1. INTRODUCCIÓN

Hoy en día son varios los ecosistemas en nuestro país que se encuentran

afectados, en mayor o menor grado, por la desertificación. Es así como el

Archipiélago de Juan Fernández, ubicado en el Océano Pacífico al oeste de la costa

de Chile continental, no escapa a este efecto, a pesar de estar protegido como

Parque Nacional, desde 1935 y como Reserva de la Biosfera, desde 1977, ya que

desde su descubrimiento por el navegante español Juan Fernández, en el año 1574,

comenzó la explotación de los recursos y se dio pie al deterioro de sus riquezas

naturales con la introducción de las primeras cabras, conejos, vegetales exóticos,

pestes de plantas, incendios y la sobre utilización por animales domésticos (bovinos,

caballares), dejándose una enorme huella en las comunidades de plantas nativas y

endémicas.

Debido a su accidentada geomorfología, un clima semi riguroso y, en especial, por

su flora y fauna, única en el mundo (endémica), constituye uno de los ecosistemas

más particulares, sorprendentes y de mayor interés botánico del mundo, lo que ha

estimulado una basta actividad de investigación y estudio de sus recursos,

existiendo actualmente más de 60 obras científicas sobre aspectos generales de la

vegetación del archipiélago y más de 80 trabajos botánicos específicos (CONAF,

1992).

La flora del archipiélago está compuesta por 131 especies endémicas (62% de la

flora nativa vascular), 12 géneros endémicos, y 1 familia endémica

(MARTICORENA, STUESSY y BAEZA, 1998). Sin embargo, a pesar de su

importancia botánica (un alto endemismo de géneros, especies y variedades), cerca

del 70% de las angiospermas endémicas se encuentran amenazadas de extinción.

Por esta razón, se tomaron medidas de conservación y recuperación de la

2

fitocenosis del Parque Nacional, donde, a partir del año 1985, se iniciaron los

primeros ensayos de propagación de algunas especies vegetales endémicas en las

instalaciones del Parque, llegando a tener sobre el 50% de ellas con técnicas

conocidas de propagación (RICCI y LEIVA, 2000; RICCI, 1998). Es así como, en

conjunto con la Corporación Nacional Forestal, en diversos viajes de colecta a las

islas se han llevado al vivero del Jardín Botánico Nacional, ubicado en Viña del Mar,

semillas de las especies endémicas, ensayándose diversas técnicas de

propagación. Además, el Gobierno de Chile, junto con el de Holanda, financiaron e

iniciaron, en el año 1997, un proyecto llamado “Conservation, Restoration and

Development of the Juan Fernández islands”, cuyo objetivo es la mantención y

reforestación de la flora nativa, y, a la vez, contribuir al desarrollo socioeconómico

de la población local, la cual está muy íntimamente ligada a los recursos naturales

de la isla (CONAF, 2001).

La idea es lograr afinar un protocolo que permita la propagación in vitro de 6

especies endémicas del Archipiélago de Juan Fernández, Isla Róbinson Crusoe,

con problemas de conservación, para la reforestación de su ecosistema y la posible

comercialización como plantas ornamentales y/o medicinales, evitando su extinción.

Para la presente investigación los objetivos son los siguientes:

Objetivos generales

- Preservar la flora nativa de nuestro país y endémica del Parque Nacional

Archipiélago de Juan Fernández, que se encuentra en estado de

conservación vulnerable y en peligro de extinción.

3

- Aplicar métodos de propagación in vitro a plantas del Archipiélago de Juan

Fernández, Isla Robinson Crusoe, que se encuentran en estado de

conservación a punto de extinción, en peligro de extinción, vulnerable y rara,

para la creación de bancos de germoplasma.

- Propagar una cantidad de plantas que permitan concretar las etapas

posteriores de enraizamiento y aclimatación.

Objetivos específicos

- Seleccionar plantas de los géneros Dendroseris, Robinsonia, junto con las

especies Ochagavia elegans, Plantago fernandezia, disponibles en el vivero

del Jardín Botánico Nacional.

- Desarrollar un protocolo para propagar in vitro estas plantas, manteniendo las

características de la planta madre.

- Describir la capacidad germinativa de Plantago fernandezia, bajo

determinadas condiciones.

4

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Descripción general del Archipiélago de Juan Fernández:

2.1.1. Ubicación.

CONAF (2001) señala que este grupo de tres islas, situado en el Océano Pacífico a

667 km de la costa de Chile continental (frente al puerto de San Antonio), está

compuesto por las islas Robinson Crusoe (Masatierra), con una superficie de 4.794

ha. (78º 51’ O, 33º 37’ S), Marinero Alejandro Selkirk (Masafuera), con una

superficie de 4.952 ha. y a 187 km al oeste de la primera (80º 45’ O, 33º 45’ S), y

Santa Clara, una pequeña isla de 221 ha. y a una distancia de 1,2 km al suroeste de

Robinson Crusoe, abarcando el archipiélago una superficie total de 9.967 hectáreas.

2.1.2. Clima.

Debido a la ubicación del Archipiélago de Juan Fernández, al oeste de la Corriente

marina de Humboldt, dispone de un clima oceánico, agradable, libre de heladas (a

nivel del mar), y con lluvias mucho más abundantes y mejor distribuidas que en las

tierras continentales de Chile a la misma latitud (MUÑOZ, 1969).

Según la CONAF (2003), presenta un clima mediterráneo continental con una fuerte

influencia oceánica, con una humedad ambiental elevada (76,5% de humedad

relativa), un promedio anual de temperatura de 15,2ºC con una amplitud térmica de

6,3ºC entre los meses más fríos y más cálidos. Las precipitaciones son abundantes

5

en los meses de otoño-invierno (BARRERA, 1997), las que decrecen entre los

meses de octubre y febrero, teniendo una media anual de 1041,5 mm. (CONAF,

2003), produciéndose un déficit hídrico en los meses de verano, sin embargo sobre

los 300 m.s.n.m. existe durante todo el año abundante neblina y humedad

(BARRERA, 1997).

COSIO y GÁLVEZ (2003), describen un Clima Templado Seco Estival, Provincia

Seco Estival Breve, desde la cota 0 a 400 m.s.n.m., y un Clima Templado Húmedo,

Provincia Húmedo de Verano Fresco, desde la cota 400 m.s.n.m. a las altas

cumbres (900-1000 m.s.n.m.).

2.1.3. Geología y Geomorfología.

Éstas son islas jóvenes de origen volcánico (MUÑOZ, 1969; STUESSY, SANDERS

y SILVA, 1984), con edades que varían entre 3.79 ± 0.20 y 4.23 ± 0.16 millones para

Robinson Crusoe (MARTICORENA, 1995; STUESSY et al., 1984); 1.01 ± 0.12 y

2.44 ± 0.14 millones de años para Alejandro Selkirk, y 5.80 ± 2.10 millones para

Santa Clara, las que tienen relación con su geomorfología, origen y evolución de la

flora nativa. Con respecto a la geomorfología, la Isla Robinson Crusoe presenta

amplios valles y un alto grado de erosión; en cambio, la Isla Alejandro Selkirk

presenta profundas quebradas y una erosión más suave (STUESSY et al., 1984).

Por otro lado, COSIO y GALVEZ (2003) describen la Isla Robinson Crusoe con una

predominancia del Distrito Cerrano y Montano, de altas pendientes, con algunos

sectores ondulados y una baja proporción de valles o sectores planos.

6

2.1.4. Ubicación Administrativa.

Corresponde a la Comuna de Juan Fernández y es administrada por la Provincia de

Valparaíso, Quinta Región de Valparaíso, Chile (CONAF, 2003).

Se ubica Geográficamente a una altitud entre 0 - 915 m.s.n.m., y Ecológicamente

dentro del Reino Templado, Dominio Seco Estival, Provincia Seco Estival Breve y

dentro del Reino Templado, Dominio Húmedo, Provincia Húmeda de Verano Fresco

(COSIO y GÁLVEZ, 2003).

2.1.5. Población.

Su población total es de 509 habitantes, lo que representa un 0.037% de la

población regional y un 0.062 % del nivel provincial (INE, 1992). Datos del Censo

Poblacional del año 2002, muestran un total de 633 personas, con una variación

intercensal del 29,7% (INE, 2003).

2.1.6. Grado de Protección.

En el año 1935 fue declarado Parque Nacional Archipiélago de Juan Fernández,

mediante el Decreto Supremo Nº 103 del Ministerio de Tierras y Colonización, para

la protección del patrimonio ecológico nacional. Posteriormente, en el año 1977 fue

declarado Reserva de la Biosfera por la UNESCO, integrando la Red Mundial de

Reservas de la Biosfera (CONAF, 2003).

7

2.2. Descripción Botánica del Archipiélago de Juan Fernández:

2.2.1. Características Generales de la Flora Vascular.

El médico y botánico alemán JOHOW (1896), en su análisis evolutivo de la Flora de

Juan Fernández señala un total de 236 especies, de las cuales existen 74 especies

nativas, 69 endémicas y 93 introducidas.

El botánico sueco SKOTTSBERG (1921) considera en su lista un total de 142

especies nativas, representadas en 40 familias y 80 géneros, de las cuales no

menos del 69% es endémica. Posteriormente, analiza en su conjunto la flora del

Archipiélago de Juan Fernández, conformando un total de 146 especies nativas y

137 especies adventicias, 16 de los 87 géneros son de naturaleza endémica (18,4%

correspondiente a 101 especies), es decir, el 70% del total de las especies

(SKOTTSBERG, 1953).

Contiene, según STUESSY et al. (1992), 361 especies de plantas vasculares, entre

las que se incluyen 53 helechos, 65 monocotiledóneas y 243 dicotiledóneas,

representadas en 75 familias y 213 géneros. En relación con el endemismo presenta

1 familia, 12 géneros y 126 especies (23 helechos, 15 monocotiledóneas y 88

dicotiledóneas), 29 de ellas (dicotiledóneas) son Asteráceas, es decir, un 33% de la

flora dicotiledónea endémica. De las angiospermas endémicas, el 97% son

perennes y 64% son leñosas (arbustos, árboles arrosetados y árboles), las cuales

se encuentran en una frágil condición, y un 75% de ellas están consideradas como

extintas, amenazadas, raras u ocasionales.

8

El inventario de todas las angiospermas introducidas en la flora del Archipiélago de

Juan Fernández contabiliza un total de 195 especies, señalando que 175 especies

están presentes en la isla Robinson Crusoe, 106 en la isla Alejandro Selkirk y 25 en

Santa Clara, encontrándose varias de ellas en más de una isla (MATTHEI,

MARTICORENA y STUESSY, 1993).

MARTICORENA, STUESSY y BAEZA (1998) señalan, en el último catálogo de la

flora vascular del Archipiélago de Juan Fernández, un total de 423 especies (55

Pteridofitas, 289 Dicotiledóneas y 79 Monocotiledóneas), de las cuales el 31,2% son

endémicas, 18,7% nativas y 50,1% adventicias.

Es importante resaltar la relación fitogeográfica que tiene la flora del archipiélago

con otras regiones del mundo, ubicadas a grandes distancias. Tal es el caso de las

islas Hawai (5500 millas), Nueva Zelandia (4700 millas), Magallanes y la Antártida

(2.300 millas), la región andina (400 millas) y aún México (MUÑOZ, 1969; CONAF,

2003).

La flora del archipiélago se caracteriza también por la forma que adoptan los

árboles, es decir, sus hojas agrupadas en el extremo superior del tallo a causa del

acortamiento de los entrenudos (en roseta), representada por unas 25 especies de

las familias Asteraceae, Apiaceae (Ex Umbeliferae), Plantaginaceae y

Bromeliaceae. Estos representantes se subdividen, a la vez, en plantas con forma

de candelabro (especies de Compuestas arborescentes) y palmiforme, siendo en

este último tipo Plantago fernandezia Bert. y las especies del género Phoenicoseris

las más importantes (MUÑOZ, 1969).

9

2.2.2. Características de la Isla Robinson Crusoe.

En la isla Robinson Crusoe (ex Más a Tierra), su parte oeste es una área seca,

formada por campos de gramíneas y sin árboles, lo que contrasta con su parte

central, la Bahía de Cumberland y el cerro Yunque (915 m. de altura), los que están

formados por un bosque siempre verde y donde abundan la mayoría de las plantas

endémicas de la isla (MUÑOZ, 1969). Actualmente, predominan las Geraniáceas,

Juncáceas y Ciperáceas, existiendo un suelo desnudo (COSIO y GÁLVEZ, 2003).

Las asociaciones vegetales de esta isla son: a) El bosque de montaña baja; b) El

bosque de montaña alta; c) Matorral; d) Grupos aislados de Nothomyrcia

fernandeziana; e) Formaciones de gramíneas Stipa fernendeziana; f) Asociaciones

de Compuestas arborescentes, donde se encuentran especies del género

Robinsonia; y g) Asociación del matorral de maqui, Aristotelia chilensis (Mol.) Stuntz.

(SKOTTSBERG, 1921).

MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY (1993) señalan una alta proporción de

especies adventicias, especialmente en esta isla, donde la flora exótica (61,4%)

supera a la suma de la flora nativa, junto con la endémica (38,6%).

2.2.3. Características de la Isla Alejandro Selkirk.

La vegetación se divide en dos categorías principales, siendo una de ellas la flora de

las quebradas, la que se desarrolla desde el nivel del mar hasta los 1000 m. de

altitud. La flora que está a nivel del mar, es escasa, debido a las transformaciones

que ha sufrido por la presencia de numerosas malezas, entre las cuales se

10

encuentra el palqui (Cestrum parqui L’ Her.), cardilla (Carthamus lanatus L.), cardo

penquero (Cynara cardunculus L.), etc; la otra categoría es la flora magallánica, la

que se encuentra a mayores alturas hasta alcanzar los 1350 m. Las principales

comunidades de plantas son el bosque de la montaña baja y el bosque de montaña

alta (MUÑOZ, 1969).

MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY (1993) señalan también en esta isla una

alta proporción de especies adventicias, pero de menor relevancia que en las otras

dos islas, superando la flora exótica (58,6%) a la suma de la flora nativa, junto con la

endémica (41,4%).

2.2.4. Características de la Isla Santa Clara.

Esta isla no presenta cursos de agua, y se desarrolla una flora que coincide con la

parte seca de la isla Robinson Crusoe. Entre las especies endémicas, se

encuentran Dendroseris litoralis Skottsb. y Dendroseris pruinata (Joh.) Skottb.,

Compuestas arborescentes (MUÑOZ, 1969). Además, presenta una muy alta

proporción de especies adventicias, superando la flora exótica (25 especies u

83.3%) a la suma de la flora nativa junto con la endémica (6 especies o 16.7%)

(MATTHEI, MARTICORENA y STUESSY, 1993). CONAF (2003) señala que hoy

existen solamente una estepa graminosa y algunas compuestas arborescentes,

formando manchas aisladas en la franja costera.

11

2.3. Cambio y causas del cambio de la Flora del Archipiélago de Juan Fernández:

SANDERS et al. (1987) indican que la flora ha ido cambiando rápidamente desde el

tiempo de los primeros colonizadores, con la introducción de plantas adventicias, las

que removieron plantas nativas al competir con éstas, generando la extinción de

algunas especies que se explotaban con importancia económica. En los últimos

veintisiete años, este deterioro continuó por un sobrepastoreo, debido a la

introducción de animales y por una extrema competencia de especies leñosas

agresivas, amenazando con la extinción de muchas especies endémicas de valor

científico.

Entre los dos cambios más importantes, se encuentran aquellas plantas que eran

vistas ocasionalmente en los primeros dos mil años, han llegado a ser mucho más

raras, no encontrándose en varias localidades. La abundante reducción de estas

especies se ve reflejado por la disminución, entre un 9 y 67% de las especies, en

siete localidades. Las localidades sobre Alejandro Selkirk han sufrido la mayor

pérdida, con un 50% de promedio, en comparación con el 20% de disminución en

Santa Clara y un 17% de promedio de pérdida en Robinson Crusoe. El segundo

mayor cambio es la invasión de especies agresivas en el hábitat de las especies

endémicas, habiendo un incremento de un 250% de promedio de especies

introducidas en la isla Robinson Crusoe (SANDERS et al., 1987)

Otro cambio que señalan SANDERS et al. (1987) es la desecación del hábitat de las

tres islas y el incremento del suelo árido y del hábitat xerófito en comparación con el

mesófito, al parecer causado por el sobrepastoreo y pisoteo, resultando, en la

cubierta de plantas y el suelo, menor capacidad de retener el agua de lluvia. Estos

autores sugieren que el sobrepastoreo y el pisoteo por la introducción de mamíferos

son la gran amenaza para la flora única de Juan Fernández, señalando la presencia

12

de cabras (Capra hircus L.)en gran número (3.000 a 5.000) y fuerza destructiva,

entre otros como vacunos (Bos taurus L.), ovejas (Ovies aries L.), caballares (Equus

caballus L.), coatis (Nasua nasua L.), conejos (Oryctolagus cuniculus L.). Los

factores señalados anteriormente son favorecidos en mayor medida por la erosión,

que afecta en un 40% de forma severa a extremadamente severa en la isla

Robinson Crusoe, causada por la actividad humana (corte y quema de la

vegetación), junto con los factores naturales de erosión como precipitaciones

abundantes, vientos fuertes, laderas abruptas y suelos con baja capacidad de

retención de agua (IREN-CORFO, 1982).

2.4. Descripción del género y especies de la Familia Asteraceae:

Antes de la descripción de los géneros y especies, es necesario especificar que

BENOIT (1989), describe de la siguiente forma las categorías de Estado de

Conservación de Especies.

Las especies en peligro son aquellas de las que existe un escaso número de

ejemplares en la naturaleza y cuya existencia está seriamente amenazada si los

factores causales siguen funcionando. Se incluyen especies cuyas poblaciones se

han reducido tan drásticamente que se hallan en riesgo inminente de extinción

(BENOIT, 1989).

Las especies “vulnerables” son aquellas que podrían pasar a la categoría de “en

peligro” en el futuro próximo, si las causales de su disminución continúan

funcionando (BENOIT, 1989).

13

También es importante describir las especies en la forma en que las plantas,

específicamente sus yemas de conservación o renuevo, son capaces de pasar el

invierno, denominada formas biológicas de las plantas y, conforman las categorías

Fanerófitas, Caméfitas, Hemicriptófitas, Criptófitas, Terófitas, Hidrófitas, Epífitas y

Parásitas (RAUNKIAER, 1934).

RAUNKIAER (1934) describe las Fanerófitas (del griego phaneros = visible y, pitón

= vegetal) como árboles y arbustos, plantas cuyas formas de renuevo están

alejadas del suelo y, por los tanto, en climas donde hay nevadas invernales no son

cubiertas por la nieve; a las Caméfitas (del griego chamae = a tierra) como plantas

cuyas yemas de renuevo se encuentran sobre el nivel del suelo, pero a menos de

25 cm. de altura.

Los géneros Dendroseris y Robinsonia, pertenecientes a la familia Asteraceae son

monotípicos del Archipiélago de Juan Fernández. Por su parte, esta familia es la

más representada en este grupo de islas, ya que forma el 20% de su flora

(SKOTTSBERG, 1956).

Estos dos géneros destacan también por una alta especiación, la que es favorecida

por la presencia en estas islas de una enorme diversidad de hábitat, y la que origina

una gran diversidad morfológica, expresándose ésta en el género Dendroseris a

través de la forma de árboles y arbustos en roseta (SANDERS et al., 1987),

pertenecientes a las Fanerófitas (RAUNKIAER, 1934).

14

2.4.1. Género Dendroseris D.Don (Lactuceae).

El género Dendroseris corresponde a árboles o arbustos lactíferos, de ramas

bifurcadas marcadas por las cicatrices de las hojas caídas. Las hojas se ubican

agrupadas hacia el extremo apical de las ramas. Sus flores están ubicadas en

cabezuelas paniculadas, con todas las flores liguladas, de corolas blancas o

amarillas; involucro constituido de varias filas de hojuelas unidas en la base, siendo

las exteriores más cortas; receptáculo sin brácteas; anteras aladas, con la base

aflechada; ramitas del estilo largas, delgadas, troncadas. Sus frutos son aquenios

glabros, trasaovado-oblongos, escotados en ambos extremos; pelos del vilano

numerosos, delgados, sencillos. Incluye un total de 5 especies endémicas del

Archipiélago de Juan Fernández (REICHE, 1910), siendo actualmente 11 las

especies determinadas, de las cuales ocho han evolucionado en la isla Robinson

Crusoe y tres en Alejandro Selkirk (STUESSY et al., 1984). La gran diversidad

morfológica de estas especies permite distinguir los subgéneros Rea, Dendroseris y

Phoenicoseris, encontrándose Dendroseris neriifolia en el primero y Dendroseris

litoralis en el segundo (SANDERS et al., 1987). Las especies del subgénero

Dendroseris habitan tanto en zonas costeras como bosques húmedos,

especialmente a orillas del mar y en altos arrecifes, mientras que las del subgénero

Rea se desarrollan mayormente en bosques de mediana altura.

JOHOW (1896) indica que las especies de este género destilan una gran cantidad

de un jugo lechoso, de gran viscosidad y espesor. Sus troncos y ramas son

ahuecados.

La especie Dendroseris litoralis Skottsb., llamada comúnmente Col de Juan

Fernández, es descrita por RODRÍGUEZ, MATTHEI y QUEZADA (1983) como un

árbol de 2 a 5 m. de altura, copa redondeada, tronco tortuoso, de 10-30 cm. de

15

diámetro, blando con látex, ramificado desde cerca de la base; una corteza de color

gris, con estrías transversales más oscuras. Ramas tortuosas, cubiertas de hojas

rosuladas en su parte apical. Hojas perennes, simples y pecioladas; lámina de 25-45

cm. de largo y 18-30 cm. de ancho, aovada u oblonga, coriáceo-carnosa,

acorazonada en la base, de color verde glauco en la cara superior, más claro en la

inferior, margen ondulado; pecíolo de 12-20 cm. de largo, de sección triangular y

caniculado en la base. Capítulos dispuestos en inflorescencias paniculadas,

péndulas de 40-60 cm. de largo, con hojas sésiles, redondas o lanceoladas,

abrazadora en la base, de 2-12 cm. de largo y 2-10 cm. de ancho. Capítulos

amarillos o de color rojo anaranjado (MUÑOZ, 1969), numerosos, de 2-5 cm. de

diámetro con pedúnculos de 1-5 cm. de largo. Cinco estambres insertos en el tubo

de la corola, con anteras de 7-9 mm. de largo, caudadas en la base, unidas para

formar un tubo. Ovario lenticular, con los márgenes dilatados, de 1 mm. de largo y

1,5 mm. de ancho; estilo filiforme, dividido en dos ramas de 2,5-3 mm. de largo y en

cuyo interior van las pailas estigmáticas. El fruto es un aquenio, aplanado, de 2-5

mm. de largo y 2-3 mm. de ancho, ligeramente alado; papus formado por 1-2 grupos

de cerdas que están cubiertas por finos apéndices antrosos.

MUÑOZ (1969) hace mención de un grupo particular de especies que ofrece el

Archipiélago de Juan Fernández, desde un punto de vista agronómico para la

horticultura. Entre estas especies está la “col de Juan Fernández”, Dendroseris

litoralis Skottsb., de hojas grandes y flores muy vistosas de color rojo anaranjado, la

que se cultivaba en muchos jardines y plazas de Viña del Mar. Además, BENOIT

(1999) señala que sus cabezuelas aportan néctar para la supervivencia del picaflor

de Juan Fernández (Sephanoides fernandensis), entre diciembre y febrero

(RODRÍGUEZ, MATTHEI y QUEZADA, 1983).

BENOIT (1999) señala que todas las coles están en peligro de extinción y,

actualmente la especie Dendroseris litoralis Skottsb., sólo existe en jardines y no se

16

encuentra en estado silvestre. Sin embargo, RODRIGUEZ, MATTHEI y QUEZADA

(1983) indican que en estado natural se encuentra en lugares muy restringidos, sólo

sobre rocas en las cercanías del mar. Además, es cultivada en la isla Robinson

Crusoe y en el continente, siendo frecuente encontrarla en Valparaíso, Viña del Mar

y Reñaca y, aisladamente, en La Serena y Concepción.

CONAF (2001) citan a la especie Dendroseris litoralis Skottsb., como una de entre

varias especies endémicas afectadas por el pastoreo de cabras (Capra hircus),

debido a que crecen en lugares solo accesibles para éstas. Además, señalan que

de esta especie junto a Dendroseris neriifolia, entre otras, permanecen solo unos

pocos individuos en su ambiente natural, se extrajeron semillas y se cultivaron

almácigos, como una de las tareas del proyecto “Conservación, mantención y

desarrollo del Archipiélago de Juan Fernández”.

La especie Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook. et Arn, es un árbol muy ramificado,

de copa extendida. Sus hojas se distribuyen sobre la mitad superior de las ramas,

son angostas y lanceoladas, obtusas, coriáceas, glabras, enteras, atenuadas en el

pecíolo, de aproximadamente 15 cm. de largo y de 1,5-2 cm. de ancho. Sus

inflorescencias son compuestas (en cabezuelas pequeñas), corolas blancas, de

pedúnculos cortos provistos de agudas brácteas; involucro cilíndrico de 3 filas de

hojuelas donde las exteriores son aovadas, las interiores linear oblongas, obtusas,

con tricomas y márgenes pestañosos. Sus frutos son aquenios comprimidos, de

forma oblongo-trasovoides (JOHOW, 1896 y REICHE, 1910). Por su parte, JOHOW

(1896) la describe como un árbol de 2-4 m. de alto y de 0,1-0,3 m. de diámetro.

Según REICHE (1910), esta especie es una planta endémica en la isla Robinson

Crusoe que se encuentra escasa.

17

Según CONAF (2003), las especies Dendroseris litoralis Skottsb. y Dendroseris

neriifolia (Dcne.) Hook. et Arn, se encuentran dentro de la Categoría Estado de

Conservación “en peligro”, aunque también son catalogadas por DANTON et al.

(1998) en un grado de amenaza “a punto de extinción”.

2.4.2. Género Robinsonia D.C (Senecionae).

El género Robinsonia, el segundo más numeroso de la familia Asteraceae (SILVA,

BITTNER y PACHECO, 1992) y característico de la isla Robinson Crusoe, se

distingue principalmente por poseer las flores en un involucro compuesto de una o

dos filas de escamas. Sus cabezuelas son dioicas, debido al abortamiento de uno

de los 2 sexos de sus cabezuelas. Las flores femeninas presentan 5 estambres

rudimentarios, un estilo con 2 brazos extendidos, y anteras libres. Se caracteriza

también por tener un vilano de pelos uniseriados, blancos, más o menos unidos en

la base, que se desprende del aquenio antes de la madurez, lo que impide que los

aquenios de estas plantas residentes en una pequeña isla oceánica, sean

arrastrados por el viento al mar (JOHOW, 1896).

Por su parte, REICHE (1910) describe al género Robinsonia como arbolitos o

arbustos glabros, resinosos, con las ramas marcadas por las cicatrices

semicirculares de las hojas caídas. Sus hojas enteras y alternas, se ubican hacia el

extremo de las ramas. Sus flores, son cabezuelas pequeñas, corimbosas, radiadas

y dioicas; de involucro acampanado, de hojuelas uniseriadas, libres o más o menos

unidas, un receptáculo desnudo y plano. Las flores masculinas tienen las anteras

soldadas entre sí, el ovario rudimentario, un estilo sencillo y provisto de largos pelos.

La corola de las flores femenina presenta una lígula tridentada; en cambio, en las

flores hermafroditas, la corola es tubulosa y las masculinas angostamente

acampanadas con ápice con 5 dientes. Las anteras de las cabezuelas masculinas

18

son aladas, sin colas; en las flores femeninas las anteras son pequeñas, reducidas y

libres. El estilo de las flores hermafroditas sobresale de las cabezuelas. Sus frutos

son aquenios glabros, marcados de costillas prominentes. Los cotiledones

enroscados o planos. Las 5 especies conocidas son endémicas en la Isla Robinson

Crusoe (REICHE, 1910).

La especie Robinsonia thurifera Dcne. se caracteriza por ser un arbusto con ramas

bifurcadas, renuevos delgados y con muchas hojas hasta la base. Sus hojas son

sésiles, semi-abrasadoras, entre 15-23 cm. de largo, de forma linear-lanceoladas,

enteras, acuminadas, atravesadas por un nervio central muy grueso que se

encuentra surcado en la base, y muy poco reticuladas por los nervios secundarios.

Panícula hojosa de centenares de cabezuelas aglomeradas en los extremos de los

pedúnculos principales. con pedicelos más o menos del largo de las cabezuelas (3

mm). Las hojuelas del involucro están soldadas hasta la mitad, con lígulas

trilobuladas. Vilano frágil, de 5 pelos libres y distantes. Aquenios pelados, con 5

costillas elevadas. Cabezuelas masculinas desconocidas (JOHOW, 1896 y REICHE,

1910).

JOHOW (1896) y REICHE (1910) señalan que esta especie es endémica de la Isla

Robinson Crusoe. Actualmente es poco abundante, debido a que en el pasado se le

extraía una resina medicinal (REICHE, 1910).

Es descrita por JOHOW (1896) como una especie muy rara (debido a lo difícil que

fue encontrar un individuo para su clasificación), la que secreta una muy olorosa y

abundante resina, de renuevos de 1,5 cm de diámetro, marcados por cicatrices.

Vulgarmente era llamado por los isleños como “Resino macho” y al parecer, en

tiempos pasados, esta especie era la que entregaba la resina tan estimada por sus

19

virtudes medicinales, para el dolor de cabeza, explicando el porqué de su casi

exterminio.

Según CONAF (2003), la especie Robinsonia thurifera Dcne, se encuentra dentro de

la Categoría Estado de Conservación “en peligro”, siendo también catalogada por

DANTON et al. (1998) en un grado de amenaza “a punto de extinción”.

La especie Robinsonia gayana Dcne. es un arbusto con ramas igualmente

bifurcadas, renuevos delgados y con muchas hojas hasta la base. Sus hojas son

sésiles, semi abrasadoras, linear-lanceoladas, enteras, acuminadas, atravesadas

por un nervio central que se engruesa en la base y que se adelgaza hacia el ápice

con numerosos nervios laterales que se distribuyen en forma casi paralela (JOHOW,

1896 y REICHE, 1910). Sus flores son corimbos terminales, compuestos, de entre

30-40 cabezuelas, provistos de brácteas alesnadas, cabezuelas de 5 mm de ancho,

hojuelas del involucro soldadas hasta la mitad, lígulas con el ápice 3 dentado. Sus

frutos son aquenios, marcados de 5 costillas gruesas. El vilano está formado por

entre 13-15 pelos ligeramente unidos en la base. Cotiledones planos. Sus troncos

pueden tener una altura entre 2-4 m. (REICHE, 1910).

Según JOHOW (1896), esta especie habita en la zona boscosa de la isla, desde

baja altitud sobre el mar, hasta la cima de los cerros, creciendo entre arbustos. La

describe como un arbusto de entre 2 y 4 m de estatura, con hojas de entre 9 y 15

cm de largo y 1,5 cm de ancho, enteras, acuminadas, agrupadas en las puntas de

renuevos, las que más adelante, al caer, dejan una gran cantidad de cicatrices

sobre la corteza de las ramas, sobre la que más tarde destilará una resina olorosa;

como frutos, aquenios desnudos. Es nombrado vulgarmente también como Resino.

20

JOHOW (1896) y REICHE (1910) señalan que Robinsonia gayana Dcne. es

endémica de la isla Robinson Crusoe, siendo en la actualidad considerada por la

CONAF (2003) y DANTON et al. (1998), dentro de la Categoría Estado de

Conservación “vulnerable”.

