UJI SEROLOGI Tomato chlorosis virus (ToCV) PADA

TANAMAN TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill.)

RIZA DESTARI

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Uji Serologi Tomato

chlorosis virus (ToCV) pada Tanaman Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)”

adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing dan belum diajukan

dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang

berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Februari 2014

Riza Destari

NIM A34090031

*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak

luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.

ABSTRAK

RIZA DESTARI. Uji Serologi Tomato chlorosis virus (ToCV) pada Tanaman

Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.). Dibimbing oleh GEDE SUASTIKA. Tomato chlorosis virus (ToCV) merupakan salah satu anggota genus

Crinivirus yang ditularkan melalui kutukebul dan terbatas hanya pada jaringan

floem tanaman inangnya. Virus ini dilaporkan telah menginfeksi tanaman tomat di

dunia dan pertama kali dilaporkan di Indonesia pada tahun 2006. Pada tanaman

tomat, ToCV menimbulkan gejala berupa menguningnya bagian di antara tulang

daun (interveinal yellowing) yang berawal dari daun bagian bawah dan

berkembang ke bagian atas tanaman. Virus ini juga dapat mengakibatkan

turunnya kebugaran tanaman dan menurunkan hasil produksi karena dapat

menunda proses pematangan dan buah yang dihasilkan berukuran lebih kecil.

Antiserum poliklonal telah berhasil dibuat dengan menggunakan coat protein

(CP) ToCV yang diekpresikan pada Escherichia coli. Penelitian ini bertujuan

untuk menganalisis reaksi dan titer antiserum dengan menggunakan uji serologi

melalui metode agarose gel precipitation test (AGPT) dan dot immunobinding

assay (DIBA). Titer antiserum diukur dengan menggunakan sap tanaman yang

tidak diencerkan yang berasal dari tanaman tomat terinfeksi ToCV. Berdasarkan

hasil penelitian ini, antiserum ToCV bereaksi secara spesifik dengan antigen

ToCV. Sinyal positif pada metode AGPT dan DIBA tampak jika antiserum

bereaksi dengan sap tanaman tomat sumber ToCV, akan tetapi sinyal positif tidak

tampak jika antigen berasal dari sap tanaman tomat sehat. Titer antiserum yang

didapatkan dengan metode AGPT adalah 1/2, sedangkan dengan menggunakan

DIBA titer antiserum mencapai 1/10000. Oleh karena itu, DIBA merupakan

metode serologi yang dapat dipertimbangkan dalam deteksi ToCV dengan

menggunakan antiserum ini.

Kata kunci: agarose gel precipitation test, titer antiserum, dot immunobinding

assay.

ABSTRACT

RIZA DESTARI. Serological Test of Tomato chlorosis virus (ToCV) in Tomato

Plants (Lycopersicon esculentum Mill.). Supervised by GEDE SUASTIKA.

Tomato chlorosis virus (ToCV), a whitefly-transmitted and phloem-

limited Crinivirus infecting tomatoes worldwide, is reported for the first time

occur in Indonesia in 2006. In tomato, ToCV cause interveinal yellowing that

developed initially on lower leaves and then progressed to the upper part of the

plant. Affected plants were less vigorous and yielded less due to reduced fruit

growth and delayed ripening. Polyclonal antiserum has been already produced

using capsid proteins of ToCV expressed in Escherichia coli. Reaction and titer of

the antiserum were analyzed in this research. Serological reactions were analyzed

using agarose gel precipitation test (AGPT) and dot immunobinding assay

(DIBA). The titer of the antiserum was measured using undiluted sap prepared

from ToCV-infected tomato leaf tissues. Based on the research result, the ToCV

antiserum was specifically reacted with ToCV antigen. AGPT and DIBA gave a

strong positive signal if the antiserum was reacted with ToCV-containing sap, but

there no any positive signal if the antigen extracted from healthy tomato plant.

Using AGPT method, the titer of the antiserum was only 1/2, but using DIBA the

titer was reach up to 1/10000. The DIBA, therefore, considered as a reliable

serological method for the ToCV using this antiserum.

Key words: agarose gel precipitation test, antiserum titer, dot immunobinding

assay.

UJI SEROLOGI Tomato chlorosis virus (ToCV) PADA

TANAMAN TOMAT (Lycopersicon esculentum Mill.)

RIZA DESTARI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Pertanian

pada

Departemen Proteksi Tanaman

DEPARTEMEN PROTEKSI TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Judul Skripsi : Uji Serologi Tomato chlorosis virus (ToCV) pada Tanaman

Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)

Nama Mahasiswa : Riza Destari

NIM : A34090031

Disetujui oleh

Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc

Dosen Pembimbing

Diketahui oleh

Dr. Ir. Abdjad Asih Nawangsih, M.Si

Ketua Departemen

Tanggal disetujui:

Judul Skripsi Uji Serologi Tomato chlorosis virus (ToCV) pada Tanaman Tomat (Lycopersicon esclilentlll71 Mill.)

Nama Mahasiswa Riza Destari NIM A34090031

Disetujui oleh

Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc Dosen Pembimbing

awangsih, M.Si Ketua Departemen

Tanggal disetujui: ,1 D FEB 20 14

PRAKATA

Puji syukur kehadirat Allah SWT karena berkat rahmat dan karunia-Nya

penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan segala kemampuan dan keterbatasan

yang dimiliki penulis. Skripsi yang berjudul “Uji Serologi Tomato chlorosis virus

(ToCV) pada Tanaman Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)” disusun sebagai

salah satu syarat dalam memperoleh gelar Sarjana Pertanian di Departemen

Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Gede Suastika, M. Sc selaku

dosen pembimbing akademik dan sekaligus dosen pembimbing skripsi atas

bimbingannya selama penelitian. Dr. Ir Sri Hendrastuti Hidayat, M. Sc, dan Dr. Ir.

