Mtodos microbiolgicos para la vigilancia del estado de portador de bacterias multirresistentes

Procedimientos en Microbiologa Clnica

Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica

55

Emilia Cercenado Mansilla

Rafael Cantn Moreno

Jess Oteo Iglesias Germn Bou Arevalo

Fernando Chaves Snchez

Antonio Oliver Palomo

Jess Oteo Iglesias

Editores Coordinador Autores

EDITORES:

Emilia Cercenado Mansilla. Servicio de Microbiologa. Hospital General Universitario Gregorio Maran.

Madrid.

Rafael Cantn Moreno, Servicio de Microbiologa. Hospital Universitario Ramn y Cajal e Instituto Ramn

y Cajal de Investigacin Sanitaria (IRYCIS). Madrid.

SUGERENCIA DE CITACIN:

Bou Arevalo G, Chaves Snchez F, Oliver Palomo A, Oteo Iglesias J. Mtodos microbiolgicos para

la vigilancia del estado de portador de bacterias multirresistentes. 55. Oteo Iglesias J (coordinador).

Procedimientos en Microbiologa Clnica. Cercenado Mansilla E, Cantn Moreno R (editores). Sociedad

Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica (SEIMC). 2015.

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ISBN:

Procedimientos en Microbiologa Clnica

Mtodos microbiolgicos para la vigilancia del

estado de portador de bacterias multirresistentes

Editores: Emilia Cercenado Mansilla

Rafael Cantn Moreno

55 . MTODOS MICROBIOLGICOS PARA LA VIGILANCIA DEL ESTADO DE PORTADOR

DE BACTERIAS MULTIRRESISTENTES. 2015

Coordinador: Jess Oteo Iglesias1

Autores:Germn Bou Arevalo2

Fernando Chaves Snchez3

Antonio Oliver Palomo4

Jess Oteo Iglesias1

1 Laboratorio de Antibiticos, Bacteriologa, Centro Nacional de Microbiologa, Instituto de Salud Carlos III, Ma-jadahonda, Madrid. 2 Servicio de Microbiologa-INIBIC, Complejo Hospitalario Universitario A Corua, A Corua. 3 Servicio de Microbiologa, Hospital Universitario 12 de Octubre, Instituto de Investigacin Biomdica Hospital 12 de Octubre i + 12, Madrid. 4 Servicio de Microbiologa, Hospital Son Espases, Instituto de Investigacin Sanitaria de Palma (IdISPa), Palma de Mallorca

NDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO

1. Introduccin............................................................................................................................................... 6

2. Diferentes abordajes de la vigilancia microbiolgica: consideraciones generales ................................... 7 2.1. Recogida, transporte, conservacin y procesamiento de la muestra .................................................... 7 2.2. Mtodos tradicionales basados en el cultivo. Medios cromognicos .................................................... 8 2.3. Mtodos moleculares .......................................................................................................................... 9 2.4. Mtodos basados en protemica ........................................................................................................ 9

3. Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) ....................................................................... 10

3.1. Impacto clnico y epidemiolgico ....................................................................................................... 10 3.2. Mtodos basados en el cultivo .......................................................................................................... 10 3.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin .................................................. 10 3.2.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultados ............................ 11 3.2.3. Informacin de los resultados .................................................................................................. 12 3.3. Mtodos moleculares ........................................................................................................................ 12 3.3.1. Tipos de mtodos moleculares y seleccin .............................................................................. 12 3.3.2. Criterios para la interpretacin e informacin de los resultados ................................................ 12 3.3.3. Informacin de los resultados .................................................................................................. 13

4. Enterococcus spp. resistente a los glucopptidos ................................................................................. 14

4.1. Impacto clnico y epidemiolgico ....................................................................................................... 14 4.2. Mtodos basados en el cultivo .......................................................................................................... 14 4.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin .................................................. 14 4.2.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultados ............................ 15 4.2.3. Informacin de los resultados .................................................................................................. 15 4.3. Mtodos moleculares ........................................................................................................................ 15 4.3.1. Tipos de mtodos moleculares y seleccin ............................................................................. 15 4.3.2. Criterios para la interpretacin e informacin de los resultados ................................................ 15

5. Enterobacterias productoras de beta-lactamasas de espectro extendido (BLEE), AmpC plasmdicas (AmpC-p) y carbapenemasas (EPC) ........................................................................ 16

5.1. Impacto clnico y epidemiolgico ....................................................................................................... 16 5.2. Mtodos basados en el cultivo .......................................................................................................... 17 5.2.1. BLEE y AmpC plasmdicas ...................................................................................................... 17 5.2.1.1. Seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin...................................... 17 5.2.1.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultados ............... 18 5.2.1.3. Informacin de los resultados ..................................................................................... 18 5.2.2. Carbapenemasas .................................................................................................................... 18 5.2.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin...................................... 18 5.2.2.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultados ............... 20 5.2.2.3. Informacin de los resultados ..................................................................................... 21 5.3. Mtodos moleculares para la deteccin de BLEE, AmpC-p y carbapenemasas ................................. 21 5.3.1. Tipos de mtodos moleculares y seleccin .............................................................................. 21 5.3.2. Criterios para la interpretacin e informacin de los resultados ................................................ 23

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6. Acinetobacter baumannii multirresistente a antibiticos ......................................................................... 25

6.1. Impacto clnico y epidemiolgico ....................................................................................................... 25 6.2. Mtodos basados en el cultivo .......................................................................................................... 26 6.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin .................................................. 26 6.2.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultados ............................ 27 6.2.3. Informacin de los resultados .................................................................................................. 27 6.3. Mtodos moleculares ........................................................................................................................ 28 6.3.1. Tipos de mtodos moleculares y seleccin ............................................................................. 28 6.3.2. Criterios para la interpretacin e informacin de los resultados ............................................... 28

7. Pseudomonas aeruginosa multirresistente a antibiticos ....................................................................... 29

7.1. Impacto clnico y epidemiolgico ....................................................................................................... 29 7.2. Mtodos basados en el cultivo .......................................................................................................... 31 7.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin .................................................. 31 7.2.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultados ............................ 31 7.2.3. Informacin de los resultados .................................................................................................. 32 7.3. Mtodos moleculares ........................................................................................................................ 32 7.3.1. Tipos de mtodos moleculares y seleccin .............................................................................. 32 7.3.2. Criterios para la interpretacin e informacin de los resultados ................................................ 33

8. Bibliografa ............................................................................................................................................... 33

DOCUMENTOS TCNICOS

1. PNT-MMV-01. Mtodos microbiolgicos para la deteccin de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en muestras de vigilancia

2. PNT-MMV-02. Mtodos microbiolgicos para la deteccin de Enterococcus spp. resistente a los glucopptidos en muestras de vigilancia

3. PNT-MMV-03. Mtodos microbiolgicos para la deteccin de enterobacterias productoras de beta-lactamasas de espectro extendido y AmpC plasmdicas en muestras de vigilancia

4. PNT-MMV-04. Mtodos microbiolgicos para la deteccin de enterobacterias productoras de carbapenemasas en muestras de vigilancia

5. PNT-MMV-05. Mtodos microbiolgicos para la deteccin de Acinetobacter baumannii multirresistente a anti-biticos en muestras de vigilancia

6. PNT-MMV-06. Mtodos microbiolgicos para la deteccin de Pseudomonas aeruginosa multirresistente a anti-biticos en muestras de vigilancia

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DOCUMENTO CIENTFICO

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1. INTRODUCCINLa resistencia combinada a mltiples antibiticos en algunas de las principales bacterias patgenas en humanos est aumentando en los ltimos aos. Este hecho est generando una importante amenaza para la salud pblica y para la salud individual de los pa-cientes, debido a que limita de manera importante las alternativas teraputicas frente a las infecciones pro-ducidas por estos patgenos.

Aunque se han utilizado diferentes criterios y concep-tos para definir la multirresistencia (MDR), Magiorakos et al. la definieron recientemente como la ausencia de sensibilidad a al menos un antibitico de tres o ms familias consideradas de utilidad para el tratamiento de las infecciones producidas por cada una de las es-pecies bacterianas consideradas. En este mismo tra-bajo se defini la resistencia extensa (XDR) como la ausencia de sensibilidad a al menos un antibitico de todas las familias excepto una o dos y la panresisten-cia (PDR) como la ausencia de sensibilidad a todos los antibiticos de todas las familias habitualmente utiliza-das en el tratamiento de la bacteria considerada.

La aparicin de MDR afecta tanto a bacterias gram-positivas como a gramnegativas, sin embargo merece especial atencin la diseminacin de bacterias gram-negativas XDR y PDR, en especial Acinetobacter bau-mannii, Pseudomonas aeruginosa y algunas especies de enterobacterias, principalmente Klebsiella pneumo-niae.

El mayor impacto clnico de las bacterias MDR se pro-duce en la infeccin nosocomial en la que suelen verse afectados pacientes con patologa de base grave. No obstante, cada vez son ms frecuentes las infeccio-nes por bacterias MDR de inicio comunitario, gene-ralmente asociadas a cuidados sanitarios pero tam-bin comunitarias estrictas, como son las producidas por Escherichia coli productor de beta-lactamasas de espectro extendido (BLEE), o por Staphylococcus au-reus resistente a la meticilina (SARM).

Las bacterias MDR ms prevalentes suelen presen-tar una alta capacidad de diseminacin epidmica, no slo intrahospitalaria sino tambin inter- y extra-hospitalaria. Adems, la posibilidad de transferencia horizontal de la MDR a travs de diversos elementos genticos mviles aade mayor gravedad al proble-ma y favorece la aparicin de brotes. La presencia de pacientes colonizados por este tipo de bacterias es

una de sus principales vas de propagacin. La con-tencin de esta expansin es una prioridad asistencial en los centros sanitarios, as como una prioridad de salud pblica reconocida por las principales institucio-nes nacionales e internacionales. Por tanto, adems del conocimiento generado por el diagnstico micro-biolgico de los pacientes infectados, son necesarios los estudios de vigilancia microbiolgica locales que permitan una deteccin precoz de los pacientes colo-nizados por este tipo de bacterias.

En 2007, la Sociedad Espaola de Enfermedades In-fecciosas y Microbiologa Clnica (SEIMC) public un Procedimiento de Microbiologa Clnica titulado Cul-tivos de vigilancia epidemiolgica de bacterias resis-tentes a los antimicrobianos de inters nosocomial (n 26). Desde entonces se han producido importantes cambios tanto en la epidemiologa de las bacterias MDR en Espaa, principalmente con la irrupcin y r-pida dispersin de las enterobacterias productoras de carbapenemasas (EPC), como en los mtodos mole-culares para el diagnstico rpido de muchas de estas bacterias.