2.4.3. Características químicas de la Familia Asteraceae.

Es decrita por HEYWOOD, HARBORNE y TURNER (1977) como una familia muy

rica en metabolitos secundarios, sustancias muchas de ellas tóxicas para el hombre

y/o animales, caracterizados por sesquiterpenolactonas, compuestos acetilénicos y

flavonoides, éstos últimos de gran importancia, porque permiten determinar

relaciones sistemáticas y de evolución en las plantas durante la floración.

SILVA, BITTNER Y PACHECO (1992) se aislaron e identificaron 16 flavonoides,

algunos esteroides, dos sesquiterpenos y tres compuestos fenólicos, además de los

característicos triterpenos pentacíclicos, dentro de las 11 especies del género

Dendroseris. Dentro de la especie Dendroseris litoralis, se aislaron los compuestos:

Escualeno, ácido morólico, Lupeol acetato, Lupeol, Taraxteril acetato, ácido ursólico,

β-sistosterol, daucosterina, estigmasterol glicósido, octadecano, ácido graso

triglicérico y alcohol de cadena larga insturada, en tanto que en la especie

Dendroseris neriifolia se aislaron los compuestos Lupeol, ácido betulinico,

taraxasterol, β-sistosterol, estigmasterol, vainilina, ácido ursólico, 8-(x-Hidroxi

achillin, Dendroserin, Hidrocarburo y grasas, siendo el subgénero Rea característico

en tener flavonoles y flavonas mono y diglucósidos.

Estos mismos autores aislaron y encontraron en el género Robinsonia, cuatro tipos

de flavonoides, con un total de 14 compuestos, 8 flavonoles (5 Quercetin, 1

21

Kaempferol, 2 Isorhamnetin), 3 flavonas (2 Luteolin y 1 Apigenin), 2 flavanonas

(Eriodictyol y Naringenin) y 1 dihidriflavonol (Taxifolin). También se aislaron 5

diterpenos conocidos y uno nuevo (thuriferin), β-sistosterol, stigmast-4 en 3- ona y

vainilina, en Robinsonia thurifera; 3 diterpenos (kauranol, thuriferin y ent-kaur-8-16

dien, 17,19 ácido dioico) en Robinsonia gayana.

2.5. Descripción del género y especie de la Familia Bromeliaceae.

El género Ochagavia, no monotípico del archipiélago, pertenece a la familia

Bromeliaceae, suculenta, de forma vital Caméfita (RAUNKIAER, 1934), es endémico

de Chile e incluye a 3 especies: Ochagavia carnea, Ochagavia chamissonis y

Ochagavia elegans. Es relativamente abundante en la isla Robinson Crusoe, por lo

que se encuentra en estado de conservación vulnerable.

El género Ochagavia se caracteriza por tener flores con 3 sépalos linear-oblongos,

no mucronados, libres hasta el ápice del ovario ciatiforme, cubiertos imbricadamente

en la base, erectos, aquillado-triangulares, simétricos, glabros, un poco encorvados

en el ápice. Además, poseen 3 pétalos libres, erectos, oblongo-unguiculados, algo

más grandes que el cáliz, angostos y elípticos, apenas mucronados, a veces

finamente escamosos en la base, doblados hacia atrás en el ápice; uñuela corta y

ancha. Sus estambres son un poco o mucho más largos que los pétalos, epíginos;

filamentos libres, glabros, filiformes; anteras dorsifijas, elípticas o linear-oblongas,

versátiles, dehiscentes longitudinalmente. Tiene un ovario ínfero, anguloso o

comprimido, glabro, oblongo, con tres lóculos, tubo epígino visible, pero corto, con

muchos óvulos en cada lóculo; estilo largo, filiforme, sobrepasando los pétalos;

estigmas cortos, algo retorcidos. El fruto es ovoídeo, triangular abayado, con

semillas pequeñas, irregulares en forma, esféricas o elípticas, base aguda, ápice

obtuso, testa delgada, oscura (a causa de la endopleura), rugoso-estriada,

22

tuberculada; endosperma harinoso, abundante; embrión muy pequeño. Sus hojas se

distribuyen en una roseta densa, ensiformes, textura firme, con márgenes provistos

de espinas pungentes; tomento visible; el ápice terminado en un acumen tieso y

muy punzante; espinas dirigidas hacia arriba. Como inflorescencia tiene un capitulo

multifloro, central, pedúnculo corto o sésil; cuando es pedunculado las hojas están

distanciadas; la flor está rodeada parcialmente por una bráctea ancha, más larga

que el ovario, bordes serrados, ápice acuminado-dentado. Flores de color rojo,

violeta o amarillas (MUÑOZ, 1969). Este mismo autor indica que es endémico de

Chile y está conformado por 5 representantes específicos (MUÑOZ, 1966).

La especie Ochagavia elegans R. A. Phill., endémica de la isla Robinson Crusoe,

habita en rocas de acceso casi imposible, ubicadas en la costa occidental; en Puerto

Francés y Puerto Inglés, entre peñas muy altas y perpendiculares; en el Morro de

Juanango, que está cerca de la parte norte de la isla, se desarrolla casi a nivel del

mar hasta varios metros sobre él (JOHOW, 1896).

JOHOW (1896) entre sus observaciones, señala que esta especie al igual que

aquellas del género Puya, crece únicamente en el suelo. Además la describe como

una planta que tiene un tallo que se extiende horizontalmente, con muchas ramas,

las que permiten en ciertas ocasiones formar con algunos pocos individuos,

manchones entre las rocas. En la parte apical de estas ramas, se ubica una roseta

de hojas rodeadas de dientes con forma de espina, y cubiertas de escamas

plateadas.

MUÑOZ (1969) menciona a un grupo particular de especies que ofrece el

Archipiélago de Juan Fernández, desde un punto de vista agronómico para la

horticultura, señalando entre estas especies el “ajo dulce” o “ajo verde”, Ochagavia

23

elegans Phil., una Bromeliácea de muy atractiva belleza durante su floración, que

es, sin duda, la planta más hermosa del archipiélago.

CONAF (2003) declara a la especie Ochagavia elegans R.A. Phill. dentro de la

Categoría Estado de Conservación “vulnerable”, mientras que DANTON et al. (1998)

la consideran “poco amenazada, pero rara”.

2.6. Descripción del género y especie de la Familia Plantaginaceae.

El género Plantago, perteneciente a la familia Plantaginaceae, se caracteriza por

poseer plantas normalmente herbáceas y excepcionalmente leñosas, anuales o

perennes. Sus hojas son alternas, generalmente arrosetadas y con pedúnculos

acanalados. Sus flores son hermafroditas, actinomorfas; con 4 estambres, ovario

normalmente bilocular (excepcionalmente 3-4 lóculos), estilo pubescente. El fruto es

una cápsula dehiscente (pixidio) (NAVAS, 1979).

La especie Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., es una planta leñosa, de forma vital

Caméfita (RAUNKIAER, 1934), de 1-2 m. de altura (JOHOW, 1896), de tallos poco

ramificados en la base, delgados, frágiles, marcados por las cicatrices de las hojas

caídas. Sus hojas, que miden aproximadamente 20 cm. de largo y 2-3 cm de ancho,

se ubican agrupadas en el ápice del tallo, de forma linear u oblongo lanceoladas,

sésiles, semi-abrasadoras (JOHOW, 1896 y REICHE, 1911), adelgazadas y algo

pubescentes hacia la base, por lo demás, glabro (REICHE, 1911), según JOHOW

(1896) glabras; enteras o ligeramente denticuladas hacia el ápice, recorridas por 7 o

9 nervios gruesos y paralelos. Sus inflorescencias delgadas y de 20-30 cm. de largo,

nacen en las axilas de las hojas sobre largos pedúnculos, de estambre inclusos. Su

fruto es una cápsula bilocular de 2 semillas.

24

Es una especie endémica de la isla Robinson Crusoe (JOHOW, 1896 y REICHE,

1911). Según JOHOW (1896), habita en la zona del bosque claro, en el sector de

Portezuelo de Villagra, desde los 300 m.s.n.m., señalando que es muy escasa,

debido a que no fue posible encontrarla en otro lugar de la isla.

Según CONAF (2003), la especie Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., se encuentra

dentro de la Categoría Estado de Conservación “en peligro”, en cambio DANTON et

al. (1998) la catalogan en un grado de amenaza “a punto de extinción”.

2.7. Propagación y cultivo de Géneros y sus especies:

CONAF (2001) ha cultivado, en vivero, 16 especies endémicas del Archipiélago de

Juan Fernández, de las cuales, 13 se encuentran en estado crítico de conservación,

señalando que las especies han sido reintroducidas en su ambiente natural gracias

al Proyecto “Conservación, restauración y desarrollo de las islas Juan Fernández”.

2.7.1. Propagación por semillas y cultivo del Género Dendroseris.

STUESSY et al. (1983) señalan el éxito que ha tenido CONAF en el cultivo de

plantas provenientes de semillas de Dendroseris litoralis como resultado de un plan

en terreno, indicando que un total de 100 plantas germinadas en la oficina central de

San Juan Bautista presentan un buen crecimiento, las que son establecidas sin

problemas dentro de su propiedad y en sectores del poblado. Dentro del proyecto y

enfocado en la conservación “in situ”, se han colectado semillas y cultivado

almácigos de especies de las cuales solo existen unos pocos individuos en su

25

ambiente natural, entre estos Dendroseris litoralis y Dendroseris neriifolia (CONAF,

2001).

Es señalado por RODRIGUEZ, MATTHEI y QUEZADA (1983) el cultivo de la

especie Dendroseris litoralis Skottsb en la isla Robinson Crusoe y en el continente,

siendo frecuente encontrarla en Valparaíso, Viña del Mar (STUESSY et al, 1984),

Reñaca y aisladamente en La Serena y Concepción. También corroborado por

BENOIT (1999), indicando que las coles están presentes sólo en jardines.

2.7.2. Propagación por semillas y cultivo del Género Robinsonia.

Normalmente se ha estado cultivando la especie Robinsonia berteroi Bert., también

endémica del archipiélago de Juan Fernández a través de semillas, pero este

método es muy lento y de alta incidencia en enfermedades, lo que no permite

obtener una propagación masiva de la especie con el objetivo de evitar su extinción

y reforestación en su hábitat natural (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2001).

2.7.3. Propagación por semillas y cultivo de Género Ochagavia.

RICCI (1998) describe la propagación de la especie Ochagavia elegans R.A. Phill. a

través de la siembra de semillas en un sustrato mullido, arenoso y con buen drenaje,

desinfectado con Basamid granulado (BASF), suministrando un riego permanente

por nebulización, en platabandas bajo un invernadero, para obtener un 21% de

germinación de las semillas a los 103 días de siembra. El repique se realiza a través

de hijuelos, los que se enraizan en un sustrato arenoso limoso.

26

2.7.4. Propagación y cultivo del Género Plantago.

Dentro del arboretrum de la Administración del Parque Nacional Archipiélago de

Juan Fernández, unos pocos individuos de especies muy raras, provenientes de

semillas, son conservados, entre estos Plantago fernandezia (CONAF, 2001).

2.8. Cultivo in vitro:

Aunque el método de propagación in vitro ha sido tradicionalmente usado para el

cultivo de especies comerciales, ha aumentado el conocimiento de su aplicación en

especies raras o en peligro de extinción (ARRABAL et al., 2002).

2.8.1. Tipos y tamaños de explante.

MERINO (1987) menciona que a pesar de que todos los cultivos de tejidos

provienen de órganos o de sus secciones, la organización del progenitor no siempre

se mantiene durante el desarrollo in vitro. Sin embargo, un cultivo de órganos tiene

el objetivo de alcanzar, a partir de una estructura organizada, la morfología y la

fisiología que lo identifican con los órganos de su especie. Además, señala que se

ha ensayado con secciones de hojas como explantes (órganos muy inmaduros),

logrando pocos resultados exitosos.

Los primordios de hoja requieren un medio nutritivo simple para completar su

desarrollo, con agar para primordios grandes y, líquido para primordios muy

pequeños, para favorecer el crecimiento y supervivencia (MERINO, 1987).

27

El material de inicio utilizado en micropropagación de plantas arbóreas está

constituido por porciones apicales de brotes en crecimiento activo (BALDINI, 1992),

debiendo considerar que el riesgo de aparición de patógenos en los tejidos

vegetales aumenta con el incremento del tamaño de los explantes iniciales

(GARCIA y NOA, 1998).

YEOMAN y MACLEOD (1977) recomiendan utilizar fragmentos de tejidos que

contengan un gran número de células (± 5 a 10 mm. por lado), para incrementar la

posibilidad de éxito en el cultivo.

GARCIA y NOA (1998) consideran el proceso de formación de callos como una de

las técnicas de cultivo de tejidos para la obtención de plantas libres de virus, debido

a que el crecimiento celular es más veloz que la replicación viral, sin embargo,

según BARBA (1987) existen varias anormalidades en estos tejidos, provocadas por

una modificación en la citología nuclear de las células, durante el cultivo

(aberraciones cromosómicas, mutaciones, etc.), cuya frecuencia aumenta con la

edad de cultivo, y la proporción de aparición, dependiendo de la composición del

medio y la especie.

Según YU y MEDERITH (1986), en Vitis vinifera L., el estado de desarrollo de las

yemas y la posición de los explantes en la planta madre, son factores importantes

en la respuesta de éste a la brotación. También, afirman que el tamaño del explante

y su edad fisiológica son factores que influyen en la sobrevivencia del explante,

siendo menor en yemas ubicadas en los ápices de las ramillas. Este efecto de la

posición está relacionado con el contenido de fenoles presentes en el tejido. Los

fenoles son más abundantes en las yemas apicales y con mayor exposición al sol.

28

2.8.2. Cultivo in vitro en la Familia Asteraceae.

El cultivo de órganos y tejidos de plantas como una técnica para la propagación

masiva de plantas seleccionadas está ahora establecido para muchas especies de

plantas, pero sólo unas pocas especies en la familia Asteraceae han sido

propagadas usando el cultivo de tejidos (KOTHARI y CHANDRA, 1984).

MURASHIGE, SERPA y JONES (1974) describen la multiplicación clonal de

Gerbera a través del cultivo de tejidos, utilizando como explantes iniciales puntas de

brotes de 0,5 a 1 cm de alto, compuestos de una yema terminal, siendo poco

común, debido a la alta frecuencia de contaminación por microorganismos, y porque

las puntas de brotes son extremadamente pubescentes, siendo poco efectivo el uso

de desinfectantes convencionales. La multiplicación la realizan separando

repetidamente y recultivando secciones muy pequeñas que se originan de las

puntas de brotes, utilizando el medio Murashige y Skoog (MS), gelificado en agar,

suplementado con bajos niveles de AIA (0,5 mg/l) y una alta concentración de

Kinetina (10 mg/l), para la rápida multiplicación de secciones pequeñas. Para el

enraizamiento de las pequeñas secciones, las cultivan en el medio MS con una

concentración de Ácido β-Indol Acético (AIA) mucho más alta (10 mg/l) y una alta

intensidad de luz (10000 lux), ya que se logra el máximo incremento en las

secciones y mejora el vigor de los cultivos.

Variaciones genéticas han sido observadas en algunas plantas propagadas a través

del cultivo de tejidos, siendo la más común el incremento en el número de los

cromosomas y colores mutantes entre otras (MURASHIGE, SERPA y JONES,

1974).

29

El cultivo de puntas de brotes como explante en Gerbera es un sistema más rápido

que el uso de capítulos florales, pero el número de inicio requerido es mucho más

alto, debido a la alta tasa de infección (80%). Para objetivos prácticos, ambos

métodos pueden ser usados, el sistema de capítulo en la fase inicial y el sistema

punta de brote en la fase de propagación masiva (PIERIK et al., 1975).

HILL (1968) describe en Chysanthemum la formación de brotes sobre cultivo de

callos, derivados de explantes de tallo, de receptáculo y hoja.

KOTHARI y CHANDRA (1986) describen la regeneración de plantas de Tagetes

erecta L., una importante planta ornamental, a través del cultivo de segmentos de

hojas (1,5 *0,6 cm.) sobre el medio base Murashige y Skoog (MS), suplementado

con Bencil Adenina (BA) (3 a 5 mg/l), más AIA (1 a 5 mg/l), observando la

regeneración de un gran número de yemas brotadas adventiciamente, las que se

multiplicaron sobre el mismo medio, pero con 3 mg/l de BA más 1 mg/l de AIA.

Estos autores aseguran la elongación de las yemas cuando son repicadas sobre un

medio con 2 mg/l de BA más 0,5 mg/l de Ácido Giberélico (GA3); y la formación de

raíces en la base de los brotes cultivados sobre papel filtro, sin callos, en tubos

sobre un medio MS líquido con 0,5 mg/l de Ácido β-Indol Butírico (IBA) más 0,5 mg/l

de GA3.

La propagación de cultivos de tejidos de Senecio cruentus D.C., se realizó,

utilizando puntas de brotes provenientes de plantas seleccionadas a partir de

semillas germinadas in vitro. La multiplicación de brotes resultó mejor sobre medio

de Gerbera Murashige y Skoog (MS), suplementado con 2,8 uM de AIA. Por otra

parte, la máxima formación de raíces ocurrió con un medio MS modificado con

reducidos niveles de sales inorgánicas y 1,3 uM de ANA (COCKREL, MC DANIEL y

GRAHAM, 1986). También, observaron que la germinación de la semilla y el

30

desarrollo de la planta fue mejor inducido sobre medio MS de Gerbera, con el

desarrollo de brotes múltiples, luego de 6 semanas de iniciado el cultivo.

La obtención del máximo número de brotes vegetativos en el cultivo de Centaurea

paui Loscos ex Willk. a partir de yemas axilares, es logrado en el medio MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962), con 2% de sucrosa, 100 mg/l de myo-inositol, 10

mg/l de tiamina, 1 mg/l de ácido nicotínico, 1,0 mg/l de piridoxina, suplementado con

0,5 mg/l de BA o 2 mg/l de kinetina (CUENCA, AMO-MARCO y PARRA, 1999).

LEE et al (1994), describen la regeneración de plantas de Coreopsis lanceolata L.

mediante el cultivo de secciones de hojas en un medio MS, vitaminas de MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962) suplementado con 1uM de ANA más 10uM de BA,

favoreciendo la formación de brotes adventicios sobre los explantes.

2.8.2.1. Cultivo in vitro del Género Robinsonia.

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) describen el cultivo de tejidos de Robinsonia

berteroi Bert., utilizando como explantes secciones de hojas (1cm2), secciones

nodales, partes de inflorescencias y raquis, sobre un medio de cultivo WPM (Woody

Plant Medium), con micronutrientes y vitaminas de MS, 40000 mg/l de sacarosa,

100 mg/l de inositol, 0,8 % de agar, con antioxidante (100mg/l de ácido cítrico).

La inclusión del ácido cítrico logra retardar significativamente el proceso oxidativo

durante 2 a 3 semanas; sin embargo, después de un mes de cultivo no observan

respuestas de crecimiento en hojas y nudos, pero sí en raquis y flores. En estas

últimas, ven hiperplasia (abultamiento) de los tejidos de la zona media, con indicios

31

de desarrollo de callo en un 80% de los explantes; mostrando una mejor respuesta

al sistema de cultivo, con una menor oxidación y logrando el desarrollo de alguna

forma de crecimiento. En raquis detectan el desarrollo de callo en una muestra, la

que después de 2 meses de cultivo se oxidó (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2000).

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) aclaran que esta especie es recalcitrante y

desarrolla una respuesta oxidativa muy acelerada causada por el daño mecánico

propio del cultivo, sin poder anular este fenómeno ni con previos lavados como

inclusión en el medio de soluciones antioxidantes.

2.8.3. Cultivo in vitro en la Familia Bromeliaceae.

La micropropagación, a través de yemas laterales, constituye un método más rápido

para obtener una gran cantidad de plantas uniformes en esta familia (HOSOKI y

ASAHIRA, 1980).

HOSOKI y ASAHIRA (1980) describen la propagación clonal de 4 especies

(Quesnelia quesneliana, Vriesea poelmannii, Aechmea fasciata y Guzmania spp.),

mediante el cultivo in vitro de hojas y yemas laterales, sobre un medio base MS

líquido con macroelementos, RINGE y NITSCH (1968) con microelementos y

suplemento orgánico, 2% de sucrosa y 0,7% de agar. La formación de yemas

adventicias, a partir de yemas laterales, se obtienen sobre un medio líquido con 1

mg/l de ANA, más 1 mg/l de BA; a partir de hojas al ser repicadas sobre un medio

líquido con 1 mg/l de ANA más 1 mg/l de BA. El enraizamiento se logra cultivando

los brotes obtenidos, en un medio sólido con 0,1 mg/l de ANA.

32

La propagación in vitro de la especie Puya chilensis, puede realizarse a través del

cultivo de yemas axilares de tejido foliar nuevo, sobre un medio Reinert y Mohr

(1967) con 6 g/l de agar y 30 g/l de azúcar. La formación de vástagos laterales

(multiplicación) se logró con la adición al medio de 1 mg/l de ANA y 2 mg/l de

kinetina. La formación de raíces es favorecida por la inclusión de carbón activado en

el medio nutritivo (600 mg/l) (CAMPOS, 1995).

ARRABAL et al. (2002) describen la propagación de Crypthanthus sinuosus (L.B.

Smith), planta endémica en peligro de extinción, mediante el cultivo de ápices de

tallo y raíz, sobre un medio MS líquido sin reguladores de crecimiento (MS0),

logrando una frecuencia de regeneración del 93%o suplementado con 2,2 uM BAP y

0,05 uM ANA

2.8.4. Cultivo in vitro en la Familia Plantaginaceae.

2.8.4.1. Género Plantago.

PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI (1995) describen el cultivo de

Plantago ovata Forssk. utilizando como material vegetal plantas de semillas

germinadas in vitro y a partir de éstas, puntas de brotes como explantes (6-8 mm de

largo), sobre un medio de cultivo MS, con 0,8% de agar y suplementado con 0,2

mg/l de AIA y 5 mg/l de BAP, en el cual forman brotes múltiples.

En esta misma especie, CHAWDHURY, KUNDU y RAYCHAUDHURI (1995) utilizan

como explante yemas brotadas y segmentos de hipocotilo (entre 4-6 mm de largo),

colocados en un medio base MS, formando callos al suplementarlo con 1 mg de 2,4-

33

D y 0,5 mg/l de kinetina. Este callo indujo embriones al ser cambiado a medio MS

suplementado con 0,5 mg/l de ANA y 1 mg/l de BAP. El mejor resultado lo

obtuvieron con las yemas brotadas como explantes.

Puntas de brotes (10 mm de largo) de Plantago major L. son cultivadas en un medio

MS modificado: reduciendo el contenido de NH4NO3 a 412,5 mg/l y KH2PO4 a 340

mg/l, conteniendo 100 mg/l de myo-inositol, 0,4 mg/l de pyridoxina-HCl, 30 g/l de

sacarosa, 8g/l de agar, 0,01 uM de GA3 y 0,01 uM de BAP. Esto indujo entre un

57% y 100% los brotes y se mejoró la elongación y vigor de los mismos. Sin

embargo, la mejor concentración en el medio fue 0,5 uM de BAP, junto con un

incremento de glucosa, estimulando la formación de casi 7 brotes su elongación (50

mm cada uno). Se obtiene un mejor enraizamiento de los brotes elongados, en un

medio MS a la mitad suplementado con 5g/l de agar y 1 uM de ANA (MEDEROS et

al., 1997).

2.9. Propagación por semillas:

La utilización de una semilla sana constituye un método de control importante para

muchas enfermedades sistémicas en varias especies, en que la vía de transmisión

del patógeno, se produce a través de los órganos vegetativos empleados en la

propagación (GARCIA y NOA, 1998), por lo tanto, virus y micoplasmas que pueden

estar presentes en las plantas madres, se transmiten limitadamente a sus

descendientes (BALDINI, 1992).

Sin embargo, BALDINI (1992) señala que las semillas sufren cambios bioquímicos

durante su formación que inducen una condición de latencia fisiológica transitoria de

34

los embriones, permaneciendo quiescentes (dormición embrional), aunque las

condiciones sean favorables para el inicio del proceso germinativo.

2.9.1. Germinación de la semilla.

Es definida por TISCORNIA (1984) como el paso de una semilla del estado de

reposo al vegetativo, y descrito por BALDINI (1992) como un proceso compuesto de

cuatro fases:

a) Preparación: durante la cual el cuadro hormonal se modifica, con una

disminución de los inhibidores y aumento de los promotores.

b) Activación de los procesos metabólicos, la cual se caracteriza por un aumento

de la actividad enzimática, sobre todo de las alfa amilasas, por un aumento de

la respiración celular e hidrólisis de las sustancias de reserva.

c) Mitótica: durante la cual los meristemos embrionales crecen por división celular.

d) Fase de desarrollo, durante la cual el epicotilo y radícula salen originando la

plántula.

La semilla germinada es aquella semilla en que la radícula ha emergido tras romper

las cubiertas, debido al brusco cambio que sufre el metabolismo interno de la

semilla en ese momento (BESNIER, 1989). Según AZCON - BIETO y TALÓN

(2000), con la emergencia radicular finaliza la germinación y se inicia el crecimiento

de la plántula.

35

BALDINI (1992) señala que las plántulas se pueden desarrollar según dos modelos

distintos: germinación epígea, en la cual el hipocótilo se alarga llevando a los

cotiledones fuera del sustrato o germinación hipógea en la que los cotiledones

permanecen en el sustrato.

HARTMANN y KESTER (1987) definen viabilidad de las semillas como el porcentaje

de germinación, el cual indica el número de plantas producidas por un número dado

de semillas, considerando como características adicionales, la germinación rápida,

el crecimiento vigoroso de las plántulas y el aspecto normal de ellas. Estos mismos

autores señalan que deben ocurrir dos procesos para que una semilla sea viable:

polinización y fecundación. La viabilidad se puede determinar por varias pruebas,

pero las más utilizadas son la germinación directa, de embrión separado y la de

tetrazolio. En la prueba de germinación directa, el porcentaje de germinación se

determina por la cantidad de plántulas normales producidas por las semillas.

Una vez que el embrión ha alcanzado su capacidad para germinar, es esencial para

la supervivencia de la especie que la germinación de la semilla se efectúe en un

tiempo y lugar favorables para el crecimiento y la supervivencia de la especie

(HARTMANN y KESTER, 1987).

CUENCA, AMO-MARCO y PARRA (1999) indican que el uso de semillas es una

alternativa para el establecimiento de abundantes brotes libres de patógenos, sin

dañar la planta silvestre, sin embargo pueden darse mecanismos de hibridación,

imposibilitando el material para las programas de conservación.

HARTMANN y KESTER (1998) señalan que las semillas de Bromeliáceas se han

cultivado en la forma descrita para orquídeas, pero en un medio de cultivo líquido en

36

agitación constante, siendo cambiados cada siete días hasta la germinación.

Además, considera importante en órganos de almacenamiento, los patrones de

letargo estacional.

2.10. Desinfección del material para la propagación in vitro:

2.10.1. Antecedentes generales.

El inicio del cultivo in vitro es la primera etapa crítica en el éxito de la propagación

de varias plantas (MARKS y SIMPSOM, 1989), siendo importante el tipo de explante

y el lugar de colecta (HARTMANN, KESTER y DAVIES, 1990), para contar con un

material libre de microorganismos como hongos, bacterias y levaduras (HARTMANN

y KESTER, 1998), a partir de plántulas cultivadas en condiciones semiestériles

después de la desinfección de las semillas o plantas cultivadas en invernadero

sobre sustratos inertes (PIERIK, 1987; MARGARA, 1988). Para esto, es necesario

realizar una exhaustiva desinfección del explante, sobre todo de aquel que proviene

de terrenos en donde no se hacen desinfecciones, como también de las mesas de

trabajo utilizados (HARTMANN y KESTER, 1998).

La concentración de la solución desinfectante y el tiempo de desinfección depende

de la especie con que se trabaje (PIERIK, 1987; HARTMANN y KESTER, 1998).

Para las desinfecciones, se utilizan compuestos químicos, como algunos alcoholes

(etílico, metílico o isopropílico), en concentraciones del 70 al 75%, los cuales son

muy tóxicos para el material vegetal, por ello su empleo es recomendado sólo para

enjuagues de corta duración y para la esterilización de superficies externas

(HARTMANN y KESTER, 1998).

37

BIANCANI (1996), en la desinfección de explantes de chirimoyo (Annona cherimola

Mill.), afirma que no hay diferencias al utilizar hipoclorito de sodio al 3% más Tween

20 por 15 min., etanol 95% por 5 seg más hipoclorito de sodio 0,25% más Twenn 20

por 10 min. y peróxido de hidrógeno 35% más Tween 20 por 10 min. En cambio, si

hay diferencias en la época en que se toman los explantes, presentando los

menores niveles de contaminación en el mes de enero con brotes nuevos y

herbáceos.

2.10.2. Desinfección de explantes en la Familia Asteraceae.

CUENCA, AMO-MARCO y PARRA (1999) recomiendan como procedimiento

práctico de micropropagación para conservar especies endémicas en peligro de

extinción (Centaurea paui Loscos ex Willk., Asteraceae) y evitar la hibridación, el

uso de yemas axilares en la base de la roseta y en la época de floración en el tallo

de la inflorescencia. Sin embargo, señalan que la micropropagación de plantas que

crecen en terreno en forma de roseta es a menudo difícil, debido a la contaminación

por hongos y bacterias en las yemas de la base de la roseta rodeadas por un grupo

de hojas y localizadas a nivel del suelo, siendo muy difícil su esterilización. Además,

consideran que el uso de explantes de la roseta implica la destrucción de la planta

madre, siendo una desventaja para la conservación de especies en peligro.

Descartando éstos, utilizan segmentos de tallos de inflorescencias los que son

desinfectados en etanol por 1 minuto más Tween 80, seguido por 20 minutos en

hipoclorito de calcio al 7%.

Los explantes, puntas de brotes de Gerbera, son desinfectados por 10 minutos con

hipoclorito de sodio al 5,25% diluido con agua y conteniendo 0,1% de Tween 20.

Luego son enjuagados 3 veces con agua estéril (MURASHIGE, SERPA y JONES,

1974).

38

La esterilización de las hojas de Tagetes erecta L., es realizada en una solución de

Hg Cl2 al 0,1% por 5 minutos y luego enjuagadas 3 veces en agua destilada estéril

(KOTHARI y CHANDRA, 1986).

Los explantes puntas de brotes de Senecio cruentus D.C., son desinfectados en

hipoclorito de sodio al 5,25% por 3 minutos, seguido de 3 enjuagues en agua

destilada estéril (COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM, 1986).

2.10.2.1. Género Robinsonia.

La desinfección de secciones de hojas, secciones nodales y secciones de flores sin

raquis de la especie Robinsonia berteroi Bert., pueden ser esterilizadas con

hipoclorito de sodio, al 10%, durante 10 minutos, luego enjuagadas cuatro veces

con agua estéril y dejadas en una solución antioxidante (100 mg/l de ácido cítrico)

durante 5 minutos (VELOZO, CAMUS y ROJAS, 2000).

2.10.3. Desinfección de explantes en la Familia Bromeliáceae.

Los explantes de las 4 especies de Bromeliáceas se logran desinfectar en una

solución de hipoclorito de sodio, conteniendo 1% de cloro activo, por 10 minutos, y

luego enjuagadas 2 veces en agua estéril (HOSOKI y ASAHIRA, 1980).

