rink tektum

LAPORAN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK TUMBUHAN

Disusun Oleh :Imam Bagus Nugroho (7907)

Priska (7916)Muhammad Bima Atmaja (7936)

Romana Iqbal Ghozali (7992)Arfian Wicaksono (7998)

Yoga Dwi Permana (8025)Asri Wahyuni (8026)Nugraha Aminjoyo ()Ibnu Fadilatussari ()

Misbakhul Bait ()Andrianus Endra Jaya ()Mahya Nur Rohmah ()

LABORATORIUM MIKROTEKNIK DAN EMBRIOLOGI TUMBUHAN

FAKULTAS BIOLOGI

1

BORANG No. Dokumen FO-UGM-BI-07-13Berlaku sejak 03 Maret 2008

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK TUMBUHAN

Revisi 00


Halaman1 dari 44

UNIVERSITAS GAJAH MADAYOGYAKARTA

2009

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penyusun panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena

atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan laporan

praktikum ini tepat pada waktunya.

Laporan ini disusun untuk melengkapi tugas praktikum Mikroteknik

Tumbuhan tahun ajaran 2008/2009 di Laboratorium Mikroteknik dan Embriologi

Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada yang bertujuan untuk

mengenal dan mengetahui cara pembuatan preparat organ tumbuhan demi keperluan

identifikasi dan untuk mempelajari hubungan structural dari jaringan tumbuhan.

Dengan terselesaikannya penulisan ini, penyusun ingin menyampaikan ucapan

terima kasih kepada:

1. Bapak/Ibu Dosen Kepala Laboratorium Mikroteknik dan Embriologi

Tumbuhan

2. Bapak Drs. Sutikno, S.U. selaku Koordinator praktikum

3. Semua pihak yang tidak dapat penyusun sebutkan

Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan penulisan laporan ini, masih

banyak kekurangan dan kelemahan. Oleh karena itu untuk kesempurnaan laporan ini,

penyusun mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun.

Penyusun berharap semoga laporan ini dapat memberikan manfaat bagi

pembaca.

Yogyakarta, 10 Juni 2009

2



Revisi 00


Halaman2 dari 44

Penyusun

LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Praktikum Mikroteknik Tumbuhan ini disusun untuk melengkapi

tugas akhir Praktikum Mikroteknik Tumbuhan, di Laboratorium Mikroteknik dan

Embriologi Tumbuhan Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Telah disahkan pada:

Hari :

Tanggal :

Yogyakarta, Juni 2009

Mengetahui,

Dosen pembimbing Praktikan,

( Drs. Sutikno, S.U.) ( kelompok )

3



Revisi 00


Halaman3 dari 44

DAFTAR ISI

Halaman

Judul ............................................................................................................. i

Kata Pengantar……………………………………………………………… ii

Lembar Pengesahan………………………………………………………… iii

Daftar Isi ....................................................................................................... iv

Pendahuluan .................................................................................................. 1

Metode

A. Alat .................................................................................................... 2

B. Bahan ................................................................................................ 3

C. Cara Kerja.......................................................................................... 6

Latihan I Preparat Keseluruhan (Whole Mount) ....................................... 7

Latihan II Squash ........................................................................................ 11

Latihan III Preparat Pollen ........................................................................... 15

Latihan IV Preparat Penampang tanpa “Embedding” ................................. 20

Latihan V Preparat Penampang (Section) ................................................... 24

Latihan VI Maserasi ..................................................................................... 28

Latihan VII Mikrometri ................................................................................ 32

4



Revisi 00


Halaman4 dari 44

Daftar Pustaka ............................................................................................... 35

PENDAHULUAN

Mikroteknik tumbuhan merupakan teknik atau cara yang pada prinsipnya

meliputi :

1. Pembuatan preparat permanen dari bahan tumbuhan yang meliputi berbagai

metode (whole mount, section).

2. Pengamatan preparat mikroskopik dengan menggunakan alat khusus (Camera

Lucida).

3. Pengukuran panjang dan lebar sel atau bagian sel tumbuhan dengan

menggunakan mikrometer (Mikrometri).

4. Pengenalan sifat – sifat anatomis (palisade ratio, indeks stomata, dsb.).

5. Pengenalan bermacam zat penyusun bagian – bagian sel tumbuhan dengan

pembubuhan bahan – bahan kimia (mikrokimia).

Preparasi dapat dibuat secara section maupun non-section. Pada preparasi

non- section dapat dikelompokkan menjadi ;

a. Preparasi kering berupa herbarium, riker mount, dan specimen batang,

b. Preparasi basah berupa preparasi museum jar dan bahan bulk intuk dissection,

c. Whole mount dan maserasi untuk studi mikroskopik fisiologis.

5



Revisi 00


Halaman5 dari 44

Preparasi dibuat dengan tujuan supaya tumbuhan dapat dipelajari dengan lebih

baik dan mendetail. Pemilihan jenis atau metode preparasi disesuaikan dengan sifat

bahan tumbuhan, tujuan pembuatan, dan asal bahan, misalnya bahan akuatik. Pada

praktikum Mikroteknik Tumbuhan ini dilakukan preparasi section, whole mount,

squash, preparasi tanpa embedding, koleksi pollen, dan maserasi.

