sipulien polyfenolien antimikrobisuus · itÄ-suomen yliopisto, luonnontieteiden ja metsätieteiden...

SIPULIEN POLYFENOLIEN ANTIMIKROBISUUS

Anna Kårlund

Pro gradu -tutkielma

Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka

Biotiede

Luonnontieteiden ja metsätieteiden

tiedekunta

Itä-Suomen yliopisto

Marraskuu 2012

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta

Biotiede

Ravitsemus- ja elintarvikebiotekniikka

KÅRLUND ANNA O.: Sipulien polyfenolien antimikrobisuus

Pro gradu -tutkielma, 63 s.

Tutkielman ohjaajat: Dos. Reijo Karjalainen ja prof. Atte von Wright

Marraskuu 2012

Avainsanat: polyfenoli, sipuli, antimikrobisuus, elintarvikepatogeeni

Fenolisilla yhdisteillä on merkittävä rooli sekä kasvien evoluutiossa että selviytymisessä

ympäristön asettamista akuuteista ja kroonisista haasteista. Fenoliset yhdisteet toimivat

kasvissa esim. pigmentteinä, herbivoreja karkottavina yhdisteinä, antioksidantteina sekä mm.

signalointimolekyyleinä ja antimikrobisina komponentteina kasvi-mikrobi-

vuorovaikutussuhteissa. Fenolisilla yhdisteillä on biologisia aktiivisuuksia myös ihmisessä.

Allium-suvun kasvit eli sipulit ovat yksi vanhimmista ja taloudellisesti merkittävimmistä

viljelykasveista. Sipuleja on käytetty vuosituhansien ajan ravintona ja lääkkeinä, ja jotkut

niistä ovat tunnettuja koristekasveja. Sipuleissa esiintyvillä polyfenoleilla on todettu paitsi

antikarsinogeenisia ja sydän- ja verisuonitaudeilta suojaavia myös antimikrobisia

ominaisuuksia mm. elintarvikepatogeeneja vastaan. Sipulin runsaimpia fenolisia yhdisteitä

ovat flavonoidi kversetiini ja sen glykosyloidut johdannaiset kversetiini-4’-glukosidi ja

kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi.

Yksittäisillä polyfenolisilla yhdisteillä tai niiden johdannaisilla, esim. glykosideilla, on

havaittu eri tutkimuksissa hyvin vaihtelevia antimikrobisia vaikutuksia, jotka riippuvat sekä

yhdisteen että altistetun mikrobin ominaisuuksista. Gram-positiiviset bakteerit ovat monissa

tutkimuksissa todettu gram-negatiivisia bakteereita herkemmiksi kasvien fenolisille

yhdisteille ja kasveista valmistetuille polyfenolipitoisille raakauutteille. Hiivat ovat yleensä

osoittaneet hyvää resistenssiä. Myös kasvatusolosuhteilla, joissa tutkittavat mikrobit

altistetaan raakauutteille ja puhdasaineille on huomattava merkitys

antimikrobisuusaktiivisuuteen.

Pro gradu -tutkimuksessa kelta-, puna-, salotti- ja banaanisalottisipulista uutettujen

polyfenolien todettiin ehkäisevän gram-positiivisen Listeria monocytogenes

-bakteerin, gram-negatiivisen Salmonella infantis -bakteerin sekä Candida albicans -hiivan

kasvua. Kversetiini-4’-glukosidilla ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidilla ei havaittu olevan

bakteerien kasvua inhiboivaa vaikutusta. Hiivalla kversetiiniglukosidit vaikuttivat lähinnä

kasvun alkuvaiheeseen. Tutkimuksen tulokset osoittavat, että sipuliuutteen polyfenolisten

yhdisteiden synergistiset mikrobien kasvua inhiboivat vaikutukset ovat parempia kuin

puhtaiden flavonoidiglykosidien. Polyfenolien uuttaminen sipulin teollisen käsittelyn

seurauksena muodostuvasta kasvijätemateriaalista ja uutteiden hyödyntäminen

elintarviketeollisuuden säilöntäainesovelluksissa voisi olla mahdollista.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Natural and Forest Sciences

Biosciences

Nutrition and Food Biotechnology

KÅRLUND ANNA O.: The antimicrobial activity of onion polyphenols

Master’s thesis, 63 pages

Supervisors: Dos. Reijo Karjalainen and Prof. Atte von Wright

November 2012

Keywords: polyphenol, onion, antimicrobial activity, foodborne pathogen

Phenolic compounds have many important roles in the terrestrial plant evolution and in

plants’ survival responses to acute and chronic environmental stress factors. In plants,

phenolic compounds act for example as pigments, antiherbivoral agents, antioxidants, and as

signaling molecules and antimicrobial components in plant-microbe-interactions. Phenolic

compounds also have biological activities in humans.

Allium sp., better known as onions, are one of the oldest and economically most important

crops. Onions have been used for centuries as food and medicinal plants, and some of them

are known as ornamental plants. Onion polyphenols are known not only to protect against

cancer and cardiovascular diseases but also to have antimicrobial properties against foodborne

pathogens. Flavonoid quercetin and its derivatives quercetin-4’-glucoside and quercetin-3,4’-

di-O-glucoside are the most abundant onion polyphenols.

Single polyphenolic compounds and their derivatives, for example glycosidic forms, have

been found to possess very variable antimicrobial effects which depend both of the compound

and the microorganism exposed. In many studies, Gram-positive bacteria have been found to

be more sensitive than Gram-negative bacteria to plant phenolic compounds and plant-derived

polyphenol containing raw extracts. Yeasts have usually shown good resistance. Also the

culture conditions, in which the microbes are exposed to raw extracts and pure compounds,

have a great impact on the antimicrobial activity.

In this master’s study, polyphenols extracted from yellow and red onions and round and long

shallots were found to reduce the growth of Gram-positive bacterium Listeria monocytogenes,

Gram-negative bacterium Salmonella infantis and yeast Candida albicans. Quercetin-4’-

glucoside and quercetin-3,4’-di-O-glucoside did not show inhibitory effect on the growth of

the bacteria. With the yeast, the quercetin glucosides affected mainly the start of the growth.

The results indicate that the synergistic antimicrobial effects of the polyphenols of the onion

extracts are stronger than the inhibitory effects of the pure onion flavonoid glycosides.

Extraction of polyphenols from waste material arising from industrial handling of onions, and

utilization of the extracts in food industry in preservative applications could be possible.

SISÄLLYSLUETTELO

1. KIRJALLISUUSKATSAUS .................................................................................................. 6

1.1 Kasvien sekundaarimetabolia ........................................................................................... 6

1.1.1 Kasvien sekundaarinen aineenvaihdunta ja ekologia ................................................. 6

1.1.2 Terpenoidit ................................................................................................................. 6

1.1.3 Alkaloidit .................................................................................................................... 7

1.1.4 Fenyylipropanoidit ..................................................................................................... 7

1.2 Kasvien fenoliset yhdisteet ............................................................................................... 8

1.2.1 Fenolisten yhdisteiden tehtävät ja esiintyminen kasveissa ........................................ 8

1.2.2 Flavonoidit ............................................................................................................... 10

1.2.3 Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi ........................................................... 11

1.2.4 Fenolisten yhdisteiden biologinen aktiivisuus ihmisessä ......................................... 14

1.3 Sipulit ja niiden terveysvaikutukset ................................................................................ 15

1.4 Sipulien bioaktiiviset yhdisteet ....................................................................................... 17

1.4.1 Polyfenolit ................................................................................................................ 17

1.4.2 Rikkiyhdisteet........................................................................................................... 18

1.4.3 Saponiinit ................................................................................................................. 19

1.4.4 Frukto-oligosakkaridit .............................................................................................. 19

1.5 Elintarvikepatogeenit ja niiden hallinta .......................................................................... 19

1.5.1 Listeria monocytogenes ............................................................................................ 19

1.5.2 Salmonellat ............................................................................................................... 21

1.5.3 Candida albicans...................................................................................................... 22

1.5.4 Perinteiset ja uudet menetelmät elintarvikepilaajien kontrolloimiseksi ................... 23

1.6 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuus .......................................................................... 24

1.7 Fenolisten yhdisteiden molekyylirakenteen vaikutus antimikrobisuuteen ..................... 25

1.8 Sipulien flavonoidien bioaktiivisuus elintarvikepatogeeneja vastaan ............................ 29

2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ........................................................................................ 31

3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT ................................................................................. 32

3.1 Sipulimateriaali ............................................................................................................... 32

3.2 Uutteiden valmistus antimikrobisuuskokeita varten ....................................................... 32

3.3 Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen ..................................................................... 32

3.5 Tutkittavat mikrobit ja kasvatusolosuhteet ..................................................................... 33

3.6.2 Yhdistepitoisuudet .................................................................................................... 34

3.6.3 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteella........................................................ 35

4. TULOKSET ......................................................................................................................... 37

4.1 Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet ..................................................................... 37

4.2 Sipuliuutteiden antibakteerisuus ..................................................................................... 37

4.3 Puhdasaineiden antibakteerisuus .................................................................................... 39

4.4 Sipuliuutteiden antifungaalisuus ..................................................................................... 39

4.5 Puhdasaineiden antifungaalisuus .................................................................................... 40

5. POHDINTA .......................................................................................................................... 43

5.1 Erilaiset mikrobit ovat osoittaneet vaihtelevaa resistenttiyttä sipuliuutteille ja fenolisille

yhdisteille .............................................................................................................................. 43

5.2 Sipulien polyfenoliprofiilit vaihtelevat ja vaikuttavat sipuliuutteiden antimikrobiseen

aktiivisuuteen ........................................................................................................................ 45

5.3 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuuden mekanismit .................................................. 47

5.4 Pro gradu -tutkimuksen menetelmät ja niiden haasteet .................................................. 48

5.5 Sipuliuutteiden polyfenolit ja muut antimikrobiset komponentit toimivat synergistisesti

.............................................................................................................................................. 50

5.6 Tutkimuksen sovellusmahdollisuudet ............................................................................. 51

LÄHTEET ................................................................................................................................ 53

6

1. KIRJALLISUUSKATSAUS

1.1 Kasvien sekundaarimetabolia

1.1.1 Kasvien sekundaarinen aineenvaihdunta ja ekologia

Kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet, sekundaarimetaboliitit, ovat monimuotoinen

orgaaninen yhdisteryhmä, joka osallistuu primaaristen aineenvaihduntatuotteiden, kuten

sokereiden, proteiinien ja rasvahappojen, ohella lukuisiin kasvin selviytymisen kannalta

merkittäviin toimintoihin koko kasvin elinkierron ajan (Verpoorte & Memelink 2002; Zangerl

& Berenbaum 2004; Weng ym. 2012). Kasveista on eristetty tuhansia

sekundaarimetaboliitteja, jotka vaikuttavat kasvin ja sen ympäristön välisiin

vuorovaikutussuhteisiin ja kasvin lisääntymiseen sekä vastaavat omalta osaltaan kasvin

puolustautumisesta ympäristön bioottisia ja abioottisia stressin aiheuttajia vastaan (Rhodes

1994; Verpoorte & Memelink 2002). Mittavan sekundaarimetaboliansa ansiosta kasvit

kykenevät sopeutumaan muuttuvaan ympäristöönsä siitä huolimatta, etteivät voi liikkua

paikasta toiseen suotuisampiin olosuhteisiin (Gantet & Memelink 2002; Weng ym. 2012).

Sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden synteesi kasveissa on hyvin tarkasti säädeltyä

ajallisesti, paikallisesti ja geenitasolla (Rhodes 1994). Sekundaarimetaboliitteja, jotka

osallistuvat kasvin suojautumiseen ulkoisia uhkia vastaan muodostuu stressisignaalin

seurauksena, kun taas esimerkiksi pölyttäjiä houkuttelevien pigmenttimolekyylien

ilmentyminen on kasvikudoskohtaista (Gantet & Memelink 2002). Toisin kuin primaaristen

aineenvaihduntatuotteiden synteesi, jota tapahtuu kaikissa kasveissa, monien

sekundaarimetaboliittien esiintyminen rajoittuu vain muutamaan kasvilajiin, ja yhdisteiden

synteesi tapahtuu biokemialtaan erittäin spesifisiä reittejä pitkin (Rhodes 1994; Weng ym.

2012). Kasvien sekundaariset aineenvaihduntatuotteet voidaan jakaa biosynteesireittien

mukaan kolmeen ryhmään, terpenoideihin, alkaloideihin ja fenyylipropanoideihin (Bassman

2004).

1.1.2 Terpenoidit

Viisihiilisistä isopreeniyksiköistä johdettavat terpenoidit ovat suurin seukndaarimetaboliittien

ryhmistä (Bassman 2004). Terpenoidit luokitellaan isopreeniyksiköiden lukumäärän mukaan

mono-, seskvi-, di-, tri- ja tetraterpeeneihin (Bassman 2004). Kasvun säätelyyn osallistuvat

abskissihappo ja gibberelliinit ovat esimerkkejä terpenoideista, samoin kuin apupigmentteinä

7

toimivat karotenoidit (Bassman 2004). Suurin osa terpenoideista kuitenkin kuuluu kasvin

puolustautumisjärjestelmään (Bassman 2004). Hyönteistuholaisten aiheuttaman

vahingoittumisen seurauksena esimerkiksi tomaatin lehtien mono- ja seskviterpeenien

tuotanto lisääntyy, minkä tarkoituksena on mahdollisesti houkutella herbivorien luonnollisia

vihollisia (Raghava ym. 2010). Sukkulamatojen aiheuttamat juurituhot lisäävät terpenoidien

tuotantoa tupakassa, ja esimerkiksi altistuminen sienipatogeenien soluseinien komponentille,

ergosterolille, indusoi tupakkasolujen seskviterpeenien synteesiä (Kaplan ym. 2008;

Tugizimana um. 2012). UV-B-säteily aiheuttaa resiini-terpeenin tuotannon lisääntymistä

kasvun kustannuksella esimerkiksi Grindelia chiloensis -asterikasvissa (Zavala & Ravetta

2002).

1.1.3 Alkaloidit

Tyypillinen alkaloidiyhdiste muodostuu rengasrakenteesta ja typpiatomista (Koleva ym.

2012). Alkaloidit ovat kuitenkin kemiallisesti monimutkaisia ja -muotoisia rakenteita, joiden

biosynteesireittien selvittäminen on haasteellista (Bassman 2004). Monet alkaloidit johdetaan

aminohapoista, kuten lysiinistä, tryptofaanista tai tyrosiinista, mutta alkaloideihin kuuluu

myös esimerkiksi nikotiinihaposta johdettavia yhdisteitä (Koleva ym. 2012). Kokapensaan

lehdissä esiintyvä kokaiini ja tupakkakasvien nikotiini ovat alkaloidijohdannaisia (Koleva ym.

2012). Alkaloidit osallistuvat kasvien puolustautumiseen herbivoreja vastaan sekä jatkuvan

että indusoituvan synteesin kautta (Kaplan ym. 2008). Esimerkiksi perunan, tomaatin ja

munakoison glykoalkaloidipitoisuus vaihtelee lajikkeen ja sadonkorjuun jälkeisten

olosuhteiden mukaan (Barceloux 2009).

1.1.4 Fenyylipropanoidit

Fenyylipropanoidit ovat monimuotoinen aromaattisten yhdisteiden ryhmä, jonka jäsenet

johdetaan fenyylialaniini-aminohaposta fenyylialaniiniammoniumlyaasi-entsyymin (PAL)

katalysoimana muodostuvasta kanelihaposta (Dixon & Paiva 1995; Bonawitz ym. 2012).

Fenyylipropanoideista johdetaan edelleen suurin osa kasvien fenolisista yhdisteistä, jotka

voidaan luokitella karkeasti fenolisiin happoihin, flavonoideihin, stilbeeneihin ja lignaaneihin

(Bassman 2004; Manach ym. 2004). Fenyylipropanoidien rakenteellinen monimuotoisuus on

seurausta muun muassa prekursoriyhdisteiden hydroksylaatio-, glykosylaatio-, asylaatio-,

prenylaatio-, sulfaatio- ja metylaatioreaktioista (Dixon & Paiva 1995).

8

Fenyylipropanoidien pääasiallisen synteesireitin entsyymit ja useat transkriptiofaktorit

tunnetaan nykyään hyvin (Bonawitz ym. 2012). Fenyylipropanoidien synteesin säätely liittyy

sekä kasvien kemialliseen että fyysiseen suojautumiseen ulkoisia uhkia vastaan (Shadle ym.

2003; Dauwe ym. 2007). Tietyt fenyylipropanoidit ovat kasvien rakenteiden osia tai

osallistuvat kasvien kasvuun ja lisääntymiseen ja ovat välttämättömiä esimerkiksi siitepölyn

muodostumiselle (Dixon & Paiva 1995; Shadle ym. 2003; Bassman 2004; Dauwe ym. 2007).

Monet fenyylipropanoidit, kuten jotkin flavanonit, isoflavonoidit ja stilbeenit, luokitellaan

fytoaleksiineihin eli pienimolekyylisiin yhdisteisiin, joiden synteesi indusoituu patogeenien

hyökkäyksen tai esimerkiksi raskasmetalli- tai UV-altistuksen seurauksena (Halverson &

Stacey 1986; Kodan ym. 2002; Otomo ym. 2004; Zabala ym. 2006; Shimizu ym. 2012).

Seuraavassa kappaleessa on esitelty tarkemmin kasvien fenolisia yhdisteitä, niiden synteesiä

ja esiintymistä kasveissa sekä biologisia aktiivisuuksia kasveissa ja ihmisissä.

1.2 Kasvien fenoliset yhdisteet

1.2.1 Fenolisten yhdisteiden tehtävät ja esiintyminen kasveissa

Polyfenolisilla yhdisteillä on merkittävä rooli sekä kasvien evoluutiossa että selviytymisessä

ympäristön asettamista akuuteista ja kroonisista haasteista (Quideau ym. 2011). Osittain

polyfenolisten yhdisteiden ansiosta kasvit ovat kyenneet sopeutumaan elämään ja

lisääntymiseen kuivalla maalla sekä muodostamaan vuorovaikutussuhteita muiden maan

päällä elävien organismien kanssa (Quideau ym. 2011). Yleensä polyfenolit kertyvät kukkien,

lehtien, varsien, juurien, siementen ja hedelmien epidermisoluihin (Sakihama ym. 2002).

Kasvisolujen sisällä vesiliukoiset fenoliyhdisteet sijaitsevat usein vakuoleissa ja apoplasteissa,

joskus kloroplasteissa ja etioplasteissa (Sakihama ym. 2002). Rasvaliuokoiset molekyylit

sijoittuvat muun muassa kasvien vahamaisiin kerroksiin ja öljyrauhasiin (Sakihama ym.

2002). Esimerkiksi flavonoidien ja hydroksikanelihapon synteesi on useimmissa kasveissa

jatkuvaa, mutta myös stressi voi laukaista polyfenolien muodostumisen ja kertymisen

(Sakihama ym. 2002). Fenoliyhdisteiden synteesi kuluttaa hiiltä, mikä voi hidastaa kasvin

kasvua (Tattini & Traversi 2008; Scogings ym. 2011). Fenolisia yhdisteitä myös mahdollisesti

kulkeutuu tarpeen mukaan kasvinosasta toiseen, ja kasvi saattaa konsentroida esimerkiksi

lignifikaatioon osallistuvia fenoliyhdisteitä niihin solukoihin, joissa tarvitaan mekaanista

tukea bioottisia ja abioottisia uhkia vastaan (Negro ym. 2012; Singh ym. 2012). Muun muassa

apilassa, artisokassa ja omenassa on todettu tilastollisesti merkittäviä eroja polyfenolien

pitoisuuksissa sekä eri lajikkeiden, kasvinosien että kasvin kehitysvaiheiden välillä (Saviranta

9

ym. 2008; Vieira 2009; Negro ym. 2012). Muun muassa omenan ja sipulin kuoriosissa on

huomattavasti enemmän ja erilaisia polyfenoleja kuin kuorenalaisissa kasvinosissa (Vieira

2009; Pastene ym. 2009; Benítez ym. 2010). Monet polyfenolit ovat tyypillisiä tietyille

kasveille (Del Rio ym. 2012). Esimerkiksi flavanoneja esiintyy lähes yksinomaan

sitrushedelmissä, isoflavoneja palkokasveissa ja flavoneja sellerissä ja joissakin yrteissä

(Manach ym. 2004; Del Rio ym. 2012).

Useat polyfenolit ovat pigmenttejä, värillisiä yhdisteitä, joiden avulla kasvit houkuttelevat

pölyttäjiä ja siemeniä levittäviä eläimiä (Havsteen 2002). Polyfenoliset yhdisteet osallistuvat

kasvien puolustautumiseen taudinaiheuttajia vastaan muodostamalla esimerkiksi reaktiivisia

hapettumistuotteita, kinoneita, jotka voivat sitoutua patogeeniperäisiin molekyyleihin ja

muokata niitä (Quideau ym. 2011). Polyfenoleilla on edellä mainitun kinoniaktiivisuuden

lisäksi lukuisia muita antibioottisia toimintamekanismeja (Cowan 1999; Cushnie & Lamb

2005). Polyfenolit osallistuvat kasvi-mikrobi-vuorovaikutussuhteisiin toimimalla esimerkiksi

signalointimolekyyleinä kasvin ja symbioottisten maaperäbakteerien ja mykorritsasienten

välillä (Chabot ym. 1992; Mandal ym. 2010). Kasvien polyfenolit torjuvat myös herbivoreja

(Quideau ym. 2011). Kasvit voivat puolustautua esimerkiksi lehtiä syöviä eläimiä vastaan

tuottamalla fenolisia yhdisteitä, kuten tanniineja, ja kasvinosien kokonaisfenolipitoisuuden on

joissakin tapauksissa havaittu kasvavan herbivorian lisääntyessä (Scogings ym. 2011).

Kasvien normaali valosta riippuvainen aineenvaihdunta ja abioottinen, esimerkiksi UV-

säteilyn, kylmyyden, raskasmetallialtistuksen tai ravinnepuutosten aiheuttama stressi johtavat

reaktiivisten happilajien muodostumiseen kasveissa, ja yksi polyfenolien tehtävistä on suojata

kasveja tältä oksidatiiviselta stressiltä toimimalla antioksidantteina (Sakihama ym. 2002).

Esimerkiksi kurkun sirkkalehtiin kertyy UV-B-säteitä absorboivia stressipolyfenoleita

jatkuvan UV-B-sätelyaltistuksen seurauksena (Yamasaki ym. 2007). UV-säteilyä absorboivat

fenoliyhdisteet suojelevat kasvisoluja ionisoivan UV-B-säteilyn aiheuttamilta DNA-tuhoilta

(Dixon & Paiva 1995). Myös liian suolaisessa ympäristössä kasvava kasvi voi lisätä ja

muokata fenoliyhdisteidensä synteesiä siten, että antioksidatiiviselta teholtaan hyviä

flavonoideja muodostuu runsaasti (Tattini & Traversi 2008). Geenien lisäksi siis myös

kasvuolosuhteet vaikuttavat kasvin fenolipitoisuuteen ja -koostumukseen (Romani ym. 2003;

Saviranta ym. 2008).