Las yemas axilares de Puya chilensis, se desinfectan con una solución de

hipoclorito de sodio al 1% durante 3 minutos, y luego se enjuagan con agua

39

destilada estéril durante 5 minutos. Sin embargo, el porcentaje de sobrevivencia de

los explantes por tratamiento es bajo (33%) (CAMPOS, 1995).

2.10.4. Desinfección de explantes en la Familia Plantaginaceae.

Para la desinfección de las semillas de Plantago ovata Forssk. se sumergen en

HgCl2 al 0,05% por 10 minutos, las que luego se enjuagan tres veces con agua

destilada estéril (PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI, 1995;

CHAWDHURY, KUNDU y RAYCHAUDHURI, 1996).

Las puntas de brotes de la especie Plantago major L. se desinfectan primero con

etanol, al 40%, durante dos minutos y, luego, en HgCl2, por 10 minutos, siendo

posteriormente enjuagadas tres veces con agua destilada estéril (MEDEROS et al.,

1997).

2.11. Pardeamiento y antioxidantes:

2.11.1. Pardeamiento.

El pardeamiento enzimático es definido como la transformación de enzimas en las

primeras etapas, de compuestos fenólicos en polímeros coloreados, normalmente

pardos o negros. Este proceso es observado en los vegetales ricos en compuestos

fenólicos (CHEFTEL y CHEFTEL, 1992).

40

CHEFTEL y CHEFTEL (1992) señalan entre los sustratos naturales de

pardeamiento enzimático los mono, di o polifenoles, cuya reactividad varía según su

estructura y el origen de las enzimas que catalizan su oxidación. También, clasifican

algunos sustratos como los principales constituyentes fenólicos de los vegetales,

entre éstos se encuentran el pirocatecol, la 3,4-dihidroxifenilalanina o dopamina

(DOPA), los ácidos de anillo aromático como el ácido clorogénico, y los flavonoides

como los antocianidoles, leucoantocianidoles, flavonoles y flavonas, entre otros.

El mecanismo de reacción de las enzimas participantes consiste en una

hidroxilación de monofenoles y la oxidación de difenoles. Las enzimas responsables

de la oxidación son nombradas individualmente como monofenolasa y polifenol

oxidasa y, sistemáticamente, como o-difenol oxígeno oxidoreductasa (CHEFTEL y

CHEFTEL, 1992).

La enzima polifenol oxidasa (PPO), considerada una metaloenzima por contener un

0,2% de cobre, se activa generalmente en el mismo rango de pH óptimo para el

pardeamiento enzimático; es decir, entre 5 y 7 o específicamente entre 6 y 6,5. Este

proceso es señalado por DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991), quienes

confirman que los compuestos fenólicos son oxidados por las polifenoloxidasas y los

productos de la oxidación inhiben la actividad de las enzimas, causando la muerte

del explante y el bronceado del medio de cultivo.

2.11.2. Técnicas para reducir y controlar el pardeamiento enzimático.

Para el control del pardeamiento enzimático, se necesita reducir la cantidad de

componentes fenólicos y sus productos oxidativos, inhibir la acción de las

41

polifenoloxidasas (PPO), y disminuir el suministro de oxígeno (DIRR y HEUSER,

1987).

Para lograr lo anterior, existen varios métodos, que han sido utilizados

principalmente en el cultivo de especies leñosas con exitosos resultados, entre los

que se encuentran, la exposición de la planta madre a oscuridad o bajos niveles de

irradiación (MARKS y SIMPSON, 1989; CASSELLS y MINAS, 1983; PIEPER y

ZIMMER, 1976), uso reducido de la luz o completa oscuridad durante el

establecimiento de los explantes (DIRR y HEUSER, 1987), adición de PVP

(CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975), PVPP (OYANEDEL, 1995) y/o carbón

activado y/o antioxidantes como ácido cítrico o ascórbico al medio (ZIV y HALEVY,

1983), mantención de los explantes por varias horas previo al cultivo en

antioxidantes (ZIV y HALEVY, 1983), utilización de medios líquidos al inicio del

cultivo para facilitar y diluir más rápido los productos tóxicos (REINERT y MOHR,

1967; DIRR y HEUSER, 1987; AMIN, SHARMA y SRINIVASA, 1992), disminuir los

tejidos dañados por cortes para reducir la exudación (DIRR y HEUSER, 1987),

traspaso de los explantes a un medio renovado (BROOME y ZIMMERMAN, 1978)

para evitar la formación de pigmentos (PIERIK, 1990).

MACÍAS, RODRIGUEZ y CANALS (1998), definen el PVPP como un clarificante

sintético formado a partir de la polimerización en medio alcalino de la vinilpirrolidona,

que presenta gran afinidad por los polifenoles, de forma que, debido a su particular

insolubilidad en medio hidroalcohólico, está especialmente adaptado para eliminar

los compuestos fenólicos del medio. Su mecanismo de adsorción de los polifenoles

se basa en la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos fenólicos y el

oxígeno del grupo amida del anillo pirrolidona del PVPP. De esta forma, arrastra

consigo los compuestos fenólicos que a él se enlacen, eliminándolos del medio.

Dentro del grupo de polifenoles, el PVPP adsorbe preferentemente aquellos que

poseen un mayor grado de hidroxilación (taninos fundamentalmente).

42

AMIN, SHARMA y SRINIVASA (1992) obtuvieron una disminución del porcentaje de

explantes pardeados y de la cantidad de pardeamiento por explante, junto con un

incremento de la sobrevivencia in vitro, al tratar las yemas dormantes de uva vinífera

con captan (0,2%) y luego almacenadas en bolsas de polietileno a 4 ± 3ºC previo a

ser usadas.

2.12. Reacción, temperatura y fotoperiodo:

2.12.1. Reacción.

Es un factor muy importante en la elaboración de un medio de cultivo, debido a que

la mayoría de las células animales y vegetales tienen un pH que varía entre 5.0 y

8.0; muchos elementos no están disponibles para las plantas en determinados pH o

se hacen poco aprovechables (CORFO, 1990).

HARTMANN y KESTER (1998) recomiendan utilizar pH en el rango de 5 a 6 para

lograr un crecimiento adecuado de las plantas cultivadas in vitro.

2.12.1.1. Reacción Familia Asteraceae.

El pH utilizado para el cultivo in vitro de Gerbera es 5,7 (MURASHIGE, SERPA y

JONES, 1974), pH 5,6 para Gerbera jamesonii (PIERIK et al., 1975), pH 5,8 para el

cultivo de Tagetes erecta L. (KOTHARI y CHANDRA, 1986) y Senecio cruentus D.C.

(COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM, 1986), mientras que en Robinsonia berteroi

Bert., VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) ensayaron con pH 5,5.

43

2.12.1.2. Reacción Familia Bromeliaceae.

El pH utilizado por HOSOKI y ASAHIRA (1980), para el cultivo in vitro de las 4

especies de Bromeliáceas y al igual que Puya chilensis es de 5,6 (CAMPOS, 1995).

2.12.1.3. Reacción Familia Plantaginaceae.

El pH utilizado para el cultivo in vitro de Plantago ovata Forssk. es 5,7

(PARAMANIK, CHAKRABORTY y RAYCHAUDHURI, 1995; CHAWDHURY, KUNDU

y RAYCHAUDHURI, 1996) y pH 5,8 para Plantago major L. (MEDEROS et al.,

1997).

2.12.2. Temperatura y fotoperiodo.

Se obtiene un desarrollo satisfactorio de las plantas cultivadas in vitro al utilizar

temperaturas entre 20ºC y 28ºC (HARTMANN y KESTER, 1998), en cambio

MARGARA (1988) señala que temperaturas adecuadas para este tipo de cultivos

van entre 22 y 25ºC.

HARTMANN y KESTER (1998) señalan que la luz proporcionada a los cultivos in

vitro debe ser considerada, en términos de intensidad, largo del día y calidad, siendo

necesaria para la regulación de procesos como formación de tallo, inducción

radicular y embriogénesis asexual. Además, consideran al igual que MARGARA

(1988) que la intensidad de la luz de 1.000 lux es óptima, para muchos cultivos de

tejidos.

44

2.12.2.1. Temperatura y fotoperiodo Familia Asteraceae.

La incubación de Gerbera es descrita con un fotoperiodo de 16 horas, una

intensidad de luz de 1000 lux y una temperatura de 27ºC, para estimular el

desarrollo de brotes, y de 10000 lux, para iniciar el enraizamiento (MURASHIGE,

SERPA y JONES, 1974). Para Gerbera jamesonii se incuba primero en oscuridad a

una temperatura de 25ºC por 4 semanas, y luego con un fotoperiodo de 16 horas,

una intensidad de luz de 2100 lux, y una temperatura de 23ºC por otras 4 semanas

(PIERIK et al., 1975). Estos mismos autores obtuvieron un buen enraizamiento y

desarrollo de brotes a una baja intensidad de luz (800 lux), en comparación con una

alta intensidad de luz (2100 lux).

Las condiciones de incubación utilizadas para el cultivo de Tagetes erecta L. son un

24 horas de iluminación (1000 lux), con una temperatura de 28ºC (KOTHARI y

CHANDRA, 1986).

COCKREL, MC DANIEL y GRAHAM (1986) incuban el cultivo de Senecio cruentus

D.C., a 23º ± 1ºC de temperatura y un fotoperiodo de 16 horas (1000 lux).

La temperatura de incubación de Robinsonia berteroi Bert. es de 25ºC, junto con un

fotoperiodo de 16 horas y una intensidad lumínica de 33 umoles m2 s-1 (VELOZO,

CAMUS y ROJAS, 2000).

45

2.12.2.2. Temperatura y fotoperiodo Familia Bromeliaceae.

HOSOKI y ASAHIRA (1980), utilizan para la incubación in vitro de las 4 especies de

Bromeliáceas una temperatura de 27º± 2ºC, un fotoperiodo de 16 horas y una

agitación constante a 20 rpm.

Puya chilensis se incuba con un fotoperiodo de 16 horas de luz y una temperatura

de 24ºC (CAMPOS, 1995).

2.12.2.3. Temperatura y fotoperiodo Familia Plantaginaceae.

Las condiciones de incubación utilizadas para el cultivo de Plantago ovata Forssk.

son un fotoperiodo de 16 horas de luz con una intensidad de luz de 1500 lux, 55 ±

5% de humedad relativa y 25 ± 1ºC de temperatura (PARAMANIK, CHAKRABORTY

y RAYCHAUDHURI, 1995). En cambio, CHAWDHURY, KUNDU y

RAYCHAUDHURI (1996), la incuban con un fotoperiodo de 16 horas luz, 55-60%

de humedad relativa y 22-25ºC de temperatura.

MEDEROS et al. (1997) incuban Plantago major L. con un fotoperiodo de 16 horas

de luz y 24ºC de temperatura.

46

3. MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Propagación

Profesor Gregorio Rosenberg, de la Facultad de Agronomía de la Pontificia

Universidad Católica de Valparaíso, en el período comprendido entre agosto 2002 y

agosto 2003.

El material vegetal necesario para el cultivo y desarrollo de estas especies en

estudio, fue extraído desde el vivero del Jardín Botánico Nacional, ubicado en

Camino el Olivar s/n, Viña del Mar, Quinta Región.

Se seleccionaron plantas de las especies Dendroseris litoralis, Dendroseris

neriifolia, Robinsonia gayana, Robinsonia thurifera, Ochagavia elegans y Plantago

fernandezia. De todas estas plantas, a excepción de Dendroseris litoralis, solo una

de cada especie fueron trasladadas al sombreadero perteneciente al Laboratorio de

Propagación, ubicado a un costado del mismo. En este lugar, las plantas fueron

desinfectadas con una solución fungicida de Captan más Benlate al 1.5%, media

hora antes de la extracción del material para su uso en el laboratorio.

De estas plantas, aquellas pertenecientes a la familia Asteraceae (Dendroseris

litoralis, Dendroseris neriifolia, Robinsonia gayana, Robinsonia thurifera), se tomaron

y seleccionaron hojas con y sin pecíolo (Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera),

del sector superior, medio e inferior del follaje, del cual se obtuvieron, como

explantes, secciones de hoja de, aproximadamente 1cm2, para el cultivo in vitro.

47

De la planta perteneciente a la familia Bromeliaceae (Ochagavia elegans), se

tomaron hojas basales y apicales, de las cuales se obtuvieron como explantes,

secciones de hojas de aproximadamente 1cm2, y del tallo, secciones del mismo con

y sin yemas apicales y basales.

De la planta perteneciente a la familia Plantaginaceae, se tomaron frutos (simples)

con dos estados distintos de madurez, de los cuales se extrajeron semillas para

realizar ensayos de germinación.

Basándose en la técnica descrita por PIERIK (1987), se prepararon los medios de

cultivo mediante soluciones madres. Para éstas y para las diluciones de los medios

de cultivo, se utilizó agua bidestilada.

Los compuestos orgánicos y las sales minerales fueron pesados en una balanza

analítica, y para la medición de los líquidos, se utilizaron matraces Erlenmeyer,

pipetas graduadas, probetas y matraces de aforo.

Se homogeneizó la solución con un agitador magnético, y con un pH-metro se

ajustó el pH. Posteriormente se calentó la solución en un anafe eléctrico y a los

60ºC se aplicó el agar, se agitó y mantuvo hasta alcanzar los 98ºC.

Se utilizó para los ensayos tubos de vidrio de 37 ml, vertiendo aproximadamente 10

ml de medio por tubo, y luego cubriéndolos con cuadrados de papel de aluminio de

25 cm2. La esterilización de los medios se realizó en un autoclave controlado

manualmente a 121ºC y 1,1 bar de presión durante 15 minutos.

48

El aislamiento e inoculación del material vegetal se realizó en condiciones de

asepsia dentro de una cámara de flujo laminar, con aire filtrado de 0,2 micras, la que

previamente se desinfectó con etanol al 96% y se aplicó luz UV por media hora. El

material quirúrgico como pinzas, porta bisturíes, bisturíes y Placas de Petri, algodón

y papel gofrado, se esterilizaron en una estufa de calor seco (105ºC). La

manipulación de los explantes se realizó cerca de un mechero (metanol), el material

quirúrgico se flameó constantemente, la boca de los tubos se orientó hacia la

corriente de aire filtrado y se utilizó mascarilla para reducir la contaminación.

Para el desarrollo de los explantes de hojas, yemas y tallos, se utilizó una cámara

de crecimiento con temperatura controlada (23±2ºC) y un fotoperiodo de 16 horas

de luz; en cambio, para semillas, se utilizó una cámara de crecimiento con

temperatura controlada (27±2ºC) y un fotoperiodo de 16 horas de luz.

Ensayo 1. Efecto de cuatro protocolos de desinfección sobre los explantes de hojas de las especies Dendroseris litoralis, Dendroseris neriifolia, Robinsonia

gayana y Robinsonia thurifera, familia Asteraceae.

El medio nutritivo que se utilizó en este ensayo, consistió en una solución con macro

y micro nutrientes de WPM (Woody Plant Medium) (LLOYD y McCOWN, 1981),

ácido ascórbico (100 mg/l), 7g/l de agar, ajustada a pH 5,5.

La desinfección se realizó, basándose en el protocolo de desinfección para plantas

leñosas, del Laboratorio de Propagación de la Facultad de Agronomía, Pontificia

Universidad Católica de Valparaíso.

49

De este modo, las hojas de estas especies fueron lavadas superficialmente con

abundante agua corriente, para quitar esporas de hongos y restos de tierra.

A continuación, las hojas se sometieron a los siguientes tratamientos:

Tratamiento 1: Desinfección con hipoclorito de sodio al 1%, más ácido cítrico (500

ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

Tratamiento 2: Desinfección con etanol al 70%, más hipoclorito de sodio al 1%,

ácido cítrico (500 ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

Tratamiento 3: Desinfección con hipoclorito de sodio al 1,5%, más ácido cítrico (500

ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

Tratamiento 4: Desinfección con etanol al 70%, más hipoclorito de sodio al 1,5%,

ácido cítrico (500 ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

La preparación de las soluciones desinfectantes para cada tratamiento se realizó

utilizando matraces de 1000 ml. y fueron guardadas en botellas plásticas de 1000

ml. hasta el momento de su uso.

Las desinfecciones se realizaron en vasos precipitados de 500 y 1000 ml. Para

aquellas en las que se usó alcohol al 70%, las hojas se sumergieron en éste durante

10 segundos y se enjuagaron inmediatamente con una solución de agua destilada

estéril más ácido cítrico y ácido ascórbico (500 ppm cada uno), sobre un colador

para eliminar restos del alcohol.

50

Este experimento fue conducido como Diseño Completamente al Azar (DCA), con el

siguiente Modelo matemático:

Yij = uij + σ + ε

Donde:

Yij : Valor observado en cada unidad experimental.

uij : Efecto de la Media General sobre cada observación.

σ : Efecto del Tratamiento sobre cada observación.

ε : Efecto del error experimental Aleatorio sobre cada observación.

Se realizaron 25 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como

una repetición. Se evaluaron en cada caso las variables sobrevivencia y grado de

oxidación de los explantes. Las mediciones se realizaron cada 15 días, a partir de la

segunda semana de cultivo.

La sobrevivencia fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, según la

presencia o ausencia de ésta, así como también la incidencia o causa de ésta

(hongo y/o bacteria). Las mediciones se efectuaron hasta el día 80, asumiendo que

después del día 80 no existió contaminación posterior.

Para la evaluación del grado de oxidación se utilizó la Escala Relativa de

Pardeamiento (ERP) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificación

a cada estado del explante para cada especie, especificada en el ensayo 2. Los

resultados de sobrevivencia y grado de oxidación de los explantes, se registraron de

forma similar al Cuadro 1.

51

CUADRO 1. Efecto de cuatro protocolos de desinfección y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidación de los explantes in vitro.

Sobrevivencia de explantes (%) Oxidación por explante Tratamiento

Día 20** Día 40 Día 80 Día 75 T1: Desinfección 1 T2: Desinfección 2 T3: Desinfección 3 T4: Desinfección 4

Ensayo 2: Efecto de dos medios de cultivo sólidos sobre la oxidación promedio, callosidad y color de explantes de hojas, de cuatro Asteráceas y, explantes de yemas de Robinsonia thurifera, en la etapa de establecimiento in vitro.

El material vegetal que se utilizó para ser establecido in vitro, fueron hojas y yemas

(tercio medio y superior), provenientes de la respectiva planta madre para cada

especie, obtenidas durante los primeros 15 días de febrero. La desinfección usada

fue aquella en la que se obtuvo el mejor resultado en cuanto a menor contaminación

y el mejor resultado en cuanto a menor oxidación.

Su establecimiento se realizó utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el

medio nutritivo base macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981),

vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), que contenían dos reguladores

de crecimiento (auxinas y citoquininas) en distintas concentraciones, 30 g/l de

sacarosa, 1g/l de PVPP, 7 g/l de agar, ajustado a pH 5,5. Los tratamientos que se

evaluaron fueron los siguientes:

Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA más 2 mg/l de BAP.

Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA más 3,5 mg/l de BAP.

52

Luego los explantes se mantuvieron en la cámara de crecimiento (23 ± 2ºC) por una

semana en completa oscuridad, y, con el tiempo, fueron expuestos gradualmente a

la luz directa.

En este ensayo, se evaluaron las variables contaminación, grado de oxidación y

color, para explantes de hojas, incluyendo las variables longitud del brote y número

de hojas para explantes de yemas. Las mediciones se realizaron cada 15 días, a

partir de la segunda semana posterior al cultivo.

La contaminación fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, según la

presencia o ausencia de ésta, así como también la incidencia o causa de ésta

(hongo y/o bacteria). Las mediciones se realizaron cada quince días. Las

anotaciones de las observaciones se registraron de forma similar al Cuadro 2.

CUADRO 2. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie, según el medio de cultivo.

Para la evaluación del grado de oxidación, se utilizó una Escala Relativa de

Pardeamiento (ERP) similar a la descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una

calificación a cada estado del explante, según la especie.

Para las especies del género Robinsonia y la especie Dendroseris litoralis, la escala

utilizada es la siguiente:

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20 Día 40 Día 60

T1: Medio 1 T2: Medio 2

53

1 : Tejido sin pardeamiento.

2 : Tejido con pardeamiento en cortes.

3 : Tejido con pardeamiento heterogéneo leve

4 : Tejido con pardeamiento homogéneo leve.

5 : Tejido con pardeamiento heterogéneo fuerte

6 : Tejido con pardeamiento homogéneo fuerte

7 : Necrosis total del explante.

Para la especie Dendroseris neriifolia, las calificaciones para formar la ERP son las

siguientes:

1 : Tejido sin pardeamiento.

2 : Tejido con pardeamiento heterogéneo

3 : Tejido con pardeamiento homogéneo leve.

4 : Tejido con pardeamiento homogéneo leve y fuerte en la nervadura.

5 : Tejido con pardeamiento homogéneo fuerte

6 : Necrosis total del explante.

Para evaluar el grado de tejido de callo, se utilizó también una escala similar,

asignando una calificación a cada estado del explante, la que varió según la

especie. Para las especies del género Robinsonia, la calificación utilizada se señala

a continuación:

1 : Explante sin presencia de tejido de callo.

2 : Explante con tejido de callo en dos cortes.

3 : Explante con tejido de callo en dos cortes y nervadura.

4 : Explante con tejido de callo en más de dos cortes.

5 : Explante con tejido de callo en más de dos cortes y nervadura.

54

Para la especie Dendroseris litoralis, las calificaciones asignadas para cada estado

del explante son las siguientes:

1 : Explante sin presencia de tejido de callo.

2 : Explante con tejido de callo en dos cortes.

3 : Explante con tejido de callo en más de dos cortes

4 : Explante con tejido de callo en más de dos cortes y nervadura.

5 : Explante con tejido de callo en todo el explante.

Para la especie Dendroseris neriifolia, se midió esta variable con la siguiente

calificación:

1 : Explante sin presencia de tejido de callo.

2 : Explante con tejido de callo en un corte.

3 : Explante con tejido de callo en más de un corte.

El color fue medido de acuerdo a una tabla Munsell (MUNSELL, 1998), asignando

un número a cada color del explante y asociándolo a un valor de la tabla específico

para cada especie. En la especie Dendroseris litoralis, se ocupó la siguiente escala

de color:

1: verde oscuro 3/4 5 GY

2: verde propio de la especie 5/8 7.5 GY

3: verde oscuro pardeado 3/2 7.5 GY

4: verde amarillo 8/6 2.5 GY

5: amarillo 8/10 5Y

6: naranjo café 7/8 2.5 Y

7: café claro 5/4 2.5 Y

8: café oscuro 3/2 5YR

55

En la especie Dendroseris neriifolia, se ocupó la siguiente escala de color:

1: verde oscuro 3/4 5 GY

2: verde propio de la especie 5/10 5GY

3: verde amarillo 3/2 7.5 GY

4: verde café 8/6 2.5 GY

5: café anaranjado 8/10 5Y

6: café plomizo 7/8 2.5 Y

En Robinsonia gayana, se utilizó la siguiente escala de color:

1: verde oscuro 3/4 5 GY

2: verde propio de la especie 5/6 7.5 GY

3: verde claro 5/8 5 GY

4: verde amarillo 8/10 2.5 GY

5: verde oscuro opaco 4/4 7.5 YR

6: café oscuro 4/2 7.5 YR

7: café muy oscuro 3/2 5 YR

En Robinsonia thurifera, se ocupó la siguiente escala de color:

1: verde oscuro 3/4 5 GY

2: verde propio de la especie 4/6 5 GY

3: verde claro 5/10 5 GY

4: verde oscuro opaco 4/4 7.5 YR

5: café claro 5/6 2.5 Y

6: café muy oscuro 3/2 5 YR

56

Las variables longitud del explante, número de brotes y número de hojas se

analizaron descriptivamente para las yemas, debido a que el número de

repeticiones no era representativo para comparar tratamientos y evaluarlos

estadísticamente.

Las mediciones de longitud se realizaron con un pie de metro de marca “Mitutoyo”

por fuera del tubo o frasco de vidrio, donde los explantes fueron medidos desde la

superficie del medio de cultivo hasta el ápice del explante. En las mediciones de

número de hoja, se consideró hoja a aquella totalmente expandida.

El experimento fue conducido como Diseño Completamente al Azar (DCA), con el

mismo Modelo matemático descrito en el ensayo 1.

La variable cuantitativa sobrevivencia fue contrastada con el Test de Tukey. Las

variables oxidación y tejido de callo, también fueron contrastadas con el Test de

Tukey, debido a que la escala numérica asignada a cada estado del explante

corresponde a una graduación, donde un estado es mejor que el siguiente. Lo

anterior no se cumple para la variable respuesta color, porque fue medida a través

de rangos, por lo que no cumple con el supuesto de normalidad de los datos, siendo

necesario el uso del Test U de Mann-Whitney, el cual es equivalente al Test no

paramétrico T-Student (CANAVOS, 1988; SPIEGEL, 1991), cuyo estadístico de

prueba, U de Mann-Whitney está dado por:

111

21 2)1(* RnnnnU −

++=

57

Donde, U es una función de la variable aleatoria R1 y de los tamaños de las

muestras n1 y n2. Si H0 es cierta, la ocurrencia de cualquier orden particular para las

observaciones en el conjunto combinado es equiprobable. Por lo tanto, bajo H0, R1

es la suma de n1 enteros positivos seleccionados en forma aleatoria de entre los

primeros n1 + n2. De acuerdo a lo anterior, puede determinarse que:

E(R1) = n1 (n1 + n2 + 1) / 2

Var(R1) = n1 * n2 (n1 + n2 + 1) / 12.

Por lo tanto, se tiene que:

Para una hipótesis alternativa bilateral, es probable que se rechace H0 si se obtiene

un valor muy grande o muy pequeño de U. Lo anterior ocurrirá cuando el valor de R1

es muy grande o muy pequeño, respectivamente. Sin embargo, cuando n1 y n2 son

mayores de 10, la distribución de U se encuentra, en forma adecuada, aproximada

por una distribución normal con media y varianza dadas anteriormente. Por lo tanto,

bajo H0 la variable aleatoria

.12

1*)*()()(

2*)(

2)1(*)(

21211

211

1121

++==

=−+

+=

nnnnRVarUVar

y

nnREnnnnUE

)()(

UVarUEUZ −

=

58

es aproximadamente N(0,1) para valores grandes de n1 y n2. La hipótesis de nulidad

puede establecerse como sigue:

H0 = No existe efecto de los tratamientos sobre el color.

La decisión de rechazar o no rechazar H0 está basada en el valor-p, que

corresponde al nivel de significación más bajo con el cual el valor del estadístico de

prueba observado es significativamente distinto a lo propuesto en H0. Luego, si se

trabaja con un nivel de significación α=0,05 la regla de decisión es:

Se Rechaza H0 si: Valor-p < α=0,05.

Cuando se rechaza la hipótesis nula, existe efecto de tratamiento, lo que implica que

al menos un par de medias son distintas, en este caso se debe utilizar un test para

comparar todos los pares de medias.

Ensayo 3: Efecto de dos medios de cultivo líquidos sobre la oxidación promedio, callosidad y color de explantes de hojas en la etapa de establecimiento in vitro, de cuatro especies de la familia Asteraceae.

Se utilizó como material vegetal para ser establecido in vitro, hojas provenientes de

la respectiva planta madre para cada especie, obtenidas a fines de abril para

Dendroseris neriifolia, a mediados de mayo para Dendroseris litoralis, Robinsonia

gayana y Robinsonia thurifera.

La desinfección usada fue aquella en la que se obtuvo el mejor resultado en cuanto

a mayor sobrevivencia y el mejor resultado en cuanto a menor oxidación.

59

Su establecimiento se realizó utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el

mismo medio nutritivo utilizado en el ensayo anterior, macro y micro nutrientes de

WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG,

1962), conteniendo las mismas concentraciones de auxinas y citoquininas, 30 g/l de

sacarosa, 1g/l de PVPP, pero líquido, ajustado a pH 5,5; en tubos de ensayo sobre

un soporte metálico en agitación constante, bajo las mismas condiciones

ambientales del ensayo anterior, para su desarrollo.

En este ensayo, se evaluaron las variables sobrevivencia, grado de oxidación,

callosidad y color. Las mediciones se realizaron cada 15 días, a partir de la segunda

semana de cultivo. Para la evaluación del grado de oxidación de cada especie, se

utilizó la ERP, descrita en el segundo ensayo.

Debido a la escasa cantidad de explantes disponibles por planta, se usaron pocos,

seis para las especies Dendroseris litoralis, Robinsonia thurifera, y diez para

Dendroseris neriifolia y Robinsonia gayana, por lo tanto, los resultados fueron

analizados descriptivamente.

Ensayo 4: Efecto de dos medios de cultivo sólidos sobre la oxidación, callosidad y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para cuatro especies de la familia Asteraceae.

El material vegetal que se utilizó para ser establecido in vitro, fueron hojas

provenientes de la respectiva planta madre para cada especie, obtenidas a fines de

abril para Dendroseris neriifolia y Robinsonia gayana y, a mediados de mayo para

Dendroseris litoralis y Robinsonia thurifera.

60

Al igual que el ensayo anterior, se utilizó la desinfección en la que se obtuvo el

mejor resultado en cuanto a menor contaminación y menor oxidación. Su

establecimiento se realizó utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el mismo

medio nutritivo base utilizado en el ensayo anterior, macro y micro nutrientes de

WPM (LLOYD y MCCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG,

1962), 30 g/l de sacarosa, 1g/l de PVPP, 0,3 g/l de carbón activado, 7 g/l de agar,

ajustado a pH 5,5.

Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes:

Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA más 2 mg/l de BAP.

Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA más 4,5 mg/l de BAP.

Se realizaron 25 repeticiones por tratamiento para explantes de hojas, considerando

a cada explante como una repetición. También, se evaluaron las variables

contaminación, grado de oxidación y color, cuyas mediciones se realizaron cada 15

días, a partir de la segunda semana posterior al cultivo.

La contaminación fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, según la

presencia o ausencia de ésta, así como también la incidencia o causa de ésta

(hongo y/o bacteria). Las observaciones se registraron de forma similar al cuadro 2,

en el ensayo 2.

Para la evaluación del grado de oxidación, se utilizó la Escala Relativa de

Pardeamiento (EPR) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificación

a cada estado del explante, especificada en el ensayo 2 para cada especie.

61

El experimento fue conducido como Diseño completamente al azar (DCA), usando

el mismo Modelo matemático descrito en el ensayo uno.

La variable cuantitativa sobrevivencia fue contrastada con el Test de Tukey. Las

variables cualitativas oxidación y tejido de callo, también fueron contrastadas con el

Test de Tukey, debido a que la escala numérica asignada a cada estado del

explante corresponde a una graduación, donde un estado es mejor que el siguiente.

Lo anterior no se cumple para el color, por lo que éste fue contrastado con el Test

no paramétrico de Mann-Whitney, descrito en el ensayo dos.

Ensayo 5: Efecto de dos medios de cultivo sólidos sobre la oxidación y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para Robinsonia thurifera, familia Asteraceae.

El material vegetal que se utilizó para ser establecido in vitro, fueron hojas (tercio

superior) de un brote lateral, de 15 cm de longitud, provenientes de la respectiva

planta madre, obtenidas a mediados de mayo.

La desinfección se realizó basándose en el protocolo de desinfección para plantas

leñosas, del Laboratorio de Propagación de la Facultad de Agronomía, Pontificia

Universidad Católica de Valparaíso. Al igual que el ensayo 2, 3 y 4, se utilizó la

desinfección que obtuvo el mejor resultado en cuanto a mayor sobrevivencia y una

baja oxidación.