METODE

A. ALAT

Alat – alat yang dipergunakan, pada praktikum Mikroteknik Tumbuhan

adalah :

1. Gelas benda ,

2. Gelas penutup,

3. Gelas ukur,

4. Pipet kecil,

5. Pipet besar,

6. Skalpel,

7. Jarum preparat,

8. Kuas,

9. Gunting,

10. Pinset,

11. Pena halus (runcing) dengan tinta,

12. Gelas jam,

13. Tempat – tempat pewarnaan,

14. botol – botol tempat bahan kimia,

15. Botol atau tabung untuk fiksasi,

16. Lampu spiritus,

17. Botol balsam dengan batang gelas,

18. Gelas – gelas Petri,

19. Pompa penghisap,

20. Pensil,

21. Mikroskop,

22. Loupe,

23. Kertas penghisap,

24. Mikrotom,

25. Pisau cukur atau silet,

26. Parafin Oven / Thermostat,

6



Revisi 00


Halaman6 dari 44

27. Tempat penyimpan preparat,

28. Meja pemanasan,

29. Gelas benda berlekuk,

30. Camera Lucida,

31. Prisma proyeksi,

32. Cermin gambar,

33. Okuler – micrometer,

34. Obyek – micrometer,

35. Meja gambar,

36. Alat pemotret,

37. Lap biasa,

38. Lap flannel,

39. Tempat untuk membersihkan alat

– alat dari gelas.

7



Revisi 00


Halaman7 dari 44

B. BAHAN

Bahan – bahan kimia yang lazim dipergunakan pada praktikum

Mikroteknik Tumbuhan adalah;

1. Reagensia untuk dehidrasi, yaitu :

- Aseton,

- Etil Alkohol ,

- Higrobutol,

- Iso – propel alcohol,

- Butil alcohol normal,

- Propil alcohol normal,

- Butil alcohol sekunder,

- Butil alcohol tersier,

- dll

2. Reagensia untuk penjernihan, yaitu :

- Bensol, Tuluol,

- Kreosot,

- Minyak Berganot,

- Minyak Cedar,

- Chloroform,

- Minyak cengkeh,

- Terpineol,

- Trochloroethylen, xilol,

- dll.

3. Reagaensia untuk pemutihan, yaitu :

- Hydrogen peroxide,

- Proxida ammonia,

- dll.

4. Media untuk penyelubungan, yaitu :

- Paraffin,

- Celloidin, Colloidin, Parlodion,

- Glycol stearat,

- dll.

5. Bahan untuk perekat, yaitu :

8



Revisi 00


Halaman8 dari 44

- Haup`s adhesive,

- Mayer`s adhesive (gliserin dan albumin),

- Celloidin,

- Ullrich`s adhesive.

6. Media untuk penutupan preparat, yaitu :

- Balsem damar,

- Balsem Kanada,

- Euparal,

- Styrax,

- Hyrax,

- Minyak cedar,

- Venetian turpentine,

- Lactophenol,

- Gliserin jeli,

- dll.

7. Larutan – larutan untuk fiksasi, yaitu :

a. Bersifat asam

- Campuran asam asetat – alcohol, yaitu larutan Carnoy (alcohol

absolute 30cc; asam asetat glacial 5cc; chloroform 15cc),

- Campuran formalin – asam asetat – alcohol, yaitu Formalin – aseto

alcohol atau FAA (Alkohol 50% atau 70% 90 cc; asam asetat glacial 5

cc; formalin 5 cc),

- Campuran asam khromat – asam asetat, yaitu medium Asam Khromat

( larutan 10 % asam Khromat (air) 7cc; larutan 10% asam asetat (air

10 cc; dan akuades sampai 100 cc),

- Campuran asam khromat – asam asetat – asam asmiat, yaitu larutan

Fleming (larutan 10 % asam khromat 3,1 cc; larutan 10 % asam asetat

(air) 30 cc; 2% asam osmiat dalam 2% asam khromat 12 cc; dan

akuades 11,9cc),

9



Revisi 00


Halaman9 dari 44

- Campuran asam khromat – asam asetat – formalin, yaitu larutan

Navashin yang terdiri atas dua larutan ; larutan A (Asam Khromat 7

cc; asam asetat glacial 7cc; akuades 92 cc) dan larutan B (Formalin

30cc; akuades 70 cc). Kedua larutan ini dicampur dengan

perbandingan 1 : 1jika akan diakpai,

- Campuran yang mengandung K – bikhromat, yaitu larutan

Tellyesnicky (K-bikhromat 3 g; asam asetat glacial 5 cc, dan akuades

192cc),

- Campuran yang mengandung Asam pikrat, yaitu larutan Bouin

(alrutan jenuh asam pikrat dalam akuades 75 cc, formalin 25cc, asam

asetat glacial 5cc),

- Campuran yang mengandung Hg – klorida, yaitu Larutan Worcester

(larutan jenuh Hg – klorida dalam akuades 96cc, formalin 4 cc,

larutan 10% asam asetat glacial dalam akuades 10 cc).

b. Bersifat alkalis;

- Larutan Zirkle – Eerliki; K –bikromat 1,25 g; Ammonium bikhromat

1,25 g; Cu sulfat 1 g; dan akuades 200cc.

8. Zat warna untuk pewarnaan, yaitu :

a. Zat warna alami; Brazilin, Hematoksilin, Cochineal dan derivate.

b. Zat warna sintetis;

- Acid fuchsin,

- Alizarin Red`s,

- Anilin Blue (Cotton B,

Water B, China B),

- Basic Fuchsin

(Pararosanilin),

10



Revisi 00


Halaman10 dari 44

- Bismarck Brown,

- Congo Red,

- Crystal Violet, Gentian

Violet,

- Eosin, Erythrosin,

- Fast green, Janus Green, Light

Green (Acid Green)

- Magdala Red,

- Malachit Green, Methyl Green,

- Methylene blue, methylene green,

- Neutral red,

- Nigrosin, Orange G,

- Safranin,

- Sudan III, Sudan IV,

- Scharlach R, Vital red,

- Dll.

11



Revisi 00


Halaman11 dari 44

9. Zat – zat untuk penyelidikan mikrokimia, yaitu :

- Jodium / K – Jodida, - Zn – Klorida,

- Phloroglucin, - Asam nitrat / Hg,

- Anilin, - dll.

