresit të shkaktuar nga komponimet e një lëngu frutash duke aplikuar një periudhë adoptimi gradual të vazhduar për një kohë relativisht të gjatë. Kuptohet që proçesi i adoptimit duhet përshtatur në nivel shtami duke qënë se në këtë proçes u vërejtën edhe shtame të cilëve ju shtaktua efekti i kundërt, pra humbje e rezistencës.

- Metoda e përdorur e adoptimit sygjerohet të aplikohet në shtame origjinale me rezistencë të ulët sepse efekti i përmirësimit ishte shumë më i ndjeshëm tek to sesa tek shtamet origjinale me rezistencë të mesme e të lartë.

- Duhet të studjohen mundësi edhe për aplikimin e inokulave të përziera të shtameve të ndryshme të gjinisë Bifidobacterium apo qoftë edhe Lactobacillus për tu inokuluar në lëngun e boronicës.

- Një aspekt tjetër i rëndësishëm është përcaktimi i aftësisë toleruese të këtyre shtameve ndaj kushteve të traktit intestinal (pH 2 dhe pranisë së kriprave biliare për 2 orë).

- Duhet studjuar edhe pranueshmëria në nivel sensorial i lëngut të boronicës inokuluar me këto fenotipe.

108

KAPITULLI 7. Studimi i ndryshimeve probabël gjenetike të shtameve të Bifidobacterium.spp para dhe pas adoptimit. 7.1 Përmbledhje

Në këtë fazë studimi u krye ekstraktimi, kuantifikimi, Polymerase Chain Reaction

(PCR) dhe xhel elektroforeza për të gjithë shtamet e marra në studim në (fazën studimore 4) si ato origjinale ashtu edhe shtamet pas adoptimit në matricën Miks, me synim studimin e ndryshimeve probabël gjenetike në to pas adoptimit. U aplikua në fillim protokolli i ekstraktimit të ADN-së nga kulturë e pastër, duke marrë ADN-të si nga “precipitimi i parë” ashtu edhe nga “precipitimi i dytë”. Më pas kuantifikimi i ADN-ve të ekstraktuara u krye me spektorfotometër dhe e ADN-ve të holluara me TECAN. Nga rezultatet e kuantifikimit dhe pastërtisë së ADN-ve të ekstraktuara, u vërejt që ADN-të e “precipitimit të dytë” rezultuan të papastra, ndërsa ato të “precipitimit të parë” për të gjithë shtamet ishin në një nivel pastërtie të lartë që të mund të kryhej me to më pas PCR. Cikli i PCR u krye në termociklator Verity 96, më pas u aplikua elektroforeza në xhel agarozë. Nga rezultatet e marra nga vëzhgimi i xhelit nuk u dalluan ndryshime në nivel fingerprinting. 7.2 Hyrje

Metodat tradicionale të identifikimit dhe klasifikimit të mikroorganizmave bazohen kryesisht mbi karakterizimin fenotipik, si edhe mbi analiza të karakteristikave morfologjike, biokimike, fiziologjike, etj… Në mënyrë që identifikimi i mikroorganizmave të jetë më i besueshëm pra më i saktë, teknikat fenotipike sot përdoren të kombinuara me teknika molekulare që investigojnë gjenomin (Vaughan et al., 2008).

7.2.1 Ekstratktimi i ADN-së gjenomike nga kultura GRAM+ Ekstraktimi i acideve nukleike përfaqëson hapin e parë në pjesën më të madhe të

protokolleve eksperimentalë që synojnë analizat gjenotipike. Ekzistojën protokolle të ndryshme ekstraktimi të acideve nukleike. Përzgjedhja dhe optimizimi i metodës të ekstraktimit varet nga: - tipi i acidit nukleik që do të ekstraktohet (ADN-së me një apo dy zinxhirë, ARN-së totale dhe mRNA-së) - kampioni bilogjik (si psh qeliza nga maja, myqe filamentozë, baktere gram+, baktere gram-, etj...) - proçedura që do të kryhet post ekstraktimit (si psh PCR, klonim, restriksion enzimatik, etj..) Të gjithë protokollet kryesisht përbëhen nga këto 3 faza, (Vaughan et al., 2008):

1. Shkatërrimi i mbështjellave qelizore: Kjo ëshë një fazë ekstremisht delikate, sepse duhet të marrë në konsideratë dy aspekte shumë të rëndësishme që kundërshtojnë njëri-tjetrin: të fragmentojë materialin fillestar, duke ruajtur integritetin e acideve nukleike që duhet të ekstraktohen. Ky shtkatërrim kryhet nëpërmjet një solucioni lizimi i cili përmban substancën litike (enzima, solvente organik, detergjentë,..) dhe aditivë për stabilizimin e acideve nukleike përgjatë

109

proçesit të purifikimit, si psh polialkoole (si saharozë, glukozë, glicerol, sorbitol, etj...) si edhe agjentë lidhës të kationeve bivalentë, në veçanti MgCl2 (si psh acid etilen-diamino-tetra acetik, EDTA, acid etilen glikol bis–(2-aminoetileter) tetraaectike, EGTA), si edhe tampon (si psh tris (hidroksimetil) aminometan klorhidrat, Tris-HCl); për bakteret Gram (+), të cilët karakterizohen nga një mur qelizor i trashë dhe rezistent është i nevojshëm përdorimi i enzimave, detergjentëve (si psh SDS) dhe trestësirave tampone në mënyrë që të rritet efikasiteti i proçesit të shkatërrimit të mbështjellave qelizore.

2. Ndarja e acidit nukleik nga komponentët e lizimit qelizor: Pas fazës së lizimit të mbështjellave qelizore, vjen veçimi i acideve nukleike nga komponentët e tjerë të lizimit, kryesisht peptide, lipide dhe polisaharadie. Eleminimi i proteinave (deproteinizimi) mund të kryhet nëpërmjet trajtimeve enzimatike me proteazë (si psh pronazë, proteazë K) shpesh të pranishmë bashkë në lizimin, ose ekstraktimin me solventë organikë (si psh fenol dhe/ose kloroform). Largimi i proteinave nga lizati është veçanërisht i rëndësishëm sepse midis proteinave janë të pranishme enzima të afta për të degraduar acidet nukleike, si edhe të proteina të afta të lidhen me acidet nukleike gjë që do të pengonte purifikimin. Përveç denatyrimit të proteinave, fenoli dhe kloroformi janë kryesisht të indikuar edhe për të ndarë acidet nukleike nga lipidet dhe nga disa polisaharide. Që të dy këto komponentë janë pak të tretshëm në ujë; shtimi i këtyre solventëve në lizatin qelizor si edhe përzierja e mëpasëshme, përcakton formimin e një emulsioni, centrifugimi i të cilit mundëson ndarjen e fazës ujore nga faza organike. Përzierjes së fenolit dhe kloroformit i shtohet zakonisht një sasi e vogël alkool izoamilik, i nevojshëm si antishkumues në fazën e përzierjes si edhe si stabilizues i tërësisë së proteinave të denatyruara midis dy fazave.

3. Precipitimi dhe marrja e acidit nukleik: acidet nukleike precipitohen me alkoole me peshë molekulare të ulët (etanol, izopropanol) në prani të kationeve monovalent ( si psh Na+, Li+, etj...). Është e mundur të lahet pelleti i ADN-së ose ARN-së së përftuar nëpërmjet centrifugimit, me etanol, në mënyrë që të largohen kriprat e precipituara bashkë me acidin nukleik. Acidet nukleike mund të ritreten në tretësira tampone të përshtatshme si (psh Tris-EDTA, TE) dhe të konservohen në temperatura nga -20°C në +4°C.

Përveç procedurave të purifikimit të sipërpërpermendura, sot është i mundur përdorimi i kiteve komerçiale.

7.2.1.1 Pastërtia e ADN-së

Pas përfundimit të fazës së ekstraktimit, sasia (përqëndrimi) dhe pastërtia e acideve nukleike mund të përcaktohen nëpërmjet metodave fluorimetrike dhe spektrofotometrike. Acidet nukleike përthithin rrezatime UV të një gjatësie vale të përfshirë në intervalin 200-320nm (rajone UVB dhe UVC të spektrit elektromagnetik), edhe pse absorbimi maksimal është në 260 nm. Në bazë të ligjit Lambert-Beer, absorbanca e matur në 260 nm është linearisht proporcionale me përqëndrimin e ADN-së ose ARN-së në solucion. Raporti midis absorbancës A260 (ADN)/A280 (proteina) përdoret për të përcaktuar pastërtinë e solucionit me acid nukleik, sepse proteinat, që janë burimi kryesor i kontaminimit, absorbojnë në 280nm. Solucione të pastra të ADN-së kanë vlera të raportit A260/A280 të barabartë me 1,8 (janë të pranueshme raporte deri në 2.0).

110

7.2.1.2 Kontaminimi i ADN Absorbimi në 230nm, pra në limitin e spektrit të absorbimit të acidit nukleik,

pasqyron kontaminimin e kampionit për shkak të substancave si karbohidrate, fenole, peptide dhe komponime aromatike. Për kampione të pastra raporti A260/A230 duhet të jetë rreth 2.2 (Vaughan et al., 2008). 7.2.2 Polimerase Chain Reaction PCR

Polymerase chain reaction (PCR; Erlich, 1989) është një teknikë e fuqishme që është shëndruar me shpejtësi në një nga teknikat më gjerësisht të përdorura në biologjinë molekulare, sepse është e shpejtë, jo e kushtueshme dhe e thjeshtë. Kjo teknikë amplifikon fragmente specifike të ADN-së duke nisur nga sasi shumë të vogla ADN-je.

Ciklet e PCR janë të thjeshta dhe përbëhen nga tre hapa:

Figura 7.1Profil i përgjithshëm i cikleve të PCR me tre stade (skematikisht)

Etapat e PCR kryehn të gjitha njëra pas tjetrës, në një seri ciklesh Figura 7.1 dhe Figura 7.2.

Cikli i parë kryhet si më poshtë:

Denatyrimi: Përgjatë denatyrimit rreth 1 minut për 95 °C, fragmentet e ADN-së nxehen në temperatura të larta, duke reduktuar helikat dyfishe të ADN-së në fije teke. Këto fije ADN-je bëhen të aksesueshëm nga primerat.

“ Annealing”: Zgjat rreth 1 minut në një temperaturë nga 45-60°C. Miksi i reaksionet i nënshtrohet ftohjes. Primerat hibridizohen me rajonet specifike komplementare në fijen e ADN-së, në këtë mënyrë formohen përsëri fije dyfishe midis primerave dhe sekuencave komplementare.

Ekstensioni (Zgjatja) : Zgjat rreth 1 minut në 72°C. Sinteza e ADN-së vazhdon në rajonin e interesit, duke sintetizuar një fije komplementare. Enzima lexon fijen opozitare dhe zgjat primerat duke shtuar nukleotide në një renditje në mënyrë që ato të përputhen. I gjithë proçesi përsëritet shumë herë.

111

Cikli i nxehjes dhe ftohjes përsëritet vazhdimisht, duke stimuluar kështu primerat për tu lidhur në sekuncat origjinale dhe që të sintetizojnë sërisht sekuenca. Enzima do të zgjasë përsëri sekuencat e primerave. Ky ciklim i temperaturave sjell kopjimin e më pas kopjimin e kopjes e kështu me rradhë, duke çuar në një rritje eksponenciale në numrin e kopjeve të sekuencave specifike (Erlich. 1989, Erlich & Arnheim. 1992, Griffiths et al., 1996, Newton & Graham. 1994. Saiki et al., 1988).

Figura 7.2 Ciklet e PCR të ilustruara

Tipikisht ciklet përsëriten 24-45 herë. Standartizimi i kushteve të proçedurës së termociklatorit është faktor thelbësor për saktësinë e rezultateve.

Shumë nga paisjet e PCR janë aktualisht të disponueshme me një sasi pusesh prej 48-96- ose edhe më shumë. Nëse duhet të përgatiten njëkohësisht disa reaksione, duhet të përkatitet një Master miks me këtë përbërje: ujë, bufer, dNTPs, primera, MgCl2 dhe Taq DNA polymerase në një tub të vetëm.

7.2.2.1 Konsiderata mbi PCR

ADN-ja. Përafërsisht çdo metodë standarte është e përshtatshme për pastrimin e ADN-së. Sasia e përshtatshme e ADN-së është midis 0.1 dhe 1 µg për ADN-në gjenomike për një miks total reaksioni prej 100 µl.

Primerat. (1) për PCR primerat duhet të jenë 10-24 nukleotide në gjatësi. (2) Përmbajtja GC duhet të jetë midis 40%-60%. (3) Primeri nuk duhet të jetë vetë-komplementar ose komplementar me ndonjë primer tjetër në miksin e reaksionit. (4) Temperaturat e shkrirjes të çifteve të primerave nuk duhet të ndryshojnë më shumë se 5°C, kështu që përmbajtaj e GC dhe gjatësia duhet të përzgjidhen në funksion të tyre. (5) Temperatura e shkrirjes dhe e aniling të primerave përcaktohen si më poshtë: kur primeri është më i shkurtër se 25 nukleotide, temperatura e përafërt e shkrirjes përcaktohet me formulën: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T). (6) Temperatura e aniling duhet të jetë rreth 5°C më e ulët sesa temperatura e shkrirjes.

Përqëndrimi i MgCl2. Meqënëse jonet Mg2+ formojnë komplekse me dNTPs, me primerat dhe me ADN-në, përqëndrimi optimal i MgCl2 duhet të përzgjidhet

112

veçanërisht për çdo eksperimet. Intervali i rekomanduar i përqëndrimit të MgCl2 është 1 deri 3 mM, nën kushte të specifikuara standarte të reaksionit.

dNTPs. Përqëndrimi i sejcilit prej dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) në miksin e reaksionit është zakonisht 200 µM, ky përqëndrim duhet të kontrollohet në mënyrë që të jetë i njëjtë (Erlich. 1989, Erlich & Arnheim. 1992, Griffiths et al., 1996, Newton & Graham. 1994. Saiki et al., 1988).

7.2.3 Xhel elektroforeza

Zhvillimi i vrullshëm i teknikave të biologjisë molekulare, i cili filloi në mesin e viteve 1970 (dhe vazhdon edhe sot) ka siguruar një seri mjetesh për të ekzaminuar strukturën fizike të ADN-së, sekuencën e nukleotideve të saj dhe mënyrën sesi gjenet lexohen e rregullohen. Njëri nga mjetet kyçe është aftësia për të vëzhguar molekulat e ADN-ve dhe për të përcaktuar gjatësinë e tyre duke përdorur një teknikë të quajtur xhel elektroforezë.

Në xhel elektroforezë, fragmentet e ADN-së lëvizin përmes një matrice poroze

të përbërë nga agarozë, një substancë si xhelatinë e përftuar nga algat e detit. Xhel agarozi derdhet në një kontenitor horizontal drejtkëndor plastik. Në njërin nga skajet e xhelit vendoset një krëhër plastik, në mënyrë që gjatë solidifikimit të xhelit të formohen puset ku të mund të vendosen kampionet e ADN-së. ADN-ja është pjesë e një miksi reaksioni që përveç të tjerash përmban edhe bufer dhe glicerol, që e bën më të rëndë se uji, kështu që ajo do të mbetet e zhytur në fund të pusit. Më pas xheli mbulohet nga një solucion bufer që mund të mbart energjinë elektrike, dhe në të dy skajet e xhelit janë të vendosura elektrodat të cilat lidhen me rrymën elektrike.

Meqënëse ADN-ja është e ngarkuar negativisht (sejcili nukleotid ka të lidhur

një fosfat të ngarkuar negativisht) ajo do të lëvizë drejt elektrodës pozitive. Molekulat më të mëdha lëvizin më ngadalë përmes agarozit, ndërkohë që ato më të vogla mund të kalojnë midis poreve më shpejt. Pra fragmentet përfundojnë të renditur në bazë të përmasave, ku fragmentet me përmasa më të vogla kanë lëvizur më shumë drejt polit pozitiv. Fig. 7.3 tregon një shëmbull të sa u përmend më sipër.

Meqënëse ADN-ja është e padukshme, miksi i reaksionit përmban gjithashtu

dy ngjyrues: bromfenol blu (një molekulë ngjyruese e vogël e cila sillet si një fragment ADN-je i gjatë prej afërsisht 600 bazash) si edhe ksilen cianol (një molekulë ngjyruese e madhe e cila sillet si një fragment ADN-je i gjatë prej afërsisht 4000 bazash). Këta ngjyrues formojnë vija të cilat japin idenë se sa larg ka lëvizur ADN-ja. Ndërkohë që ADN-ja migron, fragmentet e ndryshme do të formojnë banda; çdo bandë është e përbërë nga shumë kopje identike e një pjese me përmasa të posaçme të ADN-së (xhel elektroforeza nuk mund të realizohet me një molekulë ADN-je; për këtë nevojiten miliona ose miliarda molekula identike). Hapi i fundit është; përdorimi i një molekule fluoreshente e cila ndërfutet midis bazave në helikën e ADN-së që bandat e ADN-së të bëhen të dukshme. Njëra nga mënyrat është zhytja e xhelit në bromur etidi pasi ka përfunduar migrimi. Në këtë mënyrë bandat mund të vëzhgohen nëpërmjet rrezeve UV dhe të fortografohen.

113

Figura 7.3 Ndarja e fragmenteve të ADN-ve në bazë të përmasave me anë të xhel elektroforezës.

7.2.4. Efekti i përftimit të tolerancës acide në karakteristikat biologjike të shtameve të Bifidobacterium.spp

Karakterizimi krahasues midis shtmaeve acido-sensibël dhe shtameve të tyre derivuese acido-rezistentë të B. longum dhe B. catenulatum, mundësuan identifikimin e ndryshimeve fenotipike, të derivuara nga përftimit i tolerancës ndaj aciditetit, një aftësi shumë e rëndësishme për aplikimin e probiotikëve (Collado, Gueimonde, Sanz, & Salminen, 2006).

Sanchez et al., (2007), studjuan mekanizmin e cili aktivizon përgjigjen acide dhe

adoptimin ndaj acidit në Bifidobacterium longum biotype longum NCIMB 8809 dhe mutantit të tij rezistent ndaj pH-it acid B. longum biotype longum 8809dpH. U krye krahasimi i hartës së proteinave si edhe identifikimit të proteinave, duke identifikuar 9 proteina të ndryshme ku prodhimi i tyre u shtua shumë në shtamin mutant. Gjithashtu u vunë re diferenca të konsiderueshme në nivelin e produkteve fundore metabolike dhe në statusin redoks të qelizave midis shtamit origjinal dhe atij mutant si rezultat i pëgjigjes apo adoptimit ndaj acidit. Si përfundim rezultatet e kësaj pune indikuan se përgjigjia dhe adoptimi ndaj pH-it të ulët tek B. longum biotype longum përfshin ndryshime në fluksin glikolitik dhe në aftësisnë për të të rregulluar pH-in e brëndshëm. Këto ndryshime u shoqëruan me një sasi më të madhe amoniumi në citoplazëm, probabilisht si rezultat i deaminimit të aminioacideve si edhe një ulje e aktivitetit hidrolitik të kriprave biliare.

M. Saarela et al., (2010), studjuan përdorimin e mundëshëm të UV mutagjenezës të

kombinuar me një hap specifik seleksionimi për të gjeneruar shtame të Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 me rezistencë më të lartë acide me një mbijetesë më të lartë në matrica ushqimore me pH të ulët. U karakterizuan një total prej 144 Bb-12 UV-mutantë. Pas një ruajtjeje të zgjatur në lëng molle (pH 3.5) u kryen teste fenotipike (toleranca acide dhe ndaj kriprave biliare, përdorimi i karbohidrateve, ndjeshmëria ndaj antibiotikëve) dhe gjenotipike (fingerprinting gjenotipik). U konkludua se në këto kushte karakteristikat fenotipike dhe gjenotipike qëndruan të pandryshuara për pjesën më të madhe të mutantëve.

114


Të gjithë shtamet pas adoptimit (Kapitulli 5), të ruajtura në kriostat në -80°C ju nënshtruan protokollit të ekstraktimit të ADN-së nga kulturë e pastër. Protokolli përshkruhet më poshtë: 7.3.1 Ekstraktimi i ADN-ve nga kulturë e pastër të shtameve origjinale dhe atyre pas adoptimit në Miks Dita 1:

-Centrifugimi i 2 tuba me nga 10 mL suspension të kulturës në terrenin e lëngshëm.

• larje me TE pufer (~ 1 mL → ri-tretje → centrifugim → eleminim i filtratit) • Ri-tretje në 1 mL TE + 15 mg lisozimë • Inkubim në 37°C gjithë natën në banjomari (arrihet një pamje si qumësht për

shkak të prishjes së paretit qelizor)

Dita 2°

• Lizimi i qelizave duke shtuar: - 3 mL Lysis Pufer - 220 μl SDS 10% w/v - 150 μl Proteinase K (soluzion stok 20 mg/mL)

• Inkubim në 60°C për 2 orë në banjomari (përftohet një solucion i kthjellët) • Shtim i 1 mL tretësirë NaCl të ngopur dhe përzierje me anë të inversionit të

ngadaltë • Centrifugim 8000 rpm në °t ambjenti për 15 min • Transferim i surnaktantit në një tub të ri (duke pasur kujdes që të mos kalohet

në të edhe kripa!) • Precipitim i ADN-së me 2,5 volum EtOH glacial 95% (ose me një volum

izopropanoli) • Formohet një re ADN-je e dukshme dhe ajo mblidhet. Pas një përzierje tjetër

formohet edhe një re tjetër. Për ta mbledhur përdorni një baketë qelqi ose një ansë sterile.