El presente documento pretende actualizar y com-plementar la informacin previamente recogida en el procedimiento de 2007 adaptndolo a las condiciones epidemiolgicas y tcnicas actuales; por tanto se re-mitir a las recomendaciones recogidas en 2007 que sigan vigentes, realizando un desarrollo ms pormeno-rizado de aquellas tcnicas ms novedosas.

Aunque muchas son las especies bacterianas que ocasionalmente pueden generar brotes en los centros sanitarios, en este documento se abordan aquellas de mayor inters debido a su frecuencia, su impacto clnico y epidemiolgico y las dificultades teraputicas que suponen: SARM, Enterococcus spp. resistente a los glucopptidos (ERG), enterobacterias productoras de BLEE o de beta-lactamasas plasmdicas de tipo AmpC (AmpC-p), EPC, A. baumannii multirresistente y P. aeruginosa multirresistente.

Las opciones metodolgicas disponibles en la actua-lidad para la deteccin de colonizacin por bacterias multirresistentes son mltiples lo que permite diferen-tes aproximaciones en funcin de las caractersticas de cada caso. La informacin general recogida en este documento debe considerarse como una estructura matriz que se beneficiar de una adecuada adaptacin a las necesidades especficas de cada centro estable-cidas por el equipo multidisciplinar de control de la in-feccin nosocomial de cada centro.

DOCUMENTO CIENTFICO

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2. DIFERENTES ABORDAJES DE LA VIGI-LANCIA MICROBIOLGICA: CONSIDERA-CIONES GENERALES

2.1. RECOGIDA, TRANSPORTE, CONSERVACIN Y PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

La toma de la muestra, su transporte y su conserva-cin para cultivos de vigilancia se realizarn siguiendo las recomendaciones generales de la SEIMC en su Procedimiento de Microbiologa Clnica n 1a: Reco-gida, transporte y procesamiento general de las mues-tras en el laboratorio de Microbiologa.

Como con cualquier otra muestra recibida en el Labo-ratorio de Microbiologa, se debe comprobar que est correctamente identificada, que se recibe en cantidad suficiente y que se han cumplido las condiciones de transporte y conservacin adecuadas. Adems debe constar explcitamente que la solicitud corresponde a un cultivo de vigilancia microbiolgica as como la bacteria y problema de resistencia a vigilar, ya que en funcin de ello se debe evaluar la adecuacin del tipo de muestra a la prueba solicitada. A ttulo orientativo, en la Tabla 1 se recogen las localizaciones de mayor inters para la bsqueda con fines epidemiolgicos de los patgenos multirresistentes considerados. Se recomienda procesar la muestra a la mayor celeridad posible en un tiempo inferior a 24 horas; si no se va a procesar de manera inmediata es recomendable su conservacin a 2-8C para facilitar la recuperacin de la bacteria a vigilar evitando el sobrecrecimiento de la microbiota comensal.

La toma de muestras en la vigilancia microbiolgica de SARM va dirigida a detectar pacientes o personal sanitario colonizados por este microorganismo. En diferentes estudios se han evaluado mltiples mues-tras, como el exudado nasal y farngeo, perineal, axi-lar, orina, heces o exudado vaginal. Aunque muchas de estas muestras pueden ser vlidas, es aconseja-ble emplear las que son ms rentables a efectos de la vigilancia. En estudios previos de colonizacin por SARM, la sensibilidad observada en funcin del tipo de muestra ha sido: 31-48% el exudado farngeo, 19-38% el exudado perineal, 78-82% el exudado nasal, 85-92% el nasal junto con el farngeo, 88-93% el nasal junto con el perineal, y 98% la triple toma nasal, farn-gea y perineal. Por tanto, se considera que el exudado nasal es la muestra ms adecuada si se elige una ni-ca muestra para los cultivos de vigilancia. El exudado

de piel de la zona perineal-perirrectal no se aconseja como muestra nica. Determinadas muestras espec-ficas pueden ser tiles en el caso de pacientes con ventilacin mecnica o traqueostoma (muestra respi-ratoria), solucin de continuidad en la piel (exudados de lceras o heridas) o sonda vesical (orina). Existen estudios que sugieren diferencias importantes, en cuanto a un incremento en la deteccin de S. aureus en muestras nasales, cuando se utilizan torundas con una punta cubierta con fibras de nylon en combinacin con un medio lquido de transporte (ESwab).

El tracto gastrointestinal de los pacientes ingresados constituye el principal reservorio de enterobacterias multirresistentes y ERG en el ambiente hospitalario. Por este motivo, las muestras ms habituales para el cultivo de vigilancia de ERG son las muestras rectales y las de heces. En determinadas situaciones clnicas, como ya se ha especificado en el caso de SARM, se pueden aceptar otras muestras como la orina y los exudados de herida. En circunstancias especiales en que se requiera el estudio de contaminacin ambien-tal se analizarn muestras procedentes de las superfi-cies prximas al paciente y del instrumental mdico en contacto con l.

Dada la complejidad de la epidemiologa de las infec-ciones por A. baumannii multirresistente, es adecua-do considerar la toma de muestras tanto del pacien-te como de muestras ambientales. Las muestras de vigilancia que se han evaluado ms frecuentemente incluyen esputo y exudado de traqueostoma, heridas, axila/ingle y frotis rectal. La efectividad del cribado se incrementar si se realiza un muestreo de distin-tas zonas anatmicas del cuerpo; un estudio espaol muestra una sensibilidad mayor del 90% cuando se combinan muestras de diferentes localizaciones (por ejemplo axilar-rectal, axilar-farngea o farngea-rectal). Las muestras ambientales a considerar pueden ser muy diversas; se ha descrito contaminacin por A. baumannii en los equipos de respiracin asistida, lqui-dos diversos, medicaciones multidosis, ropa de cama, transductores de presin no desechables y carros de curas, entre otros.

De igual forma, los cultivos de vigilancia para P. aeru-ginosa multirresistente pueden contemplar la toma de muestras de pacientes y muestras del medio ambiente y equipos de atencin sanitaria. Son particularmente tiles las muestras respiratorias incluyendo esputo, frotis farngeo, exudado de traqueostomia, etc. La co-lonizacin intestinal por P. aeruginosa multirresistente se detecta con cierta frecuencia en el frotis rectal.

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2.2. MTODOS TRADICIONALES BASADOS EN EL CULTIVO. MEDIOS CROMOGNICOS

La seleccin de medios de cultivo y condiciones de incubacin para asegurar un rendimiento ptimo en la recuperacin de bacterias multirresistentes est revi-sada previamente en el Procedimiento de Microbiolo-ga clnica de la SEIMC n 26: Cultivos de vigilancia epidemiolgica de bacterias resistentes a los antimi-crobianos de inters nosocomial.

La inoculacin de cualquiera de las muestras des-critas en la Tabla 1 en un medio de cultivo, con una orientacin diagnstica o con fines epidemiolgicos, es la prctica habitual en los laboratorios de micro-biologa. Considerando el carcter de multirresis-tencia de la mayora de las bacterias implicadas, es necesario emplear medios selectivos que eviten el crecimiento de la microbiota sensible. La eleccin de un medio u otro, as como de las concentracio-nes de antibitico a usar, vendr condicionado por la especie bacteriana y por la situacin epidemiolgi-ca local del centro donde se va a realizar el cribado. Una vez aisladas las colonias en el medio selectivo, se proceder a la identificacin del microorganismo a travs de mtodos bioqumicos, fenotpicos, mole-culares o protemicos. Sin embargo, en las muestras de vigilancia microbiolgica, el uso de medios de cul-

tivo cromognicos puede ser muy til. Estos medios permiten la diferenciacin o seleccin de muchos mi-croorganismos usando un sustrato cromognico que da como resultado un color caracterstico de cada gnero/ especie bacteriana. La incorporacin de di-ferentes antibiticos en el medio de cultivo lo hace ms selectivo permitiendo slo el crecimiento del mi-croorganismo resistente. Bsicamente, las bacterias a estudiar suelen caracterizarse por tener enzimas especficas que son responsables de la escisin del sustrato en el interior del cromgeno. El enzima bac-teriano libera el cromforo y pueden ser detectados visualmente mediante la observacin de un cambio de color en el medio. Sus principales ventajas son: i) la reduccin del tiempo en dar el resultado; ii) un solo medio sirve para la deteccin de ms de un orga-nismo; iii) la interpretacin del resultado es visual sin necesidad de equipamiento complejo; iv) la elimina-cin en su mayora de anlisis bioqumicos complejos para la identificacin del patgeno, aunque en mu-chos casos se requieren pruebas confirmatorias; y v) la capacidad de realizar pruebas adicionales sobre la propia colonia aislada en el medio.

Estos medios de cultivo cromognicos son por tanto especficos de cada microorganismo y sern discuti-dos de manera individual en los apartados correspon-dientes de este documento.

Tabla 1. Indicaciones orientativas sobre el inters cualitativo de diferentes muestras clnicas para la investigacin de patgenos multirresistentes con fines epidemiolgicos.

MicroorganismoMuestra clnica

Rectal/Heces Perineal Faringe Nasal *Aspirado traqueal*Heridas/ulceras *Orina

SARM - + +++ ++++ +++ +++ ++

Enterococcus spp. resistente a los glucopptidos

++++ ++++ - - - +++ ++

Enterobacterias productoras de BLEE, AmpC-p y carbapenemasas

++++ ++++ + - - + +++

A. baumannii multirresistente ++++ ++++ ++++ - ++++ +++ +++

P. aeruginosa multirresistente +++ +++ ++++ - ++++ +++ +++

*En la Tabla se mencionan determinadas muestras especficas que pueden ser tiles en circunstancias especficas como es el caso de pacientes con ventilacin mecnica o traqueostoma (muestra respiratoria), solucin de continuidad en la piel (exudados de lceras o heridas) o sonda vesical (orina).

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2.3. MTODOS MOLECULARES

Los mtodos moleculares, en sus distintas vertientes, permiten la identificacin rpida del microorganismo resistente, a travs de la deteccin del gen/es de re-sistencia al antibitico implicado. Esto tiene una impor-tancia capital en algunas situaciones de control epide-miolgico de la infeccin, especialmente en el caso de brotes nosocomiales. Su principal ventaja respecto a los mtodos basados en cultivo es la posibilidad de dar un resultado en la misma jornada de trabajo, habitual-mente entre 1-3 horas tras la recepcin de la muestra. Es importante resaltar su mayor sensibilidad respecto a los mtodos basados en el cultivo y enfatizar la po-sibilidad de aplicacin directa sobre muestra clnica, lo cual es tremendamente importante para tomar de-cisiones de control de la infeccin y epidemiolgicas. Como inconvenientes, cabe resaltar que slo identifica aquellos genes de resistencia diseados en el ensayo, y que muchas veces requiere de un cultivo posterior para la realizacin de estudios de sensibilidad antibi-tica o de tipificacin molecular. Los ms utilizados en la prctica clnica y con mejor coste-efectividad son aquellos basados en PCRs a tiempo real con sondas Taqman, aunque hay otras modalidades de mayor o diferente complejidad.