10

1.2.2 Flavonoidit

Fenolisista yhdisteistä flavonoideja muodostuu kasveissa eniten (Quideau ym. 2011).

Flavonoidien rakenteessa on kaksi aromaattista rengasta (A- ja B-renkaat), joita yhdistää

kolmen hiiliatomin muodostama oksygenoitunut heterosyklinen pyraanirengas (C-rengas)

(Manach ym. 2004; Cushnie & Lamb 2005). Flavonoidien perusrakenne on esitetty kuvassa 1.

Flavonoideja on kuvattu yli 6500 erilaista ja ne voidaan jakaa karkeasti kuuteen ryhmään

flavonoleihin, flavoneihin, isoflavoneihin, flavanoneihin, antosyanidiineihin ja flavanoleihin

(Nemeth & Piskula 2007). Flavonoidit voidaan luokitella edelleen tarkemmin sen mukaan,

ovatko ne sekä biosynteesin väli- että lopputuotteita, kuten flavanonit ja flavan-3-olit, vai

ainoastaan synteesireitin lopputuotteita, kuten antosyanidiinit ja flavonolit (Cushnie & Lamb

2005). Kaikki korkeammat kasvit kykenevät flavonoidisynteesiin, sillä flavonoideja esiintyy

kaikissa fotosynteesiin osallistuvissa soluissa (Cushnie & Lamb 2005; Pollastri & Tattini

2011). Flavonoidikonsentraatiolla on yleisesti ottaen taipumus pienentyä siirryttäessä kasvin

ulommista kerroksista sisempiin (Nemeth & Piskula 2007; Benítez ym. 2010). Flavonoidien

tehtävät kasveissa vaihtelevat pölyttäjien houkuttelemisesta energian siirtoon, morfogeneesin,

fotosynteesin ja kasvihormonien toiminnan säätelyyn ja patogeeneiltä ja UV-säteilyltä

suojaamiseen (Cushnie & Lamb 2005).

Kuva 1. Flavonoidin perusrakenne (Del Rio ym. 2012 mukaillen).

Flavonolit ovat runsaimpia kasvien flavonoideista (Manach ym. 2004). Kversetiini (kuva 2) ja

kemferoli (kuva 3) puolestaan ovat yleisimmät flavonolit (Manach ym. 2004). Myös

esimerkiksi isoramnetiini (kuva 4), joka on kversetiinin metyylieetteri, on yksi biologisesti

aktiivisimmista ja ihmisen ravitsemuksen kannalta merkittävimmistä flavonoleista (Park &

Lee 1996). Flavonoleja on erityisen runsaasti esimerkiksi sipuleissa, purjoissa, parsakaalissa

ja mustikoissa (Manach ym. 2004). Flavonolit ovat kasveissa yleensä glykosidisessa

muodossa, ja sokeritähteenä on tavallisesti glukoosi tai ramnoosi (Manach ym. 2004).

Glykosyylitransferaasi-entsyymit katalysoivat flavonolien glykosylaatiota kasveissa (Li ym.

2001).

11

Kuva 2. Kversetiini Kuva 3. Kemferoli Kuva 4. Isoramnetiini

(ChemSpider, 2012a). (ChemSpider, 2012b). (ChemSpider, 2012c).

1.2.3 Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi

Fenolisten sekundaarimetaboliittien synteesi alkaa pitkin sikimaattireittiä, jossa sikimaatista

muodostuu ensin korismaattia, ja korismaatista edelleen korismaattimutaasi-entsyymin

katalysoimana aromaattisia aminohappoja, muun muassa fenyylipropanoidien prekursoreina

toimivia fenyylialaniinia ja tyrosiinia (Herman & Weaver 1999; Bassman 2004; Fraser &

Chapple 2011). Sikimaatti johdetaan fosfoenolipuryvaatista ja erytroosi-4-fosfaatista, jotka

muodostuvat kasvien primaarisen hiiliaineenvaihdunnan, glykolyysin ja

pentoosifosfaattireitin välituotteina (Tzin & Galili 2010). Fenoliyhdisteiden johtaminen

fenyylialaniinista jatkuu pitkin fenyylipropanoidireittiä, jonka ensimmäisessä vaiheessa PAL

muokkaa fenyylialaniinista trans-kanelihappoa poistamalla molekyylistä aminoryhmän

(Fraser & Chapple 2011). Kuvassa 5 on esitetty sikimaatti- ja fenyylipropanoidireitit sekä

joidenkin niiden lopputuotteiden biosynteesitiet pääpiirteittäin. Trans-kanelihaposta

muodostuu edelleen para-kumariinihappoa kanelihappo-4-hydroksylaasi-entsyymin lisätessä

yhdisteeseen happimolekyylin (Zabala ym. 2006). Para-kumariinihappoa saadaan myös

suoraan tyrosiinista, ja kanelihaposta voidaan valmistaa stilbeenejä (kuva 6), kasvien fenolisia

puolustautumisyhdisteitä, sekä salisyylihappoa (kuva 7), signaalimolekyyliä, jota tuotetaan

esimerkiksi mikrobien hyökkäyksen seurauksena (Dixon & Paiva 1995; Shadle ym. 2003;

Bassman 2004).

12

FOTOSYNTEESI

fosfoenolipuryvaatti erytroosi-4-fosfaatti

sikimaatti

korismaatti

fenyylialaniini tyrosiini

PAL

salisyylihappo trans-kanelihappo LIGNIINIT sinappihappo

stilbeenit CH4

para-kumariinihappo kahvihappo ferulahappo

4CL

4-kumaryyli-KoA klorogeenihappo

CHS

ISOFLAVONIT naringeniini kalkoni suberiini

CHI

ISOFLAVANONIT naringeniini flavanoni FLAVONIT

F3H

dihydrokemferoli

F3’H ANTOSYANIDIINIT

dihydrokversetiini

FLAVONOLIT leukosyanidiini FLAVAN-3-OLIT

esim. kversetiini

PROANTOSYANIDIINIT

Kuva 5. Sikimaatti- ja fenyylipropanoidireittien pääpiirteet sekä joidenkin fenolisten yhdisteiden ja

yhdisteryhmien jatkosynteesireitit (Dixon & Paiva 1995; Bassman 2004; Zabala ym. 2006 mukaillen).

PAL = fenyylialaniiniammoniumlyaasi, CH4 = kanelihappo-4-hydroksylaasi, 4CL = 4-

kumaraatti:KoA-ligaasi, CHS = kalkonisyntaasi, CHI = kalkoni-isomeraasi, F3H = flavanoni-3-

hydroksylaasi, F3’H = flavonoidi-3’-hydroksylaasi

13

Para-kumariinihapon muodostumisen jälkeen reaktiotie haarautuu useisiin sivupolkuihin,

joita pitkin muodostuu lukuisia fenyylipropanoidiyhdisteitä (Dixon & Paiva 1995; Bassman

2004). Para-kumariinihaposta johdetaan esimerkiksi fenoliset polymeerit suberiinit ja

ligniinit, joiden rakenteet vaihtelevat kasvilajeittain (kuva 8) (Dixon & Paiva 1995; Zabala

ym. 2006; Fraser & Chapple 2011). Myös fenolinen kahvihappo ja edelleen klorogeeni-,

ferula- ja sinappihappo muodostuvat para-kumariinihaposta (Dixon & Paiva 1995; Zabala

ym. 2006).

Flavonoidien synteesi alkaa para-kumariinihapon muuttuessa 4-kumaraatti:KoA-ligaasin

katalysoimana 4-kumaryyli-koentsyymi A:ksi (Zabala ym. 2006; Fraser & Chapple 2011). 4-

kumaryyli-koentsyymi A muuttuu edelleen naringeniini kalkoniksi ja naringeniini

flavanoniksi kalkonisyntaasin ja kalkoni-isomeraasin toiminnan seurauksena (Zabala ym.

2006). Monet entsyymit osallistuvat naringeniinin muokkaamiseen muiksi flavonoideiksi,

kuten flavoneiksi, flavonoleiksi, antosyaaniineiksi ja flavan-3-olien kautta

proantosyanidiineiksi (Zabala ym. 2006). Flavanoni-3-hydroksylaasi-entsyymin avulla

naringeniini flavanonista muodostuu dihydrokemferoli, josta flavonoidi-3’-hydroksylaasi

tekee edelleen dihydrokversetiiniä (Slimestad ym. 2007). Dihydrokversetiini on esimerkiksi

sekä kversetiinin että leukosyanidiinin prekursori, ja kasvissa vallitsevat sisäiset olosuhteet,

kuten kehitysvaihe, vaikuttavat entsyymiaktiivisuuksien kautta siihen, mitä lopputuotetta

prekursorista muodostuu (Ju ym. 1997). 4-kumaryyli-koentsyymi A:sta tai naringeniinista

johdetaan myös isoflavonit (kuva 9) ja niistä edelleen isoflavanonit (Zabala ym. 2006).

Kuva 6. Stilbeeni Kuva 7. Salisyylihappo

(ChemSpider, 2012d). (ChemSpider, 2012e).

14

Kuva 8. Koniferyylialkoholi, yksi esim.

havupuiden ligniinin prekursoreista Kuva 9. Isoflavoni

(ChemSpider, 2012f). (ChemSpider, 2012g).

1.2.4 Fenolisten yhdisteiden biologinen aktiivisuus ihmisessä

Fenoliset yhdisteet eivät ole välttämättömiä ihmisen terveydelle, mutta nauttimalla runsaasti

(poly)fenoleja sisältäviä ruoka-aineita saattaa olla mahdollista ehkäistä kroonisten sairauksien

muodostumista: fenolisten yhdisteiden on todettu hillitsevän muun muassa hermoston

rappeutumista, syöpää, tyypin 2 diabetesta ja sydän- ja verisuonitauteja (Del Rio 2012;

Hollman ym. 2012; Yilmazer-Musa ym. 2012). Syötävistä kasveista on tunnistettu useita

satoja polyfenoleja (Manach ym. 2004). Hedelmät, tee, kahvi ja viini ovat tärkeimpiä

polyfenolien lähteitä ihmisruokavaliossa (Manach ym. 2004; Rastmanesch 2011). Muita

tärkeitä polyfenolien lähteitä ovat muun muassa vihannekset, joista merkittävänä esimerkkinä

sipulit, viljat ja siemenet (Rastmanesch 2011). Ihmisen keskimääräinen polyfenolien saanti on

noin 1 g päivässä (Rastmanesch 2011). Kansallinen ruokakulttuuri ja alueelle ominainen

maatalous ja luonnonkasvillisuus pitkälti määrittävät, mitkä ovat merkittävimpiä polyfenolien

lähteitä ja siten myös mitkä yhdisteet esiintyvät runsaimpina ruokavaliossa (Manach ym.

2004).

Fenolisten yhdisteiden terveysvaikutukset on perinteisesti yhdistetty molekyylien

antioksidatiiviseen aktiivisuuteen, mutta tuoreet tutkimukset ovat paljastaneet myös muita

toimintamekanismeja, jotka vähentävät elimistön tulehdusstressiä tai kohdistuvat esimerkiksi

solusyklin säätelyyn (Del Rio ym. 2012; Giménez-Bastída ym. 2012; Hollman ym. 2012).

Muun muassa sydän- ja verisuonitautien osalta elimistön kokonaisantioksidanttikapasiteetin ja

pienentyneen sairastumisriskin välistä yhteyttä ei ole todistettu pitävästi (Hollman ym. 2012).

Suoran antioksidanttivaikutuksen lisäksi polyfenolit voivat esimerkiksi kyetä aktivoimaan

geenejä ja signaalireittejä, jotka vastaavat solujen suojautumisesta oksidatiivista stressiä

vastaan (Hollman ym. 2012). Jotkut polyfenolijohdannaiset osallistuvat sairauksien ehkäisyyn

15

esimerkiksi inhiboimalla verihiutaleiden aktivaatiota ja aggregoitumista, vaikuttamalla

verisuonten supistumiseen ja laajenemiseen typpioksidin tuotannon kautta tai osallistumalla

kasvutekijä- tai sytokiinireseptorigeenien, tuumorirepressorigeenien tai onkogeenien

säätelyyn (Del Rio ym. 2012; Giménez-Bastída ym. 2012; Hollman ym. 2012; Togolini 2012;

Yilmazer-Musa ym. 2012). Polyfenolit kykenevät osallistumaan lukuisten entsyymien kuten

kinaasien, erilaisia signaalimolekyylejä, esimerkiksi typpioksidia ja prostaglandiinia

muodostavien syntaasien sekä sokereita pilkkovien amylaasien ja glukosidaasien toimintaan

(Del Rio ym. 2012; Hollman ym. 2012; Yilmazer-Musa ym. 2012). Esimerkiksi katekiini-3-

gallaatit voivat estää ravinnon tärkkelyksen entsymaattista hajoamista ruoansulatuskanavassa,

millä puolestaan on merkitystä verensokerin säätelyssä ja siten tyypin 2 diabeteksen

ennaltaehkäisyssä (Yilmazer-Musa ym. 2012). Fenoliset yhdisteet myös muokkaavat

suoliston mikrobiflooraa vaikuttaen tätä kautta muun muassa ruoansulatuskanavan terveyteen

ja ihmisen energia-aineenvaihduntaan (Rastmanesh 2011; Queipo-Ortuño ym. 2012).

Maksan ja suoliston entsyymit muokkaavat ravinnon mukana saatuja fenolisia yhdisteitä,

jolloin yhdisteiden biosaatavuus, bioaktiivisuudet ja esimerkiksi antioksidatiivinen

kapasiteetti muuttuvat (Manach ym. 2004; Del Rio ym. 2012; Hollman ym. 2012). Ihmisen

suoliston mikrobiflooran muokkaamat polyfenolit ovat usein paremmin elimistön

hyödynnettävissä ja aktiivisuudeltaan alkuperäisestä yhdisteestä poikkeavia (Cerdá ym. 2004;

Tomás-Barberán & Andrés-Lacueva 2012). Fenoliyhdisteiden aktiivisuudet vaihtelevat myös

ihmisyksilöittäin, mikä johtunee ainakin osittain eroista henkilökohtaisessa

suolistomikrobistossa (Cerdá ym. 2004; Chanet ym. 2012). Polyfenolit voivat toimia

antioksidatiivisina komponentteina myös mahalaukussa ennen ravintoaineiden absorptiota,

jolloin yhdisteet estävät esimerkiksi verisuoniterveydelle haitallisten rasvojen

oksidaatiotuotteiden muodostumista (Kanner ym. 2012).

1.3 Sipulit ja niiden terveysvaikutukset

Allium-suvun kasvit eli sipulit ovat yksi vanhimmista viljelykasveista (Lanzotti 2006).

Sipulikasveja on käytetty vuosituhansien ajan ravintona ja lääkkeinä, ja jotkut niistä ovat

tunnettuja koristekasveja (Voipio 2001; Keusgen ym. 2006; Lanzotti 2006). Allium cepa -

lajiin kuuluva kepa- eli ruokasipuli on maailmanlaajuisesti tomaatin jälkeen toiseksi

merkittävin puutarhakasvi (Griffiths ym. 2002). Valkosipuli (Allium sativum) ja purjo (Allium

porrum) ovat myös taloudellisesti tärkeitä viljelykasveja (Voipio 2001). Allium cepa -lajin

uskotaan olevan alun perin kotoisin Keski-Aasiasta (Griffiths ym. 2002). Allium-lajeja

16

tavataan kuitenkin kaikilla mantereilla sekä viljeltyinä että luonnonvaraisina (Voipio 2001;

Griffiths ym. 2002; Li ym. 2010). Tärkeimmät sipulintuottajamaat ovat Kiina, Intia, USA,

Venäjä, Turkki ja Iran (Slimestad ym. 2007). Hyvien säilyvyysominaisuuksiensa vuoksi

sipulien kansainvälinen kauppa on laajamittaista verrattuna moniin muihin vihanneksiin

(Griffiths ym. 2002). Sipuleja käytetään ravintona lähes kaikissa etnisissä ja kaikissa

kuluttajaryhmissä, joten se on suosittu raaka-aine myös prosessoiduissa elintarvikkeissa

(Griffiths ym. 2002). Sipulin teollisen prosessoinnin seurauksena syntyy erilaisten

sipuliperäisten materiaalien sivuvirtoja, joita voitaisiin käsitellä ja hyödyntää edelleen muun

muassa elintarviketeollisuuden sovelluksissa, vaikkapa hapettumisenesto- tai säilöntäaineena

(Nemeth & Piskula 2007; Benítez ym. 2010).

Allium-lajit ovat erittäin monimuotoisia niin väriltään, muodoltaan kuin maultaankin. Allium

cepa -lajin edustajiksi luokiteltavia sipuleita ovat muun muassa kelta- ja punasipuli sekä

salottisipuli (Griffiths ym. 2002; Nemeth & Piskula 2007), joita kaikkia käytetään yleisesti

ruoanvalmistuksessa. Keltaiset ja valkoiset Allium cepa -lajikkeet ovat käytetyimpiä

Euroopassa ja USA:ssa, mutta monissa maailman maissa punertavat lajikkeet ovat

suosituimpia, ja esimerkiksi tropiikin kosteissa olosuhteissa salottisipuli menestyy parhaiten

(Griffiths ym. 2002). Valkosipuli, Allium sativum, on lukuisista terveysvaikutuksistaan

tunnettu, aasialaista alkuperää oleva lääke- ja maustekasvi (Agarwal 1996; Voipio 2001;

Casella ym. 2012). Purjo, Allium porrum, on maultaan mieto Allium-suvun jäsen, jonka

viljely Euroopassa ja Suomessa on kohtalaisen aktiivista (Voipio 2001). Myös purjoa on

laajalti käytetty sekä elintarvikkeena että kansanlääketieteessä, mutta purjon bioaktiivisten

yhdisteiden tutkimus ja analysointi on tähän mennessä ollut vähäistä (Adão ym. 2011; Casella

ym. 2012). Sekä valkosipulista että purjosta on olemassa eri tyyppejä, jotka poikkeavat

toisistaan muun muassa kasvuominaisuuksiltaan (Voipio 2001).

Allium cepa -lajikkeiden tuotanto oli jo vuonna 2000 melkein 47 miljoonaa kiloa, ja määrä on

kasvussa (Slimestad ym. 2007). Sipulit ja niiden käyttötavat monimuotoistuvat kuluttajien

kiinnostuksen myötä ja kysynnän mukaisesti (Griffiths ym. 2002; Yang ym. 2004; Bonaccorsi

ym. 2008). Sipulin monet terveysvaikutukset ovat laajalti tunnettuja, mikä lisää halukkuutta

sipulin käyttöön ruoanvalmistuksessa (Griffiths ym. 2002). Sipulin sisältämien bioaktiivisten

yhdisteiden tiedetään olevan muun muassa sydän- ja verisuonitauteja ja syöpää ehkäiseviä,

antioksidatiivisia ja antimikrobisia sekä lievittävän esimerkiksi diabetekseen liittyvää

munuaisten vajaatoimintaa (Griffiths ym. 2002; Yang ym. 2004; Singh ym 2009; Casella ym.

2012; Lanzotti ym. 2012). Muun muassa sipulin ja valkosipulin vaikutuksista mahasyöpää ja

17

sen muodostumiseen osallistuvaa Helicobacter pylori -bakteeria vastaan on saatu vahvaa

näyttöä (Griffiths ym. 2002). Sipulin flavonoidit voivat esimerkiksi vaikuttaa syöpäsolujen

jakaantumiseen ja apoptoosiin liittyvien signaalireittien toimintaan (Galluzzo ym. 2009).

Terveysvaikutteisten aineenvaihduntatuotteiden lisäksi sipulit sisältävät runsaasti esimerkiksi

seleeniä, jonka riittävä saanti voi auttaa ylläpitämään mielenterveyttä ja hedelmällisyyttä sekä

ehkäisemään syöpiä ja sydän- ja verisuonitauteja (Griffiths ym. 2002).

1.4 Sipulien bioaktiiviset yhdisteet

1.4.1 Polyfenolit

Flavonoidit ovat sipulien tärkein fenoliyhdisteiden ryhmä (Benítez ym. 2010). Sipulit

sisältävät runsaasti flavonoideja verrattuna moniin muihin tutkittuihin kasviksiin ja ovat

maailmanlaajuisesti tärkeä flavonoidien lähde ihmisen ruokavaliossa (Miean & Mohamed

2001; Yang ym. 2004; Nemeth & Piskula 2007). Allium cepa -lajikkeiden pääasiallisia

fenolisia yhdisteitä ovat flavonoideihin kuuluva flavonoli kversetiini ja sen johdannaiset

(Bonaccorsi ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008; Soininen ym. 2012). Esimerkiksi sipulin

antikarsinogeeniset ja sydän- ja verisuonitaudeilta suojaavat vaikutukset perustunevat ainakin

osittain sipulin sisältämien polyfenolien, kuten juuri kversetiinin ja sen glykosyloitujen

johdannaisten, antioksidanttiominaisuuksiin ja muihin toimintamekanismeihin (Griffiths ym.

2002; Galluzzo ym. 2009; Lee ym. 2011).

Sipulien sisemmissä kerroksissa kversetiini on lähes yksinomaan glykosideina, mutta

kuoriosassa on runsaasti myös kversetiini-aglykonia (Benítez ym. 2010). Ohutsuolessa β-

glukosidaasi pilkkoo tehokkaasti kversetiini-monoglukosidin ja -diglukosidin kversetiini-

aglykoniksi, josta suurin osa absorboituu hyödynnettäväksi muualle elimistöön (Griffiths ym.

2002). Flavonoideista kversetiinin ja sen glykosidien lisäksi sipuleista on eristetty

isoramnetiinia ja kemferolia sekä niiden glykosidisia muotoja, pieniä määriä myrisetiiniä ja

dihydroflavonoli taksifoliinin johdannaisia (Slimestad ym. 2007). Sipulien

flavonoidiglykosideissa sokeriosa on tavallisesti glukoosi (Slimestad ym. 2007). Punasipulista

on eristetty myös flavonoideihin lukeutuvia antosyaaneja ja proantosyanidiineja (Bahorun ym.

2004; Slimestad ym. 2007). Punasipulista valmistetuissa kuoriuutteissa on havaittu

flavonoidien (kversetiini ja kemferoli) lisäksi myös fenolisia galli-, ferula- ja

protokatekuhappoja (Singh ym. 2009). Allium cepa -sipuleista punasipuli on verrattain hyvä

flavonoidien ja niiden glykosidien lähde (Yang ym. 2004; Slimestad ym. 2007; Bonaccorsi

18

ym. 2008). Kokonaisfenolipitoisuudeltaan salottisipuli on osoittautunut Allium cepa -

lajikkeista parhaimmaksi (Yang ym. 2004).