• Larje e ADN-së me EtOH 70% • Lënie për tharje e ADN-së që të avullojë EtOH • Risospendim i ADN-së në 300 μl TE • Konservim në frigorifer në -20°C ose në 4°C për disa ditë

Në Figurën 7.4 a) dhe b) paraqiten respektivisht krijimi i shtjellës së ADN-së pas

precipitimit me EtOH dhe tharja e ADN-së në ajër pas ekstraktimit të ADN-së nga kulturë e pastër.

115

a) b) b)

Figura 7.4 Ekstraktimi i ADN-së nga kulturë e pastër. a) krijimi i shtjellës së ADN-së pas precipitimit me EtOH b) tharja e ADN-së në ajër pas ekstraktimit

7.3.2 Kuantifikimi i ADN-ve me anë të spektrofotometrit Kuantifikimi i ADN-ve u krye me anë të Spektrofotometrit UV-VIS (Figura 7.5).

ADN-të e shtameve të “precipitimit të parë” dhe “precipitimit të dytë” ishin të ruajtura në 4°C në Rehidration Buffer ADN (RBA). Me anë të spektrofotometrit u krye kuantifikimi i ADN-ve si dhe përcaktimi i raportit ʎ=230/260 si edhe ʎ=230/280, për të përcaktuar shkallën e pastërtisë së ADN-ve të ekstraktuara, që të mund të vazhdohej me to PCR. Hapi 1. - u bë ndezja e aparaturës - u bë leximi i provës së bardhë në kyvetë me 1mL (RBA) për ADN (analiza e acidit nukleik të provës së bardhë), për të taruar paisjen. Hapi 2. - në kyvetë u shtua 4µl ADN, u lexuan vlerat e raporteve: Δʎ1÷ ʎ2 dhe Δʎ1÷ ʎ3. Më pas u lexua përqëndrimi i ADN-së si C (µg/mL). - u zbraz dhe u shpëla kyveta me ujë steril “nuclease free” dhe u krye e njëjta proçedurë e sipër përmendur për të gjithë shtamet origjinale dhe fenotipet e adopturar për të dy ADN-të e ekstraktuara (“precipitimi i parë dhe i dytë”). Pas mbarimit të proçedurës ADN-të u ruajtën në frigorifer 4°C.

Figura 7.5 Kuantifikimi i ADN-ve me Spektrofotemetër

116

7.3.3 Kunatifikimi i ADN-ve me anë të TECAN

• Hollimi i ADN-ve

ADN-të e kuantifikuara për tju nënshtruar më pas PCR me Primer Box duhet të kenë një përqëndrim 25-50µg/mL, për këtë u krye hollimi i tyre me TRIS, në raportin 1:5 nisur nga sasia që rezultoi në kuantifikim. U pipetuan 160µl Tris+40µl ADN= total 200µl ADN e holluar. Më pas u krye përsëri kuantifikimi i kësaj alikuote por kësaj rradhe me TECAN (The Infinite® 200 PRO NanoQuant –multimode microplate reader) Switzerland. Ky përcaktim u krye në mënyrë që të kishim një përqëndrim të ADN-ve nga 25-50 µg/mL të saktë (Figura 7.6).

• Kuantifikimi i ADN-ve me TECAN:

Në piastrën e quajtur “nano quant plate” me 16 pozicione, u vendos për çdo pozicion nga 2µl prova e bardhë “TRIS 5mmolar”, më pas u bë leximi i provës së bardhë nëpërmjet një software të lidhur me paisjen që karikon në sistem automatikisht të dhënat (Figura 7.7). Pas pastrimit të pozicioneve të piastrës, u karikuan në të 16 pozicionet nga 2 µl të ADN-ve të shtameve në një rend të paracaktuar. U krye leximi i vlerave për to. Në bazë rezultateve të marra u krye më pas hollimi përfundimtar i ADN-ve që të mund të arrinin intervalin e duhur të përqëndrimit të përshtatshëm për aplikimin e PCR me primer BOX.

a) b)

Figura 7.6 Kuantifikimi i ADN-ve me a) TECAN, (The Infinite® 200 PRO NanoQuant –multimode microplate reader) Switzerland. b) Nano Quant Plate

Figura 7.7 Karikimi i rezultateve të përqëndrimit dhe raportit gjatë kuantifikimit të ADN-ve me TECAN

117

7.3.4 Polimerase chain reaction (PCR)

Krahasimi i fingerprinting të shtameve origjinale dhe atyre pas adoptimit u krye me dy metoda, PCR-BOX dhe PCR-ERIC. 7.3.4.1 PCR me primer BOX

PCR-BOX u realizua duke përdorur primerin: - BOXA1R (5’CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3’), (Masco et al., 2003).

Hollimi i ADN-ve: Për të realizuar PCR me primer-at BOX, ADN-të u holluan në përqëndrimin 30µg/mL. Pasi u krye hollimi i ADN-ve u përgatit MIKS-i i reaksionit, përbërë nga këto komponentë: MIKS 10.00µl MIKS 240.00 µl Coral 2.00 µl Coral 48.00 µl Primer BOX 0.40 µl x 24* = Primer BOX 9.60 µl dntps 0.004µl Dntps 1.00 µl ADN 2.00 µl ADN 2.00 µl dH2O 5.56 µl dH2O 134.00 µl * U krye përllogaritja sikur të ishin 24 kampione dhe jo 20 sa ishin realisht, për të futur edhe gabimet e pipetimit.

Gjithsej ishin 20 kampione, 10 shtame origjinale dhe 10 shtamet e adoptuar, 2 prova kontrolli që kishin brënda të gjithë komponentët e MIKS-it të reaksionit përveç ADN-ve. Miks-i pa praninë e ADN-ve u përgatit për 24 kampionet total, e më pas u shpërnda në seicilin tub të vogël konik (pjesë të strips-ave) të 20 kampioneve nga 18µl për shtam ku më pas u shtua 2µl ADN përkatëse për 20 kampionet (Figura 7.8).

Figura 7.8 Përgatitja e Miksit të reaksionit në kapë për të kryer PCR

118

Më pas u krye PCR në Termociklator Veriti® 96-Well, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, USA (Figura 7.9). Konkretisht ciklet e PCR BOX ishin:

- Volumi i reaksionit 20µl - Stadi 1 – 1 cikël 95°C, 5 min - Stadi 2 – 35 cikle 92°C, për 30 sekonda

50°C, për 1minutë 65°C, për 8 minuta - Stadi 3 – 1 cikël 65°C, për 8 minuta

PCR u krye gjatë natës dhe i gjithë cikli zgjati 6 orë e 30 minuta. Pas mbarimit të ciklit termociklatori ul automatikisht temperaturat në 4°C për të bërë ruajtjen e kampjoneve deri sa të hapet paisja.

Figura 7.9 PCR me primer BOX, kryer në termociklator Veriti® 96-Well, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, USA

7.3.4.2 PCR me primer ERIC

PCR – ERIC u krye në përputhje me metodën e përshkruar nga Ventura et al,. (2006), me modifikime të vogla, duke përdorur primerat:

- ERIC (5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’) dhe - ERIC2 (5’ ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’) (Ventura et al., 2003). Për të realizuar PCR me primer-at ERIC, ADN-të u holluan në përqëndrimin

30µg/mL. Pasi u krye hollimi i ADN-ve u përgatit MIKS-i i reaksionit. Në këtë rast në MIKS-in e reaksionit u karikua 1.5µl ADN dhe jo 2µl si në rastin e PCR BOX, sepse në të fundit, nga fotot e Xhelit rezultoi ADN shumë e përqëndruar. MIKS-i i reaksionit: MIKS 10.00µl MIKS 240.00 µl Coral 2.00 µl Coral 48.00 µl MgCl 1.20 µl MgCl 30.00 µl Eric 1 1.00 µl x24* = Eric 1 24.00 µl Eric 2 1.00 µl Eric 2 24.00 µl ADN 1.50 µl ADN 1.50 µl dH2O 3.30 µl dH2O 79.20 µl * U krye përllogaritja sikur të ishin 24 kampione dhe jo 20 sa ishin realisht, për të futur edhe gabimet e pipetimit.

119

Gjithsej ishin 20 kampione, 10 shtame origjinale dhe 10 shtamet e adoptuar, 2 prova kontrolli që kishin brënda të gjithë komponentët e MIKS-it të reaksionit përveç ADN-ve. Miks-i pa praninë e ADN-ve u përgatit për 24 kampionet total, e më pas u shpërnda në secilin tub të vogël konik (pjesë të strips-ave) të 20 kampioneve nga 18.5µl/shtam ku më pas u shtua 1.5µl ADN përkatëse për 20 kampionet.

Më pas u krye program i amplifikimit PCR në Termociklator Veriti 96 (Figura 7.10).

Konkretisht ciklet e PCR ERIC ishin: - Stadi 1 – 1 cikël 95°C, 5 min - Stadi 2 – 35 cikle 94°C, për 30 sekonda

48°C, për 30 sekonda 72°C, për 4 minuta - Stadi 3 – 1 cikël 72°C, për 6 minuta 4°C, në infinit

PCR u krye gjatë natës. Pas mbarimit të ciklit termociklatori ul automatikisht temperaturat në 4°C për të bërë ruajtjen e kampjoneve deri sa të hapet paisja.

Figura 7.10 PCR me primer ERIC, kryer në termociklator Veriti

7.3.5 XHEL-elektroforeza

U përgatit xheli me 163 mL TBE 2% dhe 2% agaroz. Sasia e këtyre komponimeve

varet nga volumi (ose përmasat) që përzgjidhen për të bërë xhelin, konkretisht; u bë përllogaritja në funksion të brinjëve të drejtkëndëshit të bazamentit të përzgjedhur dhe lartësisë së tij prej 0.5cm. Më pas u krye përzierje dhe vlim për trejtje të plotë të agarozit.

Më pas u kalua përzierja në vasketën përkatëse, u vendos krëhëri për krijimin e puseve (gropëzave) për kampionet e miksit të reaksionit, u la xheli për tu solidifikuar në temperaturë ambjenti për 20-30minuta. Pas solidifikimit u hoq krëhëri, dhe u shtuan në puset përkatëse mikset e reaksionit me ADN-të e shtameve si edhe të laderit kontroll prej 1Kb (Figura 7.11).

120

Figura 7.11 Karikimi i miksit të reaksionit me ADN-të në puset e xhelit për elektroforezë

Më pas u mbyll dhoma elektroforetike, u aktivizua fusha elektrike duke aplikuar një diferencë tensioni 7 V/cm (Figura 7.12).

Figura 7.12 Migrimi i bandave të ADN-ve me anë të aplikimit të xhelelektroforezës

Pas migrimit u vendos xheli në një vasketë me 500 mL TBE dhe 30µl solucion ngjyrues Bromur Etidi dhe u la në përzierje të vazhduar për 30-40 minuta (Figura 7.13). Profilet fingerprinting u vëzhguan duke vendosur xhelin në një trans-iluminator nën rreze UV, 260 nm nëpërmjet (Molecular Imager Xhel Doc XR System (BIO-Rad), California. U bë krahasimi i bandave të përftuara nëpërmjet imazheve.

Figura 7.13 Ngjyrosja e xhelit me Bromur etidiumi pas migrimit të bandave

121

7.4 Rezultate 7.4.1- Kuantifikimi i ADN-ve dhe përcaktimi i pastërtisë së tyre

Si nga rezultati i raporteve ashtu edhe nga kuantifikimi i ADN-ve të shtameve

origjinale dhe atyre të adoptuar, rezultuan të mjaftueshme në sasi ashtu edhe shumë të pastra.

Nga rezultatet e “precipitimit të dytë”, vlerat e raporteve Δʎ1÷ ʎ2 dhe Δʎ1÷ʎ3 tregojnë shkallë të lartë papastërtie pra këto ADN nuk mundeshin të përdoreshin për provat e rradhës. Ndërsa vlerat e raporteve të “precipitimit të parë” treguan ADN me nivel pastërtie shumë të lartë.

Tabela 7.1 Përqëndrimi dhe raportet e pastërtisë së ADN-ve së ekstraktuara totale, të shtameve origjinale dhe të adoptuar, sipas përcaktimit nëpërmjet spektrofotometrit

*indeksi (+), tregon ADN-në e ekstraktuar nga “precipitimi i dytë”, indeksi (ad), tregon ADN-në e

ekstraktuar nga shtami i adoptuar. Nga rezultatet e mara nga kuantifikimi, proçedura e ekstraktimit të ADN-ve rezultoi e

kryer saktësisht, sepse vërehen përqëndrime të ADN-ve në nivele të pranueshme edhe të larta (Tabela 7.1), gjithashtu raporti ʎ260/ʎ280 ka rezultuar në vlera që tregojnë nivel pastërtie shumë të lartë të ADN-ve të ekstraktuara, veçanërisht për ADN-të e “precipitimit të parë”. Për të kryer PCR u përdorën ADN-të e “precipitimit të parë”. Mbledhja e ADN-ve edhe nga “precipitimit i dytë” u krye për arsye të krijimit të një kampioni rezervë në rast se përqëndimi i ADN-së së ekstraktuar nga “precipitimit i parë” ishte në nivel të ulët. Raporti ʎ260/ʎ280 varjon për të njëzetë kampionet nga 1.93 në 2.83 (Tabela 7.2) ndërkohë që sipas literaturës ky raport duhet të jetë i barabartë me 1,8 (janë të pranueshme raporte deri në 2.0). Për këtë u mundësua kryerja e PCR-BOX dhe PCR-ERIC për të njëzetë kampionet. U përdorën dy tipe primer-PCR, sepse në provën e parë fingerprinting nuk doli shumë i saktë (banda të ngjeshura dhe të pa shkëputura mirë), për shkak të përqëndrimit të lartë të ADN-ve të përfshirë në miksin e reaksionit (2 µl). Për këtë në PCR-ERIC u përdor një sasi më e vogël ADN-je prej 1.5µl.

122

Tabela 7.2 Përqëndrimi dhe raportet e pastërtisë së ADN-ve të ekstraktuara të shtameve origjinale dhe të adoptuar pas hollimit të parë, sipas përcaktimit nëpërmjet

TECAN

Pozicionet në nanoplate dsDNA_1 260 280

Përqëndrimi ng/µl Raporti

ID-ja e Kampioneve

A1 0.0961 0.0485 96.1 1.98 P32 A2 0.2825 0.1389 282.5 2.03 P32+ B1 0.0769 0.0377 76.9 2.04 B609 B2 0.1496 0.0706 149.6 2.12 B609+ C1 0.1124 0.0545 112.4 2.06 B2150 C2 0.2914 0.1427 291.4 2.04 B2150+ D1 0.0787 0.0383 78.7 2.05 MB29 D2 0.2664 0.0942 266.4 2.83 MB29+ E1 0.1056 0.0506 105.6 2.09 M354 E2 0.5677 0.2585 567.7 2.2 M354+ F1 0.0805 0.0387 80.5 2.08 B1958 F2 0.3221 0.1696 322.1 1.9 B1958+ G1 0.242 0.1212 242 2 MB16 G2 0.2654 0.1313 265.4 2.02 MB16+ H1 0.1753 0.0866 175.3 2.02 RA18 H2 0.3919 0.1885 391.9 2.08 RA18+ A1 0.2761 0.1331 276.1 2.07 B1958 A2 0.2336 0.1213 233.6 1.93 B1958+ B1 0.0985 0.0478 98.5 2.06 B609 B2 0.0472 0.0228 47.2 2.07 B609+ C1 0.1496 0.0754 149.6 1.98 B2150 C2 0.2256 0.1148 225.6 1.97 B2150+

Në Tabelën 7.2 është paraqitur përcaktimi i përqëndrimit të ADN-ve dhe raportit të

pastërtisë pas hollimit të parë të kampioneve të marra nga ekstraktimi i ADN-ve totale të shtameve orgjinalë dhe atyre të adoptuar.

7.4.2 Krahasimi i profileve fingerprinting të shtameve origjinale me ato të adoptuar

Ashtu si u përmend edhe tek materiale dhe metoda, për të krahasuar profilet

fingerprinting të shtameve origjinale dhe atyre të adoptuar, u kryen dy PCR me dy metoda. Më poshtë në Fig. 7.4 janë paraqitur vetëm profilet fingerprinting të marra nga PCR ERIC.

123

a) Lader B609(O) B609(A) B2150(O) B2150(A) B1279(O) B1279 (A) 1Kb

b) Lader B2339(O) B2339(A) B1958(O) B1958(A) MB16(O) MB16(A) 1Kb

c) Lader M354(O) M354(A) P32(O)/(A) RA18 (O) RA18(A) MB29(O)/(A) 1Kb * indeksi (O)- shtami origjinal, (A)- shtami i adoptuar Figura 7.14 Profilet fingerprinting për 20 kampionet e ADN-ve të shtameve origjinale dhe atyre të adoptuar; a) B.breve B609(O), B609(A), B2150(O), B2150(A), B.pseudocatenulatum B1279(O), B1279 (A), b) B.pseudocatenulatum B2339(O) B2339(A), B.bifidum B1958(O), B1958(A), B.thermofilum MB16(O), MB16(A), c) B.animalis.subsp.lactis M354(O), M354(A), P32(O)/(A), RA18 (O), RA18(A), MB29(O) dhe MB29 (A)

124

Nga Fig 7.14, vërehet që për të gjithë shtamet, pavarësisht species, profilet fingerprinting janë identike, midis shtamit origjinal dhe shtamit i cili ka kaluar proçedurën e adoptimit gradual të zgjatur në matricën miks me lëng boronice.

7.5 Diskutime

Në këtë fazë studimi u synua të përcaktoheshin ndryshimet probabël në profilet fingerprinting të shtameve origjinale dhe atyre të cilët ju nënshtruan proçedurës së adoptimit në matricën miks TPY lëng+lëng boronice, konkretisht; B.breve B609(O), B609(A), B2150(O), B2150(A), B.pseudocatenulatum B1279(O), B1279(A), b) B.pseudocatenulatum B2339(O), B2339(A), B.bifidum B1958(O), B1958(A), B.thermofilum MB16(O), MB16(A), c) B.animalis.subsp.lactis M354(O), M354(A), P32(O)/(A), RA18 (O), RA18(A), MB29(O) dhe MB29 (A). Nga rezultatet e marra gjatë kryerjes së proçedurave të ekstraktim/kuantifikimit, kampionet e ADN-ve rezultuan me një përqëndrim dhe pastërti shumë të lartë. Nga vëzhgimi i profileve nëpërmjet rrezeve UV, vërehet që për të gjithë shtamet, pavarësisht species, profilet fingerprinting janë identike midis shtamit origjinal dhe shtamit i cili ka kaluar proçedurën e adoptimit gradual të zgjatur në matricën miks me lëng boronice.

Si konkluzion proçedura e vazhduar e zgjatur në matricën miks TPY+lëng boronice,

nuk shkakton asnjë ndryshim në nivel fingerprinting. Ky rezultat mbështetet edhe nga studime të tjera të kohëve të fundit, ku sipas Saarela et al., (2010), të cilët përftuan 144 Bb-12 UV-mutantë dhe pas ruajtjes së zgjatur në lëng molle (pH 3.5), u konkludua se në këto kushte karakterisrikat fenotipike dhe gjenotipike qëndruan të pandryshuara për pjesën më të madhe të mutantëve. Kryesisht studimet janë përqëndruar në studimin e karakteristikave të shtameve mutante të përftuara nëpërmjet aplikimit të UV mutagjenezës, krahasuar ky me trajtimin aktual të studimit tonë (adoptim i vazhduar në kushtet e lëngut të boronicës) ku si faktor stresi më ndikues ishte pH-i i ulët, ishte pak probabël që të dalloheshin ndryshime në nivel profilesh fingerprinting. Pavarësisht kësaj, kjo pjesë e studimit synoi që të kryente një investigim, duke qënë se nga rezultatet e marra nga Kapitulli 6, mbi rezistencën e shtuar të shtameve karshi kushteve të lëngut të boronicës, pra aftësisë së fituar të tyre karshi kushteve acide u hodh hipoteza mbi ndryshimet probabël në nivel fingerprinting. Nga studime të shumta janë analizuar modifikimet biologjike në shtamet e Bifidobacterium.spp pas përftimit të aftësisve rezistuese ndaj pH-it ose pas aktivizimit të ATR nga qelizat e tyre në kushtet e stresit të hasur.

Në përgjithësi, derivatet acdio-rezistente paraqitën aftësi më të larta fermentuese si edhe aktivitet enzimatik, si të glukozidazës (Sanchez et al., 2005). Shtamet acido-tolerante paraqitën një rezistencë më të ulët ndaj shumicës së antibiotikëve të testuar krahasuar me shtamet mëmë, për shkak të ndryshimeve të parametrave të tyre të sipërfaqes qelizore (Collado & Sanz, 2006b). Disa nga shtamet acido-rezistente kanë treguar gjithshtu një aderencë më të lartë në mukusin intestinal dhe aftësi më të lartë për të zëvendësuar bakteret patogjene (Collado, Gueimonde, Sanz, & Salminen, 2006).

125

Sanchez et al., (2007) identifikuan 9 proteina të ndryshme ku prodhimi i tyre u shtua shumë në shtamin mutant të Bifidobacterium longum biotype longum NCIMB 8809 si rezultat i pëgjigjes apo adoptimit ndaj acidit dhe u vunë re diferenca të konsiderueshme në nivelin e produkteve fundore metabolike dhe në statusin redoks të qelizave.

7.6 Konkluzione - Shtamet e përftuara pas adoptimit në matricën Miks, me aftësi të përmirësuara ndaj kushteve të lëngut të boronicës, nuk paraqitën ndryshime në nivel gjenotipik (në profiling fingerprinting), duke paraqitur një profil identik me shtamin mëmë.