El mayor coste econmico de las pruebas molecula-res respecto a los mtodos basados en el cultivo es un aspecto importante a valorar a la hora de decidir su posible introduccin en la prctica clnica. Un ar-gumento que se utiliza para sustituir el mtodo de cultivo por los mtodos moleculares es que el au-mento del coste se puede justificar por la mejora en los cuidados de los pacientes. Estos se traducen en una disminucin en la transmisin y en el nmero de infecciones por bacterias multirresistentes y, conse-cuentemente, en una reduccin en la morbi-mortali-dad y en el coste de los cuidados sanitarios. Esta ar-gumentacin no ha sido uniformemente demostrada en los estudios de vigilancia donde se han aplicado las tcnicas moleculares. La generalizacin de estas pruebas moleculares para la vigilancia de bacterias multirresistentes es un tema a debate, pero depen-diendo de los programas de vigilancia y control de la infeccin de los diferentes hospitales pueden existir pacientes y determinadas circunstancias epidemiol-gicas en los que las pruebas moleculares pueden ser muy tiles y coste-eficaces.

En cada apartado de este documento y para cada me-canismo de resistencia en cada patgeno concreto, se discutir la cartera de servicios o posibilidades dispo-

nibles para realizar un diagnstico molecular con fines de control epidemiolgico.

2.4. MTODOS PROTEMICOS

La identificacin microbiana basada en mtodos pro-temicos a travs de MALDI-TOF ha revolucionado la prctica clnica diaria en los laboratorios de Microbio-loga. Algunos estudios recientes estn adems de-mostrando la posibilidad de detectar mecanismos de resistencia a antimicrobianos, fundamentalmente enzi-mas BLEE y carbapenemasas, ya sea en aislados cl-nicos bacterianos, en muestras clnicas con alta carga bacteriana o en los frascos de hemocultivos positivos. Estos ltimos an no estn totalmente implementados en los laboratorios de Microbiologa y requieren mayor validacin, pero an as se postulan como un mtodo rpido muy prometedor para detectar microorganis-mos con mecanismos de resistencia a antimicrobianos especficos.

No existen recomendaciones especficas sobre el mtodo preferido para detectar el estado de portador de bacterias multirresistentes. La eleccin del mto-do de cribado depender en gran medida de la pol-tica de control de la infeccin que se lleve a cabo en el hospital (vigilancia activa o no, universal o en deter-minados servicios clnicos o pacientes, si se realiza o no aislamiento preventivo, etc.) as como de la epide-miologa y prevalencia local del patgeno/resistencia a vigilar. Otros factores a considerar son el tipo de institucin u hospital, infraestructura del laboratorio, experiencia del personal, y recursos disponibles en el laboratorio. En cualquier caso el cribado debera incluir al menos los pacientes con alto riesgo de estar colonizados por bacterias multirresistentes como son aquellos ingresados en UCIs, trasplantados, inmuno-deprimidos o procedentes de hospitales o pases con una alta prevalencia de este tipo de cepas. La detec-cin de un paciente infectado y/o colonizado por una de estas bacterias obliga a incluir en el estudio de vigilancia a los otros pacientes que hayan mantenido contacto epidemiolgico con l (misma habitacin, mismo servicio, mismas pruebas diagnstico/tera-puticas). Por otra parte, un tema a debate en la literatura cientfica reciente es qu estrategia es mejor para reducir las infecciones por determinadas bac-terias multirresistentes como por ejemplo el SARM: descolonizacin universal (baos de clorhexidina y mupirocina nasal) en todos los pacientes de determi-nados servicios clnicos como UCIs versus vigilancia activa y descolonizacin selectiva de los pacientes colonizados.

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3. Staphylococcus aureus RESISTENTE A LA METICILINA (SARM)

3.1. IMPACTO CLNICO Y EPIDEMIOLGICO

S. aureus es un microorganismo que habitualmente coloniza a los seres humanos. Sin embargo, en de-terminadas circunstancias puede comportarse como un patgeno oportunista y ser la causa de una gran diversidad de infecciones. La primera cepa de SARM se describi en 1961, pocos meses despus del inicio de la utilizacin clnica de la cloxacilina. En las ltimas dcadas, la prevalencia de SARM ha aumentado de forma importante, convirtindose en un patgeno muy relevante en la infeccin hospitalaria. Los datos del European Antimicrobial Resistance Surveillance Net-work (EARS-Net) de 2013 muestran una prevalencia de SARM del 22,6% en aislamientos de sangre en Es-paa y del 18% en el total de los pases europeos par-ticipantes. En Espaa, existen variaciones importantes en su prevalencia dependiendo del rea geogrfica y del tipo de hospital.

La resistencia a meticilina/oxacilina se puede detectar fenotpicamente mediante determinacin de la CMI, pruebas de difusin disco-placa, o mediante la detec-cin de la protena PBP2a; y genotpicamente median-te PCR. La cefoxitina es un marcador muy sensible y especfico para la deteccin de resistencia a la metici-lina en S .aureus, y es el antibitico de eleccin para el mtodo de difusin con disco. El principal mecanis-mo de resistencia es la produccin de una protena de unin a la penicilina (PBP2a), codificada por el gen mecA, que presenta baja afinidad por los antibiticos beta-lactmicos, a excepcin de una nueva clase de cefalosporinas como es la ceftarolina o el ceftobipro-le. En el ao 2011 se describi un gen homlogo de mecA denominado mecC. Se han aislado cepas de SARM con mecC en humanos y en una gran variedad de animales. Los estudios retrospectivos han demos-trado que estas cepas de SARM ya estaban presentes en el ao 1975 en Dinamarca, y en otros pases como Espaa en el ao 2008. Las cepas con mecC no se detectan mediante las pruebas de laboratorio basadas en la amplificacin del gen mecA o en la aglutinacin de la protena PBP2a.

Adems, la deteccin del gen mec permite la diferen-ciacin de otras cepas de S. aureus, muy poco fre-cuentes, con bajo nivel de resistencia a la meticilina debido tanto a alteraciones de las PBPs (denomina-das moderately resistant S. aureus MODSA) como a hiperproduccin de beta-lactamasa (denominadas

bordeline oxacillin-resistant S. aureus BORSA). El protocolo que se desarrolla a continuacin se refiere a S. aureus que contiene el gen mec.

3.2. MTODOS BASADOS EN EL CULTIVO

3.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condi-ciones de incubacinLa deteccin de colonizacin por SARM basada en el cultivo es la tcnica tradicionalmente usada en los laboratorios de Microbiologa. La utilizacin de un me-dio convencional, no selectivo, como agar sangre no sirve para la deteccin de SARM, ya que permite el crecimiento de otras especies bacterianas y de pobla-ciones de S. aureus con diferentes sensibilidades a los antibiticos. Por ello, se recomienda la utilizacin de medios de cultivo selectivos y diferenciales que permi-ten obtener resultados de forma rpida (24-48 horas).

Existen mltiples medios de cultivo selectivos y dife-renciales que pueden ser utilizados para la deteccin de SARM. Los ms utilizados son el agar manitol-sal (AMS o medio de Chapman) y los de agar cromogni-co. El medio AMS puede prepararse fcilmente en el laboratorio y suplementarse con cefoxitina (4 mg/L). La combinacin de una placa de AMS y otra de AMS-cefoxitina permite la deteccin de SARM, y eventual-mente, la colonizacin por cepas de S. aureus sensi-bles a meticilina (SASM). Un estudio que evaluaba el medio de AMS-cefoxitina con una gran variedad de cepas de SARM y SASM a diferentes concentracio-nes bacterianas, mostr una sensibilidad del 96% y una especificidad del 100% despus de 48 horas de incubacin. Es importante tener en cuenta la posibili-dad de resultados falsos positivos con algunas espe-cies de estafilococo coagulasa negativa, enterococos, e incluso con alguna bacteria gramnegativa. Tambin pueden darse resultados falsos negativos con cepas de S. aureus manitol-negativo y con variantes de S. aureus de colonia pequea.

Actualmente existen disponibles diferentes medios cromognicos comerciales. Estos medios incorporan cromgenos para diferenciar S. aureus de otros pa-tgenos y antibiticos para el crecimiento selectivo de SARM. Los estudios que han evaluado la utilidad de los medios cromognicos han mostrado resultados variables. En general, a las 24 horas de incubacin la especificidad es alta para todos los medios de cultivo, pero la sensibilidad vara entre los diferentes medios y los diferentes estudios. La prolongacin del tiempo de incubacin a 48 horas aumenta la sensibilidad, pero en general reduce la especificidad. Un estudio reciente

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que evaluaba cinco medios cromognicos, [Brilliance MRSA agar (Oxoid), ChromoID (bioMrieux), MRSASe-lect (Bio-Rad), CHROMagar (CHROMagar Microbiolo-gy), y BBL-CHROMagar (BD Diagnostics)], mostr, tras 24 horas de incubacin, una sensibilidad del 90% para el medio Brilliance MRSA agar y del 81%-83% para el resto de medios, y una especificidad del 87% para el medio Brilliance MRSA agar y del 97 al 99% para el resto de medios cromognicos. La evaluacin de los diferentes medios de cultivo a las 48 horas mostraba una sensibilidad entre el 93 y el 96%, y una especifi-cidad entre el 69 y el 98%. Otro estudio que evaluaba tres medios de cultivo [BBL CHROMagar MRSA II (BD Diagnostic), MRSASelect (Bio-Rad), y Spectra MRSA (Remel)] para la deteccin de SARM en muestras na-sales a las 24 horas, y los comparaba con el cultivo en agar sangre (identificacin y deteccin de resistencia a cefoxitina mediante mtodos habituales), mostraba una sensibilidad del 84-88% y una especificidad del 92-98%. Los estudios publicados muestran que exis-ten resultados falsos positivos debidos a la interpreta-cin del color de las colonias en alguno de estos me-dios cromgnicos. Los resultados falsos negativos se producen, en general, por una escasa carga bac-teriana en la muestra clnica. Tambin es importante tener en cuenta las variantes de colonia pequea de S. aureus. En base a los estudios publicados, no existen recomendaciones absolutas a favor o en contra de un determinado medio cromognico.

Algunos estudios han mostrado que la preincubacin de las muestras en un medio lquido de enriquecimien-to selectivo, como por ejemplo caldo Mueller-Hinton o tripticasa-soja suplementados con cloruro sdico al 6,5%, aumenta significativamente la sensibilidad de los medios cromognicos para la deteccin de SARM. Una posible limitacin de esta estrategia sera el retra-so en un da de la obtencin de resultados.

3.2.2 Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultadosLa ventaja de utilizar medios de cultivo selectivos y di-ferenciales es la posibilidad de emitir resultados positi-vos (deteccin de SARM) a las 24 horas de incubacin. Sin embargo, el tiempo recomendable de incubacin de los diferentes medios de cultivo para emitir un in-forme definitivo en que no se detecta SARM es de 48 horas.