Purjossa suurin osa flavonoideista on kemferolia (Nemeth & Piskula 2007). Valkosipulissa on

kversetiinin ja myrisetiinin lisäksi runsaasti apigeniiniä, jota ei ole merkittäviä määriä Allium

cepa -lajikkeissa (Miean & Mohamed 2001; Lanzotti 2006). Valkosipulin ei ole havaittu

sisältävän isoramnetiinia tai kemferolia (Miean & Mohamed 2001). Kaiken kaikkiaan purjo ja

valkosipuli sisältävät huomattavasti vähemmän flavonoideja kuin Allium cepa -lajikkeet

(Nemeth & Piskula 2007). Kuoritussa valkosipulinkynnessä ei ole lähes lainkaan

flavonoideja, ja muidenkin sipuleiden flavonoideista suuri osa menetetään kuorittaessa

(Griffiths ym. 2002). Lisäksi esimerkiksi keitettäessä sipulin kversetiini-glukosidit liukenevat

keitinveteen, ja sipulimurskassa sipulin omat flavonoidiglukosidaasi-entsyymit saattavat alkaa

pilkkoa kversetiini-diglukosideja (Nemeth & Piskula 2007).

1.4.2 Rikkiyhdisteet

Solukkovaurion, esimerkiksi pilkkomisen, seurauksena S-alk(en)yyli-L-kysteiini-S-oksideista

muodostuu sipuleissa allinaasi-entsyymin katalysoimassa reaktiossa orgaanisia, rikkipitoisia

bioaktiivisia yhdisteitä, jotka ovat tutkituimpia sipulien terveysvaikutteisista komponenteista

(Griffiths ym. 2002; Lanzotti 2006; Kyung 2011). Sipulin ominainen maku ja tuoksu

aiheutuvat juuri tällaisista rikkiyhdisteistä, joita ovat esimerkiksi tiosulfinaatit, mono-, di- ja

trisulfidit sekä kepaeeni (engl. cepaene) (Griffiths ym. 2002). Sipulin rikkiyhdisteillä on

todettu lisäksi useita farmakologisia, muun muassa antioksidatiivisia, kasvainten

muodostumista ehkäiseviä, veren kolesterolipitoisuutta alentavia ja antimikrobisia vaikutuksia

(Lanzotti 2006). Valkosipuli on erittäin hyvä terveysvaikutteisen allisiinin ja sen

johdannaisten lähde (Agarwal 1996). Muissa sipuleissa kuin valkosipulissa S-alk(en)yyli-L-

kysteiini-S-oksideista muodostuu sulfeenihapon kautta tiopropanaali-S-oksidia ja siitä

edelleen muun muassa kepaeenia, jolla on esimerkiksi verihyytymien muodostumista

ehkäiseviä ominaisuuksia (Griffiths ym. 2002). Sipuleiden verihiutaleiden aggregoitumista

ehkäisevä aktiivisuus on yhdistetty orgaanisiin rikkiyhdisteisiin, ja antiastmaattisten

vaikutusten taustalla ovat mahdollisesti tiosulfinaatit ja kepaeenit (Griffiths ym. 2002).

19

1.4.3 Saponiinit

Saponiinit ovat glykosideja, joissa on yhdestä kolmeen sakkaridia kinnittyneenä

triterpenoidiin tai steroidirakenteeseen (Osbourn 1996; Khokhar & Apenten 2009; Lanzotti

ym. 2012). Sipulien saponiinien tiedetään osallistuvan tärkeisiin biologisiin prosesseihin

(Lanzotti 2006). Saponiinit ovat pintajännitystä alentavia kitkeriä yhdisteitä, joilla on todettu

lukuisia terveysvaikutuksia (Osbourn 1996; Lanzotti 2006; Khokhar & Apenten 2009).

Detergenttiominaisuuksiensa vuoksi saponiinit voivat tosin aiheuttaa esimerkiksi haitallista

verisolujen hemolyysiä (Khokhar & Apenten 2009; Adão ym. 2011). Saponiinien

antimikrobiset, erityisesti kasvien sienitauteja ehkäisevät ominaisuudet ovat hyvin tunnettuja

(Osbourn 1996; Lanzotti ym. 2012). Esimerkiksi purjosta eristetyllä saponiinilla uskotaan

olevan ruoansulatuskanavaa suojaavaa ja tulehduksia ehkäisevää aktiivisuutta (Adão ym.

2011).

1.4.4 Frukto-oligosakkaridit

Sipulit sisältävät runsaasti frukto-oligosakkarideja kestoosia, nystoosia ja

fruktofuranosyylinystoosia (Jaime 2001; Soininen ym. 2012). Frukto-oligosakkaridit ovat

lineaarisia fruktoosioligomeereja, joita tavataan sipulin ja valkoispulin lisäksi paljon myös

muun muassa parsassa, maa-artisokassa, vehnässä ja rukiissa (Bornet ym. 2002). Frukto-

oligosakkaridit ovat prebioottisia molekyylejä, jotka edistävät hyödyllisten bifidobakteerien

kasvua ja hidastavat haitallisen mikrobien lisääntymistä ihmisen suolistossa (Bornet ym.

2002). Lisäksi frukto-oligosakkarideilla on havaittu positiivisia vaikutuksia lipidi- ja

glukoosiaineenvaihduntaan (Bornet ym. 2002).

1.5 Elintarvikepatogeenit ja niiden hallinta

1.5.1 Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes on zoonoottinen gram-positiivinen sauvabakteeri, joka ei muodosta

itiöitä (NACMCF 1991). Bakteeri on fakultatiivisesti anaerobinen (Jadhav ym. 2012). L.

monocytogenes -bakteerin isäntiä ovat lukuisat nisäkkäät, linnut, kalat, äyriäiset ja hyönteiset

(Murray 1955; NACMCF 1991). L. monocytogenes leviää ympäristöön, esimerkiksi

maaperään ja vesistöön, isäntäeläinten ulosteiden välityksellä (Beuchat 1996). L.

monocytogenes on Listeria-suvun seitsemästä jäsenestä käytännössä ainut ihmispatogeeni,

20

joskin harvoja muiden Listeria-lajien aiheuttamia tautitapauksiakin on esiintynyt (Jadhav ym.

2012).

L. monocytogenes on ollut viime vuosikymmeninä useiden ruokamyrkytysepidemioiden

aiheuttaja (NACMCF 1991). Listerioiden aikaansaamaa ruokamyrkytystilaa kutsutaan

listerioosiksi (Murray 1955). Terveillä ihmisillä oireet eivät yleensä ole vakavia, mutta

riskiryhmään kuuluvilla, kuten vastasyntyneillä ja henkilöillä, joilla on alentunut

immuunipuolustuskyky (vanhukset, syöpä- ja HIV-potilaat ym.), tauti voi olla vaarallinen

(NACMCF 1991; Lyytikäinen ym. 2000a; Pontello ym. 2012). Listerioosin ensioireita ovat

muun muassa vatsavaivat, kuten ripuli, ja kuume (Beuchat 1996; Lyytikäinen ym. 2000a).

Tauti voi myös olla täysin oireeton (Pontello ym. 2012). Vakavimmillaan listerioosista voi

kuitenkin seurata aivokalvontulehdus, verenmyrkytys ja jopa kuolema (Murray 1955;

Lyytikäinen ym. 2000a). Vaikka listerioosi on suhteellisen harvinainen sairaus, se aiheuttaa

lähes kolmasosan ruokamyrkytyskuolemista, ja kuolleisuusprosentti on 20˗30 (Lyytikäinen

ym. 2000a; Tompkin 2002).

Valmisateriat, raa'at kasvikset, pastöroimattomat maitovalmisteet ja esimerkiksi tyhjiöpakatut

kalatuotteet ovat listerioositartunnan kannalta riksielintarvikkeita (NACMCF 1991; Beuchat

1996; Lyytikäinen ym. 2000a; Tompkin 2002). Bakteeri pystyy elämään suurissa

suolapitoisuuksissa ja pH-alueella 5,0-9,6 sekä kasvamaan ja lisääntymään jopa vain hieman

yli 1 °C:ssa (NACMCF 1991). Listerian kasvun kannalta epäsuotuisia elintarvikkeita ovat

happamat, pienen vesiaktiivisuuden tuotteet sekä pakastevalmisteet, jotka kuumennetaan

ennen nauttimista (Tompkin 2002). Koska L. monocytogenes kykenee sopeutumaan

monenlaisiin kasvuolosuhteisiin ja muodostaa biofilmejä abioottisille kasvualustoille, se

saattaa kotiutua myös ruoanvalmistusympäristöjen mikrobistoon ja olla ongelmallinen

torjuttava (NACMCF 1991; Lyytikäinen ym. 2000a; Jadhav ym. 2012). Elintarvike voi

kontaminoitua käsittelyn ja valmistuksen yhteydessä ihmisen tai työvälineiden kautta, tai

raaka-aine voi olla saastunut jo ennen käsittelyä (Beuchat 1996). Pistokokeissa L.

monocytogenes -kontaminaatioita havaitaan monenlaisissa elintarvikkeissa, mutta

bakteeripitoisuudet ovat yleensä pieniä, noin 100 pesäkkeen muodostavaa yksikköä

grammassa (Lyytikäinen ym. 2000a). Listerioositartunnan aiheuttavissa elintarvikkeissa

mikrobipitoisuus on ollut yli 1000 pesäkkeen muodostavaa yksikköä grammassa (Tompkin

2002).

21

Vuonna 1999 Suomessa puhkesi listerioosepidemia, jonka yhteydessä diagnosoitiin 25

potilasta (Lyytikäinen ym. 2000b). Lähes kaikilla sairastuneilla immuunipuolustus oli selvästi

heikentynyt muun sairauden seurauksena, ja kuusi potilaista kuoli (Lyytikäinen ym. 2000b).

Epidemian aiheutti todennäköisesti pastöroitu voi, joka oli kontaminoitunut

pastörointiprosessin jälkeen laitteiston tai meijeriympäristön välityksellä (Lyytikäinen ym.

2000b). Listerioosiepidemioiden ennaltaehkäisyn kannalta elintarvikevalmistuksen hygienia

ja kattava ja jatkuva elintarvikkeiden ja niiden prosessointiympäristöjen seuranta L.

monocytogenes -kontaminaatioiden varalta on tärkeää (Lyytikäinen ym. 2000b, Pontello ym.

2012).

1.5.2 Salmonellat

Salmonella-suvun bakeerit ovat gram-negatiivisia sauvabakteereja, jotka ovat fakultatiivisesti

anaerobeja eivätkä muodosta itiöitä (Franz & van Bruggen 2008). Salmonellat ovat yksi

tavallisimmista ja parhaiten tunnetuista ihmisten ripulisairauksien aiheuttajista (D'Aoust 1991;

Franz & van Bruggen 2008 ). Salmonellat leviävät usein maatalouseläinten, esimerkiksi

nautakarjan, sikojen ja kanojen välityksellä, ja sekä ihmiset että eläimet voivat kantaa

bakteeria myös oireettomina (D'Aoust 1994; Franz & van Bruggen 2008). Salmonelloosin

aiheuttavia elintarvikkeita ovat perinteisesti olleet eläinperäiset tuotteet, kuten liha ja

kananmunat, mutta myös kasvisperäiset salmonelloositapaukset ovat lisääntyneet (Franz &

van Bruggen 2008; Rihmanen-Finne ym. 2011). Salmonellalla saastuneiden vesien ja maan

käyttö maanviljelyssä voi aiheuttaa esimerkiksi hedelmien suoraa tai ristikontaminaatiota

jatkojalostuksen yhteydessä (D’Aoust 1994). Salmonella voi siirtyä ruokaan myös esimerkiksi

kuumentamisen jälkeen lisättävien mausteiden yhteydessä (D’Aoust 1994).

Salmonellainfektioon tarvittava solumäärä vaihtelee, mutta tietyissä tapauksissa jo hyvin

pienikin altistus voi aiheuttaa sairauden (Cruickshank & Humprey 1987).

Tavallisesti salmonellakannat aiheuttavat ei-typhoidista salmonelloosia, jonka oireita ovat

korkeintaan viisi vuorokautta kestävä vetinen ripuli ja lievä kuume (D'Aoust 1991).

Salmonelloosin sairastanut henkilö voi kuitenkin kantaa ja levittää bakteeria vielä kaksikin

kuukautta oireiden lievittymisen jälkeen (D'Aoust 1991). Harvinaisemman typhoidisen

salmonelloosiin oireet voivat kestää jopa kuukauden, ja sairaus voi muuttua systeemiseksi eli

levitä ruoansulatuskanavan ulkopuolisiin kudoksiin (D'Aoust 1991). Riittämättömästi

hoidetun salmonellainfektion seurauksena voi muodostua myös krooninen kantajuus, joka voi

kestää vuosikymmeniä (D’Aoust 1991). Salmonellainfektio voi pahimmassa tapauksessa

22

johtaa kuolemaan (D’Aoust 1994). Salmonellan ruoansulatuskanavaan isäntäsolujen

solulimaan erittämä enterotoksiini on bakteerin merkittävin ripulia aiheuttava virulenssitekijä

(D'Aoust 1991).

Salmonelloosin puhkeamisen syynä ovat usein lihojen epähygieeninen käsittely ja riittämätön

kypsennys kotitalouksien tai ateriapalveluiden keittiöissä (D’Aoust 1994).

Elintarviketeollisuuden ja ravintolapalveluiden tarjoajien työtekijöiden välityksellä tapahtuva

ristikontaminaatio voi muodostua ongelmaksi pitkien, jopa kroonisten kantajuusjaksojen

vuoksi, joiden seurauksena laajojen salmonelloosiepidemioiden riski kasvaa (Cruickshank &

Humprey 1987; D’Aoust 1991). Epidemioiden yhteydessä salmonelloositapauksia todetaan

usein todellisia tapauksia vähemmän, sillä vatsatautiin sairastuneet eivät yleensä hakeudu

lääkäriin, mikäli oireet eivät ole vakavia (Rihmanen-Finne ym. 2011). Suomessa todettiin

vuonna 2009 S. Bovismorbificans -kannan aiheuttama salmonelloosiepidemia, jonka

yhteydessä varmistettiin 42 tautitapausta, joskin todellisen määrän uskotaan olevan suurempi

(Rihmanen-Finne ym. 2011). Suomen epidemian tartuntalähde olivat sinimailasen itujen

italialaiset siemenet (Rihmanen-Finne ym. 2011). Kansainvälistyvä elintarvikekauppa luo

haasteita myös salmonellan kontrolloinnille, sillä erityisesti kehittyvistä maista tuotavien

tuotteiden mikrobiologinen laatu on usein kärsinyt vajavaisesta puhtaanapidosta, ja valvonta

voi olla puutteellista (D’Aoust 1994). Elintarviketeollisuudessa on huolehdittava riskialttiiden

raaka-aineiden pysymisestä erillään muista raaka-aineista ristikontaminaatioiden välttämiseksi

(D’Aoust 1994). Myös antibioottien käyttö eläintuotannossa edesauttaa antibioottiresistenttien

salmonellakantojen syntyä (D’Aoust 1994). Lainsäädäntö, viranomaisten suorittama

säännöllinen testaus ja valvonta, ripulin sairastaneiden elintarvikealan työntekijöiden riittävän

pitkät karenssi- ja seuranta-ajat, sekä tehokkaat ja turvalliset dekontaminointimenetelmät ovat

tärkeitä salmonelloosiepidemioiden torjunnassa (D’Aoust 1991; D’Aoust 1994; Rihmanen-

Finne ym. 2011).

1.5.3 Candida albicans

Candida albicans on ihmisen normaaliflooraan kuuluva hiiva, joka elää kommensaalina

terveiden yksilöiden ruoansulatuskanavassa sekä suun ja emättimen limakalvoilla (Kim &

Sudbery 2011). C. albicans on kuitenkin opportunistinen taudinaiheuttaja ja tavallisin ihmisen

sienipatogeeni, joka infektoi yleensä limakalvoja ja ihoa (Kim & Sudbery 2011). C. albicans -

hiivan aiheuttamaa limakalvoinfektiota kutsutaan kandidaasiksi ja verenmyrkytystä

kandidemiaksi (Kim & Sudbery 2011). Verenkierrosta C. albicans -hiivan aiheuttama

23

tulehdus voi siirtyä sisäelimiin (Kim & Sudbery 2011). Terveillä henkilöillä esimerkiksi

emättimen kandidaasi on tavallinen, vaaraton ja hoidettavissa oleva sairaus, ja

immuunipuolustuksen neutrofiilit estävät yleensä kandidemian muodostumisen (Kim &

Sudebery 2011). Yksilöillä, jotka kärsivät alentuneesta immuunipuolustuksen tasosta

esimerkiksi AIDSin tai syövän seurauksena, suun limakalvojen kandidaasi kertoo usein taudin

etenemisestä, ja heillä sisäelinten infektio on erittäin vakava ja vaikeasti hoidettava tila (Segal

ym. 1979; Kim & Sudbery 2011).

Leivin- ja panimohiivoja käytetään hyödyksi elintarviketeollisuudessa tiettyjen tuotteiden

valmistuksessa (Fleet 2007). Lisäksi esimerkiksi Aasiassa on pitkät perinteet erilaisten

fermentoitujen tuotteiden valmistuksesta hiivojen avulla (Hesseltine & Wang 19667).

Joidenkin hiivojen, myös C. albicans -hiivan, läsnäolo elintarvikkeessa on kuitenkin

haitallista (Fleet 2007; Evira 2009; Sanas ym. 2010). Hiivat aiheuttavat aistittavan laadun

muutoksia ja pilaavat hiilihydraattipitoisia tuotteita esimerkiksi alkoholikäymisreaktioilla

(García-Gimeno & Zurera-Cosano 1997; Fleet 2007; Evira 2009). Lisäksi hiivojen

aineenvaihdunta saattaa mahdollistaa muiden haitallisten mikro-organismien kasvun (Irlinger

& Mounier 2009). C. albicans kykenee muodostamaan biofilmejä kiinteille pinnoille (Kim &

Sudbery 2011; Maisch ym. 2012). C. albicans -hiivaa esiintyy joskus ulosteperäisenä

luonnonvesissä, joissa se ilmentää veden laatua ja saattaa muodostaa myös terveysriskin

(Buck & Bubucis 1978). C. albicans -hiivan on havaittu myös siirtyvän vedestä mereneläviin

(Buck ym. 1977). Candida -suvun hiivoja on havaittu ilmestyneen +4 °C:ssa varastoituihin

kasvissalaatteihin 156 h:n säilytyksen aikana (García-Gimeno & Zurera-Cosano 1997).

Candida-suvun hiivoilla voi olla maidon rasvoja hydrolysoivaa lipolyysiaktiivisuutta, joka

aiheuttaa esimerkiksi makumuutoksia voissa (Sagdic ym. 2010).

1.5.4 Perinteiset ja uudet menetelmät elintarvikepilaajien kontrolloimiseksi

Nykypäivän elintarviketeollisuudessa käytetään muun muassa etikkahappoa ja sen suoloja

sekä kalium- ja natriumnitriittiä estämään useiden ruokamyrkytyksiä aiheuttavien bakteerien

kasvua tuotteissa (Evira 2009). Esimerkiksi puolukassa luontaisesti esiintyvä bentsoehappo,

sen suolat ja muut johdannaiset ovat tehokkaita hiivojen ja homeiden kasvun ehkäisyssä

(Evira 2009; Devi ym. 2008). Jo ennen kemiallisten säilöntämenetelmien käyttöönottoa

esimerkiksi suolapitoisuuden lisäämisellä, vesipitoisuuden vähentämisellä (kuivaaminen),

savustamisella, happamuuden lisäämisellä (fermentointi) ja pakastamisella on pyritty

hidastamaan elintarvikepilaajien kasvua ruoassa (Gorris & Smid 1998; Evira 2009).

24

Säilöntäaineiden käyttö on usein elintarviketurvallisuuden näkökulmasta hyvin perusteltua,

sillä erityisesti pitkään säilytettävissä elintarvikkeissa mikrobien aiheuttama

pilaantumisprosessi on oikeanlaisesta varastoinnista huolimatta jatkuvasti käynnissä (Evira

2009). Esimerkiksi listerian esiintyminen elintarvikkeissa on lisääntynyt, kun säilöntäaineiden

ja suolan käyttöä elintarvikkeissa on vähennetty (Lyytikäinen ym. 2000a).

Kiinnostus luonnonmukaisesti tuotettuja, mahdollisimman vähän prosessoituja, terveellisiä

elintarvikkeita kohtaan kasvaa jatkuvasti (Gorris & Smid 1998; Grunert & Bredahl 1998;

Griffiths ym. 2002). Siksi synteettiset lisäaineet, mukaan lukien elintarvikepilaajien torjuntaan

käytetyt säilöntäaineet, ovat joutuneet kuluttajien ennakkoluulojen kohteeksi (Grunert &

Bredahl 1998; Arima ym. 2002; Park ym. 2008; Santas ym. 2010). Myös esimerkiksi

elintarvikkeiden säteilyttämiseen patogeenien torjuntamenetelmänä suhtaudutaan varauksella

(D’Aoust 1994). Toisaalta kysyntää on myös nopeille ja käytännöllisille valmisaterioille,

joiden säilyvyysajat ovat pitkiä (Grunert & Bredahl 1998; Devi ym. 2008). Näistä syistä

luonnosta peräisin olevien säilöntäaineiden tutkimus ja kehitys lienee ajankohtaista (Gorris &

Smid 1998; Arima ym. 2002; Park ym. 2008; Santas ym. 2010).

1.6 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuus

Yksinkertaisilla fenoleilla, fenolihapoilla ja polyfenoleilla on kauan tiedetty olevan mikrobien

kasvua sääteleviä ominaisuuksia (Cowan 1999; Cushnie & Lamb 2005; Mandal ym. 2010).

Erilaiset fenoliset yhdisteet toimivat muun muassa signalointimolkeyyleinä palkokasvien ja

niiden kanssa symbioosissa elävien Rhizobium-bakteerien välillä (Mandal ym. 2010).

Fenolisten yhdisteiden uskotaan osallistuvan myös kasvi-sieni-vuorovaikutussuhteisiin:

joidenkin flavonoidien ja fenolihappojen on tietyissä olosuhteissa havaittu edistävän

mykorritsasienten kasvua, joillakin yhdisteillä taas on sienirihmojen kasvua inhiboivaa

aktiivisuutta (Chabot ym. 1992; Mandal ym. 2010). Punaviinin polyfenolien on todettu

vaikuttavan ihmisen suolistomikrobistoon edistämällä probioottisten bakteerien kasvua ja

inhiboimalla haitallisia lajeja (Queipo-Ortuño ym. 2012). Ihmiskunta on hyödyntänyt kasvien

bioaktiivisten yhdisteiden antimikrobisia ominaisuuksia jo vuosituhansia erilaisten

sairauksien hoidossa, ja esimerkiksi propoliksen eli kittivahan, leipäpuu-uutteiden ja

eukalyptuksen bakteereita ja sieniä torjuvat vaikutukset on yhdistetty nimenomaan fenolisiin

yhdisteisiin (Cowan 1999; Ahmad & Beg 2011; Cushnie & Lamb 2005; Jagtap & Bapat

2010).