C. CARA KERJA

Cara kerja untuk setiap latihan akan dijelaskan bersama dengan

pembahasan pada setiap topik latihan, yaitu latihan preparat keseluruhan (whole

mount), squash, preparat pollen, preparat penampang tanpa “embedding”,

preparat penampang (section), mikrometri, dan maserasi.

12



Revisi 00


Halaman12 dari 44

LATIHAN 1

PREPARAT KESELURUHAN (WHOLE MOUNT)

A. METODE

Bahan : Spirogyra sp.

Preparat : Seluruh tubuh tumbuhan kecil.

Metode : Gliserin-Xilol.

B. HASIL DAN PEMBAHASAN

a. Hasil

Gambar 1. Preparat Whole Mount dari Spirogyra sp.

dengan perbesaran 10x40.

b. Pembahasan

Pembuatan preparat tanpa section atau pengirisan (kalaupun ada

pengirisan, tujuannya untuk mengecilkan bahan) dapat dikelompokkan menjadi:

1. Preparat kering; herbarium, riker mount, dan spesimen batang.

2. Preparat basah; preparat dalam botol (museum), meteri yang terlalu

besar untuk dissection.

3. Whole mount, smear, dan maserasi.

Percobaan ini dilakukan dalam 3 hari. Bahan yang akan digunakan telah

tersedia dan telah difiksasi dengan FAA (Formalin-Aseto-Alkohol) selama 24

jam. Fiksatif yang digunakan ini tersusun atas:

- Alkohol 70%…………….90 bagian,

- Asam asetat glacial……….5 bagian, dan

- Formalin………………….5 bagian.

Proses fiksasi ini dilakukan untuk mengawetkan komponen-komponen

sel/jaringan semaksimal mungkin supaya kondisinya mendekati kondisi sewaktu

masih hidup serta menguatkan praparat agar tahan terhadapperubahan fisika

(suhu) dan kimia yang akan dilakukan pada tahap berikutnya . Dalam fiksasi,

protein yang menyusun sel/ jaringan akan mengalami perubahan komposisi/

struktur dan mengalami perubahan sifat kimia, fisika, dan biologi. Karena

perubahan-perubahan itu, maka pritein akan mengalami denaturasi yang berarti

sel itu mati. Dalam kondisi terdenaturasi, protein akan mengalami koagulasi

sehingga sel menjadi kuat. Protein itu kemudian akan mengendap sehingga akan

tetap berada pada tempatnya (sama seperti saat masih hidup).

Pencucian

Bahan yang telah difiksasi itu dicuci dengan alkohol secara bertahap 70%,

50%, 20% masing-masing selama 30 menit. Dalam pencucian dipilih bahan yang

paling banyak terkandung dalam fiksatif (dalam FAA banyak mengandung

alkohol). Pencucian ini dilakukan dengan konsentrasi alkohol yang makin

mengecil karena dalam pewarnaan akan digunakan pewarna dengan pelarut

akuades. Tahap terakhir pencucian adalah dengan akuades selama 30 menit.

Proses pencucian ini dimaksudkan untuk menghilangkan fiksatif yang masih

tersisa karena fiksatif itu dapat bereaksi dengan bahan-bahan yang akan

digunakan dalam proses selanjutnya.

Pewarnaan

Setelah proses pencucian selesai, dilakukan pewarnaan dengan Fast Green

1% dalam akuades selama 24 jam. Pewarna Fast Green digunakan agar warna

praparat sama seperti aslinya (hijau).

Dehidrasi

Pertama-tama, bahan yang telah diwarnai selama 24 jam itu dicuci terlebih

dahulu dengan akuades sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit.

Pencucian ini dimaksudkan untuk mengurangi atau menghilangkan endapan zat

warna yang tidak perlu yang masih menempel pada permukaan luar preparat

karena dapat mengganggu proses selanjutnya. Dalam pembuatan preparat ini

diperlukan proses dehidrasi karena pada tahap terakhir akan diberi Balsam

Kanada padahal zat warnanya mengandung air dan pencucian zat warnanya

menggunakan akuades yang tidak bisa bercampur dengan Balsam Kanada. Dalam

proses dehidrasi ini digunakan gliserin 10% dan dikondisikan pada suhu 60°C

selama 24 jam. Gliserin 10% merupakan campuran antara gliserin 10 ml (titik

didihnya 280°C) dengan akuades 90 ml (titik didihnya 100°C). Karena perbedaan

titik didih ini maka akuades yang terkandung akan menguap terlebih dulu

(penghilangan air). Dehidrasi dilakukan perlahan-lahan karena bahan yang

digunakan merupakan bahan yang lembut.

Pencucian

Setelah didehidrasi, bahan dicuci dengan alkohol 95% selama 30 menit

sebanyak dua kali dan alkohol 100% selama 30 menit sebanyak dua kali. Hal ini

dilakukan untuk menghilangkan akuades yang kemungkinan masih terdapat dalam

bahan.

Dealkoholisasi

Kemudian dilakukan dealkoholisasi (pembuangan alcohol) dengan

menggunakan campuran antara alkohol dan xilol. Perbandingan yang digunakan

adalah:

- Alkohol : Xilol = 9 : 1








- Alkohol : Xilol = 1 : 9, masing-masing dilakukan selama 10 menit.

Kemudian dengan Xilol selama 10 menit sebanyak dua kali. Perlakuan

alkohol : xilol ini dimaksudkan untuk menyesuaikan kondisi dari alkohol 100%

menuju xilol untuk perlakuan selanjutnya.

Mounting atau penutupan

Mounting atau penutupan. Proses yang selanjutnya dilakukan adalah

penutupan preparat. Dalam proses ini pertama-tama gelas benda diberi dengan

xilol kemudian bahan diletakkan di atasnya dan ditetesi dengan Balsam Kanada.

Kemudian ditutup dengan gelas penutup dengan hati-hati supaya tidak terbentuk

gelembung udara. Preparat kemudian dikeringkan hingga Balsam Kanada kering.