Tri Asmira Damayanti, M. Agr yang telah memberikan saran, nasihat, serta

pengarahan selama di laboratorium. Staf pengajar di Departemen Proteksi

Tanaman yang telah memberikan pengajaran mata kuliah selama di Departemen

Proteksi Tanaman. Kepada Fitrianingrum Kurniawati, M. Si dan Sari Nurulita, SP

yang telah berkenan menjadi tutor selama penelitian. Teman-teman Laboratorium

Virologi yang senantiasa membantu selama penelitian dan teman-teman HPT 46

yang selalu ada dalam suka dan duka. Kepada orang tua tercinta bapak Samsul

Rizal, ibu Yulizar, adik Ari Saputra, dan adik Ferri Yusra yang selalu memberikan

semangat, motivasi, doa, dan kasih sayang yang tulus.

Semoga skripsi ini bermanfaat

Bogor, Februari 2014

Riza Destari

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

BAHAN DAN METODE 3

Tempat dan Waktu Penelitian 3

Metode Penelitian 3

Tanaman Tomat Sumber ToCV 3

Ekstraksi RNA Total 3

Sintesis complementary cDNA 4

Amplifikasi DNA 4

Elektroforesis 5

Agarose Gel Precipitation Test (AGPT) 6

Dot Immunobinding Assay (DIBA) 6

HASIL DAN PEMBAHASAN 8

Tanaman Tomat Sumber ToCV 8

Reaksi Antiserum terhadap ToCV 9

Agarose Gel precipitation Test (AGPT) 9

Dot Immunobinding Assay (DIBA) 10

Titer Antiserum ToCV 11

SIMPULAN DAN SARAN 14

Simpulan 14

Saran 14

DAFTAR PUSTAKA 15

RIWAYAT HIDUP 17

DAFTAR TABEL

1 Komposisi reaktan reverse transcription untuk sintesis cDNA genom

ToCV

4

2 Komposisi reaktan polymerase chain reaction untuk satu kali reaksi

amplifikasi DNA genom ToCV

5

3 Titer antiserum poliklonal ToCV pada metode agarose gel

precipitation test (AGPT) dan dot immunobinding assay (DIBA)

pada seri pengenceran yang berbeda*

11

DAFTAR GAMBAR

1 Ilustrasi pengujian AGPT. antigen; antibodi 6

2 Gejala penyakit klorosis pada tanaman tomat, dicirikan dengan

(a) menguningnya bagian di antara tulang daun (interveinal

yellowing); (b) nekrotik pada beberapa bagian daun; dan (c)

terjadinya perubahan warna menjadi keunguan (bronzing)

8

3 Hasil amplifikasi DNA terhadap gen coat protein ToCV

menggunakan reverse transcription-polymerase chain reaction.

Marker 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific, USA) [Lajur M];

kontrol negatif (tanaman sehat) [Lajur K(-)]; tanaman bergejala

[Lajur 1, 2, dan 3]

9

4 Reaksi antigen (sap tanaman terinfeksi ToCV [AgTo] atau sap

tanaman tomat sehat [AgKo] dengan antibodi (antiserum ToCV

[AsTo])) pada metode agarose gel precipitation test

10

5 Reaksi antigen (sap tanaman tomat sehat [Lajur H] dan tomat

terinfeksi ToCV [Lajur T]) dengan antibodi (antiserum ToCV) pada

metode dot immunobinding assay

10

6 Reaksi antiserum ToCV [As] terhadap antigen (partikel virus dalam

sap tanaman tomat [Ag]) melalui agarose gel pricipitation test pada

pengenceran 1/1 [Lajur a]; 1/2 [Lajur b]; dan (c) 1/4 [Lajur c]

12

7 Reaksi antiserum ToCV terhadap antigen (partikel virus dalam sap

tanaman tomat) melalui dot immunobinding assay pada pengenceran

1/1000 [Membran a]; 1/10000 [Membran b]; dan 1/100000

[Membran c]

13

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tomato chlorosis virus (ToCV) merupakan salah satu anggota genus

Crinivirus yang termasuk ke dalam famili Closteroviridae yang ditularkan oleh

kutukebul dan terbatas hanya pada jaringan floem. Virus ini pertama kali

ditemukan tahun 1996 di pertanaman tomat (Lycopersicon esculentum Mill.)

rumah kaca di daerah Florida bagian utara. Gejala yang ditimbulkan berupa

menguningnya bagian di antara tulang daun (interveinal yellowing) yang berawal

dari daun-daun di bagian bawah dan berkembang ke bagian atas tanaman. Gejala

demikian dapat menghambat proses fotosintesis tanaman (Wintermantel dan

Wisler 2006). Selain itu virus ini juga dapat menurunkan kebugaran tanaman dan

menyebabkan kehilangan hasil (Wisler et al. 1998a) karena menunda proses

pematangan buah, serta buah yang dihasilkan ukurannya menjadi jauh lebih kecil

(Navas-Castillo et al. 2000). Keberadaan ToCV telah dilaporkan dibeberapa

negara di dunia seperti Amerika Serikat (Wisler et al. 1998b) khususnya Florida

(Wintermantel dan Wisler 2006), Cyprus (Papayiannis et al. 2006), Meksiko

(Alvarez-Ruiz et al. 2007), Turki (Cevik 2008), Pulau Mayotte (Masse et al.

2008) dan termasuk Indonesia (Hartono dan Wijanarko 2007; Suastika et al.

2010) karena telah menjadi kendala penting bagi pertanaman tomat.