25

Flavonoidit ovat polyfenolinen yhdisteryhmä, johon kuuluvilla yhdisteillä on rakenteellisista

samankaltaisuuksistaan huolimatta lukuisia erilaisia aktiivisuuksia ja farmakologisia

ominaisuuksia (Cushnie & Lamb 2005). Flavonoidit tunnetaan myös antimikrobisista

ominaisuuksistaan. Flavonoideihin kuuluvista flavonoleista ainakin datiscetiinin, kemferolin,

kversetiinin, myrisetiinin ja moriinin on toistuvasti havaittu ehkäisevän muun muassa

Staphylococcus- ja Bacillus-sukuihin kuuluvien patogeenien kasvua (Mori ym. 1987; Nishino

ym. 1987; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001; Santas ym. 2010). Puhdas ei-hydroksyloitu

flavoni sekä 6,7-dihydroksiflavoni ovat osoittaneet antibakteerista aktiivisuutta (Mori ym.

1987; Nishino ym. 1987; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). Flavanoneista ainakin

naringeniinin on todettu olevan joissakin tapauksissa antibakteerinen (Tsuchiya ym. 1996;

Rauha ym. 2000). Esimerkiksi vihreässä teessä esiintyvä flavan-3-oli epigallokatekiini on

osoittanut monissa yhteyksissä antimikrobisia ominaisuuksia (Mori ym. 1987; Nishino ym.

1987; Taguri ym. 2004). Lisäksi useilla flavonoidimonomeereista muodostuvilla

kondensoiduilla tanniineilla eli proantosyanidiineilla ilmenee bakteereita ja sieniä torjuvaa

aktiivisuutta (Scalbert 1991; Cowan 1999).

Sienet, kuten Candida albicans, ovat osoittautuneet useissa tutkimuksissa bakteereja

resistentimmiksi flavonoideille (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010). Monien flavonoidien

antimikrobisuudesta on saatu ristiriitaisia tuloksia, joihin vaikuttanevat ainakin kokeissa

käytetty mikrobikanta ja koeolosuhteet (Mori ym. 1987; Nishino ym. 1987; Chabot ym. 1992;

Xu & Lee 2001; Taguri ym. 2004; Santas ym. 2010).

1.7 Fenolisten yhdisteiden molekyylirakenteen vaikutus antimikrobisuuteen

Fenolisen yhdisteen bioaktiivisuuteen vaikuttavat paitsi molekyylin oma hiilirunko, myös

muut kemialliset ominaisuudet, kuten hapettumisaste, fenolirenkaiden hydroksyloituminen,

molekyyliin liittyneet sokeritähteet (glykosylaatio), asylaatio ja stereoisomeria (Scalbert &

Williamson 2000). Jo pienet erot yhdisteiden rakenteessa vaikuttavat merkittävästi niiden

bioaktiivisuuksiin (Cowan 1999). Luonnossa suurin osa kasvien fenolisista yhdisteitä esiintyy

glykosideina, mutta molekyylit voivat muodostaa myös muita bioaktiivisia konjugaatteja ja

aineenvaihduntatuotteita joutuessaan kosketuksiin ihmisen solujen tai mikrobien kanssa

(Scalbert & Williamson 2000; Spencer ym. 2004). Yksittäisten polyfenolien ja niiden

johdannaisten, esimerkiksi juuri glykosidien, antimikrobiset ominaisuudet vaihtelevat, ja

vaihteluun vaikuttaa myös tutkittavana oleva mikrobilaji ja -kanta (Waage & Hedin 1985;

Ohemeng ym. 1992; Rauha ym. 2000; Ahmad & Beg 2001; Taguri ym. 2004). Gram-

26

positiiviset bakteerit ovat useissa tutkimuksissa osoittautuneet gram-negatiivisia bakteereita

herkemmiksi polyfenolisille puhdasaineille, mutta sekä gram-positiivisten että gram-

negatiivisten bakteerien keskuudessa on suuria kantakohtaisia eroja resistenttiydessä

esimerkiksi flavonoideille (Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001; Taguri ym. 2004; Santas ym.

2010). Bakteereilla solukalvoa ympäröi fysikaalisesti vahva, runsaasti monimutkaisia

polymeerisiä peptidoglykaaniyhdisteitä sisältävä soluseinä, jonka rakenne on gram-

positiivisilla bakteereilla gram-negatiivisten soluseinää yksinkertaisempi (Strominger &

Tipper 1965; Martin 1966). Bakteerien soluseinän peptidoglykaanit ja niiden synteesi ovat

monien antibakteeristen lääkkeiden vaikutuskohde (Bugg ym. 2011). Myös sienillä on

soluseinä, jossa on muun muassa kitiiniä ja polysakkaridi-proteiinikomplekseja, joiden määrä

vaikuttaa esimerkiksi hiivan soluseinän läpäisevyyteen (Chattaway ym. 1967). Ainakin

joidenkin flavonoidipolymeerien antifungaalisen aktiivisuuden ajatellaan kohdistuvan sienen

soluseinään (Patel ym. 2011). Perinteisten antifungaalisten lääkkeiden vaikutukset ovat

perustuneet muun muassa sienten, esimerkiksi hiivojen, solukalvoille spesifisen ergosterolin

synteesiin osallistuvan demetylaasi-entsyymin inhiboitumiseen (Fukuoka ym. 2003; Yu ym.

2011).

Flavonoidien vaikutusmekanismit mikrobisolussa voivat kohdistua solukalvon ja -seinän

lisäksi muun muassa entsyymeihin, soluseinän ja soluliman proteiineihin tai

nukleiinihappoihin (Mori ym. 1987; Nishino ym. 1987; Cowan 1999; Xu & Lee 2001;

Spencer ym. 2004; Apostolidis ym. 2008; Patel ym. 2011). Esimerkiksi myrisetiini inhiboi

Burholderia cepacia -bakteerin proteiinisynteesiä DNA:sta riippumattomalla mekanismilla

(Xu & Lee 2001). Olemalla vuorovaikutuksessa mikrobisolujen makromolekyylien kanssa,

flavonoidit ja niiden johdannaiset mahdollisesti osallistuvat solunsisäiseen signalointiin,

proteiinien ja soluseinän synteesiin ja hajotukseen sekä aiheuttavat esimerkiksi

raudanpuutosta ja reagoivat solun komponenttien tioliryhmien kanssa (Scalbert 1991; Cowan

1999; Spencer ym. 2004; Kylli ym. 2011). Fenolisten yhdisteiden kertyminen solukalvoille

voi aiheuttaa muun muassa kalvojen juoksevuuden ja stabiilisuuden muutoksia ja edelleen

häiritä elektronien siirtoa ja solujen energia-aineenvaihduntaa (Apostolidis ym. 2008). On

mahdollista, että esimerkiksi flavonoidin antimikrobinen aktiivisuus kohdistuu useampaan

kuin yhteen solun komponenttiin, mutta toisaalta yhdisteen tietyt rakenteelliset ominaisuudet

saattavat olla välttämättömiä molekyylin pääsylle mikrobisolun läheisyyteen tai sen sisään

(Cushnie & Lamb 2005). Molekyylin solutason vaikutukset riippuvat lopulta siitä, kuinka

laajaan kosketukseen yhdiste pääsee solun kanssa joko kalvolla tai solulimassa (Spencer ym.

2003).

27

Flavonoidin fenoliryhmän hydroksylaation on usein ajateltu liittyvän flavonoidien kykyyn

ehkäistä mikrobien kasvua: merkitystä on todennäköisesti sekä hydroksyyliryhmien määrällä

että sijainnilla (Tsuchiya ym. 1996). Useissa tutkimuksissa on tultu johtopäätökseen, että mitä

hydroksyloituneempi ja siten myös hydrofiilisempi yhdiste on, sitä tehokkaammin se toimii

antimikrobisena komponenttina (Nishino ym. 1987; Cowan ym. 1999; Xu & Lee 2001).

Toisaalta hydroksyloitujen, luonteeltaan hydrofiilisten flavonolien on tietyissä olosuhteissa

todettu jopa edistävän sienirihmojen kasvua, ja hydroksyyliryhmien lisääminen flavoni-

molekyyliin vähentää yhdisteen antifungaalisuutta (Chabot ym. 1992; Rauha ym. 2000).

Polyfenolin hydrofobisuus puolestaan voi edesauttaa proteiini-polyfenoli-kompleksien

muodostumista ja fenolien kiinnittymistä ja akkumuloitumista mikrobin solukalvolle (Richard

ym. 2006; Apostolidis ym. 2008). Fenolisten yhdisteiden taipumus sitoutua proteiineihin

voimakkailla vetysidoksilla voi edelleen aiheuttaa tärkeiden entsyymien

konformaatiomuutoksia ja inhiboitumista ja vaurioittaa esimerkiksi bakteerien soluseinän

proteiinipitoisia alueita (Mulaudzi ym. 2012). Hydrofobiset voimat osallistuvat myös

polyfenolien sitoutumiseen suoraan solukalvolle (Yu ym. 2011).

Ainakin kversetiini ja jotkin flavonit sitoutuvat DNA-gyraasiin, prokaryoottien DNA:n

topologiaa muokkaavaan entsyymikompleksiin, inhiboiden entsyymin aktiivisuutta ja siten

estäen sen toiminnan (Ohemeng ym. 1993; Plaper ym. 2003). Kversetiinijohdannaisten

rutiinin ja isokversitriinin on havaittu häiritsevän topoisomeraasi IV:n, toisen bakteerien

DNA:n kierteisyyttä säätelevän entsyymin toimintaa mahdollisesti ohjaamalla entsyymin

vääriin DNA:n katkaisukohtiin (Bernard ym. 1997). Esimerkiksi fenolisten kahvi- ja

gallihappojen antimikrobisen aktiivisuuden kohteeksi on esitetty myös

proliinidehydrogenaasi-entsyymiä, jonka toiminta on edellytys bakteerien kasvulle (Kwon

ym. 2007; Apostolidis ym. 2008). Lisäksi bakteerien lipaasi-entsyymejä on pidetty

mahdollisena flavonoidien vaikutuskohteena (Nishino ym. 1987). Omenasta eristettyjen

flavan-3-olien, kversetiiniglykosidien ja poly- ja oligomeeristen prosyanidiinien sekä sipulista

eristetyn kversetiini-4’-glukosidin on osoitettu inhiboivan Helicobacter pylori -bakteerin

virulenssille tärkeää ureaasi-entsyymiä ja sitä vastaavaa Lactobacillus fermentum -bakteerin

ureaasia in vitro (Pastene ym. 2009; Shabana ym. 2010). Joidenkin katekiinien ajatellaan

alentavan C. albicans -hiivan proteasomien entsyymiaktiivisuutta aiheuttamalla sykliini-

riippuvaisen kinaasi-inhibiittorin kertymistä hiivasoluihin ja sitä kautta häiritsevän solujen

morfogeneesiä, normaalia solusykliä ja lopulta biofilmin muodostusta (Evensen & Braun

2009).

28

Flavonoidiglykosidit eivät sellaisenaan ole osoittaneet merkittävää antimikrobista tehoa

(Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). Polyfenoliin kiinnittyneet

glukoositähteet voivat estää hydrofobisten, antimikrobisuusaktiivisuudelle olennaisten

proteiini-polyfenoli-vuorovaikutusten syntymisen (Richard ym. 2006). Glukosidiosan

leikkautuminen irti polyfenoliglukosidista lisää aglykonin lipofiilisyyttä ja samalla taipumusta

hakeutua solukalvoille (Del Rio ym. 2012). Glykosylaation osuus heikkoon antimikrobiseen

tehoon saattaa kuitenkin olla merkityksetön in vivo -olosuhteissa, sillä esimerkiksi suoliston

mikrobiflooran lajit deglykosyloivat ravinnon flavonoidiglykosideja ja käyttävät syntyviä

glykaaneja ravintonaan (Rastmanesh 2011). Bakteerien kyvyssä hyödyntää glykaaneja on

sukukohtaisia eroja, mikä saattaa selittää suolistomikrobiston lajisuhteita sen lisäksi, että

bakteerilajien herkkyys polyfenolien antimikrobisia ominaisuuksia kohtaan vaihtelee

(Rastmanesh 2011). Antimikrobisissa, kasveista eristetyissä raakauutteissa, joissa flavonoidit

ovat usein glykosidisessa muodossa, ovat aina useiden yhdisteryhmien seoksia, jolloin

molekyylien väliset vuorovaikutukset voivat aiheuttaa antimikrobisen aktiivisuuden, vaikka

vaikutusta ei havaita yksittäisillä glykosideilla tai muilla yhdisteillä (Griffiths ym. 2002;

Cowan 1999; Cushnie & Lamb 2005). Yhdistämällä fenolisia yhdisteitä keskenään tai muiden

antimikrobisten kemikaalien, kuten antibioottien tai elintarvikesäilöntäaineiden kanssa,

mikrobien kasvun ehkäiseminen on usein tehokkaampaa (Tsuchiya ym. 1996; Cowan 1999;

Arima ym. 2002; Taguri ym. 2004; Ramos ym. 2006).

Esimerkiksi kversetiinin ja muiden flavonoidien hapettuessa transitiometallien läsnäollessa

voi muodostua myrkyllisiä kinonimuotoja, joilla on mahdollisesti sytotoksisia ja

antimikrobisia ominaisuuksia (Cowan 1999; Spencer ym. 2004; Ramos ym. 2006; Sung ym.

2008; Perron ym. 2011). Lisäksi kversetiinin antimikrobinen aktiivisuus saattaa ainakin osin

olla seurausta yhdisteen C-renkaan kaksoissidoksesta (Xu & Lee 2001). Flavonit ja flavonolit,

joiden A/C-rengas on ollut muodoltaan tasomainen, ovat osoittaneet verrattain hyvää

antimikrobista tehoa verrattuna flavonoideihin, joiden A/C-rengas on asettautunut ei-

tasomaisesti (Nishino ym. 1987). Flavonoidien B-renkaan on ajateltu olevan merkittävässä

osassa ainakin DNA- ja RNA-synteesin inhibition kautta toteutuvassa antimikrobisessa

aktiivisuudessa (Mori ym. 1987). Metoksiryhmä kalkonin rakenteessa vaikuttaisi vähentävän

yhdisteen antimikrobista tehoa (Alcaráz ym. 2000). Lisäksi fenolisten yhdisteiden

molekyylikoolla on vaikutusta siihen, missä ja miten yhdisteiden antimikrobinen aktiivisuus

ilmenee (Mulaudzi ym. 2012). Pienemmät molekyylit pääsevät helpommin mikrobisolujen

läheisyyteen ja läpäisevät solujen fyysiset esteet (Mulaudzi ym. 2012). Toisaalta

29

molekyylipainoltaan suurempien polyfenolien on todettu tehokkaammin ehkäisevän

ureaasiaktiivisuutta in vitro (Pastene ym. 2009).

1.8 Sipulien flavonoidien bioaktiivisuus elintarvikepatogeeneja vastaan

Flavonoidi kversetiini ja erityisesti sen glykosidiset muodot kversetiini-4’-glukosidi tai

kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi ovat sipulin runsaimpia polyfenolisia yhdisteitä (Bonaccorsi

ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008). Kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-

glukosidin lisäksi sipuli sisältää pääasiassa viittä muuta flavonolia kversetiini-3,7,4’-

triglukosidia, kversetiini-7,4’-diklukosidia, isoramnetiini-3,4’-glukosidia, kversetiini-3’-

glukosidia ja isoramnetiini-4’-glukosidia (Bonaccorsi ym. 2008; Soininen ym. 2012). Edellä

mainittujen yhdisteiden ohella sipuleissa on havaittu pieniä määriä muita kversetiini- ja

isoramnetiinijohdannaisia, kemferolia ja myrisetiiniä johdannaisineen, dihydroflavonoli

taksifoliinin johdannaisia sekä antosyaaneja, joita esiintyy erityisesti punasipulissa (Slimestad

ym. 2007). Polyhydroksyloidut flavonoidit kversetiini, kemferoli ja myrisetiini, ovat

osoittaneet antimikrobista aktiivisuutta esimerkiksi ruokamyrkytyksiä aiheuttavaa

Staphylococcus aureus -bakteeria vastaan (Xu & Lee 2001). Aglykonit ovat yhdisteiden

glykosidimuotoja tehokkaampia mikrobien kasvun ehkäisijöitä (Rauha ym. 2000). Sipulin

ruskea kuori, jossa kversetiinin aglykonia esiintyy muita sipulin osia enemmän, suojaa

luonnossa sipulia taudinaiheuttajien hyökkäyksiltä (Takahama & Hirota 2000; Benítez ym.

2010). Kuoriosassa on myös kversetiinin antifungaalisiksi ja antibakteerisiksi todettuja

hapettumistuotteita, jotka ehkäisevät paitsi sipuleita infektoivia sienipatogeeneja myös

esimerkiksi H. pylori -bakteerin kasvua (Takahama & Hirota 2000; Ramos ym. 2006).

Sipulista voidaan eristää polyfenoleja uuttamalla sipulin solukoita orgaanisilla liuottimilla,

kuten metanolilla, etanolilla, propanolilla, asetonilla ja etyyliasetaattilla, joita voidaan käyttää

myös seoksina toistensa tai voimakkaasti poolisen veden kanssa (Garcia-Salas ym. 2010).

Fenoliyhdisteen liukoisuus joko poolisiin tai poolittomiin liuottimiin riippuu paitsi yhdisteen

omista ominaisuuksista myös vuorovaikutussuhteista esimerkiksi kasvisolukon

makromolekyylien kanssa (Garcia-Salas ym. 2010). Sipuliuutteiden antimikrobinen teho

vaihtelee sen mukaan, mitä liuotinta uutossa on käytetty (Kyung 2011). Sipulista orgaanisilla

liuottimilla valmistettujen flavonoidirikkaiden raakauutteiden on todettu monissa

tutkimuksissa olevan antimikrobisia elintarvikepatogeeneja, kuten Listeria monocytogenes,

Bacillus cereus, Staphylococcus aureus ja Escerichia coli -bakteereja vastaan (Rauha ym.

2000; Benkeblia ym. 2005; Park & Chin 2010; Santas ym. 2010). Kuitenkin esimerkiksi

30

kversetiinin ja kemferolin puhtaat aglykonimuodot ovat osoittaneet raakauutteita parempaa

antimikrobista aktiivisuutta, mikä saattaa olla seurausta siitä, että uutteissa sipulin flavonoidit

ovat glykosideina, joilta puuttuu C-3-hydroksyyliryhmä (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010).

Kversetiiniglykosidit ovat luonteeltaan hydrofiilisiä, mikä vaikuttaa niiden biologiseen

aktiivisuuteen solussa (Bischoff 2008; Santas ym. 2010). Mikro-organismit saattavat lisäksi

kyetä metaboloimaan flavonoidiglykosideja, jolloin myös yhdisteiden biologiset aktiivisuudet

muuttuvat (Spencer ym. 2004; Chung ym. 2011; Millet ym. 2012).

Myös vedellä sipulista liukenee paljon fenolisia yhdisteitä, mutta vesiuutteiden

flavonoidipitoisuus on pieni ja antimikrobinen teho heikko verrattuna orgaanisilla liuottimilla

uutettuihin fraktioihin, joissa flavonoidipitoisuus on suurempi (Santas ym. 2010; Rahman ym.

2011). Vedellä ja orgaanisilla liuottimilla sipulista liukenee paljon myös sipulien ominaisia

antimikrobisia rikkiyhdisteitä, jotka kuitenkin ovat haihtuvia ja erityisesti Allium cepa -lajin

sipuleissa erittäin epästabiileja (Griffiths ym. 2002; Lanzotti 2006; Kyung 2011; Millet ym.

2012). Fermentoimalla sipulin vesiuutetta sipulin ja heran luontaisen mikrobiflooran avulla,

uutteen antimikrobinen teho patogeenisia bakteerikantoja vastaan paranee, tosin uutteessa ei

ilmene enää samaa sipulille ominaista flavonoidiprofiilia kuin fermentoimattomassa

vesiuutteessa (Millet ym. 2012). Sipulin raakauutteiden antimikrobinen teho perustuu

luultavasti paitsi fenolisiin yhdisteisiin myös muihin uutteessa läsnä oleviin komponentteihin

ja on riippuvainen mikrobien määrästä ja kasvuolosuhteista, joissa

antimikrobisuusaktiivisuutta ilmennetään (Cowan 1999; Cushnie & Lamb 2005).

31

2. TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää kelta-, puna-, salotti ja banaanisalottisipulista

(Allium cepa), valkosipulista (Allium sativum) ja purjosta (Allium porrum) uutettujen

fenolisten yhdisteiden sekä sipuleissa runsaimpina esiintyvien yksittäisten

flavonoidiglykosidien vaikutuksia gram-positiivisen Listeria monocytogenes -bakteerin,

gram-negatiivisen Salmonella infantis -bakteerin ja eukaryoottisen Candida albicans -hiivan

kasvuun turbidometriaan perustuvalla, reaaliaikaisella mittausmenetelmällä. Tavoitteena oli

myös arvioida sipulimateriaalin jatkojalostuksesta muodostuvien sivuvirtojen potentiaalia

elintarvikkeiden säilyvyyttä edistävien fenoliyhdisteiden lähteenä.

32

3. MATERIAALIT JA MENETELMÄT

3.1 Sipulimateriaali

Suomalaiset kelta-, puna- ja banaanisalottisipulit, tanskalaiset salottisipulit, espanjalaiset

valkosipulit sekä ranskalainen purjo valittiin sattumanvaraisesti kuopiolaisesta

supermarketista fenoliyhdisteiden uuttamista varten. Sipulit säilytettiin +4 °C:ssa pimeässä

uuttamiseen asti.

Sipulit käytettiin uuttoon tuoreina. Sipulit kuorittiin ja niistä poistettiin kuivat ja sitkeät osat.

Purjosta käytettiin sekä valkoinen että vihreä osa. Sipulit silputtiin tavallisella

kotitalouskäyttöön tarkoitetulla leikkurilla.

3.2 Uutteiden valmistus antimikrobisuuskokeita varten

Uutot suoritettiin 50 ml Falcon-putkissa, joihin oli punnittu 15 g sipulisilppua ja lisätty 30 ml

99,5 % etyyliasetaattia (Sigma-Aldrich, USA). Yhtä sipulilajia kohden käsiteltiin 15˗25 x 15

g sipulisilppua, jossa oli yhdistetty 1-7 sipulista saatu materiaali. Sipulimateriaalia käsiteltiin

60 min tasoravistelijassa (Unimax 2010, Heidolph Instuments, Saksa) ravistellen 400 rpm.