126

KAPITULLI 8. Mbijetesa në lëng e dy shtameve B.breve të mikroinkapsuluara dhe “të lira”

8.1 Përmbledhje Synimi i kësaj faze studimi ishte testimi i ndikimit të mikroinkapsulimit në

mbijetesën e shtameve probiotikë inokuluar në lëngun e boronicës. Për këtë u inokuluan shtamet B.breve BR 03 dhe B632 në lëng boronice në temperaturë 37°C anaerobiozë si edhe në një provë të dytë në 37°C dhe 4°C aerobiozë. Nga rezultatet e marra, u dallua një mbijetesë në nivel më të lartë e shtamit BR03 në të dyja temperaturat e inkubimit në lëngun e boronicës. Gjtithashtu u vu re se shtamet në trajtë të lirë paraqitën një nivel ndjeshmërie të lartë karshi lëngut, duke e humbur totalisht vitalitetin e tyre pas 24 orësh në lëng, edhe në trajtë të mikroinkapsuluar ato paraqitën përsëri rezistencë të ulët, ku B632 humbi totalisht vitalitetin ndërsa BR 03 humbi 6 shkallë logaritmike. Një nivel i lehtë ndikimi në mbijetesën e shtamit BR 03 në 37 °C në aerobiozë u vu re në këto kushte, ku shtami humbi vitalitetin e tij me një kinetikë më të përshpejtuar krahasuar me inkubimin në anaerobiozë për të njëjtën temperaturë.

8.2 Hyrje

Mikroinkapsulimi përkufizohet si “një teknologji për paketimin e solideve, likuideve, ose të substancave të gazta në miniaturë, kapsula të vulosura që mund të lëshojnë jashtë përbërjen e tyre në nivele të caktuara në kushte specifike” (Shahidi & Han, 1993).

Është një proçes me anë të të cilit një matricë e brëndshme e paqëndrueshme mbështillet nga lëndë mbështjellëse të përshtatshme për stabilitet dhe mbrojtje më të lartë ndaj mjedisit rrethues të pafavorshëm (pH i ulët, oksigjeni i tretur, etj...) (Kailasapathy, 2002). Mikroinkapsulimi i organizmave probiotikë është me interes të lartë për industrinë e ushqimeve probiotike, sepse është mënyra më e mirë për të ruajtur fuqinë e mikroorganizmave probiotike për tu lëshuar më pas në GI (Siuta-Cruce & Goulet, 2001).

Arsyet kryesore për përdorimin e kësaj metode janë si më poshtë: përmirësimi i vitalitetit dhe stabilitetit të kulturave probiotike gjatë prodhimit, ruajtjes dhe kalimit përgjatë GIT (Kailasapathy, 2002; Krasaekoopt et al., 2003; Sultana et al., 2000), për të siguruar një lëshim të kontrolluar dhe efiçent të baktereve probiotike në GIT (Crittenden et al., 2006; Kailasapathy, 2002), për një menaxhim më të lehtë të kulturës (Picot & Lacroix, 2003b), efekt i limituar mbi parametrat sensorialë të produktit që përmban mikrokapsulat (Picot & Lacroix, 2003b).

Ka disa metoda mikroinkapsulimi për probiotikët, duke përfshirë tharjen spray, ngrirjen spray, tharjen me shtrat fluid, emulgimi, ekstrusionin (shtrydhjen), ndarjen fazore (Kailasapathy, 2002). Megjithatë dy nga teknikat më gjerësisht të përdorura për inkapsulim janë ektrusioni dhe emulgimi (Krasaekoopt et al., 2003). Për mikroinkapsulimin e probiotikëve përdoren një seri e gjërë susbstancash inkapsuluese, duke përfshirë, kripë të acidit alginik (alignat), amidon, alignat-amidon, ftalat acetoili i celulozës, κ-carrageenan, xhelatinë, xhel me bazë ksantani, kitosan dhe proteina hirre (Doleyres & Lacroix, 2005; Krasaekoopt et al., 2003).

127

8.2.1 Rezistenca e baktereve të mikroinkapsulura në kushte të ndryshme stresi Rezistenca e baktereve të ndryshme probiotike të lira dhe të

mikroinkapsuluara, karshi ndryshimeve të pH-it dhe pranisë së lëngjeve gastrike, është studjuar gjërësisht. Mokarram et al., (2009) studjuan numrin e shtresave të alignatit në mbijetesën e LA (PTCC1643) dhe L. rhamnosus (PTCC1637) në kushtet e GI. Në këtë studim, mikroinkapsulimi me anë të një shtrese dyfishe alignati (rreth 100 μm) u zbulua se siguronte mbrojtje më të mirë karshi humbjes së vitalitetit për të dy shtamet bakterialë si në kushtet e lëngut gatstrik (pH 1.5, 2 orë) ashtu edhe lëngjeve intestinale (pH 7.25, 2 orë). Chandramouli et al.,(2004) dhe Kim et al., (2008) gjithashtu treguan se mikroinkapsulimi me alignat rriti mbijetesën e LA CSCC 2400 dhe ATCC 43121, përkatësisht në kushtet e GI. Lyer & Kailasapathy, (2005) raportuan se LA i mikroinkapsuluar në një apo dy shtresa kitosan dhe amidon rezistent, tregoi një humbje të vitalitetit prej 1 x 102 ose 3 x 103 CFU/g, përkatësisht në kushte e GI, ndërkohë që për LA në trajtë të lirë u vërejt një humbje e vitalitetit prej 1 x 105 CFU/g.

Mandal et al., (2006) zbuluan se mbijetesa e L. casei (NCDC-298) u përmirësua me rritjen e përqëndrimit të algnatit në pH 1.5 për 3 orë, dhe Li et al., (2010) konfirmuan këtë rezultat për L. casei (ATCC 393). Rezultate të ngjashme u raportuan nga Sun & Griffiths (2000) edhe për B.infantis ATCC 15697 i mikroinkapsuluar në “gellan gum” (0.75%) dhe ksantan (1%) në pH 1.5 deri 2.5. Sun & Griffiths, (2000) gjithashtu zbuluan se B. infantis i mikroinkapsuluar, i shtuar në kos të pasterizuar mbijetoi pesë javë në kushte frigoriferike. Megjithatë, Trindade & Grosso, (2000) raportuan se mikroinkapsulimi i B. lactis dhe LA me alignat kalciumi ishte jo efektiv në mbrojten e qelizave ndaj ekspozimit me kripra biliare në përqëndrim 2% dhe 4%, përkatësisht.

Studimet që kanë përshkruar rezistencën ndaj kushteve të GI të baktereve të ndryshme, kanë vënë në dukje një tendencë varësie specie-specifike. Ding & Shah, (2009) vlerësuan efektin e pH-it acid (pH 2.0) mbi vitalitetin prej (1010 CFU/g) të LA, L. rhamnosus, B. longum, L. salivarius, L. plantarum, L. paracasei, dhe B. lactis (type BI-O4 dhe Bi-07) të mikroinkapsuluar me substanca të ndryshme. LA ishte njëri nga mikroorganizmat më tolerantë (105 deri 108 CFU/g) në aciditet (pH 2.0, 2 orë) dhe në prani të kriprave biliare, veçanërisht në rastin kur ishte i mikroinkapsuluar në aligant dhe ksantan.

Rezistenca e probiotikëve të mikroinkapsuluar varet gjithashtu nga materiali mbështjellës i përzgjedhur.

Ding & Shah (2008), studjuan mbijetesën e baktereve probiotike të lira dhe të

mikroinkapsuluara në lëng portokalli dhe lëng molle. U përdorën tetë shtame të ndryshme bakteresh probiotike, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, L. salivarius, L. plantarum, L. acidophilus, L. paracasei, B. lactis type Bi-04 dhe B. lactis type Bi-07. Bakteret e lira dhe bakteret e mikroinkapsuluara u inokuluan në lëngjet e portokallit dhe mollës dhe u monitorua mbijetesa e tyre një herë në javë për gjashtë javë. Gjithashtu u monitoruan, Grada Briks, përqëndrimi i acidit malik dhe pH-i. Bakteret e inkapsuluara mbijetuan në lëngjet e frutave përgjatë ruajtjes për gjashtë javë, ndërsa bakteret e lira e humbën mbijetesën e tyre brënda pesë javëve. Në përgjithësi lëngjet e frutave që përmbanin baktere

128

probiotike të mikroinkapsuluara ishin më të qëndrueshëm në parametra sesa ato që përmbanin baktere probiotike të lira.

Ding & Shah (2007), studjuan tolerancën karshi aciditetit dhe kripërave

biliare të baktereve probiotike, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, L. salivarius, L. plantarum, L. acidophilus, L. paracasei, B. lactis type Bi-04 dhe B. lactis type Bi-07. Për të rritur mbijetesën e këtyre baktereve në aciditet të lartë dhe prani të kriprave biliare, u përdor mikroinkapsulimi i tyre në matricë alignati. Mikroorganizmat në trajtë të lirë u përdorën si kontroll. Toleranca acide e mikroorganizmave probiotikë u testua duke përdorur HCl në terren të lëngshëm MRS përgjatë një periudhe inkubimi prej 2 orësh. Rezultatet treguan se mikroorganizmat e mikroinkapsuluar mbijetuan më mirë sesa bakteret e lira në MRS me HCl. Në përgjithësi u konkludua se mikroinkapsulimi përmirësoi mbijetesën e baktereve probiotike karshi ekspozimit ndaj kushteve acide, kripërave biliare dhe trajtimit mesatar termik.

8.2.2 Aspekte sensoriale të ushqimeve me probiotikë të mikroinkapsuluar

Është vërtetuar se shtimi i probiotikëve në produkte bulmetore dhe jo- bulmetore, modifikon parametrat e tyre sensorialë: Produktet ushqimore jo-bulmetore (si psh lëngjet e frutave probiotikë) ndryshojnë gjithashtu parametrat e tyre sensorialë pas shtimit dhe/ose pas fermentimit me baktere probiotike (de Souza et al., 2012; Hassan et al., 2012). Megjithatë krijimi i karakteristikave të reja sensoriale në ushqimet e pasuruar me probiotikë mund të jetë i dëshirueshëm në disa raste, ndërsa zakonet ushqimore të disa konsumatorëve mund të cilësojnë këto karakteristika si të papëlqyeshme.

Karakteristika e padëshirueshme të përmendura më sipër si në formulimin e ushqimeve bulmetore (Ozer et al., 2008, 2009) ashtu edhe në ato jo-bulmetore, mund të evitohen me anë të përzgjedhje së duhur të shtameve si edhe të metodës së inkapsulimit. Si është përmendur edhe më sipër, përfshirja e baktereve probiotike në mikrosfera gjysëm të përshkueshme polimerike (1 deri 1000 μM) krijon izolimin fizik të baktereve nga mjedisi i jashtëm, duke ruajtur ndërkohë një mikromjedis të brëndshëm “mikpritës” (Rathore et al., 2013). Sipas Fahimdanesh et al., (2012) L. casei dhe B. bifidum të mikroinkapsuluar përmirësuan karakteristikat sensoriale të majonezës. Megjithatë është e detyrueshme të konsiderohet forma dhe përmasat e mikrosferave finale sepse ato mund të ndikojnë në pranueshmërinë shqisore të produktit që i përmban.


Në këtë fazë u studjuan kurbat e mbijetesës së dy shtameve B.breve: BR03 dhe B632 në trajtë të inkapsuluar dhe jo inokuluar në lëng boronice.

- Dy shtame të mikroinkapsuluar, B.breve: BR03 dhe B632 në trajtën e granulave të vogla të liofilizuara të ruajtur në kontenierë sterilë.

129

8.3.1 Studimi i vitalitetit të dy shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë” 24 orë në lëngun e boronicës

• Përcaktimi i numrit të qelizave në 1 gr granulë mikroinkapsulati U bë peshimi në tuba konikë sterilë i 1g granulë për sejcilin nga shtamet: B.breve

BR03MC, B632MC. U prish shtresa lipidike e mikroinkapsulimit me 10 ml tretësirë tampone Borati, pH 8.4, duke e përzierë energjikisht dhe vazhdimisht dhe duke e lënë të veprojë 10 minuta. Përcaktimi i numrit të qelizave u krye me anë të kultivimit të hollimeve të suspensioneve në dy pjata paralele në TPY agar dhe TPY agar + Mupirocinë në sasinë 50µg/100ml, për të bërë krahasimin e numrit të qelizave në rast kontaminimi me baktere të huaja kryesisht laktobacile. Pas inkubimit në anaerobiozë 37°C/24 orë u krye numërimi i kolonive të rezulturara në pjata.

• Përgatitja e inokulit me qeliza “të lira”, për provën në lëng boronice

U izoluan nga dy koloni për sejcilin shtam nga pjatat me TPY agar+Mupirocinë në

TPY lëng, inkubim në termostat në anaerobiozë 37°C/24 orë. Tre rinfreskime të njëpasnjëshme në TPY lëng të freskët pas çdo 24 orë inkubim.

U krye përcaktimi i përqëndrimit të qelizave të inokulit fillestar në lëng me metodën e hollimeve limite dhe kultivim në TPY agar. Kalimi i kulturave të “lira” në 6mL lëng boronice. Inkubim në anaerobiozë në 37°C/24 orë.

• Përgatitja e inokulit për shtamet e mikroinkapsuluara.

Nga përcaktimi i sasisë së qelizave në 1 gramë granulë mikroinkapsulati, njihej

rrjedhimisht përqëndrimi qelizor i inokulit fillestar që do të përdorej.

Për 1g granulë të liofilizuar mikroinkapsulati rezultoi:

BR03=8 x1011 CFU/1g granulë

B632=7 x1011 CFU/1g granulë

Për këtë u peshua 0.5g granulë e liofilizuar mikroinkapsulat dhe u kalua në 6mL lëng boronice.

BR03=4x1011 CFU/1g granulë

B632=3.5x1011 CFU/1g granulë

Inkubim në anaerobiozë në 37°C/24 orë.

• Përcaktimi i rezistencës së shtameve të mikroinkapsuluar dhe jo 24 orë në 6mL lëng boronice:

- Shtamet e “lira”

Pas 24 orë inkubim në anaerobiozë në 37°C në 6mL lëng boronice, u krye proçedura e zakonshme e hollimeve për të përcaktuar rezistencën e tyre pas 24 orë në 37°C/anaerobiozë, në lëng.

130

- Shtamet e mikroinkapsuluara.

Për shtamet e mikroinkapsuluar proçedura e hollimeve u krye duke liruar fillimisht qelizat nga shtresa e mikroinkapsulimit, për këtë; për hollimin e parë, 10-1 u përdorën 9 mL solucion tampon borati pH 8.4. Më pas u proçedua si zakonisht për hollimet e tjera të cilat u kryen në 9 ml tretësirë fiziologjike. U krye kultivimi në pjatë Petri për të përcaktuar rezistencën e tyre pas 24 orë në 37°C/anaerobiozë, në lëngun e boronicës.

Pas inkubimit u krye numërimi i kolonive të zhvilluara në pjata për të përcaktuar vitalitetin e këtyre kulturave në trajtë “të lirë” dhe të mikroinkapsuluar 24 orë në 6mL lëng boronice.

Prova e rezistencës së mësipërme u krye dy herë për shkak të rezistencës së dobët të paraqitur nga shtamet, në mënyrë që të konfirmoheshin rezultatet!!!!!

Figura 8.1 Përcaktimi i rezistencës së shtameve të mikroinkapsuluar dhe jo, 24 orë në 6mL lëng boronice

8.3.2 Përcaktimi i kurbës së mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50mL lëng

Për shtamet B632 dhe BR03 të mikroinkapsuluar u përcaktua kurba e jetë/vdekjes për një periudhë kohore prej 3 ditësh.

Dita.1: U krye peshimi i granulës së kulturave të mikroinkapsuluara në dy paralele:

B632 A = 0.50g = 3.4x1011CFU B632 B = 0.50g = 3.4x1011CFU

BR03 A = 0.50 g = 4.7x1011CFU BR03 B = 0.50 g = 4.7x1011CFU

T0= koha fillestare. Në tuba konikë me volum 50mL, ku u peshuan granulat, u shtua 20mL lëng boronice, pipetimi i 1ml suspension kulturë+lëng dhe kalimi në një tub me 9mL tretësirë tampone Borati pH 8.4, përzierje e vazhdueshme dhe e vrullshme për 10 minuta, për të realizuar sa më mirë çlirimin e qelizave nga shtresa e mikroinkapsulimit. Më pas u kryen hollimet për të përcaktuar numrin e qelizave në kohën T0, sipas proçedurës normale duke i kultivuar në TPY agar, inkubim në termostat në 37⁰C në anaerobiozë si tubat konikë me lëng+inokul ashtu edhe pjatat e kultivuara.

131

Për T1 - pas 3orësh, T2 - pas 6 orësh, T3 - pas 24 orësh, T4 - pas 30 orësh, T5 - pas 48 orë, u përcaktua vitaliteti në të njëjtën mënyrë si në kohën T0.

• Numërimi i kolonive për të përcaktuar vitalitetin e shtameve në kohët T0, T1, T2, T3,T4,T5.

Pas inkubimit për 48 orë të pjatave të kultivuara u krye numërimi i kolonive të zhvilluara duke përcaktuar kështu numrin e qelizave të inokuluara dhe të rezistuara në lëngun e boronicës në kohën T0, në kohën T1 (3 orë në lëng), T2(6 orë në lëng), T3(24 orë në lëng), T4(30 orë në lëng) dhe T5(48 orë në lëng).

8.3.3 Përcaktimi i kurbës së mbijetesës së shtameve B.breve të mikroinkapsuluar në 20 mL lëng në dy temperatura ruajtjeje

U përcaktua rezistenca e shtameve B.breve BR03, B632, vetëm në trajtë të mikroinkapsuluar në 20 mL lëng boronice në dy temperatura ruajtjeje 4°C dhe 37°C për të përcaktuar kurbën e mbijetesës së tyre në këto kushte. Pra u veprua njësoj si në provën e sipërpërmendur (8.3.2), me një ndryshim që kontrolli i vitalitetit u krye çdo 24 orë dhe u ndryshuan kushtet e inkubimit; inkubimi u bë në kushte aerobike.

• Kalimi i inokulit fillestar në 20mL lëng

U krye peshimi i granulave të mikroinkapsulateve për të përgatitur inokulat për në lëng. Më poshtë janë paraqitur peshat e granulave dhe përqëndrimet përkatëse të shtameve të mikroinkapsuluara dhe të kaluara në nga 2 tuba konikë paralelë me nga 20 mL lëng boronice.

37°C

BR03 = 0.521g = 4.32x1011CFU/50mL lëng/2 = 2.17x1010CFU/mL lëng

B632 = 0.595g = 4.10x1011CFU/50mL lëng/2 = 2.05x1010CFU/mL lëng

4°C

BR03(R) = 0.588g =4.88x1011CFU/50mL lëng/2 = 2.44x1010CFU/mL lëng

B632(R) = 0.525g = 3.62x1011CFU/50mL lëng/2 = 1.81x1010CFU/mL lëng

• Përcaktimi i vitalitetit të shtameve në kohët e ndryshme të inkubimit në lëng boronice

U kryen sipas proçedurës së zakonshme hollimet dhe kultivimet në pjatë për kohë të ndryshme inkubimi. Pas inkubimit për 48 orë të pjatave të kultivuara, u krye numërimi i kolonive të zhvilluara duke përcaktuar kështu numrin e qelizave të inokuluara dhe të rezistuara në lëngun e boronicës për kohët e inkubimit deri në 240 orë.

132

8.4 Rezultate dhe diskutime

8.4.1 Vitaliteti i shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë” 24 orë në lëngun e boronicës

Në Grafikun 8.1, paraqitet vitaliteti i shtameve B.breve BR03 dhe B 632 në trajtë të mikroinkapsuluar dhe në trajtë të lirë.

Grafiku 8.1 Vitaliteti i shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë”, 24 orë në lëngun e

boronicës (anaerobiozë) (L) shtame në trajtë të lirë (Mic) shtame në trajtë të mikroinkpasuluar

Nga rezultatet e Grafikut 8.1, vërehet se shtamet B.breve BR03 dhe B632 në trajtë “të lirë”, inokuluar në një përqëndrim qelizor përkatësisht 2.7x109 CFU/mL dhe 2.7x109 CFU/mL, kanë humbur totalisht vitalitetin e tyre pas 24 orësh në lëngun e boronicës në 37°C anaerobiozë, duke treguar se këto shtame janë shumë të ndjeshme ndaj kushteve të ofruara nga lëngu i boronicës. Këto shtame B.breve BR03 dhe B632, edhe pse në trajtë të mikroinkapsuluar inokuluar në një përqëndrim qelizor përkatësisht 4.7x1011 CFU/mL dhe 3.4x1011 CFU/mL, paraqesin një rezistencë të ulët pas 24 orë në lëngun e boronicës; ku BR03 humbi 6 shkallë logaritmike në përqënrimin e tij qelizor, ndërsa B632 edhe pse në trajtë të mikroinkapsuluar e humbi totalisht vitalitetin pas 24 orësh në lëng. Nga këto rezultate konkludohet se mikroinkapsulimi dëmtohet nga mjedisi i orfuar nga lëngu i boronicës.

Grafiku 8.2 Rënia e Vitalitetit (%) e shtameve B. Breve të mikroinkapsuluar dhe “të lirë”, 24 orë në

lëngun e boronicës

Në Grafikun 8.2, paraqitet RV(%) për shtamet e sipërpërmendur. Ajo që spikat është se shtamet sillen në formë të ngjashme si në trajtë “të lirë” ashtu edhe në trajtë

0

2

4

6

8

10

12

BR 03 (L) BR 03 (Mic) B632 (L) B632 (Mic)

log

cfu/

mL

lëng

T0

T24

100

50

100 100

0

20

40

60

80

100

120

BR 03 (L) BR 03 (Mic) B632 (L) B632 (Mic)

RV (%

)

133

të mikroinkapsuluar që sjell si hipotezë se shtresa e mikroinkapsulimit dëmtohet pas një kohe të caktuar, duke ekspozuar këto shtame të ndjeshme ndaj kushteve agresive të pH-it acid të lëngut.