Adanya serangan ToCV tentu sangat mengkhawatirkan mengingat produksi

tomat Indonesia yang cukup tinggi. Berdasarkan data Badan Pusat Statistik (BPS)

produksi tomat di Indonesia pada tahun 2010, 2011, dan 2012 secara berturut-

turut adalah 891 616 ton, 954 046 ton, dan 887 556 ton (BPS 2012). Perlu

adanya cara tepat untuk mengetahui adanya infeksi virus ini sedini mungkin di

lapangan. Beberapa ahli telah mengembangkan berbagai macam cara untuk

mendeteksi keberadaan virus yang menginfeksi tanaman salah satunya melalui

deteksi molekuler seperti reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-

PCR) (Agrios 2005). Deteksi melalui RT-PCR lebih banyak dilakukan karena

dapat memberikan hasil yang cepat serta akurat. Akan tetapi, deteksi melalui RT-

PCR sangat sulit dilakukan karena kendala biaya alat dan bahan yang cukup

mahal. Oleh karena itu cara lain yang mulai dikembangkan salah satunya adalah

deteksi melalui uji serologi.

Uji serologi merupakan suatu metode yang digunakan untuk deteksi virus

pada tanaman yang dapat memberikan hasil lebih sensitif, spesifik, dan tidak

memerlukan waktu yang cukup lama serta dengan biaya yang terjangkau. Metode

uji serologi untuk deteksi virus tanaman terdiri dari agarose gel precipitation test

(AGPT), dot immunobinding assay (DIBA), dan enzyme linked immunosorbent

assay (ELISA) (Naidu dan Hughes 2003). Metode-metode tersebut merupakan

metode yang dilakukan dengan menggunakan antiserum. Berdasarkan hasil

penelitian Kurniawati (2012) telah berhasil dibuat antiserum poliklonal untuk

ToCV yang merupakan hasil imunisasi kelinci dengan protein produk ekspresi

gen CP ToCV pada Escherichia coli. Antiserum poliklonal merupakan antiserum

yang mengandung beberapa antibodi yang dapat mengenali lebih dari satu jenis

epitop pada partikel virus (Ritter 2000). Melalui metode uji serologi inilah dapat

diketahui kemampuan antiserum yang diproduksi tersebut dalam mendeteksi

keberadaan ToCV di dalam tanaman.

2

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis reaksi antiserum ToCV dan

mengukur titer antiserum ToCV melalui AGPT dan DIBA.

Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah memberikan informasi mengenai cara deteksi

ToCV pada tanaman tomat dengan menggunakan uji serologi dengan titer

antiserum yang berbeda.

2

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Virologi Tumbuhan,

Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, pada

bulan Maret sampai September 2013.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan terdiri dari daun tanaman tomat yang positif

terinfeksi Tomato chlorosis virus (ToCV), antiserum ToCV yang telah tersedia di

Laboratorium Virologi Tumbuhan IPB yang merupakan hasil imunisasi kelinci

dengan protein produk ekspresi gen CP ToCV pada Escherichia coli (Kurniawati

2012).

Metode Penelitian

Tanaman Tomat Sumber ToCV

Sampel tanaman tomat diperoleh dari daerah Pacet dan Pasir Sarongge

Kabupaten Cianjur, Jawa Barat berdasarkan gejala yang dimiliki seperti

menguningnya bagian di antara tulang daun (interveinal yellowing), nekrotik,

serta perubahan warna daun menjadi merah keunguan (bronzing). Verifikasi

keberadaan ToCV pada sampel tanaman tersebut dilakukan melalui RT-PCR yang

terdiri dari proses ekstraksi RNA total, sintesis complementary cDNA, amplifikasi

DNA, dan elektroforesis dengan menggunakan Bench-Top Protocols for Xprep

Plant RNA Mini Kit (PKT Korea).

Ekstraksi RNA Total. Ekstraksi dilakukan untuk mendapatkan RNA total

dengan menggunakan Bench-Top Protocols for Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT

Korea). Sebanyak 0.1 g sampel daun tanaman yang bergejala digerus dalam

nitrogen cair dan ditambahkan 500 µl bufer XPRB yang mengandung 1%

mercaptoethanol. Hasil gerusan selanjutnya dipipet ke dalam filter column

berwarna putih dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 13000 rpm.

Supernatan yang ada dipipet tanpa menyentuh pelet dan dipindahkan ke tabung

koleksi baru sambil dihitung volumenya. Selanjutnya supernatan ditambahkan

dengan ethanol 96% sebanyak 1/2 volume supernatan yang ada (±100 µl).

Suspensi tersebut dicampur dengan cara membolak-balikkan tabung koleksi

sebanyak 10 kali.

Setelah tercampur, suspensi tersebut dipipet ke dalam XPPLR mini column

berwarna merah dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm.

Sisa supernatan yang terdapat pada dasar tabung koleksi kemudian dibuang dan

XPPLR mini column tersebut dipindahkan ke tabung koleksi yang baru. Sebanyak

500 µl wash buffer 1 ditambahkan ke dalam XPPLR mini column dan

disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. Supernatan yang

terdapat di tabung koleksi dibuang dan dipasang kembali ke XPPLR mini column.

Sebanyak 750 µl wash buffer 2 ditambahkan ke dalam XPPLR mini column dan

disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 13000 rpm. XPPLR mini column

4

dipindahkan ke tabung koleksi yang baru dan disentrifugasi selama 3 menit

dengan kecepatan 13000 rpm. Sebanyak 20 µl RNAse free water (air bebas

nuklease) ditambahkan ke dalam XPPLR mini column dan didiamkan selama 1

menit. Kemudian, disentrifugasi kembali selama 2 menit dengan kecepatan 13000

rpm untuk mendapatkan RNA total. RNA total ini yang selanjutnya digunakan

sebagai templat dalam reaksi RT.