El medio nutritivo base que se utilizó en este ensayo, consistió en una solución con

macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS

62

(MURASHIGE y SKOOG, 1962), ácido ascórbico (100 mg/l), 30 g/l de sacarosa, 3

g/l de carbón activado, 6 g/l de agar, ajustado a pH 5,5.

Su establecimiento se realizó utilizando los siguientes tratamientos:

Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA más 2 mg/l de BAP.

Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA más 4,5 mg/l de BAP.

Se realizaron 20 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como

una repetición y, se evaluaron las variables sobrevivencia, grado de oxidación y

color. Las mediciones se realizaron 30 días posterior al cultivo.

La contaminación fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, según la

presencia o ausencia de ésta, así como también la incidencia o causa de ésta

(hongo y/o bacteria). Las anotaciones de las observaciones se registraron de forma

similar al cuadro 2.

Para la evaluación del grado de oxidación se utilizó la Escala Relativa de

Pardeamiento (EPR) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificación

a cada estado del explante, especificada en el ensayo 2.

El experimento fue conducido como Diseño Completamente al Azar (DCA), usando

el mismo Modelo matemático descrito en el ensayo 1.

63

La variable cuantitativa sobrevivencia fue contrastada con el Test de Tukey. Las

variables cualitativas oxidación y tejido de callo, también fueron contrastadas con el

Test de Tukey, debido a que la escala numérica asignada a cada estado del

explante corresponde a una graduación, donde un estado es mejor que el siguiente.

Lo anterior no se cumple para el color, por lo que éste fue contrastado con el Test

no paramétrico de Mann-Whitney, descrito en el segundo ensayo.

Ensayo 6: Efecto de cuatro protocolos de desinfección sobre los explantes de hojas en la especie Ochagavia elegans, familia Bromeliaceae.

El material vegetal usado fueron hojas basales, obteniendo como explantes

secciones de hojas de aproximadamente 1cm2.

El medio nutritivo que se utilizó en este ensayo, consistió en una solución con macro

y micro nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), ácido ascórbico (100

mg/l), 7% de agar, ajustado a pH 5,5.

La desinfección se realizó basándose en el protocolo de desinfección para plantas

leñosas, del Laboratorio de Propagación de la Facultad de Agronomía, Pontificia

Universidad Católica de Valparaíso. De este modo, las hojas de estas especies

fueron lavadas y escobilladas superficialmente con abundante agua corriente, para

quitar restos de tierra y esporas. Luego, las hojas fueron sometidas a los siguientes

tratamientos:

Tratamiento 1: Desinfección con hipoclorito de sodio al 1%, más ácido cítrico (500

ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

64

Tratamiento 2: Desinfección con etanol al 70%, más hipoclorito de sodio al 1%,

ácido cítrico (500 ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

Tratamiento 3: Desinfección con hipoclorito de sodio al 1,5%, más ácido cítrico (500

ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

Tratamiento 4: Desinfección con etanol al 70%, más hipoclorito de sodio al 1,5%,

ácido cítrico (500 ppm) y ácido ascórbico (500 ppm).

El experimento fue conducido como Diseño Completamente al Azar (DCA), cuyo

Modelo matemático fue descrito en el primer ensayo.

Se realizaron 25 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como

una repetición. Se evaluaron en cada caso las variables sobrevivencia y oxidación

de los explantes, cuyas mediciones se efectuaron cada 15 días, hasta el día 75.

La sobrevivencia fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes, según la

presencia o ausencia de ésta, así como también la incidencia o causa de ésta

(hongo y/o bacteria). Las anotaciones de las observaciones se registraron de forma

similar al Cuadro 1.

Para la evaluación del grado de oxidación se utilizó la Escala Relativa de

Pardeamiento (ERP) descrita por ZIV y HALEVY (1983), asignando una calificación

a cada estado del explante para cada especie, descrita en el siguiente ensayo. Los

resultados fueron expresados de forma similar al cuadro 2.

65

Ensayo 7: Efecto de dos medios de cultivo sobre la oxidación promedio y color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, en Ochagavia elegans.

El material vegetal que se utilizó para ser establecido in vitro fueron hojas y tallos,

obtenidos a mediados de febrero. Del tallo se obtuvieron secciones de tallo con y sin

yemas apicales y basales provenientes de plantas madre de semilla, sembradas el

año 2000. La planta madre se trasladó desde el vivero del Jardín Botánico de Viña

del Mar hasta el sombreadero perteneciente al Laboratorio de Propagación.

Su establecimiento se realizó utilizando 2 tratamientos, cada uno de ellos con el

mismo medio nutritivo, conteniendo diferentes concentraciones de reguladores de

crecimiento. El medio nutritivo base usado es macro y micro nutrientes de RM

(REINERT y MOHR, 1967) con 30 g/l de azúcar, vitaminas de RM, 6 g/l de agar,

ajustado a pH 5,6. Los tratamientos que se evaluaron fueron los siguientes:

Tratamiento 1: 1 mg/l de ANA más 2 mg/l de Kinetina.

Tratamiento 2: 1 mg/l de ANA más 3 mg/l de Kinetina.

En este ensayo, se evaluaron las variables contaminación, grado de oxidación,

callosidad y color, cuyas mediciones se realizaron cada 15 días a partir de la

segunda semana posterior al cultivo.

Para la evaluación del grado de oxidación se utilizó la Escala Relativa de

Pardeamiento (EPR) descrita por ZIV y HALEVY (1983), pero la calificación

asignada a cada estado del explante varió, según el tipo de explante probado. En el

caso de secciones de hoja estas se describen a continuación:

66

1 : Tejido sin pardeamiento.

2 : Tejido con pardeamiento en uno de los cortes.

3 : Tejido con pardeamiento en más de un corte.

4 : Tejido con pardeamiento en todos los cortes.

5 : Tejido con pardeamiento total del explante.

En el caso de yemas, tanto apicales como basales, la calificación fue la siguiente:

1 : Tejido sin pardeamiento.

2 : Tejido con pardeamiento leve en el trozo de tallo

3 : Tejido con pardeamiento homogéneo leve.

4 : Tejido con pardeamiento fuerte en el trozo de tallo.

5 : Tejido con pardeamiento homogéneo fuerte.

6 : Necrosis total del explante.

El experimento fue conducido como Diseño Completamente al Azar (DCA), con el

Modelo matemático detallado en el primer ensayo.

Las variables cuantitativas longitud del explante (crecimiento), número de brotes,

número de hojas y sobrevivencia fueron contrastadas con el Test de Tukey. Las

variables oxidación y tejido de callo, también fueron contrastadas con el Test de

Tukey, debido a que la escala numérica asignada a cada estado del explante

corresponde a una graduación, donde un estado es mejor que el siguiente. Lo

anterior no se cumple para el color, siendo contrastado con el Test no paramétrico

de Mann-Whitney, especificado en el segundo ensayo.

67

La medición del color se realizó de igual forma que los ensayos anteriores, de

acuerdo a una tabla Munsell (MUNSELL, 1998), asignando un número a cada color

del explante y asociándolo a un valor de la tabla específico para cada especie.

En este caso se ocupó la siguiente escala de color para explantes de hoja:

1: blanco propio de la especie 8/4 5Y

2: verde oscuro propio de la especie 4/4 7.5 GY

3: verde claro propio de la especie 7/10 5GY

4: verde amarillo 7/8 2.5 GY

5: verde pardeado 5/4 2.5 GY

6: café claro 6/6 2.5 Y

Para explantes de yemas y tallos, se utilizó la escala de color siguiente:

1: blanco propio de la especie 8/4 5Y

2: café claro 6/6 2.5 Y

3: café oscuro 4/2 7.5 YR

Ensayo 8: Efecto de dos medios de cultivo con carbón activo sobre la oxidación promedio y el color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, para Ochagavia elegans.

El material vegetal que se utilizó para ser establecido in vitro fue similar al ensayo

anterior, hojas y tallos, obtenidos a principios de mayo, pero de otra planta obtenida

de semilla del mismo año. Al igual que en el ensayo anterior los explantes

correspondieron a secciones de tallo, pero solamente con yemas. En este caso

68

también la planta madre se trasladó desde el vivero del Jardín Botánico de Viña del

Mar hasta el sombreadero perteneciente al Laboratorio de Propagación.

Para su establecimiento, se realizaron 2 tratamientos, cada uno de ellos con el

mismo medio nutritivo, conteniendo diferentes concentraciones de reguladores de

crecimiento que el ensayo anterior. El medio nutritivo base usado, macro y micro

nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), vitaminas de MS, con 25 g/l de

azúcar, 0,3 g/l carbón activo, 7,5 g/l de agar, ajustado a pH 5,7. Los tratamientos

que se evaluaron fueron los siguientes:

Tratamiento 1: 0,2 mg/l de AIB más 0,4 mg/l de BAP.

Tratamiento 2: 0,2 mg/l de AIB más 0,7 mg/l de BAP.

El experimento fue conducido como Diseño Completamente al Azar (DCA). Se

utilizaron 20 repeticiones por tratamiento, considerando a cada explante como una

repetición. El Modelo matemático usado fue descrito en el ensayo 1.

Se evaluaron en este ensayo las variables contaminación, grado de oxidación y

color, para explantes de hojas, agregando la variable largo del explante, para

explantes de yemas, cuyas mediciones se realizaron cada 15 días a partir de la

segunda semana posterior al cultivo.

La sobrevivencia fue evaluada en porcentaje de explantes sobrevivientes. Las

mediciones se efectuaron cada 15 días, hasta el día 90, asumiendo que después del

día 90 no existió contaminación posterior. Las anotaciones de las observaciones se

registraron de forma similar al cuadro 2, para explantes de hojas.

69

El grado de oxidación se evaluó al igual que el ensayo anterior, utilizando la Escala

Relativa de Pardeamiento (ERP) descrita por ZIV y HALEVY (1983), con las mismas

calificaciones detalladas. En el caso de secciones de hoja estas calificaciones se

describen a continuación:

1 : Tejido sin pardeamiento.

2 : Tejido con pardeamiento en uno de los cortes.

3 : Tejido con pardeamiento en más de un corte.

4 : Tejido con pardeamiento en todos los cortes.

5 : Tejido con pardeamiento total del explante.

En el caso de yemas, la calificación fue la siguiente:

1 : Tejido sin pardeamiento.

2 : Tejido con pardeamiento leve en el trozo de tallo

3 : Tejido con pardeamiento homogéneo leve.

4 : Tejido con pardeamiento fuerte en el trozo tallo.

5 : Tejido con pardeamiento homogéneo fuerte.

6 : Necrosis total del explante.

La variable cuantitativa sobrevivencia y las variables cualitativas oxidación y tejido

de callo fueron contrastadas con el Test de Tukey. En cambio para el color lo

anterior no se cumple, siendo contrastado con el Test no paramétrico de Mann-

Whitney, descrito en el ensayo dos.

La medición del color también se realizó de igual forma que los ensayos anteriores,

de acuerdo a una tabla Munsell (MUNSELL, 1998) asignando un número a cada

70

color del explante y asociándolo a un valor de la tabla específico para cada especie,

pero con una calificación distinta al ensayo anterior.

En este caso se ocupó la siguiente escala de color para explantes de hoja:

1: blanco propio de la especie 8/4 5Y

2: verde oscuro propio de la especie 4/4 7.5 GY

3: verde oscuro pardeado 5/8 5GY

4: verde claro propio de la especie 7/10 5GY

5: café claro 6/6 2.5 Y

Para explantes de yemas y tallos, se utilizó la escala de color siguiente:

1: blanco propio de la especie 8/4 5Y

2: verde claro propio de la especie 8/6 2.5 GY

3: café claro 6/6 2.5 Y

4: café rojizo 4/4 7.5 YR

5: café oscuro 4/2 7.5 YR

Ensayo 9: Germinación de semillas de Ochagavia elegans R. A. Phill.

El objetivo de este ensayo fue probar otra alternativa de explantes, disponible en

abundancia para esta especie recalcitrante, sin tener que destruir algunas plantas.

Se utilizó como material vegetal flores maduras de Ochagavia elegans, colectadas a

fines de octubre del año 2002 a partir de algunas plantas establecidas en terreno

71

bajo malla semisombra, en sector Islas Oceánicas del Jardín Botánico de Viña del

Mar, siendo facilitadas por el colector Oscar Fernández, a inicios de febrero del año

2003. Posteriormente, en el mes de abril, se extrajeron las semillas desde la base

de una flor (ovario) para ser sembradas in vitro.

La desinfección de las semillas se realizó sumergiendo éstas en una solución de

hipoclorito de sodio al 1% más tween 20, dentro de una jeringa (40 ml) durante 10

minutos. Luego, fueron enjuagadas 3 veces con agua destilada estéril, expulsando

los restos de detergente mediante una aguja hipodérmica unida a la punta de la

jeringa.

La siembra de las semillas se realizó en tubos de vidrio de 37 ml, sobre un medio de

germinación de cítricos utilizado en el Laboratorio de Propagación de la Facultad de

Agronomía, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, conteniendo una semilla

por tubo. El medio nutritivo base utilizado es macro nutrientes y micro nutrientes de

MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), sin vitaminas, 8 g/l de agar, ajustado a pH 5,5.

Las semillas se mantuvieron en una cámara de crecimiento con una temperatura

controlada (27 ± 2ºC) y ciclos alternantes de luz y oscuridad, siendo 16 horas de luz

y 8 horas de oscuridad.

Ensayo 10: Germinación de semillas de la especie Plantago fernandezia (Dcne) Bert.

El objetivo de este ensayo era construir curvas de germinación, las cuales se

obtienen al representar gráficamente el tanto por ciento de semillas germinadas, con

relación al tiempo transcurrido desde la siembra (PÉREZ, PITA y GOMEZ, 1994).

72

Para esto, se recolectaron frutos nuevos y maduros de Plantago fernandezia (Dcne)

Bert. en el vivero del Jardín Botánico de Viña del Mar, de la única planta madre

existente con la capacidad de dar frutos, establecida en un macetero plástico de 20

m3. Los frutos nuevos y maduros fueron colectados en invierno (julio, 2002) y

primavera (fines de octubre, 2002), respectivamente. Luego de colectados los frutos, se les extrajo las semillas. Estas últimas fueron

sumergidas y agitadas en una solución fungicida de Captan más Benlate al 1.5%, y

posteriormente enjuagadas con agua destilada estéril. La desinfección de las

semillas, se realizó utilizando hipoclorito de sodio al 1% por 10 minutos, más tween

20. Luego, fueron enjuagadas con agua destilada estéril, hasta eliminar los restos

del detergente.

La siembra de las semillas se realizó en tubos de vidrio de 37 ml sobre un medio de

germinación, conteniendo una semilla por tubo. El medio nutritivo base utilizado es

macro y micronutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), 8 g/l de agar, pH

5,5, el mismo medio utilizado para cítricos.

La germinación de las semillas se llevó a cabo en cámaras de crecimiento con una

temperatura controlada (27± 2ºC) y ciclos alternantes de luz y oscuridad, siendo 16

horas de luz y 8 horas de oscuridad.

73

4. PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS

Ensayo 1: Efecto de cuatro protocolos de desinfección sobre los explantes de hojas para cuatro especies de la familia Asteraceae.

Los explantes de hojas de las especies Dendroseris litoralis, Dendroseris neriifolia,

Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera, colocados sobre un medio WPM cero

(sin reguladores de crecimiento), sobrevivieron sin generar algún tipo de

crecimiento, hasta que la fuerte oxidación sobre éstos produjo una completa

necrosis y muerte de ellos. 4.1.1. Género Dendroseris

Se analizan, a continuación, los resultados obtenidos de los registros de

sobrevivencia y oxidación al cabo de dos meses y medio para explantes de la

especie Dendroseris litoralis (Cuadro 1).

CUADRO 1. Efecto de cuatro protocolos de desinfección y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidación de los explantes in vitro en Dendroseris litoralis.

Sobrevivencia de explantes (%) Oxidación por explante Tratamiento

Día 20** Día 40 Día 80 Día 75 T1: Desinfección 1 T2: Desinfección 2 T3: Desinfección 3 T4: Desinfección 4

100 a* 96 b 88 c 100 a

96 a* 96 a

88 b 96 a

72 d 88 b 84 c 96 a

4.0 b* 3.6 a* b 3.32 a 3.48 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

74

El porcentaje de explantes sobrevivientes a los 40 días, es alto para todos los

tratamientos, presentando una similitud entre los tratamientos uno (T1), dos (T2) y

cuatro (T4), siendo la desinfección numero tres (T3) la peor, en tanto que, a los 20

días sólo los T1 y T4 son superiores al resto. Sin embargo, a los 80 días, todos los

tratamientos presentan diferencias (P≤0.05) entre ellos, siendo T4 la mejor con la

menor contaminación por hongos y bacterias. Esto podría ser debido a que contiene

la mayor concentración de hipoclorito de sodio (1.5%) y la aplicación previa de

etanol (70%).

Aunque la desinfección número cuatro presenta poca mortalidad hasta el día 80,

presenta una alta oxidación de los explantes, confirmando lo expuesto por

McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la desventaja que posee el

hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos vivos.

La variable oxidación, a los dos meses y medio de realizado el cultivo de los

explantes, presenta diferencias (P≤0.05) (Cuadro 1), siendo las desinfecciones

número tres y cuatro las mejores, ya que muestran la menor oxidación promedio y,

porque T2 al no diferir del resto, es considerada una desinfección intermedia. Esto

puede deberse a una desinfección sin alcohol y a la posición del explante utilizado

en la planta, como es señalado por YU y MEREDITH (1986) en cultivos de vid (Vitis

vinífera L.), donde encontraron que la posición de los explantes y los efectos de la

luz, son factores muy significantes para el control del pardeamiento de los tejidos,

por efecto de los contenidos fenólicos preexistentes y la posterior sobrevivencia.

En ninguno de los tratamientos hubo formación de callo u órgano, lo que puede

deberse a la falta de compuestos orgánicos en el medio de cultivo como vitaminas y

reguladores del crecimiento, acelerándose la mortalidad de los mismos por efecto

del pardeamiento. Esto es confirmado por MURASHIGE (1977) para la mayoría de

75

las plantas propagadas in vitro, donde el éxito depende tanto de la selección del

explante adecuado como la composición del medio, siendo importante también la

edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE

GROOT, 1985).

Es importante indicar que, se usa el medio WPM cero, porque se quiere lograr la

obtención de explantes sanos o libres de patógenos y, porque existen especies que

generan crecimiento en respuesta a un medio simple (solo sales inorgánicas), sin la

necesidad de agregar compuestos orgánicos. El medio WPM fue desarrollado por

LLOYD y McCOWN (1981), para algunas especies leñosas sensibles a la salinidad

in vitro, como Rhododendron spp. y Kalmia spp.

A esto hay que agregar que los explantes fueron cambiados a un medio renovado a

los 98 días de cultivo, con el fin de obtener alguna reacción positiva, al reducir el

efecto del pardeamiento de los compuestos fenólicos liberados al medio, sobre los

tejidos del explante, siendo que BROOME y ZIMMERMAN (1978) recomiendan en

Rubus ursinus Cham y Schlecht., hacerlo después de dos días, sin embargo, este

es un período de tiempo extremo, siendo lo normal para otras especies leñosas,

traspasarlos al cabo de 30 días de cultivo. A pesar de ser transferidos, los explantes

sufrieron una completa necrosis.

La oxidación de compuestos fenólicos liberados por un rompimiento celular debido a

lesiones, es una de las serias causas de pérdida al inicio del cultivo (MARKS y

SIMPSON, 1989), por inhibición y muerte de los explantes en un amplio rango de

especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

76

Por lo anterior, se desprende que en el tratamiento número cuatro los explantes

presentan la menor contaminación junto con la menor oxidación, ya que no difiere

(P≤0.05) del tercer tratamiento.

A continuación, se analizan los resultados obtenidos de los registros de explantes

sobrevivientes, durante tres períodos de cultivo y los registros de oxidación a los dos

meses y medio de cultivo, para la especie Dendroseris neriifolia (Cuadro 2).

CUADRO 2. Efecto de cuatro protocolos de desinfección y un origen de explante

sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidación de los explantes in vitro de Dendroseris neriifolia.

Sobrevivencia de explantes (%) Oxidación por explante Tratamiento

Día 20** Día 40 Día 80 Día 75 T1: Desinfección 1 T2: Desinfección 2 T3: Desinfección 3 T4: Desinfección 4

100 a 96 b 96 b 92 c

92 b 96 a 96 a 88 c

88 c 92 b 96 a 84 d

3.12 a* 3.0 a 3.0 a 3.12 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Se presentan diferencias (P≤0.05) en el alto porcentaje de explantes sobrevivientes

durante los días 20, 40 y 80 de cultivo. A los 20 días, T2 y T3 presentan porcentajes

similares de explantes sobrevivientes, siendo superadas solo por T1, en tanto que, a

los 40 días, T2 y T3 superan a los restantes. Sin embargo, a los 80 días, la

desinfección número tres es la mejor, con la menor tasa de contaminación por

hongos y bacterias, donde los primeros fueron la principal fuente de contaminación.

77

La baja mortalidad de explantes en T3 hasta el día 80, puede ser debido al igual que

en Dendroseris litoralis porque contiene la mayor concentración de hipoclorito de

sodio (1.5%), sin la aplicación previa de etanol (70%). Sin embargo, presenta

también oxidación al igual que los demás tratamientos, de los cuales no difiere, por

lo tanto, se desprende que es el mejor.

Esto puede ser al igual que para Dendroseris litoralis favorecido por una

desinfección con hipoclorito de sodio (McCLELLAND y SMITH, 1993) y, a la

posición del explante utilizado en la planta, como lo señalan YU y MEREDITH

(1986), quienes detectaron que existe una fuerte relación entre el fenómeno de

pardeamiento de puntas de brotes de Vitis vinífera L.. como explantes y el origen del

explante, por efecto de los contenidos fenólicos preexistentes y la posterior

sobrevivencia.

Los explantes fueron cambiados a un medio renovado a los 80 días de cultivo, para

intentar reducir la fuerte oxidación que provocan los compuestos fenólicos liberados

al medio de cultivo sobre los tejidos, prolongar el período de vida del explante y,

obtener alguna respuesta de crecimiento. Con respecto a lo señalado, de forma

poco común para otras especies leñosas, recomiendan BROOME y ZIMMERMAN

(1978), cambiar los explantes a los dos días de cultivo, en Rubus ursinus Cham y

Schlecht., siendo normalmente después de 30 días, como sucede en Rhododendron

spp., cuyos primeros subcultivos se realizan cada dos semanas, pero

posteriormente se realizan cada 6 a 8 semanas (HARTMANN y KESTER, 1998). Sin

embargo, a pesar del subcultivo en el medio nuevo, los explantes se necrosaron

completamente luego de 10 días.

Al igual que en Dendroseris litoralis, los explantes no formaron callos ni órganos en

ninguno de los tratamientos, lo que también puede deberse a la falta de compuestos

78

orgánicos en el medio de cultivo como vitaminas y reguladores del crecimiento,

acelerándose la mortalidad de los mismos por efecto del pardeamiento. Esto es

señalado por MURASHIGE (1977) para la mayoría de las plantas propagadas in

vitro, donde el éxito depende tanto de la selección del explante adecuado como la

composición del medio, siendo importante también la edad, el estatus de agua y

nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

4.1.2. Género Robinsonia.

Al observar los resultados obtenidos de los registros de explantes sobrevivientes

para la especie Robinsonia gayana en el Cuadro 3, se presentan diferencias

(P≤0.05) entre todos los tratamientos, a los 20, 40 y 80 días de cultivo.

CUADRO 3. Efecto de cuatro protocolos de desinfección y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidación de los explantes in vitro de Robinsonia gayana.

Sobrevivencia de explantes (%) Oxidación por explante Tratamiento

Día 20** Día 40 Día 80 Día 75 T1: Desinfección 1 T2: Desinfección 2 T3: Desinfección 3 T4: Desinfección 4

92 b 96 a 72 c 92 b

72 b 80 a 40 d 64 c

16 a 4 c 0 d 8 b

2.76 a* 3.6 a 3 6 a 3.8 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

A diferencia de las especies del género Dendroseris, los porcentajes de explantes

sobrevivientes, son mucho más bajos, a los 80 días de cultivo. En este caso, la

desinfección dos, presenta el mayor porcentaje de explantes sobrevivientes hasta

79

los 40 días de cultivo, pero a los 80 días, la desinfección número uno es la mejor, al

presentar el mayor porcentaje de explantes sobrevivientes con una menor

contaminación por hongos y bacterias, siendo estas últimas la principal causa de la

alta mortalidad de los explantes en todos los tratamientos, al final del cultivo. El uso

de antibióticos en el medio de cultivo, tales como amoxicilina, agramicina

(OYANEDEL, 1995) o penicilina, terramicina, estreptomicina, ha sido útil para el

control del desarrollo de bacterias, incluso, con efectos estimuladores sobre el

crecimiento (HARTMANN y KESTER, 1998). Estos antibóticos podrían ser una

buena alternativa para mejorar la sobrevivencia de los explantes en esta especie,

evitando la aparición bacterias, posterior al cultivo o tardíamente en él.

La desinfección número tres (T3) puede haber tenido un insuficiente efecto de la

aplicación de la solución fungicida (Captan y Benlate) sobre estos explantes, previo

a la desinfección. Debe mencionarse que en algunos tubos se encontraron tanto

hongos como bacterias.

HARTMANN y KESTER (1998) consideran que la desinfección es uno de los puntos

más importantes para el éxito del cultivo in vitro, sobre todo si se trabaja con

material proveniente de sitios en donde no se hacen desinfecciones y no se utilizan

como explante tejidos bien protegidos (meristemas) o ápices de tallo cubiertos por

las escamas foliares (MARGARA, 1988), como es en este caso, en que el material

provenía del Jardín Botánico de Viña del Mar, siendo más propenso a la penetración

de patógenos.

Los resultados de la variable oxidación, por explante, para la especie Robinsonia

gayana, presentados en el cuadro 3, se describen y analizan a continuación, luego

de 75 días de cultivo.

80

Los tratamientos número uno, dos y tres (T1, T2 y T3) presentan el menor

pardeamiento promedio, al no existir diferencias (P≤0.05) entre ellos, siendo

mejores con respecto al tratamiento número cuatro (T4). Sin embargo, se debe

considerar que la variable oxidación es la más importante que se debe controlar en

estas especies, tal como lo confirman MARKS y SIMPSON (1989) para poder

alcanzar el éxito y un eficiente establecimiento y cultivo de muchas especies in vitro.

El efecto de la oxidación sobre los explantes puede haber sido causado por el uso

de hipoclorito de sodio (1% y 1,5%), que es confirmado por McCLELLAND y SMITH

(1993), al señalar la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, es decir, producir

oxidaciones en los tejidos vivos. También es posible que exista alguna relación

entre el fenómeno de pardeamiento del explante y el origen del explante, tal como

sucede entre puntas de brotes de Vitis vinífera L. como explantes y el origen del

explante, existiendo una fuerte relación entre ellos, por efecto de los contenidos

fenólicos preexistentes y la posterior sobrevivencia, detectado por YU y MEREDITH

(1986).

Al igual que en las otras especies, los explantes no presentan organogénesis en

ningún tratamiento, quizás también debido la falta de compuestos orgánicos en el

medio de cultivo (vitaminas, reguladores del crecimiento, etc.), acelerando así la

mortalidad de los mismos por efecto del pardeamiento, después de dos meses y

medio. MURASHIGE (1977) confirma que el éxito de la mayoría de las plantas

propagadas in vitro, depende tanto de la selección del explante adecuado como de

la composición del medio, siendo importante también la edad, el estatus de agua y

nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

81

Se analizan a continuación los resultados de registros de sobrevivencia para los

explantes de la especie Robinsonia thurifera (Cuadro 4), durante tres períodos de

cultivo.

CUADRO 4. Efecto de cuatro protocolos de desinfección y un origen de explante sobre el porcentaje de sobrevivencia y oxidación de los explantes in vitro de Robinsonia thurifera.

Sobrevivencia de explantes (%) Oxidación por explante Tratamiento

Día 20** Día 40 Día 80 Día 75 T1: Desinfección 1 T2: Desinfección 2 T3: Desinfección 3 T4: Desinfección 4

88 b* 76 c 92 a 88 b

60 a 44 c 52 b 40 d

8 a* 0 b 8 a 0 b

2.8 a* 3.2 a 3.36 a 3.0 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Los tratamientos número uno y tres son los mejores por presentar la mayor tasa de

sobrevivientes de explantes a los 80 días de cultivo, existiendo diferencias (P≤0.05)

con respecto a los demás tratamientos. Tanto hongos como bacterias en igual

proporción son causantes de la alta mortalidad de los explantes.

Aunque los tratamientos número uno y tres presentan una menor mortalidad de

explantes hasta el día 80, existe una alta oxidación de los explantes al igual que los

restantes tratamientos, también debido al efecto oxidativo del hipoclorito de sodio,

expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) sobre los tejidos vivos al entrar en

contacto durante los enjuagues.

En cuanto a los resultados de pardeamiento promedio de los explantes, no

muestran diferencias (P≤0.05) entre los tratamientos de desinfección a que fueron

82

sometidos. Al igual que las restantes especies del género, se produce oxidación

sobre los tejidos, debido quizás al efecto negativo de oxidación del hipoclorito de

sodio y el alcohol, señalado por McCLELLAND y SMITH (1993) y, posiblemente

debido una fuerte relación entre el fenómeno de pardeamiento de puntas de brotes

de Vitis vinífera L. como explantes y el origen del explante, por efecto de los

contenidos fenólicos preexistentes y la posterior sobrevivencia, detectada por YU y

MEREDITH (1986).

Es importante señalar que, los explantes de hoja, presentan muy bajos porcentajes

de sobrevivencia, a diferencia de las especies del género Dendroseris.

Se desprende de los resultados de ambas variables, que los tratamientos número

uno y tres son los mejores al presentar una similar oxidación promedio por explante

y la mayor tasa de explantes sobrevivientes.

En ninguno de los tratamientos, los explantes mostraron organogénesis, lo que al

igual que en las otras tres especies de la familia, puede ser por la falta de

compuestos orgánicos en el medio de cultivo (vitaminas y reguladores del

crecimiento), acelerando así la mortalidad de los mismos por efecto del

pardeamiento, después de dos meses y medio, siendo factores importantes para el

éxito de la mayoría de las plantas propagadas in vitro, según MURASHIGE (1977),

la selección del explante adecuado y la composición del medio, al igual que la edad,

el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE

GROOT, 1985).

Finalmente, la inclusión del ácido ascórbico (100 mg/l), en las cuatro Asteráceas,

logra retardar el proceso oxidativo durante 2 semanas, de forma similar a lo que

83

obtuvieron VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000), en cultivo de secciones de hojas en

Robinsonia berteroi. Sin embargo, ellos utilizan una desinfección más fuerte

(hipoclorito de sodio al 10%), pero por menos tiempo (10 minutos) y, luego del

lavado posterior en agua destilada estéril, dejan los explantes en una solución

antioxidante de ácido cítrico (100 mg/l) durante 5 minutos, repitiendo cuatro veces

esta operación. Además, se confirma lo que señalan VELOZO, CAMUS y ROJAS

(2000), con respecto a que se desarrolla una respuesta oxidativa muy acelerada

causada por el daño mecánico propio del cultivo, sin poder anular este fenómeno ni

con previos lavados como inclusión en el medio de soluciones antioxidantes.

Ensayo 2: Efecto de dos medios de cultivo sólidos con PVPP sobre la oxidación promedio, callosidad y color de explantes de hojas, de cuatro Asteráceas y, explantes de yemas de Robinsonia thurifera, en la etapa de establecimiento in vitro.