Setelah itu, preparat diberi keterangan yang berisi nama spesies, organ yang

bersangkutan, dan sebagainya.

LATIHAN II

SQUASH

Metode

Bahan : Ujung akar Allium cepa, 3mm dari ujung

Pengambilan jam 08.00 – 14.00

Preparat : 1. Pembelahan mitosis

2. Pembelahan meiosis

A. Hasil dan Pembahasan

a. Hasil

Gambar 2. Preparat squash ujung akar Allium cepa

b. Pembahasan

Pembuatan preparat dengan metode squash digunakan untuk mengamati

terjadinya pembelahan motosis dan meiosis. Pada pembuatan preparat ini

diperlukan 1 lapis sel agar dapat diamati dengan jelas peristiwa pembelahan

motosis.

Bahan yang digunakan dalam percobaan adalah ujung akar bawang merah

(Allium cepa) karena pada ujung akar Allium cepa sel-selnya selalu membelah,

dinding selnya transparan dan kromosom yang dimiliki besar sehingga

memudahkan dalam pengamatan. Alasan kenapa pengambilan ujung akar

dilakukan pada pukul 08.00 sampai 14.00 ialah karena pada waktu itu sel Allium

cepa aktif membelah.

Fiksasi

Fiksasi adalah proses yang bertujuan untuk mematikan sel dan berusaha

mempertahankan komponen sel seperti atau mendekati keadaan sewaktu hidup.

Untuk metode squash fiksasi terutama dilakukan dengan tujuan untuk

mempertahankan kondisi kromosom yang sedang membelah. Fiksasi dilakukan

dengan menggunakan Asam asetat 45% selama 15 menit pada suhu 5oC (dalam

lemari es). Asam asetat digunakan karena merupakan fiksatif yang penetrasinya

cepat sehingga kromosom dapat secara cepat terawetkan. Konsentrasi yang

digunakan tidak terlalu besar karena apabila Asam asetrat konsentrasi tinggi

ditambahkan ke dalam praparat maka akan terjadi pembengkakan. Inkubasi pada

suhu 50C dimaksudkan untuk meng-inaktivasi enzim di dalam sel.

Pencucian

Proses pencucian menggunakan akuades dilakukan sebanyak 3 kali.

Pencucian ini bertujuan untuk menghilangkan fiksatif yang dapat bereaksi dengan

bahan yang digunakan pada tahap selanjutnya, sehingga dapat mempengaruhi

hasil. Selain itu ada tujuan lain dari pencucian yaitu untuk menghilangkan kotoran

dan mencegah kenaikan suhu yang terlalu ekstrim dengan jalan menyesuaikan

suhu pada suhu kamar.

Hidrolisa

Tujuan dari proses ini adalah untuk memisahkan sel-sel (maserasi) dengan

cara melepaskan komponen lamela antar sel agar nantinya kromosom terlihat

jelas. Hidrolisa dilakukan dengan menggunakan HCl 1 N dan dipanaskan pada

temperatur 60o C selama + 2 menit. Hidrolisa dilakukan dengan HCl konsentrasi

rendah karena apabila digunakan reagen yang lebih pekat maka sel akan hancur.

Inkubasi tidak boleh terlalu lama karena apabila terlalu lama preparat tidak dapat

diwarnai selain itu sel juga bisa hancur atauinti sel memanjang melebihi ukuran

aslinya. Langkah berikutnya preparat dicuci dengan akuades sebanyak 3 kali.

Pewarnaan

Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan Acetoorcein Corecein yang

dilarutkan dalam asam asetat 45%. Pewarnaan ini cocok untuk preparat

kromosom. Preparat harus terendam agar dapat terwarnai secara sempurna.

Pewarnaan dilakukan selama + 1 jam.

Mounting

Mounting dilakukan dengan menggunakan gliserin yaitu dengan

mengambil ujung akar yang telah diwarnai kemudian diletakkan di atas gelas

benda dan ditetesi gliserin. Ujung akar yang diambil adalah bagian akar yang

terlihat lebih lancip dan terpulas lebih tebal (pekat) sepanjang ± 3 mm. Setelah itu

gelas benda ditutup menggunakan gelas penutup. Gelas penutup ditekan (tepat di

bawahnya ada ujung akar) dengan gagang pensil hingga ujung akar hancur.

Kemudian di tepi gelas penutup diolesi cat kuku/cutex untuk merekatkan gelas

penutup agar tidak bergeser. Penambahan gliserin di sini dimaksudkan untuk

menaikkan indeks bias dan menjaga kelembutan serta kesegaran bahan.

Pemberian Nama

Pemberian nama ditempatkan di sebelah kiri gelas penutup, etiket

dilekatkan dan diberi keterangan nama spesies.

Tahap mitosis yang dapat diamati ialah :

a. Interfase

Saat fase ini, sel telah siap membelah, namun belum

mempersiapkan kegiatan membelah. Inti sel tampak keruh dan akan

tampak benang kromatin yang halus.

b. Profase

Benang kromatin terlihat memendek dan lebih tebal. Kemudian

terbentuk kromosom-kromosom. Setiap kromosom membelah memanjang

dan anakan kromosom inilah yang dinamakan kromotid. Dinding sel pada

fase ini ikut membelah.

c. Metafase

Kromosom berada di bidang tengah/ekuator sehingga jumlahnya

dapat diketahui dengan jelas.

d. Anafase

Sentromer membelah dan kedua belah kromotid memisahkan diri

dan menuju sel kutub yang berlawanan. Sifat tiap kromotid memiliki

keturunan yang sama. Mulai saat itulah kromotid dianggap sebagai

kromosom baru.

e. Telofase

Pada tiap kutub sel terbentuk sel kromosom yang identik. Plasma

sel akan terbagi menjadi 2 bagian. Proses ini dinamakan sitoklinase. Pada

tambahan karena selnya berbanding maka sitokinase ditandai dengan

terbentuknya dinding pemisah di tengah sel. Tiap sel induk bersifat diploid

(2n) dan menghasilkan sel anakan yang haploid.