Sintesis complementary cDNA. Proses RT-PCR dilakukan menggunakan

kit komersial Access RT-PCR System (Promega, USA). Hasil ekstraksi RNA

berupa RNA total selanjutnya dilakukan sintesis DNA melalui proses Reverse

Transcription (RT) atau transkipsi balik yang digunakan untuk merubah RNA

menjadi DNA. Adapun komposisi bahan yang digunakan dalam proses RT-PCR

terdapat pada Tabel 1.

Tabel 1 Komposisi reaktan reverse transcription untuk sintesis cDNA genom

ToCV

Reaktan Volume (µl)

ddH2O 3.70

Bufer RT 2.00

dTT 50 mM 0.35

dNTP10 mM 0.50

MMuLV Rev 0.35

Ribolock 0.35

Random heksamer 0.75

RNA 2.00

Total volume 10.00

Reaksi RT dilakukan dengan menggunakan Automated Thermal cycler

(Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) dalam volume total

10 µl. RT diprogram satu siklus pada suhu 25 ºC selama 5 menit, 42 ºC selama 60

menit, dan 70 ºC selama 15 menit. Hasil RT berupa cDNA selanjutnya digunakan

dalam proses PCR.

Amplifikasi DNA. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Go Taq

Green Master Mix 2x (Promega, Madison, USA) dalam volume total 25 µl.

Adapun komposisi bahan yang digunakan dalam proses PCR terdapat pada Tabel

2.

4

5

Tabel 2 Komposisi reaktan polymerase chain reaction untuk satu kali reaksi

amplifikasi DNA genom ToCV

Reaktan Volume (µl)

Go taq green 12.5

Primer CP F 1.00

Primer CP R 1.00

ddH2O 8.50

Templat cDNA 2.00

Total 25.00

Primer yang digunakan dalam proses PCR merupakan primer yang spesifik

untuk mendeteksi ToCV, yaitu ToCV CP-R (5’-AATTAAAAGCTTTTAGCAA

CCAGTTATCGATGCAAG-3’) dan ToCV CP-F (5’-AATTAAGGATCCGAG

AACAGTGCYGTTGC-3’) yang digunakan untuk mengamplifikasi genom virus

pada bagian coat protein (CP) sebesar 700 bp.

Program amplifikasi terdiri dari denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 4

menit; dilanjutkan 30 siklus untuk denaturation (fase pemisahan utas DNA) pada

suhu 94 ºC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada suhu 45 ºC

selama 1 menit, elongation (sintesis untaian DNA baru) pada suhu 72 ºC selama 2

menit; ditambah pasca extention pada suhu 72 ºC selama 10 menit, dan disimpan

pada 4 ºC. Proses PCR dilakukan dengan menggunakan mesin PCR Automated

Thermal Cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA).

Elektroforesis. Hasil amplifikasi DNA yang didapat dari proses PCR

selanjutnya dilakukan visualisasi dengan elekroforesis gel agarose 1%. Sebanyak

0.3 gram agarose ditambah bufer Tris-Borate EDTA (TBE) 0.5x sebanyak 30 ml

dipanaskan di dalam microwave selama 2 menit hingga tercampur merata. Larutan

didiamkan selama 5 menit kemudian dituang ke dalam cetakan dan didiamkan

selama 1 jam hingga agar memadat dan membentuk gel. Setelah gel terbentuk,

sebanyak 4 µl marker DNA berukuran 1 kb (Thermo Scientific, USA) dan 7 µl

hasil PCR dimasukkan masing-masing ke dalam sumur gel. Elektroforesis

dilakukan selama 30 menit dengan voltase sebesar 50 volt, kemudian dilanjutkan

dengan voltase sebesar 100 volt selama 5 menit. Gel tersebut selanjutnya

direndam dalam larutan ethidium bromida (EtBr) selama 10 menit dan direndam

di dalam air selama 2 menit. DNA hasil elektroforesis selanjutnya divisualisasi di

bawah UV transiluminator. Pita DNA diambil gambarnya menggunakan kamera

digital.

6

Agarose Gel Precipitation Test (AGPT)

Reaksi antigen-antibodi pada metode AGPT dilakukan pada media 1% gel

agarose (Sigma, USA). Agar dibuat dengan melarutkan 0.1 g agarose dan 0.01 g

Natrium azida dalam 5 ml aquabidest dan 5 ml bufer PBS [NaCl 8 g, Na2HPO4

1.15 g, KH2PO4 0.2 g, KCl 0.2 g, aquades 1000 ml] pH 7.4 yang kemudian

dipanaskan dalam microwave selama 1 menit. Agar yang sudah cair tersebut

dituangkan di atas kaca preparat dengan ketebalan sekitar 2 mm dan dibiarkan

pada suhu ruang hingga terbentuk gel. Gel agar kemudian dilubangi dengan cork

borer berdiameter 4 mm dan jarak 4 mm antar lubang. Lubang diisi dengan

reaktan berbeda yang terdiri dari antigen dan antibodi sebanyak 20 µl. Antigen

yang dimasukkan berupa sap tanaman tomat yang positif terserang ToCV dan

tanaman sehat sebagai kontrol negatif. Sap disiapkan dengan menggerus daun

tomat dalam bufer PBS dengan perbandingan 1/10 (b/v). Antibodi yang

dimasukkan berupa antiserum ToCV yang telah tersedia di Laboratorium Virologi

Tumbuhan IPB yang merupakan hasil imunisasi kelinci dengan protein produk

ekspresi gen CP ToCV pada E. coli (Kurniawati 2012). Antiserum diencerkan

mulai dari 1/1 (tanpa pengenceran), 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, sampai 1/64 dalam

aquabidest. Terbentuknya garis presipitasi sebagai hasil dari reaksi antigen-

antibodi pada gel agarose diamati setelah inkubasi semalam pada suhu ruangan.