8.4.2 Kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50mL lëng në 37°C (anaerobiozë)

Grafiku 8.3 Kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50mL lëng

në 37°C/anaerobiozë Nga Grafiku 8.3 dallohet kinetika e vdekjes së shtameve B.breve BR03, B632 në

50mL lëng në 37°C. Për përftimin e grafikut janë përdorur vlerat mesatare të marra nga dy përcaktime paralele. Shtamet B.breve BR03, B632 u inokuluan në lëng në përqëndrimin qelizor përkatësisht 2.0x1010 dhe 1.7x1010. Në kohën T0, menjëherë pas inokulimit ka shumë pak diferencë në numrin e qelizave. Për kohën T3, pas 3 orë inkubim në 37°C në lëngun e boronicës vërehet një ulje e menjëhershme e numrit të qelizave të shtamit B.breve B632 i cili humbet pothuajse 7 shkallë logaritmike, duke e humbur më pas totalisht vitalitetin pas 6 orësh. Ndërsa shtami B.breve BR03 reagon në formë tjetër, duke paraqitur rezistencë më të lartë. Ky shtam paraqet një kinetikë vdekjeje relativisht graduale krahasuar me shtamin tjetër dhe humbet vitalitetin e tij plotësisht pas 120 orë inkubim në 37°C në anaerobiozë në lëngun e boronicës. 8.4.3 Kurbat e mbijetesës së shtameve B.breve të mikroinkapsuluar në 20 mL lëng në dy temperatura ruajtjeje (aerobiozë)

Për të kuptuar ndikimin e temperaturës si edhe të pranisë së oksigjenit u krye përcaktimi i vitalitetit të këtyre shtameve në dy temperatura ruajtjeje si edhe në mungesë e në prani të oksigjenit.

a) b) Grafiku 8.4 Kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 20mL lëng

boronice në a)37°C/aerobiozë dhe b) 4°C/aerobiozë

0123456789

1011

log

CFU

/mL l

ëng

BR 03 MesB 632 Mes

02468

1012

log

CFU

/mL l

ëng

BR 03 MicB632 Mic

02468

1012

log

CFU

/mL l

ëng

BR 03 MicB632 Mic

134

Në Grafikun 8.4, paraqiten kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 20mL lëng në a)37°C/aerobiozë dhe b) 4°C/aerobiozë. Nga këto kurba konfirmohen rezultatet e kryera në provën e mbijetesës në anaerobiozë. Dallohet për një mbijetesë në nivel më të lartë BR03 si edhe ajo që spikat është mbijetesa më e gjatë në temperaturën e ulët të ruajtjes në 4°C.

Grafiku 8.5 Krahasimi midis kurbave të mbijetesës së shtamit të mikroinkapsuluar B.breve BR03, në 20mL lëng në 37°C anaerobiozë dhe aerobiozë

Në Grafikun 8.5, paraqiten kurbat e mbijetesës së shtamit të mikroinkapsuluar B.breve BR03, në 20ml lëng boronice në 37°C anaerobiozë dhe aerobiozë. Nga këto kurba vërehet se shtami i inokuluar në lëng inkubuar në kushte anaerobike paraqet një mbijetesë fare pak më të lartë (<1log) krahasuar me shtamin e inkubuar në kushte aerobike, duke konkluduar se prania e oksigjenit në kushtet e mësipërme ndikon lehtësisht në mbijetesën e shtamit.

8.5 Konkluzione Nga përcaktimi i vitalitetit të shtameve B. Breve “të lirë” 24 orë në lëngun e

boronicës, vërehet se shtamet, kanë humbur totalisht vitalitetin e tyre pas 24 orësh, duke treguar se këto shtame janë shumë të ndjeshme ndaj lëngut të boronicës.

Në trajtë të mikroinkapsuluar gjithashtu paraqesin një rezistencë të ulët pas 24 orë në lëngun e boronicës, ku BR03 humbi 50% të vitalitetit të tij, ndërsa B632 humbi totalisht vitalitetin pas 24 orësh në lëng. Nga këto rezultate konkludohet se mikroinkapsulimi dëmtohet nga mjedisi i orfuar nga lëngu i boronicës.

Shtamet sillen në formë të ngjashme si në trajtë “të lirë” ashtu edhe në trajtë të mikroinkapsuluar që sjell si hipotezë se shtresa e mikroinkapsulimit dëmtohet pas një kohe të caktuar, duke ekspozuar këto shtame të ndjeshme ndaj kushteve agresive të pH-it acid të lëngut.

Nga kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në 50mL lëng në 37°C (anaerobiozë) pas 3 orë inkubim në 37°C në lëngun e boronicës, vërehet një ulje e menjëhershme e numrit të qelizave të shtamit B.breve B632 i cili humbet totalisht vitalitetin pas 6 orësh. Ndërsa shtami B.breve BR03 paraqet rezistencë më të lartë dhe humbet vitalitetin e tij plotësisht pas 120 orë.

0

2

4

6

8

10

12

logC

FU/m

L lë

ngBR 03 anaerobiozëBR 03 aerobiozë

135

Nga analizimi i kurbave të mbijetesës së shtameve B.breve të mikroinkapsuluar në 20 mL lëng në dy temperatura ruajtjeje (aerobiozë), konfirmohen rezultatet e kryera në provën e mbijetesës në anaerobiozë si edhe spikat mbijetesa më e gjatë në temperaturën e ulët të ruajtjes në 4°C.

Nga krahasimi i kurbave të mbijetesës së shtamit të mikroinkapsuluar B.breve BR03, në 20mL lëng boronice në 37°C anaerobiozë dhe aerobiozë, vërehet se shtami i inokuluar në lëng inkubuar në kushte anaerobike paraqet një mbijetesë fare pak më të lartë krahasuar me shtamin e inkubuar në kushte aerobike, duke konkluduar se prania e oksigjenit në kushtet e mësipërme ndikon lehtësisht në mbijetesën e shtamit.

136

Kapitulli 9. Konkluzione përfundimtare dhe tendencat kërkimore për të ardhmen.

9.1 Konkluzione përfundimtare Qëllimet kryesor të këtij studimi ishin:

Studimi i metodave efiçente për të rritur tolerancën e Bifidobacterium.spp karshi faktorëve të stresit si pH-i acid, për të rritur gamën dhe për të diversifikuar speciet e mikroorganizmave të përfshira në formulimin e lëngjeve probiotikë.

Studimi i mbijetesës së shtameve probiotikë në lëngun e boronicës në dy temepratura ruajtjeje, në të ftohtë dhe në kushtet e jetgjatësisë së përshpejtuar, për të përcaktuar jetëgjatësinë e këtij produkti me synim mundësinë e përdorimit të këtyre shtameve në nivel aplikues si edhe të modifikimeve të mundshme që mund të shkaktohen në lëng prej tyre.

KAPITULLI 3. Përzgjedhja e metodave për përmirësimin e rezistencës ndaj aciditetit të shtameve të Bifidobacterium.spp

Synimi i kësaj pjese studimi ishte zhvillimi i strategjive efektive për të përmirësuar tolerancën e shtameve të Bifidobacterium.spp ndaj kushteve mjedisore të ashpra (pH-it të ulët). Hap i parë ishte analizimi i zhvillimit të 10 shtameve në trajtë të liofilizuar: B.bifidum B1958, B.bifidum B2334, B.infantis B1522, B.infantis B1602, B.infantis B1652, B.longum B2402, B.longum B2426, B.longum B7231, B.breve B609, B.pseudocatenulatum B7396, në terren TPY pH 4.5, pH 4.0 dhe pH 3.5 (24 orë) në anaerobiozë 37°C. Nga ky studim shtamet më rezistente rezultuan B.bifidum B1958 dhe B. breve B609 (30 ditë rezistencë në kushtet e përmendura më sipër). U vendos që të ishin këto shtame për tju nënshtruar teknikave të ekspozimit të zgjatur ndaj kushteve të pH-it acid, duke qënë se probabilisht mund të reagonin mirë krahasuar me shtame të tjera të ndjeshme.

- Nga kjo fazë studimi u konkludua se shtamet e përzgjedhura të deklaruara rezistente ndaj pH-it 4.0 në (4°C), rezultuan gjithashtu rezistente në TPY pH 3.5 në (37°C).

- U krijua gama e shtameve shumë rezistente dhe mesatarisht rezistente në pH 3.5, nga specie të ndryshme të Bifidobacterium, si B.bifidum, B.breve, B.infantis, B.longum dhe B.pseudocatenualtum për tju nënshtruar proçedurës së ekspozimit të zgjatur në stres acid.

- U izoluan shtame probabilisht acido-rezistente në pH 3.5, nëpërmjet ekspozimit të zgjatur në këto kushte për 4 ditë.

KAPITULLI 4. Impakti i lëngut të boronicës si një mjedis matriks mbartës në vitalitetin e specieve të probiotikëve të izoluar, potencialisht acido-tolerantë.

Qëllimi i kësaj faze studimi ishte testimi i rezistencës të fenotipeve probabël rezistente (përftuar nga faza e parë Kapitulli 3), drejt për drejtë në lëngun e boronicës komercial (me bazë fruti 25% dhe pH 2.9) në dy përqëndrime fillestare inokuli, 107 dhe 105 CFU/mL lëng. Nisur nga rezultatet e testimit të rezistencës 24

137

orë në TPY lëng pH 3.5, për këtë fazë të dytë studimin u përzgjodhën shtamet të cilat reaguan më mirë, konkretisht B. bifidum B1958, B. breve B609, B.longum B2402. Për këto shtame u përcaktua fillimisht aftësia e zhvillimit të tyre në kushte normale për të realizuar saktësisht inokulin me përqëndrimin fillestar të dëshiruar. Më pas shtamet u inokuluan në dy përqëndrimet e sipërpermendura në 400 mL lëng boronice në kontenitorë qelqi sterilë me tapë. Inkubim në termostat në kushte aerobike, 37°C/24 orë.

- Renditja e shkallës së rezistencës së shtameve u ruajt e njëjtë gjatë të trija provave të rezistencës (Provës së Kapitullit 3 dhe provave të Kapitullit 4).

- Përqëndrimi fillestar i inokulit në vlera të ndryshme nuk ndikoi në shkallën e rezistencës së shtameve.

- Metoda e parë e aplikuar në Kapitullin 3 prodhoi shtame acido-rezistente në kushtet e pranisë së acideve inorganike

- Metoda e dytë vërtetoi faktin se për të përftuar fenotipe të qëndrueshme rezistente në lëng, duhet të aplikohet një metodë adoptimi e vazhduar ndaj komponentëve të lëngut dhe jo vetëm ndaj vlerës së ulët të pH-it.

KAPITULLI 5 Adoptimi i shtameve të Bifidobacterium.spp në matricën model lëng boronice+terren i lëngshëm TPY, për të përftuar fenotipe rezistente në lëng.

Synimi i kësaj faze studimi ishte përfshirja e një game të gjërë speciesh të Bifidobacterium.spp, në një adoptim gradual të vazhduar në një matricë model përbërë nga TPY dhe lëng boronice, me synim përftimin e fenotipeve rezistente ndaj mjedisit të ofruar nga lëngu i boronicës. U krye proçedura e provës së rezistencës 24 orë në lëng boronice, në 37°C, aerobiozë, për 30 shtame: (3)B.bifidum, (3)B.longum.subsp.longum, (1)B. longum.subsp.infantis, (5)B.breve, (5)B.pseudocatenulatum, (4)B.catenulatum, (4)B.adolescentis, (4)B.animalis subsp.lactis, (1)B.thermofilum. Nga kjo provë u synua të përzgjidheshin për të vazhduar adoptimin shtame të cilat do të rezistonin. Shtamet rezistente 10 nga 30 total iu nënshtruan adoptimit në përzierjen model të quajtur “MIKS” e përbërë nga lëng boronice + TPY lëng pH 7.0. U vazhdua proçedura e adoptimit në këtë matricë miks e cila çdo 24 orë pas inkubimit pësonte një rritje të vazhdueshme të volumit të lëngut në masën 200µl, duke zëvendësuar të njëjtin volum të TPY lëng. Kjo proçedurë u vazhdua derisa i gjithë volumi i TPY lëng pH 7.0 u zëvendësua totalisht nga volumi i lëngut të boronicës. Kjo proçedurë zgjati mesatarisht 44 ditë (1050 orë).

- Lidhur me mbijetesën e shtameve të testuar për rezistencën e tyre 24 orë në lëngun e boronicës përpara adoptimit u vërejt se shtame të të njëjtave specie në të njëjtat kushte paraqitën rezistencë të ndryshme.

- Aftësia për të mbijetuar varet nga shtami.

- Rezistencë më të lartë paraqesin shtame të gjinisë B. animalis subsp.lactis P32, MB29, RA18, të cilët humbën më pak se 1shkallë log CFU/mL.

- Rezistenca nuk varet nga përqëndrimi i inokulit fillestar por nga aftësia e vetë shtamit për të mbijetuar.

138

- Në lidhje me përqindjen e mbijetesës dhe vdekshmërisë në nivel specieje, nga të 8 speciet e marra në studim, vetëm specia B.animalis.supsb.lactis ka paraqitur përqindje mbijetese në masën 100%, pra rikonfirmohet fakti që shtamet e kësaj specieje kanë aftësi të larta për të mbijetuar në kushte stresi acid.

-Përqindje mbijetese mesatare paraqitën speciet B. Catenualtum, B.pseudocatenulatum, B.breve dhe B.bifidum.

- Speciet të cilat paraqitën ndjeshmëri shumë të lartë rezultuan B.adolescentis, B.longum, B.thermofilum me përqindje mbijetese në masën 0%.

- Mbijetesa dhe vdekshmëria mesatare në përqindje e të gjithë shtameve të testuara 24 orë në lëng boronice tregon se vlera mesatare e vdekshmërisë për të 30 shtamet e testuara është në masën 67%, duke konfirmuar kështu faktin se Bifidobacterium.spp janë kryesisht pak tolerante ndaj kushteve të pH-it acid.

- Përqindja e mbijetesës rezultoi 33%. Konkludohet që ka një probabilitet të kënaqshëm për të përdorur shtame të Bifidobacterium.spp nga specie të ndryshme si suplement në lëngjet e frutave. Gjithashtu për shtamet e ndjeshme probabilisht egzistojnë aletrnativa për përmirësimin e tolerancës së tyre ndaj aciditetit dhe për të përftuar shtame lëng rezistente.

- Vlerat e Rma pavarësisht se në këtë rast shtamet kanë qënë në kushte optimale për zhvillim maksimal, vërehet gjithsei e njëjta tendencë e zhvillimit më të pakët, për B. pseudocatenulatum B1279 dhe B.animalis.susbsp.lactis M354 me Rma më të ulët se shtamet e tjera.

- Shtamet të cilët e humbën totalisht vitalitetin e tyre në fund të adoptimit në miks ishin B. pseudocatenulatum B1279, B.breve B609, dhe B.animalis.susbsp.lactis M354, gjithashtu B.animalis.susbsp.lactis MB29 paraqet një Rmi shumë të ulët e më pas vjen B.breve B2150 me Rmi 2.8.

- Gjatë gjithë periudhës së adoptimit, shtamet më sensibël si B1279, M354, B609 u karakterizuan nga një rënie e përqëndrimit qelizor në më shumë se një herë gjatë ciklit të adoptimit në vlera të ulta.

- Gjatë fazës së fundit të adoptimit në 10 mikset e fundit, Miks 30 (pH 3.5, Vol TPY 2.4mL, Vol lëng boronice 6.4mL), shtamet sensibël kanë filluar ta humbasin vitalitetin e tyre ndjeshëm, pra vlera të pH-it para-letale ndikojnë dukshëm në vitalitetin e këtyre shtameve të ndjeshëm.

- Ndërkohë po në 10 mikset e fundit dallohen për rezistencë të lartë pavarësisht vlerave të ulta të pH-it, që varjojnë nga (pH 3.5- pH 2.9), shtamet si RA18 dhe P32.

- Duke analizuar RV në (%) të shtameve në Miks-e në kater vlera pH-i, pasi vlera e pH-it ka rënë me 1 (në pH 5.2), shtamet kanë pësuar një rënie të konsiderueshme vitaliteti, ndërsa me vazhdimin e adoptimit, në vlerën e pH 3.9 ato duket sikur janë përshtatur ndaj këyre kushteve duke paraqitur një RV me vlerë më të ulët se faza e mëparshme, shenjë kjo e induktimit probabël të ATR.

- Faza e fundit ajo që i takon fundit të adoptimit me vlerë pH 2.9, diferencon dukshëm shtamet sensibël nga ato rezistente, duke hyrë kjo fazë e cila ka një pH në vlera letale (pH 2.9).

139

- Nga studimi i fazës fillestare të adoptimit dhe përcaktimit të KIR e cila i takon kushteve para-letale, pra është atribut i shtamit të pa adoptuar, u vërejt se paraqesin një fazë fillestare rritjeje me përqëndrim qelizor në rënie të ngadaltë me kalimin e kohës, shtamet B.pseudocatenulatum B2339, B.breve me një kinetikë vdekjeje në trajtën e “shpatullës” e cila jep indikacion për një kinetikë vdekjeje në vazhdimësi jo të theksuar, duke indikuar një nivel mbijetese më të lartë.

- Kinetikë të përshpejtuar vdekjeje paraqesin B.thermofilum MB16 me KIR 24 orë, B.pseudocatenulatum B1279, B.bifidum B1958, indikacion për mbijetesë të ulët në këto kushte. Ky parametër i përcaktuar në fazën fillestare të adoptimit dha informacion të saktë mbi ndjeshëmrinë e shtameve në këto kushte deri në fund të adoptimit.

- Nga krahasimi i mbijetesës së shtameve pas adoptimit, vihet re se ndryshim të ndjeshëm në nivelin e mbijetesës kanë paraqitur kryesisht shtamet sensibël, të cilët në fazën e parë të testimit përpara adoptimit humbën vitalitetin në nivele të larta.

- Rritje të lartë të Rezistencës në lëng në % pas adoptimit në Miks, parqitën B.thermofilum MB16 95%, B.pseudocatenulatum B1279 68.5%, B.breve B2150 64.6%.

- Shtamet e paraqitur si rezistentë në fazën para adoptimit, ju është rritur pak rezistenca si në rastin e B.animalis.subs.lactis RA18 dhe P32 të cilët pësuan një rritje rezistence përkatësisht prej 9.5% dhe 3.8%.

- Për disa shtame proçedura e adoptimit të ngadaltë e aplikuar, ka kryer efektin e kundërt, duke ulur rezistencën, si në rastin e B.bifidum B1958 i cili ka një ulje të rezistencës në masën 12.3%, B.animalis.subsp.lactis MB29 dhe M354 një ulje të rezistencës përkatësisht në masën 1.6%, dhe 0.7%.

Kapitulli 6. Përcaktimi i vitalitetit dhe rezistencës së fenotipeve pas adoptimit në lëngun e boronicës, inkubuar në dy temperatura

Në këtë fazë studimi u studjua paralelisht, efiçenca e adoptimit në Miks-e (Kapitulli 5) si

edhe qëndrueshmëria e fenotipeve probabël lëng rezistente. Rezistenca e shtameve u provua duke inokuluar fenotipet e adoptuar të 10 shtameve (Tabela 6.1) në lëng boronice, në dy temperatura inkubimi, 4°C dhe 37°C, në aerobiozë.

- Lidhur me mbijetesën e fenotipeve të adoptuara në lëngun e boronicës në dy temperatura ruajtjeje, në të ftohtë dhe në kushtet e jetgjatësisë të përshpejtuar, u vunë re diferenca të mëdha midis tyre sidomos në ruajtjen në 37°C. Si edhe dihej lëngu i boronicës ndikoi ndjeshëm në mbijetesën e fenotipeve kryesisht për shkak të pH-i të tij të ulët.

- Proçedura paraprake e adoptimit në matricën Miks (Kapitulli 5), ndikoi në forma të ndryshme në shtame të ndryshëm. Kjo fazë rezultatesh vërtetoi se atributet e fituara gjatë adoptimit mbi rezistencën karshi kushteve të lëngut të boronicës u ruajtën për një periudhë më afatgjatë.

- Në lëngun e boronicës ruajtur në kushtet e jetgjatësisë së përshpejtuar në 37°C, shtamet pësuan një rënije të konsiderueshme edhe për një kohë të shkurtër në numrin e

140

qelizave, por gjithsesi u vunë re diferenca të ndjeshme midis shtameve rezistente dhe atyre të ndjeshme. Ku spikatën si më rezistentët B.animalis.subsp.lactis RA18 i cili rezistoi 8 ditë në lëng. Ndërsa shtami më i ndjeshëm me një jetgjatësi prej vetëm 72 orësh rezultoi B.bifidum B1958.

- Në lëngun e boronicës ruajtur në të ftohtë 4°C, qoftë nga përcaktimi drejt për drejtë i vitaliteti të B.animalis.subsp.lactis P32, qoftë edhe nga jetgjatësia e parashikuar për fenotipet e tjera në këto kushte, rezultoi se, B.animalis.subsp.lactis RA18 do të qëndronte mbi nivelin minimal të lejuar për një peiudhë prej 7 javësh, ndërsa fenotipe të tjerë si B.pseudocatenulatum B1279 prej 3.5 javë, B.animalis.subsp.lactis. P32 dhe MB29 prej 3 javësh. Shtamet të cilët u parashikua të rezistojnë më pak se 2 javë në këto kushte rezultuan B.bifidum B1958 me 1.2 javë, B.breve B609 me 1.8 javë. Shtamet e tjerë si B. pseudocatenulatum B2339, B. breve B2150, B. thermofilum MB16, B. animalis. subsp. lactis. M354 patën një rezistencë nga 2.3 -2.7 javë.