4.2.1. Explantes de hojas en género Dendroseris.

Del ensayo anterior, se utilizó la desinfección del tratamiento número tres

(hipoclorito de sodio al 1,5%) (Cuadro 1), por presentar la menor contaminación de

los explantes, sin la necesidad de gastar etanol, como sucede en los T2 y T4. Los

explantes de hojas fueron establecidos sobre el medio nutritivo base WPM (LLOYD

y Mc COWN, 1981), conteniendo ANA y BAP en distintas concentraciones y, 1 g/l de

PVPP, entre otros.

En el cuadro 5, se presentan los resultados de sobrevivencia para los explantes de

la especie Dendroseris litoralis en ambos medios de cultivo, los que no presentan

diferencias (P≤0.05) entre ellos, a los 20 y 80 días de cultivo, pero sí a los 40 días

de cultivo.

84

CUADRO 5. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris litoralis, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Esta alta mortalidad por contaminación se debe a la detección en el medio de cultivo

mediante previo análisis fitopatológico (Anexo 1), de algunas colonias bacterianas

del género Erwinia y Xanthomonas, previsto por un cambio de coloración en el

medio (color amarillo leve a intenso), generado por la liberación de exudados de

polifenoles por los explantes (MARGARA, 1988).

Se presentan a continuación (Cuadro 6) las variables oxidación y formación de callo

promedio por explante, en la etapa de establecimiento in vitro, donde la variable

oxidación evidencia diferencias (P≤0.05) entre los tratamientos, contrario a lo que

sucede en la variable callosidad.

CUADRO 6. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris litoralis.

Oxidación por explante Formación de callo por explante Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 30 Día 60 T1: Medio 1 T2: Medio 2

3.36 a* 3.24 a

3.72 b 3.28 a

2.44 a* 2.16 a

2.92 a* 2.92 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20** Día 40 Día 80

T1: Medio 1 T2: Medio 2

68 a* 68 a

56 b 60 a

0 a* 0 a

85

En el medio uno los explantes presentan mayor oxidación promedio solo a los 60

días después de realizado el cultivo, en tanto que, la formación de tejido de callo es

similar en los explantes de ambos medios. Esta diferencia en el grado de oxidación,

puede deberse a lo que señala YU y MEREDITH (1986) en cultivos de Vitis vinífera

L., donde encontraron que la posición de los explantes y los efectos de la luz, son

factores muy significativos para el control del pardeamiento de los tejidos, por efecto

de los contenidos fenólicos preexistentes y la posterior sobrevivencia.

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) obtuvieron en Robinsonia berteroi, con

explantes de hojas, una completa oxidación a los 15 días de cultivo, mientras que en

este ensayo todavía hay explantes que no se oxidan completamente a los 30 días

de cultivo, comprobando que el uso de PVPP, favorece la absorción de sustancias

fenólicas (PIERIK, 1990), mediante la formación de puentes de hidrógeno entre los

grupos fenólicos y el oxígeno del grupo amida del anillo pirrolidona del PVPP,

arrastrando consigo los compuestos fenólicos que a él se enlacen, eliminándolos del

medio (MACÍAS, RODRIGUEZ y CANALS, 1998).

También, fue importante para CHRISTIANSEN y FONNESBECH (1975) la época

del año en que los explantes de Hamamelis (Familia Hamamelidaceae) fueron

tomados, siendo mejor en el mes de julio (Hemisferio Norte) en comparación a

aquellos tomados en agosto. Estos autores obtuvieron un mejor desarrollo y la

menor intensidad de pardeamiento en los explantes de estas especies leñosas

arbóreas, al usar en el medio de cultivo 1% de PVP (Polivinilpilorridona). Sólo es

posible señalar que el contenido de PVPP, en el medio de cultivo, junto con otras

condiciones (oscuridad al inicio del cultivo, cámara de crecimiento con menores

temperaturas) redujo el efecto de pardeamiento sobre los tejidos.

86

Ambos medios producen formación de callos en los sectores de corte del explante,

principalmente en aquellos perpendiculares a la nervadura, acompañado de

oxidación del medio (exudaciones de color rojizo alrededor del callo) y del explante,

lo que lleva a una mortalidad total más rápida si no se cambian los explantes a un

medio renovado. Esto corrobora lo expuesto por MARGARA (1988) con respecto a

que las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenólicos, taninos, etc.)

producen oscurecimiento del medio e inhibición del crecimiento acompañado, a

veces, por necrosis del explante, y por YEOMAN y MACLEOD (1977), quienes

señalan la importancia de transferir el tejido de callo a un medio renovado, con una

frecuencia de dos a seis semanas para evitar un irremediable debilitamiento,

intoxicación y muerte. Los explantes no son transferidos a un medio nuevo porque

se perdió la totalidad de los explantes por una alta contaminación de bacterias

endógenas.

También, con respecto a lo anterior, ZIV y HALEVY (1983) detectaron, en Strelitzia

reginae (Familia Strelitziaceae), que los exudados de color café que difunden en el

medio son detrimentales para favorecer el desarrollo de los explantes, los cuales

eventualmente llegan a ser necróticos y mueren, tal como sucedió en esta especie.

Además, la oxidación de compuestos fenólicos liberados por un rompimiento celular,

debido a lesiones, es una de las serias causas de pérdida al inicio de

establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989). DAMIANO, CHIAROTTI y

ANTONELLI (1991) afirman, también, que los productos de la oxidación inhiben la

actividad enzimática, causando la muerte del explante y el bronceado del medio de

cultivo.

HARTMANN y KESTER (1998) afirman que la formación de callo se debe a la alta

concentración de auxinas y baja dosis de citoquininas en el medio de cultivo, en

tanto que CHISTIANSON y WARNICK (1983) consideran que el tejido de callo

aparece cuando estos dos grupos de hormonas se encuentran en proporciones

87

similares, aunque no siempre se cumple para todas las especies. Sin embargo, en

este ensayo la proporción de citoquininas es mayor que la de auxinas en ambos

tratamientos, e igualmente se observó formación de callos. Además, con respecto al

tejido de callo, debe mencionarse que es positiva su formación en términos de

respuesta al medio de cultivo, pero es negativa en relación a la formación de

órganos, siendo considerada una etapa intermedia a la organogénesis.

No se observa formación de órganos, a excepción de seis explantes (4 explantes

del medio uno y 2 explantes del medio dos), que forman raíces aéreas (presentes

en 5 explantes de hojas y 1 explante de pecíolo) y cuatro explantes de hoja que

forman raíces en el medio (Figura 1).

Con respecto a las raíces adventicias, según BARBA (1987), existe un problema

complejo con el tejido de callo, que es la alteración y daño de la citología nuclear de

las células durante el cultivo, pudiendo aparecer mutaciones puntuales producto de

la formación de brotes adventicios (PIERIK, 1990), como en este caso, o distintos

tipos de ploidías (NOVAK, 1980), es decir, se asocia a una potencial variabilidad

genética (HARTMANN y KESTER, 1998). También con respecto a esto, MERINO

(1987) considera que las hojas se cultivan normalmente bajo luz, con ciclos de

oscuridad, porque aparecen anormalidades morfogenéticas durante el cultivo en

oscuridad, como el caso de los explantes que formaron raíces aéreas.

También, PIERIK (1990) señala que en Gerbera, una alta concentración de

citoquininas causa no solo fragosidad, sino también la aparición de diferentes

formas de hojas, formación de callos y brotes adventicios. Estos brotes adventicios

pueden aumentar las tasas de producción de plantas aberrantes (HARTMANN y

KESTER, 1998).

88

FIGURA 1. Explantes de pecíolo y hoja en Dendroseris litoralis Skottsb., que formaron raíces adventicias (1A), del medio uno; explantes (EX.) de hojas (±1cm2), que presentan raíces normales (1B).

1A HOJA 1A PECÍOLO

1B 2 EX.HOJAS 1B 3 EX. HOJAS (T1)

89

Es posible que esta especie requiera una proporción de citoquininas mucho mayor

que el de auxinas, como sucede con el cultivo de Gerbera, en el que MURASHIGE,

SERPA y JONES (1974) utilizan bajos niveles de AIA (0,5 mg/l) y una alta

concentración de Kinetina (10 mg/l), tanto para la inducción de brotes como la

rápida multiplicación de secciones pequeñas; al igual que en Coreopsis lanceolata

L., pero en un medio MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962) suplementado con 1uM de

ANA más 10uM de BA, favoreciendo la formación de brotes adventicios sobre los

explantes (LEE et al, 1994).

Las auxinas y citoquininas son, posiblemente, los componentes más importantes del

medio, regulando el desempeño del explante, en gran medida (DIRR y HEUSER,

1987)

La medición de las variables (Cuadro 6) a los 90 días de cultivo no fue evaluada

debido a la detección en el medio, mediante un previo análisis fitopatológico, de

algunas colonias bacterianas del género Erwinia y Xanthomonas (Anexo 1). En

tanto, la variable respuesta color, es expresada a continuación, en valores promedio

muestrales (Cuadro 7), registrados a los 30 y 60 días de cultivo.

CUADRO 7. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris litoralis, a los 30 y 60 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 4 a* Día 30** T2: Medio 2 4 a

T1: Medio 1 6 b Día 60 T2: Medio 2 5 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

90

Se detectaron diferencias (P≤0.05), entre los dos tratamientos, solo a los 60 días de

cultivo, observándose principalmente en el medio uno, el color naranjo café,

correspondiente en la tabla Munsell (MUNSELL, 1998) para tejidos a 7/8 2.5 Y y, en

el medio dos, el color amarillo (8/10 5 Y). Esta diferencia es confirmada con los

resultados de oxidación (Cuadro 6). En tanto que, a los 30 días de cultivo, se

observó mayormente el color verde amarillo (8/6 2.5 GY).

Se presentan, en el Cuadro 8, los resultados del porcentaje de explantes

sobrevivientes para la especie Dendroseris neriifolia, en donde no hay diferencias

(P≤0.05) entre ambos medios de cultivo, solo a los 80 días de cultivo.

CUADRO 8. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris

neriifolia, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P= 0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

La coloración amarilla detectada en el medio de cultivo en todas las repeticiones,

aunque más leve que en Dedroseris litoralis, puede ser debida también a la

presencia de bacterias endógenas, aunque no fue comprobado por análisis

fitopatológico. Sin embargo, este material vegetal se descartó para las siguientes

mediciones.

Al igual como sucedió con Dendroseris litoralis, HARTMANN y KESTER (1998)

señalan que estos patógenos bacterianos internos, como Erwinia, están presentes,

pero no crecen con facilidad en el medio de cultivo, debido a la acidez de éste o

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20** Día 40 Día 80

T1: Medio 1 T2: Medio 2

96 b 100 a

28 a 16 b

0 a* 0 a

91

porque la citoquinina presente en el medio reduce su crecimiento, pudiendo llegar a

inhibir el potencial de crecimiento y el enraizamiento.

Es importante destacar lo señalado por MARGARA (1988), quien recomienda el uso

de tejidos bien protegidos (meristemas) o ápices de tallo cubiertos por las escamas

foliares como explantes, para lograr con éxito la propagación in vitro, sobre todo

considerando que el material se encuentra muy expuesto al medioambiente. Sin

embargo, dada la escasez de material disponible (plantas madres) y nula formación

de yemas axilares en estas dos especies, es un proceso más complejo de realizar.

Las variables oxidación y formación de callo (Cuadro 9) en la etapa de

establecimiento in vitro, no evidenciaron diferencias (P≤0.05) entre los dos

tratamientos, a los 30 y 60 días de cultivo.

CUADRO 9. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris neriifolia.

Oxidación por explante Formación de callo por explante Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 30 Día 60 T1: Medio 1 T2: Medio 2

3.24 a* 3.36 a

3.88 a* 3.96 a

1.64 a* 1.28 a

1.8 a* 1.56 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

En ambos medios de cultivo, los explantes presentan una similar oxidación y

callosidad promedio al cabo de dos meses de cultivo. Esta nula diferencia

significativa en el grado de oxidación, contrario a lo que sucedió en Dendroseris

litoralis, también puede deberse a los factores, posición de los explantes y los

92

efectos de la luz, detectados por YU y MEREDITH (1986), para el control del

pardeamiento de los tejidos.

También, al igual que en Dendroseris litoralis, ambos medios producen formación de

pequeños callos (2 a 3 mm) en los sectores de corte del explante, pero solamente

en la zona de contacto de la nervadura central con el medio, y, por lo tanto, menor,

siendo también positivo como respuesta al medio de cultivo, pero detrimental para la

organogénesis en los explantes. Además, se observó una leve coloración amarilla

del medio y una fuerte oxidación del explante en la zona que rodea la nervadura

central. En relación a esta fuerte oxidación, recomiendan YEOMAN y MACLEOD

(1977) transferir el tejido de callo a un medio renovado, con una frecuencia de dos a

seis semanas para evitar el debilitamiento, intoxicación y muerte. Sin embargo, al

igual que en Dendroseris litoralis, no se tranfirieron los explantes a medio renovado

por la posible presencia de bacterias en el medio. Además, corrobora lo que

MARGARA (1988) indica con respecto a que las sustancias excretadas por el

explante (compuestos fenólicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio e

inhibición del crecimiento acompañado, a veces, por necrosis del explante.

La similitud en formación de callo entre los tratamientos es debida, según

CHISTIANSON y WARNICK (1983), a que los dos grupos de hormonas se

encuentran en proporciones similares, siendo posible que esta especie también

requiera una proporción de citoquininas mucho mayor que el de auxinas, como es

descrito en el cultivo de Gerbera (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974) y

Coreopsis lanceolata L. (LEE et al, 1994), para la formación de brotes u

organogénesis.

Tampoco se observa formación de órganos en los explantes, al igual como sucedió

en Dendroseris litoralis, también debido quizás al pardeamiento de los tejidos,

93

provocado por la oxidación de compuestos fenólicos liberados en un rompimiento

celular, causado por lesiones (MARKS y SIMPSON, 1989), ya que las especies de

éste género poseen según SILVA, BITTNER y PACHECO (1992), una alta cantidad

de flavonoides, y algunos flavonoles y flavonas, considerados por CHEFTEL y

CHEFTEL (1992) como sustratos naturales de pardeamiento enzimático y

principales constituyentes fenólicos de los vegetales.

También se debe considerar con respecto al pardeamiento, las diferencias

morfológicas de las hojas entre las especies Dendroseris litoralis y Dendroseris

neriifolia, descritas por JOHOW (1896), REICHE (1910), RODRIGUEZ, MATTHEI y

QUEZADA (1983), siendo las hojas de Dendroseris neriifolia, más pequeñas,

angostas (15 cm de largo y entre 1,5-2 cm. de ancho), coriáceas y con una delgada

nervadura central (tejido meristemático); en cambio, en Dendroseris litoralis, son

grandes (lámina entre 25-45 cm. de largo y 18-30 cm. de ancho), aovada u

oblonga, coriáceo-carnosa, y una nervadura central con ramificaciones laterales.

Los resultados de la variable respuesta color en los explantes, se presentan a

continuación (Cuadro 10), en dos periodos de cultivo.

CUADRO 10. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris neriifolia los 30 y 60 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 3 a* Día 30** T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 4 a Día 60 T2: Medio 2 4 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

94

No se evidencian diferencias (P≤0.05) entre los dos medios de establecimiento a los

30 y 60 días de cultivo, observándose a los 30 días principalmente el color verde

amarillo, equivalente en la tabla Munsell (MUNSELL, 1998) a 3/2 7.5 GY y, a los 60

días mayormente el color café plomizo (7/8 2.5 Y).

4.2.2. Explantes de hojas en género Robinsonia.

En este género se utilizó la desinfección número uno (T1), que resultó ser mejor en

el ensayo uno, para ambas especies, por presentar la menor contaminación de los

explantes junto a un menor efecto sobre la oxidación de los explantes.

El Cuadro 11 presenta los resultados de sobrevivencia para explantes de la especie

Robinsonia gayana en ambos medios de cultivo.

CUADRO 11. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia gayana, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

A diferencia de las dos especies del género Dendroseris, ambos medios de cultivo

presentan diferencias (P≤0.05) en los tres períodos de cultivo, siendo el medio

número dos el mejor, porque muestra una mayor sobrevivencia de los explantes por

una menor contaminación provocada por hongos, la principal causa de mortalidad,

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20** Día 40 Día 60

T1: Medio 1 T2: Medio 2

72 b 92 a

68 b 92 a

68 b 92 a

95

posiblemente debido a una mayor eficiencia de la solución fungicida aplicada al

material vegetal del cual provienen esos explantes. La sobrevivencia de los

explantes en ambos medios es alta, en comparación a aquella obtenida en el

ensayo del protocolo de desinfección, debido a la ausencia de bacterias.

Se evidenciaron diferencias significativas (P≤0.05) entre los dos medios de cultivo

según el Test de Tukey en la variable formación de callo, no así en la variable

oxidación, en la etapa de establecimiento in vitro. Estos resultados se expresan a

continuación (Cuadro 12):

CUADRO 12. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia gayana.

Oxidación por explante

Formación de callo por explante

Tratamiento

Día 30** Día 60 Día 90 Día 30 Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

2.72 a* 2.68 a

3.2 a* 3.12 a

4.88 a* 4.46 a

1.72 a* 1.96 a

2.12 a 2.56 b

2.36 a 3.24 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

La oxidación promedio por explante es similar en ambos medios de cultivo, durante

los tres períodos de evaluación, sin embargo, la formación de callo por explante es

similar solo a los 30 días, siendo mayor en el medio dos a los 60 y 90 días de

cultivo. Esta similitud en el grado de oxidación, al igual que en Dendroseris neriifolia,

puede ser debido a una posición y recepción de luz similares al material que aporta

explantes, factores detectados por YU y MEREDITH (1986), en Vitis vinífera,

necesarios para el control del pardeamiento de los tejidos, asegurando también que

existe una relación inversa entre la existencia de compuestos fenólicos y la

sobrevivencia in vitro de los explantes.

96

VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000) lograron, en la especie Robinsonia berteroi,

retardar dos o tres semanas el proceso oxidativo, al incluir en el medio de cultivo,

ácido cítrico (100 mg/l), siendo similar al efecto del PVPP en el medio de cultivo. Sin

embargo, estos autores también obtienen, en explantes de hoja, el mayor grado de

oxidación, a diferencia de secciones nodales, inflorescencias y raquis.

La menor oxidación sobre los explantes permite la formación de una mayor

callosidad, pero esta relación no siempre es inversa, tal como sucede en

Dendroseris litoralis (Cuadro 6), por lo que depende principalmente de las

características químicas y morfológicas de la especie. Al contrario, VELOZO,

CAMUS y ROJAS (2000) no observaron respuestas de crecimiento en secciones de

hojas de Robinsonia berteroi, solamente en secciones de raquis y flores, los que

formaron tejido de callo, pero también se oxidaron luego de dos meses, sin

presentar un crecimiento significativo.

Ambos medios producen formación de callos en los sectores de corte del explante, y

algunos explantes también en la nervadura central, acompañados de exudación en

el medio (con una coloración rojiza alrededor del callo) y oxidación del explante. Es

por esta razón que YEOMAN y MACLEOD (1977) dan mucha importancia a

transferir el tejido de callo a un medio renovado con una frecuencia de dos a seis

semanas para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicación y muerte. Esto

último se favorece con el cambio de los explantes a un medio renovado a los 40

días de cultivo. Sin embargo, al igual que en las especies del género Dendroseris,

en ambos medios, no se observa la formación de órganos sobre los explantes,

confirmando lo expuesto por MARGARA (1988), con respecto a que las sustancias

excretadas por el explante (compuestos fenólicos, taninos, etc.) producen

oscurecimiento del medio, inhibición de la actividad enzimática (DAMIANO,

CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991) y del crecimiento, acompañado de bronceado del

medio de cultivo y, a veces, por necrosis del explante.

97

También, se debe considerar la alta cantidad de flavonoides encontrados por SILVA,

BITTNER y PACHECO (1992), tales como flavonoles, flavonas, flavanonas y

dihidriflavonol, en la composición química de esta especie y las demás de la familia

Asteraceae, considerados por CHEFTEL y CHEFTEL (1992) como sustratos

naturales de pardeamiento enzimático y principales constituyentes fenólicos de los

vegetales.

Al igual que en las otras especies, esta nula formación de órganos en los explantes,

también se puede explicar al usar concentraciones hormonales similares entre las

auxinas y citoquininas, lo que permite la formación de tejido callo según

CHISTIANSON y WARNICK (1983), siendo posible que esta especie también

requiera una proporción de citoquininas mucho mayor que el de auxinas, como es

descrito en el cultivo de Gerbera (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974) y

Coreopsis lanceolata L. (LEE et al, 1994), para la formación de brotes u

organogénesis.

Sin embargo, KOTHARI y CHANDRA (1984) obtienen en Tagetes erecta L., con una

combinación de 1mg/l de AIA y 3mg/l de BA, una buena respuesta morfogenética,

con un excelente desarrollo de brotes. Es importante enfatizar que las especies

Gerbera, Chrysanthemum, Tagetes, etc., son todas herbáceas, mientras que los

géneros Robinsonia y Dendroseris conforman especies que son Fanerófitas

semileñosas.

Finalmente, la oxidación sobre los explantes no pudo ser controlada, provocando

una necrosis total y homogénea sobre éstos después de tres meses de cultivo. Sin

embargo, se logra alargar el período de cultivo en comparación al ensayo número

uno.

98

Se presentan a continuación (Cuadro 13) los resultados de los registros de la

variable color, en valores promedio muestrales, durante tres meses de cultivo.

CUADRO 13. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia gayana los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 4 a* Día 30** T2: Medio 2 4 a

T1: Medio 1 5 a Día 60 T2: Medio 2 5 a

T1: Medio 1 6 a Día 90 T2: Medio 2 6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Durante los tres períodos de registro de las observaciones de color, 30, 60 y 90

días de cultivo, no se detectaron diferencias (P≤0.05) entre los dos tratamientos,

presentando principalmente el color verde amarillo (8/10 2.5 GY) a los 30 días; el

color verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR), a 60 días; y, el color café oscuro (4/2 7.5

YR), a los 90 días desde su cultivo.

El cuadro siguiente (Cuadro 14) presenta los resultados de sobrevivencia, en

porcentaje de explantes sobrevivientes, para la especie Robinsonia thurifera en

ambos medios de cultivo.

99

CUADRO 14. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia thurifera, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Los resultados no evidencian diferencias (P≤0.05) entre los dos medios de cultivo,

durante los tres meses de cultivo. Al igual que la especie Robinsonia gayana, los

explantes presentan una alta sobrevivencia en comparación al ensayo número uno

del protocolo de desinfección, causada por la baja incidencia de bacterias, siendo

totalmente opuesto a los resultados en el género Dendroseris, quizás más

susceptible a éstas (Cuadros 5 y 8).

Es importante tener presente las recomendaciones de MARGARA (1988), en el uso

de tejidos bien protegidos (meristemas) o ápices de tallo cubiertos por las escamas

foliares, como explantes, para lograr con éxito la propagación in vitro, porque

pueden manifestarse en cualquier momento bacterias y virus, como sucedió en el

género Dendroseris. Por este motivo, se intenta más adelante probar como

explantes, yemas axilares en esta especie.

Aunque ambos tratamientos presentan una baja mortalidad de explantes hasta el

día 90, existe una alta oxidación de ellos, incluso mayor que en las especies

anteriormente analizadas. Se presentan a continuación (Cuadro 15) los resultados

de las variables oxidación y callosidad promedio por explante para la especie

Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 días de cultivo.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 30** Día 60 Día 90

T1: Medio 1 T2: Medio 2

100 a* 100 a

92 a* 92 a

92 a* 92 a

100

CUADRO 15. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia thurifera.

Oxidación por explante

Formación de callo por explante

Tratamiento Día 30** Día 60 Día 90 Día 30 Día 60 Día 90

T1: Medio 1 T2: Medio 2

2.64 a* 2.32 a

4.24 a* 4.08 a

5.84 a* 5.76 a

2.24 a 2.60 b

2.44 a 3.16 b

2.92 a 3.72 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

No se evidenciaron diferencias (P≤0.05) entre los explantes de ambos medios, en la

variable oxidación, desde el inicio hasta los 90 días de cultivo, pero sí en la variable

callosidad, donde el medio número dos, forma una mayor cantidad promedio de

tejido de callo por explante, semejante a lo sucedido en Robinsonia gayana, aunque

ligeramente mayor, a pesar de existir una más alta oxidación promedio en los dos

últimos meses. Esta similitud en el grado de oxidación, al igual como sucedió en

Robinsonia gayana, también puede deberse a los factores posición de los explantes

y los efectos de la luz, detectados por YU y MEREDITH (1986), para el control del

pardeamiento de los tejidos.

Al igual que en Robinsonia gayana y en las especies del género Dendroseris,

ambos medios producen formación de callos en los sectores de corte del explante y

nervadura, acompañados de una leve exudación en el medio (con una coloración

rojiza alrededor del callo), y una fuerte oxidación homogénea de los explantes

después de tres meses de cultivo. A pesar de que los explantes fueron transferidos

a un medio renovado a los 38 días de cultivo, se produjo una completa necrosis de

ellos. Con respecto esto, YEOMAN y MACLEOD (1977) recomiendan transferir el

tejido de callo sano (sin contaminación y sin necrosis) a un medio renovado, con

una frecuencia de dos a seis semanas, para evitar un irremediable debilitamiento,

intoxicación y muerte. Sin embargo, en ésta y al igual que en las otras especies es

101

imposible transferir un tejido sin necrosis, considerando que la eliminación del sector

necrosado, significa la liberación de más polifenoles o exudados de color café (ZIV y

HALEVY, 1983) y la inhibición de la actividad enzimática, causando la muerte del

explante y el bronceado del medio de cultivo (DAMIANO, CHIAROTTI y

ANTONELLI, 1991).

Es importante destacar la alta cantidad de flavonoides (flavonoles, flavonas,

flavanonas y dihidriflavonol), encontrados y descritos por SILVA, BITTNER y

PACHECO (1992), en la composición química de las especies del género y de la

familia Asteracea, siendo considerados por CHEFTEL y CHEFTEL (1992) como

sustratos naturales de pardeamiento enzimático y principales constituyentes

fenólicos de los vegetales.

PIERIK (1990) considera importante el estado fisiológico y la edad de la planta

donadora de callo. Es recomendable utilizar plantas jóvenes y con crecimiento

activo.

Al igual que en Robinsonia gayana y las otras especies, esta nula formación de

órganos en los explantes también se puede explicar debido al uso de

concentraciones hormonales similares entre las auxinas y citoquininas, estimulando

la formación de tejido callo, según CHISTIANSON y WARNICK (1983), no

cumpliéndose siempre esta relación en todas las especies, ya que, con diferencias

de concentraciones entre estas hormonas muy similares a las que utilizan KOTHARI

y CHANDRA (1984) en Tagetes erecta L., obtienen una buena respuesta

morfogenética, con un excelente desarrollo de brotes.

102

Es posible que esta especie también requiera una proporción de citoquininas mucho

mayor que el de auxinas para estimular la formación de brotes, como es descrito en

el cultivo de Gerbera (MURASHIGE, SERPA y JONES, 1974) y Coreopsis

lanceolata L. (LEE et al, 1994), o solo la presencia de citoquininas, descrito en el

cultivo de Centaurea paui Loscos ex Willk.,a partir de yemas axilares en un medio

MS (MURASHIGE and SKOOG, 1962), suplementado con 0,5 mg/l de BA o 2 mg/l

de kinetina (CUENCA, AMO-MARCO y PARRA, 1999).

Por lo señalado en el párrafo anterior y, al igual que en la otras especies, es muy

importante aclarar las diferencias morfológicas entre las especies de los géneros

Gerbera, Chrysanthemum, Tagetes, Centaurea, etc. (todas herbáceas) y las

especies de los géneros Robinsonia y Dendroseris (semileñosas).

Los resultados de la variable color de los explantes de Robinsonia thurifera, luego

de 90 días de cultivo, se presentan a continuación (Cuadro 16).

CUADRO 16. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los

explantes de Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL T1: Medio 1 3 a*

Día 30** T2: Medio 2 3 a T1: Medio 1 5 a

Día 60 T2: Medio 2 5 a T1: Medio 1 6 a

Día 90 T2: Medio 2 6 a *: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

103

No se evidenciaron diferencias (P≤0.05) entre los medios de establecimiento, a los

30, 60 y 90 días de cultivo de los explantes, encontrándose en mayor cantidad el

color verde claro (5/10 5 GY) a los 30 días; el color café claro (5/6 2.5 Y), a los 60

días; y el color café muy oscuro (3/2 5 YR), a los 90 días.

Estos cambios, en las condiciones medioambientales in vitro, han limitado,

efectivamente, el pardeamiento del medio en explantes de la orquídea Phalaenopsis

al iniciar el cultivo en oscuridad (PIEPER y ZIMMER, 1976, GEORGE y

SHERRINGTON, 1984). Aún así, no se logró eliminar completamente el efecto de

pardeamiento y necrosis total de los explantes.

Se desprende de los resultados de este ensayo, que los explantes de hojas de las

cuatro especies, colocados sobre un medio nutritivo base macro y micro nutrientes

de WPM (LLOYD y MCCOWN, 1981), vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG,

1962), PVPP y 7 g/l de agar, entre otros, reaccionaron a los dos medios, generando

una mejor respuesta que en el ensayo anterior, algunos formando callos en la zona

de corte y otros, sobre la nervadura, lo que les permitió permanecer con vida por

más tiempo (más de tres meses) a causa de un menor efecto de oxidación, debido

al uso de PVPP en el medio, las menores temperaturas de la cámara de crecimiento

y una baja exposición a la luz durante el inicio del cultivo.

4.2.3. Explantes de yemas en Robinsonia thurifera.

Otra alternativa al uso de secciones de hoja como explante es, probar secciones de

tallo con yemas axilares del sector medio y apical de la planta, obtenidas a fines de

marzo, y que se presentan visualmente solo en esta especie.

104

Los resultados de las variables sobrevivencia, oxidación y color se analizan

descriptivamente, debido al bajo número de explantes disponibles por planta (16),

que representan el número de repeticiones (8) por tratamiento.

El porcentaje de explantes sobrevivientes a los 90 días de cultivo es bajo (12,5%) en

comparación con los explantes de hojas, debido al uso de una desinfección más

leve (hipoclorito de sodio al 0,5% por 10 minutos), siendo los hongos la principal

causa de muerte al inicio del cultivo y las bacterias, al final del mismo (90 días). Se

encontraron diferencias principalmente en la posición o lugar de origen del explante,

donde el 100% de las yemas del sector medio de la planta muere al inicio del cultivo

en ambos medios, porque creció sin la protección de las hojas, las que

anteriormente fueron removidas para llevar a cabo otros ensayos.

En yemas apicales, también hay diferencias de sobrevivencia entre los medios,

siendo los hongos la principal causa de mortalidad, debido posiblemente a la baja

eficiencia de la solución fungicida aplicada antes de la desinfección o a la

desinfección misma en cuanto al tiempo o cantidad de hipoclorito utilizada o al lugar

de procedencia de las yemas axilares (3-5 mm. de largo), el sombreadero del

Laboratorio de Propagación, encontrándose al igual que en el Jardín Botánico, muy

expuestas al medioambiente y susceptibles a la penetración de patógenos. La

selección del explante (MARGARA, 1988) y el lugar de origen (HARTMANN y

KESTER, 1998), son factores muy importantes para lograr el éxito del cultivo in vitro.