Gambar 1 Ilustrasi pengujian AGPT. antigen; antibodi.

Dot Immunobinding Assay (DIBA)

DIBA dilakukan berdasarkan metode Mahmood et al. (1997). Membran

nitroselulosa direndam terlebih dahulu dalam bufer TBS [Tris HCl 0.02 M, NaCl

0.15 M, dalam 100 ml aquades steril] selama 1 menit dan dikeringanginkan

sebelum digunakan. Antigen berupa sap disiapkan dengan menggerus daun tomat

sumber virus dan yang sehat dalam bufer TBS dengan perbandingan 1/10 (b/v).

Setelah dijernihkan dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 2 menit, sebanyak 4 µl

sap diteteskan pada membran nitroselulosa dan dibiarkan hingga kering.

Selanjutnya membran direndam dalam larutan blocking (non fat milk 2% dalam

TBS yang mengandung Triton X-100 dengan konsentrasi akhir 2%) selama 2 jam

sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran dicuci sebanyak 5 kali

dengan menggunakan dH2O selama 5 menit untuk setiap pencucian sambil

digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Selanjutnya, masing-masing membran

6

7

direndam dalam antiserum ToCV yang diencerkan 1/1000, 1/10000, dan 1/100000

dalam TBSM (TBS yang mengandung non fat milk 2%) selama 24 jam pada suhu

4 ºC. Setelah dicuci sebanyak 5 kali dengan bufer TBST (TBS, 0.05% Tween-20),

membran direndam dalam konjugat Goat anti rabbit-IgG (Sigma, USA) yang

dilarutkan dengan seri pengenceran yang sama dalam TBSM, selama 60 menit

dalam suhu 4 ºC. Membran dicuci kembali dengan TBST sebanyak 5 kali. Setelah

pencucian, membran siap untuk diwarnai di dalam larutan nitro blue tetrazolium

(NBT)/ bromo chloro indolil phosphate (BCIP) sebanyak 100 µl untuk setiap 5 ml

bufer AP [Tris HCl 0.1 M, NaCl 0.1 M, MgCl2 5 mM, pH 9.5 dalam 200 ml

aquades steril]. Pengamatan dilakukan dengan melihat reaksi positif yang ditandai

dengan terjadinya perubahan warna putih menjadi ungu pada membran

nitroselulosa yang telah ditetesi antigen. Reaksi dihentikan dengan merendam

membran dalam dH2O kemudian dikeringkan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tanaman Tomat Sumber ToCV

Tanaman tomat yang digunakan sebagai sumber ToCV merupakan tanaman

yang menunjukkan gejala penyakit klorosis yang dikoleksi dari daerah Pacet dan

Pasir Sarongge Kabupaten Cianjur, Jawa Barat. Penyakit klorosis pada tanaman

tomat sampel dicirikan dengan gejala menguning pada bagian di antara tulang

daun (interveinal yellowing), beberapa bagian daun mengalami nekrotik, atau

perubahan warna menjadi merah keunguan (bronzing) (Gambar 2). Gejala seperti

ini bersesuaian dengan yang dideskripsikan oleh Wintermantel dan Wisler (2006).

Gambar 2 Gejala penyakit klorosis pada tanaman tomat, dicirikan dengan (a)

menguningnya bagian di antara tulang daun (interveinal yellowing);

(b) nekrotik pada beberapa bagian daun; dan (c) terjadinya perubahan

warna menjadi keunguan (bronzing).

Deteksi keberadaan ToCV pada tanaman tomat sampel berhasil dilakukan

melalui RT-PCR (Gambar 1). Dari beberapa tanaman tomat yang dikoleksi, tiga

diantaranya memberikan sinyal positif pada RT-PCR yang menggunakan primer

spesifik untuk ToCV yaitu CP-R (5’AATTAAAAGCTTTTAGCAACCAGT

TATCGATGCAAG-3’) dan ToCV CP-F (5’-AATTAAGGATCCGAGAACAG

TGCYGTTGC-3’).

a b c

9

Gambar 3 Hasil amplifikasi DNA terhadap gen coat protein ToCV menggunakan

reverse transcription-polymerase chain reaction. Marker 1 kb DNA

ladder (Thermo Scientific, USA) [Lajur M]; kontrol negatif (tanaman

sehat) [Lajur K(-)]; tanaman bergejala [Lajur 1, 2, dan 3].

Hal ini ditunjukkan dengan ditemukannya pita DNA hasil amplifikasi

dengan PCR berukuran ±700 bp (Fitriasari 2010) yang merupakan DNA ToCV

yang sesuai dengan target basa primer CP-F dan CP-R yang digunakan (Gambar

3). Tanaman yang positif terinfeksi ToCV digunakan sebagai sumber virus pada

uji serologi selanjutnya.

Reaksi Antiserum terhadap ToCV

Agarose Gel Precipitation Test (AGPT)

AGPT dilakukan untuk melihat reaksi pengendapan antigen oleh antibodi

spesifik. Pengendapan antigen oleh antibodi ini diperlihatkan oleh adanya garis

presipitasi di media gel agarose (Natih et al. 2010). Hasil pengujian dengan

metode AGPT menunjukkan bahwa antiserum dapat bereaksi dengan jelas

terhadap antigen ToCV. Hal ini ditandai dengan terbentuknya garis presipitasi

berwarna putih yang tampak di antara lubang gel agarose yang diisi dengan

antigen (sap tanaman bergejala) dan antibodi (antiserum) setelah 2-3 hari

pengamatan (Gambar 4). Reaksi yang tampak pada pada kontrol negatif

menunjukkan antiserum tidak bereaksi terhadap antigen tanaman, sehingga tidak

terbentuk garis presipitasi.