- Lidhur edhe me rezultatet e Kapitullit 5, ku u testua përmirësimi i rezistencës së shtameve pas adotptimit (Grafiku 5.15), vërehte se shtami B.pseudocatenulatum B1279, i ka ruajtur atributet e tij të rezistencës edhe për një periudhë kohore më të gjatë se 24 orë në lëng, duke u renditur në këtë fazë si një nga shtamet më rezistente. Gjthashtu edhe shtame të tjera të cilët paraqitën përmirësim të rezistencës pas fazës së adoptimit në vlera të konsiderueshme si B.thermofilum MB16 dhe B.breve B2150 kanë paraqitur një rezistencë mesatare deri të lartë krahasuar me fenotipet e tjerë. Ruhet e njëjta linjë me përfundimet e marra nga Kapitulli 5, edhe për B.bifidum B1958 i cili paraqiti në të kundërt një rënije të rezistencës dhe kjo u vërtetua edhe në këtë fazë të studimit ku ky fenotip rezultoi më i ndjeshmi nga të dhjetë fenotipet.

- Pra si përfundim këto rezultate konfirmojnë faktin se është e mundur të përmirësohen vetitë toleruese karshi pH-it apo faktorëve të tjerë të stresit të shkaktuar nga komponimet e një lëngu frutash duke aplikuar një periudhë adoptimi gradual të vazhduar për një kohë relativisht të gjatë.

Kapitulli 7. Studimi i ndryshimeve probabël gjenetike të shtameve të Bifidobacterium.spp para dhe pas adoptimit.

Në këtë fazë studimi u synua të përcaktoheshin ndryshimet probabël në profilet fingerprinting të shtameve origjinale (O) dhe atyre të cilët ju nënshtruan proçedurës së adoptimit (A), në matricën miks TPY lëng+lëng boronice, konkretisht; B.breve B609(O), B609(A), B2150(O), B2150(A), B.pseudocatenulatum B1279(O), B1279(A), b) B.pseudocatenulatum B2339(O), B2339(A), B.bifidum B1958(O), B1958(A), B.thermofilum MB16(O), MB16(A), c) B.animalis.subsp.lactis M354(O), M354(A), P32(O)/(A), RA18 (O), RA18(A), MB29(O) dhe MB29 (A). Nga rezultatet e marra gjatë kryerjes së proçedurave të ekstraktim/kuantifikimit, kampionet e ADN-ve rezultuan me një përqëndrim dhe pastërti shumë të lartë. Nga vëzhgimi i profileve nëpërmjet rrezeve UV, vërehet që për të gjithë shtamet, pavarësisht species, profilet fingerprinting janë identike midis shtamit origjinal dhe shtamit i cili ka kaluar proçedurën e adoptimit gradual të zgjatur në matricën miks me lëng boronice.

- Shtamet e përftuara pas adoptimit në matricën Miks, me aftësi të përmirësuara ndaj kushteve të lëngut të boronicës, nuk paraqitën ndryshime në nivel gjenotipik (në profiling fingerprinting), duke paraqitur një profil identik me shtamin mëmë.

141

- Si konkluzion proçedura e vazhduar e zgjatur në matricën miks TPY+lëng boronice, nuk shkakton asnjë ndryshim në nivel fingerprinting.

KAPITULLI 8 Mbijetesa në lëng e shtameve B.breve të mikroinkapsuluara dhe “të lira”

Synimi i kësaj faze studimi ishte testimi i ndikimit të mikroinkapsulimit në mbijetesën e shtameve probiotikë inokuluar në lëngun e boronicës. Për këtë u inokuluan 2 shtame B.breve BR 03 dhe B632 në lëng boronice në temperaturë 37°C anaerobiozë si edhe në një provë të dytë në 37°C dhe 4°C aerobiozë. Nga rezultatet e marra, u dallua një mbijetesë në nivel më të lartë e shtamit BR03 në të dyja temperaturat e inkubimit në lëngun e boronicës. Gjtithashtu u vu re se shtamet në trajtë të lirë paraqitën një nivel ndjeshmërie të lartë karshi lëngut, duke e humbur totalisht vitalitetin e tyre pas 24 orësh në lëng, edhe në trajtë të mikroinkapsuluar ato paraqitën përsëri rezistencë të ulët, ku B632 humbi totalisht vitalitetin ndërsa BR 03 humbi 6 shkallë logaritmike. Një nivel i lehtë ndikimi në mbijetesën e shtamit BR 03 në 37 °C në aerobiozë u vu re në këto kushte, ku shtami humbi vitalitetin e tij me një kinetikë më të përshpejtuar krahasuar me inkubimin në anaerobiozë për të njëjtën temperaturë.

- Nga përcaktimi i vitalitetit të shtameve B. Breve “të lirë” 24 orë në lëngun e boronicës, vërehet se shtamet, kanë humbur totalisht vitalitetin e tyre pas 24 orësh, duke treguar se këto shtame janë shumë të ndjeshme ndaj lëngut të boronicës.

- Në trajtë të mikroinkapsuluar gjithashtu paraqesin një rezistencë të ulët pas 24 orë

në lëngun e boronicës, ku BR03 humbi 50% të vitalitetit të tij, ndërsa B632 humbi totalisht vitalitetin pas 24 orësh në lëng. Nga këto rezultate konkludohet se mikroinkapsulimi dëmtohet nga mjedisi i orfuar nga lëngu i boronicës.

- Shtamet sillen në formë të ngjashme si në trajtë “të lirë” ashtu edhe në trajtë të

mikroinkapsuluar që sjell si hipotezë se shtresa e mikroinkapsulimit në pas një kohe të caktuar dëmtohet duke ekspozuar këto shtame të ndjeshme ndaj kushteve agresive të pH-it acid të këtij lëngu.

- Nga kurbat e mbijetesës së shtameve të mikroinkapsuluara B.breve BR03, B632 në

50mL lëng në 37°C (anaerobiozë) pas 3 orë inkubim në 37°C në lëngun e boronicës vërehet një ulje e menjëhershme e numrit të qelizave të shtamit B.breve B632 i cili humbet totalisht vitalitetin pas 6 orësh. Ndërsa shtami B.breve BR03 paraqet rezistencë më të lartë dhe humbet vitalitetin e tij plotësisht pas 120 orë.

- Nga analizimi i kurbave të mbijetesës së shtameve B.breve të mikroinkapsuluar në

20 mL lëng në dy temperatura ruajtjeje (aerobiozë), konfirmohen rezultatet e kryera në provën e mbijetesës në anaerobiozë si edhe spikat mbijetesa më e gjatë në temperaturën e ulët të ruajtjes në 4°C.

- Nga krahasimi i kurbave të mbijetesës së shtamit të mikroinkapsuluar B.breve

BR03, në 20mL lëng boronice në 37°C anaerobiozë dhe aerobiozë, vërehet se shtami i inokuluar në lëng inkubuar në kushte anaerobike paraqet një mbijetesë fare pak më të lartë krahasuar me shtamin e inkubuar në kushte aerobike, duke konkluduar se prania e oksigjenit në kushtet e mësipërme ndikon lehtësisht në mbijetesën e shtamit.

142

9.2 Tendenca kërkimore të ardhshme

Si përfundim përftimi i rezistencës ndaj aciditetit mund të induktojë ndryshime në parametrat e sipërfaqes të bifidobaktereve. Në këtë kuptim, disa shtame acido-rezistente, kanë paraqitur një aftësi më të mirë për të aderuar në GI njerëzor, dhe disa të tjerë kanë paraqitur një aftësi të shtuar për të inhibuar aderencën e disa patogjenëve, apo për të zëvendësuar patogjenë të aderuar (Collado et al., 2006).

Duhet pasur kujdes se adoptimi ndaj aciditetit mund të shaktojë ndryshime të thella në ndjeshmërinë ndaj antibiotikëve të shtameve Bifidobacterium.spp (Collado & Sanz, 2007).

Kuptohet që proçesi i adoptimit ndaj kushteve të ndryshme të stresit, duhet përshtatur në nivel shtami duke qënë se në këtë proçes në studimin tonë, u vërejtën edhe shtame të cilëve ju shtaktua efekti i kundërt, pra humbje e rezistencës. Gjithashtu metoda e përdorur e adoptimit sygjerohet të aplikohet në shtame origjinale me rezistencë të ulët sepse efekti i përmirësimit ishte shumë më i ndjeshëm tek to sesa tek shtamet origjinale me rezistencë të mesme e të lartë.

Megjithatë duhet të studjohen mundësi edhe për aplikimin e inokulave të përziera të shtameve të ndryshme të gjinisë Bifidobacterium apo qoftë edhe Lactobacillus për tu inokuluar në lëngun e boronicës.

Një aspekt tjetër i rëndësishëm është përcaktimi i aftësisë toleruese të këtyre shtameve në kushtet e traktit intestinal (pH 2 dhe pranisë së kriprave biliare për 2 orë).

Edhe pranueshmëria në nivel sensorial i lëngut të boronicës inokuluar me këto fenotipe duhet studjuar.

Gjithashtu duhen studjuar mundësitë e përdorimit të matricave të ndryshme ushqimore për mbartjen e shtameve probiotkë si, lëngje të frutave të ndryshëm, përzierje lëngje frutash, akullore, çokollatë, etj...

Aspekt tjetër shumë i rëndësishëm është përcaktimi i saktë i mekanizmit të aktivizimit të ATR në shtamet e adoptuar, duke analizuar në nivel ekpresioni gjenik (përcaktimi i hartës së proteinave) si edhe metabolik (fermentim i karbohidrateve të ndryshme).

Gjithashtu analizimi i ndryshimit të strukturës qelizore të shtamit ekspozuar karshi kushteve të stresit acid duhet studjuar me anë të aplikimit të vëzhgimit të strukturave qelizore me mikroskop elektronik.

143

REFERENCA

Akua Amponsaa Owusu, (2012). Formulation and shelf life evaluation of avocado (Persea Americana ) fruit spread

Adhikari, K., Mustapha, A., & Grun, I. U. (2003). Survival and metabolic activity of microencapsulated Bifidobacterium longum in stirred yogurt. Journal of Food Science, 68(1), 275-280.

Agerholm-Larsen, L., Raben, A., Haulrik, N., Hansen, A.S., Manders, M., and Astrup, A. (2000). Effect of 8 week intake of probiotic milk products on risk factors for cardiovascular diseases. European Journal of Clinical Nutrition, 54: 288–297.

Agrawal, R. (2005). Probiotics: An emerging food supplement with health benefits. Food Biotechnology, 19(3), 227-246.

Ahmed, M., Prasad, J., Gill, H., Stevenson, L., & Gopal, P. (2007). Impact of consumption of different levels of Bifidobacterium lactis HN019 on the intestinal microflora of elderly human subjects. The journal of Nutrition, Health & Aging 11(1), 26-31.

Alander, M., Satokari, R., Korpela, R., Saxelin, M., Vilpponen-Salmela, T., Mattila-Sandholm, T., et al. (1999). Persistence of colonization of human colonic mucosa by a probiotic strain, Lactobacillus rhamnosus GG, after oral consumption. Applied & Environmental Microbiology, 65(1), 351-354.

Amakura, Y., Umino, Y., Tsuji, S., and Tonogai, Y. (2000). Influence of jam processing on the radical scavenging activity and phenolic content in berries. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48:6292-6297.

Anon. (2005). Probiotic beverage in Norway. Functional Foods & Nutraceuticals, 47.

Azar, M., Brun, S., and Verette, E. (1987). Identification of some phenolic compounds in bilberry juice Vaccinium myrtillus. Journal of Food Science, 52(5): 1255-1257.

Ballongue, J. (1989). Evolution de la taxonomie des bifidobactéries. Bifidobacterium et facteurs bifidigénes, Roˆle en santéhumaine, ARBBA, 33–45.

Ballongue J, Bifidobacteria and probiotic action, In: Salminen S, Von Wright A and Ouwehand AC, editors. Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, 3rd edition. Marcel Dekker, New York, 2004, pp 67-124.

Balmer, S.E.; Wharton, B.A. (1990). Diet and faecal flora in the newborn: breast milk and infant formula. Arch. Dis. Child., 64, 1672–1677.

Baltasar Mayo and Douwe van Sinderen, (2010), Bifidobacteria:Genomics and Molecular aspects.

144

Beachey, E. H. (1981). Bacterial adherence: adhesin-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surface. The Journal of Infectious Disease, 143(3), 325-345.

Beal, C. and Corrieu, G. (1994) Viability and acidification of pure and mixed starters of Streptococcus salivarius ssp. thermophilus 404 and Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus 398 at the different steps of their production. Lebensmittel Wissenshaft uun Technologie 27, 86–92.

Begley, M., Hill, C., & Gahan, C. G. (2006). Bile salt hydrolase activity in probiotics. Applied & Environmental Microbiology, 72(3), 1729-1738.

Begley, M., Gahan, C. G. M., & Hill, C. (2005). The interaction between bacteria and bile. Fems Microbiology Reviews, 29(4), 625-651.

Begley, M., C. G. Gahan, and C. Hill. (2002). Bile stress response in Listeria monocytogenes LO28: adaptation, cross-protection, and identification of genetic loci involved in bile resistance. Appl. Environ. Microbiol. 68:6005-6012.

Benkouider, C. (2005). The world’s emerging markets. Functional ingredients. Available on: http://newhope360.com/food/world-s-emerging-markets (accessed on June 2011).

Benno, Y.; Sawada, K.; Mitsuoka, T. (1984). The intestinal microflora of infants: composition of fecal flora in breast-fed and bottle-fed infants. Microbiol. Immunol., 28, 975–986.

Beerens, H., F. Gavini and C. Neut (2000). Effect of exposure to air on 84 strains of bifidobacteria. Anaerobe 6: 65-67.

Betoret, N., Puente, L., Diaz, M. J., Pagan, M. J., Garcia, M. J., Gras, M. L., et al. (2003). Development of probiotic-enriched dried fruits by vacuum impregnation. Journal of Food Engineering, 56(2-3), 273-277.

Bezkorovainy, A. (2001). Probiotics: determinants of survival and growth in the gut. American Journal of Clinical Nutrition, 73, 399-405.

Bezkorovainy, A.; Topouzian, N. (1981b). B. bifidus var. penn. growth promoting activity of human milk casein and its derivatives. Int. J. Biochem., 13, 585–590.

Biavati, B., & Mattarelli, P. (2006). The Family Bifidobacteriaceae. In M. Dworkin (Ed.), The Prokaryotes. New York: Springer-Verlag. Vol. 3. 322–382.

Biavati, B. and P. Mattarelli. (2001). "The family Bifidobacteriaceae. The prokaryotes: an evolving electronic source." 3rd edition, release 3.7. 2006.

Biavati. B, Sozzi. T, Mattarelli. P, Trovatelli. L.D. (1992). Survival of Bifidobacteria from human habitat in acidified milk, Microbiologica, 15, 197-200.

145

http://newhope360.com/food/world-s-emerging-markets

Bialonska, D., Kasimsetty, S., Schrader, K., & Ferreira, D. (2009). The effect of pomegranate (Punica granatum L.) byproducts and ellagitannins on the growth of human gut bacteria. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57(18), 8344-8349.

Bisakowski, B., Atwal, A., Gardner, N., & Champagne, C. (2007). Effect of lactic acid fermentation of onions (Allium cepa) on the composition of flavonol glucosides. International Journal of Food Science and Technology, 42(7), 783-789.

Bore, E., LAngsrud, S., LAngsrud, O., Rode, T.M., and Holck, A., (2007). Acid-shock responses in Staphylococcus aureus, investigated by global gene expression analysis. Microbiology-SGM. 153, 2289-2303.

Boyle, R. J., Robins-Browne, R. M., & Tang, M. L. K. (2006). Probiotic use in clinical practice: what are the risks? American Journal of Clinical Nutrition, 83(6), 1256-1264.

Broadbent, J. R., Oberg, C. J., Wang, H., & Wei, L. (1997). Attributes of the heat shock response in three species of dairy Lactobacillus. Systematic & Applied Microbiology, 20(1), 12-19.

Brown, A.C., and Valiere, A. (2004). Probiotics and medical nutrition therapy. Nutrition in Clinical Care, 7: 56–68.

Brunser, O., & Gotteland, M. (2010). Probiotics and prebiotics in human health: an overview. In R. R. Watson & V. R. Preedy (Eds.), Bioactive foods in promoting health: probiotics and prebiotics (pp. 73-93). London: Academic Press.

Brunton, N. P., O’Donnell, C., Patras, A., & Tiwari, B. K. (2010a). Effect of thermal processing on anthocyanin stability in foods; mechanisms and kinetics of degradation. Trends in Food Science and Technology, 21, 3-11.

Brunton, N., Cullen, P. J., O`Donnell, C. P., Patras, A., & Tiwari, B. K. (2010b). Effect of ultrasound processing on anthocyanins and color of red grape juice. Ultrasonics Sonochemistry, 17, 598-604.

Buchanan, R.L, and Edelson, S.G., (1996), Culturing an enterohemorrhagic Escherichia coli in the presence and absence of glucose as a simple means of evaluating the acid tolerance of stationary-phase cells. Appl.Environ.Microbiol, 11, 4009-4013.

Caglar, E., Kavaloglu, S. C., Kuscu, O. O., Sandalli, N., Holgerson, P. L., & Twetman, S. (2007). Effect of chewing gums containing xylitol or probiotic bacteria on salivary mutans streptococci and lactobacilli. Clinical Oral Investigations, 11(4), 425-429.

Cardarelli, H.R., Buriti, F.C.A., Castro, I.A., and Saad, S.M.I. 2008. Inulin and oligofructose improve sensory quality and increase the probiotic viable count in potentially symbiotic petit-suisse cheese. LWT—Food Science and Technology, 41: 1037–1046.

146

Carmen Leane NICOLESCU, Lavinia Claudia BURULEANU. 2010. Bifidobacteria Growth in Vegetables and Fruit Juices Bulletin UASVM Agriculture, 67(2), 512-520

Chaluvadi. S, (2012). Technical feasibility for comercialisation of symbiotic matrices., Master of Science. The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey

Champagne, C. P., & Gardner, N. J. (2008). Effect of storage in a fruit drink on subsequent survival of probiotic lactobacilli to gastro-intestinal stresses. Food Research International, 41(5), 539-543.

Champagne, C. P., & Møllgaard, H. (2008). Production of probiotic cultures and their addition in fermented foods. In E. R. Farnworth (Ed.), Handbook of fermented functional foods (2 ed., pp. 513-532). Boca Raton: CRC Press.

Champagne, C. P., Raymond, Y., & Gagnon, R. (2008). Viability of Lactobacillus rhamnosus R0011 in an apple-based fruit juice under simulated storage conditions at the consumer level. Journal of Food Science, 73(5), M221-M226.

Champagne, C. P., Gardner, N. J., & Roy, D. (2005). Challenges in the addition of probiotic cultures to foods. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 45(1), 61-84.

Chandramouli V, Kailasapathy K, Peiris P, Jones M. (2004). An improved method of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp. in simulated gastric conditions. J Microbiol Methods 56(1):27–35.

Charernjiratrakul, W., Kantachote, D., and Vuddhakul, V. (2007). Probioitc lactic acid bacteria for applications in vegetarian food products. Songklanakarin Journal Science and Technology, 29: 981–991.

Chien, P., and Su, M. (2007). Antioxidant activity, anthoycnains, and phenolics of rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) fluid products as affected by fermentation. Food Chemistry, 104: 182-187.

Chung, H.J., W. Bang and M.A. Drake (2006). Stress response of Escherichia coli. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 5: 52-64.

Clifford MN. (2000). Anthocyanins – nature, occurrence and dietary burden. J Sci Food Agric 80(7):1063–72.

Collado, M. C., Isolauri, E., Salminen, S., & Sanz, Y. (2009). The impact of probiotic on gut health. Current Drug Metabolism, 10, 68-78.

Collado, M. C., Meriluoto, J., & Salminen, S. (2007). Development of new probiotics by strain combinations: is it possible to improve the adhesion to intestinal mucus? Journal of Dairy Science, 90(6), 2710-2716.

Collado, M.C., and Sanz, Y., (2007). Induction of acid resistance in Bifidobacterium: a mechanism for improving desirable traits of potentially probiotic strains. J.Appl.Microbiol. 103, 1147-1157.

147

Collado MC, Sanz Y. (2006) Method for direct selection of potentially probiotic Bifidobacterium strains from human feces based on their acid-adaptation ability. J Microbiol Meth; 66: 560-3.

Collado, M.C., Gueimonde, M., Sanz, Y., and Salminen, S., (2006). Adhesion properties and competitive pathogen exlusion ability of Bifidobacteria with acquired acid resistance. J.Food.Prot. 69, 1675-1679

Collins, J. K., Thornton, G., & Sullivan, G. O. (1998). Selection of probiotic strains for human applications. International Dairy Journal, 8(5-6), 487-490.

Corcoran, B. M., Stanton, C., Fitzgerald, G. F., & Ross, R. P. (2005). Survival of probiotic lactobacilli in acidic environments is enhanced in the presence of metabolizable sugars. Applied & Environmental Microbiology, 71(6), 3060- 3067.

Cotter, P.D. and C. Hill (2003). Surviving the acid test: Responses of gram-positive bacteria to low pH. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 429-453.

Crittenden, R., Weerakkody, R., Sanguansri, L., & Augustin, M. (2006). Synbiotic microcapsules that enhance microbial viability during nonrefrigerated storage and gastrointestinal transit. Applied & Environmental Microbiology, 72(3), 2280-2282.

Cummins, C.S.; Glendenning, O.M.; Harris, H. Composition of the cell wall of Lactobacillus bifidus. Nature 1957, 180, 337–338.