A pesar de la alta oxidación y la mediana contaminación de los explantes, dos

yemas del medio 2 logran sobrevivir y crecer durante más de dos meses y una por

más de tres meses, donde lamentablemente las primeras se contaminaron con

bacterias y la última se oxidó al ser transferida a los tres meses de cultivo al medio

renovado número dos del ensayo cuatro (con carbón activo), quizás debido a un

105

efecto negativo del carbón activo sobre estas especies o por deshidratación del

explante durante el subcultivo. La yema llegó a medir 8.12 mm. de largo y a

expandir 3 hojas. GARCIA y NOA (1998) señalan que, a pesar de usar ápices

meristemáticos en el cultivo de caña de azúcar, plátano y banano, el principal factor

que influye en los bajos índices de establecimiento se debe a la necrosis de los

tejidos, consecuencia de la oxidación de los fenoles.

Los explantes en la zona de la sección del tallo presentan una oxidación promedio

menor (valor de 3.3) que en explantes de hojas a los 90 días de cultivo para ambos

medios (Figura 2). Sin embargo, es posible pensar que es una buena alternativa

como explante sobre todo si se logra controlar eficientemente la oxidación del tejido

que es cortado (la sección de tallo), confirmándose que la oxidación de compuestos

fenólicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las

serias causas de pérdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y

SIMPSON, 1989), por inhibición y muerte de los explantes, en un amplio rango de

especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

Los resultados descriptivos confirman la efectividad del medio de cultivo en cuanto

al balance de los grupos de hormonas, para el desarrollo de las yemas durante al

menos tres meses. Esto confirma lo señalado por MURASHIGE (1977) con respecto

a que el éxito de la propagación in vitro depende tanto de la selección del explante

adecuado como la composición del medio, así como también la edad, el estatus

hídrico y nutritivo de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

106

FIGURA 2. Explantes de yemas axilares de Robinsonia thurifera Dcne., en el medio

número dos, a los 20 días de cultivo.

107

A lo largo del cultivo, las yemas presentaron una menor heterogeneidad de colores

que los explantes de hojas, predominando el color verde claro, que en la tabla

Munsell (MUNSELL, 1998) para tejidos, equivale a 8/4 2.5 GY, mientras que la

sección del tallo presenta colores entre café claro y café oscuro, correspondientes a

6/4 2.5 Y y 3/2 5 YR en la tabla Munsell, respectivamente.

Es importante destacar que VELOZO, CAMUS y ROJAS (2000), durante los

ensayos de cultivo in vitro de Robinsonia berteroi, no reportan el uso de yemas con

secciones de tallo como explantes, ni la presencia de agentes patógenos, como

bacterias, las que sí tienen una alta incidencia en la sobrevivencia de todas las

Asteráceas, sobre todo, en las especies del género Dendroseris.

Ensayo 3: Efecto de dos medios de cultivo líquidos sobre la oxidación promedio, callosidad y color de explantes de hojas en la etapa de establecimiento in vitro, de cuatro especies de la familia Asteraceae.

Otra alternativa al uso de medio sólido para el favorable desarrollo de los explantes

es probar inicialmente con medio líquido, para controlar el pardeamiento de tejidos

como en el cultivo de especies de Cattleya (ISHII, UEMOTO y FUJIEDA, 1979) y de

Pelargonium x hortorum (HILDEBRANDT y HARNEY, 1988), debido a las ventajas

de absorber nutrientes y evitar las impurezas del agar, siendo preferible en

explantes de ciertas especies de plantas que exudan sustancias tóxicas desde la

superficie cortada (HARTMANN y KESTER 1998).

Los explantes de hojas son cultivados sobre el mismo medio nutritivo base del

ensayo anterior, macro y micro nutrientes de WPM (LLOYD y MCCOWN, 1981),

vitaminas de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), PVPP, pero líquido (sin agar),

probando los medios uno y dos del tercer ensayo, en tubos de ensayo sobre un

108

soporte metálico en agitación constante, bajo las mismas condiciones ambientales

del ensayo anterior.

Este medio demostró tener un efecto distinto al medio sólido en todas las especies

sobre los pocos explantes usados, seis para las especies Dendroseris litoralis,

Robinsonia thurifera, y diez para Dendroseris neriifolia y Robinsonia gayana, por lo

tanto, los resultados serán analizados descriptivamente.

Los explantes de la especie Dendroseris litoralis, al igual que en medio sólido,

muestran formación de callos en ambos medios en la zona de corte del explante,

pero con la diferencia que lo hacen 15 días más tarde, en todos los cortes y en un

alto número por corte. Los valores de oxidación promedio de los explantes a los 30 y

60 días son similares al ensayo con medio sólido, al igual que la variación del color,

sin embargo, se prolongó por más tiempo el color cercano a la especie. Se debe

mencionar la similitud de la coloración amarilla leve a fuerte del medio líquido,

respecto al medio sólido, lo que puede indicar tanto la liberación de polifenoles por

los explantes como la presencia de bacterias.

Lo anterior es confirmado por la alta cantidad de sustratos naturales de

pardeamiento enzimático CHEFTEL y CHEFTEL (1992) que posee ésta y las demás

especies (SILVA, BITTNER y PACHECO, 1992), y que las sustancias excretadas

por el explante (compuestos fenólicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del

medio (MARGARA, 1988), inhibición de la actividad enzimática (DAMIANO,

CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991) y del crecimiento, acompañado de bronceado del

medio de cultivo y a veces por necrosis del explante.

109

Los explantes de la especie Dendroseris neriifolia, a diferencia del medio sólido, no

forman callos en la zona de corte y de unión de la nervadura con el medio, sino que

presentan un arrugamiento u ondulamiento homogéneo como reacción al medio, y

una oxidación promedio por explante mayor en ambos tratamientos, a los 60 días de

cultivo, sin la formación de callos. De igual forma, los explantes muestran

mayormente los colores café anaranjado (8/10 5 Y) y café plomizo (7/8 2.5 Y), que

representan tejidos muy oxidados, tempranamente a los 30 días de cultivo.

En Robinsonia gayana, al igual que en medio sólido, algunos explantes formaron

callos en la zona de corte perpendicular a la nervadura, con la diferencia de que el

medio líquido estimuló la elongación de algunos explantes y prolongó el color de la

especie en algunos explantes de forma heterogénea por más de un mes y medio.

Sin embargo, los explantes presentan una oxidación promedio mucho mayor que en

el medio sólido a los 30 días de cultivo. En un par de tubos, el medio líquido, a

diferencia del medio sólido, presenta una coloración anaranjada leve, lo que puede

indicar la liberación de polifenoles desde los explantes y la absorción de éstos por el

contenido de PVPP (polyvinylpolypyrrolidona), siendo descrito por PIERIK (1990)

como un polímero que adsorbe las sustancias de tipo fenólico. También, MACÍAS,

RODRÍGUEZ y CANALS (1998) describen su acción en base a la gran afinidad que

posee con los poilifenoles, gracias a su insolubilidad en el medio hidroalcohólico.

Además, su mecanismo de adsorción de los polifenoles se basa en la formación de

puentes de hidrógeno entre los grupos fenólicos y el oxígeno del grupo amida del

anillo pirrolidona del PVPP, arrastrando consigo los compuestos fenólicos que a él

se enlacen y, eliminándolos del medio.

El medio líquido a diferencia del medio sólido, en Robinsonia thurifera, retardó la

formación de tejido de callo, manifestando a los 60 días de cultivo un pequeño

engrosamiento, en los extremos de la nervadura, en algunos explantes. Al igual que

la especie anterior y a diferencia del medio sólido, también se presentó esta

110

coloración en un tubo, lo que puede indicar la liberación de polifenoles o de

bacterias endógenas al explante.

Ensayo 4: Efecto de dos medios de cultivo sólidos con carbón activo y PVPP sobre la oxidación, callosidad y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para cuatro especies de la familia Asteraceae.

Los explantes de hojas fueron colocados sobre un medio nutritivo base macro y

micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962), PVPP, carbón activado y agar.

Los explantes se desarrollaron bajo las mismas condiciones del ensayo dos,

menores temperaturas de la cámara de crecimiento y una baja exposición a la luz

durante el inicio del cultivo. PIEPER y ZIMMER (1976) afirman que estas

condiciones medioambientales in vitro han limitado efectivamente el pardeamiento

del medio en explantes de la orquídea Phalaenopsis al iniciar el cultivo en

oscuridad. Sin embargo, no se logró eliminar completamente, ni reducir, ni detener

por un largo período el efecto de pardeamiento, haciéndose presente

tempranamente la necrosis total de los explantes.

4.4.1. Género Dendroseris.

De igual modo que el ensayo dos, se utiliza la desinfección número tres (hipoclorito

de sodio al 1,5%), por tener un menor efecto sobre la oxidación de los explantes y

una baja contaminación de los mismos, en el ensayo del protocolo de desinfección.

Sin embargo, se debe tener presente que, a pesar de usar esta desinfección, está la

posibilidad de que surjan bacterias endógenas, como sucedió en el ensayo dos, lo

que es, en esta especie, otro gran problema durante su cultivo.

111

Se presentan a continuación (Cuadro 17) los resultados de sobrevivencia de los

explantes, para la especie Dendroseris litoralis, en tres períodos de cultivo.

CUADRO 17. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris litoralis, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Ambos medios de cultivo presentan diferencias (P≤0.05) entre ellos, a los 20 y 60

días de cultivo, siendo el medio número uno el mejor, a los 60 días, porque muestra

una mayor sobrevivencia de los explantes, debido a una menor contaminación por

bacterias, la principal causa de mortalidad, posiblemente se deba a un menor

contenido endógeno de éstas en esos explantes. Estas bacterias internas están a

menudo presentes en los cultivos, pero la infección puede no ser aparente hasta

después de varios subcultivos (DIRR y HEUSER, 1987) o más adelante del cultivo,

hasta que las condiciones de acidez y citoquininas en el medio se reduzcan

(HARTMANN y KESTER, 1998).

Aunque ambos tratamientos presentan una baja mortalidad de explantes hasta el

día 90, ya existe una muy alta oxidación de los explantes a los 30 días de cultivo, la

que incluso es mayor a la oxidación promedio en los explantes del ensayo dos, a los

60 días de cultivo (Cuadro 18). En el mismo cuadro, se presenta la variable

oxidación en la etapa de establecimiento in vitro.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20** Día 40 Día 60

T1: Medio 1 T2: Medio 2

76 b 80 a

68 a* 68 a

68 a 60 b

112

CUADRO 18. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris litoralis.

Oxidación promedio por explante

Tratamiento Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

3.96 a 4.52 b

4.68 a* 4.92 a

4.92 a* 5.08 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

En los medios número uno y dos los explantes presentan una similar oxidación

promedio, a los 60 y 90 días de cultivo, sin embargo no se observó formación de

tejido de callo, durante los tres periodos de evaluación, y, por lo tanto, no hubo

diferencias significativas (P≤0.05). Al igual que en otros ensayos, esto puede

deberse a la relación que existe entre la posición de los explantes y la luz que

reciben, con el pardeamiento de los tejidos (YU y MEREDITH, 1986;

CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975), por efecto de los contenidos fenólicos

preexistentes y la posterior sobrevivencia.

Al igual que el ensayo dos, el medio de cultivo presenta una tenue coloración

amarilla, debido al color negruzco del carbón activado, indicando posiblemente la

presencia de alguna contaminación por bacterias o generada por la liberación de

exudados de polifenoles por los explantes. Sin embargo, los efectos positivos y

negativos del carbón activo varían, dependiendo de la especie y de la edad del

material colectado. Un efecto favorable se tuvo en Sequoiadendron giganteum, con

la adición de 20 g/l al medio de cultivo y usando microestacas de clones juveniles en

crecimiento activo, las que presentaron un menor contenido de polifenoles en la

parte alta del explante durante la fase de elongación, cuya diferencia no fue

observada en clones maduros (BON, GENDRAUD y FRANCLET, 1988).

113

MARGARA (1988), en tanto, señala que el carbón activado favorece el crecimiento

de los tejidos, especialmente en el cultivo de ápices, sin embargo también existen

efectos negativos sobre algunos frutales, inhibiendo la formación de raíces o el

crecimiento, debido a la absorción de reguladores de crecimiento (auxinas,

citoquininas) contenidas en el medio, lo que es posiblemente la causa de la leve

reacción al medio, a diferencia del ensayo anterior.

Los resultados de la variable respuesta color, expresados en valores promedio

muestrales, durante tres períodos de cultivo en la etapa de establecimiento, se

observan en el Cuadro 19.

CUADRO 19. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris litoralis a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 5 b Día 30** T2: Medio 2 7 a*

T1: Medio 1 7 a Día 60 T2: Medio 2 7 a

T1: Medio 1 7 a Día 90 T2: Medio 2 7 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Se detectaron diferencias (P≤0.05) entre los medios de establecimiento, solo a los

30 días de cultivo de los explantes, observándose principalmente en el medio uno,

el color amarillo (8/10 5GY) y, en el medio dos, el color café claro (5/4 2.5 Y). Por lo

tanto, es posible inferir que el medio uno es mejor al representar un color promedio

más cercano al color verde propio de la especie (5/8 7.5 GY), que implicaría un

114

menor pardeamiento sobre los explantes, tal como se observa en el Cuadro 18. En

tanto que, a los 60 y 90 días de cultivo, se observó mayormente el color café claro

(5/4 2.5 Y), indicando la exudación de compuestos fenólicos.

Se presentan en el Cuadro 20 los resultados del porcentaje de explantes

sobrevivientes para la especie Dendroseris neriifolia, los que presentan diferencias

(P≤0.05) entre ambos medios de cultivo, solo después de 40 días, y que se prolonga

hasta los 60 días.

CUADRO 20. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Dendroseris neriifolia, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

De igual modo que en Dendroseris litoralis, los explantes en el medio número dos

muestran una mayor Tasa de sobrevivencia a los 40 días de cultivo, debido,

principalmente, a una menor incidencia de hongos, gracias a una mayor eficiencia

de la solución fungicida aplicada antes de la desinfección y, a la misma

desinfección, en relación a cantidad de surfactante y la adherencia o cubrimiento

superficial del mismo sobre los explantes, cuya efectividad varía en respuesta al

tiempo y dosis (HARTMANN y KESTER, 1998). Sin embargo, a los 80 días de

cultivo, el medio uno, presenta una mayor tasa de explantes sobrevivientes, debido

a la ausencia de bacterias endógenas.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20** Día 40 Día 60

T1: Medio 1 T2: Medio 2

88 a* 88 a

84 b 88 a

84 a 80 b

115

HARTMANN y KESTER (1998) dan mucha importancia al lugar de recolección del

material como al tipo de explante con que se trabaja para tener éxito en la

desinfección y cultivo in vitro. A pesar de esto y considerando que el lugar de

procedencia del material vegetal es el sombreadero del Laboratorio de Propagación,

la mortalidad de los explantes es baja y la aparición de bacterias es nula.

En la etapa de establecimiento in vitro se evidenciaron diferencias (P≤0.05) entre los

dos tratamientos, solamente en la variable oxidación. Los resultados de las variables

oxidación y callosidad promedio se presentan a continuación (Cuadro 21):

CUADRO 21. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Dendroseris neriifolia.

Oxidación por explante Tratamiento

Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

4.84 a* 4.36 a

5.52 b 5.12 a

5.68 b 5.4 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤ 0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

En el medio de cultivo número uno, los explantes presentan una mayor oxidación

promedio que el medio número dos, luego de dos y tres meses de cultivo; en tanto

que no se observa formación de tejido de callo, en ambos medios, durante los tres

meses de cultivo. Sin embargo y, al igual que en Dendroseris litoralis, los altos

valores promedios de oxidación en los explantes a los 60 días de cultivo superan en

casi un punto a aquellos para la misma especie en el ensayo anterior, a los 30 días

de cultivo. Es posible que el carbón activo sea la causa de esta alta oxidación, lo

que podría confirmar lo expuesto por PIERIK (1990), quien señala que el carbón

activo puede estabilizar el pH, pero también en algunos casos adsorber compuestos

116

orgánicos como auxinas, citoquininas, vitaminas, etc. (HARTMANN y KESTER,

1998), provocando un efecto inhibitorio como en este caso.

Lo anterior también puede haber sido favorecido con las sustancias excretadas por

el explante (compuestos fenólicos, taninos, etc.) como lo expone MARGARA (1988)

y DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991) las que producen oscurecimiento

del medio e inhibición del crecimiento, acompañado a veces por necrosis del

explante, al igual que en las especies anteriormente señaladas. Incluso, se realizó el

cambio a un medio renovado de aquellos explantes que no presentaban una

oxidación fuerte y homogénea a los 34 días de cultivo. Sin embargo, a los 10 días

de llevado a cabo el traspaso, los explantes se oxidaron completamente, sin llegar a

formar tejido de callo ni presentar organogénesis (Cuadro 21).

En el Cuadro 22, se presentan los resultados de coloración en los explantes durante

tres períodos de cultivo.

CUADRO 22. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Dendroseris neriifolia a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 5 a* Día 30** T2: Medio 2 5 a

T1: Medio 1 6 a Día 60 T2: Medio 2 6 a

T1: Medio 1 6 a Día 90 T2: Medio 2 6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

117

La variable respuesta color no evidenció diferencias (P≤0.05) entre los medios de

establecimiento, durante los tres períodos de cultivo, observándose preferentemente

el color café anaranjado (8/10 5Y) a los 30 días de cultivo y, el color café plomizo, a

los 60 y 90 días.

4.4.2. Género Robinsonia.

Los resultados de sobrevivencia para explantes de la especie Robinsonia gayana en

ambos medios de cultivo, se presentan a continuación (Cuadro 23), a los 20, 40 y 60

días de realizado el cultivo.

CUADRO 23. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia gayana, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤ 0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Ambos medios de cultivo presentan diferencias (P≤0.05), a los 20, 40 y 60 días de

cultivo, siendo el medio uno el mejor, porque obtiene una mayor sobrevivencia de

explantes por una menor contaminación por bacterias al inicio del cultivo, la principal

causa de mortalidad, posiblemente debido a un menor contenido exógeno y

endógeno de éstas en esos explantes, las que incluso pueden aparecer más

adelante (DIRR y HEUSER, 1987; HARTMANN y KESTER,1998). Sin embargo, en

esta especie no era evidente la aparición de éstas al inicio del cultivo, en los

ensayos anteriores.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 20** Día 40 Día 60

T1: Medio 1 T2: Medio 2

36 a 16 b

28 a 16 b

28 a 16 b

118

En la variable oxidación, se evidencian diferencias (P≤0.05) entre los dos medios de

cultivo, solo a los 30 días de cultivo; en cambio, hay diferencias en la formación de

callo, a los 60 y 90 días, en la etapa de establecimiento in vitro (Cuadro 24), siendo

mayor la callosidad en el medio dos, y, por ende, en contra de la organogénesis en

los explantes.

CUADRO 24. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia gayana.

Oxidación por explante

Formación de callo por explante

Tratamiento

Día 30** Día 60 Día 90 Día 30 Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

4.64 b 3.84 a

5.56 a* 5.44 a

5.72 a* 5.52 a

1.0 a* 1.0 a

1.24 a 1.76 b

1.56 a 2.0 b

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤ 0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

En ambos medios, los explantes presentan una alta oxidación promedio, debido a

las sustancias excretadas por el explante (compuestos fenólicos, taninos, etc.) como

lo expone MARGARA (1988) y DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI (1991), las

que producen oscurecimiento del medio e inhibición del crecimiento, acompañado a

veces por necrosis del explante, al igual que en las especies anteriormente

señaladas.

La oxidación se vio favorecida al no trapasar los explantes a un medio nuevo, como

lo recomienda BROOME y ZIMMERMAN (1978), hacerlo a los dos días de cultivo,

en Rubus ursinus Cham y Schlecht. Sin embargo, este periodo de tiempo no es lo

característico para las especies leñosas, siendo subcultivado Rhododendron spp. al

inicio cada 2 semanas, y, posteriormente, cada 6 u 8 semanas. A pesar de cambiar

a un medio renovado un explante, debido a que los demás presentaban una

119

oxidación fuerte y homogénea, a los 54 días de cultivo, se oxidó completamente a

los pocos días.

A diferencia del segundo ensayo, la oxidación promedio de los explantes es muy

alta al inicio del cultivo (30 días), y supera, en poco más de un punto, al promedio

obtenido a los 60 días. Esto sugiere que los factores nombrados quizás no son la

única causa de aquello, pudiendo ser también la época de cultivo, siendo mejor para

CHRISTIANSEN y FONNESBECH (1975), en Hamamelis, en el mes de julio

(Hemisferio Norte); o un efecto negativo del carbón activo al provocar un efecto

inhibitorio con la adsorción de auxinas, citoquininas y vitaminas (HARTMANN y

KESTER, 1998).

La acción individual o conjunta de estos factores en ambos medios, inhibe la

reacción del explante al medio de cultivo, viéndose reflejado en la formación de

callos pequeños en el sector de corte del explante, perpendicular a la nervadura del

mismo, que es mayor en el medio dos a los 60 y 90 días de cultivo. La oxidación

sobre los explantes no pudo ser controlada, lo que provocó una necrosis total y

homogénea de forma muy acelerada, en 60 días de cultivo.

Se presentan, a continuación (Cuadro 25), los resultados de los registros de color en

los explantes, expresados en valores promedio muestrales, de tres períodos de

cultivo.

120

CUADRO 25. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia gayana a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 5 b Día 30** T2: Medio 2 3 a*

T1: Medio 1 6 a Día 60 T2: Medio 2 6 a

T1: Medio 1 7 a Día 90 T2: Medio 2 7 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

De igual modo que en Dendroseris litoralis, solo se encontró diferencias (P≤0.05) a

los 30 días de cultivo, presentándose en el medio uno, en mayor cantidad, el color

verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR) y, en el medio dos, mayormente el color verde

claro (5/8 5GY), demostrando ser mejor al representar un color de explante más

cercano al color verde propio de la especie (5/6 7.5 GY), lo que podría indicar un

menor grado de oxidación. Esto queda demostrado en los resultados de la variable

oxidación (Cuadro 24). En tanto, a los 60 y 90 días de cultivo, se observaron los

colores café oscuro (4/2 7.5 YR) y café muy oscuro (3/2 YR), respectivamente.

El Cuadro 26 presenta los resultados de sobrevivencia en explantes de Robinsonia

thurifera, en ambos medios de establecimiento, de tres períodos de cultivo.

121

CUADRO 26. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Robinsonia thurifera, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤ 0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Los resultados evidencian diferencias (P≤0.05) entre los dos medios, a los 30, 60 y

90 días de cultivo, siendo mejor el medio número uno, desde los 60 hasta los 90

días, por obtener un mayor porcentaje de explantes sobrevivientes, gracias a una

menor contaminación de bacterias al inicio del cultivo, durante los primeros 15 días,

de igual forma que en Robinsonia gayana, las que se encontraban en menor

cantidad endógena en esos explantes.

Por esto es importante partir con un material óptimo, libre de enfermedades

sistémicas producidas por bacterias, virus, micoplasmas y rickettsias, comenzando

con una selección adecuada, en terreno, del explante (HARTMANN y KESTER,

1998; GARCIA y NOA, 1998).

Se presentan los resultados de las variables oxidación y callosidad promedio por

explante para la especie Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 días de cultivo

(Cuadro 27).

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 30** Día 60 Día 90

T1: Medio 1 T2: Medio 2

44 b 48 a

40 a 28 b

40 a 24 b

122

CUADRO 27. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación y formación de callo en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia thurifera.

Oxidación por explante

Formación de callo por explante

Tratamiento

Día 30** Día 60 Día 90 Día 30 Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

4.40 a* 5.08 a

5.8 a* 5.88 a

5.92 a* 6.0 a

1.44 b 1.12 a

2.0 b 1.24 a

2.0 b 1.76 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

No se evidenciaron diferencias (P≤0.05) entre los explantes de ambos medios, en la

variable oxidación, desde el inicio hasta los 90 días de cultivo, pero sí en la variable

callosidad, donde el medio número uno fue mejor, pues formó una mayor cantidad

promedio de tejido de callo por explante.

Al igual que en Robinsonia gayana, en ambos medios de establecimiento los

explantes presentan una extremadamente alta oxidación promedio a 30 días de

cultivo, incluso mayor, superando en casi un punto al promedio obtenido a los 60

días. Esto es en parte debido a que las sustancias excretadas por el explante

(compuestos fenólicos, taninos, etc.) producen oscurecimiento del medio e inhibición

del crecimiento e incluso necrosis del explante (MARGARA, 1988; DAMIANO,

CHIAROTTI y ANTONELLI, 1991).

La oxidación en esta especie también se vio favorecida al no traspasar los explantes

a un medio renovado hasta los 34 días de cultivo, siendo muy tarde para lo que

recomienda BROOME y ZIMMERMAN (1978) en Rubus ursinus Cham y Schlecht.,

a los dos días de cultivo. Sin embargo, normalmente en otras especies leñosas los

explantes son cambiados a un medio renovado al cabo de 30 días de cultivo, como

sucede en Rhododendron spp., donde los primeros subcultivos se realizan cada dos

123

semanas, pero posteriormente se hacen cada 6 u 8 semanas (ANDERSON, 1975;

KYTE y BRIGGS, 1979). Estas transferencias se realizan para contrarrestar el

efecto y evitar, según YEOMAN y MACLEOD (1977), un irremediable debilitamiento,

intoxicación y muerte. Esto también puede ser confirmado con lo expuesto por

McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la desventaja que posee el

hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos vivos al entrar en

contacto durante los enjuagues. A pesar de la transferencia a un medio nuevo, a los

pocos días de realizar el cambio, los explantes se oxidaron fuerte y

homogéneamente, lo que indica que alguno de los constituyentes del medio de

cultivo, posiblemente el carbón activado, afectó fuertemente la sobrevivencia de los

explantes.

Esto también sugiere que los factores nombrados no son los únicos causantes de

los altos valores de oxidación a los 30 días de cultivo, pudiendo ser en este caso

también la época de cultivo, siendo mejor para CHRISTIANSEN y FONNESBECH

(1975) en Hamamelis el mes de julio (Hemisferio Norte); o un efecto negativo del

carbón activo, al provocar un efecto inhibitorio con la adsorción de auxinas,

citoquininas y vitaminas (HARTMANN y KESTER, 1998).

Al igual que en la otra especie del género, se inhibe la reacción del explante al

medio de cultivo, con la escasa cantidad y pequeña formación de callos en el sector

de corte del explante, perpendicular a la nervadura del mismo y nula organogénesis.

Sin embargo, existe una mayor formación de callos en el medio uno, debido a la

estrecha relación de las concentraciones entre ambas hormonas, lo que es

corroborado por CHISTIANSON y WARNICK (1983), HARTMANN y KESTER

(1998), quienes afirman que la formación de callo se debe a la alta concentración de

auxinas y baja dosis de citoquininas en el medio de cultivo. Se debe considerar que

mejor es que no haya formación de callo, en el sentido de favorecer la

organogénesis, pero, en cuanto a respuesta, podría considerarse algo negativo.

124

Producto de una oxidación homogénea fuerte, los explantes se necrosaron y

murieron rápidamente, luego de 60 días de cultivo.

Los resultados del color de los explantes de Robinsonia thurifera, luego de 90 días

de cultivo se presentan a continuación (Cuadro 28).

CUADRO 28. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los

explantes de Robinsonia thurifera a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 3 a* Día 30** T2: Medio 2 4 b

T1: Medio 1 5 a Día 60 T2: Medio 2 6 a

T1: Medio 1 6 a Día 90 T2: Medio 2 6 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Se obtienen diferencias (P≤0.05) a los 30 y 60 días de cultivo, entre los dos medios

de establecimiento. A los 30 días, el color verde claro (5/10 5GY) fue el más

representativo en el medio uno; y en el medio dos, el color verde oscuro opaco (4/4

7.5 YR). A los 60 días, en el medio uno, el color más sobresaliente fue el café claro

(5/6 2.5 Y), en tanto que en el medio dos, es el color café muy oscuro (3/2 5YR). De

esto, se desprende que el medio uno es mejor hasta los 60 días de cultivo, al

representar colores equivalentes a un menor distanciamiento del color propio de la

especie (4/6 5GY), que representa un menor pardeamiento sobre los explantes. Sin

embargo, a los 90 días de cultivo, en ambos tratamientos se observa mayormente el

color café muy oscuro (3/2 5 YR).

125

Se desprende de los resultados que los explantes de las cuatro Asteráceas

reaccionaron de forma tardía a los medios, generando una menor y peor respuesta

que en el ensayo dos, casi todos ellos evidenciando un rápido pardeamiento al inicio

del cultivo y, por consiguiente, una muerte más acelerada, y donde solo algunos

explantes formaron callos muy pequeños, principalmente, en la zona de corte.

Además, se pudo constatar de una alta incidencia de bacterias, no solo como

sucedió en el género Dendroseris, del segundo ensayo, sino que también el género

Robinsonia es susceptible a ellas.

La razón de la diferencia en los resultados existentes entre este ensayo y el ensayo

dos, que deberían haber sido positivos y mejores en cuanto a contrarrestar los

efectos de pardeamiento por más tiempo, no lo fueron, porque quizás la inclusión de

carbón activado tuvo un efecto negativo para estas especies.

Ensayo 5: Efecto de dos medios de cultivo sólidos sobre la oxidación y color de explantes de hoja en la etapa de establecimiento in vitro para Robinsonia thurifera, familia Asteraceae.

Los explantes de hojas fueron colocados sobre un medio nutritivo base macro y

micro nutrientes de WPM (LLOYD y McCOWN, 1981), vitaminas de MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962), ácido ascórbico, carbón activado, ANA y BAP

como reguladores de crecimiento y agar.

Los explantes se desarrollaron en una cámara de crecimiento con temperaturas de

23±2ºC y en oscuridad durante una semana, exponiéndolos gradualmente a la luz,

en los días siguientes de cultivo. PIEPER y ZIMMER (1976), afirman que estas

condiciones medioambientales in vitro han limitado efectivamente el pardeamiento

del medio en explantes de la orquídea Phalaenopsis al iniciar el cultivo en

126

oscuridad. Sin embargo, no se logró eliminar completamente, ni reducir, ni detener

por un largo período el efecto de pardeamiento, haciéndose presente

tempranamente la necrosis total de los explantes.

El Cuadro 29 presenta los resultados de sobrevivencia, en porcentaje de explantes

sobrevivientes para la especie Robinsonia thurifera, en ambos tratamientos, a los 30

días de cultivo.

CUADRO 29. Efecto de dos medios de cultivo y un origen de explante sobre el porcentaje de explantes sobrevivientes y la oxidación promedio por explante, en la etapa de establecimiento in vitro de Robinsonia thurifera, a los 30 días de cultivo.

Tratamiento Porcentaje de sobrevivencia de

explantes (%) Oxidación por explante

T1: Medio 1 T2: Medio 2

65 a 60 b

4.9 a* 4.65 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05).

Los resultados evidencian diferencias (P≤0.05) entre los dos medios, a los 30 días

de cultivo, en el porcentaje de explantes sobrevivientes, no siendo así en la variable

oxidación. El medio uno resulta ser mejor, al presentar la mayor tasa de explantes

sobrevivientes, siendo las bacterias la causa principal de la mortalidad. Sin

embargo, la sobreviviencia es mayor que el ensayo 4, para la misma especie,

posiblemente debido a que contiene exógena y endógenamente una menor

presencia de éstas en esos explantes, las que incluso pueden aparecer en un

período más avanzado del cultivo (DIRR y HEUSER, 1987; HARTMANN y KESTER,

1998).