700 bp ±700 bp

M K(-) 1 2 3

10

Gambar 4 Reaksi antigen (sap tanaman terinfeksi ToCV [AgTo]) atau sap

tanaman tomat sehat [AgKo] dengan antibodi (antiserum ToCV

[AsTo]) pada metode agarose gel precipitation test.

Garis presipitasi yang tidak terbentuk pada kontrol negatif menandakan

bahwa antibodi yang terkandung di dalam antiserum tersebut hanya mengenali

protein CP ToCV (dalam bentuk partikel virus) dan tidak mengenali protein lain

seperti protein tanaman tomat (Adnyani 2012). Reaksi positif yang terdapat pada

(Gambar 4) menunjukkan bahwa antiserum hasil imunisasi kelinci dengan protein

produk ekspresi gen CP ToCV pada E. coli (Kurniawati 2012) dengan spesifik

dapat bereaksi terhadap antigen ToCV.

Dot Immunobinding Assay (DIBA)

Hasil pengujian dengan metode DIBA yang menunjukkan reaksi antara

antibodi (antiserum ToCV) dengan antigen (sap tanaman tomat sakit dan sehat)

tampak pada Gambar 5. Hasil pengujian menunjukkan tidak terjadi reaksi antara

antiserum ToCV dengan komponen tanaman tomat. Hal ini ditunjukkan dengan

tidak terjadinya perubahan warna ungu pada membran yang telah ditetesi sap

tanaman tomat sehat (Gambar 5). Berbeda dengan bagian membran yang ditetesi

sap tanaman tomat yang positif terserang ToCV, terjadi reaksi antara antiserum

ToCV dengan antigen ToCV (partikel virus) yang ditunjukkan dengan adanya

perubahan warna ungu pada membran yang ditetesi sap tanaman sumber ToCV

(Gambar 5).

Gambar 5 Reaksi antigen (sap tanaman tomat sehat [Lajur H] dan tomat

terinfeksi ToCV [Lajur T]) dengan antibodi (antiserum ToCV) pada

metode dot immunobinding assay.

10

AgKo AgTo

AsTo AsTo

H T

11

Perubahan warna ungu disebabkan karena antiserum ToCV yang merupakan

hasil imunisasi kelinci dengan protein produk ekspresi gen CP ToCV pada E. coli

(Kurniawati 2012) yang digunakan sebagai antibodi primer berikatan dengan pita

CP ToCV sebagai antigennya. Anti Rabbit IgG AP-Conjugated (konjugat Goat

anti rabbit-IgG) yang digunakan sebagai antibodi sekunder akan mengikat

antibodi primer tersebut, sehingga pada saat dilakukan pewarnaan dengan

menggunakan substrat NBT/ BCIP yang akan berikatan dengan enzim AP (alkalin

phosphatase) pada antibodi sekunder sehingga menghasilkan dot berwarna ungu

pada membran nitroselulosa (Widodo dan Aulanni’am 2005). Sama halnya seperti

hasil yang didapatkan dari metode AGPT, bahwa antibodi yang terkandung di

dalam antiserum tersebut hanya mengenali protein CP ToCV (dalam bentuk

partikel virus) dan tidak mengenali protein lain seperti protein tanaman tomat

(Adnyani 2012), sehingga hasil yang ditunjukkan pada kontrol negatif (tanaman

sehat) tidak menunjukkan adanya perubahan warna ungu. Selain itu, antiserum

yang digunakan (diuji) bereaksi spesifik hanya dengan partikel ToCV.

Titer Antiserum ToCV

Titer antiserum adalah tingkat pengenceran tertinggi dari suatu antiserum

yang masih memberikan sinyal positif terhadap adanya kompleks antigen-antibodi

pada uji serologi tertentu (Noordam 1973). Antigen yang digunakan dalam

penelitian ini merupakan partikel ToCV yang terdapat dalam sap tanaman tomat

yang positif terinfeksi ToCV dan tidak dilakukan pengenceran. Sedangkan

antiserum yang digunakan merupakan hasil imunisasi kelinci dengan protein

produk ekspresi gen CP ToCV pada E. coli (Kurniawati 2012) yang dilakukan seri

pengenceran pada tingkat tertentu yang berbeda untuk setiap uji serologi. Hasil

titer antiserum ToCV yang digunakan disajikan pada Tabel 3.

Tabel 3 Titer antiserum poliklonal ToCV pada metode agarose gel precipitation

test (AGPT) dan dot immunobinding assay (DIBA) pada seri

pengenceran yang berbeda*

Metode Pengenceran antiserum Sinyal

1/1 +

1/2 +

AGPT 1/4 -

1/8 -

1/16 -

1/32 -

1/1000 +

DIBA 1/10000 +

1/100000 -

*Pengujian sejenis telah dilakukan sebanyak 5-7 kali dan memberikan hasil yang konsisten

Seri pengenceran antiserum yang digunakan untuk masing-masing uji

serologi dilakukan berbeda karena kepekaan yang dimiliki kedua metode ini

12

berbeda. Pada metode AGPT, sinyal positif merupakan akumulasi presipitasi

kompleks Ag-Ab yang dilihat secara langsung. Oleh karena itu, reaksi antigen dan

antibodi pada AGPT memberikan sinyal positif pada tingkat pengenceran

antiserum yang sangat rendah yaitu 1/2, sedangkan pada tingkat pengenceran

yang lebih tinggi sudah tidak terlihat lagi garis presipitasi (Gambar 5, Tabel 3).