LATIHAN III

PREPARAT POLLEN

A. Tujuan

Latihan ini bertujuan untuk membuat suatu preparat pollen.

B. Metode

Bahan : Anthera

Preparat : Preparat pollen Hibiscus rosa- sinensis dan Lillium sp.

Metode : Asetolisis

C. Hasil dan Pembahasan

a. Hasil

Gambar 3. Preparat pollen Hibiscus rosa-sinensis dengan

perbesaran 10x40

Gambar 4. Preparat pollen Lillium sp. dengan perbesaran 10x40

b. Pembahasan

Benang sari (stamen) memiliki bagian-bagian antara lain kepala sari

(anthera) yang terletak di ujung tangkai sari (filamen) yang merupakan suatu

badan yang berbentuk jorong , bulat atau dapat juga bulat telur. Serbuk sari

merupakan bahan yang sangat lembut dan mudah beterbangan jika tertiup angin.

Dinding pollen terdiri dari dua bagian atau lapisan, yaitu:

Intin

Dinding pollen yang mengandung selulose, pektin, kalose, polisakarida

lain dan protein.

Eksin

Dinding pollen yang mengandung sporopolenin dan glikokaliks.

Sporopolenin merupakan polimer kompleks antara karotenoid dan ester

karotenoid dengan oksigen.

Dengan adanya sporopolenin tersebut maka dalam pembuatan preparat

pollen digunakan metode acetolysis, yaitu melarutkan didnding sel anthera dengan

asam asetat sehingga akan tampak transparan. Pollen yang digunakan dalam

praktikum ini adalah pollen Hibiscus rosa-sinensis dan Lillium sp.

Dalam pembuatan preparat pollen ini dilakukan beberapa proses yaitu :

Fiksasi

Fiksasi merupakan suatu proses atau usaha yang dilakukan untuk

komponen-komponen sel dan mengawetkan semaksimal mungkin mendekati

keadaan sewaktu masih hidup. Tujuan dari fiksasi adalah untuk mematikan sel

pollen, mengeraskan atau menguatkan pollen dan mengawetkan pollen.

Pollen-polen yang diperoleh dari antara Hibiscus rosa- sinensis

dikumpulkan dan dimasukkan dalam botol flakon yang berisi asam asetat glasial

kemudian didiamkan selam 24 jam. Asam asetat glasial digunakan bukan untuk

menguatkan pollen karena pollen sudah bersifat kuat (memiliki sporopolenin yaitu

polimer kompleks antara korotenoid dan ester korotenoid dengan oksigen yang

tahan terhadap proses pemecahan). Asam asetat glacial berfungsi untuk penguatan

pada proses selanjutnya dan asam asetat glacial untuk membengkakkan pollen.

Sebenarnya pollen tidak perlu difiksasi karena dinding pollen mengandung

sporopollenin (merupakan ester karotenoid) yang kuat sehingga tidak perlu lagi

untuk dikuatkan. Tetapi karena pollen akan mengalami berbagai perubahan-

perubahan baik fisik maupun kimiawi selama proses pembuatan preparat, maka

pollen tetap difiksasi.

Sentrifugasi

Setelah 24 jam, bahan dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse. Setelah itu

dilakukan sentrifus selama + 5 menit terhadap pollen sehingga pollen akan berada

dibagian atas dan berlapis-lapis tergantung berat molekulnya. Pollen yang

memiliki berat molekul yang rendah akan berada lebih atas daripada pollen yang

berat molekulny lebih tinggi. Sentrifus berfungsi untuk mengendapkan pollen.

Tahap selanjutnya cairan yang ada di tabung bersama pollen dituang, dan

penuangan dilakukan langsung sekali waktu agar pollen tidak ikut keluar.

Selanjutnya ditambahkan campuran antara AAG dengan Asam sulfat pekat

dengan perbandingan 9 : 1. Penambahan campuran kedua larutan tersebut

merupakan proses asetolisis yang berfungsi menjernihkan pollen dengan jalan

melarutkan dinding sel karena awalnya pollen berupa bahan yang tidak

transparan. Setelah ditambah campuran AAG dan Asam sulfat pekat dipanaskan

dalam waterbath selama + 3 menit. Hal ini dilakukan untuk mempercepat reaksi

asetolisis dan untuk membuka pori-pori pollen. Apabila asetolisis terlalu singkat,

zat kimia yang menempel pada pollen semuanya lisis sehingga pollen belum

transparan menjadi gelap lagi.

Pemanasan

Pollen yang telah di sentrifuse kemudian dipanaskan dalam waterbath

selama + 3 menit, pemanasan yang terlalu lama akan menyebabkan pollen

menjadi gelap atau hangus karena adanya asam sulfat pekat dan panas. Setelah itu

pemanasan dihentikan dan tabung diambil dan didiamkan selam + 15 menit.

Dilakukan pendinginan agar pollen tidak pecah untuk disentrifus lagi. Apabila

telah dingin tabung isentrifus dan cairan dituang. Lalu diganti dengan akuades dan

diforteks dan disentrifus lagi. Ulangi 2 – 3 kali dan setiap pencucian harus

disentrifus lagi. Pencucian berfungsi untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang

mungkin timbul selama proses asetolisis. Forteks berfungsi untuk meratakan

pencucian pada pollen.

Pewarnaan

Pewarnaan pollen dilakukan dengan menggunakan Safranin 1% dalam

akuades + 2 tetes dan ditambah dengan sedikit akuades agar warna yang didapat

tidak terlalu pekat. Digunakan safranin 1% (konsentrasi rendah) karena apabila

menggunakan pewarna yang memiliki konsentrasi tinggi, pollen yang transparan

akan menjadi gelap lagi. Lalu dilakukan forteks dan sentrifus lagi. Forteks

digunakan untuk meratakan proses pengecatan pollen.