Dave, R. I., & Shah, N. P. (1997). Effectiveness of ascorbic acid as an oxygen scavenger in improving viability of probiotic bacteria in yoghurts made with commercial starter cultures. International Dairy Journal, 7(6-7), 435-443.

Davis, M.J., Coote, P.J., dhe O’Byrne, C.p., (1996), Acid tolerance in Listeria monocytogenes, the adaptive acide tolerance response (ATR) and growth phase dependent acid resistance. Microbiology- SGM, 142, 2975-2982

De Angelis, M. and M. Gobbetti (2004). Environmental stress responses in Lactobacillus: A review. Proteomics 4: 106-122.

Deepika, G., Green, R. J., Frazier, R. A., & Charalampopoulos, D. (2009). Effect of growth time on the surface and adhesion properties of Lactobacillus rhamnosus GG. Journal of Applied Microbiology, 107(4), 1230-1240.

De Dea Lindner, J., C. Canchaya, Z. Zhang, E. Neviani, G.F. Fitzgerald, D. van Sinderen and M. Ventura (2007). Exploiting Bifidobacterium genomes: The molecular basis of stress response. International Journal of Food Microbiology 120: 13-24.

Dellaglio, F., & Felis, G. E. (2005). Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria. In G. W. Tannock (Ed.), Probiotics and Prebiotics: Scientific Aspects (pp. 25-50). Norfolk: Caister Academic Press.

148

De Souza NEL, Granato D, Bigetti GK, Wosiacki G. 2012. Development and sensory profile of a probiotic beverage from apple fermented with Lactobacillus casei. Eng Life Sci 12(4):475–85.

Devries, W. and A. Stoutham (1968). Fermentation of glucose lactose galactose mannitol and xylose by bifidobacteria. Journal of Bacteriology 96: 472-478.

Ding WK, Shah NP. 2009. Effect of various encapsulating materials on the stability of probiotic bacteria. J Food Sci 74(2):M100–7.

Ding, W. K. and *Shah, N. P. (2008) Survival of Free and Microencapsulated Probiotic Bacteriain Orange and Apple Juices, International Food Research Journal, 15(2):219-232

Ding WK, Shah NP. 2007. Acid, bile and heat tolerance of free and microencapsulated probiotic bacteria. J Food Sci 72(9):M446.50.

do Espírito Santo. A. P, Perego. P, Converti. A and Oliveira. M .N., (2011) Influence of food matrices on probiotic viability – A review focusing on the fruity bases. Trends in Food Science &Technology Elsevier ltd. 22 . 377-385.

Doleyres, Y., & Lacroix, C. (2005). Technologies with free and immobilised cells for probiotic bifidobacteria production and protection. International Dairy Journal, 15(10), 973-988.

Dong, X.Z., Y.H. Xin, W.Y. Jian, X.L. Liu and D.W. Ling (2000). Bifidobacterium thermacidophilum sp nov., isolated from an anaerobic digester. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50: 119-125.

Donner, H., Kalt, W., and McDonald, J. E. (2000). Anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity of processed lowbush blueberry products. Journal of Food Science, 65(3): 390-393.

Durst, R. W. Lee, J., and Wrostland, R. E. (2002). Impact of juice processing on blueberry anthoycyanins and polyphenolics: comparison of two pretreatments. Journal of Food Science, 67(5): 1660-1667.

Erlich, H.A. and N. Arnheim. (1992). Genetic analysis using the polymerase chain reaction. Ann. Rev. Genet. 26:479-506.

Erlich, H.A. (1989). PCR technology: principles and applications for DNA amplifications.Stockton Press, NY.

Erdman, J. W., Lila, M. A., and Schmidt, B. M. (2005). Effects of food processing on blueberry antiproliferation and antioxidant activity. Journal of Food Science, 70(6): S389-S394.

Espinoza, Y.R., and Navarro, Y.G. 2010. Non-dairy probiotic products. Food Microbiology, 27: 1–10.

Fahimdanesh M, Mohammadi N, Ahari H, Khosravi MA, Zanjani FZH, Behrouznasab K 2012. Effect of microencapsulation plus resistant starch

149

on survival of Lactobacillus casei and Bifidobacterium bifidum in mayonnaise sauce. Afr J Microbiol Res 6(40):6853–8.

FAO/WHO. (2001)Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria.. In Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, October, Cordoba, Argentina. Food and Agriculture Organization of the United Nations, World Health Organization.

FAO/WHO (2002). Joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food. London, Ont., Canada.

Farnworth, E. R. (2001). Probiotics and Prebiotics. In R. E. C. Wildman (Ed.), Handbook of Nutraceuticals and Functional Foods. Florida: CRC Press LLC.

Favaro-Trindale, C. S., & Grosso, C. R. F. (2002). Microencapsulation of L-acidophilus (La-05) and B-lactis (Bb-12) and evaluation of their survival at the pH values of the stomach and in bile. Journal of Microencapsulation, 19(4), 485-494.

Favaro-Trindade, C., Bernardi, S., Bodini, R., Balieiro, J. C. C., & De Almeida, E. (2006). Sensory acceptability and stability of probiotic microorganisms and Vitamin C in fermented acerola (Malpighia emarginata DC.) ice cream. Journal of Food Science, 71(6), S492-S495.

Fellows, P. J. (2009 ). Food processing technology: principles and practice (3 ed.). Cambridge, UK: Woodhead Publishing.

Flahaut, S., A. Hartke, J. C. Giard, A. Benachour, P. Boutibonnes, and Y. Auffray. (1996). Relationship between stress response towards bile salts, acid and heat treatment in Enterococcus faecalis. FEMS Microbiol. Lett. 138:49-54.

Flahaut, S., J. Frere, P. Boutibonnes, and Y. Auffray. (1997). Relationship between the thermotolerance and the increase of DnaK and GroEL synthesis in Enterococcus faecalis ATCC19433. J. Basic Microbiol. 37:251-258.

Fonteles, T.V., Costa, M.G.M., de Jesus, A.L.T., and Rodrigues, S. (2011). Optimization of the fermentation of Cantaloupe juice by Lactobacillus casei NRRL B-442. Food and Bioprocess Technology, in press (DOI 10.1007/s11947-011-0600-0).

Fortitech, Inc. Strategic Nutrition. (2011). New inovations in functional beverages.

Fukushima, Y., Kawata, Y., Hara, H., Terada, A., & Mitsuoka, T. (1998). Effect of a probiotic formula on intestinal immunoglobulin A production in healthy children. International Journal of Food Microbiology, 42(1-2), 39-44.

Gareau, M., Sherman, P., & Walker, W. (2010). Probiotics and the gut microbiota in intestinal health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 7, 503-514.

150

Ganzle, M. G., Hertel, C., van der Vossen, J. M., & Hammes, W. P. (1999). Effect of bacteriocin-producing lactobacilli on the survival of Escherichia coli and Listeria in a dynamic model of the stomach and the small intestine. International Journal of Food Microbiology, 48(1), 21-35.

Gardiner, E. G., Ross, R. P., Kelly, P. M., Stanton, C., Collins, J. K., & Fitzgerald, G. (2002). Microbiology of therapeutic milks. In R. K. Robinson (Ed.), Dairy Microbiology Handbook. New York: John Wiley and Sons, Inc.

Gardner, P. T., White, T. A. C., McPhail, D. B., & Duthie, G. G. (2000). The relative contributions of vitamin C, carotenoids and phenolics to the antioxidant potential of fruit juices. Food Chemistry, 68(4), 471-474.

GastroNetAustralia. (2010). Your digestive system/Stomach. Retrieved 26.10.2010, 2010, from http://www.gastro.net.au/digestive/stomach.html

Geoffrey A. Preidis, J. V. (2009). "Targeting the Human Microbiome with Antibiotics, Probiotics, and Prebiotics: Gastroenterology Enters the Metagenomics Era." GASTROENTEROLOGY(136): 2015-2031.

Gibson, G.R., Probert, H.M., Van Loo, J., Rastall, R.A., and Roberfroid, M.B. 2004. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Updating the concept of prebiotics. Nutrition Research Review, 17: 259–275.

Gill, H. S., Rutherfurd, K. J., & Cross, M. L. (2001). Dietary probiotic supplementation enhances natural killer cell activity in the elderly: an investigation of age-related immunological changes. Journal of Clinical Immunology, 21(4), 264-271.

Gill, H. S., Rutherfurd, K. J., Cross, M. L., & Gopal, P. K. (2001). Enhancement of immunity in the elderly by dietary supplementation with the probiotic Bifidobacterium lactis HN019. American Journal of Clinical Nutrition, 74(6), 833-839.

Girardin, M., Kader, F., Metche, M., and Rovel, B. (1996). Fractionation and identification of the phenolic compounds of highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Food Chemistry, 55(1): 35-40.

Girard, K. K., Hui, Y. H., and Sinha, N. K. (2006). Cranberry, blueberry, currant, and gooseberry (chapter 21) In Handbook of fruits and fruit processing, Blackwell Publishing, USA.

Girgis, H.S., J. Smith, J.B. Luchansky, and T.R. Klaenhammer. (2002). Stress adaptations of lactic acid bacteria. In: Microbial adaptation to stress and safety of new-generation foods. Yousef, A.E. and Juneja, V.K. (eds.): CRC Press, NY. pp. 159-212.

Godward, G., & Kailasapathy, K. (2003a). Viability and survival of free and encapsulated probiotic bacteria in Cheddar cheese. Milchwissenschaft-Milk Science International, 58(11-12), 624-627.

Godward, G., & Kailasapathy, K. (2003b). Viability and survival of free, encapsulated and co-encapsulated probiotic bacteria in ice cream. Milchwissenschaft-Milk Science International, 58(3-4), 161-164.

151

http://www.gastro.net.au/digestive/stomach.html

Godward, G., & Kailasapathy, K. (2003c). Viability and survival of free, encapsulated and co-encapsulated probiotic bacteria in yoghurt. Milchwissenschaft-Milk Science International, 58(7-8), 396-399.

Gomes, A.M.P. and Malcata, F.X. (1999). Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics. Trends in Food Science and Technology, 10: 139–157.

Gorbach, S. L. (2002). Probiotics in the third millennium. Digestive & Liver Disease, 34 Suppl 2, S2-7.

Greene, J. D., & Klaenhammer, T. R. (1994). Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells. Applied & Environmental Microbiology, 60(12), 4487-4494.

Griffiths, A.J.F., J.H. Miller, D.T. Suzuki, R.C. Lewontin and W.M. Gelbart. (1996). An introduction to genetic analysis (6th edn.). W.H. Freeman and Co., NY.

Gotcheva, V., Hristozova, E., Hrostozova, T., Guo, M., Roshkova, Z., and Angelov, A. (2002). Assessment of potential probiotic properties of lactic acid bacteria and yeast strains. Food Biotechnology, 16: 211–225.

Guergoletto, K. B., Magnani, M., San Martin, J., Andrade, C. G. T. J., & Garcia, S. (2010). Survival of Lactobacillus casei (LC-1) adhered to prebiotic vegetal fibers. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 11, 415-421.

Häkkinen. S., Kärenlampi. S, Heinonen. M, Mykkänen, & Törrönen. A.R. (2000). Ellagic acid content in berries. Influence of domestic processing and storage. Europian Food Research and Technology. 12(1). 75-80

Häkkinen. S., Kärenlampi. M, Mykkänen, S, Heinonen. & Törrönen. A.R. (1999). Content of the flavonols quercetin, myricetin and kaempferol in 25 edible berries. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47(6).2274-2279.

Häkkinen, S., Heinonen, M., Karenlampi, S., Mykkänen, H., Ruuskanen, J., and Törrönen, R. (1999). Screening of selected flavonoids and phenolic acids in 19 berries. Food Research International, 32:345-353.

Haluk, J., Kader, F., Metche, M., and Nicolas, J. (1998). Degradation of cyaniding-3-glucoside by blueberry polyphenol oxidase: Kinetic studies and mechanisms. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 46: 3060-3065.

Hamilton-Miller, J. M., Shah, S., & Winkler, J. T. (1999). Public health issues arising from microbiological and labelling quality of foods and supplements containing probiotic microorganisms. Public Health Nutrition, 2(2), 223-229.

Hansen, L. T., Allan-Wojtas, P. M., Jin, Y. L., & Paulson, A. T. (2002). Survival of Ca-alginate microencapsulated Bifidobacterium spp. in milk and simulated gastrointestinal conditions. Food Microbiology, 19(1), 35-45.

Harb., J, Khraiwesh.,B, Reskid., R, & Frank., W, (2010). Caracterisation of bluberry monodehydroascorbate reductase gene and changes in level of ascorbic acid and the antioxidative capacity of the water solulble antiocidant

152

s upon storage of fruits under storage conditions. Scienta Horticulturae, 125, 390-395

Harborne JB, Mabry TJ, Mabry H. (1975). The flavonoids. London: Chapman & Hall.

Harmsen, H.J.M., A.C. Wildeboer-Veloo and G.C. Raangs (2000). Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 30: 61-67.

Hassan AA, Aly MM, Soher T. 2012. Production of Cereal-Based Probiotic Beverages. World Appl Sci J 19(10):1367–80.

Havenaar, R., & Huis In’t Veld, J. M. J. (1992). Probiotics: a general view. In B. J. B. Wood (Ed.), Lactic acid bacteria in health and disease (Vol. 1, pp. 151-170). London: Elsevier Applied Science Publishers.

Hayes, M., Coakley, M., O’Sullivan, L., Stanton, C., Hill, C., Fitzgerald, G. F., et al. (2006). Cheese as a delivery vehicle for probiotics and biogenic substances. Australian Journal of Dairy Technology, 61, 132-141.

Heckly, R.J. (1985) Principles of preserving bacteria by freeze-drying. Development of Industrial Microbiology 26, 379–395.

Heenan, C. N., Adams, M. C., Hosken, R. W., & Fleet, G. H. (2004). Survival and sensory acceptability of probiotic microorganisms in a nonfermented frozen vegetarian dessert. Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie-Food Science & Technology, 37(4), 461-466.

Hekmat, S., & McMahon, D. J. (1992). Survival of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum in ice cream for use as a probiotic food. Journal of Dairy Science, 75(6), 1415-1422.

Herbert, R. A. (1989). Microbial growth at low temperatures. In G. W. Gould (Ed.), Mechanisms of Action of Food Preservation Procedures (pp. 71-96). London: Elsevier Applied Science.

Hermann. K & Nagel. C.W. (1989). Occurrence and content of hydroxycinamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods. Critical Reviewes in Food Science and Nutrition. 28(4). 315-347.

Hilliam, M. (2000). Functional food––How big is the market? The World of Food Ingredients,12: 50–52.

Holzapfel, W.H. and Schillinger, V. 2002. Introduction to pre-and probiotics. Food Research International, 35: 109–116.

Holzapfel, W. H., Haberer, P., Snel, J., Schillinger, U., & Huis in't Veld, J. H. J. (1998). Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food Microbiology, 41(2), 85-101.

Hosoi, T., Hirose, R., Saegusa, S., Ametani, A., Kiuchi, K., & Kaminogawa, S. (2003). Cytokine responses of human intestinal epithelial-like Caco-2 cells to the

153

nonpathogenic bacterium Bacillus subtilis (natto). International Journal of Food Microbiology, 82(3), 255-264.

Hsiao, H.-C., Lian, W.-C., & Chou, C.-C. (2004). Effect of packaging conditions and temperature on viability of microencapsulated bifidobacteria during storage. Journal of the Science of Food & Agriculture, 84(2), 134-139.

Huang, Y., & Adams, M. C. (2004). In vitro assessment of the upper gastrointestinal tolerance of potential probiotic dairy propionibacteria. International Journal of Food Microbiology, 91(3), 253-260.

Hull, R. R., Conway, P. L., & Evans, A. J. (1992). Probiotic foods - a new opportunity. Food Australia, 44(3), 112-113.

Isolauri, E. (2007). Probiotics in preterm infants: a controversial issue. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 45, S188-S189.

Isolauri, E., Arvola, T., Sutas, Y., Moilanen, E., & Salminen, S. (2000). Probiotics in the management of atopic eczema. Clinical & Experimental Allergy, 30, 1604- 1610.

Jackson, L. S., & Lee, K. (1991). Microencapsulation and the Food-Industry. Food Science & Technology-Lebensmittel-Wissenschaft & Technologie, 24(4), 289- 297.

Jan, G., Rouault, A., & Maubois, J. L. (2000). Acid stress susceptibility and acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii subsp shermanii. Lait, 80(3), 325-336.

Jay, J.M., Loessner, M.J. and Golden, D.A. (2005). Modern food microbiology. 7th ed. New York:Springer Verlag, pp 678.

Jayamanne, V.S., & Adams, M.R. (2006). Determination of survival, identity and stress resistance of probiotic bifidobacteria in bio-yoghurts. Letters in Applied Microbiology, 42, 189-194.

Kailasapathy, K. (2002). Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications. Current Issues in Intestinal Microbiology, 3(2), 39-48.

Kailasapathy, K. (2006). Survival of free and encapsulated probiotic bacteria and their effect on the sensory properties of yoghurt. LWT - Food Science & Technology, 39(10), 1221-1227.

Kalliomaki, M., Salminen, S., Arvilommi, H., Kero, P., Koskinen, P., and Isolauri, E. (2001). Probiotics in primary prevention of atopic disease: A randomized placebo controlled trial. Lancet, 357: 1076–1079.

Kalt, W. and Dufour, D. (1997). Health functionality of blueberries. Horticulture Technology, 7:216-221.

Kalt, W., McDonald, J.E., and Donner, H. (2000). Anthocyanins, phenolics, and antioxidant capacity of processed lowbush blueberry products. Journal of Food Science, 65:390-393.

154

Kandler, O.; Lauer, E. Modern concepts of the taxonomy of bifidobacteria. Zbl. Bakt. 1974, 228, 29–45.

Kankaanpaa, P. E., Salminen, S. J., Isolauri, E., & Lee, Y. K. (2001). The influence of polyunsaturated fatty acids on probiotic growth and adhesion. FEMS Microbiology Letters, 194(2), 149-153.

Kawasaki, S., T. Mimura, T. Satoh, K. Takeda and Y. Niimura (2006). Response of the microaerophilic Bifidobacterium species, B. boum and B. thermophilum, to oxygen. Applied and Environmental Microbiology 72: 6854-8.

Kheader, E., Dabour, N., Le Lay,C., and Fliss, I (2007), Antibiotic susceptibility profile of Bifidobacteria as affected by oxgall, acid and hydrogen peroxide stress. Antimicrob. Agents Chemother, 51, 169-174.

Kim, D. C., Chae, H. J., & In, M. J. (2010). Fermentation characteristics of Korean pear (Pyrus pyrifolia Nakai) puree by the Leuconostoc mesenteroides 51-3 strain isolated from kimchi. African Journal of Biotechnology, 9, 5735-5738.

Kim SJ, Cho SY, Kim SH, Song OJ, Shin S. 2008. Effect of micro encapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC 43121. LWT 41(2008):493–500.

Klewicka, E., Zdunczyk, Z., & Juskiewicz, J. (2009). Effect of lactobacillus fermented beetroot juice on composition and activity of cecal microflora of rats. European Food Research and Technology, 229(1), 153-157.

Klijn, A. (2005a). Physiological and molecular characterization of stress responses in Bifidobacterium longum NCC2705. PhD Thesis. Department of Microbiology, University College Cork, Ireland.

Klijn, A., A. Mercenier and F. Arigoni (2005b). Lessons from the genomes of bifidobacteria. FEMS Microbiology Reviews 29: 491-509.

Koch, S., G. Oberson, E. Eugster-Meier, L. Meile and C. Lacroix (2007). Osmotic stress induced by salt increases cell yield, autolytic activity, and survival of lyophilization of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis. International Journal of Food Microbiology 117: 36-42.

Kosin, B., & Rakshit, S. K. (2006). Microbial and processing criteria for production of probiotics: A review. Food Technology & Biotechnology, 44(3), 371-379.

Krasaekoopt, W., Bhandari, B., & Deeth, H. (2003). Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt. International Dairy Journal, 13(1), 3-13.

Krasaekoopt, W., Bhandari, B., & Deeth, H. C. (2006). Survival of probiotics encapsulated in chitosan-coated alginate beads in yoghurt from UHT- and conventionally treated milk during storage. LWT - Food Science & Technology, 39(2), 177-183.

155

Kun, S., Rezessy-Szabo, J., Nguyen, Q., & Hoschke, A. (2008). Changes of microbial population and some components in carrot juice during fermentation with selected Bifidobacterium strains. Process Biochemistry, 43(8), 816-821.

Labuza, T.P., (1979). A Theoretical Comparison of Losses in Foods Under Fluctuating Temperature Sequences, J of Food Sci., 44, pp. 1162

Lacroix, C. and S. Yildirim (2007). Fermentation technologies for the production of probiotics with high viability and functionality. Current Opinion in Biotechnology 18: 176-183.

Lahtinen, S. J., Ahokoski, H., Reinikinen, J.P., Guimonde, M., Nurmi, J., Ouwehand, A.C., and Salminen, S.J., (2008), Degradation of 16s rRNA and attributes of viability of viable but not culturable probiotic bacteria. Lett. Appl. Microbiol, 46, 693-698.

Langhendries, J. P., Detry, J., Van Hees, J., Lamboray, J. M., Darimont, J., Mozin, M. J., et al. (1995). Effect of a fermented infant formula containing viable bifidobacteria on the fecal flora composition and pH of healthy full-term infants. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition 21(2), 177-181.

Laszlo, P. (2007). Citrus: A History. Chicago: The Univesity of Chicago Press.

Lavermicocca, P., Valerio, F., Lonigro, S. L., De Angelis, M., Morelli, L., Callegari, M. L., et al. (2005). Study of adhesion and survival of lactobacilli and bifidobacteria on table olives with the aim of formulating a new probiotic food. Applied & Environmental Microbiology, 71(8), 4233-4240.