Uutteet suodatettiin kolveihin kuitukankaan (Mölnlycke Health Care, Ruotsi) läpi ja

etyyliasetaatti haihdutettiin kuiviin pyöröhaihduttajalla (Rotavapor - RE, Büchi, Sveitsi)

vesihauteessa vakuumissa. Kuiva-aineet liuotettiin kolveista uudelleen 99,5 %

etyyliasetaattiin. Uutteet siirrettiin lasisiin koeputkiin ja ilmakuivattiin huoneenlämmössä

vetokaapissa uudelleen kuiviksi. Ilmakuivatuksen jälkeen yhdisteet liuotettiin 1ml:aan 80 %

etanolia (Altia, Suomi) ja siirrettiin Eppendorf-putkiin. Kiinteä aine erotettiin uutteista

sentrifugoimalla 13000 g 5 min mikrosentrifugilla (Biofuge Pico, Heraeus Instruments,

Saksa). Sentrifugoidut uutteet suodatettiin 0,2 µm:n suodattimella (Phenomenex, Tanska) ja

niiden kokonaisfenolipitoisuus määritettiin. Valmiit uutteet säilöttiin -20 °C:ssa

antimikrobisuuskokeisiin asti.

3.3 Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen

Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuus määritettiin värireaktioon perustuvalla Folin-

Ciocalteu-menetelmällä. Sipuliuutteista valmistettiin 1:200, 1:1000 ja 1:2000 laimennokset

33

ultrapuhtaaseen veteen. Uuttomenetelmän optimointivaiheessa uutteista valmistettiin 1:10,

1:50 ja 1:100 laimennokset. Standardikantaliuos valmistettiin liuottamalla gallihappoa

(Sigma-Aldrich, USA) ultrapuhtaaseen veteen konsentraatiolla 1 mg/ml, ja kantaliuoksesta

valmistettiin laimennossarja, jossa gallihappopitoisuudet olivat 0,01 mg/ml, 0,03 mg/ml, 0,05

mg/ml, 0,07 mg/ml ja 0,10 mg/ml. 200 µl:aan laimennettuja näytteitä tai standardiliuoksia

lisättiin 1000 µl 1:10 laimennettua Folin-Ciocalteu-reagenssia (Merck, Saksa) ja 800 µl 7,5 %

natriumkarbonaattiliuosta. Kustakin uute- ja standardipitoisuudesta valmistettiin kolme

rinnakkaista mitattavaa näytettä. Negatiivikontrolli valmistettiin vastaavasti ultrapuhtaasta

vedestä. Näytteet sekoitettiin koeputkisekoittajalla ja suojattiin valolta. Reaktion annettiin

tapahtua 1 h:n ajan. Näytteet sekoitettiin koeputkisekoittajalla kertaalleen n. 25 min

inkuboinnin jälkeen ja siirrettiin muovikyvetteihin (Kartell, Australia) n. 50 min inkuboinnin

jälkeen. Näytteiden absorbanssit mitattiin spektrofotometrillä (Ultrospec 2000, Pharmacia

Biotech, USA) 765 nm:n aallonpituudella. Standardinäytteiden perusteella piirrettiin

standardisuora, jonka pohjalta määritettiin uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet

gallihappoekvivalentteina mg/ml.

Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet säädettiin joko laimentamalla tai konsentroimalla

pitoisuuteen 15 mg/ml.

3.4 Puhdasaineet

Antimikrobisuuskokeissa testattavat puhtaat fenoliyhdisteet olivat flavonolit kversetiini-3,4’-

di-O-glukosidi (CAS-numero 29125-80-2) ja kversetiini-4’-glukosidi eli spireosidi (CAS-

numero 243-614-6) (Extrasynthese, Ranska). Kyseiset kversetiinijohdannaiset ovat sipulien

runsaimpia polyfenoleja (Bonaccorsi ym. 2008). Puhdasaineista valmistettiin kantaliuokset

dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Merck Schuchardt, Saksa) pitoisuudessa 10 mg/ml.

3.5 Tutkittavat mikrobit ja kasvatusolosuhteet

Antimikrobisuuskokeissa käytetyt mikrobikannat olivat bakteerit Listeria monocytogenes

EELA Hki L211 ja Salmonella infantis EELA 72 sekä hiiva Candida albicans EELA 188.

Kannat on saatu Elintarviketurvallisuusvirastosta (EVIRA) ja ne ovat elintarvikkeista

eristettyjä. Työssä haluttiin tutkia tyypillisiä elintarvikkeiden pilaajamikrobeja ja

ruokamyrkytysten aiheuttajia. Listeria on grampositiivinen ihmisen patogeeni, joka aiheuttaa

34

pääasiassa elintarvikevälitteisesti tarttuvaa listerioosia, salmonella on gramnegatiivinen,

zoonoottinen elintarvikepatogeeni, ja C. albicans on opportunistisesti patogeeninen ihmisen

pöytävierasmikrobi.

Ennen antimikrobisuuskokeiden aloittamista mikrobikannat siirrostettiin kiinteille

kasvatusalustoille joko syväjäädytetyistä (-70 °C) helmistä tai maljoilta. Kantoja ylläpidettiin

tutkimuksen ajan siirrostamalla yksi pesäke uudelle kasvatusmaljalle kerran viikossa. Listeria-

ja salmonella-kantoja ylläpidettiin veriagarmaljoilla + 37 °C:ssa ja hiivaa oxytetracycline

glucose yeast extract (OGYE) -maljoilla (Lab M Ltd, Iso-Britannia) + 30 °C:ssa.

3.6 Sipuliuutteiden ja puhdasaineiden antimikrobisuuden määritys

3.6.1 Mittauslaitteisto

Antimikrobisuuskokeet suoritettiin inkubaattorista ja turbidometristä koostuvan automaattisen

mittauslaitteen (Bioscreen C, ThermoLabsystems, Suomi) avulla. Laite mittaa kustakin 100-

kuoppalevyn (Honeycomb, ThermoLabsystems, Suomi) kuopasta absorbanssin, jonka

muutokset ovat suoraan verrannollisia kuopissa olevan kasvatusliemen samentumiseen ja

siten myös bakteerien kasvuun. Laitteella voidaan mitata yhdellä ajokerralla 200 näytettä.

3.6.2 Yhdistepitoisuudet

Antimikrobisuuskokeissa tutkittavat mikrobit altistettiin useille pitoisuuksille sipuleista

uutettuja fenolisia yhdisteitä ja puhdasaineita, joista valmistettiin laimennokset

kantaliuoksista. Kelta-, puna, salotti- ja banaanisalottisipuliuuttella kantaliuosten

kokonaisfenolipitoisuus oli 15 mg/ml 80 % etanolia, valkosipuliuutteella 12 mg/ml ja

purjouutteella 7,5 mg/ml. Puhdasaineet liuotettiin pitoisuuteen 10 mg/ml DMSO:ta. Käytetyt

yhdistepitoisuudet kullekin mikrobille on esitetty taulukossa 1.

35

Taulukko 1. Antimikrobisuuskokeissa käytetyt polyfenolipitoisuudet kullekin tutkittavalle

mikrobikannalle.

YHDISTE KÄYTETYT YHDISTEPITOISUUDET mg/ml

L. monocytogenes S. infantis C. albicans

Uute, kokonaisfenolipitoisuus 5, 10, 15, *) 5, 10, 15, *) 0.6, 0.75, 1, 1.3, 1.8,

2.4

Kversetiini-4’-glukosidi 1, 2, 4, 6, 8, 10 1, 2, 4, 6, 8, 10 1, 2, 3, 4, 5

Kversetiini-4’-glukosidi +

kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi

1, 2, 3, 4, 5 1, 2, 3, 4, 5 1, 2, 3, 4, 5

*) Valkosipuliuutteiden antibakteerisuuskokeissa käytetyt kokonaisfenolipitoisuudet olivat 4, 8 ja 12 mg/ml ja

purjouutteen n. 7,5 mg/ml.

3.6.3 Antimikrobisuuskokeet Bioscreen C -laitteella

Sipuliuutteiden antimikrobisuuden testaamista varten yksi pesäke kumpaakin bakteerikantaa

siirrettiin kasvamaan 5 ml:aan tryptonisoija-kasvatuslientä (TSB)(Oxoid Ltd, Iso-Britannia) ja

hiivaa yksi pesäke 5 ml:aan OGYE-kasvatuslientä (Lab M Ltd, Iso-Britannia). Bakteereita

inkuboitiin yön yli + 37 °C:ssa ja hiivaa + 30 °C:ssa. Seuraavana päivänä nestekasvatusten

absorbanssit aallonpituudessa 625 nm säädettiin n. 0,1:een, jolloin mikrobitiheys liemessä oli

bakteereilla n. 1 x 108 pmy/ml ja hiivalla n. 1 x 10

5 pmy/ml.

Mikrobit altistettiin 100-kuoppalevyllä sipuliuutteille siten, että 5-10 rinnakkaiseen kuoppaan

pipetoitiin 220 µl kasvatuslientä, 75 µl mikrobisuspensiota ja 7,5 µl uutetta tai

puhdasaineliuosta. Taulukossa 2 näkyvät kokonaisfenoli- ja puhdasainepitoisuudet kuopissa.

Lisäksi kuoppalevylle pipetoitiin seuraavat kontrollit:

- Puhdas kasvatusliemi (TSB/OGYE, 300 µl)

- Kasvatusliemi (TSB/OGYE, 295 µl) ja uute/puhdasaineliuos (7,5 µl)

- Kasvatusliemi (TSB/OGYE, 225 µl) ja mikrobisuspensio (75 µl)

- Kasvatusliemi (TSB/OGYE, 220 µl), mikrobisuspensio (75 µl) ja liuotin (80 % EtOH /

DMSO, 7,5 µl)

Taulukko 2. Sipulien fenolien tai puhdasaineiden lopulliset pitoisuudet antimikrobisuuskokeiden

aikana (μg/ml).

YHDISTE PITOISUUS KUOPASSA μg/ml

L. monocytogenes ja S. infantis C. albicans

Sipulin polyfenolit: kelta-,

puna-, salotti- ja

banaansalottisipuli

123, 246, 369 15, 18, 25, 32, 44, 59

Sipulin polyfenolit: valkosipuli 98, 197, 295 -

Sipulin polyfenolit: purjo 184 -

Kversetiini-4’-glukosidi 25, 49, 98, 148, 197, 246 25, 49, 74, 98, 123

Kversetiini-4’-glukosidi +

kversetiini-3,4’-di-O-glukosidi

25, 49, 74, 98, 123 25, 49, 74, 98, 123

36

Kasvun inhibition määrittämiseksi bakteereja inkuboitiin kuoppalevyllä Bioscreen C -

laitteessa + 37 °C:ssa ja hiivaa + 30 °C:ssa 24 h. Laite mittasi absorbanssin 15 min välein

420-580 nm:n laajalla suodattimella. Laite ravisteli bakteerikasvatuksia 10 s ennen mittauksia,

hiivaa kasvoi jatkuvassa ravistelussa.

Bakteerikokeissa uutteiden ja puhdasaineiden inhibitiotehokkuuden selvittämiseksi

määritettiin kuopissa tapahtunut absorbanssin muutos vähentämällä lähtötilanteen

absorbanssiarvo absorbanssiarvosta 24 h:n kokeen lopussa. Tällöin arvosta vähenivät

kasvatusliemen, alkuperäisten solujen ja uutteen vaikutus. Absorbanssin muutos on suoraan

verrannollinen mikrobien kasvuun. Rinnakkaisten kuoppien absorbanssin muutoksista

laskettiin keskiarvo. Kasvuprosentin laskemiseksi fenolisille yhdisteille altistettujen

bakteerikasvatusten keskimääräinen absorbanssin muutos jaettiin liuotinkontrollikasvatusten

keskimääräisellä absrobanssin muutoksella, jonka katsottiin edustavan 100-prosenttista

kasvua. Inhibitioprosentit laskettiin edelleen vähentämällä kasvuprosentti 100 prosentista.

Bakteerien kasvu määritettiin kokonaan estyneeksi, kun inhibitioprosentti oli yli 90

(Väkeväinen 2010).

Hiivan kasvua tarkasteltiin kasvukäyrien avulla. Absorbanssissa tapahtuneet muutokset

laskettiin edellä kuvatun mukaisesti jokaiselle mittauspisteelle. Rinnakkaisten kuoppien

keskimääräisen absorbanssin muutoksen perusteella piirrettiin 24 h:n kasvukäyrät, joista

nähtiin hiivasolujen kasvussa uute- ja puhdasainealtistuksen jälkeen tapahtuneet muutokset

liuotinkontrollikasvatuksiin verrattuna. Myös hiivalla kasvun katsottiin estyneen, kun solujen

määrä kokeen lopussa oli korkeintaan 10 % liuotinkontrollisolujen määrästä.

37

4. TULOKSET

4.1 Sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet

Uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet vaihtelivat välillä 7,5˗30 mg/ml ja grammasta tuoretta

sipulimateriaalia saatiin etyyliasetaatilla uutettua 0,01-0,09 mg fenolisia yhdisteitä. Uuttoihin

käytetyt sipulimäärät, uutteiden fenolipitoisuudet ja sipulien fenolipitoisuudet milligrammoina

grammaa tuorepainoa kohti on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3. Antimikrobisuuskokeisiin valmistettuihin sipuliuutteisiin käytetyt sipulimäärät, uutteiden

Folin-Ciocalteu-menetelmällä määritetyt kokonaisfenolipitoisuudet ja sipulien fenolipitoisuudet

tuorepainoon suhteutettuna.

Sipuli Uuttoon käytetty

sipulimäärä (g)

Uutteen fenolipitoisuus

(mg/ml)

Sipulin fenolipitoisuus

(mg/g tuorepainoa)

Keltasipuli 360 30 0,08

Punasipuli 360 33 0,09

Salottisipuli 360 22 0,06

Banaanisalottisipuli 330 24 0,07

Valkosipuli 360 12 0,02

Purjo 360 5 0,01

4.2 Sipuliuutteiden antibakteerisuus

Bioscreen-kokeissa bakteerien kasvussa havaittiin selvä annosvaste kelta-, puna-, salotti- ja

banaanisalottisipulista uutetuille fenolisille yhdisteille: uutteen kokonaisfenolipitoisuuden

kasvaessa myös uutteen kyky hidastaa bakteerien kasvua parani. Kuvassa 10 on esitetty

bakteerikohtaiset inhibitioprosentit kullekin uutteelle ja kokonaisfenolipitoisuudelle.

Punasipuliuute ehkäisi tehokkaimmin sekä L. monocytogenes että S. infantis -bakteerin

kasvua. Punasipuliuute, jonka kokonaisfenolipitoisuus oli 15 mg/ml, esti L. monocytogenes -

bakteerin kasvun lähes täysin. S. infantis -bakteerilla absorbanssi oli kokeen lopussa

alhaisempi kuin kokeen alussa, kun bakteerit altistettiin punasipuliuutteille, joiden

kokonaisfenolipitoisuus oli 15 tai 10 mg/ml; inhibitioprosentteina ilmaistuna S. infantis -

bakteerin kasvu siis ehkäistyi yli 100-prosenttisesti. Punasipuliuutteen

kokonaisfenolipitoisuudet 10 ja 5 mg/ml hidastivat L. monocytogenes -bakteerin kasvua

selvästi, ja pitoisuus 5 mg/ml inhiboi S. infantis -bakteerin kasvusta yli 60 %. Keltasipuli- ja

banaanisalottisipuliuutteet ehkäisivät kaikilla kokonaisfenolipitoisuuksilla S. infantis -

bakteerin kasvua L. monocytogenes -bakteerin kasvua tehokkaammin, ja S. infantis oli selvästi

L. monocytogenes -bakteeria herkempi banaanisalottisipuliuutteelle. Sen sijaan L.

monocytogenes -bakteerin kasvu reagoi voimakkaammin salottisipuliuutteisiin, joskin pienin

38

kokonaisfenolipitoisuus, 5 mg/ml, hillitsi hieman tehokkaammin S. infantis -bakteerin kuin L.

monocytogenes -bakteerin kasvua.

A

B

Kuva 10. Sipuliuutteiden antibakteerisuus inhibitioprosentteina (keskiarvo ± keskihajonta) 24 h:n

altistuksen jälkeen suhteutettuna liuotinkontrolliin (80% EtOH) A) L. monocytogenes ja B) S. infantis

-bakteereille. PS= punasipuli, KS = keltasipuli, BS = banaanisalottisipuli, SS = salottisipuli.

39

Myös valkosipuli ja purjouutteet näyttivät hidastavan tehokkaasti bakteerien kasvua

(mittaustuloksia ei näytetä). Valkosipulin ja purjon alhaiset fenolipitoisuudet ja uutteiden

sakkautuminen kasvatusliemessä kuitenkin heikensivät antimikrobisuuskokeiden tulosten

vertailukelpoisuutta ja vaikeuttivat inhibitiovaikutusten luotettavaa tulkintaa.

4.3 Puhdasaineiden antibakteerisuus

Bakteerien kasvussa ei havaittu mainittavaa johdonmukaista muutosta kversetiini-4’-

glukosidille tai kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin yhdistelmälle

altistumisen jälkeen testatuilla pitoisuuksilla (mittaustuloksia ei näytetä). L. monocytogenes -

bakteerilla kasvu estyi kversetiini-4’-glukosidilla maksimissaan 12-prosenttisesti ja S. infantis

-bakteerilla 8-prosenttisesti, mutta keskihajonnat kokeissa olivat suuria. Yhdisteiden

yhdistelmällä ei käytännössä ollut vaikutusta bakteerien kasvuun.

4.4 Sipuliuutteiden antifungaalisuus

Sipuliuutteilla oli selvä vaikutus C. albicans -hiivan kasvuun. C. albicans -hiivan kasvun

alkuvaihe hidastui huomattavasti aina, kun solut altistettiin sipuliuutteille. Kelta- ja

punasipuliuutteet, joiden kokonaisfenolipitoisuus oli vähintään 2,4 mg/ml estivät täysin

hiivasolujen kasvun, ja kelta-, salotti- ja banaanisalottisipuliuutteissa kasvun esto tapahtui jo

kokonaisfenolipitoisuudella 1,8 mg/ml. Sipuliuutteille altistettujen hiivasolujen kasvussa ei

kuitenkaan havaittu selkeää annosvastetta kokonaisfenolipitoisuuksille, jotka olivat alle 1,8

mg/ml. Sipuliuutteilla, joiden kokonaisfenolipitoisuus oli korkeintaan 1,3 mg/ml, havaittiin

erittäin vaihtelevia hiivasolujen kasvua ehkäiseviä vaikutuksia. Taulukossa 4 on esitetty

inhibitioprosentit sipuliuutelaimennoksille, joiden kokonaisfenolipitoisuus on 0,6 ja 1,8

mg/ml.

Taulukko 4. Sipuliuutteiden C. albicans -hiivasolujen kasvua ehkäisevä vaikutus 24 h:n altistuksen

jälkeen, kun uutteen kokonaisfenolipitoisuus on 0,6 tai 1,8 mg/ml. Tulokset on suhteutettu

liuotinkontrolliin (80 % EtOH) ja esitetty inhibitioprosentteina (keskiarvo ± keskihajonta).

KASVUA EHKÄISEVÄ VAIKUTUS (%)

SIPULI Fenolipitoisuus 0,6 mg/ml Fenolipitoisuus 1,8 mg/ml

Keltasipuli 23 ± 23 98 ± 1

Punasipuli 76 ± 24 85 ± 9

Salottisipuli 67 ± 27 101 ± 1

Banaanisalottisipuli 20 ± 9 101 ± 1

40

Banaanisalottisipuliuutteelle altistettujen hiivasolujen kasvu kuitenkin noudatteli keskimäärin

uutelaimennosten kokonaisfenolipitoisuuksia: banaanisalottisipuliuute, jonka

kokonaisfenolipitoisuus oli suurin (2,4 mg/ml) ehkäisi kasvua tehokkaimmin ja uute, jonka

kokonaisfenolipitoisuus oli pienin (0,6 mg/ml) vastaavasti heikoimmin. Kuvassa 11 on

esitetty banaanisalottisipuliuutteiden vaikutus C. albicans -hiivan kasvuun. Kasvukäyrät on

piirretty absorbanssissa tapahtuneen muutoksen perusteella siten, että lähtötasoksi on asetettu

0. Absorbanssin muutos on laskettu vähentämällä jokaisen mittauspisteen absorbanssiarvosta

kokeen alussa mitattu lähtöabsorbanssi, jolloin arvosta vähenivät kasvatusliemen,

alkuperäisten solujen ja uutteen vaikutus.

Kuva 11. Muutokset C. albicans -hiivan kasvussa 24 h:n aikana, kun solut on

altistettu banaanisalottisipulista uutetuille fenolisille yhdisteille. Uutteiden

kokonaisfenolipitoisuudet vaihtelivat välillä 0,6-1,8 mg/ml.

Hiivasolujen kasvusta estyi 24 h:n kokeen aikana liuotinkontrolliin verrattuna

punasipuliuutteella vähintään 40 %, salottisipuliuutteella 37 %, banaanisalottisipuliuutteella 9

% ja keltasipuliuutteella 2 %. Sipuliuutteista punasipuliuute siis ehkäisi varmimmin

hiivasolujen kasvua myös pienimmällä testatulla uutteen kokonaisfenolipitoisuudella (0,6

mg/ml).

4.5 Puhdasaineiden antifungaalisuus

Kversetiini-4’-glukosidi hidasti C. albicansin kasvun alkuvaihetta kaikilla testatuilla

pitoisuuksilla. 24 h:n aikana solujen määrä kasvatusliemessä kuitenkin saavutti ja jopa ylitti

41

kontrollisolujen määrän. Kuvassa 12 on esitetty kversetiini-4’-glukosidin keskimääräinen

vaikutus C. albicans -kasvatusten absorbanssiin.

Kuva 12. Kversetiini-4’-glukosidille altistettujen C. albicans -hiivasolujen

kasvukäyrät 24 h:n ajalta absorbanssin muutoksen avulla esitettynä. Kversetiini-4’-

glukosidi-liuosten kokonaisfenolipitoisuus vaihteli välillä 1-5 mg/ml.

Kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin yhteisvaikutus C. albicans -

hiivan kasvuun oli selvempi kuin pelkän kversetiini-4’-glukosidin, ja kaikki testatut

pitoisuudet ehkäisivät solujen kasvua kontrolliin verrattuna. Tulokset olivat kuitenkin

vaihtelevia. Keskimäärinkin suurin testattu kversetiinipitoisuus hidasti solujen kasvua kokeen

loppuun mennessä parhaiten, mutta muilla pitoisuuksilla hiivasolujen kasvun hidastumisessa

ei havaittu annosvastetta, kun tarkasteltiin koko 24 h:n mittausaikaa (kuva 13). Yllättäen

kasvun alkuvaihe hidastui sitä enemmän, mitä pienemmälle kversetiinipitoisuudelle hiivasolut

oli altistettu, mutta solumäärät eri kversetiinipitoisuuksissa tasoittuivat kokeen loppuun

mennessä. Suurimalle käytetylle yhdistepitoisuudelle altistettujen solujen määrä jäi kuitenkin

selvästi alhaisimmaksi.

42

Kuva 13. Kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin

yhteisvaikutus C. albicans -hiivasolujen kasvuun 24 h:n aikana. Tulokset on esitetty

absorbanssin muutoksena, joka on suoraan verrannollinen hiivasolujen kasvuun.

Yhdisteiden kokonaispitoisuus kantaliuoksissa vaihteli välillä 1-5 mg/ml.

43

5. POHDINTA

Pro gradu -tutkielman tarkoituksena oli selvittää eri sipulimateriaaleista uutettujen fenolisten

yhdisteiden elintarvikepatogeenien kasvua ehkäiseviä vaikutuksia ja siten yhdisteiden

potentiaalia toimia esimerkiksi elintarvikkeiden säilyvyyttä edistävinä komponentteina.

Sipulien polyfenolien antimikrobisuudesta on olemassa paljon tutkimustietoa, mutta tulosten

vertailu ja selkeiden johtopäätösten tekeminen niiden perusteella on melko haasteellista

vaihtelevien tutkimusmenetelmien vuoksi. Perinteisimmät antimikrobisuuskokeet pohjautuvat

mielenkiinnon kohteena olevien aineiden diffuusioon joko kiekosta tai kaivosta kiinteään

kasvatusalustaan, jolla tutkittavat mikrobit kasvavat: kiekon tai kaivon ympärille muodostuu

niin sanottu inhibitiokehä, jonka koko kertoo yhdisteen mahdollisesta antimikrobisuudesta.

Tässä tutkimuksessa gram-positiivisen Listeria monocytogenes -bakteerin, gram-negatiivisen

Salmonella infantis -bakteerin ja eukaryoottisen Candida albicans -hiivan kasvun

inhiboitumisen määrittämiseksi käytettiin nestekasvatusten sameuden automaattiseen,

säännölliseen mittaamiseen perustuvaa menetelmää, jonka avulla saatiin tietoa mikrobisolujen

kasvun muutoksista koko altistusajalta reaaliaikaisesti. Vastaavaa menetelmää ei ole juurikaan

käytetty aiemmin sipuliuutteiden antimikrobisuuden selvittämisessä.

5.1 Erilaiset mikrobit ovat osoittaneet vaihtelevaa resistenttiyttä

sipuliuutteille ja fenolisille yhdisteille

Gram-postiiviset bakteerit, erityisesti listeriat, ovat aiemmissa tutkimuksissa osoittaneet

huonoa vastustuskykyä sipulista valmistetuille polyfenolipitoisille raakauutteille (Rauha ym.

2000; Santas ym. 2010). Santas ryhmineen (2010) testasi hopea- ja keltasipulista uutettujen

polyfenolien antimikrobisia vaikutuksia useilla mikrobeilla ja totesi, että gram-negatiivisiin

bakteereihin uutteilla ei ollut kasvua ehkäisevää vaikutusta, mutta että uutteet inhiboivat lähes

kaikkia testattuja gram-positiivisia bakteereja. Heidän tutkimuksessaan gram-positiivinen L.

monocytogenes osoittautui kaikkein herkimmäksi kuoppalevykokeessa, jossa bakteerit

altistettiin agarin joukkoon lisätyille sipuliuutteille. Pro gradu -tutkimuksessa gram-

negatiivinen S. infantis osoittautui yllättäen hieman gram-positiivista L. monocytogenes -

bakteeria herkemmäksi useimmille eri sipulilajikkeista valmistetuille polyfenolipitoisille

raakauutteille. Ainoastaan salottisipuliuute ehkäisi tehokkaammin L. monocytogenes -

bakteerin kuin S. infantis -bakteerin kasvua.

44

Flavonoideihin kuuluva flavonoli kversetiini on sipulin runsain polyfenolinen yhdiste, joka

esiintyy sipulissa yleensä glykosidisessa muodossa, joko kversetiini-4’-glukosidina tai

kversetiini-3,4’-di-O-glukosidina (Bonaccorsi ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008). Tästä

johtuen pro gradu -tutkimuksessa testattiin sekä pelkän kversetiini-4’-glukosidin että

kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin yhdistelmän vaikutusta

elintarvikepatogeenien kasvuun. Kversetiini-4’-glukosidi tai kahden kversetiiniglykosidin

yhdistelmä ei käytännössä ehkäissyt kummankaan bakteerin kasvua tai havaittu kasvun

heikkeneminen oli vähäistä. Yksittäisillä polyfenolisilla yhdisteillä tai niiden johdannaisilla,

esimerkiksi juuri glykosideilla, on havaittu eri tutkimuksissa hyvin vaihtelevia antimikrobisia

ominaisuuksia, jotka riippuvat sekä yhdisteen että altistetun bakteerin ominaisuuksista. Gram-

positiiviset bakteerit ovat useissa tutkimuksissa osoittautuneet gram-negatiivisia bakteereita

herkemmiksi uutteiden lisäksi polyfenolisille puhdasaineille (Rauha ym. 2000; Taguri ym.

2004; Santas ym. 2010), mutta myös gram-positiivisten bakteerien resistenttiydessä

esimerkiksi flavonoideille on eroja (Xu & Lee 2001). Flavonoidiglykosidit ovat yleisesti

ottaen osoittaneet vain heikkoa antimikrobisuutta (Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000;

Xu & Lee 2001). Kversetiini-aglykonin ja sen isomeerin moriinin sen sijaan tiedetään olevan

antibakteerisia tiettyjä lajeja kohtaan (Rauha ym. 2000; Corrales ym. 2010; Santas ym. 2010).

Eukaryoottiset mikrobit, esimerkiksi hiiva C. albicans, ovat useissa tutkimuksissa osoittaneet

hyvää resistenssiä sipulista ja muista kasveista valmistetuille polyfenoliuutteille

kiekkodiffuusiokokeissa (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010). C. albicans -hiivan osalta tässä

tutkimuksessa saadut tulokset poikkeavat hieman aiemmista, sillä hiivasolujen kasvu

inhiboitui erittäin tehokkaasti, kun ne altistettiin sipuliuutteille. Lisäksi C. albicans -hiivan

kasvun estävät uutteiden kokonaisfenolipitoisuudet olivat pieniä verrattuna bakteerien kasvun

inhiboitumiseen vaadittaviin pitoisuuksiin. Puhdasaineiden osalta C. albicans -hiivalla

tehtyjen altistuskokeiden tulokset puolestaan tukivat aiemmin tehtyjä havaintoja. Kversetiini-

4’-glukosidi ja kversetiiniglykosidien yhdistelmä eivät estäneet C. albicans -hiivan kasvua,

joskin solujen kasvun alkuvaihe hidastui huomattavasti kontrollisoluihin verrattuna.

Aiemmissakaan tutkimuksissa kversetiinillä tai sen glykosideilla ei ole saatu hidastettua C.

albicans -hiivan kasvua (Rauha ym. 2000; Santas ym. 2010).

45

5.2 Sipulien polyfenoliprofiilit vaihtelevat ja vaikuttavat sipuliuutteiden

antimikrobiseen aktiivisuuteen

Sipulista on tunnistettu kversetiini-4’-glukosidin ja kversetiini-3,4’-di-O-glukosidin ohella

pääasiassa viittä muuta flavonolia: kversetiini-3,7,4’-triglukosidia, kversetiini-7,4’-

diklukosidia, isoramnetiini-3,4’-glukosidia, kversetiini-3’-glukosidia ja isoramnetiini-4’-

glukosidia (Bonaccorsi ym. 2008; Soininen ym. 2012). Lisäksi sipulissa on havaittu pieniä

määriä muita kversetiini- ja isoramnetiinijohdannaisia, kemferolia ja myrisetiiniä sekä niiden

johdannaisia, dihydroflavonoli taksifoliinin johdannaisia sekä lähinnä punasipulissa esiintyviä

antosyaaneja (Slimestad ym. 2007). Polyhydroksyloidut flavonoidit, kuten kversetiini,

kemferoli ja myrisetiini, ovat osoittaneet antimikrobista aktiivisuutta (Xu & Lee 2001).

Sipulilajikkeissa, jotka on jalostettu pitkäaikaiseen säilytykseen, näyttäisi olevan erityisen

paljon kversetiini-3,7,4’-triglukosidia ja isoramnetiini-3,4’-diglukosidia (Bonaccorsi ym.

2008). Tämä saattaisi viitata siihen, että kversetiini-3,7,3’-triglukosidi ja isoramnetiini-3,4’-

diglukosidi liittyisivät sipulin säilyvyyteen ja siten myös mahdollisesti osallistuisivat mikro-

organismien kasvun estymiseen.

Allium cepa -lajikkeiden kemialliset koostumukset tunnetusti poikkeavat merkittävästi

toisistaan esimerkiksi juuri kokonaisfenolipitoisuuden ja kversetiinin eri muotojen osalta

(Yang ym. 2004; Bonaccorsi ym. 2008; Rodríguez Galdón ym. 2008). Geenien osuuden

sipulin polyfenoliprofiilin määräytymisessä uskotaan olevan merkittävä, mutta myös

ympäristöllä, esimerkiksi kasvupaikalla ja sillä vallitsevalla ilmastolla, sipulin

kypsyysasteella, sadonkorjuuajankohdalla ja jopa siementen alkuperällä uskotaan olevan

vaikutusta (Yang ym. 2004; Rodríguez Galdón ym. 2008). Ennen pro gradu -työtä tehdyissä

koeuutoissa havaittiin, että sipuliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet olivat hyvinkin

poikkeavia verrattuna antimikrobisuuskokeissa käytettyihin lopullisiin uutteisiin; erot

saattavat selittyä koeuuttojen sipulimateriaalin ostoajankohdalla, alkuperämailla ja

varastointiajoilla.

Pro gradu -työssä punasipuli osoittautui tehokkaimmaksi bakteerien kasvun ehkäisijäksi,

keltasipuli toiseksi tehokkaimmaksi. Punasipuli sisältää paljon flavonoideja ja niiden

glykosideja verrattuna moniin muihin Allium cepa -sipuleihin (Yang ym. 2004; Slimestad ym.

2007; Bonaccorsi ym. 2008). Joissakin tutkimuksissa punasipulin on todettu sisältävän

moninkertaisesti muun muassa myrisetiiniä verrattuna keltasipuliin (Franke ym. 2004;

46

Slimestad ym. 2007). Myrisetiinillä on saatu ehkäistyä sekä gram-positiivisten että gram-

negatiivisten bakteerien kasvua (Xu & Lee 2001). Lisäksi punasipulissa on muista

sipulilajikkeista poiketen muun muassa proantosyanidiineja, joiden tiedetään olevan

antibakteerisia ja antifungaalisia (Scalbert 1991; Bahorun ym. 2004; Slimestad ym. 2007;

Kylli ym. 2011; Patel ym. 2011). Keltasipulilajikkeiden kokonaisfenolipitoisuudet ovat usein

suurempia kuin esimerkiksi hopeasipulilajikkeiden, mutta pienempiä kuin salottisipulin ja

punasipulin (Yang ym. 2004; Santas ym. 2010). Flavonoideja tietyissä keltasipulilajikkeissa

on havaittu olevan kokonaisuudessaan salottisipulia enemmän (Yang ym. 2004).

Keltasipulilajikkeiden sijoittuminen lajikkeiden välisissä kokonaisfenoli- ja

flavonoidipitoisuusvertailussa on kuitenkin hyvin vaihtelevaa, sillä keltasipulilajikkeiden

polyfenoliprofiileissa on eroja (Yang ym. 2004).

Myös antifungaalisuuskokeissa punasipuliuute ehkäisi varmimmin hiivasolujen kasvua, mutta

toisin kuin bakteerikokeissa, salottisipuli vaikutti hiivakokeissa antimikrobiselta teholtaan

keltasipulia varmemmalta myös pienimmällä testatulla kokonaisfenolipitoisuudella.

Salottisipulista puristetun raakamehun on jo aikaisemmin todettu olevan antifungaalista (Zarei

Mahmoudabadi & Gharib Nasery 2009). C. albicans on eukaryootti, jonka soluseinän rakenne

poikkeaa bakteerisolujen soluseinän rakenteesta. Näistä syistä lienee luonnollista, että samat

fytokemikaalit vaikuttavat bakteereihin ja hiivoihin eri tavoin. Yleisesti ottaen vaikuttaisi

siltä, että kasviuutteiden polyfenolien kvalitatiiviset ominaisuudet ja esimerkiksi

molekyylikoot ovat antimikrobisuustehon kannalta merkittävämpiä kuin

kokonaisfenolipitoisuus (Apostolidis ym. 2008; Patel ym. 2011). Pro gradu -työssä hiivan

kasvun inhiboitumiseen tarvittavat polyfenolipitoisuudet olivat huomattavasti pienempiä kuin

bakteereiden kasvun estävät vähimmäiskonsentraatiot. Tämä voisi viitata siihen, että

tutkimuksessa käytettyjen etyyliasetaattiuutteiden polyfenoliprofiilit suosivat vallitsevissa

koeolosuhteissa erityisen hyvin juuri hiivojen kasvun kontrollointia. Viinirypäleistä uutetuilla

polyfenoleilla tehtyjen antifungaalisuuskokeiden yhteydessä on pohdittu esimerkiksi tiettyjen

torjunta-ainejäämien mahdollista tehostavaa osuutta kasviuutteiden sienten kasvua

ehkäisevään aktiivisuuteen, jota ei antibakteerisuuskokeissa havaittu (Corrales ym. 2010).

Hiivasoluilla voisikin olla kiinnostavaa testata esimerkiksi luomusipulista ja tehotuotetusta

sipulista valmistettujen kuoriuutteiden välisiä inhibitorisia bioaktiivisuuseroja.

Salottisipulin on lajikevertailuissa todettu sisältävän runsaimmin fenolisia yhdisteitä (Yang

ym. 2004) ja sipulin pääasiallisia flavonoideja (Bonaccorsi ym. 2008). Banaanisalottisipuli

kuuluu nykyluokittelun mukaan salottisipulin tapaan Allium cepa -lajin ryvässipulien

47

(Aggregatum) ryhmään (Voipio 2001; Nemeth & Piskula 2007; Thompson & Morgan,

http://www.thompson-morgan.com/vegetables/vegetable-seeds/onion-and-leek-seeds/shallot-

banana/376TM), mutta banaanisalottisipulista ja sen sekundaarimetaboliiteista on saatavana

vain vähän spesifistä tutkimustietoa. Pro gradu -työssä banaanisalottisipulista ja

salottisipulista kokonaisfenolipitoisuusmittauksissa ja antimikrobisuuskokeissa saadut

tulokset osoittavat, että banaanisalottisipuli sekä sisältää enemmän fenoliyhdisteitä että on

tehokkaampi gram-negatiivisen S. infantis -bakteerin kasvun ehkäisyssä kuin ”perinteinen”

salottisipuli. Banaanisalottisipuli ja salottisipuli ehkäisivät kuitenkin aavistuksen puna- ja

keltasipulia heikommin bakteerien kasvua. Koska salottisipuli sisältää aiempien tutkimusten

mukaan muihin sipulilajikkeisiin verrattuna runsaasti kversetiini-4’-glukosidia ja kversetiini-

3,4’-di-O-glukosidia, sipulin pääasiallisia flavonoideja, voidaan ehkä päätellä, että ainakaan

nämä kaksi kversetiinin glykosidimuotoa eivät ole tärkeimpiä sipuliuutteiden fenolisten

yhdisteiden antibakteerisuutta selittäviä komponentteja. Myrisetiinin, antosyaanien ja

proantosyanidiinien mahdollinen osallisuus erityisesti punasipuliuutteen hyvään

antimikrobiseen tehoon herättää mielenkiintoa.

5.3 Fenolisten yhdisteiden antimikrobisuuden mekanismit

Fenolisten yhdisteiden ja flavonoidien antimikrobisuuden taustalla vaikuttavista

mekanismeista on esitetty lukuisia teorioita. On selvää, että mikrobi- ja muiden solujen

herkkyys fenolisille yhdisteille riippuu sekä yhdisteen että solun ominaisuuksista, ja jo pienet

erot yhdisteiden rakenteessa saattavat vaikuttaa niiden aktiivisuuteen (Cowan 1999; Spencer

ym. 2004; Taguri ym. 2004). Monien tutkimusten yhteydessä on todettu, että flavonoidin

fenoliryhmän hydroksylaatioaste ja hydroksyyliryhmien sijainti näyttäisivät melko

johdonmukaisesti liittyvän flavonoidien kykyyn ehkäistä mikrobien kasvua: mitä

hydroksyloituneempi yhdiste on, sitä tehokkaammin se toimii antimikrobisena komponenttina

(Nishino ym. 1987; Cowan ym. 1999; Xu & Lee 2001). Polyfenolin hydrofobisuus puolestaan

voi helpottaa proteiini-polyfenoli-kompleksien muodostumista ja fenolien antimikrobista

aktiivisuutta mikrobin solukalvolla (Richard ym. 2006; Apostolidis ym. 2008; Yu ym. 2011).

Kversetiinillä C-renkaan kaksoissidos saattaa lisäksi olla tärkeä yhdisteen antibakteeriselle

aktiivisuudelle (Xu & Lee 2001). Isoramnetiinin esimerkiksi NADPH-oksidaasi-entsyymin

toimintaa inhiboiva aktiivisuus on yhdistetty yhdisteen metyyliryhmään (Steffen ym. 2008),

joten metylaatio saattaa vaikuttaa myös molekyylin muihin bioaktiivisuuksiin, kuten

antimikrobisuuteen. Flavonoidien bioaktiiviset muodot voivat myös olla absorption

yhteydessä muodostuneita metaboliitteja tai konjugaatteja, jotka poikkeavat kasveissa

48

esiintyvistä luonnollisista muodoista, myös toiminnaltaan (Spencer ym. 2004). Esimerkiksi

kversetiinin ja muiden flavonoidien hapettumistuotteet ovat osoittaneet antimikrobisia

ominaisuuksia, mikä voi olla seurausta muun muassa toksisten kinonimuotojen

muodostumisesta (Cowan 1999; Spencer ym. 2004; Ramos ym. 2006). Flavonoidien ja

flavan-3-olijohdannaisten mahdollisia vaikutuskohteita mikrobisoluissa ovat entsyymit,

solukalvo, soluseinän ja soluliman proteiinit ja DNA (Nishino ym. 1987; Cowan 1999; Xu &

Lee 2001; Spencer ym. 2004; Apostolidis ym. 2008; Patel ym. 2011). Flavonoidit ja niiden

johdannaiset voivat mahdollisesti vaikuttaa solunsisäisiin signaalireitteihin, proteiinien ja

soluseinän synteesiin ja hajotukseen sekä aiheuttaa raudanpuutosta ja reagoida solun

komponenttien tioliryhmien kanssa (Scalbert 1991; Cowan 1999; Spencer ym. 2004; Kylli

ym. 2011).

5.4 Pro gradu -tutkimuksen menetelmät ja niiden haasteet

Tulkittaessa pro gradu -työn tuloksia ja vertailtaessa niitä aiempiin tutkimustuloksiin, on

otettava huomioon, että kasvatusolosuhteilla, joissa tutkittavat mikrobit altistetaan

raakauutteille ja puhdasaineille, voi olla huomattava merkitys saatuihin

antimikrobisuustuloksiin (Taguri ym. 2004; Apostolidis ym. 2008; Santas ym. 2010; Kyung

2011). Flavonoidimetaboliittien solutason vaikutukset ovat lopulta riippuvaisia solukontaktin

laajuudesta, ja kasvumediumin komponentit, esimerkiksi transitiometallit, voivat osallistua

muun muassa kversetiinin kaltaisten dihydroksyloitujen flavonoidien metaboloitumiseen ja

siten muokata niiden aktiivisuutta ja pienentää vaikuttavaa konsentraatiota (Spencer ym.

2004). Tässä tutkimuksessa mikrobit altistettiin sipulista uutetuille polyfenoleille ja

puhdasaineille nestekasvatuksessa jatkuvassa tai säännöllisessä ravistelussa, jolloin solujen

kontaktin tutkittavien yhdisteiden kanssa voisi olettaa olevan hyvä. Tutkimuksessa valmistetut

raakauutteet osoittivatkin hyvää antimikrobista tehoa sekä gram-positiivisia ja gram-

negatiivisia bakteereita että hiivasoluja vastaan. Bioscreen C -laite ja vastaavat

turbidometriaan perustuvat laitteet mittavat kasvatusliemestä sekä elävät että kuolleet solut

(Raynolds & Farinha 2005). Esimerkiksi punasipuliuutealtistuksessa havaittu yli sadan

prosentin inhibitio voi selittyä S. infantis -solujen uutteen sisältämien polyfenolien

aiheuttamalla aggregoitumisella (Cushnie & Lamb 2005), jonka seurauksena kasvatusliemen

sameus on vähentynyt. Myös solujen hajotessa kasvatusliemen absorbanssi voi muuttua (Prior

ym. 1975). Sipulin flavonoidit ovat pigmenttejä (Slimestad ym. 2007), ja värillisten

sipuliuutteiden aiheuttaman tausta-absorbanssin vuoksi koe- ja kontrollikuopista saadut

mittaustulokset eivät olleet suoraan verrannollisia keskenään, mikä vaikeutti tulosten

49

tulkintaa. Pro gradu -työssä käytetyllä uuttomenetelmällä saatiin valmistettua kerralla vain 1-2

ml uutetta, jonka polyfenolipitoisuus oli riittävän suuri antimikrobisuuskokeisiin. Tästä syystä

uuttoja oli tarpeen suorittaa useita. Eri uuttokerroilla valmistettujen uutteiden fysikaaliset

ominaisuudet vaihtelivat jonkin verran, ja siksi myös eri mittauskerroilta saatujen

antimikrobisuuskokeiden tuloksia oli haasteellista verrata. Valkosipuli- ja purjouutteet

vaahtosivat tai sakkasivat kasvatusliemessä, joko heti reagoidessaan liemen kanssa tai

myöhemmin mittauksen aikana, joten luotettavien mittaustulosten saaminen oli mahdotonta.

Valkosipuli- ja purjouutteiden reaktiot kasvatusliemessä saattavat johtua esimerkiksi

sipulimateriaalin sisältämistä saponiineista tai uutteissa epäpuhtautena olevista proteiineista.