Penutupan

Setelah larutan safranin dibuang dan diganti dengan gliserin jelly

menggunakan batang gelas sambil dipanaskan, tetapi jangan sampai mendidih

atau timbul gelembung udara karena gelembung udara ini akan terlihat hitam dan

mengganggu pengamatan preparat. Bahan diambil dengan batang gelas lalu

ditaruh di gelas benda kemudian ditutup dengan gelas penutup yang zat-zatnya

diberi potongan parafin. Dipanaskan lagi agar potongan parafin meleleh. Parafin

yang telah meleleh digunakan sebagai perekat atau penyegel gelas penutup agar

pollen tidak bergeser-geser.

Fungsi pemberian gliserin jeli adalah :

a) Menjaga kesegaran atau kelembaban

b) Meningkatkan indeks bias

c) Tidak mudah menguap seperti air karena titik didih gliserin jeli 280° C

d) Mencegah agar preparat tidak bergeser kerena gliserin jeli (gelatin)

berbentuk padat pada suhu ruang

Pemberian nama

Di sebelah kiri gelas penutup dilekatkan etiket dan diberi keterangan :

nama species, preparat yang bersangkutan, dsb.

LATIHAN IV

PREPARAT PENAMPANG TANPA EMBEDDING

A. Tujuan

Latihan ini bertujuan untuk membuat suatu preparat penampang tanpa

embedding.

B. Metode

Bahan : Batang Theobroma cacao

Preparat : Preparat Irisan Melintang Batang Theobroma cacao


a. Hasil

Gambar 5. Preparat penampang melintang batang dengan metode

preparat penampang tanpa embedding pada perbesaran tanpa

embedding pada perbesaran 10x10

b. Pembahasan

Preparat penampang batang dilakukan dengan menggunakan teknik tanpa

embedding karena batangnya sudah keras, sehingga tidak perlu ditanam ke

kentang, wortel, atau lilin. Sebelum pengirisan batang, pisau pemotong diolesi

Alkohol 70% sebagai pelicin agar pengirisan batang tidak retak. Kemudian batang

dipotong dengan Slidding Microtome dengan tebal 0,01 mm dengan secara

melintang artinya pemotong tegak lurus dengan panjangnya batang. Pemotongan

membujur radial dan tangensial adalah batang dipotong sejajar dengan arah

panjang batang. Selain sebagai pelicin, Alkohol 70% berguna sebagai fiksatif

preparat dalam larutan FAA. Pewarna preparat adalah Safranin 1% yang berwarna

merah. Safranin merupakan cat yang umumnya digunakan untuk mewarnai lignin

dan bersifat basa (basic stains). Penggunaan safranin dikarenakan penyusun

bagian dalam batang bersifat asam. Hasil pada gambar menunjukkan penampang

melintang batang yang terdiri dari beberapa lapisan (struktur anatomi).

Langkah-langkah pembuatan preparat penampang lintang batang dengan

teknik tanpa embedding adalah sebagai berikut :

Fiksasi

Fiksasi dilakukan dengan menggunakan Alkohol 70%, asam asetat, dan

formalin (larutan FAA). Tujuan fiksasi adalah untuk mempertahankan komponen-

komponen sel agar benda pada tempatnya, untuk menguatkan bahan dan

memudahkan pengecatan. Fiksasi dengan menggunakan FAA karena bahan yang

digunakan kayu cokelat yang sudah keras, sehingga digunakan Alkohol 70% agar

permukaan kayu licin. Fiksasi dilakukan selama 24 jam.

Pengirisan

Setelah difiksasi di dalam botol flakon, lalu dikeluarkan dan diiris dengan

menggunakan slidding microtome dengan ketebalan yang sudah diatur, berkisar

20 – 30 mikrometer. Irisan dilakukan secara melintang agar seluruh jaringan dapat

terlihat. Semua irisan ditampung dalam botol flakon yang sudah diisi dengan

alkohol 70%.

Pewarnaan

Proses selanjutnya adalah pewarnaan menggunakan safronin 1% dalam

alkohol 70% selama 24 jam. Safranin adalah zat pewarna basa (basic stain) yang

dapat mewarnai lignin. Dengan pewarnaan dinding sel, porontim dan sklerenkim

yang mengandung lignin diharapkan dapat diamati dengan jelas di bawah

mikroskop.

Pencucian

Setelah 24 jam cairan safranin dibuang dan diganti berturut-turut dengan

alkohol 70%, 80%, 95%, 100%, dan 100%. Masing-masing perlakuan dilakukan

selama 10 menit, untuk alkohol konsentrasi 100% dilakukan sebanyak dua kali.

Fungsi pencucian adalah untuk menghilangkan sisa-sisa fiksatif dan bekas

pewarnaan.

Dealkoholisasi

Karena medium untuk menutup preparat adalah xilol, maka harus

dilakukan dealkoholisasi untuk menarik molekul alkohol. Dealkoholisasi ini

dilakukan secara bertahap agar preparat tidak rusak dengan menggunakan

campuran alkohol dan xilol dengan perbandingan :

Alkohol : xilon = 3 : 1

Alkohol : xilol = 1 : 1


Xilol I

Xilol II

Masing-masing dilakukan selama 10 menit. Fungsi dealkoholisasi adalah

untuk menghilangkan sisa-sisa fiksatif dan bekas pewarnaan.

Penutupan

Irisan dalam botol flakon kemudian diambil satu irisan dan diletakan

diatas gelas benda. Selanjutnya diberi Balsam Kanada dan ditutup dengan gelas

penutup lalu diatas hot plate dengan temperatur 45°C agar Balsam Kanadanya

kering. Balsam Kanada dipilih sebagai perekat gelas benda dangan gelas preparat

karena tahan lama dan preparatnya terhindar dari kerusakan atau kemasukkan

mikrobia. Setelah itu, diamati di bawah mikroskop.