Hal ini terjadi karena pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi, kompleks Ag-

Ab yang terakumulasi tidak mencukupi untuk dilihat secara langsung dengan

kasat mata. Berdasarkan hasil penelitian ini dapat dinyatakan bahwa titer

antiserum ToCV ini mencapai 1/2 dengan AGPT.

Gambar 6 Reaksi antiserum ToCV [As] terhadap antigen (partikel virus dalam

sap tanaman tomat [Ag]) melalui agarose gel pricipitation test pada

pengenceran 1/1 [Lajur a]; 1/2 [Lajur b]; dan (c) 1/4 [Lajur c].

Pada DIBA sinyal positif masih terlihat pada tingkat pengenceran

antiserum yang cukup tinggi yaitu 1/10000. Namun sinyal positif sudah tidak

terlihat pada tingkat pengenceran antiserum 1/100000 (Tabel 3). Hasil DIBA pada

penelitian ini menunjukkan adanya korelasi antara tingkat pengenceran antiserum

dan perubahan warna menjadi ungu pada kertas membran, yaitu semakin rendah

konsentrasi antiserum yang digunakan maka akan semakin pudar warna ungu

yang terlihat pada kertas membran (Gambar 7). Berdasarkan hasil penelitian ini,

antiserum poliklonal ToCV melalui metode DIBA layak digunakan untuk

mendeteksi keberadaan ToCV pada jaringan tanaman tomat. Sinyal positif masih

sangat jelas terlihat walaupun antiserum yang digunakan pada tingkat

pengenceran sangat tinggi (1/10000), yang berarti penggunaan antiserum dalam

setiap pengujian sangat sedikit.

12

a

Ag Ag

As As As

Ag

b c

13

Gambar 7 Reaksi antiserum ToCV terhadap antigen (partikel virus dalam sap

tanaman tomat) melalui dot immunobinding assay pada pengenceran

1/1000 [Membran a]; 1/10000 [Membran b]; dan 1/100000 [Membran

c].

Menggunakan kedua metode serologi (AGPT dan DIBA) dapat terlihat

bahwa antiserum poliklonal yang digunakan mampu mendeteksi keberadaan

ToCV dalam jaringan tanaman tomat. Tingginya konsentrasi antiserum yang

digunakan dalam metode AGPT (titer 1/2) membuat metode ini menjadi tidak

efisien. Untuk menimbulkan sinyal positif pada metode AGPT diperlukan

konsentrasi antigen dan antibodi yang sangat tinggi karena sensitivitasnya yang

sangat rendah (Sere et al. 2005). Berbeda dengan penggunaan antiserum dalam

metode DIBA yang hanya diperlukan dalam konsentrasi yang sangat rendah (titer

1/10000). DIBA memiliki tingkat sensitivitas lebih tinggi jika dibandingkan

dengan AGPT. Hal ini dikarenakan membran nitroselulosa yang digunakan sangat

baik untuk blotting protein. Antigen yang mengandung protein ToCV yang

ditetesi di atas membran dapat terikat dengan sangat baik di membran tersebut.

Hal ini ditunjukkan dengan tingginya titer antiserum yang didapatkan dari metode

DIBA jika dibandingkan dengan AGPT. Walaupun DIBA memiliki sensitivitas

yang lebih tinggi dibandingkan AGPT, tidak berarti metode AGPT harus

ditinggalkan karena metode ini merupakan satu-satunya metode serologi yang

dapat membedakan isolat virus yang berbeda tipe serologinya.

a b c

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Berdasarkan pengujian melalui AGPT dan DIBA terlihat bahwa antiserum

ToCV poliklonal yang diuji pada penelitian ini bereaksi secara spesifik dengan

partikel ToCV dan tidak terjadi reaksi silang dengan komponen protein jaringan

tanaman tomat. Titer antiserum yang diuji mencapai 1/2 pada AGPT dan 1/10000

pada DIBA, sehingga kedua metode ini sangat layak digunakan sebagai sarana

deteksi ToCV pada tanaman tomat.

Saran

Perlu adanya penelitian lanjutan mengenai konjugat antiserum ToCV

sehingga dapat dilakukan deteksi ToCV dengan metode uji serologi lainnya

terhadap beberapa sampel tanaman tomat dari berbagai daerah dengan

menggunakan antiserum yang sama sehingga dapat dilihat perbandingan hasil

yang didapatkan.

DAFTAR PUSTAKA

Adnyani NNP. 2012. Uji serologi Tomato infectious chlorosis virus (TICV) pada

tanaman tomat [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Agrios GN. 2005. Plant Pathology. 5th Ed. New York (US): Academic Press.

Alvarez-Ruiz P, Jimenez CG, Leyva-Lopez NE, Mendez-Lozano J. 2007. First

report of Tomato chlorosis virus infecting tomato crops in Sinaloa,

Mexico. Plant Pathol. 56(6):1043. doi: 10.1111/j.1365-3059.2007.01626.

[BPS] Badan Pusat Statistik. 2012. Produksi buah-buahan di Indonesia. [Internet].

Badan Pusat Statistik; [diunduh pada 2013 Apr 17]. Tersedia pada:

http://www.bps.go.id.

Cevik B, Erki G. 2008. First report of Tomato chlorosis virus in Turkey. Plant

Pathol. 57(4):767. doi: 10.1111/j.1365-3059.2007.01795.

Fitriasari ED. 2010. Keefektifan kutukebul dalam menularkan virus penyebab

penyakit kuning pada tanaman tomat [tesis]. Bogor (ID): Intitut Pertanian

Bogor.