Sipulimateriaalista irtoaa uuton yhteydessä vettä ja sen mukana mahdollisesti myös

vesiliukoisia molekyylejä, esimerkiksi proteiineja. Denaturoituneet proteiinit voivat

muodostaa ravistelun seurauksena vaahtoa (Cooper & Kennedy 2010). Saponiinit ovat

tunnetusti vesiliuoksissa vaahtoavia yhdisteitä (Khokhar & Apenten 2009).

Uuttomenetelmän valinta on polyfenolitutkimuksessa tärkeää, jos yhdisteiden määrä ja

aktiivisuus halutaan selvittää mahdollisimman tarkkaan (Santas ym. 2008). Uutettaessa kasvin

polyfenoleja on otettava huomioon yhdisteiden laaja kirjo kasvissa: kunkin fenoliyhdisteen

liukoisuus riippuu sen kemiallisesta muodosta ja vuorovaikutussuhteista esimerkiksi

makromolekyylien kanssa (Garcia-Salas ym. 2010). Myös kasvisolukko, josta yhdisteet

halutaan eristää, vaikuttaa siihen, millaisia liuottimia tai niiden yhdistelmiä kannattaa käyttää

(Pekić ym. 1998). Polyfenolien uutossa käytettyjä poolittomia orgaanisia liuottimia ovat

muun muassa metanoli, etanoli, propanoli, asetoni ja etyyliasetaatti, joita voidaan käyttää

myös seoksina toistensa tai voimakkaasti poolisen veden kanssa (Garcia-Salas ym. 2010).

Yleisellä tasolla orgaanisten liuottimien käytön huono puoli on menetelmän vaatima pitkä

käsittelyaika, jonka seurauksena uutetut polyfenolit voivat alkaa hajota (Garcia-Salas ym.

2010). Pro gradu -työssä käytettiin 60 minuutin uuttoaikaa, ja uutteet altistuivat vielä uuton

jälkeenkin valolle ja korkeille lämpötiloille, jotka voivat vaikuttaa uutteen koostumukseen.

Uuttomenetelmien monimuotoisuus tekee kirjallisuudessa raportoitujen kasviuutteista

mitattujen kokonaisfenolipitoisuuksien ja yksittäisten polyfenolien määrien vertailun

haastavaksi: käytetyn liuottimen ja käsittelyaikojen lisäksi myös esimerkiksi kasvimateriaali

ja sen käsittelytapa ennen uuttoa vaihtelevat, mikä vaikuttaa muun muassa yksikköön, jolla

kokonaisfenolipitoisuus ilmaistaan.

Mielenkiinnon kohteesta riippuen käytettävän liuottimen poolisuuden on siis oltava sellainen,

että se liuottaa joko mahdollisimman monen muotoisia polyfenoleja tai spesifisesti vain

50

tiettyjä fenolisia yhdisteitä. Etyyliasetaatti on monessa yhteydessä osoittautunut hyväksi

liuottimeksi uutettaessa polyfenoleja, erityisesti flavonoideja (Rauha ym. 2000; Singh ym.

2009; Santas ym. 2010). Etyyliasetaatti sopii siis hyvin myös sipulin polyfenolien

uuttamiseen, sillä flavonoidit ovat sipulin runsaimpia polyfenoleja (Slimestad ym. 2007). Pro

gradu -työtä edeltävässä uuttomenetelmien optimointivaiheessa vertailtiin eri liuottimien (100

% MeOH, 70% MeOH, 99,5% EtOAc) vaikutusta uutteiden kokonaisfenolipitoisuuteen ja

todettiin, että 99,5-prosenttisella etyyliasetaatilla saatiin keltasipuliuutteisiin suurimmat

kokonaisfenolipitoisuudet. Myös sipuliuutteiden antimikrobisuuden tiedetään aiempien

tutkimusten perusteella vaihtelevan riippuen uutossa käytetystä liuottimesta (Kyung 2011).

Heikosti polaarinen etyyliasetaatti uuttaa kasvimateriaalista tehokkaasti flavonoidien

hydrofobisia aglykonisia muotoja, jotka tunnetusti ovat antimikrobisuudeltaan glykosideja

parempia (Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). Tutkittaessa

nimenomaan polyfenolien antimikrobisia ominaisuuksia etyyliasetaattiuuton ongelma on, että

etyyliasetaatilla sipulista irtoaa myös muun muassa tiosulfinaattien transformaatiotuotteita,

joiden tiedetään olevan antimikrobisia (Kyung 2011).

5.5 Sipuliuutteiden polyfenolit ja muut antimikrobiset komponentit

toimivat synergistisesti

Antimikrobisuusnäkökulmasta tarkasteltuna etyyliasetaatti kuitenkin vaikuttaa hyvältä

liuotinvalinnalta, sillä etyyliasetaattiuutteiden teho mikrobien torjunnassa osoittautui erittäin

hyväksi. 99,5-prosenttisen etyyliasetaatin kaltaisella epäspesifisellä liuottimella

kasvimateriaalista valmistetut raakauutteet ovat aina useiden yhdisteryhmien seoksia, joissa

molekyylit saattavat toimia synergistisesti, vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Monissa

tutkimuksissa on havaittu, että yhdistämällä fenolisia yhdisteitä keskenään tai muiden

antimikrobisten kemikaalien kanssa, saadaan mikrobien kasvun inhiboitumista usein

tehostettua (Cowan 1999; Arima ym. 2002; Taguri ym. 2004; Ramos ym. 2006). Myös

elintarvikesäilöntäainesovelluksissa eri yhdisteiden seokset toimivat todennäköisesti

tehokkaammin kuin esimerkiksi yksittäiset polyfenolit (Apostolidis ym. 2008; Devi ym.

2008). Esimerkiksi L. monocytogenes -bakteerin kasvun inhiboitumista on saatu tehostettua

yhdistämällä oreganosta ja karpalosta uutettuja fenolisia yhdisteitä natriumlaktaattiin

(Apostolidis ym. 2008). Pro gradu -työn yhteydessä saadut tulokset vahvistavat aiempien

tutkimusten tuloksia puhtaiden kversetiiniglykosidien heikosta antimikrobisesta tehosta

(Waage & Hedin 1985; Rauha ym. 2000; Xu & Lee 2001). C. albicans -solujen kasvukäyrät

51

osoittavat, että hiivasolujen kasvun alkuvaihe hidastuu kversetiiniglykosidialtistuksessa,

mutta kasvu normalisoituu vuorokauden kuluttua lähes kontrollisolujen kasvun tasolle. Tätä

ilmiötä saattaa selittää esimerkiksi se, että mikro-organismit voivat kyetä metaboloimaan

flavonoidijohdannaisia (Spencer ym. 2004). Bakteerisolujen kasvuun puhdasaineilla ei ollut

mainittavaa vaikutusta. Kokonaisuudessaan tämä viittaa siihen, että mitä useammalle

antimikrobiselle komponentille solut altistetaan samanaikaisesti, sitä huonommin solujen

puolustusmekanismit kykenevät torjumaan yhdisteiden toksisia vaikutuksia. Lisäksi tässä

tutkimuksessa havaittu kversetiiniglykosidien huono antimikrobinen teho voi olla seurausta

yhdisteiden välisten synergististen reaktioiden puutteesta tai molekyylien tehon esimerkiksi

hapettumisesta johtuvasta heikkenemisestä vallitsevissa olosuhteissa (Spencer ym. 2004).

5.6 Tutkimuksen sovellusmahdollisuudet

Elintarviketeollisuus tuottaa ohellaan monenlaista kasviperäistä jätettä, jonka sisältämien

bioaktiivisten yhdisteiden hyödyntäminen edelleen muissa teollisuuden sovelluksissa tarjoaa

monia mahdollisuuksia. Sipulin teollisesta käsittelystä yli jäävä kuori- ja muu jätemateriaali

sisältää runsaasti esimerkiksi ravintokuitua, hivenaineita, terveysvaikutteisia rikkiyhdisteitä ja

myös polyfenoleja (Benítez ym. 2011). Sipulin uloin, kuiva kuori ja välittömästi sen alla

olevat mehevät kerrokset ovat erittäin hyviä fenolisten yhdisteiden lähteitä (Benítez ym.

2011). Pro gradu -työssä sipulin polyfenoliuutteilla saatuja hyviä antimikrobisuustuloksia

voitaisiin siis edelleen parantaa käyttämällä uuttoon sipulin sisimpien osien sijasta ulompia

kerroksia.

Sipulista valmistettujen raakauutteiden elintarvikesovelluksia ajatellen on otettava huomioon

uutteiden haju ja maku, jotka johtuvat luultavasti sipulin ominaisen aromin aikaan saavista S-

alk(en)yyli-L-kysteiini-S-oksidien hajoamistuotteista (Griffiths ym. 2002; Benítez ym. 2011).

Elintarvikkeissa, esimerkiksi joissakin lihavalmisteissa, joiden maustamiseen sipuli sopii,

sipuliuutteiden käyttäminen mikrobiperäisen pilaantumisen ehkäiseminen voisi olla

mahdollista. Sipulista ja valkosipulista valmistettujen jauheiden on todettu ehkäisevän

enterobakteerien kasvua sianlihassa (Park ym. 2008). Toisaalta ainakin tiosulfinaattien osalta

on havaittu, että molekyylien reaktiivisuus elintarvikkeen komponenttien kanssa rajoittaa

näiden yhdisteiden käyttöä elintarvikesäilöntäaineena (Kyung 2011). Tämä saattaa muodostaa

ongelman myös polyfenolien kohdalla, sillä esimerkiksi juuri liharuokien sisältämä proliini-

aminohappo ja sen prekursorit voivat mitätöidä polyfenolien antimikrobisen tehon

(Apostolidis ym. 2008). Lisäksi polyfenolin liukoisuusominaisuudet vaikuttanevat sen

52

käyttökelpoisuuteen elintarvikkeissa. Sipuliuutteiden säilöntäainesovellusten

jatkotutkimuksissa onkin siis olennaista testata uutteiden tehoa ja käyttäytymistä sekä

mikrobien kasvun inhiboitumiseen riittäviä polyfenolikonsentraatioita nestemäisten

mikrobikasvatusten lisäksi myös erilaisissa elintarvikkeissa ja tyypillisissä elintarvikkeiden

säilytyslämpötiloissa.

Pro gradu -tutkimuksen tulokset osoittavat, että sipulin terveysvaikutteisiksi tiedetyillä

polyfenolisilla yhdisteillä on myös elintarvikepatogeenien kasvua ehkäisevää aktiivisuutta.

Tämän työn tulokset vahvistavat aiempia tutkimustuloksia, joiden perusteella sipuliuutteen

polyfenolisten yhdisteiden synergistiset, mikrobien kasvua inhiboivat vaikutukset ovat

huomattavasti puhtaita sipulin polyfenoleita parempia. Tulokset kannustavat kehittämään

sipulin teollisen käsittelyn seurauksena muodostuvien kasvimateriaalin sivuvirtojen

hyödyntämistä paitsi lääke- ja kosmetiikkateollisuuden myös elintarviketeollisuuden

sovelluksissa.

53

LÄHTEET

Adão CR, da Silva BP & Parente JP, 2011. A new steroidal saponin with antiinflammatory and

antiulcerogenic properties from the bulbs of Allium ampeloprasum var. porrum. Fitoterapia 82:

1175-1180

Agarwal KC, 1996. Therapeutic actions of garlic constituents. Med Res Rev 16: 111-124

Ahmad I & Beg AZ, 2001. Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants

against multi-drug resistant human pathogens. J Ethnopharmacol 74: 113

Alcaráz LE, Blanco SE, Puig ON, Tomás F & Ferretti FH 2000. Antibacterial activity of flavonoids

against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. J Theor Biol 205: 231-240

Apostolidis E, Kwon Y-I & Shetty K, 2008. Inhibition of Listeria monocytogenes by oregano,

cranberry and sodium lactate combination in broth and cooked ground beef systems and likely

mode of action through proline metabolism. Int J Food Microbiol 128: 317-324

Arima H, Ashida H & Danno G, 2002. Rutin-enhanced antibacterial activities of flavonoids against

Bacillus cereus and Salmonella enteridis. Biosci Biotech Biochem 66: 1009-1014

Bahorun T, Luximon-Ramma A, Crozier A & Aruoma OI, 2004. Total phenol, flavonoid,

proanthocyanidin and vitamin C levels and antioxidant activities of Mauritanian vegetables. J

Sci Food Agric 84: 1553-1561

Barceloux DG, 2009. Potatoes, tomatoes, and solanine toxicity (Solanum tuberosum L., Solanum

lycopersicum L.). Medical toxicology of natural substances: foods, fungi, medicinal herbs, toxic

plants, and venomous animals, 1157 s. John Wiley & Sons Inc., Hoboken, USA

Bassman JH, 2004. Ecosystem consequences of enhanced solar ultraviolet radiation: secondary plant

metabolites as mediators of multiple trophic interactions in terrestrial plant communities.

Photochem Photobiol 79: 382-398

Benítez V, Mollá E, Martín-Cabrejas MA, Aguilera Y, López-Andréu FJ, Cools K, Terry LA &

Esteban RM, 2011. Characterization of industrial onion wastes (Allium cepa L.): Dietary fibre

and bioactive compounds. Plant Foods Hum Nutr 66: 48-57

Benkeblia N, Dahmouni S, Onodera S & Shiomi N, 2005. Antimicrobial activity of phenolic

compound extracts of various onions (Allium cepa L.) cultivars and garlic (Allium sativum L.). J

Food Technol 3: 30-34

Bernard FX, Sablé S, Cameron B, Provost J, Desnottes JF, Crouzet J & Blanche F, 1997. Glycosylated

flavones as selective inhibitors of topoisomerase IV. Antimicrob Agents Chemother 41: 992-

998

Beuchat LR, 1996. Listeria monocytogenes: incidence on vegetables. Food Control 7: 223-228

Bischoff SC, 2008. Quercetin: potentials in the prevention and therapy of disease. Curr Opin Clin Nutr

Metab Care 11: 733–740

Bonaccorsi P, Caristi C, Gargiulli C & Leuzzi U, 2008. Flavonol glucosides in Allium species: A

comparative study by means of HPLC-DAD-ESI-MS-MS. Food Chem 107: 1668-1673

54

Bonawitz ND, Soltau WL, Blatchley MR, Powers BL, Hurlock AK, Seals LA, Weng J-K, Stout J &

Chapple C 2012. REF4 and RFR1, subunits of the transcriptional coregulatory complex

mediator, are required for phenylpropanoid homeostasis in Arabidopsis. J Biol Chem 287:

5434–5445

Bornet FRJ, Brounsl F, Tashiro Y & Duvillier V, 2002. Nutritional aspects of short-chain

fructooligosaccharides: natural occurrence, chemistry, physiology and health implications. Dig

Liver Dis 34: S111-S120

Buck JD , Bubucis PM & Combs TJ, 1977. Occurrence of human-associated yeasts in bivalve shellfish

from Long Island Sound. Appl Environ Microbiol 33: 370-377

Buck JD & Bubucis PM, 1978. Membrane filter procedure for enumeration of Candida albicans in

natural waters. Appl Environ Microbiol 35: 237-242

Bugg TDH, Braddick D, Dowson CG & Roper DI 2011. Bacterial cell wall assembly: still an

attractive antibacterial target. Trends Biotechnol 29: 167-173

Casella S, Leonardi M, Melai B, Fratini F & Pistelli L, 2012. The role of diallyl sulfides and dipropyl

sulfides in the in vitro antimicrobial activity of the essential oil of garlic, Allium sativum L., and

leek, Allium porrum L. . Phytother Res DOI: 10.1002/ptr.4725

Cerdá B, Espín JC, Parra S, Martínez P & Tomás-Barberán FA, 2004. The potent in vitro antioxidant

ellagitannins from pomegranate juice are metabolized into bioavailable but poor antioxidant

hydroxyl-6H-dibenzopyran-6-one derivatives by the colonic microflora of healthy humans. Eur

J Nutr 43: 205-220

Chabot S, Bel-Rhild R, Chênevert R & Piché Y, 1992. Hyphal growth promotion in vitro of the VA

mycorrhizal fungus, Giaspora margarita Becker & Hall, by the activity of structurally specific

flavonoid compounds under CO2-enriched conditions. New Phytol 122: 461-467

Chanet A, Milenkovic D, Manach C, Mazur A & Morand C, 2012.Citrus flavanones: what is their role

in cardiovascular protection? J Agric Food Chem DOI: 10.1021/jf300669s

Chattaway FW, Holmes MR & Barlow AJE, 1967.Cell Wall Composition of the mycelial and

blastospore forms of Candida albicans. J Gen Microbiol 51: 367-376

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012a: Simple search: Quercetin:

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444051.html?rid=d91fc4f1-fac3-4f7e-adc8-

61fc76d8e5bb

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012b: Simple search: Kaempferol:

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444395.html?rid=a5b44378-a20b-42f2-8a71-

d75ca2a22b12

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012c: Simple search: Isorhamnetin:

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.4444973.html?rid=0b4fc8c6-811c-40a5-933e-

db4946706124

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012d: Simple search: Stilbene:

http://www.chemspider.com/Search.aspx?rid=36b67ba0-4520-4dad-ab6a-1565f8d501b4

55

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012e: Simple search: Salicylic acid:

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.331.html?rid=0d9f0a13-d6db-4e04-9f80-

b1d7bedf9564

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012f: Simple search: Coniferol:

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.1266063.html?rid=70a2b6df-fcc0-43f2-8c2f-

d800f7da3a08

ChemSpider, The free chemical database, 6.9.2012g: Simple search: Isoflavone:

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.65255.html?rid=b625df36-5b0f-48fc-a293-

ccdf0f8bb60e

Chung D-M, Chung Y-C, Maeng PJ & Chun H-K, 2011.Regioselective deglycosylation of onion

quercetin glucosides by Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Lett 33: 783-786

Cooper A & Kennedy MW, 2010. Biofoams and natural protein surfactants. Biophys Chem 151: 96-

104

Corrales M, Fernandez A, Vizoso Pinto MG, Butz P, Franz CMAP, Schuele E & Tauscher B, 2010.

Characterization of phenolic content, in vitro biological activity, and pesticide loads of extracts

from white grape skins from organic and conventional cultivars. Food Chem Toxicol 48: 3471-

3476

Cowan MM, 1999. Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 12: 564-582

Cruickshank JG & Humprey TJ, 1987. The carrier food-handler and non-typhoid salmonellosis.

Epidem Infect 98: 223-230

Cushnie TPT & Lamb AJ, 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents 26:

343-356

D’Aoust J-Y, 1991. Pathogenicity of foodborne Salmonella. Int J of Food Microbiol 12: 17-40

D’Aoust J-Y, 1994. Salmonella and the international food trade. Int J of Food Microbiol 24: 11-31

Dauwe R, Morreel K, Goeminne G, Gielen B, Rohde A, Van Beeumen J, Ralph J, Boude A-M, Kopka

J, Rochange SF, Halpin C, Messens E & Boerjan W, 2007.Molecular phenotyping of lignin-

modified tobacco reveals associated changes in cell-wall metabolism, primary metabolism,

stress metabolism and photorespiration. Plant J 52: 263-285

Del Rio D, Rodriguez A, Spencer JPE, Togolini M, Borges G & Crozier A, 2012. Dietary

(poly)phenolics in human health: structures, bioavailability and evidence of protective effects

against chronic diseases. Antioxid Redow Signal DOI: 10.1089/ars.2012.4581

Devi KP, Suganthy N, Kesika P & Pandian SK, 2008. Bioprotective properties of seaweeds: In vitro

evaluation of antioxidant activity and antimicrobial activity against food borne bacteria in

relation to polyphenolic content. BMC Complement Altern Med 8: 38

Dixon RA & Paiva NL, 1995. Stress-induced phenylpropanoid metabolism. Plant Cell 7: 1085-1097

Evensen NA & Braun PC, 2009. The effects of tea polyphenols on Candida albicans: inhibition of

biofilm formation and proteasome inactivation. Can J Microbiol 55: 1033-1039

Evira, 2009. Lisäaineopas. Eviran julkaisuja 4/2009, 78 s. Multiprint Oy, Helsinki

56

Fleet GH, 2007. Yeasts in foods and beverages: impact on product quality and safety. Curr Opin

Biotech 18: 170-175

Franke AA, Custer LJ, Arakaki C & Murphy SP, 2004. Vitamin C and flavonoid levels of fruits and

vegetables consumed in Hawaii. J Food Compost Anal 17: 1-35

Franz E & van Bruggen AHC, 2008. Ecology of E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in the

primary vegetable production chain. Crit Rev Microbiol 34: 143-161

Fraser CM & Chapple C, 2011. The phenylpropanoid pathway in Arabidopsis. Arabidopsis Book DOI:

10.1199/tab.0152

Fukuoka T, Johnston DA, Winsolw CA, de Groot MJ, Burt C, Hitchcock CA & Filler SG, 2003.

Genetic basis for differential activities of fluconazole and voriconazole against Candida krusei.

Antimicrob Agents Chemother 47: 1213–1219

GalluzzoP, Martini C, Bulzomi P, Leone S, Bolli A, Pallottini V & Marino M, 2009. Quercetin-

induced apoptotic cascade in cancer cells: Antioxidant versus estrogen receptor α-dependent

mechanisms. Mol Nutr Food Res 53: 699-708

Gantet P & Memelink J, 2002. Transcription factors: tools to engineer the production of

pharmacologically active plant metabolites. Trends Pharmacol Sci 23: 563-568

García-Gimeno RM & Zurera-Cosano G, 1997. Determination of ready-to-eat vegetable salad shelf-

life. Int J Food Microbiol 36: 31-38

Garcia-Salas P, Morales-Soto, Segura-Carretero A & Fernández-Gutiérrez A, 2010. Phenolic-

compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules 15: 8813-8826

Giménez-Bastída JA, Larrosa M, González-Sarrías A , Tomás-Barberán F, Espín JC & García-Conesa

M-T, 2012. Intestinal ellagitannin metabolites ameliorate cytokine-induced inflammation and

associated molecular markers in human colon fibroblasts. J Agric Food Chem DOI:

10.1021/jf300290f

Gorris LGM & Smid EJ, 1998. Natural preservation systems for food application. VTT Symposium

177: Biotechnology in the food chain. New tools and applications for future foods, toim. Kaisa

Poutanen, 260 s. Oy Edita Ab, Espoo

Griffiths G, Trueman L, Crowther T, Thomas B & Smith B, 2002. Onion - a global benefit to health.