Debido a los posibles falsos positivos en la identifica-cin, parece recomendable confirmarla mediante un mtodo alternativo rpido. En estos casos, se reco-mienda la realizacin de una prueba de coagulasa,

aglutinacin con ltex o la identificacin mediante MALDI-TOF.

Respecto a la confirmacin de la resistencia a la meti-cilina en S. aureus mediante el mtodo de difusin en placa, se recomienda usar un disco de cefoxitina (30 g) y realizar la lectura a las 24 horas; se considera re-sistencia si el halo de inhibicin es < 22 mm [European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EU-CAST) 2015]. La cefoxitina es un potente inductor de la produccin de PBP2a, ello hace que sea ms pre-coz que la propia oxacilina en la deteccin de resis-tencias y que la lectura del halo de inhibicin sea ms fcil. Adems, es de gran utilidad en la deteccin de cepas de S. aureus con expresin heterognea de la resistencia a meticilina. No se recomienda realizar el mtodo de difusin con el disco de oxacilina.

Muchos laboratorios de microbiologa utilizan sistemas automatizados o comerciales para el estudio de la sen-sibilidad a antibiticos en S. aureus. Estos sistemas han incluido cefoxitina y oxacilina para la deteccin de SARM. Los puntos de corte establecidos para consi-derar resistencia son CMI >4 mg/L para cefoxitina, y CMI >2 mg/L para oxacilina. Las cepas de S. aureus con CMI de oxacilina >2 mg/L y de cefoxitina de 4 mg/L son muy poco frecuentes. Asimismo, un estudio reciente con el sistema Vitek 2 analiz 896 aislamien-tos de S. aureus (SARM-mecA, SARM-mecC, y SASM mec-negativos) y encontr que el perfil de resistencia oxacilina-S y cefoxitina-R era sugerente de SARM mecC-positivo. En un principio, la interpretacin de los resultados discrepantes entre la cefoxitina y oxaci-lina debera resolverse a favor del resultado resistente (EUCAST 2015). En estos casos, la recomendacin es estudiar fenotpicamente y genotpicamente (mecA o mecC) las cepas de S. aureus.

La resistencia a meticilina tambin se puede confirmar mediante la aglutinacin de partculas de ltex recu-biertas con anticuerpos monoclonales de la protena PBP2a. Es una prueba muy sensible y especfica. Los aislamientos que producen pequeas cantidades de la protena PBP2a pueden dar resultados dbiles o enlen-tecer la reaccin de aglutinacin. Es importante tener en cuenta que los ensayos basados en la deteccin de PBP2a (mecA) darn lugar a resultados negativos cuando se analicen cepas de SARM mecC-positivas. Una informacin complementaria, que puede ser til en los programas de vigilancia de SARM, es la monito-rizacin de la resistencia a mupirocina. Este antibitico se utiliza tpicamente para la descolonizacin nasal.

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Diferentes estudios han demostrado que su uso masi-vo incrementa la resistencia de alto nivel (>256 mg/L), que es la que tiene implicaciones clnicas.

3.2.3. Informacin de los resultadosLa informacin de los resultados depender de las muestras y de los medios de cultivo utilizados. Es importante tener en cuenta que este protocolo est orientado a la deteccin de SARM en muestras cl-nicas de vigilancia. Una informacin rpida y precisa tendr impacto en los programas de control de la in-feccin hospitalaria.

A. Si se utiliza un medio cromognico:

1. Si a las 48 horas no hay colonias con la colo-racin caracterstica definida por el fabricante para SARM, se informar: No se aisla S. au-reus resistente a la meticilina (SARM negativo).

2. En caso de aislarse un microorganismo con la coloracin caracterstica definida por el fabri-cante, se informar: Se aisla S. aureus resis-tente a la meticilina (SARM positivo).

B. Si se utiliza agar manitol-sal con y sin cefoxitina:

1. Si a las 48 horas no hay colonias manitol positi-vas, ni compatibles con S. aureus, se informa-r: No se aisla S. aureus resistente a la metici-lina (SARM negativo).

2. Si se aisla un microorganismo manitol positivo en ambos medios, y se confirma la identifica-cin como S. aureus, se informar: Se aisla S. aureus resistente a la meticilina (SARM posi-tivo).

3.3. MTODOS MOLECULARES

La necesidad de obtener un resultado rpido en los estudios de vigilancia de SARM ha favorecido el desa-rrollo de pruebas moleculares para su deteccin. Es-tos mtodos rpidos incluyen principalmente la ampli-ficacin por PCR a tiempo real y permiten la obtencin de resultados entre las dos y seis horas.

Actualmente, los mtodos basados en la reaccin de PCR para la deteccin del gen mec son considerados de referencia para la deteccin de SARM. La detec-cin del gen mec permite la diferenciacin de otras cepas de S. aureus, muy poco frecuentes, MODSA y BORSA. Existen diferentes mtodos comerciales que permiten la deteccin del gen mecA en aislamientos de S. aureus. Las cepas de SARM con un resultado

de PCR mecA negativo deberan ser estudiadas por la posible presencia del gen mecC. Los laboratorios de Microbiologa deberan considerar esta posibilidad e incorporar estrategias moleculares que detecten mecA y mecC. Recientemente, se han desarrollado mtodos comerciales que incluyen la deteccin del gen mecC.

3.3.1 Tipos de mtodos moleculares y selec-cinLos mtodos comerciales que se han aprobado para uso diagnstico se han validado principalmente en muestras nasales. Estos estudios de validacin pre-sentan una gran variabilidad metodolgica, algunos mtodos comerciales han sido extensamente evalua-dos y de otros existen muy pocas referencias. Ade-ms, una de las principales limitaciones a la hora de comparar los diferentes mtodos comerciales es que no existe una prueba de referencia (gold standard) con la que comparar. En general, estos estudios muestran una sensibilidad y especificidad que oscilan entre 82-100% y 64-99%, respectivamente. La Tabla 2 recopila informacin seleccionada sobre diferentes mtodos comerciales utilizados en la prctica clnica.

3.3.2 Criterios para la interpretacin e infor-macin de los resultadosUn aspecto importante en este tipo de mtodos es que permitan distinguir entre colonizacin por SARM y una colonizacin mixta por SASM y por estafilococco coagulasa negativa resistente a la meticilina. Algunas pruebas moleculares combinan la deteccin de un gen especfico de S. aureus y del gen mecA. Otros mto-dos tienen como diana la regin de unin SCCmec-orfX. Aunque esta regin se ha considerado especfica de SARM, presenta cierta variabilidad, lo que puede generar una disminucin en la sensibilidad de deter-minados mtodos. Por otra parte, algunas cepas de SASM pueden contener fragmentos de la estructura del SSCmec remanentes (gen mec-negativo) y dar re-sultados falsos positivos. Adems, la mayora de los ensayos moleculares comerciales no detectan las ce-pas de SARM portadoras del gen mecC.

Otras consideraciones importantes sobre los m-todos moleculares tienen que ver con las muestras, trabajo tcnico, tiempo en la obtencin de resultados y prevalencia de SARM en la poblacin. Respecto a las muestras, aunque muchas de estas tcnicas han sido aprobadas para muestras nasales, se han utili-zado tambin en otras muestras clnicas (farngeas, perineales/rectales) con buenos resultados. Incluso algn estudio sugiere un incremento en la sensibilidad cuando se realiza la prueba molecular en una mezcla

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de muestras clnicas de diversas localizaciones. Res-pecto a los aspectos tcnicos, aunque existen diferen-cias importantes de procedimiento entre los mtodos comerciales, en general la realizacin de las tcnicas es cada vez ms sencilla. Algunos de estos mtodos nicamente requieren la dispensacin de la muestra, e incluso estn totalmente automatizados. Aunque la mayora permiten obtener resultados en horas, existe cierta variabilidad entre ellos y no siempre la ventaja de la rapidez se sincroniza con los horarios de trabajo de los laboratorios. A la hora de la eleccin de un mtodo molecular tambin es importante conocer la prevalen-cia de SARM en la poblacin donde se va a implemen-tar esta prueba. Estos mtodos tienen en general una alta sensibilidad y un alto valor predictivo negativo. En lugares con baja prevalencia los resultados negativos son tiles para descartar SARM. Los resultados posi-tivos requeriran confirmacin mediante cultivo. En lu-gares con alta prevalencia de colonizacin por SARM, estos mtodos se podran utilizar como prueba defini-tiva para identificar portadores de SARM.

3.3.3 Informacin de los resultadosA la hora de informar los resultados es importante te-ner en cuenta que los mtodos moleculares detectan

la presencia o ausencia de ADN de SARM. En el con-texto de un estudio de colonizacin nasal en pacientes que no han recibido tratamiento de descolonizacin, un resultado positivo equivale a SARM positivo (se detecta SARM), y un resultado negativo a SARM ne-gativo (no se detecta SARM). Un resultado positivo no necesariamente indica la presencia de bacterias viables. Esto se puede observar en pacientes que han recibido tratamiento antibitico para descolonizacin nasal, y este resultado no indica un fracaso en el tra-tamiento. Por otra parte, un resultado negativo de una prueba molecular en una muestra nasal no excluye que el paciente pueda estar colonizado en otras loca-lizaciones anatmicas.

En general, la informacin de resultados con las prue-bas moleculares es la siguiente:

1. SARM positivo: se detecta ADN de SARM. Se interpreta como colonizacin nasal por SARM.

2. SARM negativo: no se detecta ADN de SARM. Se descarta la colonizacin nasal por SARM.

3. Resultado indeterminado o no vlido. Esto pue-de ocurrir por algn fallo en el procedimiento tc-nico, y habitualmente el programa informtico de

Tabla 2. Caractersticas de los mtodos moleculares comerciales para deteccin de SARM en muestras nasales.

Nombre comercial Diana/sTiempo de

procesamiento ()Sensibilidad Especificidad Observaciones

BD GeneOhm MRSA (BD Diagnostics)BD MAX MRSA Assay*BD MAX MRSA XT Assay**

SCCmec-orfX 2,5 horas81-100%

87,5%

89-97%

97,1%

No detecta mecC

Xpert MRSA assay (Cepheid)Xpert MRSA/SA Nasal assay***Xpert MRSA Gen 3**

SCCmec-orfXspa, mecA,

SCCmec-orfX1,5 horas 86-98% 90-95%

No detecta mecC

Las muestras se procesan

individualmente

Genotype MRSA Direct (Hain)

SCCmec-orfX 4 horas 70-94,6% 96-98%No detecta

mecC

Hyplex StaphyloResist (BioTrading)

Gen especfico de S. aureus y

mecA

4,5-6 horas 92-98% 84-96%No detecta

mecC

LC MRSA advanced Test (Roche)

SCCmec-orfX 4 horas 83,3-98.3% 90,8-99%No detecta

mecC

* Ensayo automatizado en el sistema BD MAX (BD Diagnostics). Lepainteur M, et al J Clin Microbiol 2015.** Detecta los genes mecA y mecC *** Detecta SARM y SASM

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interpretacin de los resultados indica el tipo de error. Se requiere nueva muestra.