Hartono S, Wijonarko A. 2007. Karakterisasi biologi molekuler Tomato infectious

chlorosis virus penyebab penyakit kuning pada tanaman tomat di Indonesia.

Akta Agrosia. 2(11/12):139-146.

Kurniawati F. 2012. Karakterisasi dan ekspresi gen coat protein Tomato infectious

chlorosis virus pada Escherichia coli [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian

Bogor.

Mahmood T, Hein GL, French RC. 1997. Development of serological procedures

for rapid and reliable detection of Wheat streak mosaic virus in a single

wheat curl mite. Plant Dis. 81(3):250-253.

Massea D, Lefeuvre P, Delatte H, Karime ALA, Hostachy B, Reynaud B, Lett

JM. 2008. Tomato chlorosis virus: first report in Mayotte Island. Plant

Pathol. 57(16):388. doi: 10.1111/j.1365-3059.2007.01760.

Naidu RA, Hughes Jd’A. 2003. Methods for the detection of plant viral diseasesin

plan virology in sub-Saharan Africa, Proceedings of plant virology. IITA,

Ibadan, Nigeria. Eds. Hughes JDA, Odu B, pp. 233-260.

Natih KKN, Soejoedono RD, Wibawan IWT, Pasaribu FH. 2010. Preparasi

imunoglobulin G kelinci sebagai antigen penginduksi antibodi spesifik

terhadap virus Avian Influenza H5N1 strain Legok. J Veter. 11(2):99-106.

Navas-Castillo J, Camero R, Bueno M, Moriones E. 2000. Severe yellowing

outbreaks in tomato in Spain associated with infections of Tomato chlorosis

virus. Plant Dis. 84(8):835-837.

Noordam D. 1973. Identification of Plant Viruses Methods and Experiments.

Wageningen: Center for Agricultural Publishing and Documentation.

Papayiannis LC, Ioannou N , Dovas CI , Maliogka VI,Katis NI. 2006. First report

of Tomato chlorosis virus on tomato crops in Cyprus. Plant Pathol.

55(4):567. doi: 10.1111/j.1365-3059.2006.01423.

Ritter MA. 2000. Polyclonal and Monoclonal Antibodies From: Methods in

Molecular Medicine. Totowa (NJ): Humana Press Inc.

16

Sere Y, Onasanya A, Afolabi AS, Abo EM. 2005. Evaluation and potential of

double immunodifusion gel assay for serological characterization of Rice

yellow mottle virus isolates in West Africa. Afric J of Biotec. 4(2):197-205.

Suastika G, Hartono S, Nishigawa H, Natsuaki T. 2010. Yellowing disease

outbreaks in tomato in Indonesia associated with infection of Tomato

chlorosis virus and Tomato infectious chlorosis virus. [abstract]ISSAAS

International Congress 2010: Agricultural Adaptation in Response to

Climate Change; 2010 Nov 14-18; Denpasar (ID).

Widodo E, Aulianni’am. 2005. Spesifitas antibodi BovineZona Pellusida 3 (Anti-

bZP3) terhadap ZP3 kelinci berbasis bZP3 sebagai antigen kontraseptif. J

Chem. u5(2):182 – 187.

Wintermantel WM, Wisler GC. 2006. Vector specificity, host range, and genetic

diversity of Tomato chlorosis virus. Plant Dis. 90(6):814-819.

Wisler GC, Li RH, Liu HY, Lowry DS, Duffus JE. 1998a. Tomato chlorosis

virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of

tomato. Phytopathology. 88(5):402-409.

Wisler GC, Duffus JE, Liu HY, Li RH. 1998b. Ecology and epidemiology of

whitefly-transmitted closteroviruses. Plant Dis. 82(3):270-280.

16

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Surakarta pada tanggal 26 Desember 1990 sebagai

anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Bapak Samsul Rizal dan Ibu Yulizar.

Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMA Negeri 112

Jakarta Barat, DKI Jakarta . Penulis melanjutkan pendidikan di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui

jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2009. Penulis diterima

dengan mayor Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, IPB. Untuk

mendukung mata kuliah mayor yang penulis ambil, penulis juga mengambil

berbagai mata kuliah dari beberapa mayor departemen lain sebagai supporting

course, seperti Ekonomi Sumberdaya (Departemen Ekonomi dan Sumberdaya

Lingkungan, Fakultas Ekonomi dan Manajemen), Silvika dan Silvikultur

(Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan), Manajemen Keuangan Konsumen

(Departemen Ilmu Keluarga dan Konsumen, Fakultas Ekologi Manusia), Metode

Penangkapan Ikan (Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan

Ilmu Kelautan).

Selama masa perkuliahan, penulis aktif bergabung dalam beberapa

organisasi kemahasiswaan seperti Badan Eksekutif Pertanian (BEM-A) sebagai

anggota Departemen Pertanian periode 2010-2011. Selain itu penulis juga aktif

mengikuti magang di Laboratorium Vertebrata Hama Departemen Proteksi

Tanaman dan di Balai Proteksi Tanaman Jogjakarta. Menjadi asisten praktikum

Pengantar Virologi Tumbuhan dan asisten praktikum Ilmu Penyakit Tumbuhan

Dasar untuk program S1, serta asisten praktikum Hama dan Penyakit benih

program D3. Tahun 2012 penulis didanai oleh Direktorat Jendral Pendidikan

Tinggi dalam usulan bidang Penelitian (PKM-P). Berbagai kegiatan kepanitiaan

dan juga kegiatan kampus pernah penulis ikuti baik di dalam Departemen Proteksi

Tanaman, Fakultas Pertanian, serta antar fakultas di IPB.