Lee, Y. K., & Puong, K. Y. (2002). Competition for adhesion between probiotics and human gastrointestinal pathogens in the presence of carbohydrate. British Journal of Nutrition, 88, S101-S108.

Lee J.H., Yoon Y.H. (1998). Characteristics of cell wall hydrolysing enzyme of Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. Korean J. Anal. Sci., 40: 43-50.

Lee, Y. K., & Salminen, S. (1995). The coming of age of probiotics. Trends in Food Science & Technology, 6(7), 241-245.

Len, A.C., Harty, D.W., and Jacques, N.A., (2004). Proteome analysis of Streptococcus mutans metabolic phenotype during acid tolerance. Microbiology-SGM. 150, 1353-1366.

Leverrier, P., Fremont, Y., Rouault, A., Boyaval, P., & Jan, G. (2005). In vitro tolerance to digestive stresses of propionibacteria: influence of food matrices. Food Microbiology, 22(1), 11-18.

Lian, W. C., Hsiao, H. C., & Chou, C. C. (2003). Viability of microencapsulated bifidobacteria in simulated gastric juice and bile solution. International Journal of Food Microbiology, 86(3), 293-301.

156

Li. J, Nditange. Sh, and Osmund D.M. (2010). “Use of Dacid-, Dbile-, zacid-, and zbile-Values in Evaluating Bifidobacteria with Regard to Stomach pH and Bile Salt Sensitivity”. Journal of Food Science. Vol. 75, Nr. 1, 14-18.

Li XY, Chen XG, Sun ZW, Cha DS. (2010). Preparation of alginate/chitosan/carboxymethyl chitosan complex microcapsules and application in Lactobacillus casei ATCC 393. Carbohyd Polym, 83(4):1479–85.

Lorca, G. L., & de Valdez, G. F. (2001). A low-pH-inducible, stationary-phase acid tolerance response in Lactobacillus acidophilus CRL 639. Current Microbiology, 42(1), 21-25.

Lorca, G. L., Raya, R. R., Taranto, M. P., & de Valdez, G. F. (1998). Adaptive acid tolerance response in Lactobacillus acidophilus. Biotechnology Letters, 20(3), 239-241.

Lourens-Hattingh, A., & Viljoen, B. C. (2001). Yogurt as probiotic carrier food. International Dairy Journal, 11(1-2), 1-17.

Luckow, T., Sheehan, V., Fitzgerald, G., and Delahunty, C. 2006. Exposure, health information and flavour-masking strategies for improving the sensory quality of probiotic juice. Appetite, 47: 315–323.

Luckow, T., & Delahunty, C. (2004a). Consumer acceptance of orange juice containing functional ingredients. Food Research International, 37(8), 805-814.

Luckow, T., & Delahunty, C. (2004b). Which juice is `healthier'? A consumer study of probiotic non-dairy juice drinks. Food Quality & Preference, 15(7-8), 751-759.

Lyer C, Kailasapathy K. 2005. Effect of co-encapsulation of probiotics with prebiotics on increasing the viability of encapsulated bacteria under in vitro acidic and bile salt conditions and in yogurt. J Food Sci 70(1):M18–23.

Mäkinen-Aakula, M. (2006). Trends in functional foods dairy market. In Proceedings of the Third Functional Food Net Meeting, September 18–19, Liverpool, U.K.

Mandal S, Puniya AK, Singh K. 2006. Effect of alginate concentrations on survival of microencapsulated Lactobacillus casei NCDC-298. Intl Dairy J 16(10):1190–5.

Mättö, J., E. Malinen, M. L. Suihko, M. Alander, A. Palva, and M. Saarela. (2004). Genetic heterogeneity and functional properties of intestinal bifidobacteria. J. Appl. Microbiol. 97:459-470.

Marcinakova, M., Klingberg, T. D., Laukova, A., & Budde, B. B. (2010). The effect of pH, bile and calcium on the adhesion ability of probiotic enterococci of animal origin to the porcine jejunal epithelial cell line IPEC-J2. Anaerobe, 16(2), 120- 124.

157

Masco, L., Crockaert, C., van Hoorde, K., Swings, J., and Huys, G., (2007). In vitro assessment of the gastrointestinal transit tolerance of taxonomic reference strains from human origin and probiotic product isolates of Bifidobacterium. J. Dairy.Sci. 90, 3572-3578.

Masco, L., G. Huys, E. de Brandt, R. Temmerman, and J. Swings. (2005). Culture-dependent and culture-independent qualitative analysis of probiotic products claimed to contain bifidobacteria. Int. J. Food Microbiol. 102:221-230.

Masco. L, Huys. G, Gevers. D, Verbrugghen. L, dhe Swings. J. (2003) Identification of Bifidobacterium Species Using rep-PCR Fingerprinting. System. Appl. Microbiol. 26, 557–563

Matsumoto. M, Ohishi. H, Benno .Y, (2004), “H+-ATPase activity in Bifidobacterium with special reference to acid tolerance, Int.J.Food.Microbiol, May 93, 109-113.

Mattila-Sandholm, T., Myllarinen, P., Crittenden, R., Mogensen, G., Fonden, R., & Saarela, M. (2002). Technological challenges for future probiotic foods. International Dairy Journal, 12(2-3), 173-182.

Mattila-Sandholm, T., & Saarela, M. (2000). Probiotic functional foods. In G. R. Gibson & C. M. Williams (Eds.), Functional foods (pp. 287-313). Cambridge: Woodhead Publishing Limited.

Maus, J.E. and S.C. Ingham (2003). Employment of stressful conditions during culture production to enhance subsequent cold- and acid-tolerance of bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology 95: 146-154.

Maxwell, F.J., S.H. Duncan, G. Hold and C.S. Stewart (2004). Isolation, growth on prebiotics and probiotics potential of novel bifidobacteria from pigs. Anaerobe 10: 33-39.

McGhie TK, Walton MC. 2007. The bioavailability and absorption of anthocyanins: towards a better understanding. Mol Nutr Food Res 51(6):702–13.

McGill, C. R., Wilson, A. M. R., & Papanikolaou, Y. (2004). Health Benefits of Citrus Juices. In T. Wilson & N. J. Temple (Eds.), Beverages in Nutrition and Health (pp. 63-78). Totowa, NJ: Humana Press Inc.

Meile, L., W. Ludwig, U. Rueger, C. Gut, P. Kaufmann, G. Dasen, S. Wenger and M. Teuber (1997). Bifidobacterium lactis sp. nov., a moderately oxygen tolerant species isolated from fermented milk. Systematic and Applied Microbiology 20: 57-64.

Menrad, K. (2003). Market and marketing of functional food in Europe. Journal of Food Engineering, 56: 181–188.

Metchnikoff, E. (1907). Essais optimistes. Paris. The Prolongation of Life: Optimistic Studies, P.C. Mitchell (transl. and ed.). London, U.K.: Heinemann.

Mitsuoka, T. (1984). Taxonomy and ecology of bifidobacteria, Bifidobacteria Microflora, 3 (1), 11–28.

158

Mitsuoka, T. (1982). Recent trends in research on intestinal fora. Bifidobacteria Microfora, 1 (1), 3–24.

Mitsuoka, T.; Hayakawa, K.; Kimura, N. (1974). Die faekal flora bei Menschen. II. Mitteilung: die Zuzammensetzung der Bifidobakterien-flora der verschiedenen Altersgruppen, Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. I. Abt. Orig. A., 226, 469–478.

Miwa, T., Esaki, H., Umemori, J., and Hino, T., (1997). Acitivity of H(+ )-ATPase in ruminal bacteria with special reference to acid tolerance. Apl.Environ.Microbiol. 63. 2155-2158

Mokarram RR, Mortazavi SA, Habibi NMB, Shahidi F. (2009). The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice. Food Res Intl 42(8):1040–5.

Moussavi. M. (2012). Comparative Analysis of the Viability and Functional Performance of Mono- and Multi-Species Probiotic Cultures in a Non-Dairy Food Matrix. A thesis Doctor of Philosophy, School of Environmental and Life Sciences Faculty of Science and Information Technology The University of Newcastle, New South Wales, Australia

Mousavi, Z.E., Mousavi, S.M., Razavi, S.H., Emam-Djomeh, Z., and Kiani, H. (2011). Fermentation of pomegranate juice by probiotic lactic acid bacteria. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 27: 123–128.

Moussavi, M., & Adams, M. C. (2010). An in vitro study on bacterial growth interactions and intestinal epithelial cell adhesion characteristics of probiotic combinations. Current Microbiology, 60(5), 327-335.

Mullen. W, Stewart .A.J, Lean. M.E.J, Gardner. P, Duthie. G.G, & Crozier. A. (2002). Effect of freezing and storage on the phenolics, ellagitannins, flavonoids and antioxidant capacity of red raspberries. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50 (18), 5197-5201.

Muller, J. A., Ross, R. P., Fitzgerald, G. F., & Stanton, C. (2009). Manufacture of Probiotic Bacteria. In D. Charalampopoulos & R. A. Rastall (Eds.), Prebiotics and Probiotics Science and Technology (Vol. 2, pp. 727-762). New York: Springer.

Navindra.P,S. Aviram. M, Zhang.Y, Henning. S.M., Feng. L, Dreher. M and Herber D. (2008). Comparison of Antioxidant Potency of Commonly Consumed Polyphenol-Rich Beverages in the United States, J. Agric. Food Chem., 56, 1415–1422

Nazzaro, F., Fratianni, F., Sada, A., & Orlando, P. (2008). Synbiotic potential of carrot juice supplemented with Lactobacillus spp. and inulin or fructooligosaccharides. Journal of the Science of Food and Agriculture, 88, 2271-2276.

159

Neimann, N.; La Vergne, E.; Manciaux, M.; Sterlin, S.; Percebois, G. (1965). Clinical and bacteriological study of a milk bifidogenic because of its lactulose content. Pediatrie. 20, 139–145

Newton, C.R. and A. Graham. (1994). PCR, part 1: Basic principles and methods. EngBios Scientific Publishers, Oxford.

Nicolescu, C. L., & Buruleanu, L. C. (2010). Correlation of some substrate parameters in growing Lactobacillus acidophilus on vegetable and fruit cocktail juices. Bulletin of the University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, 67(2), 352-359.

Nomoto, K. (2005). Review prevention of infections by probiotics. Journal of Bioscience and Bioengineering, 100: 583–592.

Noriega, L., M. Gueimonde, B. Sánchez, A. Margolles, and C. G. de los Reyes-Gavilán. (2004). Effect of the adaptation to high bile salts concentrations on glycosidic activity, survival at low pH and cross-resistance to bile salts in Bifidobacterium. Int. J. Food Microbiol. 94:79-86.

O'May, G. A., N. Reynolds, A. R. Smith, A. Kennedy, and G. T. Macfarlane. (2005). Effect of pH and antibiotics on microbial overgrowth in the stomachs and duodena of patients undergoing percutaneous endoscopic gastrostomy feeding. J. Clin. Microbiol. 43:3059-3065.

Op den Camp H.J.M., Oosterhof A., Veerkamp J.H. (1985). Cell surface hydrophobicity of Bifidobacterium bifidum subsp. pennsylvanicum. Antoine Van Leeuwenhoek, 51: 303-312.

Osman, N., Adawi, D., Ahrn~e, S., Jeppsson, B., & Molin, G. (2008). Probiotics and blueberry attenuate the severity of dextran sulfate sodium (DSS)- induced colitis. Digestive Diseases and Science, 53, 2464-2473.

O'Sullivan, M. G., Thornton, G., O'Sullivan, G. C., & Collins, J. K. (1992). Probiotic bacteria: myth or reality? Trends in Food Science & Technology, 3(12), 309- 314.

O'Sullivan, E., and S. Condon. (1999). Relationship between acid tolerance, cytoplasmic pH, and ATP and H+-ATPase levels in chemostat cultures of Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 65:2287-2293.

Ouwehand, A. (2007). Success in applying pro- and prebiotics in dairy products. In Proceedings of the Fourth International FFNet Meeting on Functional Foods, March 26–27, Budapest, Hungary.

Ouwehand, A. C., Kurvinen, T., & Rissanen, P. (2004). Use of a probiotic Bifidobacterium in a dry food matrix, an in vivo study. International Journal of Food Microbiology, 95(1), 103-106.

Ouwehand, A. C., & Salminen, S. (2003). In vitro adhesion assays for probiotics and their in vivo relevance: a review. Microbial Ecology in Health & Disease, 15, 175-184.

160

Ouwehand, A. C., Tuomola, E. M., Tolkko, S., & Salminen, S. (2001). Assessment of adhesion properties of novel probiotic strains to human intestinal mucus. International Journal of Food Microbiology, 64(1-2), 119-126.

Ouwehand, A. C., Isolauri, E., Kirjavainen, P. V., Tolkko, S., & Salminen, S. J. (2000). The mucus binding of Bifidobacterium lactis Bb12 is enhanced in the presence of Lactobacillus GG and Lact. delbrueckii subsp bulgaricus. Letters in Applied Microbiology, 30(1), 10-13.

Ouwehand, A.C. and S.J. Salminen (1998). The health effects of cultured milk products with viable and non-viable bacteria. International Dairy Journal 8: 749-758.

Owusu-Apenten, R.K. (2005). Introduction to Food Chemistry. Boca Raton, Fla.: CRC Press, pp 57.

¨Ozer B, Kirmaci HA, S Enel E, Atamer M, Hayaloglu A. 2009. Improving the viability of Bifidobacterium bifidum BB-12 and Lactobacillus acidophilus LA-5 in white-brined cheese by microencapsulation. Intl Dairy J 19:22–9.

¨Ozer B, Uzun YS, Kirmaci HA. 2008. Effect of microencapsulation on viability of Lactobacillus acidophilus LA-5 and Bifidobacterium bifidum BB-12 during Kasar cheese ripening. Intl J Dairy Technol 61:237–44.

Park, H. K., So, J. S., & Heo, T. R. (1995). Acid adaptation promotes survival of Bifidobacterium breve against environmental stresses. Foods & Biotechnology, 4, 226–230.

Parkar, S. G., Redgate, E. L., Wibisono, R., Luo, X., Koh, E. T. H., & Schroder, R. (2010). Gut health benefits of kiwifruit pectins: Comparison with commercial functional polysaccharides. Journal of Functional Foods, 2(3), 210-218

Parkar, S., Stevenson, D., & Skinner, M. (2008). The potential influence of fruit polyphenols on colonic microflora and human gut health. International Journal of Food Microbiology, 124(3), 295-298.

Payne, C.M., C. Crowley, D. Washo-Stultz, M. Briehl, H. Bernstein, C. Bernstein, S. Beard, H. Holubec and J. Warneke (1998). The stress-response proteins poly(ADPribose) polymerase and NF-kappaB protect against bile salt-induced apoptosis. Cell Death and Differentiation 5: 623-636.

Pereira, A.L.F., Maciel, T.C., and Rodrigues, S. (2011). Probiotic beverage from cashew apple juice fermented with Lactobacillus casei. Food Research International, 44: 1276–1283.

Peter, G. and Reichart, O. (2001) The effect of growth phase, cryoprotectants and freeze-drying rates on the survival of selected micro-organisms during freeze-drying and thawing. Acta Alimentaria 30, 89–97.

Picot, A., & Lacroix, C. (2004). Encapsulation of bifidobacteria in whey protein-based microcapsules and survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt. International Dairy Journal, 14(6), 505-515.

161

Picot, A., & Lacroix, C. (2003a). Effects of micronization on viability and thermotolerance of probiotic freeze-dried cultures. International Dairy Journal, 13(6), 455-462.

Picot, A., & Lacroix, C. (2003b). Production of multiphase water-insoluble microcapsules for cell microencapsulation using an emulsification/spray-drying technology. Journal of Food Science, 68(9), 2693-2700.

Possemiers, S., Marzorati, M., Verstraete, W., & Van de Wiele, T. (2010). Bacteria and chocolate: a successful combination for probiotic delivery. International Journal of Food Microbiology, 141(1-2), 97-103.

Post, G. (2002). Probiotic fruit juice beverages. Fruit-Processing, 12(5), 212-217

Prado, F.C., Parada, J.L., Pandey. A., and Soccol, C.R. (2008). Trends in non-dairy probiotic beverages. Food Research International, 41(2): 111–123.

Prescott, S. L., Wickens, K., Westcott, L., Jung, W., Currie, H., Black, P. N., et al. (2008). Supplementation with Lactobacillus rhamnosus or Bifidobacterium lactis probiotics in pregnancy increases cord blood interferon-gamma and breast milk transforming growth factor-beta and immunoglobin A detection. Clinical & Experimental Allergy, 38(10), 1606-1614.

Prior RL, Cao G, Martin A, Sofic E, McEwen J, O’Brien C, Lischner N, Ehlenfeldt M, Kalt W, Krewer G, Mainland CM. (1998). Antioxidant capacity as influenced by total phenolic and anthocyanin content, maturity, and variety of Vaccinium species. J Agric Food Chem 46(7):2686-2693.

Puupponen-Pimia. R, Nohynek. L, Alakomi. H. L & Oksman-Caldentey. K-M, (2005). The action of berry phenolics against human intestinal pathogens. Bio Factors. 23. 243-251.

Rathore S, Desai PM, Liew CV, Chan LW, Heng PWS. 2013. Microencapsulation of microbial cells. J Food Eng 116(2):369–81.

Rasic, J.Lj.; Kurmann, J.A. (1983). Bifidobacteria and Their Role; Birkhau¨ser: Basel,.

Ray, R.C., and Sivakumar, P.S. (2009). Traditional and novel fermented foods and beverages from tropical root and tuber crops—A review. International Journal of Food Science and Technology, 44: 1073–1087.

Rettger, L.F., (1935). Lactobacillus acidophilus: Its therapeutic application. Yale University Press, London.

Roberfroid, M.B. (2007). Prebiotics: The concept revisited. Journal of Nutrition, 137: 830S–837S.

Rodrigues. S, Narciso Fernandes. F. A. (2012). Advances in fruit processing technologies. Contemporary Food Engineering Series, Da-Wen Sun, Series Editor. CRC Press, Taylor & Francis Group. FL 33487-2742

Rogers, K. (2011). The digestive system. New York: Rosen Educational Services.

162

Romond, C.; Beerens, H.; Neut, C.; Montreuil, J. (1980). Contribution a` l’étude de la maternisation des laits. Ann. Microbiol. Inst. Pasteur, 131, 309–314.

Ross. C, Salminen. S , von Wright. A, and Ouwehand. A. (2004). Chapter 3, An Update on Probiotic Bifidobacteria, Lactic Acid Bacteria, Microbiological and Functional Aspects, Third Edition, Edited by , CRC Press.

Ross, R. P., Fitzgerald, G., Collins, K., & Stanton, C. (2002). Cheese delivering biocultures-probiotic cheese. Australian Journal of Dairy Technology, 57(2), 71-78.

Ross, R.P., C. Desmond, G.F. Fitzgerald and C. Stanton (2005). Overcoming the technological hurdles in the development of probiotic foods. Journal of Applied Microbiology 98: 1410-1417.

Saarela , M., H.-L. Alakomi J. Mättö , A.-M. Ahonen S. Tynkkynen (2011), Acid tolerant mutants of Bifidobacterium animalis subsp. lactis with improved stability in fruit juice LWT - Food Science and Technology 44 1012-1018

Saarela, M., Virkajarvi, I., Alakomi, H. L., Sigvart-Mattila, P., & Matto, J. (2006). Stability and functionality of freeze-dried probiotic Bifidobacterium cells during storage in juice and milk. International Dairy Journal, 16(12), 1477-1482.

Saarela, M., Rantala, M., Hallamaa, K., Nohynek, L., Virkajarvi, I., & Matto, J. (2004). Stationary-phase acid and heat treatments for improvement of the viability of probiotic lactobacilli and bifidobacteria. Journal of Applied Microbiology, 96(6), 1205-1214.

Saarela, M., Mogensen, G., Fonden, R., Matto, J., & Mattila-Sandholm, T. (2000). Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology 84(3), 197-215.

Saiki, R.K., D.H. Gelfand, S. Stoffel, S.J. Scharf, R. Higuchi, G.T. Horn, K.B. Mullis and H.A. Erlich. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491.

Salminen, S., and M. Gueimonde. (2004). Human studies on probiotics: what is scientifically proven? J. Food Sci. 69:M137-M140.

Salminen, S., & Playne, M. J. (2001). Probiotics. The World of Food Ingredients, January, 33-35.

Salminen, S., von Wright, A., Morelli, L., Marteau, P., Brassart, D., de Vos, W. M., et al. (1998). Demonstration of safety of probiotics -- a review. International Journal of Food Microbiology, 44(1-2), 93-106.

Salminen, S., Laine, M., von Wright, A., Vuopio-Varkila, J., Korhonen, T., & Mattila-Sandholm, T. (1996). Development of selection criteria for probiotic strains to assess their potential in functional foods: a Nordic and European approach. Bioscience & Microflora, 15, 61-67.

Salminen, S. and Von Wrigh, A. (Eds.). (1993). Lactic Acid Bacteria. Marcel Dekker Inc., New York.

163

Samelis, J., Ikeda, J.S., and Sofos, J.N, (2003), Evaluation of the pH-dependent, stacionary phase acid tolerance in Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium DT104, induced by culturing in media with 1% glucose:a comperative stady with Escherichia Coli O157:H7, J.Appl.Microbiol, 95, 563-575.

Sanchez, B., L. Ruiz, C.G. de los Reyes-Gavilan and A. Margolles (2008). Proteomics of stress response in Bifidobacterium. Frontiers in Bioscience 13: 6905-6919.