Pemberian nama

Preparat diberi etiket di sebelah kiri gelas penutup dan diberi keterangan :

nama spesies, organ, penampang, dsb.

LATIHAN V

PREPARAT PENAMPANG (SECTION)

A. Tujuan

Latihan ini bertujuan untuk membuat suatu preparat penampang (section).

B. Metode

Bahan : Folium Arachis hypogea

Preparat : Penampang melintang dari daun Arachis hypogea

Metode : Parafin, pewarnaan tunggal.


a. Hasil

Gambar 6. Penampang melintang folium Arachis hypogea dengan

perbesaran 10x10

b. Pembahasan

Pembuatan preparat ini digunakan untuk bahan yang sulit untuk dipotong

seperti daun. Sehingga bahan yang akan dipotong dibuat tegar terlebih dahulu.

Pembuatan preparat section daun Arochis hypogea menggunakan embedding

parafin.

Fiksasi

Sebelum embedding bahan difiksasi dengan FAA. Daun difiksasi selama

24 jam. Dilakukan fiksasi karena daun akan mengalami perubahan fisika kimia

sehingga perlu dikuatkan agar struktur sel tidak berubah, dan sama seperti waktu

hidup. Penggunaan FAA karena memiliki sifat penguatan sedang dan daya

penetrasi yang cukup cepat.

Pencucian atau dehidrasi

Setelah proses fiksasi, bahan kemudian didehidrasi dan didealkoholisasi.

Proses dehidrasi dilakukan menggunakan alkohol dengan konsentrasi meningkat

dari 70%, 80%, 95%, 100% dan masing-masing dilakukan selama 30 menit.

Untuk alkohol 100% dilakukan sebanyak 2 kali. Bahan di dehidrasi karena

molekul air tidak dapat bersatu dengan parafin.

Dealkoholisasi

Proses dealkoholisasi menggunakan campuran alkohol dan xilol dengan

perbandingan :




Xilol I

Xilol II

Masing-masing dilakukan selama 30 menit. Kemudian untuk

dealkoholisasi yang terakhir menggunakan campuran xilol : Parafin dengan

perbandingan 1 : 9 dengan temperatur 57o C selama 24 jam. Xilol digunakan

dalam dealkoholisasi karena penetrasinya cepat, sehingga proses dealkoholisasi

berlangsung cepat.

Infiltrasi

Dilakukan infiltrasi/penyusupan dengan cara campuran xilol dan diganti

dengan parafin murni pada temperatur 57oC selama 24 jam. Fungsi dari infiltrasi

adalah untuk mengisi ruang-ruang antar sel, infiltrasi dilakukan dengan parafin.

Parafin akan mengisi bagian daun yang berongga, sehinga bentuk sel terjaga saat

dilakukan pengirisan. Infiltrasi juga bertujuan untuk menjaga hubungan antar sel

satu dengan sel yang lain dan menjaga konsistensi bahan.

Penyelubungan

Untuk memudahkan dalam pengirisan, bahan diselubungi dengan parafin.

Setelah parafin mengeras, parafin dipotong lalu ditempelkan pada holder kayu

sehingga parafin tidak hancur saat dijepit pada rotatory microtome.

Pengirisan dan perekatan

Pengirisan dilakukan dengan menggunakan rotary microtome. Pemilihan

rotary microtomo karena mampu mengiris bahan dengan ketebalan 6 – 12

mikrometer.

Pengirisan bahan yang telah diselubungi bertujuan agar bahan yang

tebal/tidak transparan menjadi transparan sehingga sel-selnya dapat dilihat dengan

jelas menggunakan mikroskop. Pengirisan dilakukan setelah parafin mengeras

(didiamkan selama 24 jam).

Parafin dijepitkan pada rotatory microtome kemudian diiris sesuai dengan

ukuran. Irisan yang didapat dilekatkan pada gelas benda yang telah diolesi

gliserin. Pemberian gliserin ini bertujuan untuk menjaga kesegaran dan

kelembaban preparat agar tidak cepat rusak. Gelas benda ditetesi air dan

diletakkan pada hot plate dengan temperatur 45° C sampai pita parafin meregang.

Pewarnaan

Preparat diwarnai dengan teknik pewarnaan tunggal menggunakan

safranin 1% dalam alkohol 70%. Pelarut warna yang digunakan adalah alkohol

atau akuades, sehingga parafin dan air harus dihilangkan. Preparat dimasukkan

dalam parafin selama 1 jam, kemudian dilakukan dealkoholisasi dengan xilol agar

dapat diberi balsam kanada.

Proses pewarnaan dan dealkoholisasi preparat folium Arachis hypogea

dengan perbandingan :

Xilol I

Xilol II




Alkohol absolut I

Alkohol Absolut II

Alkohol 95%

Alkohol 80%

Alkohol 70%

Masing-masing dilakukan selama 3 menit, setelah itu dilakukan :

Safranin 1% dalam Alkohol 70% selama 1 jam

Alkohol 70%

Alkohol 80%

Alkohol 95%

Alkohol 100%

Alkohol absolut I

Alkohol absolut II




Penutupan

Preparat diberi balsam kanada lalu ditutup dengan gelas penutup. Setelah

itu preparat dikeringkan diatas hot plate pada temperatur 45° C.

Pemberian nama

Preparat diberi etiket di sebelah kiri gelas penutup dan diberi keterangan :

nama spesies, organ, penampang, dsb.