127

Es por esto que, es importante partir con un material óptimo, libre de enfermedades

sistémicas producidas por bacterias, virus, micoplasmas y rickettsias, comenzando

con una selección adecuada en terreno del explante (HARTMANN y KESTER, 1998;

GARCIA y NOA, 1998). Sin embargo, lo anterior no fue posible de realizar y, sería

factible incluir antibióticos en el medio de cultivo, tales como amoxicilina, agramicina

(OYANEDEL, 1995) o penicilina, terramicina, estreptomicina, de gran utilidad para el

control del desarrollo de bacterias, incluso, con efectos estimuladores sobre el

crecimiento (HARTMANN y KESTER, 1998).

Es importante destacar la similitud de los valores de oxidación, con respecto al

ensayo 4, para la misma especie, pero al mismo periodo (30 días) no hay formación

de tejido de callo. Sin embargo, la oxidación fue menor durante los primeros 7 días

de cultivo, en que estaban en oscuridad, por lo tanto, sería una buena alternativa,

prolongar el número de días bajo esta condición o quizás traspasarlos a ese tiempo

a un medio renovado, pero sin carbón activo. Se presentan a continuación (Cuadro

30) los resultados de la variable respuesta color, a los 30 días de cultivo.

CUADRO 30. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de Robinsonia thurifera a los 30 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 5 b Día 30** T2: Medio 2 4 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

A los 30 días de cultivo, se evidencian diferencias (P≤0.05) entre los explantes de

los dos tratamientos, observándose principalmente el color café claro (5/6 2.5 Y) en

el medio uno y, el color verde oscuro opaco (4/4 7.5 YR) en el medio dos, a

diferencia del ensayo 4, es mejor el medio dos, al presentar un color promedio

128

equivalente a una mayor cercanía del color propio de la especie (4/6 5GY), el cual

debería representar una menor oxidación de los explantes. No obstante, esto no se

cumple en los resultados de la variable oxidación (Cuadro 29).

Se desprende de los resultados que, los explantes reaccionaron levemente al medio

de cultivo, solo durante los primeros 15 días, con una muy leve oxidación en la zona

del corte y doblando los bordes paralelos a la nervadura hacia el agar, pero,

después de este período, los explantes comenzaron a oxidarse rápida y

homogéneamente, sin llegar a formar algún tejido u órgano.

Ensayo 6: Efecto de cuatro protocolos de desinfección sobre los explantes de hojas en la especie Ochagavia elegans, familia Bromeliaceae.

Los explantes de hojas fueron colocados sobre un medio nutritivo base MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962) cero, en el que sobrevivieron durante dos meses y

medio sin generar respuesta alguna a éste, hasta que la oxidación produjo una

completa necrosis de ellos.

Se presentan, en el Cuadro 31, los resultados de los registros de sobrevivencia de

los explantes, a los 30, 60 y 90 días de cultivo para la especie Ochagavia elegans.

129

CUADRO 31. Efecto de cuatro protocolos de desinfección sobre la tasa de sobrevivencia y la oxidación de explantes de hoja en Ochagavia elegans R. A. Phill.

Sobrevivencia de explantes (%) Oxidación por explante Tratamiento

Día 30** Día 60 Día 90 Día 75 T1: Desinfección 1 T2: Desinfección 2 T3: Desinfección 3 T4: Desinfección 4

52 c 60 b 80 a 36 d

52 c 56 b 64 a 24 d

44 c 56 b 64 a 20 d

2 a* 2.2 a 2.48 b 3 c

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

El porcentaje de explantes sobrevivientes presenta a los 30, 60 y 90 días de cultivo,

diferencias (P≤0.05) entre las desinfecciones, siendo la número tres la mejor,

porque presenta la menor contaminación por hongos y bacterias, y, en la cual, los

hongos fueron la principal causa de mortalidad. Estas diferencias, pueden ser

debido al mayor efecto de la dosis de desinfectante utilizada, al contener la mayor

concentración de hipoclorito de sodio (1.5%) sin la aplicación previa de etanol.

Aunque la desinfección número tres presenta una baja mortalidad hasta el día 90,

presenta una alta oxidación de los explantes, confirmando también al igual que en

las otras especies descritas, lo expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) con

respecto a la desventaja que posee el hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones

en los tejidos vivos al entrar en contacto durante los enjuagues.

Cabe señalar que, a pesar de que estos explantes (hojas), se encuentran más

expuestos a los patógenos, presentan una mayor tasa de sobrevivencia que en el

cultivo de trozos de hojas (provistos de yemas en la base) en Puya chilensis

(12,5%), donde CAMPOS (1995) utiliza una desinfección más leve (hipoclorito de

130

sodio al 1% durante tres minutos), debido a que es un explante más protegido del

ambiente al estar cubierto por las escamas foliares (MARGARA, 1988).

La variable oxidación (Cuadro 31) evidencia diferencias (P≤0.05), a los 75 días de

cultivo. En la desinfección número uno, los explantes presentan a los 75 días de

cultivo una menor oxidación promedio, que no es diferente, estadísticamente, de la

desinfección número dos, pero sí de la número tres y cuatro. Esta diferencia puede

ser debida al menor porcentaje de hipoclorito de sodio (1%), lo que provoca una

reducción del efecto negativo (oxidación) de esta solución sobre los tejidos

(McCLELLAND y SMITH, 1993), y/o a la fuerte relación entre el fenómeno de

pardeamiento de puntas de brotes como explantes y el origen del explante, por

efecto de los contenidos fenólicos preexistentes y la posterior sobrevivencia,

detectada por YU y MEREDITH (1986), también señalado en la familia Asteraceae.

CAMPOS (1995) en Puya chilensis no señala la presencia de pardeamiento en los

explantes, a pesar del uso de ácido cítrico en el medio de cultivo. En tanto que

Ochagavia elegans presenta una oxidación leve de los explantes en la zona de

corte, a los dos días de cultivo.

Los explantes no formaron tejido de callo ni órgano alguno en el medio utilizado

para las desinfecciones, lo que puede deberse, al igual que en las especies de la

familia Asteraceae, a la falta de compuestos orgánicos en el medio de cultivo, como

vitaminas y reguladores del crecimiento. MURASHIGE (1977) afirma que en la

mayoría de las plantas propagadas in vitro, el éxito depende tanto de la selección

del explante adecuado como la composición del medio.

131

Como consecuencia de lo anterior, los explantes presentaron necrosis a los 75 días

de cultivo, al no ser cambiados a un medio renovado. Esto corrobora la importancia

que YEOMAN y MACLEOD (1977) dan a tener que transferir el tejido callo a un

medio renovado con una frecuencia de dos a seis semanas para evitar un

irremediable debilitamiento, intoxicación y muerte.

Además, la oxidación de compuestos fenólicos liberados por un rompimiento celular

debido a lesiones, es una de las serias causas de pérdida al inicio de

establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989).

Ensayo 7: Efecto de dos medios de cultivo sobre la oxidación promedio y color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, en Ochagavia elegans.

Los explantes de hojas, yemas y tallos fueron colocados sobre un medio nutritivo

base macro y micro nutrientes de RM (REINERT y MOHR, 1967), vitaminas de RM,

suplementado con ANA y Kinetina como reguladores del crecimiento, probando dos

proporciones distintas de estos grupos de hormonas.

Se utilizan como explantes secciones de hojas del sector basal (maduras) y de

mayor tamaño para el cultivo, yemas apicales y basales con secciones de tallo y

trozos de tallo sin yemas. Debido a la escasez de explantes disponibles por planta,

se usan 9 explantes de yemas y 8 explantes de tallo.

132

4.7.1. Explantes de hojas

Se utilizan principalmente secciones de hojas externas (mayor edad) o de mayor

tamaño para el cultivo y 10 explantes por tratamiento, cuyos resultados de los

registros de sobrevivencia de tres períodos de cultivo se presentan a continuación

(Cuadro 32).

CUADRO 32. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

El alto porcentaje de explantes sobrevivientes a los 90 días de cultivo, presenta

diferencias (P≤0.05) entre los medios, siendo mejor el medio número dos por no

evidenciar contaminación por hongos, la principal causa de mortalidad. Esto puede

ser debido a una mayor eficiencia de la solución fungicida aplicada antes de la

desinfección en cuanto a homogeneidad y, a la misma desinfección, en relación a

cantidad de surfactante y la adherencia o cubrimiento superficial del mismo, sobre

los explantes, cuya efectividad varía en respuesta al tiempo y dosis (HARTMANN y

KESTER, 1998).

Por otra parte, la variable oxidación no evidenció diferencias (P≤0.05), luego de tres

meses de cultivo, entre los dos medios (Cuadro 33).

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 30** Día 60 Día 90

T1: Medio 1 T2: Medio 2

90 b 100 a

90 b 100 a

90 b 100 a

133

CUADRO 33. Efecto de dos medios de cultivo y un origen de explante sobre la oxidación, en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans.

Oxidación promedio por explante Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

2.8 a* 3.5 a

2.8 a* 3.5 a

3.1 a* 3.7 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

A pesar de no existir diferencias significativas (P≤0.05) entre los medios en esta

variable, sigue siendo la más importante, señalándose que la oxidación de

compuestos fenólicos liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es

una de las serias causas de pérdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS

y SIMPSON, 1989), por inhibición y muerte de los explantes en un amplio rango de

especies (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

Durante el período de cultivo, no hubo organogénesis ni formación de algún tejido,

lo que puede ser porque el medio no era el adecuado, provocando la muerte de los

explantes por efecto del pardeamiento y agotamiento del medio, al no ser

transferidos a un medio renovado, como señalan YEOMAN y MACLEOD (1977), la

importancia de transferir el tejido de callo a un medio renovado con una frecuencia

de dos a seis semanas para evitar un irremediable debilitamiento, intoxicación y

muerte. Esto también es confirmado por MURASHIGE (1977) para la mayoría de las

plantas propagadas in vitro, donde el éxito depende tanto de la selección del

explante adecuado como la composición del medio, siendo importantes también la

edad, el estatus de agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE

GROOT, 1985).

134

Se analizan a continuación los resultados obtenidos de los registros de la variable

color, durante tres momentos de cultivo (Cuadro 34).

CUADRO 34. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de hojas en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 3 a* Día 30** T2: Medio 2 2 a

T1: Medio 1 3 a Día 60 T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 4 a Día 90 T2: Medio 2 5 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

No se detectaron diferencias (P≤0.05) entre los distintos medios de establecimiento,

durante tres períodos de cultivo, 30, 60 y 90 días. Se observó a los 30 días,

principalmente en el medio uno, el color verde claro (7/10 5 GY) y, el color verde

oscuro propio de la especie (4/4 7.5 GY) en el medio dos. A los 60 días, ambos

medios presentaron mayormente el color verde claro (7/10 5 GY). Sin embargo, a

los 90 días, el color verde amarillo (7/8 2.5 GY) en el medio uno y, el color verde

pardeado (5/4 2.5 GY) en el medio dos, son los más representativos.

4.7.2. Explantes de yemas

Las yemas apicales se desinfectan con hipoclorito de sodio al 0,5%, durante 10

minutos y, las basales, con hipoclorito de sodio al 1,5%, durante 10 minutos.

135

Los resultados del porcentaje de sobrevivencia de dos orígenes de explantes

durante tres períodos de cultivo, se presentan en el Cuadro 35.

CUADRO 35. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Ochagavia

elegans, según el origen del explante y el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

No se evidenciaron diferencias estadísticas significativas, según el Test de Tukey

(P≤0,05), a los 90 días de cultivo, entre ambos medios de establecimiento, en

yemas de la base de la planta, al contrario de lo que sucedió en yemas apicales,

donde sí se encontraron diferencias significativas, siendo mejor el medio número

dos por presentar una menor contaminación por hongos y bacterias, los primeros

son la principal causa de mortalidad de los explantes. Esta diferencia puede ser

porque las yemas de la base son de mayor tamaño que las del ápice de la planta y

se encuentran más expuestas al ambiente; a pesar de las diferentes dosis

empleadas en la desinfección.

La desinfección es uno de los puntos más importantes para el éxito del cultivo in

vitro, sobre todo si se trabaja con material proveniente de sitios en donde no se

hacen desinfecciones (HARTMANN y KESTER, 1998), y no se utilizan como

explante tejidos bien protegidos (meristemas) o ápices de tallo cubiertos por las

escamas foliares (MARGARA, 1988), como es en este caso, en que el material se

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%)

YEMAS APICALES YEMAS BASALES Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 Día 30 Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

50 b 80 a

40 b 70 a

40 b 60 a

20 b 10 a

10 b 0 a

0 a* 0 a

136

encontraba en el sombreadero del Laboratorio de Propagación, y, por ésto, más

susceptible a la penetración de patógenos en tejidos meristemáticos.

Se presentan en el siguiente cuadro (Cuadro 36) los resultados de oxidación de dos

orígenes de explante a los 30, 60 y 90 días de cultivo.

CUADRO 36. Efecto de dos medios de establecimiento y dos orígenes de explante sobre la oxidación en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans.

Oxidación promedio por explante

YEMAS APICALES YEMAS BASALES Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 Día 30 Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

4.7 a 4.8 b

4.8 a* 4.8 a

5 a* 5 a

4.5 a* 4.5 a

4.7 a* 4.7 a

5 a* 5 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

En la variable oxidación, los explantes de ambos medios de cultivo no evidenciaron

diferencias (P≤0.05), a los dos y tres meses de cultivo, para los dos orígenes de

explantes. Este factor es también uno de los más importantes para el desarrollo de

esta especie, ya que no pudo ser controlado, observándose altos valores de

oxidación promedio, alcanzados en todos los explantes, incluso mayores que en

explantes de hojas, señalándose que la oxidación de compuestos fenólicos

liberados por un rompimiento celular debido a lesiones, es una de las serias causas

de pérdida al inicio de establecimiento del cultivo (MARKS y SIMPSON, 1989), por

inhibición y muerte de los explantes en un amplio rango de especies

(CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975). Los explantes están completamente

oxidados a los 90 días de cultivo.

137

No se observó desarrollo de las yemas ni formación de algún tejido, lo que puede

ser a causa de la alta oxidación de los explantes o quizás porque el medio no era el

adecuado, provocando la muerte de los explantes por efecto del pardeamiento y

agotamiento del medio, al no ser transferidos a un medio renovado. Esto lo confirma

MURASHIGE (1977) al señalar que el éxito del cultivo in vitro depende tanto de la

selección del explante adecuado como de la composición del medio.

CAMPOS (1995), durante la desinfección y etapa de establecimiento, reporta que no

hay pardeamiento sobre los explantes de Puya chilensis, sin embargo, utiliza una

desinfección más leve (hipoclorito de sodio al 1% por 3 minutos, pero obteniendo

una bajo porcentaje de sobrevivencia de éstos (33%), sin hacer distinción en la

posición de los explantes.

Se presentan, en los Cuadros 37 y 38, los resultados de la variable color,

registrados en tres períodos de cultivo, para yemas apicales y yemas basales,

respectivamente.

CUADRO 37. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de yemas apicales en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 3 a* Día 30** T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 3 a Día 60 T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 3 a Día 90 T2: Medio 2 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

138

No se evidenciaron diferencias (P≤0.05), entre los dos medios de establecimiento,

durante los tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90 días, observando en todos ellos,

mayormente el color café oscuro (4/2 7.5 YR), el cual representa una alta oxidación

sobre los explantes, quedando demostrado en los resultados de oxidación (Cuadro

36).

CUADRO 38. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de yemas basales en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 2 a* Día 30** T2: Medio 2 2 a

T1: Medio 1 2 a Día 60 T2: Medio 2 2 a

T1: Medio 1 3 a Día 90 T2: Medio 2 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Al igual que en yemas apicales, durante los tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90

días, no se encontraron diferencias (P≤0.05), entre los dos medios de

establecimiento, observando a los 30 y 60 días, mayormente el color café claro (6/6

2.5 Y), mientras que a los 90 días, el color más representativo es el café oscuro (4/2

7.5 YR). Estos colores implican una oxidación de las yemas basales, más leve que

en yemas apicales, sin embargo, la pérdida total del color propio de la especie

sucede tempranamente, a los 30 días de cultivo.

139

4.7.3. Explantes de tallo

Se utilizaron como explantes trozos de tallo con secciones de raíces y sin yemas

laterales. El cuadro siguiente (Cuadro 39) presenta los resultados de explantes

sobrevivientes, en ambos medios de cultivo, durante tres períodos de cultivo.

CUADRO 39. Porcentaje de explantes sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, según el medio de cultivo.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

50 b 60 a

50 a* 50 a

50 a* 50 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

El porcentaje de explantes sobrevivientes a los 60 y 90 días de cultivo no presenta

diferencias (P≤0.05), entre los medios de establecimiento. En comparación con los

otros dos tipos de explantes, la sobrevivencia es mucho menor que en explantes de

hojas, y similar a explantes de yemas.

La variable oxidación tampoco evidencia diferencias (P≤0.05), durante tres meses

de cultivo, entre los dos medios de establecimiento (Cuadro 40).

140

CUADRO 40. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans.

Oxidación promedio por explante Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

1.8 a* 2.8 a

1.8 a* 2.8 a

1.8 a* 2.8 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Se presentan bajos niveles de oxidación, a diferencia de los restantes tipos de

explantes (hojas y yemas). Sin embargo, durante el período de cultivo no hay

organogénesis, ni tampoco formación de algún tejido, lo que puede ser porque la

concentración de los grupos hormonales auxinas-citoquininas o la elección del tipo

de medio (líquido o sólido), no provoque la reacción de los explantes; es decir, no

son adecuados. Es el caso del cultivo de Cattleya por REINERT y MOHR (1967) en

medio sólido, en donde las secciones de tejido meristemático provenientes de

yemas laterales como explantes, se tornan de color café negruzco durante las

primeras tres semanas de desarrollo y posteriormente mueren. Sin embargo, en un

medio líquido el crecimiento y desarrollo de los explantes es satisfactorio. También

en Cryptanthus sinuosus L.B. Smith, una Bromeliácea de Brasil, en peligro de

extinción, resulta ser eficiente su propagación en un medio liquido MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962), sin reguladores de crecimiento, usando como

explantes secciones de tallo-raíz.

Los resultados del color de los explantes de tallo en Ochagavia elegans, luego de 90

días de cultivo, se presentan a continuación (Cuadro 41).

141

CUADRO 41. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de tallo en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 2 a* Día 30** T2: Medio 2 2 a

T1: Medio 1 2 a Día 60 T2: Medio 2 2 a

T1: Medio 1 2 a Día 90 T2: Medio 2 2 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Al igual que en los explantes de hojas y yemas, durante los tres periodos de cultivo,

30, 60 y 90 días, no se encontraron diferencias (P≤0.05), entre los dos medios de

establecimiento, observándose mayormente el color café claro (6/6 2.5 Y).

Ensayo 8: Efecto de dos medios de cultivo con carbón activo sobre la oxidación promedio y el color de tres tipos de explantes en la etapa de establecimiento in vitro, para Ochagavia elegans.

Los explantes de hojas, yemas y tallos fueron colocados sobre un medio nutritivo

base macro y micro nutrientes de MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962), vitaminas de

MS, ANA y Kinetina como reguladores del crecimiento en dos distintas proporciones

y carbón activo.

142

4.8.1. Explantes de hojas

Se utilizaron como explantes secciones de hojas del sector medio y apical para el

cultivo. Los resultados de los registros de sobrevivencia de explantes, de tres

períodos de cultivo se presentan a continuación (Cuadro 42).

CUADRO 42. Porcentaje de explantes de hojas sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

El alto porcentaje de explantes sobrevivientes a los 30, 60 y 90 días de cultivo

presenta diferencias (P≤0.05) entre los medios, siendo mejor el medio número dos,

al presentar una sobrevivencia total y mayor, debido posiblemente a una nula

incidencia de bacterias, la única causa de mortalidad en el medio número uno y

también quizás a la alta eficiencia de la desinfección en tiempo y dosis, factores que

HARTMANN y KESTER (1998) consideran importantes para la efectividad del

surfactante en la desinfección del explante, debiendo considerar también que la

capacidad para dañar tejidos también crece.

Los resultados de la variable oxidación durante tres períodos de cultivo para los

explantes en dos medios de establecimiento, se expresan en el Cuadro 43, donde

no se evidencian diferencias (P≤0.05), luego de tres meses de cultivo, para ambos

medios.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 30** Día 60 Día 90

T1: Medio 1 T2: Medio 2

90 b 100 a

90 b 100 a

90 b 100 a

143

CUADRO 43. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans.

Oxidación promedio por explante Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

2.7 a* 2.65 a

2.9 a* 2.75 a

3.1 a* 3.05 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Sin embargo, existe una alta oxidación de los explantes en la zona del corte

(transversal a la dirección de la hoja) aunque menor que en el ensayo anterior, pero

que va en aumento con el tiempo de cultivo. Este efecto oxidativo se favorece con la

permanencia del explante en el mismo medio, ya que normalmente en otras

especies leñosas los explantes son cambiados a un medio renovado al cabo de 30

días de cultivo, como sucede en Rhododendron spp., donde los primeros

subcultivos se realizan cada dos semanas, pero posteriormente se hacen cada 6 a 8

semanas (ANDERSON, 1975; KYTE y BRIGGS, 1979). Estas transferencias se

realizan para contrarrestar el efecto y evitar, según YEOMAN y MACLEOD (1977),

un irremediable debilitamiento, intoxicación y muerte. Esto también puede ser

confirmando con lo expuesto por McCLELLAND y SMITH (1993) con respecto a la

desventaja que posee el hipoclorito de sodio, de producir oxidaciones en los tejidos

vivos al entrar en contacto.

Esta oxidación en la zona del corte del explante es producida según MARKS y

SIMPSON (1989) por una oxidación de compuestos fenólicos liberados (MARGARA,

1988; DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI; 1991) por un rompimiento celular

debido a lesiones, siendo una de las serias causas de pérdida al inicio de

establecimiento del cultivo, por inhibición y muerte de los explantes

(CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975). No se han realizado estudios

anteriormente con respecto a la composición química de la especie, pero es posible

144

que esta especie suculenta, contenga químicamente una cierta cantidad de

sustratos fenólicos similares a los detectados en las Asteráceas.

Los menores valores de oxidación promedio con respecto al ensayo anterior pueden

estar relacionados con la inclusión de carbón activo en el medio de cultivo, siendo

corroborado por HARTMANN y KESTER (1998) quienes señalan que este reactivo

contrarresta el efecto de ciertas sustancias inhibitorias liberadas por algunos tejidos

(en este caso de los compuestos fenólicos) o la adsorción de pigmentos tóxicos,

marrones y negros (compuestos de tipo fenólico y melanina), y de otros compuestos

tóxicos incoloros (PIERIK, 1990). Al igual que para las especies de la familia

Asteraceae, es la variable más importante para el éxito de la propagación in vitro de

esta especie.

En los explantes de ambos medios no se observa organogénesis ni formación de

tejido de callo, lo que puede deberse, al igual que en las restantes Asteráceas, a la

selección inadecuada del medio de cultivo, considerado junto con la selección del

explante adecuado, los factores más importantes en éxito de la propagación in vitro

(MURASHIGE, 1977), pero, sin dejar de considerar también, la edad, el estatus de

agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985).

Se analizan a continuación los resultados obtenidos de los registros de la variable

color, en tres períodos de cultivo (Cuadro 44).

145

CUADRO 44. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de hojas en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 3 a* Día 30** T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 3 a Día 60 T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 3 a Día 90 T2: Medio 2 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Los resultados no demuestran diferencias (P≤0.05) entre ambos medios de

establecimiento, a los 30, 60 y 90 días de cultivo, observándose con mayor

predominancia el color verde oscuro pardeado (5/8 5 GY).

4.8.2. Explantes de yemas

Debido a la baja cantidad de este tipo de explantes disponibles por planta, solo fue

posible disponer de un bajo número de explantes (6) o repeticiones para ser

analizados estadísticamente por cada tratamiento. En este caso, se trabaja con

todas las yemas posibles del tallo, sin hacer distinción en la ubicación de ellas.

Los resultados de los registros de sobrevivencia, expresados en porcentaje de

explantes sobrevivientes, durante tres periodos de cultivo, 30, 60 y 90 días, se

presentan a continuación (Cuadro 45).

146

CUADRO 45. Porcentaje de explantes de yemas sobrevivientes en la especie Ochagavia elegans, según el medio de cultivo.

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

El alto porcentaje de explantes sobrevivientes a los 30 y 60 días de cultivo, presenta

diferencias (P≤0.05) entre los medios, siendo mejor el medio número uno, al

presentar una sobrevivencia mayor, gracias a una menor incidencia de hongos,

debido a una mayor eficiencia de la solución fungicida aplicada antes de la

desinfección. Sin embargo, esta diferencia desaparece a los 90 días de cultivo. Lo

anterior, puede ser debido también a lo que señalan (HARTMANN y KESTER

(1998), quienes indican que la efectividad del surfactante en la desinfección del

explante depende de la relación tiempo-dosis, aumentando ésta cuando se

aumentan ambos, pero la capacidad para dañar tejidos también crece.

Los resultados de la variable oxidación durante tres períodos de cultivo para los

explantes en dos medios de establecimiento, se expresan en el Cuadro 46, en

donde no se evidencian diferencias (P≤0.05), luego de tres meses de cultivo, entre

los dos medios.

Porcentaje de sobrevivencia de explantes (%) Tratamientos Día 30** Día 60 Día 90

T1: Medio 1 T2: Medio 2

83.3 a 66.6 b

83.3 a 66.6 b

66.6 a* 66.6 a

147

CUADRO 46. Efecto de dos medios de establecimiento y un origen de explante sobre la oxidación en la etapa de establecimiento in vitro de Ochagavia elegans.

Oxidación promedio por explante Tratamientos

Día 30** Día 60 Día 90 T1: Medio 1 T2: Medio 2

4.4 a* 4.5 a

4.80 a* 4.5 a

4.83 a* 4.75 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Tukey (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

Sin embargo, existe una alta oxidación de los explantes, aunque algo menor que en

el ensayo siete, sin carbón activo, el cual puede haber favorecido la absorción de

compuestos fenólicos liberados al medio de cultivo durante los primeros 30 días,

porque después los valores se asemejan a los obtenidos en el ensayo sin carbón

activo. Esto es confirmado por HARTMANN y KESTER (1998), quienes señalan que

contrarresta el efecto de ciertas sustancias inhibitorias liberadas por algunos tejidos

(en este caso de los compuestos fenólicos) o la adsorción de pigmentos tóxicos,

marrones y negros (compuestos de tipo fenólico y melanina), y de otros compuestos

tóxicos incoloros (PIERIK, 1990). Al igual que para las especies de la familia

Asteraceae, es la variable más importante para el éxito de la propagación in vitro de

esta especie.

Este efecto oxidativo se favorece con la permanencia de los explantes en el mismo

medio hasta los 30 días, luego del cual son traspasados a un medio renovado. Este

es un período de tiempo normal para las transferencias de los explantes a un medio

nuevo, como sucede en Rhododendron spp., cuyos explantes (brotes con yemas)

son subcultivados al principio cada dos semanas, pero posteriormente se hacen

cada 6 a 8 semanas (ANDERSON, 1975; KYTE y BRIGGS, 1979). Sin embargo, no

hubo cambios favorables para los explantes en esta variable.

148

Esta oxidación en casi todo el explante, es producida según MARKS y SIMPSON

(1989) por una oxidación de compuestos fenólicos liberados (MARGARA, 1988;

DAMIANO, CHIAROTTI y ANTONELLI; 1991), por un rompimiento celular debido a

lesiones, inhibición y muerte de los explantes (CHRISTIANSEN y FONNESBECH,

1975). Es posible que esta especie suculenta, contenga químicamente sustratos

fenólicos similares a los detectados en las Asteráceas, sin embargo, no se han

hecho estudios al respecto.

Los menores valores de oxidación promedio con respecto al ensayo anterior pueden

estar relacionados con la inclusión de carbón activo en el medio de cultivo, lo que

está corroborado por HARTMANN y KESTER (1998), quienes señalan que

contrarresta el efecto de ciertas sustancias inhibitorias liberadas por algunos tejidos

(en este caso de los compuestos fenólicos) o la adsorción de pigmentos tóxicos,

marrones y negros (compuestos de tipo fenólico y melanina), y de otros compuestos

tóxicos incoloros (PIERIK,1990). Al igual que para las especies de la familia

Asterácea es la variable más importante para el éxito de la propagación in vitro de

esta especie, ya que se puede controlar solamente con la inclusión de carbón activo

al medio de cultivo

CHISTIANSON y WARNICK (1983) señalan que cuando la proporción de

citoquininas es mayor que la de auxinas, se induce el inicio de yemas de brote. Si se

considera que esta relación existe en los tratamientos, entonces es posible inferir

que el problema sea la elección del tipo de medio, sólido o líquido. Tal es el caso del

cultivo de Cattleya por REINERT y MOHR (1967) en medio sólido RM (REINERT y

MOHR, 1967), en donde las secciones de tejido meristemático, provenientes de

yemas laterales como explantes, se tornan de color café negruzco durante las

primeras tres semanas de desarrollo y posteriormente mueren. Sin embargo, en un

medio RM líquido, el crecimiento y desarrollo de los explantes es satisfactorio,

149

debido a que en un medio líquido los fenoles se encuentran diluidos, en cambio, en

un medio sólido los fenoles siempre están en contacto con los explantes.

También es importante mencionar que la concentración de agar en el medio de

cultivo MS (7,5 g/l) es mucho más alto que aquel usado en el ensayo 7(6 g/l), lo que

puede influir en la retención de los nutrientes en el medio, reduciendo su absorción.

Esto lo confirman HARTMANN y KESTER (1998) al considerar que concentraciones

de agar superiores en 1,0 a 1,2 g/l a la adecuada, tienden a reducir el crecimiento.

Además, cuanto mayor es la concentración de agar, la fuerza con que el agua es

retenida también es mayor, lo que reduce el potencial osmótico (PIERIK, 1990).

En los explantes de ambos medios, no hay organogénesis ni formación de tejido de

callo, lo que puede deberse al igual que en las Asteráceas, a la selección

inadecuada del medio de cultivo, considerado junto con la selección del explante

adecuado, dos de los factores más importantes en el éxito de la propagación in vitro

(MURASHIGE, 1977), pero sin dejar de considerar también la edad, el estatus de

agua y nutrientes de la planta madre (KETEL, BRETELER y DE GROOT, 1985). El

carbón activo puede haber provocado un efecto inhibidor sobre el crecimiento, al

adsorber reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas) del medio (MARGARA,

1988; PIERIK, 1990).

Se analizan a continuación los resultados obtenidos de los registros de la variable

color, expresados en valores promedio mustrales, en tres períodos de cultivo

(Cuadro 47).

150

CUADRO 47. Valores promedio muestrales de las observaciones de color de los explantes de yemas en Ochagavia elegans a los 30, 60 y 90 días de cultivo in vitro, según el medio de cultivo.

MEDICIÓN TRATAMIENTO MEDIA MUESTRAL

T1: Medio 1 3 a* Día 30** T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 3 a Día 60 T2: Medio 2 3 a

T1: Medio 1 4 b Día 90 T2: Medio 2 3 a

*: Valores con letras iguales en las columnas indican que no existen diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos, según Test de Mann-Whitney (P≤0.05). **: Días contados desde que se realizó el cultivo.

A diferencia del ensayo 7, existen diferencias (P≤0.05) entre los medios de

establecimiento con yemas como explantes, solo a los 90 días de cultivo,

presentado el medio uno mayormente el color café rojizo (4/4 7.5 YR) y, el medio

dos el color café claro (6/6 2.5 Y). De esto se desprende que el medio dos podría

ser mejor al presentar un color más cercano al color propio de la especie (8/4 5 Y),

al representar un menor pardeamiento de los explantes, sin embargo, los resultados

de oxidación (Cuadro 46) no lo confirman.