Sanchez, B., M.C. Champomier-Verges, M. Del Carmen Collado, P. Anglade, F. Baraige, Y. Sanz, C.G. de Los Reyes-Gavilan, A. Margolles and M. Zagorec (2007a). Low pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum biotype longum. Applied and Environmental Microbiology 73: 6450-6459.

Sanchez, B., M.C. Champomier-Verges, B. Stuer-Lauridsen, P. Ruas-Madiedo, P. Anglade, F. Baraige, C.G. de Los Reyes-Gavilan, E. Johansen, M. Zagorec and A. Margolles (2007b). Adaptation and response of Bifidobacterium animalis subsp. lactis to bile: A proteomic and physiological approach. Applied and Environmental Microbiology 73: 6757-6767.

Sanchez, B., C.G.D. Reyes-Gavilan and A. Margolles (2006). The F1F0-ATPase of Bifidobacterium animalis is involved in bile tolerance. Environmental Microbiology 8: 1825-1833.

Sanchez, B., M.C. Champomier-Verges, P. Anglade, F. Baraige, C.G.D. Reyes-Gavilan, A. Margolles and M. Zagorec (2005). Proteomic analysis of global changes in protein expression during bile salt exposure of Bifidobacterium longum NCIMB 8809. Journal of Bacteriology 187: 5799-5808.

Sanders, M. E., & Marco, M. L. (2010). Food formats for effective delivery of probiotics. Annual Review of Food Science & Technology, 1, 65-85.

Sanders, M. E. (2008). Probiotics: definition, sources, selection, and uses. Clinical Infectious Diseases 46 Suppl 2, S58-61; discussion S144-151.

Sanders, J. W., Venema, G., & Kok, J. (1999). Environmental stress responses in Lactococcus lactis. FEMS Microbiology Reviews, 23(4), 483-501.

Sanz, Yolanda. (2007) Review ,”Ecological and functional implications of the acid-adaptation ability of Bifidobacterium: A way of selecting improved probiotic strains” International Dairy Journal 17 1284–1289

Sawaminee Nualkaekul, Ivan Salmeron, Dimitris Charalampopoulos, (2011) Investigation of the factors influencing the survival of Bifidobacterium longum in model acidic solutions and fruit juices, Food Chemistry 129 1037–1044

Saxelin, M., Grenov, B., Svensson, U., Fonden, R., Reniero, R., & Mattila-Sandholm, T. (1999). The technology of probiotics. Trends in Food Science & Technology, 10(12), 387-392.

164

Sazawal, S., Dhingra, U., Hiremath, G., Sarkar, A., Dhingra, P., Dutta, A., et al. (2010). Effects of Bifidobacterium lactis HN019 and prebiotic oligosaccharide added to milk on iron status, anemia, and growth among children 1 to 4 years old. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition 51(3), 341-346.

Scardovi, V. (1986a). Genus Bifidobacterium Orla-Jensen 1924, 472al. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe & J. G. Holt (Eds.), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Baltimore: Williams and Wilkins. Vol. 2, pp. 1418–1434.

Scardovi, V. (1986b). Bifidobacterium. In Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed.; Williams and Wilkins: Baltimore,.

Scardovi, V., L.D. Trovatelli, B. Biavati and G. Zani (1979). Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium boum, and Bifidobacterium pseudocatenulatum: 4 new species and their deoxyribonucleic-acid homology relationships. International Journal of Systematic Bacteriology 29: 291-311.

Scardovi, V. and F. Crociani (1974). Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium dentium, and Bifidobacterium angulatum: 3 new species and their deoxyribonucleic-acid homology relationships. International Journal of Systematic Bacteriology 24: 6-20.

Scardovi, V. and D. Trovatelli (1969). New species of bifidobacteria from Apis mellifica L. and Apis indica F. A contribution to the taxonomy and biochemistry of the genus Bifidobacterium. Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene. Zweite naturwissenschaftliche Abt.: Allgemeine, landwirtschaftliche und technische Mikrobiologie 12: 64-88.

Schmidt, G., & Zink, R. (2000). Basic features of the stress response in three species of bifidobacteria: B. longum, B. adolescentis, and B. breve. International Journal of Food Microbiology, 55(1-3), 41-45.

Sellappan, S., Akoh, C.C., and Krewer, G. (2002). Phenolic compounds and antioxidant capacity of Georgia-grown blueberries and blackberries. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 50:2432- 2438.

Searby, L. (2005a). The high-flying fruit. Functional Foods & Nutraceuticals, 24-26.

Servin, A. L., & Coconnier, M. H. (2003). Adhesion of probiotic strains to the intestinal mucosa and interaction with pathogens. Best Practice & Research in Clinical Gastroenterology, 17(5), 741-754.

Shah, N.P. W.K. Ding, M.J. Fallourd, and G. Leyer, (2010). Improving the Stability of Probiotic Bacteria in Model Fruit Juices Using Vitamins and Antioxidants, Journal of Food Science. Vol. 75, Nr. 5.M278-M282.

Shah, N. P. (2007). Functional cultures and health benefits. International Dairy Journal, 17(11), 1262-1277.

165

Shah, N.P. (2001). Functional foods from probiotics and prebiotics. Food Technology, 55: 46–53.

Shahidi, F., & Han, X. Q. (1993). Encapsulation of food ingredients. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 33(6), 501-547.

Sheehan, V.M., Ross, P., and Fitzgerald, G.F. (2007). Assessing the acid tolerance and the technological robustness of probiotic cultures for fortification in fruit juices. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 8: 279–284.

Shimakawa, Y., Matsubara, S., Yuki, N., Ikeda, M., & Ishikawa, F. (2003). Evaluation of Bifidobacterium breve strain Yakult-fermented soymilk as a probiotic food. International Journal of Food Microbiology, 81(2), 131-136.

Shu,Q., & Gill, H. S. (2001). A dietary probiotic (Bifidobacterium lactis HN019) reduces the severity of Escherichia coli O157:H7 infection in mice. Medical Microbiology & Immunology 189(3), 147-152.

Shu, Q., Lin, H., Rutherfurd, K. J., Fenwick, S. G., Prasad, J., Gopal, P. K., et al. (2000). Dietary Bifidobacterium lactis (HN019) enhances resistance to oral Salmonella typhimurium infection in mice. Microbiology & Immunology 44(4), 213-222.

Simpson, P.J., R.P. Ross, G.F. Fitzgerald and C. Stanton (2004). Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov. and Aeriscardovia aeriphila gen. nov., sp. nov., isolated from a porcine caecum. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: 401-406.

Siró, I., Kálpona, E., Kálpona, B., and Lugasi, A. 2008. Functional food. Product development, marketing and consumer acceptance: A review. Appetite, 51: 456–467.

Siuta-Cruce, P., & Goulet, J. (2001). Improving probiotic survival rates. Food Technology, 55(10), 36-42.

Smidsrod, O., & Skjakbraek, G. (1990). Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in Biotechnology, 8(3), 71-78.

Stanton, C., Gardiner, G., Lynch, P. B., Collins, J. K., Fitzgerald, G., & Ross, R. P. (1998). Probiotic cheese. International Dairy Journal, 8(5-6), 491-496.

Stanton, C., Gardiner, G., Meehan, H., Collins, k., Fitzgerald, G., Lynch, P. B., et al. (2001). Market potential for probiotics. The American Journal of Clinical Nutrition, 73, 476S–483S.

Sultana, K., Godward, G., Reynolds, N., Arumugaswamy, R., Peiris, P., & Kailasapathy, K. (2000). Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt. International Journal of Food Microbiology, 62(1-2), 47-55.

Svensson, U. (1999). Industrial perspectives. In G. W. Tannock (Ed.), Probiotics A Critical Review (pp. 57-64). Norfolk: Horizon Scientific Press.

166

Simenhoff, M. L., Dunn, S. R., Zollner, G. P., Fitzpatrick, M. E., Emery, S. M., Sandine, W. E., et al. (1996). Biomodulation of the toxic and nutritional effects of small bowel bacterial overgrowth in end-stage kidney disease using freeze-dried Lactobacillus acidophilus. Miner Electrolyte Metab, 22(1-3), 92-96.

Singh, R.P. (2000). Scientific principles of shelf-life evaluation. In: Man, D. and Jones, A. (Ed) Shelf Life Evaluation of Foods, 2nd Edition, Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, MD. pp 3-22

Slavin, J. L. (1999). Health benefits of oligosaccharides. Journal of Nutraceuticals, Functional & Medical Foods, 1(4), 43-55.

Smittle, R.B. and Cirigliano, M.C. (2001). Salad dressings. In: Downes, F.P. and Ito, K. (Ed) Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, American Public Health Association, Washington, D.C. USA, pp 543.

Smits, H. H., Engering, A., van der Kleij, D., de Jong, E. C., Schipper, K., van Capel, T. M., et al. (2005). Selective probiotic bacteria induce IL-10-producing regulatory T cells in vitro by modulating dendritic cell function through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing nonintegrin. The Journal of Allergy & Clinical Immunology 115(6), 1260-1267.

Song, S. H., Cho, Y. H., & Park, J. (2003). Microencapsulation of Lactobacillus casei YIT 9018 using a microporous glass membrane emulsification system. Journal of Food Science, 68(1), 195-200.

Stack HM, Kearney N, Stanton C, Fitzgerald GF, Ross RP. (2010). Association of beta-glucan endogenous production with increased stress-tolerance of intestinal lactobacilli. Appl Environ Microbiol; 76: 500-7.

Stackebrandt, E., Cummins, C. S. , & Johnson, J . L. (2006). Family Propionibacteriaceae: The Genus Propionibacterium. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer & E. Stackebrandt (Eds.), The Prokaryotes (3 ed., Vol. 3, pp. 400-418). New York: Springer.

Starkie, R., Ostrowski, S. R., Jauffred, S., Febbraio, M., & Pedersen, B. K. (2003). Exercise and IL-6 infusion inhibit endotoxin-induced TNF-alpha production in humans. The FASEB Journal 17(8), 884-886.

Steensberg, A., Fischer, C. P., Keller, C., Moller, K., & Pedersen, B. K. (2003). IL-6 enhances plasma IL-1ra, IL-10, and cortisol in humans. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism 285(2), E433-437.

Stober, H., Maier, E., & Schmidt, H. (2010). Protective effects of Lactobacilli, Bifidobacteria and Staphylococci on the infection of cultured HT29 cells with different enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes are strain-specific. International Journal of Food Microbiology, 144(1), 133-140.

Strachan, D. P. (1989). Hay fever, hygiene, and household size. BMJ, 299(6710), 1259- 1260.

167

Sun W, Griffiths MW. 2000. Survival of bifidobacteria in yogurt and simulated gastric juice following immobilization in gellan–xanthan beads. Intl J Food Microbiol 61(1):17–25.

Svarcova. I, Heinrich. J, & Valentova. K. (2007). Berry fruits as a source of biological active compaounds. The case of Lonicera caerulea. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub.151(2). 163-174

Swennen, K., Courtin, C. M., & Delcour, J. A. (2006). Non-digestible oligosaccharides with prebiotic properties. Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 46(6), 459-471.

Szajewska, H., & Mrukowicz, J. (2005). Meta-analysis: non-pathogenic yeast Saccharomyces boulardii in the prevention of antibiotic-associated diarrhoea. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, 22(5), 365-372.

Szakály, S. (2007). Development and distribution of functional dairy products in Hungary. In Proceedings of the Fourth International FFNet Meeting on Functional Foods, March 26–27, Budapest, Hungary.

Taipale, T., Pienihakkinen, K., Isolauri, E., Larsen, C., Brockmann, E., Alanen, P., et al. (2011). Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 in reducing the risk of infections in infancy. The British Journal of Nutrition, 105(3), 409-416.

Tallon, R., Arias, S., Bressollier, P., & Urdaci, M. C. (2007). Strain- and matrix-dependent adhesion of Lactobacillus plantarum is mediated by proteinaceous bacterial compounds. Journal of Applied Microbiology, 102(2), 442-451.

Talwalkar, A. and K. Kailasapathy (2004). The role of oxygen in the viability of probiotic bacteria with reference to L. acidophilus and Bifidobacterium spp. Current issues in intestinal microbiology 5: 1-8

Talwalkar, A., & Kailasapathy, K. (2003). Effect of microencapsulation on oxygen toxicity in probiotic bacteria. Australian Journal of Dairy Technology, 58(1), 36-39.

Tamime, A. Y. (2002). Microbiology of starter cultures. In R. K. Robinson (Ed.), Dairy Microbiology Handbook (pp. 261-366). New York: John Wiley and Sons, Inc.

Tamime, A. Y., Marshall, V. M. E., & Robinson, R. K. (1995). Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria. Journal of Dairy Research, 62(1), 151-187.

Tannock, G.W. (2003). Probiotics: Time for a dose of realism. Current Issues in Intestinal Microbiology, 4: 33–42.

Tannock, G. W. (2002a). A fresh look at the intestinal microflora. In G. W. Tannock (Ed.), Probiotics A Critical Review (pp. 5-14). Norfolk: Horizon Scientific Press.

Tannock, G. W. (2002b). Identification of lactobacilli and bifidobacteria. In G. W. Tannock (Ed.), Probiotics A Critical Review (pp. 45-56). Norfolk: Horizon Scientific Press.

168

Tannock, G. W. (2002c). The bifidobacterial and lactobacillus microflora of humans. Clin. Rev. Allergy Immunol. 22:231-253.

Taylor C Wallace, F. G., Karen Madsen, Michael D Cabana, Glenn Gibson, Eric Hentges, and Mary Ellen Sanders (2011). "Human gut microbiota and its relationship to health and disease." Nutrition Reviews 69(7): 392-403.

Teixeira P, Castro H, Malcata FX, Kirby R. 1995. Survival of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus following spray-drying. J Dairy Sci 78:1025–31.

Trehane, J. 2004. Blueberries, cranberries and other vacciniums. Royal Horticultue Society, Hong Kong. Pp 87-100.

Tsen, J. H., Lin, Y. P., & King, E. (2004). Fermentation of banana media by using ic-carrageenan immobilized Lactobacillus acidophilus. International Journal of Food Microbiology, 91, 215-220.

Tulipani. S, Mezzeti. B, Capocasa. F, Bompadre. S, Beekwilder. J, Vos. C.H.R.D. (2008). Antioxidant, phenolic compounds, and nutritional quality of different strawberry genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (3). 696-704

Tuomola, E. M., Ouwehand, A. C., & Salminen, S. J. (2000). Chemical, physical and enzymatic pre-treatments of probiotic lactobacilli alter their adhesion to human intestinal mucus glycoproteins. International Journal of Food Microbiology, 60(1), 75-81.

Tuorila, H. and Cardello, A.V. (2002). Consumer responses to an off-flavor in juice in the presence of specific health claims. Food Quality and Preference, 13: 561–569.

Turroni, F., van Sinderen, D., & Ventura, M. (2011). Genomics and ecological overview of the genus Bifidobacterium. International journal of food microbiology 149(1), 37-44.

Twetman, S., Derawi, B., Keller, M., Ekstrand, K., Yucel-Lindberg, T., & StecksenBlicks, C. (2009). Short-term effect of chewing gums containing probiotic Lactobacillus reuteri on the levels of inflammatory mediators in gingival crevicular fluid. Acta Odontologica Scandinavica, 67(1), 19-24.

USDA, (2004). USDA National Nutrient Database for standard reference. Betsville Human Nutrition Research Center, ARS.

van Baarlen, P., F.J. Troosta, S. van Hemerta, C. van der Meera, W.M. de Vos, P.J. de Groota, G.J.E.J. Hooivelda, R.M. Brummera and M. Kleerebezema (2009). Differential NF-kB pathways induction by Lactobacillus plantarum in the duodenum of healthy humans correlating with immune tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America106: 2371-2376.

van Boekel, M.A.J.S. (2007). Key reactions in foods and ways to model them. In: Linnemann, A.R. and van Boekel, M.A.J.S, (Ed) Food product design. An integrated approach. Wageningen: Academic Publishers, pp 189-193.

169

van Boekel, M.A.J.S and Walstra, P. (1995). Use of kinetics in studying heat-induced changes in foods. In: Fox, P.F. (Ed) Heat-induced changes in milk. Brussels: International Dairy Journal 1: 51-65

van de Guchte, M., Serror, P., Chervaux, C., Smokvina, T., Ehrlich, S. D., & Maguin, E. (2002). Stress responses in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek, 82(1- 4), 187-216.

Van den Abbeele, P., Grootaert, C., Possemiers, S., Verstraete, W., Verbeken, K., & Van de Wiele, T. (2009). In vitro model to study the modulation of the mucinadhered bacterial community. Applied Microbiology & Biotechnology 83(2), 349-359.

Van der Meulen, R., T. Adriany, K. Verbrugghe and L. de Vuyst (2006). Kinetic analysis of bifidobacterial metabolism reveals a minor role for succinic acid in the regeneration of NAD(+) through its growth-associated production. Applied and Environmental Microbiology 72: 5204-5210.

Van der Meulen, R., L. Makras, K. Verbrugghe, T. Adriany and L. de Vuyst (2006). In vitro kinetic analysis of oligofructose consumption by Bacteroides and Bifidobacterium spp. indicates different degradation mechanisms. Applied and Environmental Microbiology 72: 1006-1012.

Vasiljevic, T., & Shah, N. P. (2008). Probiotics from Metchnikoff to bioactives. International Dairy Journal, 18, 714-728.

Vaughan, A., Buzzini, P., Clementi, F., (2008). Laboratorio Didatico di Microbiologia. Cap 7, 112-131.

Veerkamp, J.H.; Lambert, R.; Saito, Y. (1965). The composition of the cell wall of Lactobacillus bifidus var. pennsylvanicus. Arch. Biochem. Biophys. 112 (1), 120–125.

Ventura, M., C. Canchaya, Z.D. Zhang, V. Bernini, G.F. Fitzgerald and D. van Sinderen (2006). How high G+C Gram-positive bacteria and in particular bifidobacteria cope with heat stress: Protein players and regulators. FEMS Microbiology Reviews 30: 734-759.

Ventura, M., D. van Sinderen, G.F. Fitzgerald and R. Zink (2004b). Insights into the taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria. Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 86: 205-223.

Ventura, M. Meylan, V dhe Zink, R. (2003). Identification and Tracing of Bifidobacterium Species by Use of Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequences Applied and Environmental Microbiology, Vol. 69, No. 7, p. 4296–4301

Verbeke, W. (2005). Consumer acceptance of functional foods: Sociodemographic, cognitive and attitudinal determinants. Food Quality and Preference, 16: 45–57.

170

Viljakainen. S, Visti. A & Laakso. S. (2002). Concentrations of organics acids and soluble sugars in juice for Nordic berries. Acta Agriculturae Scandinavica Section B, Soil and Plant Science, 52(2), 101-109.

Vinderola, C. G., Costa, G. A., Regenhardt, S., & Reinheimer, J. A. (2002). Influence of compounds associated with fermented dairy products on the growth of lactic acid starter and probiotic bacteria. International Dairy Journal, 12, 579-589.

Vinderola, C.G. and Reinheimer, J.A. (2000). Enumeration of Lactobacillus casei in the presence of L. acidophilus. Bifidobacteria and lactic starter bacteria in fermented dairy products. International Dairy Journal, 10: 271–275.

von Ah, U., V. Mozzetti, C. Lacroix, E. Kheadr, I. Fliss and L. Meile (2007). Classification of a moderately oxygen-tolerant isolate from baby faeces as Bifidobacterium thermophilum. BMC Microbiology 7: 79.

Vourinen. H, Määtä. K, Törrönen. R, (2000). Content of the Flavonols Myricetin, Quercetin, Kaempferol in Finnish Berry Wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(7), 2675-2680.

Walstra, P. (2003). Physical chemistry of foods. Marcel Dekker. New York, pp 28.

Wang, C.Y., Ng, C.C., Su, H., Tzeng, W.S., dhe Shyu, Y.T. (2009). Probiotic potential of noni juice fermented with lactic acid bacteria and bifidobacteria. International Journal of Food Science and Nutrition, 1: 1-9.

Wang, S. Y., and Zheng, W., (2003). Oxygen radical absorbing capacity of phenolics in blueberries, cranberries, chokeberries, and lingonberries, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 502-509.

Weizman, Z., Asli, G., & Alsheikh, A. (2005). Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: Comparison of two probiotic agents. Pediatrics, 115(1), 5-9.

Wichienchot, S., Jatupornpipat, M., & Rastall, R. (2010). Oligosaccharides of pitaya (dragon fruit) flesh and their prebiotic properties. Food Chemistry, 120(3), 850-857.

Wilmsen, P. K., Spada, D. S., & Salvador, M. (2005). Antioxidant activity of the flavonoid hesperidin in chemical and biological systems. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 53(12), 4757-4761.

Winger, R.J. (2000). Preservation technology and shelf life In: Man, D. and Jones, A. (Editors) Shelf Life Evaluation of Foods, 2nd Edition, Aspen Publishers, Inc. Gaithersburg, MD pp 73-86.

Yoon, K.Y., Woodams, E.E., and Hang, Y.D. (2006). Production of probiotic cabbage juice by lactic acid bacteria. Bioresource Technology, 97: 1427–1430.

171

Yoon, K.Y., Woodams, E.E., and Hang, Y.D. (2005). Fermentation of beet juice by: Beneficial lactic acid bacteria. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie 38(1): 73–75.

Yoon, K., Woodams, E., & Hang, Y. (2004). Probiotication of tomato juice by lactic acid bacteria. Journal of Microbiology, 42(4), 315-318.

Zarate, G., Perez Chaia, A., Gonzalez, S., & Oliver, G. (2000). Viability and beta-galactosidase activity of dairy propionibacteria subjected to digestion by artificial gastric and intestinal fluids. Journal of Food Protection, 63(9), 1214- 1221.

172

universiteti i tiranËs fakulteti i shkencave …...nuk ka fjalë për të përshkruar se sa...

Documents