LATIHAN VI

MASERASI

A. METODE

Bahan : Batang Aracis hypogaea

Preparat : Maserasi Batang Aracis hypogaea

Metode : Jeffrey


a. Hasil

Gambar 7. Preparat Maserasi Batang Aracis hypogaea dengan perbesaran

10x40

b. Pembahasan

Maserasi adalah suatu teknik pembuatan preparat dengan cara disuwir-

suwir untuk mendapatkan gambaran yang jelas tentang sel. Pada praktikum ini

yang akan dilihat adalah bentuk dari trakea. Preparat yang digunakan adalah

batang dari Aracis hypogaea.

Maserasi adalah proses yang sulit. Batang yang digunakan sengaja dipilih

Aracis hypogaea karena mudah dilunakkan dan disuwir. Perlakuan khusus pun

dilakukan. Dehidrasi bertingkat dilakukan untuk menghilangkan air yang

digunakan untuk mencuci. Dealkoholisasi dilakukan untuk menghilangkan

pengaruh alkohol dari proses dehidrasi dan diganti dengan xilol.

Dalam mengerjakan preparat ini memerlukan waktu 2 hari.

Hari I

a. Bahan dipotong kurang lebih 2 cm dan direbus ke dalam air hingga

tenggelam kurang lebih 1 jam.

b. Bahan diambil dan dipotong sebesar korek api.

c. Bahan direbus dengan larutan KOH 10% dalam waterbath selama kurang

lebih 3 menit.

d. Bahan dicuci dalam air mengalir selama 1 jam.

e. Bahan dimasukkan dalam Asam nitrat 10% dan Asam kromat 10% dengan

perbandingan sama, sampai bahan menjadi lunak, kemudian bahan dicuci

dalam air mengalir selama kurang lebih 1 jam.

f. Larutan diganti dengan alkohol 70% selama 30 menit.

g. Larutan dituang dan diganti lagi dengan zat warna menggunakan safranin

1% dalam alkohol 7% selama 24 jam.

Hari II

Dehidrasi dengan Alkohol bertingkat

- Alkohol 70% 30 menit





Dealkoholisasi

- Alkohol/xilol 3:1 30 menit



- Xilol 30 menit

- Xilol 30 menit

Penutupan

Satu bagian batang dihancurkan dengan cara disuwir-suwir kemudian

ditetesi dengan Balsam Kanada dan diatur diatas gelas benda, ditutup dengan

gelas penutup. Preparat dikeringkan diatas Hot Plate dengan temperatur 45 derajat

celcius hingga Balsam Kanada kering.

Pemberian nama

Pemberian nama disebelah kiri gelas penutup dan dilekatkan etiket dan

diberi keterangan nama spesies, organ, penampang, dan sebagainya.

Preparat yang tampak adalah trakhea yang berbentuk topi ini ditutup

dengan Balsam Kanada. Pengeringan dilakukan di atas Hot Plate hingga Balsam

Kanada kering. Pengeringan ini dijaga agar jangan sampai mendidih. Kalau

sampai mendidih akan terbentuk gelembung-gelembung udara yang akan

mengotori preparat.

LATIHAN VII

MIKROMETRI

A. METODE

Bahan : Pollen Lilium sp.

Pollen Hibiscus rosa-sinensis

Obyek mikrometer

Okuler mikrometer

Metode : Mikrometri


a. Hasil

Gambar 8.

b. Pembahasan

Mikrometri adalah teknik pengukuran preparat dibawah mikroskop. Teknik

ini menggunakan alat ukur khusus yang disebut mikrometer. Mikrometer terdiri dari

obyek mikrometer dan okuler mikrometer. Obyek mikrometer berbentuk seperti gelas

benda yang memiliki skala di bagian tengah yang tertutup oleh gelas penutup. Okuler

mikrometer berupa gelas bundar berskala yang diletakkan pada diafragma dalam

okuler.Satu skala obyek mikrometer adalah 0,01mm atau 10 nm. Skala ini digunakan

untuk menuntukan skala okuler mikrometer sebelum digunakan untuk pengukuran.

Setlah ditera dengan obyek mikrometer, skala okuler mikrometer berfungsi untuk

mengukur preparat.

Langkah-langkah dalam mikrometri adalah :

1. Persiapan

Mikroskop disiapkan dengan diberi obyek mikrometer dan okuler

mikrometer serta preparat yang akan diukur.

2. Mencari nilai skala okuler mikrometer dengan cara :

a. Mata ditempelkan diatas lensa okuler kemudian lensa atas okuler disetting

sehingga bayangan skala terlihat jelas.

b. Obyek mikrometer diletakkan dibawah lensa obyektif, kemudian diatur

sehingga bayangan skala obyek mikrometer dan skala tampak sejajar.

c. Titik 0 dari kedua skala diletakkan sama tinggi dengan cara

menggerakkanobyek mikrometer

d. Dicari bayangan skala dari kedua mikrometer yang berhimpit. Kemudian

dihitung jumlah skala pada bagian mikrometer, dihitung dari sklala 0

sampai skala ang berhimpit tersebut.

e. Jarak sesungguhnya antara dua skala mikrometer tertera pada obyek

mikrometer sehingga nilai skala okuler mikrometer dapat dihitung.

3. Mengukur panjang atau lebar sel

a. Obyek mikrometer diambil kmudian diganti dengan preparat. Kombinasi

obyektif, okuler dan panjang badab sel sama dengan ketika mencari nilai

skala okuler mikrometer.

b. Bayangan skala okuler mikrometer ditempatkan pada bayangan preparat

sehingga arah bayangan skala sesuai dengan panjang atau lebar preparat.

Panjang atau lebar yang dicari diperoleh dengan mengalikan jumlah

bagian skala dengan nilai skala.

DAFTAR PUSTAKA

Sutikno. 2006. Petunjuk Praktikum Mikroteknik Tumbuhan. Laboratorium

Mikroteknik dan Embriologi Tumbuhan Fakultas Biologi, Universitas

Gadjah Mada. Yogyakarta.

rink tektum

Documents