4. Enterococcus spp. RESISTENTE A LOS GLUCOPPTIDOS (ERG)

4.1. IMPACTO CLNICO Y EPIDEMIOLGICO

Los enterococos forman parte de la microbiota de hu-manos y animales. Aunque se han descrito ms de 20 especies, Enterococcus faecalis (~80-90%) y En-terococcus faecium (~5-10%) son las especies que causan la mayora de las infecciones en humanos. Estos microorganismos son responsables de aproxi-madamente el 10% de las infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria, principalmente infecciones de la herida quirrgica (14,5%), infecciones del tracto urinario (12,5%), y bacteriemias (8,2%). E. faecium y E. faecalis son capaces de sobrevivir en el ambiente en condiciones adversas, lo que facilita su diseminacin y transmisin entre pacientes. Entre las razones por las que estos microorganismos sobreviven en el ambien-te hospitalario se incluyen su resistencia intrnseca a mltiples antibiticos (incluidas penicilinas resistentes a penicilinasas, cefalosporinas y aminoglucsidos en concentraciones bajas), y su capacidad de desarrollar resistencias a otros antibiticos, bien por adquisicin de genes localizados en plsmidos o transposones (como por ejemplo la resistencia a glucopptidos) o por mutaciones cromosmicas (como por ejemplo la resistencia a fluoroquinolonas). La emergencia de ERG como problema teraputico fue inicialmente docu-mentada en la dcada de 1980 en Inglaterra, Francia y Estados Unidos (EE.UU.). Desde entonces, el aisla-miento de ERG ha sido una constante en diversas zo-nas geogrficas del mundo. La epidemiologa de ERG es diferente en EE.UU. y en Europa. En EE.UU. se pro-dujo un rpido aumento de brotes nosocomiales que condujo a una situacin endmica en ciertos hospita-les. En contraste, en Europa ERG se aisl inicialmente de fuentes comunitarias (personas sanas, y animales). Este reservorio comunitario se relacion con el amplio uso de avoparcina, un glucopptido utilizado como promotor de crecimiento de animales de granja hasta su prohibicin en 1997. La resistencia a los glucopp-tidos se asocia mayoritariamente a cepas de E. fae-cium resistentes a la ampicilina. Los datos del EARS-Net en 2013 mostraban importantes diferencias en la prevalencia de ERG en los distintos pases europeos. Segn esos datos, la prevalencia media de resistencia a vancomicina en E. faecium de sangre fue del 8,9%, pero cinco pases mostraban porcentajes superiores

al 20% (Grecia, Portugal, Chipre, Reino Unido e Irlan-da). En Espaa la prevalencia de E. faecium resistente a vancomicina segn los datos de EARS-Net fue del 0,9% en 2013.

La resistencia adquirida a glucopptidos en enteroco-co est mediada por 9 operones diferentes denomina-dos van (vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG, vanL, vanM, vanN). Dos de estos (vanA y vanB), los ms frecuentes y con mayor relevancia clnica, han sido descritos principalmente en E. faecalis y E. faecium. El gen vanA confiere resistencia inducible de alto nivel a vancomicina y teicoplanina, y se adquiere a travs del transposn Tn1546 o de transposones relaciona-dos con la familia Tn3. El gen vanB confiere resistencia inducible de alto o moderado nivel a vancomicina y permanece sensible a teicoplanina, y con frecuencia se encuentra presente en el transposn Tn5382 junto con la resistencia a ampicilina.

Aunque el porcentaje de infecciones por ERG en nuestro medio es muy bajo, con cierta frecuencia se describe la aparicin de brotes hospitalarios. Entre los factores de riesgo relacionados con la colonizacin/infeccin por ERG se han descrito el tratamiento an-tibitico previo (vancomicina y cefalosporinas), los in-gresos prolongados, la patologa de base, la alta tasa de colonizacin por ERG en el hospital, la exposicin a superficies o a equipos contaminados y la estancia previa en residencias de larga estancia o centros so-ciosanitarios. Las especies de E. faecium o E. faecalis con resistencia a vancomicina (CMI >4 mg/L) son las de mayor inters epidemiolgico y requieren vigilancia microbiolgica.

4.2. MTODOS BASADOS EN EL CULTIVO

4.2.1. Seleccin de medios de cultivo y condi-ciones de incubacinLos medios ms frecuentemente utilizados son los selectivos y diferenciales que permiten la deteccin rpida de ERG a partir de muestras altamente conta-minadas. Estos medios contienen vancomicina como agente selectivo, habitualmente a concentraciones de 6-8 mg/L, y otros componentes como esculina, sales biliares, y azida sdica (agar BEAV) que facilitan el cre-cimiento e identificacin de enterococos.

Existen diferentes tipos de medios comercializados, lquidos y slidos, que se pueden utilizar en el cribado de ERV. Entre estos estn Enterococcosel agar (BEAV) (BD Diagnostics), y recientemente se han introducido varios medios cromognicos como son: ChromoID

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VRE (bioMrieux), CHROMagar VRE (BD Diagnostics), VRESelect (Bio-Rad), y Spectra VRE (Remel). Estos medios incorporan cromgenos que facilitan la distin-cin de E. faecium y E. faecalis. Aunque estos medios cromognicos no han sido extensivamente evaluados, existen algunos estudios que muestran sensibilidades que oscilan entre el 92% y 95%, y especificidades en-tre el 96% y 99%. En general, el incremento del tiem-po de incubacin a 48 horas disminuye ligeramente la especificidad. Entre los microorganimos que dan re-sultados falsos positivos se encuentran otras especies de enterococos, Streptococcus spp., algunos bacilos gramnegativos, y Candida spp. Por otra parte, es im-portante tener en cuenta la posibilidad de resultados falsos negativos. La utilizacin de un medio de enri-quecimiento previo a la inoculacin en el medio cro-mognico puede aumentar la sensibilidad. Se ha des-crito que la sensibilidad disminuye cuando la densidad de ERG en heces est disminuida, y cuando la CMI de vancomicina es

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ficidad del 100% y 92,6%, respectivamente. Para la deteccin del gen vanB la sensibilidad era del 100% y 87,5%, y la especificidad del 20,6% y 14,7%. Estos resultados no confirman ni descartan de una forma se-gura la colonizacin por ERG.

En caso de realizar alguno de estos ensayos, la infor-macin de resultados es la siguiente:

1. Se detecta el gen vanA, vanB, o ambos. Se re-quiere cultivo para confirmar los resultados.

2. No de detectan los genes vanA / vanB. Se requie-re cultivo para confirmar los resultados.

3. Resultado indeterminado o no vlido. Esto pue-de ocurrir por algn fallo en el procedimiento tc-nico, y habitualmente el programa informtico de interpretacin de los resultados indica el tipo de error. Se requiere nueva muestra.

5. ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETA-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO (BLEE), AmpC PLASMDICAS (AmpC-p) Y CARBAPENEMASAS (EPC).

5.1. IMPACTO CLNICO Y EPIDEMIOLGICO

Las enterobacterias son unos de los principales agen-tes causales de infeccin, tanto nosocomial como adquirida en la comunidad, en humanos. En conjunto representan el grupo de bacterias patgenas aislado con ms frecuencia en infecciones de orina y bacte-riemias; adems incluyen algunas de las especies co-mensales habituales en humanos.

La aparicin y diseminacin de enterobacterias resis-tentes a cefalosporinas de amplio espectro en la lti-ma dcada, principalmente debida a las BLEE, se ha convertido en una de las principales amenazas para el tratamiento antibitico de las infecciones produci-das por estas bacterias. Los primeros casos de BLEE en enterobacterias descritos en Klebsiella spp. y En-terobacter spp. productores de enzimas derivadas de las beta-lactamasas TEM y SHV, se limitaban casi exclusivamente a centros hospitalarios donde ocasio-nalmente generaban importantes brotes. A finales del siglo XX, importantes cambios epidemiolgicos facili-taron la amplia diseminacin de las BLEE: 1) E. coli se convirti en la principal especie portadora de BLEE lo que gener el aumento de las infecciones adquiridas en la comunidad, principalmente infecciones del tracto urinario, producidas por estas cepas; y 2) la apari-cin de una nueva familia de BLEE, las CTX-M, muy

diferente a las previas derivadas de TEM o SHV y cuyo origen se atribuye a genes cromosmicos propios de especies ambientales del gnero Kluyvera.

En Espaa, las BLEE, sobre todo del tipo CTX-M-15 y SHV-12, se han extendido rpidamente en E. coli y K. pneumoniae alcanzando prevalencias globales de alrededor del 15% en ambas especies. Segn datos de la Red de Vigilancia Europea de la Resistencia a Antibiticos, EARS-Net, la resistencia a cefalosporinas de tercera generacin en aislamientos de sangre de Escherichia coli aument en Espaa del 0,5% en 2001 al 13,9% en 2013 (http://ecdc.europa.eu/en/healthto-pics/antimicrobial_resistance/database/Pages/data-base.aspx).

Aunque con una prevalencia inferior a las BLEE, las AmpC-p estn emergiendo como una amenaza adi-cional a la actividad de las cefalosporinas de amplio espectro en muchas regiones. Las beta-lactamasas cromosmicas inducibles de tipo AmpC estn presen-tes en muchas enterobacterias como Citrobacter fre-undii, Enterobacter spp., Providencia spp., Morganella morganii o Serratia marcescens, pero la posibilidad de diseminacin es mayor cuando los genes que las codi-fican estn movilizados por plsmidos. Las principales tipos de AmpC-p son CIT y DHA que afectan a algu-nas de las familias de enterobacterias ms comunes como son E. coli, K. pneumoniae y Proteus mirabilis. Especialmente K. pneumoniae productora de AmpC-p se ha asociado a brotes nosocomiales en pacientes con factores de riesgo en los que se ha descrito una alta morbi-mortalidad.

La frecuente asociacin de produccin de BLEE, y/o AmpC-p, con resistencia a otros antibiticos como fluo-roquinolonas y aminoglucsidos ha reducido el abanico teraputico convirtiendo a los antibiticos carbapen-micos en el tratamiento de primera opcin en las in-fecciones graves por estas bacterias. El aumento del consumo de antibiticos carbapenmicos ha llevado en pocos aos a la aparicin de cepas resistentes frente a ellos y, como consecuencia, resistentes a la prctica totalidad de los antibiticos disponibles. En la actuali-dad, la mayor amenaza en el campo de la resistencia a antibiticos en enterobacterias se debe a la rpida dise-minacin de cepas con MDR y XDR debida a la produc-cin de carbapenemasas transmitidas por plsmidos.