Phytother Res 16: 603-615

Grunert KG & Bredahl L, 1998. Future foods: consumers’ hopes and fears. VTT Symposium 177:

Biotechnology in the food chain. New tools and applications for future foods, toim. Kaisa

Poutanen, 260 s. Oy Edita Ab, Espoo

Halverson LJ & Stacey G, 1986. Signal exchange in plant-microbe interactions. Microbiol Rev 50:

193-225

Hasseltine CW & Wang HL, 1967. Traditional fermented foods. Biotechnol Bioeng 9: 275-288

Havsteen BH, 2002. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacol Ther 96:

67-202

57

Herman & Weaver, 1999. The shikimate pathaway. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 473-

503

Hollman PC, Cassidy A, Comte B, Heinonen M, Richelle M, Richling E, Serafini M, Scalbert A, Sies

H & Vidry S 2012. The biological relevance of direct antioxidant effects of polyphenols for

cardiovascular health in humans is not established. J Nutr 141: 989S-1009S

Irlinger F & Mounier J, 2009. Microbial interactions in cheese: implications for cheese quality and

safety. Curr Opin Biotechnol 20: 142-148

Jadhav S, Bhave M & Palombo EA, 2012. Methods used for the detection and subtyping of Listeria

monocytogenes. J Microbiol Methods 88: 327-341

Jagtap UB & Bapat VA, 2010. Artocarpus: A review of its traditional uses, phytochemistry and

pharmacology. J Ethnopharmacol 129: 142-166

Jaime L, Martín-Cabrejas MA, Mollá E , López-Andréu FJ & Esteban RM, 2001. Effect of storage on

fructan and fructooligosaccharide of onion (Allium cepa L.). J Agric Food Chem 49: 982-988

Ju Z, Yuan Y, Liu C, Wang Y & Tian X, 1997. Dihydroflavonol reductase activity and anthocyanin

accumulation in ‘Delicious’, ‘Golden Delicious’ and ‘Indo’ apples. Sci Hortic 70: 31-43

Kanner J, Gorelik S, Roman S & Kohen R, 2012. Protection by polyphenols of postprandial human

plasma and low-density lipoprotein modification: the stomach as a bioreactor. J Agric Food

Chem DOI: 10.1021/jf300193g

Kaplan I, Halitschke R, Kessler A, Sardanelli S & Fenno RF, 2008. Constitutive and induced defenses

to herbivory in above- and belowground plant tissues. Ecology 89: 392–406

Khokhar S & Owusu Apenten RK, 2009. Antinutritional effects in food legumes and effects of

processing. The role of food, agriculture, forestry and fisheries in human nutrition, toim. Victor

Squires, 390 s. Eolss Publishers Company Limited, Oxford, Englanti

Kim J & Sudbery P, 2011. Candida albicans, a major human fungal pathogen. J Microbiol 49: 171-

177

Kodan A, Kudora H & Sakai F, 2002. A stilbene synthase from Japanese red pine (Pinus densiflora):

Implications for phytoalexin accumulation and down-regulation of flavonoid biosynthesis.

PNAS 99: 3335–3339

Koleva II, van Beek T, Soffers AEMF, Dusemund B & Rietjens IMCM, 2012. Alkaloids in the human

food chain – Natural occurrence and possible adverse effects. Mol Nutr Food Res 56: 30-52

Kwon Y-I, Apostolidis E, Labbe RG & Shetty K, 2007. Inhibition of Staphylococcus aureus by

phenolic phytochemicals of selected clonal herbs species of Lamiaceae family and likely mode

of action through proline oxidation. Food Biotechnol 21: 71-89

Kylli P, Nohynek L, Puupponen-Pimiä R, Westerlund-Wikström B, Leppänen T, Welling J, Moilanen

E & Heinonen M, 2011. Lingonberry (Vaccinium vitis-idaea) and European cranberry

(Vaccinium microcarpon) proanthocyanidins: Isolation, identification, and bioactivities. J Agric

Food Chem 59: 3373-3384

Kyung KH, 2011. Antimicrobial properties of allium species. Curr Opin Biotechnol 23: 1-6

58

Lanzotti V, 2006. The analysis of onion and garlic. J Cromatogr A 1112: 3-22

Lanzotti V, Barile E, Antignani V, Bonanomi G & Scala F, 2012. Antifungal saponins from bulbs of

white onion, Allium cepa L. var. Voghiera. Phytochemistry 78: 126-134

Lee J & Mitchell AE, 2011. Quercetin and isorhamnetin glycosides in onion (Allium cepa L.): Varietal

comparison, physical distribution, coproduct evaluation, and long-term storage stability. J Agric

Food Chem 59: 857-863

Li Q-Q, Zhou S-D, He X-J, Yu Y, Zhang Y-C & Wei X-Q, 2010. Phylogeny and biogeography of

Allium (Amaryllidaceae: Allieae) based on nuclear ribosomal internal transcribed spacer and

chloroplast rps16 sequences, focusing on the inclusion of species endemic to China. Ann Bot

106: 709-733

Li Y, Baldauf S, Lim E-K & Bowles DJ, 2001. Phylogenetic analysis of the UDP-glycosyltransferase

multigene family of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 276: 4338-4343

Lyytikäinen O, Siitonen A, Johansson T, Lukinmaa S, Mikkola J & Ruutu P, 2000a, Listerioosi

Suomessa. Duodecim 116: 2111-2118

Lyytikäinen O, Autio T, Maijala R, Ruutu P, Honkanen-Buzalski T, Miettinen M, Hatakka M,

Mikkola J, Anttila V-J, Johansson T, Rantala L, Aalto T, Korkeala H & Siitonen A, 2000b. An

outbreak of Listeria monocytogenes serotype 3a infections from butter in Finland. J Infect Dis

181: 1838-1841

Maisch T, Shimizu T, Isbary G, Heinlin J, Karrer S, Klämpfl TG, Li YF, Morfill G & Zimmermann

JL, 2012. Contact-free inactivation of Candida albicans biofilms by cold atmospheric air

plasma. Appl Environ Microbiol 78: 4242-4247

Manach C, Scalbert A, Morand C, Rémésy C & Jiménez L, 2004. Polyohneols: food sources and

bioavailability. Am J Clin Nutr 79: 727-747

Mandal SM, Chakraborty D & Dey S, 2010. Phenolic acids act as signaling molecules in plant-

microbe symbioses. Plant Signal Behav 5: 359-368

Martin HH, 1966. Biochemistry of bacterial cell walls. Annu Rev Biochem 35:457-484

Miean KH & Mohamed S, 2001. Flavonoid (myricetin, quercetin, kaempferol, luteolin, and apigenin)

content of edible tropical plants. J Agric Food Chem 49: 3106-3112

Millet A, Lamy E, Jonas D, Stintzing F, Mersch-Sundermann V & Merfort I, 2012. Fermentation

enhances the biological activity of Allium cepa bulb extracts. J Agric Food Chem 60: 2148-2156

Mori A, Nishino C, Enoki N & Tawata S, 1987. Antibacterial activity and mode of action of plant

flavonoids against Proteus vulgaris and Staphylococcus aureus. Phytochemistry 26: 2231-2234

Mulaudzi RB, Nidhala AR, Kulkarni MG & Van Staden J, 2012. Pharmacological properties and

protein binding capacity of phenolic extracts of some Venda medicinal plants used against

cough and fever. J Ethnopharmacol 143: 185-193

Murray EGD, 1955. A characterization of listeriosis in man and other animals. CMAJ 72: 99-103

NACMCF, National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods, 1991. The ecology

of Listeria monocytogenes. Int J Food Microbiol 14: 185-246

59

Negro ym., 2012. Polyphenol compounds in artichoke plant tissues and varieties.J Food Sci 77: C244-

C252

Nemeth K & Piskula MK, 2007. Food content, processing, absorption and metabolism of onion

flavonoids. Crit Rev Food Sci Nutr 47: 397-409

Nishino C, Enoki N, Tawata S, Mori A & Kobayashi K, 1987. Antibacterial activity of flavonoids

against Staphylococcus epidermidis, a skin bacterium. Agric Biol Chem 51: 139-143

Ohemeng KA, Schwender CF, Fu KP & Barrett JF, 1992. DNA gyrase inhibitory and antibacterial

activity of some flavones (1). Bioorg Med Chem Lett 3: 225-230

Osbourn A, 1996. Saponins and plant defence - a soap story. Trends Plant Sci 1: 4-9

Otomo K, Kenmoku H, Oikawa H, König WA, Toshima H, Mitsuhashi W, Yamane H, Sassa T &

Toyomasu T, 2004. Biological functions of ent- and syn-copalyl diphosphate synthases in rice:

key enzymes for the branch point of gibberellin and phytoalexin biosynthesis. Plant J 39:886-

893

Park Sy & Chin KB, 2010. Effects of onion on physicochemical properties, lipid oxidation and

microbial growth of fresh pork patties. Int J Food Sci Technol 45, 1153-1160

Park SY, Yoo SS, Shim JH & Chin KB, 2008. Physicochemical properties, and antioxidant and

antimicrobial effects of garlic and onion powder in fresh pork belly and loin during refrigerated

storage. J Food Sci 73: C577-C584

Park YK & Lee, 1996. Identification of isorhamnetin 4'-glucoside in onions. J Agric Food Chem 44:

34-36

Pastene E, Troncoso M, Figueroa G, Alarco J & Speisky H, 2009. Association between

polymerization degree of apple peel polyphenols and inhibition of Helicobacter pylori urease. J

Agric Food Chem 57: 416-424

Patel KD, Scarano FJ, Kondo M, Hurta RAR & Neto CC, 2011. Proanthocyanidin-rich extracts from

cranberry fruit (Vaccinium macrocarpon Ait.) selectively inhibit the growth of human

pathogenic fungi Candida spp. and Cryptococcus neoformans. J Agric Food Chem 59: 12864-

12873

Pekić B, Kovač V, Alonso E & Revilla E, 1998. Study of the extraction of proanthocyanidins from

grape seeds. Food Chem 61: 201-206

Perron NR, García CR, Pinzón JR, Chaur MN & Brumaqhim JL, 2011. Antioxidant and prooxidant

effects of polyphenol compounds on copper-mediated DNA damage. J Inorg Biochem 105: 745-

53

Plaper A, Golob M, Hafner I, Oblak M, Šolmajer T & Jerala R, 2003. Characterization of quercetin

binding site on DNA gyrase. Biochem Biophys Res Commun 306: 530-536

Pollastri S & Tattini M, 2011. Flavonols: old compounds for old roles. Ann Bot 108: 1225-1233

Pontello M, Guatia A, Sala G, Cipolla M, Gattuso A, Sonnessa M & Gianfranceschi MV, 2012.

Listeria monocytogenes serotypes in human infections (Italy, 2000-2010). Ann Ist Super Sanita

48: 146-150

60

Prior BA, Fennema O & Pate J, 1975. Effect of dichlorodifluoromethane on the appearance, viability,

and integrity of Escherichia coli. Appl Microbiol 29: 685-691

Queipo-Ortuño MI, Boto-Ordóñez M, Murri M, Gomez-Zumaquero JM, Clemente-Postigo M, Estruch

R, Cardona Diaz F, Andrés-Lacueva C & Tinahones FJ, 2012. Influence of red wine

polyphenols and ethanol on the gut microbiota ecology and biochemical biomarkers. Am J Clin

Nutr 95:1323-1334

Quideau S, Deffieux D, Douat-Casassus C & Pouysgu L, 2011. Plant polyphenols: Chemical

properties, biological activities, and synthesis. Angew Chem Int Ed 50: 586-621

Raghava T, Ravikumar P, Hegde R & Kush A, 2010. Spatial and temporal volatile organic compound

response of select tomato cultivars to herbivory and mechanical injury. Plant Sci 179: 520-526

Rahman S, Khasru PA, Islam R & Khan MH, 2011. Antibacterial activity of natural spices on multiple

drug resistant Escherichia coli isolated from drinking water, Bangladesh. Ann Clin Microbiol

Antimicrob 10: 10-13

Ramos FA, Takaishi Y, Shirotori M, Kawaguchi Y, Tsuchya K, Shibata H, Higuti T, Tadokoro T &

Takeuchi M, 2006. Antibacterial and antioxidant activities of quercetin oxidation products from

yellow onion (Allium cepa) skin. J Agric Food Chem 54: 3551-3557

Rastmanesh R, 2011. High polyphenol, low probiotic diet for weight loss because of intestinal

microbiota interaction. Chem Biol Interact 189: 1-8

Rauha J-P, Remes S, Heinonen M, Hopia A, Kähkönen M, Kujala T, Pihlaja K, Vuorela H & Vuorela

P, 2000. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing flavonoids and other

phenolic compounds. Int J Food Microbiol 56: 3-12

Rhodes MJC, 1994. Physiological roles for secondary metabolites in plants: some progress, many

outstanding problems. Plant Mol Biol 24: 1-20

Richard T, Lefeuvre D, Descendit A, Quideau S & Monti JP, 2006. Recognition characters in peptide-

polyphenol complex formation. Biochim Biophys Acta 1760: 951-958

Rihmanen-Finne R, Niskanen T, Lienemann T, Johansson T, Sjöman M, Korhonen T, Guedes S,

Kuronen H, Virtanen MJ, Mäkinen J, Jokinen J, Siitonen A & Kuusi M, 2011. A nationwide

outbreak of Salmonella Bovismorbificans associated with sprouted alfalfa seeds in Finland,

2009. Zoonoses Public Health 58: 589-596

Rodríguez Galdón B, Rodríguez Rodríguez EM & Díaz Romero C, 2008. Flavonoids in onion

cultivars (Allium cepa L.). J Food Sci 73: C599-C605

Romani A, Vignolini P, Galardi C, Aroldi C, Vazzana C & Heimler D, 2003. Polyphenolic content in

different plant parts of soy cultivars grown under natural conditions. J Agric Food Chem

51:5301-5306

Sagdic O, Ozturk I, Bayram O, Kesmen Z & Yilmaz MT, 2010. Characterization of butter spoiling

yeasts and their inhibition by some spices. J Food Sci 75: M597-M603

61

Sakihama Y, Cohen MF, Grace SC & Yamasaki H, 2002. Plant phenolic antioxidant and prooxidant

activities: phenolics-induced oxidative damage mediated by metals in plants. Toxicology 177:

67-80

Santas J, Almajano MP & Carbó R, 2010. Antimicrobial and antioxidant activity of crude onion

(Allium cepa, L.) extracts. Int J Food Sci Technol 45: 403-409

Santas J, Carbó R, Gordon MH & Almajano MP, 2008. Comparison of the antioxidant activity of two

Spanish onion varieties. Food Chem 107: 1210-1216

Saviranta NMM, Anttonen MJ, von Wright A & Karjalainen RO, 2008. Red clover (Trifolium

pratense L.) isoflavones: determination of concentrations by plant stage, flower colour, plant

part and cultivar. Sci Food Agric 88: 125-132

Scalbert A, 1991. Antimicrobial properties of tannins. Phytochemistry 30: 3875-3883

Scalbert A & Williamson G, 2000. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J Nutr 130:

2073S-2085S

Shimizu T, Lin F, Hasegawa M, Nojiri H, Yamane H & Okada K, 2012. The potential bioproduction

of the pharmaceutical agent sakuranetin, a flavonoid phytoalexin in rice. Bioengineered 3,

DOI: 10.1074/jbc.M112.351270

Scogings PF, Hjältén J & Skarpe C 2011. Secondary metabolites and nutrients of woody plants in

relation to browsing intensity in African savannas. Oecologia 167: 1063-1073

Segal E, Berg RA & Bennett JE, 1979. Detection of Candida antigen in sera of patients with

candidiasis by an enzyme-linked immunosorbent assay-inhibition technique. J Clin Microbiol

10: 116-118

Shabana S, Kawai A, kai K, Akiyama K & Hayashi H, 2010. Inhibitory activity against urease of

quercetin glycosides isolated from Allium cepa and Psidium guajava. Biosci Biotechnol

Biochem 74: 878-880

Shadle GL, Wesley SV, Korth KL, Chen F, Lamb C & Dixon RA, 2003. Phenylpropanoid compounds

and disease resistance in transgenic tobacco with altered expression of l-phenylalanine

ammonia-lyase. Phytochemistry 64: 153-161

Singh BN, Singh BR, Singh RL, Prakash D, Singh DP, Sarma BK, Upadhyay G & Singh HB, 2009.

Polyphenolics from various extracts/fractions of red onion (Allium cepa) peel with potent

antioxidant and antimutagenic activities. Food Chem Toxicol 47: 1161-1167

Singh A, Sarma BK, Upadhyay RS & Singh HB, 2012. Compatible rhizosphere microbes mediated

alleviation of biotic stress in chickpea through enhanced antioxidant and phenylpropanoid

activities. Microbiol Res DOI: 10.1016/j.micres.2012.07.001

Slimestad R, Fossen T & Molund Vågen I, 2007. Onions: A source of unique dietary flavonoids. J

Agric Food Chem 55: 10067–10080

Soininen TH, Jukarainen N, Julkunen-Tiitto R, Karjalainen R & Vepsäläinen JJ, 2012. The combined

use of constrained total-line-shape 1H NMR and LC-MS/MS for quantitative analysis of

bioactive components in yellow onion. J Food Compost Anal 25: 208-214

http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M112.351270

62

Spencer JPE, Abd El Mohsen MM & Rice-Evans C, 2004. Cellular uptake and metabolism of

flavonoids and their metabolites: implications for their bioactivity. Arch Biochem Biophys 423:

148-161

Steffen Y, Gruber C, Schewe T & Sies H, 2008. Mono-O-methylated flavonols and other flavonoids

as inhibitors of endothelial NADPH oxidase. Arch Biochem Biophys 469: 209-219

Strominger JL & Tipper DJ, 1965. Bacterial cell wall synthesis and structure in relation to the

mechanism of action of penicillins and other antibacterial agents. Am J Med 39: 708-721

Taguri T, Tanaka T & Kouno I, 2004. Antimicrobial activity of 10 different polyphenols against

bacteria causing food-borne disease. Biol Pharm Bull 27: 1965-1969

Takahama U & Hirota S, 2000. Deglucosidation of quercetin glucosides to the aglycone and formation

of antifungal agents by peroxidase-dependent oxidation of quercetin on browning of onion

scales. Plant Cell Physiol 41: 1021-1029

Tattini & Traversi, 2008. Responses to changes in Ca2+

supply in two Mediterranean evergreens,

Phillyrea latifolia and Pistacia lentiscus, during salinity stress and subsequent relief

Thompson & Morgan, 17.7.2012: Vegetables: Vegetable Seeds: Onion & Leek Seeds: Shallot

‘Banana’: http://www.thompson-morgan.com/vegetables/vegetable-seeds/onion-and-leek-

seeds/shallot-banana/376TM

Togolini M, Giorgio C, Mohamed IH, Barocelli E, Calani L, Reynaud E, Dangels O, Borges G,

Crozier A, Brighenti F & Del Rio D, 2012. Perturbation of the EphA2−EphrinA1 system in

human prostate cancer cells by colonic (poly)phenol catabolites. J Agric Food Chem DOI:

10.1021/jf205305m

Tomás-Barberán FA & Andrés-Lacueva C, 2012. Polyphenols and health: current state and progress. J

Agric Food Chem DOI: 10.1021/jf300671j

Tompkin RB, 2002. Control of Listeria monocytogenes in the food-processing environment. J Food

Prot 65: 709-725

Tsuchiya H, Sato M, Miyazaki T, Fujiwara S, Tanigaki S, Ohyama M, Tanaka T & Iinuma M,

1996. Comparative study on the antibacterial activity of phytochemical flavanones

against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol 50: 27-34

Tugizimana F, Steenkamp PA, Piater LA & Dubery IA, 2012. Ergosterol-induced sesquiterpenoid

synthesis in tobacco cells. Molecules 17:1698-715

Tzin V & Galili G, 2010. New insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis

pathways in plants. Mol Plant 3: 956-72

Verpoorte R & Memelink J, 2002. Engineering secondary metabolite production in plants. Curr Opin

Biotechnol 13:181-187

Vieira FG, Borges Gda S, Copetti C, Gonzaga LV, Nunes Eda C & Fett R, 2009. Activity and contents

of polyphenolic antioxidants in the whole fruit, flesh and peel of three apple cultivars. Arch

Latinoamer Nutr 59: 101-106

63

Voipio I, 2001. Viahnnekset: lajit, viljely, sato. Puutarhaliiton julkaisuja nro 316, 351 s. Nordmanin

Kirjapaino Oy, Forssa

Väkeväinen K, 2010. Pinosylviinin ja sen sukulaisaineiden antimikrobisuus ja sytotoksisuus. Pro

gradu -tutkielma, 65 s. Biotieteiden laitos, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta, Itä-

Suomen yliopisto

Waage SK & Hedin PA, 1985. Quercetin 3-O-galactocyl-(1→6)-glucoside, a compound from

narrowleaf vetch with antibacterial activity. Phytochemistry 24: 243-245

Weng J-K, Philippe RN & Noel JP, 2012. The rise of chemodiversity in plants. Science 336: 1667-

1670

Xu H-X & Lee SF, 2001. Activity of plant flavonoids against antibiotic-resistant bacteria. Phytother

Res 15: 39-43

Yamasaki S, Shimada E Kuwano T, Kawano T & Noquchi N, 2007. Continuous UV-B irradiation

induces endoreduplication and peroxidase activity in epidermal cells surrounding trichomes on

cucumber cotyledons. J Radiat Res 51: 187-196

Yang J, Meyers KJ, van der Heide J & Liu RH, 2004. Varietal differences in phenolic content and

antioxidant and antiproliferative activities of onions. J Agric Food Chem 52: 6787-6793

Yilmazer-Musa M, Griffith AM, Michels AJ, Schneider E & Frei B, 2012. Grape seed and tea extracts

and catechin 3-gallates are potent inhibitors of α-amylase and α-glucosidase activity. J Agric

Food Chem DOI: 10.1021/jf301147n

Yu X, Chu S, Hagermann AE & Lorigan GA, 2011. Probing the interaction of polyphenols with lipid

bilayers by solid-state NMR spectroscopy. J Agric Food Chem 59: 6783-6789

Zabala G, Zou J, Tuteja J, Gonzalez DO, Clough SJ & Vodkin LO, 2006. Transcriptome changes in

the phenylpropanoid pathway of Glycine max in response to Pseudomonas syringae infection.

BMC Plant Biol 6: 26-43

Zangerl AR & Berenbaum MR, 2004. Genetic variation in primary metabolites of Pastinaca

sativa; Can herbivores act as selective agents? J Chem Ecol 30: 1985-2002

Zarei Mahmoudabadi A & Gharib Nasery MK, 2009. Anti fungal activity of shallot, Allium

ascalonicum Linn. (Liliaceae), in vitro. J Med Plants Res 3: 450-453

Zavala JA & Ravetta DA, 2002. The effect of solar UV-B radiation on terpenes and biomass

production in Grindelia chiloensis (Asteraceae), a woody perennial of Patagonia, Argentina.

Plant Ecol 161: 185-191

sipulien polyfenolien antimikrobisuus · itÄ-suomen yliopisto, luonnontieteiden ja metsätieteiden...

Documents