4.8.3. Explantes de tallo

A partir del trozo apical del tallo, se obtienen dos explantes, para probar uno en

cada medio de establecimiento. La sobrevivencia de estos explantes es del 100%,

luego de 60 días de cultivo, sin embargo presentan una alta oxidación producto de

la desinfección con hipoclorito de sodio (0,5% por 10 minutos), señalado

anteriormente como oxidante de los tejidos. De esto, se desprende que a pesar de

utilizar para la desinfección una baja concentración de hipoclorito de sodio, un corto

151

período de tiempo de desinfección, enjuagues con agua destilada más antioxidantes

(ácido cítrico y ascórbico), condiciones de desarrollo en oscuridad durante la

primera semana y temperaturas de la cámara de crecimiento de 23±2ºC, es alta la

sensibilidad del tejido a la oxidación. Sin embargo, fue efectiva, favoreciendo en

ambos medios el desarrollo de las yemas. Uno de los explantes (T1) presenta dos

yemas, una de casi 2 mm. y otra de casi 3 mm.de largo; en tanto, el otro explante

(T2) presenta una yema de casi 3 mm de largo, después de 60 días de cultivo

(Figura 3).

El color de la especie en los explantes (equivalente en la tabla Munsell a 8/6 2.5

GY), en ambos medios, se pierde a los 60 días de cultivo, tornándose de color café

rojizo (equivalente a 4/4 7.5 YR), lo que demuestra también que hay efecto de

pardeamiento de compuestos fenólicos presentes en el explante y que son liberados

al realizar el corte. Esto confirma lo expuesto por MARKS y SIMPSON (1989),

quienes describen la oxidación de compuestos fenólicos liberados por un

rompimiento celular debido a lesiones, como una de las principales causas de

pérdida al inicio de establecimiento del cultivo, por inhibición y muerte de los

explantes (CHRISTIANSEN y FONNESBECH, 1975).

152

FIGURA 3. Explantes de tallo Ochagavia elegans R. A. Phill., con yemas axilares en

crecimiento. T1: medio uno, con 1 yema; T2: medio dos, con 2 yemas.

T2 T1

153

Ensayo 9: Germinación de semillas de Ochagavia elegans R. A. Phill.

Otra alternativa al uso de secciones de hojas, yemas laterales con trozos de tallo y

secciones de tallo como explante, son las semillas.

Las semillas fueron recolectadas en primavera (fines de octubre del año 2002)

dentro de los restos florales (en el ovario) por Oscar Fernández, encargado del

vivero del Jardín Botánico, en el sector Islas Oceánicas, del Jardín Botánico de Viña

del Mar.

De una flor se extrajeron más de 100 semillas, de las cuales fueron sembradas en

abril del 2003 aproximadamente el 50%, en un medio de germinación MS

(MURASHIGE y SKOOG, 1962) utilizado para cítricos. Debido a que las semillas se

encontraban protegidas y encerradas dentro del ovario de la flor (que forma como

fruto una baya indehiscente), no fue necesario desinfectar con una solución

fungicida, pero sí con hipoclorito de sodio al 1% durante 10 minutos. Como se

esperaba, no se presentaron agentes de contaminación sobre las semillas

sembradas. Sin embargo, no se ha observado la germinación de ellas desde que se

realizó la siembra al cabo de tres meses.

BALDINI (1992) describe varios tratamientos para favorecer la germinación de las

semillas, indicando entre estos la aplicación de giberelinas a las semillas

quiescentes para modificar su estatus hormonal y permitir su pronta germinación; la

inmersión en agua caliente por 12 horas, para el ablandamiento de las cubiertas y

eliminar los inhibidores y, la escarificación mecánica o química.

154

Se decide escarificar mecánicamente (pelado manual) 10 semillas in vitro en la

cámara de flujo, mediante una lupa electrónica. En este proceso y en la mayoría de

las semillas, se encuentra el endosperma envolviendo a un pequeño tejido que

parece ser el embrión y que se prolonga en uno de los extremos, Sin embargo,

también se detectan algunas semillas vanas o atrofiadas, causado por un aborto

seminal, considerado por BALDINI (1992) como la formación de semillas sin

embrión y formadas solamente por el involucro. Este fenómeno puede ser causado

por dos razones, esterilidad genética o una insuficiente llegada de matabolitos a la

semilla. La razón más probable sería la segunda, debido a la distinta condición del

clima existente en Viña del Mar (Jardín Botánico), donde no existe una fuerte

influencia marina, la condición de humedad y precipitación necesaria para su

desarrollo con respecto al de su hábitat de crecimiento en el archipiélago (CONAF,

2002; BARRERA, 1997), descrito anteriormente por JOHOW (1896).

Luego de 20 días de cultivo, en una de las semillas se detecta una reacción del

embrión sobre el medio de cultivo, formando en el extremo del tejido, pequeñas

prolongaciones laterales.

Posiblemente el medio sólido no es el más adecuado para el cultivo de estas

semillas, por lo señalado por HARTMANN y KESTER (1998) al indicar que las

semillas de Bromeliáceas se han cultivado en la forma descrita para orquídeas, pero

siendo cambiados cada siete días hasta la germinación.

155

Ensayo 10: Germinación de semillas de Plantago fernandezia (Dcne) Bert.

La fecha de recolección de frutos se realizó en pleno invierno (principios de Agosto

del año 2002). De un fruto se extrajeron un total de 115 semillas, las cuales fueron

sembradas en un medio de germinación MS (MURASHIGE y SKOOG, 1962)

utilizado para cítricos.

Del total de semillas sembradas, germinaron sólo 22 de ellas, al cabo de 15 días de

realizada la siembra. Sin embargo, no se pudo continuar con el ensayo por

presentar una alta tasa de contaminación por hongos (100%), lo que pudo deberse

a una ineficiente desinfección en tiempo (10 minutos) o dosis de hipoclorito de sodio

(1%). Podría haberse usado previo a la desinfección, una solución fungicida, por

tratarse de un material proveniente de un sitio con alta probabilidad de infestación

por inóculos, y porque las semillas se encuentran adheridas peltadamente al fruto,

una cápsula circuncisa y dehiscente (pixidio) (NAVAS, 1979)., mucho más

expuestas que las semillas de Ochagavia elegans, del ensayo anterior. Sin

embargo, fue posible desinfectar algunas plántulas de las semillas germinadas in

vitro, con una solución de Captan más Benlate (1,25%) y plantarlas ex vitro (bajo

invernadero del Laboratorio de Propagación) en vasos contenedores plásticos, con

una mezcla de sustrato de arena, perlita y tierra de hoja (1:1:1), desinfectado con la

misma solución fungicida (Figura 4).

Es importante señalar que la desinfección fue realizada en base a los buenos

resultados obtenidos sobre semillas de cítricos y de Passiflora pinnatistipula Cav,

logrando ESTAY (2002), 100% de germinación y sin contaminación.

156

FIGURA 4. Planta de Plantago fernandezia (Dcne) Bert., de un año de edad,

obtenido de semillas recolectadas del vivero del Jardín Botánico de Viña del Mar, Agosto de 2002.

157

Se hizo el intento de probar con semillas recolectadas tardíamente (septiembre del

año 2002), pero realizando la siembra de 51 semillas en marzo del año 2003. Sin

embargo y a pesar de la contaminación del 80% de ellas, las que sobrevivieron no

estaban viables, aparentemente, por el tiempo transcurrido desde la recolección y

porque no hubo germinación alguna. Esto es corroborado por HARTMANN y

KESTER (1987), quienes definen viabilidad de las semillas como el porcentaje de

germinación, el cual indica el número de plantas producidas por un número dado de

semillas.

Lo anterior demuestra lo importante que es la etapa de desinfección del explante

para lograr propagarlo libre de patógenos, la que enfatizan y previenen HARTMANN

y KESTER (1998), sobre todo si se trabaja con material proveniente de lugares

donde no se hacen desinfecciones continuas, y no se utilizan como explantes tejidos

bien protegidos (meristemas) o ápices de tallo cubiertos por las escamas foliares

(MARGARA, 1988), como es en este caso, en que el material (fruto) provenía del

Jardín Botánico de Viña del Mar, por ende más susceptible a la penetración de

patógenos en tejidos. A diferencia del ensayo con semillas de Ochagavia elegans,

las semillas de Plantago se encontraban en los frutos abiertos expuestas al

ambiente, siendo necesaria la aplicación de un fungicida.

Posteriormente, se intenta recolectar semillas en una fecha más temprana (junio

2003), pero lamentablemente las semillas no se formaron, quizás debido a que la

condición climática que hubo en el período de la polinización no fue el adecuado o

quizás hubo polinización, pero no fecundación. HARTMANN y KESTER (1987)

señalan que deben ocurrir dos procesos para que una semilla sea viable:

polinización y fecundación.

158

La viabilidad se puede determinar por varias pruebas, pero las más utilizadas son la

germinación directa, de embrión separado y la de tetrazolio. En la prueba de

germinación directa, el porcentaje de germinación se determina por la cantidad de

plántulas normales producidas por las semillas.

No fue posible cumplir con la construcción de la curva de germinación de las

semillas, ni poder obtener una planta libre de hongos o virus. Sin embargo, este

medio de cultivo es factible para lograr la germinación de algunas semillas (19%) y

pasar a la etapa siguiente de establecimiento in vitro.

159

5. CONCLUSIONES No fue factible implementar una metodología de propagación in vitro para la fase de

establecimiento de las especies Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia

(Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne. y Robinsonia thurifera Dcne.,

endémicas de la Isla Robinson Crusoe, para propagar una cantidad de plantas que

permitan concretar las etapas de proliferación, enraizamiento y aclimatación.

La fase de establecimiento de Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia

(Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne. y Robinsonia thurifera Dcne., no

puede lograrse a través de secciones de hojas, sin embargo, las yemas apicales de

posición axilar, como explantes, pueden ser una buena alternativa a desarrollar en

Robinsonia thurifera.

Las especies Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et

Arn., Robinsonia gayana Dcne. y Robinsonia thurifera Dcne., sufren una alta

oxidación de los tejidos desde su obtención como explante y durante el cultivo in

vitro, que causa una inevitable necrosis.

Las desinfecciones de las especies del género Dendroseris y Robinsonia, no

reducen ni eliminan la alta incidencia de bacterias endógenas, durante la etapa de

establecimiento in vitro.

Es factible implementar una metodología de propagación in vitro para la fase de

establecimiento en la especie Ochagavia elegans R.A. Phill., familia Bromeliaceae.

160

No fue posible describir la capacidad germinativa de Plantago fernandezia (Dcne.)

Bert., familia Plantaginaceae, bajo condiciones controladas de crecimiento, pero sí

es factible lograr la germinación de las semillas de Plantago fernandezia (Dcne.)

Bert. en el medio de germinación MS cero, sin vitaminas y sin azúcar.

161

6. RESUMEN En el Laboratorio de Propagación Profesor Gregorio Rosenberg de la Facultad de Agronomía, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, se realizaron ensayos con el objetivo de desarrollar una metodología de propagación in vitro para las especies Dendroseris litoralis Skottsb., Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn., Robinsonia gayana Dcne., Robinsonia thurifera Dcne. y Ochagavia elegans R.A. Phill. y, un análisis de germinación de semillas de Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., endémicas de la Isla Robinson Crusoe, Archipiélago de Juan Fernández, con problemas de conservación. Primero se evaluaron cuatro protocolos de desinfección para Asteráceas, dando mejores resultados la desinfección que utilizaba hipoclorito de sodio al 1,5% más ácido cítrico y ácido ascórbico (500 ppm cada uno), para Dendroseris litoralis Skottsb. y Dendroseris neriifolia (Dcne.) Hook et Arn. y, la desinfección que utilizaba hipoclorito de sodio al 1,0% más ácido cítrico y ácido ascórbico (500 ppm cada uno), para Robinsonia gayana y Robinsonia thurifera, más Tween 20 durante 20 minutos. Para las etapas de establecimiento, se probaron tres medios de cultivo distintos, dando mejores resultados, en cuanto a menor oxidación y mayor prolongación de vida de los explantes, un WPM más vitaminas de MS, 1 mg/l de ANA más 3,5 mg/l de BAP, 30 g/l de sacarosa, 1g/l de PVPP, 7 g/l de agar, con pH 5,5. Luego, se evaluaron cuatro protocolos de desinfección para Ochagavia elegans R.A. Phill., obteniendo mejores resultados de sobrevivencia y oxidación, la desinfección que contenía hipoclorito de sodio (1,5%) más ácido cítrico y ácido ascórbico (500 ppm cada uno), más Tween 20 por 20 minutos. Se probaron dos medios de cultivo distintos para la etapa de establecimiento, con mejores resultados en cuanto a menor oxidación y mayor desarrollo de los explantes, en yemas de secciones de tallos, sobre un MS más vitaminas de MS, 0,2 mg/l de IBA más 0,4 o 0.7 mg/l de BAP, 25 g/l de azúcar, 0,3 g/l carbón activo, 7,5 g/l de agar, ajustado a pH 5,7. En la especie Plantago fernandezia (Dcne.) Bert., se probaron dos fechas de recolección de semillas, siendo mejor en el mes de Agosto, por encontrarse viables las semillas y lograr germinar el 19% de un total de 115 semillas, sobre un medio de germinación para cítricos (MS cero). Sin embargo no es factible describir la capacidad germinativa de sus semillas. A pesar de todos los ensayos, no es factible implementar una metodología de propagación in vitro para todas las especies, conservando las características de la planta madre, y, por lo tanto, no es posible preservar la flora nativa y endémica de nuestro país.

162

7. LITERATURA CITADA AMIN, M., SHARMA, B.B. and SRINIVASA, M. 1992. Studies on stock treatment and

initiation culture mode in control of oxidative browning in vitro cultures of grapevine. Scientia Horticulturae, 51: 35-41.

ANDERSON, W.C. 1975. Propagation of rhododendrons by tissue culture: Part 1.

Development of culture medium for multiplication of shoots. Proc. Inter. Plant Prop. Soc. 25: 129-135.

ARRABAL, R., AMANCIO, F., CARNEIRO, L.A. and MANSUR, E. 2002.

Micropropagation of endangered endemic Brazilian bromeliad Cryptanthus sinuosus (L.B. Smith) for in vitro preservation. Biodiversity and Conservation 11: 1081-1089.

AZCON – BIETO, J. y TALON, M. 2000. Fundamentos de fisiología vegetal. .

España. McGraw Hill. 521p. BALDINI, E. 1992. Arboricultura general. Madrid España. Mundi - Prensa. 379p. BARBA, A. 1987. Cultivo de callos. In: D. Hurtado, M. Eugenia Merino. Cultivo de

Tejidos Vegetales. México. Editorial Trillas. pp.93-100. BARRERA, E. 1997. Helechos de Juan Fernández. Publicación Ocasional del

Museo de Historia Natural. Nº 51: 5 -104. Museo Nacional de Historia Natural. Santiago. Chile

BENOIT, I. 1999. Col de Juan Fernández (Dendroseris litoralis). Chile forestal. Nº

273. p 61. ________, 1989. Libro Rojo de la Flora Terrestre de Chile. Santiago de Chile.

CONAF. 157p. BESNIER, F. 1989. Semillas. Biología y Biotecnología. Madrid. Mundi - Prensa..

637p.

163

BIANCANI, L. 1996. Evaluación de tres protocolos de desinfección, tres protocolos de uso de antioxidantes par el cultivo in vitro de chirimoyo (Annona cherimola Mill.) y determinación cuantitativa de los contenidos de fenoles en ramillas. Taller de licenciatura. Ing. Agr. Quillota. Universidad Católica de Valparaíso.112p.

BON, M.C., GENDRAUD, M. and FRANCLET, A. 1988. Roles of Phenolic

Compounds on Micropropagation of Juvenile and Mature Clones of Sequoiadendron giganteum: Influence of Activated Charcoal. Scientia Horticulturae, 34: 283 -291.

BROOME, O.C. and ZIMMERMAN, R.H. 1978. In vitro propagation of blackberry. HortScience, 13, 151-3.

CAMPOS, J. 1995. Cultivo In Vitro en el Género Puya. Tesis de Grado Ing. Agr.

Facultad de Agronomía. Universidad de Concepción. Chillán, Chile. 13p. CANAVOS, G. 1988. Probabilidad y Estadística. Aplicaciones y métodos. Mc Graw-

Hill / Interamericana de México, S.A. México. 651 p. CASSELLS, A. and MINAS, G. 1983. Plant and in vitro factors influencing the

micropropagation of Pelargonium cultivars by budtip culture. Scientia Horticulturae, 21: 53-65.

CHAWDHURY, A., KUNDU, S. and RAYCHAUDHURI, S. 1996. Regeneration of

Plantago ovata Forssk through somatic embryogenesis. Cytobios 85: 255-261.

CHEFTEL, J. y CHEFTEL, H. 1992. Introducción a la Bioquímica y Tecnología de

los alimentos. Editorial Acribia. Zaragoza. España. Volumen 1. 333p. CHRISTIANSEN, J. and FONNESBECH, M. 1975. Prevention by polyvinilpyrrolidone

of growth inhibition of Hamamelis shoot tips grown in vitro and of browning of the agar medium. Acta Hoticulturae, (54):101-104.

CHRISTIANSON, M. and WARNICK, D. 1983. Competence and determination in the

process of in vitro shoot organogenesis. Dev. Biol., 95(2): 288-293.

164

COCKREL, A.D., MC DANIEL, G.L. and GRAHAM, E.T. 1986. In Vitro Propagation of Florists’ Cineraria. HortScience 21(1):139-140.

CONAF, 2003. Plan de Manejo: Parque Nacional Archipiélago de Juan Fernández.

Actualmente en Revisión final. Viña del Mar. 75p. CONAF, 2001. Project “Conservation, Restoration and Development of the Juan

Fernández islands, Chile”. CONAF. Revista Chilena de Historia Natural. 74:899 – 910.

________, 1992. Programa de Conservación y Recuperación de Plantas

Amenazadas de Juan Fernández. Preparado por Marcia Ricci. Proyecto CONAF- W.W.F. – 3313, Informe Final Tercera Etapa. Viña del Mar. 45p.

CORPORACION DE FOMENTO A LA PRODUCCION. 1990. Fondo de desarrollo

productivo. Chile, CORFO. 99p. COSIO, F. y GÁLVEZ, C .2003. Evaluación de Praderas y Capacidad Sustentadora

Animal. Parque Nacional Archipiélago Juan Fernández. Isla Robinson Crusoe. Informe Final. Convenio CONAF-Pontificia Universidad Católica de Valparaíso.

CUENCA, S., AMO-MARCO, J.B. and PARRA, R. 1999. Micropropagation from

inflorescence stems of the Spanish endemic plant Centaurea paui Loscos ex Willk. (Compositae). Plant Cell Reports, 18: 674-679.

DAMIANO, C., CHIAROTTI, A. y ANTONELLI, M. 1991. Cultivo in vitro y

micropropagación en fruticultura. Hortofruticultura. Nº 10: 25 – 30. DANTON, PH. , BAFFRAY, M., BRETEAU, E. y LESOUEF, J. 1998. Primera

Expedición Botánica en el Archipiélago de Juan Fernández. Informe Nº1.

DIRR, M. and HEUSER, CH. 1987. The Reference Manual of Woody Plantt

Propagation: From Seed to Tissue Culture. Varsity Press, Inc. Georgia. U.S.A. 239 p.

165

ESTAY, C. 2002. Propagación in vitro de Granadilla (Pasiflora pinnatistipula Cav.). Taller de Licenciatura Ing. Agr. Quillota. Universidad Católica de Valparaíso. 98 p.

GARCÍA, L. y NOA, J.C. 1998. Obtención de Plantas libres de Patógenos. In: J.N

Pérez Ponce. Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Cuba. Instituto de Biotecnología de las Plantas. pp. 135-149.

GAY, C. 1974. “La isla de Juan Fernández”. Museo de Historia Natural. Santiago.

Chile. 16p. GEORGE, E. and SHERRINGTON, P. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture.

Eversley-London, England Exegertic. 709 p. HARTMANN, H., KESTER, D. and DAVIES, F. 1990. Plant Propagation. Principles

and Practices. Prentice Hall Career and Technology. Fifth Edition. Englewood Cliffs, NewYersey. U.S.A. 647p.

HARTMANN, H. y KESTER, D. 1998. Propagación de Plantas. México. Continental.

Sexta reimpresión. 760p. HEYWOOD, V. HARBORNE, J.H. and TURNER, B.L. 1977. Eds. Biology and

Chemestry of the Compositae. Academic Press, London. S.9. HILDEBRANDT, V. and HARNEY, P.M. 1988. Factors affecting the realease of

phenolic exudate from explants of Pelargonium x hortorum, Bailey "Sprinter Scarlet". Journal of Horticultural Science, 63, 651-657.

HILL, G.P. 1968. Shoot formation in tissue cultures of Chrysanthemum ‘Bronze

Pride’. Physiol. Plant., 21: 386-389. HOSOKI, T. and ASAHIRA, T. 1980. In Vitro Propagation of Bromeliads in Liquid

Culture. HortScience 15(5): 603-604. INE, 2002. XVII Censo Nacional de Población y Vivienda: Resultados finales (on

line) www.ine.cl.

166

________, 1992. XVI Censo Nacional de Población y Vivienda: Resultados Generales. Chile. 750p.

IREN-CORFO. 1982. Estudio de los recursos físicos del Archipiélago de Juan

Fernández- Región de Valparaíso. Corporación de Fomento Producción. Santiago. Chile. 384p.

ISHII, M., UEMOTO, S. and FUJIEDA, K. 1979. Studies on tissue culture in Cattleya

species. II. Preventive methods for the browning of explanted tissue. Journal of the Japanese Society of Horticultural Science, 48, 199-204.

JOHOW, F. 1896. Estudios sobre la flora de las Islas de Juan Fernández. Imprenta

Cervantes, Santiago. Chile. 287p. KETEL, D.H. , BRETELER, H. and DE GROOT, B. 1985. Effect of explant origin on

growth and differentiatio of calli from Tagetes species. J Plant Physiol. 118: 327-333.

KYTE, L. and BRIGGS, B. 1979. A simplified entry into tissue culture production of

rhododendrons. Proc. Inter. Plant Prop. Soc. 29: 90-95. KOTHARI, S.L. and CHANDRA, N. 1984. In Vitro Propagation of African Marigold.

HortScience 19(5):703-705. LEE, CH., NICHOLS, J., WANG, L. and KE, S. 1994. Plant Regeneration in

Coreopsis lanceolata L. from Leaf Tissue Cultures. HortScience 29 (11): 1353-1354.

LLOYD, G and McCOWN, B.H. 1981. Comercially-feasible Micropropagation of

Mountain Laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Comb.Proc.Inter.Plant Prop.Soc. 30:421-427.

MACÍAS, C. RODRIGUEZ, P. y CANALS, X. 1998. Optimización del uso de PVPP

en vinos blancos, (on line). www. acenología.com / innovación 58 htm. MARGARA, J. 1988. Multiplicación Vegetativa y Cultivo in vitro. Madrid. Mundi -

Prensa. 232p.

167

MARKS, T.R. and SIMPSON, S.E. 1989. Reduced phenolic oxidation at culture initation in vitro following the exposure of field-grown stockplants to darkness or low levels of irradiance. Journal of Horticultural Science, 65 (2):103-111.

MARTICORENA, C., STUESSY, T.F. and BAEZA, C. 1998. Catalogue of the

Vascular Flora of the Robinson Crusoe or Juan Fernández islands, Chile. Gayana Botánica (Chile) 55(2): 187-211.

________ y QUEZADA, M. 1985. Catálogo de la flora vascular de Chile. Gayana

Botánica 42 (1-2): 5-157. Facultad de Ciencias Biológicas y de Recursos Naturales. Universidad de Concepción. Chile.

________. 1995. Flora de Chile. Pteridophyta-Gymnospermae. Universidad de

Concepción. Concepción Chile. 351p. MATTHEI, O., MARTICORENA, C. y STUESSY, T.F. 1993. La Flora Adventicia del

Archipiélago de Juan Fernández. Gayana Botánica 50: 69-102. McCLELLAND, M. and SMITH, M. 1993. Alternative methods for sterilization and

cutting desinfestation. Combined Proceedings. The International Plant Propagators Society. 43: 526-530.

MEDEROS, S., MARTIN, C., NAVARRO, E. and AYUSO, M.J. 1997.

Micropropagation of a medicinal plant, Plantago major L. Biologia Plantarum 40(3): 465-468.

MERINO, M.E. 1987. Cultivo de hojas. In: D. Hurtado, M. Eugenia Merino. Cultivo

de Tejidos Vegetales. México. Editorial Trillas. Pp.149-153. MUNSELL. 1998. Color charter for plant tissue. New York U.S.A., Munsell color.

413p. MUÑOZ, C. 1969. El Archipiélago de Juan Fernández y la conservación de sus

recursos naturales renovables. Museo Nacional de Historia Natural. 1974. Santiago. Chile.

168

________. 1966. Flores Silvestres de Chile. Ediciones Universidad de Chile. 245p. MURASHIGE, T. 1977. Plant cell and organ cultures as horticultural practice. Acta

Hort. 78: 17-30. ________, SERPA, M. and JONES, J. 1974. Clonal Multiplication of Gerbera

through Tissue Culture. HortScience 9(3):175-180. ________ and SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays

with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473 – 497. NAVAS, L. 1979. Flora de la Cuenca de Santiago de Chile. Ediciones de la

Universidad de Chile. Tomo III. 509p. NOVAK, F. 1980. Chromosomal inestabilities in callus tissue from haploid barley

Hordeum vulgare. Biol. Plant. 22 (4): 303-305. ORELLANA, P. 1998. Propagación Vía Organogénesis. In: J.N Pérez, Ponce.

Propagación y Mejora Genética de Plantas por Biotecnología. Cuba. Instituto de Biotecnología de las Plantas. pp. 135-149.

OYANEDEL, E. 1995. Propagación in vitro de Portainjertos de Palto (Persea

americana Mill.) resistentes a salinidad, cv. Velvick y Lula. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota. Universidad Católica de Valparaíso. 82p.

PARAMANIK, S., CHAKRABORTY, S. and RAYCHAUDHURI, S. 1995. In vitro

clonal propagation and characterization of clonal regenerants of Plantago ovata Forrssk by isozyme análisis. Cytobios 82: 123-130.

PÉREZ, F., PITA, J., y GÓMEZ, C. 1994. Fisiología de semillas. España, Ediciones

Universidad Politécnica de Madrid. 49p. PIEPER,W. and ZIMMER, K. 1976. Clonal propagation of Phalaenopsis in vitro. Acta

Horticulturae 64, 21-3.

169

PIERIK, R.L.M. 1990. Cultivo in vitro de las Plantas Superiores. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid. España. 326p.

________. 1987. In Vitro Culture of Higers Plants. Martinus Nijhoff Publishers,

Dordrecht. Netherlands. 344 p. ________., JANSEN, J.L.M., MAASDAM and BINNENDIJK, C.M. 1975.

Optimalization of Gerbera Plantlet Production From Excised Capitulum Explants. Scientia Horticulturae, 3: 351-357.

PREIL, W. and ENGELHARDT, M. 1978. Meristem culture of azaleas

(Rhododendron simsii). Acta Horticulturae. 78: 203-207. RAUNKIAER, C. 1934. The Life forms of Plant Statical Plant Geography. London,

Oxford University. Claremdon Press. 632p REICHE, K. 1911. Flora de Chile. Tomo VI. Imprenta Barcelona. 17p. ________. 1910. Flora de Chile. Tomo V. Imprenta Barcelona. 463p. REINERT, R.A. and MOHR, H.C. 1967. Propagation of Cattleya by Tissue Culture of

Lateral Bud Meristems. Am. Soc. Hortic. Sci. 91:664-668. RICCI, M. y LEIVA, I. 2000. Flora: Parque Nacional Archipiélago Juan Fernández.

7p. ________. 1998. Manual de Propagación de algunas especies endémicas del

Archipiélago de Juan Fernández. Proyecto: “Conservación, Restauración y Desarrollo del Archiìélago de Juan Fernández”. CONAF- AGCI-CHILE- GOBIERNO DE LOS PAÍSES BAJOS. Documento Técnico. 22p.

RINGE, F. and NITSCH, J.P. 1968. Contributions leading to flower formation on

excised Begonia fragments cultured in vitro. Plant & Cell Physiol. 9:639-652.

RODRÍGUEZ, R., MATTHEI, O. y QUEZADA, M. 1983. Flora de Chile. Editorial

Universidad de Concepción. Chile. 408 p.

170

ROEST, S. and BOKELMANN, G.S. 1973. Vegetative propagation of Chrysanthemum cinerariaefolium in vitro. Scientia Hort., 1:120-122.

________ and BOKELMANN, G.S. 1975. Vegetative Propagation of

Chrysanthemum morifolium Ram. In vitro. Scientia Horticulturae, 3:317-330.

SANDERS, R. STUESSY, T., MARTICORENA, C. and SILVA, M. 1987.

Phytogeography and evolution of Dendroseris and Robinsonia, tree-compositae of the Juan Fernández Islands. Opera Botánica 92: 195-215.

SILVA, M., BITTNER, M. y PACHECO, P. 1992. Estudio Químico de la Familia

Compositae del Archipiélago de Juan Fernández. In: Orlando Muñoz. Química de la Flora de Chile. Departamento Técnico de Investigación. Universidad de Chile. pp.81-91.

SKOTTSBERG, C. 1956. Derivation of the Flora and Fauna of Juan Fernández and

Easter Islands. The Nat. Hist. Juan Fernández 1: 193-439. ________. 1953. The Vegetation of the Juan Fernández Islands. The Natural History

of Juan Fernández and Easter Island 2: 793-960. ________. 1921. The Phanerogams of the Juan Fernández Islands. The Natural

History of Juan Fernández and Easter Island 2: 95-240. SPIEGEL, M. 1991. Estadística. Madrid. España. McGraw-Hill. 556p. STUESSY, T.F., MARTICORENA, C., RODRIGUEZ, R., CRAWFORD, D.J. and

SILVA, M. 1992. Endemism in the Vascular Flora of Juan Fernández Islands. Aliso 13: 297-307.

________, FOLAND, K.A., SUTTER, J., SANDERS, R. and SILVA, M., 1984.

Botanical and Geológical Significance of Potassium-Argon Dates from the Juan Fernández Islands. Science. Reprint Series. Volume 225, p. 49-51.

171

________, SANDERS, R. and SILVA, M. 1984. Phytogeography and Evolution of the Flora of the Juan Fernández Islands: a Progress Report. In: Radovsky FJ. PH Raven and SH Sohmer (eds) Biogeography of the tropical Pacific: 55-69. Association of Systematic Collections and B.P. Bishop Museum. Lawrence, Kansas.

VELOZO, J., CAMUS, I. and ROJAS, C. 2000. Ensayos de propagación mediante

la técnica de cultivo de tejido in vitro en Juania australis y Robinsonia berteroi. Universidad Central de Chile. 10 p.

YEOMAN, M. and MACLEOD, A.J. 1977. Tissue (callus) cultures-techniques. In: Ed.

H.E. Street. Plant Tissue and Cell Culture. Cal. Press. U.S.A. pp. 31-59. YU, D. and MEREDITH, C. 1986. The Influence of Explant Origin on Tissue

Browning and Shoot Production in Shoot Tip Cultures of Grapevine. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 111(6): 972-975.

ZIV, M. and HALEVY, A.H. 1983. Control of Oxidative Browning and in Vitro

Propagation of Strelitzia reginae. HortScience 18(4): 434-436.