Las carbapenemasas son enzimas capaces de hidro-lizar la gran mayora de los antibiticos carbapenmi-cos y que se agrupan, en su mayora, en tres clases segn la clasificacin molecular de Ambler: 1) Clase

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A, principalmente enzimas del tipo KPC; 2) Clase B o metalo--lactamasas (MBL) dependientes de zinc, principalmente enzimas del tipo VIM, IMP y NDM; 3) Clase D, principalmente OXA-48.

Un estudio multicntrico realizado en 2013 (proyecto GEIH-GEMARA-REIPI) mostr que OXA-48 (71,5%) y VIM-1 (25,3%) fueron las carbapenemasas ms fre-cuentes en enterobacterias en Espaa, y K. pneumo-niae (74,4%), Enterobacter cloacae (10,3%), y E. coli (8,4%) las especies ms afectadas. En este mismo trabajo se observ una prevalencia del 1,7% de pro-duccin de carbapenemasas en aislamientos clnicos de K. pneunoniae, lo que mostraba una importante evolucin desde el 0,2% detectado en 2009. Adems de detect una amplia diseminacin de algunos clo-nes exitosos (tambin denominados de alto riesgo) de K. pneumoniae como ST11/OXA-48, ST15/OXA-48, ST405/OXA-48 y ST11/VIM-1.

Aunque con una prevalencia menor, otras carbapene-masas como las KPC y las NDM tambin estn au-mentado en Espaa generando importantes brotes intra- e interhospitalarios.

En la actualidad, mediados de 2015, se han detec-tado brotes de K. pneumoniae productora de carba-penemasa en la mayora de las regiones espaolas, algunos de ellos epidemiolgicamente relacionados a pesar de encontrarse en diferentes provincias incluso diferentes comunidades autnomas. Este escenario sugiere una diseminacin interregional, situacin epi-demiolgica rpidamente evolutiva desde previas con-sideraciones de brotes hospitalarios independientes y de diseminacin regional establecidas en 2010 y 2013, respectivamente.

Las alternativas teraputicas en estos casos son muy escasas y casi nunca ptimas e incluyen tratamien-to combinados con colistina, tigeciclina, fosfomicina, amikacina o los mismos antibiticos carbapenmicos siempre que presenten CMIs inferiores o incluso iguales a 8 mg/L. Diversos estudios han comunicado una alta morbi-mortalidad atribuida a las enterobacterias pro-ductoras de carbapenemasas, aunque difcil de esta-blecer debido a que en su gran mayora producen infec-ciones en pacientes con importante patologa de base.

La importancia de los portadores sanos en la persis-tencia y diseminacin de brotes o endemias por en-terobacterias productoras de BLEE/AmpC-p y car-bapenemasas est bien documentada. Numerosos estudios han demostrado la persistencia de esta co-

lonizacin incluso en un ambiente extrahospitalario y sin consumo de antibiticos. Por otra parte, algunos autores sugiren la posibilidad de que el estado de por-tador de enterobacterias con BLEE del tipo CTX-M- est evolucionando hacia una pandemia.

Mientras que la vigilancia de la colonizacin por ente-robacterias productoras de BLEE y carbapenemasas debera abarcar cualquier especie de enterobacteria, la vigilancia de la produccin de AmpC-p debera res-tringirse a aquellas enterobacterias que han demos-trado un importante potencial epidmico en la disemi-nacin de AmpC-p y que no poseen beta-lactamasas cromosmicas del tipo AmpC. Por tanto, en general se recomienda la vigilancia de AmpC-p en K. pneu-moniae y P. mirabilis, aunque siempre adaptada a la situacin epidemiolgica de cada centro.

5.2. MTODOS BASADOS EN CULTIVO

5.2.1. BLEE y AmpC plasmdicas

5.2.1.1. Seleccin de medios de cultivo y con-diciones de incubacinComo norma general es necesario emplear medios selectivos que permitan recuperar enterobacterias re-sistentes a cefalosporinas de 3 generacin y que evi-ten el crecimiento de la microbiota comensal sensible. Diferentes medios como el agar MacConkey o agar de Driglasky suplementado con cefotaxima o cefta-zidima han demostrado su utilidad. El uso de ceftazi-dima en vez de cefotaxima como antibitico selector puede disminuir la sensibilidad del mtodo debido a la alta prevalencia en algunas zonas de BLEEs del tipo CTX-M con CMIs bajas a ceftazidima. Cabe destacar que con estos medios se detectan bacterias resisten-tes al antibitico selector, tanto productores de BLEEs como de AmpC-p e incluso de carbapenemasas, que posteriormente se deben confirmar tanto en la espe-cie como en el mecanismo. Adems de las entero-bacterias productoras de AmpC-p, en estos medios pueden crecer enterobacterias que poseen beta-lac-tamasas cromosmicas que hidrolizan las cefalospo-rinas y son inhibidas por el cido clavulnico, y cuya hiperproduccin puede dar lugar a un patrn fenotpi-co de resistencia compatible con la presencia de una BLEE. Entre ellas se encuentra la beta-lactamasa K1 de Klebsiella oxytoca, la SHV-1 de K. pneumonie y las cefalosporinasas CepA de Proteus vulgaris y Proteus penneri.

Recientemente se han desarrollado diferentes medios cromognicos para el aislamiento selectivo y la identi-

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ficacin presuntiva de enterobacterias productoras de BLEE en 24 horas. Entre ellos se encuentra el Chro-mID ESBL (bioMrieux), Brilliance ESBL agar (Oxoid) y el CHROMagar ESBL. Aunque estos medios son en general muy sensibles y aportan una identificacin de especie presuntiva en base a un cdigo colorimtrico, todo resultado positivo debe ser confirmado antes de su informacin.

5.2.1.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultadosA pesar de que algunos de los medios selectivos pre-sentan una alta sensibilidad para la deteccin de en-terobacterias con BLEE, la especificidad no siempre es tan alta en referencia tanto al mecanismo de resis-tencia como a la especie. Por tanto, cualquier creci-miento debe ser confirmado a nivel de especie, me-diante pruebas bioqumicas convencionales, galeras comerciales, paneles automatizados o espectrometra de masas MALDI-TOF.

Una vez documentado el crecimiento de una ente-robacteria en el medio selectivo correspondiente se proceder al estudio de sensibilidad a antibiticos be-ta-lactmicos y pruebas fenotpicas que confirmen la presencia de una BLEE o una AmpC-p. La deteccin fenotpica de BLEE y AmpC-p est revisada previa-mente en el Procedimiento de Microbiologa clnica de la SEIMC n 38: Deteccin fenotpica de mecanismos de resistencia en gramnegativos. Recientemente, EUCAST ha elaborado unas guas para la deteccin de mecanismos de resistencia de importancia clnica y epidemiolgica (EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of cli-nical and/or epidemiological importance). La Tabla 3 resume los mtodos fenotpicos de confirmacin de BLEE en enterobacterias recomendados por EUCAST.Especialmente complicada puede resultar la caracte-rizacin fenotpica de BLEE en especies bacterianas con una beta-lactamasa AmpC cromosmica, en es-tos casos se recomienda el uso de cefepime con y sin clavulnico debido a la mayor estabilidad de este antibitico frente a la hiperproduccin de dichas beta-lactamasas cromosmicas.

Aunque an infrecuente, la coproduccin de una BLEE y una AmpC-p en K. pneumoniae est aumentando y puede dar un fenotipo difcil de caracterizar. La compa-racin de la recuperacin de la actividad de cefotaxi-ma y/o ceftazidima en presencia de cido clavulnico, cido fenil-bornico y ambos mediante la tcnica de difusin disco-placa ayuda a detectar fenotpicamente la presencia de ambos mecanismos.

5.2.1.3. Informacin de los resultadosEl aislamiento de una enterobacteria en la que se con-firma la produccin de una BLEE se informar como Se aisla [nombre de especie] productora de BLEE.

Si tras 48 horas el cultivo es negativo o bien no se con-firma la presencia de una enterobacteria productora de BLEE se informar como No se aislan enterobacterias productoras de BLEE.

El aislamiento de una cepa de K. pneumoniae o de P. mirabilis en las que se confirma la produccin de una AmpC-p se informar como Se aisla [nombre de es-pecie] productora de AmpC-p.

Si tras 48 horas el cultivo es negativo o bien no se confirma la presencia de K. pneumoniae o P. mirabilis productor de AmpC-p se informar como No se ais-lan [nombre de especie] productor de AmpC-p.

En cualquier caso, el diseo del informe de resultados debe realizarse en funcin de los objetivos especficos perseguidos por el programa de vigilancia que se est realizando.

5.2.2. Carbapenemasas

5.2.2.1. Seleccin de medios de cultivo y con-diciones de incubacinLa mayora de los medios selectivos para la detec-cin de resistencia a cefalosporinas de 3 generacin pueden utilizarse para el cribado de carbapenemasas realizando una comprobacin ulterior de dicha pro-duccin. Esta aproximacin presenta el inconveniente de la gran carga extra de trabajo que supone la com-probacin de todos los aislamientos BLEE que en muchas zonas geogrficas presentan una alta preva-lencia. Adems, se perderan los aislamientos produc-tores de la carbapenemasa OXA-48 (carbapenemasa que no confiere resistencia a las cefalosporinas de 3 generacin) no productores de BLEE ni AmpC; aun-que estos aislamientos son infrecuentes en K. pneu-moniae, no los son tanto en E. coli y, en general, estn aumentando.

Se han utilizado diferentes medios selectivos para la deteccin especfica de enterobacterias resistentes a antibiticos carbapenmicos, principalmente el agar MacConkey suplementado con concentraciones ba-jas de carbapenmicos (1 mg/L de imipenem) o con el uso de discos de 10 g de imipenem o ertapenem. Sin embargo, se puede optimizar la sensibilidad de estas tcnicas si se realiza un enriquecimiento previo intro-

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duciendo el hisopado rectal en un caldo BHI en el que se ha introducido un disco de 10 g de imipenem, tras incubacin de 18-24 h a 35-37C se realiza un sub-cultivo en una placa de agar MacConkey a partir de este caldo y se situa sobre el subcultivo otro disco de 10 g de imipenem, incubndose 18-24 h a 35-37C; la presencia de carbapenemasas se debera confirmar en aquellas colonias que crezcan alrededor del disco de imipenem.

Debido a que meropenem parece ser el antibitico carbapenmico con un mayor equilibrio entre sensibli-dad y especificidad para detectar EPC, cualquiera de las tcnicas previamente descritas podra beneficiarse del uso de este antibitico en lugar de imipenem y er-tapenem.

En los ltimos aos se han desarrollado diferentes me-dios cromognicos con suplementos que impiden el

crecimiento de las bacterias sensibles a carbapen-micos. Entre ellos se encuentran los medios chromID (bioMrieux, Francia) que incluyen el CARBA medium (detecta cepas productoras de KPC y metalo-beta-lac-tamasas), el OXA-48 medium (especfico para cepas productoras de OXA-48) y el CARBA SMART medium (medio biplaca que permite la detecin de carbapene-masas en la mitad de la placa y especificamente de carbapenemasas OXA-48 en la otra mitad); el medio CRE Brilliance (Thermo Fisher Scientific, UK), y el me-dio SUPERCARBA, que contiene agar Driglasky, erta-penem, cloxacilina y sulfato de zinc. Excepto los dos primeros, que deberan ser utilizados en conjunto, es-tos medios han demostrado una alta sensibilidad para detectar cualquier tipo de las carbapenemasa actual-mente circulantes en enterobacterias.

Para la utilizacin de cualquiera de los medios basa-dos en el cultivo se parte de una torunda rectal que

Tabla 3. Mtodos fenotpicos de confirmacin de BLEE en enterobacterias positivas en el cribado de BLEE

segn EUCAST.

MtodoAntibitico

(Carga del disco)La confirmacin de BLEE: es positiva si

Tiras con gradiente de

antibitico

Cefotaxima +/- cido clavulnicoRazn de CMIs 8 o deformacin de la

elipse

Ceftazidima +/- cido clavulnico CMI ratio 8 o deformacin de la elipse

*Cefepima +/- cido clavulnico CMI ratio 8 o deformacin de la elipse

Comparacin halos de

inhibicin con y sin cido

clavulnico

Cefotaxima (30 g) +/- cido clavulnico

(10 g)Aumento del halo de inhibicin 5 mm

Ceftazidima (30 g) +/- cido clavulnico

(10 g)Aumento del halo de inhibicin 5 mm

*Cefepima (30 g) +/- cido clavulnico

(10 g)Aumento del halo de inhibicin 5 mm

Microdilucin en caldo

Cefotaxima +/- cido clavulnico

(4 mg/L)Razn de CMIs 8

Ceftazidima +/- cido clavulnico

(4 mg/L)Razn de CMIs 8

*Cefepima +/- cido clavulnico (4 mg/L) Razn de CMIs 8

Test de sinergia con

discos de cefalosporinas

y amoxicilina cido

clavulnico

Cefotaxima, ceftazidima y *cefepima

Aumento del halo de inhibicin de al

menos una de las cefalosporinas haca

el disco de amoxicilina/cido clavulnico

* Para enterobacterias que poseen una AmpC cromosmica (Enterobacter spp, Serratia spp., Citrobacter

freundii, Morganella morganii, Providencia spp.) se debe utilizar cefepima debido a su mayor estabilidad ante la

hiperproduccin de dicha AmpC.

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se inocula directamente en el medio y se procede a su lectura a las 18-24 horas y a las 48 horas; excep-to para aquellos casos en los que se proceda a un enriquecimiento previo. Para un mayor rendimiento es importante que la torunda rectal contenga heces, siempre que sea posible.

5.2.2.2. Pruebas de confirmacin y criterios para la interpretacin de los resultadosUna vez obtenido crecimiento en los medios especfi-cos habra que confirmar la especie de enterobacteria que se trata y la sensibilidad a carbapenmicos. Se recomienda estudiar la produccin de carbapenema-sa en las cepas en las que los valores de CMI de los carbapenmicos se incrementan por encima de los correspondientes puntos de corte epidemiolgicos, EUCAST los ha establecido recientemente en >0,12 mg/L para ertapenem y meropenem y >1 mg/L para imipenem (EUCAST guidelines for detection of resis-tance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance). En los ltimos aos se han desarrollado diferentes pruebas que per-miten la confirmacin fenotpica de la produccin de carbapenemasas como son el test de Hodge modi-ficado, la medicin de la hidrlisis de los antibiticos carbapenmicos por espectrofotometra, los mtodos basados en la inhibicin especfica de las diferentes clases de carbapenemasas, los mtodos colorimtri-cos basados en el cambio de pH (CarbaNP y BlueCar-ba), y el mtodo recientemente descrito de la inacti-vacin de carbapenmicos (carbapenem inactivation method o CIM). El CarbaNP se recomienda por el CLSI como mtodo de confirmacin de la produccin de carbapenemasa.

Las tcnicas de espectofotometra permiten la detec-cin de la hidrlisis de los antibiticos carbapenmi-cos y por tanto la produccin de carbapenemasas, la comparacin de dicha hidrlisis en presencia y ausen-cia de inhibidores carbapenemasas de clase B (EDTA o cido dipicolnico) o de clase A (tazobactam o cido clavulnico) ayudan a la caracterizacin de este tipo de enzimas. Se trata de una tcnica considerada de referencia pero que no es fcilmente asequible para la mayora de los laboratorios de Microbiologa Clnica.

Los mtodos colorimtricos se basan en la detec-cin del cambio de pH que produce la hidrlisis del antibitico carbapenmico mediante una escala colo-rimtrica. Este mtodo se puede utilizar con cultivos bacterianos en agar Mueller-Hinton, agar sangre o la mayora de los medios selectivos usados para el cri-bado de carbapenemasas; sin embargo en el caso del

CarbaNP se desaconseja su uso en colonias desde agar Drigalski o agar McConkey. Son mtodos muy sensibles y especficos que necesitan de un cuidado-so cumplimiento de todos sus pasos para obtener un mximo rendimiento. En cepas productoras de OXA-48, con el CarbaNP se puede detectar un viraje de color (rojo a amarillo) menor del esperado, alcanzado un color anaranjado en vez de amarillo que puede difi-cultar su interpretacin.

El test de Hodge modificado es una tcnica sencilla y ampliamente utilizada para la deteccin de la actividad carbapenemasa. A pesar de ser un mtodo recomen-dado por el CLSI, tiene detractores debido a la pre-sencia de falsos negativos (fundamentalmente MBL, que se pueden evitar en gran parte aadiendo sulfato de zinc al medio) y de falsos positivos (fundamental-mente cepas con hiperproduccin de AmpC ms pr-dida de porinas, que se puede solventar en gran parte aadiendo cloxacilina u oxacilina al medio). Su lectu-ra conjunta con las tcnicas basadas en inhibidores de carbapenemasas aporta una informacin rpida y fcilmente interpretable. Para su realizacin se reco-mienda el uso de discos de ertapenem o meropenem en vez de imipenem.

Las carbapenemasas de clase A hidrolizan todos los beta-lactmicos y son inhibidas por el cido fenil bor-nico, por tanto los estudios fenotpicos para la carac-terizacin de estas carbapenemasas se basan en la recuperacin de la actividad de los antibiticos carba-penmicos en presencia de este compuesto. Dichos estudios se pueden realizar mediante difusin disco-placa o mediante dilucin en agar, aunque lo ms habitual es comparar el halo de inhibicin de discos/tabletas de meropenem (10 g) con y sin cido fenil bornico. Esta tcnica tiene una alta sensibilidad pero muy baja especificidad por los falsos positivos que se producen en cepas productoras de AmpC ms dismi-nucin de permeabilidad por prdida de porinas; este problema se puede evitar probando en paralelo discos de meropenem con y sin cloxacilina (u oxacilina). Si se detecta recuperacin de la actividad de meropenem (halo 5 mm) con cido fenil bornico y cloxacilina se atribuir la disminucin de sensibilidad a antibiticos carbapenmicos a la produccin de AmpC ms per-dida de porinas, si se detecta recuperacin slo en presencia de cido fenil bornico se sospechar pro-duccin de carbapenemasa de clase A.

Las carbapenemasas de clase B hidrolizan todos los antibiticos carbapenmicos excepto aztreonam y se inhiben por quelantes del zinc como el EDTA y cido

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dipicolnico. No obstante, es frecuente que los aisla-mientos productores de carbapenemasa de clase B sean resistentes a aztreonam por la co-produccin de BLEE o de beta-lactamasas de tipo AmpC, ya sean cromosmicas o adquiridas. Se han desarrollado di-ferentes pruebas en diferentes formatos (difusin dis-co-placa, tiras con gradientes de concentracin de antibitico, microdilucin) basados en la inhibicin de las carbapenemasas de clase B por EDTA o cido di-picolnico utilizando imipenem, meropenem e incluso ceftazidima como sustratos. EUCAST recomienda el uso de discos/tabletas de meropenem (10 g) con y sin EDTA o cido dipicolnico; la recuperacin de la ac-tividad de meropenem (halo 5 mm) se interpretar como produccin de una carbapenemasa de clase B. El EDTA tiene cierta actividad intrnseca frente a algu-nas cepas (tambin se puede observar con el cido dipicolnico pero con menos frecuencia), en estos ca-sos se puede detectar una recuperacin en el lmite (5-6 mm) en ausencia de carbapenemasas de clase B, este hecho se puede evaluar probando el halo de inhi-bicin que tiene un disco que contenga slo EDTA. En cepas con sospecha de producir una carbapenemasa de clase A que sean resistentes a aztreonam se puede demostrar la co-produccin de una BLEE probando la recuperacin de la actividad de aztreonam en presen-cia de cido clavulnico.

Las carbapenemasas de clase D, principalmente OXA-48, hidrolizan en mayor o menor grado antibiticos carbapenmicos sin afectar (ceftazidima, cefepime) o hacindolo a muy bajo nivel (cefotaxima) a las cefalos-porinas de amplio espectro. No obstante, las cepas productoras de OXA-48 presentan una alta asocia-cin, ms en K. pneumoniae que en otras especies como E. coli o Enterobacter spp., con la produccin de BLEE. Estas enzimas no se inhiben por cido cla-vulnico, cido fenil bornico, cloxacilina, EDTA o ci-do dipicolnico, pero s suelen presentar resistencia de alto nivel a temocilina (>64 mg/L) y piperacilina/tazo-bactam. Por tanto, una primera aproximacin para la sospecha de produccin de OXA-48 podra ser la presencia de disminucin de sensibilidad a algn anti-bitico carbapenmico, cuya actividad no se recupera con ningn inhibidor, y que presente alto nivel de re-sistencia a temocilina y piperacilina/tazobactam, con-siderando tanto las cepas sensibles a cefalosporinas de 3 generacin como las que presentan un perfil de produccin de BLEE. Sin embargo, las resistencias a temocilina y piperacilina/tazobactam no son marcado-res especficos de OXA-48, por lo que para la confir-macin de carbapenemasas de clase D es altamente recomendable la realizacin de un mtodo genotpico.

Alternativamente, existen mtodos enzimticos co-mercializados diseados para detectar la carbapene-masa OXA-48, que presentan una buena sensibilidad y especificidad, son de muy fcil realizacin y propor-cionan los resultados en 15 minutos. Estos mtodos enzimticos tambin se han comercializado para de-tectar carbapenemasas de tipo IMP.

En general, la presencia de mecanismos mixtos de resistencia a antibiticos carbapenmicos (carbape-nemasas, BLEE y/o AmpC ms pdida de porinas u otros) dificultan en gran medida la tcnicas de confir-macin fenotpica a nivel de clase. Para estos casos, y en general para acelerar la obtencin del resultado confirmatorio a nivel de clase, se aconseja la utilizacin de tcnicas moleculares (ver apartado 6.3.2 de este documento).

La Figura 1 muestra un algoritmo de actuacin para la confirmacin de mecanismos de resistencia a antibi-ticos carbapenmicos en enterobacterias.

5.2.2.3. Informacin de los resultadosEl aislamiento de una enterobacteria en la que se con-firma la produccin de una carbapenemasa se infor-mar como Se aisla [nombre de especie] productora de carbapenemasa.

Si los resultados fenotpicos son muy sugerentes de la clase de carbapenemasa producida se informar como Se aisla [nombre de especie] productora de carbapenemasa con alta sospecha de pertenecer a la clase [A o B o D]

Si tras 48 horas el cultivo es negativo o bien no se con-firma la presencia de una enterobacteria productora de carbapenemasas se informar como No se aislan enterobacterias productoras de carbapenemasa.

En cualquier caso, el diseo del informe de resultados debe realizarse en funcin de los objetivos especficos perseguidos por el programa de vigilancia que se est realizando.

5.3. MTODOS MOLECULARES PARA LA DETECCIN DE BLEE, AmpC-p Y CARBAPENEMASAS

5.3.1. Tipos de mtodos moleculares y selec-cin Existen diferentes mtodos moleculares rpidos que permiten detectar genes adquiridos de resistencia a antibiticos beta-lactmicos de amplio espectro en

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enterobacterias. Se clasifican en funcin del nmero de genes buscados (PCR simple o PCR mltiple) y de la tcnica utilizada (PCR en tiempo real, microarray y pirosecuenciacin).

La amplificacin de ADN mediante PCR simple con-vencional permite la identificacin de un solo gen y re-quiere de iniciadores especficos para la diana busca-da. Aunque es posible distinguir variantes allicas muy

Temocilina 64 mg/L y resistencia a

piperacilina/tazobactam. Perfil de BLEE ms leve

elevacin de CMI a carbapenmicos

ertapenem

Resistencia a todos los -lactmicos + CMIs

elevadas a antibiticos carbapenmicos

Temocilina > 64 mg/L y sensible a cefalosp. De amplio espectro y/o perfil de BLEE

-

CMI de meropenem >0,12 mg/LHalo de inhibicin de meropenem

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similares con el diseo de iniciadores que incluyan los lugares de variacin entre alelos, en general para la caracterizacin de variantes allicas especficas se requiere una posterior secuenciacin del amplicn obtenido. Por otra parte, mediante una PCR conven-cional simple con iniciadores degenerados se pueden detectar diferentes variantes de una misma familia, por ejemplo para la deteccin de los diferentes grupos de las BLEE de la familia CTX-M.

La utilizacin de PCRs mltiples permite la caracteri-zacin de diferentes mecanismos en una sola reac-cin de amplificacin, circunstancia especialmente til en el estudio de beta-lactamasas de amplio espectro debido a su diversidad. Requiere de varios pares de iniciadores que sean altamente especficos de la diana a amplificar, que tengan condiciones de amplificacin semejantes y que amplifiquen fragmentos de tamaos diferentes que permitan su fcil diferenciacin. En la l-tima dcada se han propuesto diferentes PCRs mlti-ples para la deteccin de genes que codifican enzimas plasmdicas de tipo AmpC, BLEEs y carbapenemasas. Se han descrito diferentes limitaciones a algunas de estas tcnicas entre las que destacan el tamao poco discriminativo de los amplicones que dificulta su dife-renciacin, la utilizacin de diferentes condiciones de amplificacin que obliga a realizar varias PCRs mlti-ples en paralelo, la amplificacin cruzada con genes de beta-lactamasas cromosmicas intrnsecas de de-terminadas especies y, en general, la inclusin de un nmero limitado de genes, con frecuencia agrupados por familias como carbapenemasas de clase A o de clase B. Recientemente se han comercializado dife-rentes sistemas basados en PCRs mltiples y algunas permiten el diagnstico rpido de BLEE y carbapene-masas, en general con una alta sensibilidad y especi-ficidad.

Existen otros mtodos moleculares alternativos a los mtodos basados en PCR. El microarray es una me-todologa muy til para analizar un gran nmero de ge-nes en un mismo ensayo y poder detectar variaciones nucleotdicas de un alelo. Es una tecnologa verstil, fcil de aplicar y de actualizar. Diferentes microarrays comerciales para la deteccin de genes codificantes de BLEE, AmpC-p y carbapenemasas han demostra-do una alta sensibilidad y especificidad.

Recientemente se han desarrollado mtodos alterna-tivos para la deteccin molecular de BLEEs y carba-penemasas, entre ellos destacan la amplificacin iso-trmica mediada por bucle (loop-mediated isothermal amplification, LAMP).

Como se ha ido reflejando en el texto, se han comer-cializado en los ltimos aos numerosos mtodos moleculares de deteccin rpida de BLEE, AmpC y carbapenemasas en muestras rectales; la Tabla 4 re-sume algunos de los principales mtodos comerciales disponibles.

5.3.2. Criterios para la interpretacin e infor-macin de los resultadosLos mtodos moleculares deben ser utilizados y eva-luados en un contexto multidisciplinar acorde con la si-tuacin especfica de cada hospital. Aunque los mto-dos moleculares pueden alcanzar una alta sensibilidad y especificidad no pueden reemplazar en su totalidad al cultivo microbiolgico, que sigue siendo el procedi-miento de referencia en la mayora de los protocolos y que permite comprobar la identificacin de la especie, la viabilidad de la cepa, y realizar estudios fenotpicos y epidemiolgicos ulteriores.

La deteccin mediante mtodos moleculares de un gen codificante de una beta-lactamasa de amplio es-pectro directamente de muestra clnica debe informar-se especificando la metodologa empleada pero no la especie, la cual desconocemos con este tipo de apro-ximaciones.

Por tanto se informar como Mediante [mtodo em-pleado] se detecta la presencia de un gen codificante de [tipo de BLEE, AmpC-p o carbapenemasa] Por ejemplo, Mediante PCR en tiempo real se detecta la presencia de un gen codificante de carbapenemasa tipo NDM

En el caso de que se haya aplicado el mtodo mo-lecular para confirmacin sobre colonia bacteriana previamente identificada y con sospecha fenotpica se debe informar tambin la especie: Se aisla [nombre de la especie] productora de [tipo de BLEE, AmpC-p o carbapenemasa]. Por ejemplo, Se asla Enterobacter cloacae productor de carbapenemasa tipo VIM.

Dependiendo del mecanismo y de la tcnica empleada se podr especificar la beta-lactamasa concreta que se detecta o bien, que es lo ms habitual, un grupo o familia. En la mayora de los casos, la caracteriza-cin del mecanismo concreto slo se puede hacer tras la secuenciacin completa del gen que lo codifica. La deteccin de un beta-lactamasa perteneciente a un grupo de BLEE, AmpC-p o carbapenemasas se infor-mar como Mediante [mtodo empleado] se detecta la presencia de un gen codificante de [grupo/familia de BLEE, AmpC-p o carbapenemasa]. Por ejemplo, Me-

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Tabla 4. Mtodos comerciales para la deteccin molecular de BLEE, AmpC-p y carbapenemasas en muestras rectales*.

Mtodo Diana Nombre Compaa

PCR Mltiple ms hibridacin

TEM, SHV, CTX-M, OXA Hyplex ESBL Amplex Diagnostic

KPC, IMP, VIM, NDM y OXA-48 like Hyplex Superbug Amplex Diagnostic

OXA-23, OXA-24 y OXA-51 like Hyplex CarbOXA Amplex Diagnostic

NASBA (Amplificacin simple a tiempo real)

KPCNucliSENS EasyQ KPC Test

bioMerieux

PCR Mltiple a tiempo real

KPC, NDM, OXA-48, VIM, CTX-M-1, CTX-M-9

eazyplex SuperBug CRE

Amplex Diagnostic

KPC, NDM, OXA-48, VIM, OXA-23, OXA-40 y OXA-58 (A) o OXA-181 (B)

eazyplex SuperBug complete A and B Amplex Diagnostic

TEM, SHV, CTX-MPCR Check-MDR ESBL kit

Checkpoints Health BV

KPC, IMP, OXA-48 like, VIM y NDMPCR Check-MDR Carba kit

Checkpoints Health BV

KPC, IMP-1, OXA-48 like, VIM, NDMPCR Xpert Carba-R Assay

Cepheid/Werfen

CTX-M, IMP, KPC, NDM, OXA, VIM PCR ePlex BCID-GN GenMark Dx/ Werfen

ADN de E. coli, CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-9

PCR RealCycler CTXE

Progenie Molecular/ Werfen

CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-9 PCR RealCycler BLACTX

AmpC de los grupos ACC, EBC, CIT y DHA.

PCR RealCycler AMPC

IMP, VIM PCR RealCycler IMVI

KPC, NDM-1PCR RealCycler KPND

VIM, OXA-48 like, KPCPCR RealCycler OXVIKP

KPC, OXA-48, VIM, IMP, NDM-1/2, GES

LightMix Modular Assays

Roche Applied Science (TibMolBiol)

LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification)

Diseos in house

OC-SENSOR System. Compatible con PCR simples o mltiples a tiempo real.

Eiken Chemical CO, LTD

VIM, OXA-48, NDM, KPC, OXA-23, OXA-24, OXA-58, grupo CTX-M-1, grupo CTX-M-9

Eazyplex (Amplex) Menarini Diagnostics

Microarray

TEM, SHV, CTX-M , IMP, KPC, OXA-48 like

Check-MDR CT102 Checkpoints Health BV/HAIN Lifescience

SHV, CTX-M, AmpC, carbapenemasas,

Check-MDR CT103Checkpoints Health BV/HAIN Lifescience

KPC, OXA-48 o VIM/NDM Check-Direct CPECheckpoints Health BV/HAIN Lifescience

OXA, GIM, KPC, BLEE Identibac CarbDetect AS-1 Kit

Alere Technologies GmbH

* Varias de estas tcnicas han demostrado su eficacia sobre otras muestras clnicas diferentes a las torundas rectales

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diante PCR mltiple se detecta la presencia de un gen codificante de una BLEE del grupo CTX-M-1. Sobre colonia, el informe se realizar como Se aisla [nombre de la especie] productora de [grupo/familia de BLEE, AmpC-p o carbapenemasa]. Por ejemplo, Se aisla P. mirabilis productor de una AmC-p de la familia CIT.

La ausencia de deteccin se informar como Median-te [mtodo empleado] no se detecta la presencia de genes codi