a recombinação pericentromérica e o estágio meiótico da não
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A RECOMBINAÇÃO PERICENTROMÉRICA E O ESTÁGIO MEIÓTICO
DA NÃO DISJUNÇÃO DO CROMOSSOMO 21
NA SÍNDROME DE DOWN
ANTÔNIO FRANCISCO ALVES DA SILVA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO DE 2011
ii
iii
A RECOMBINAÇÃO PERICENTROMÉRICA E O ESTÁGIO MEIÓTICO
DA NÃO DISJUNÇÃO DO CROMOSSOMO 21
NA SÍNDROME DE DOWN
ANTÔNIO FRANCISCO ALVES DA SILVA
Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia – CBB, da Universidade
Estadual do Norte Fluminense, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE - UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ FEVEREIRO DE 2011
iv
A RECOMBINAÇÃO PERICENTROMÉRICA E O ESTÁGIO MEIÓTICO
DA NÃO DISJUNÇÃO DO CROMOSSOMO 21
NA SÍNDROME DE DOWN
ANTÔNIO FRANCISCO ALVES DA SILVA
Tese apresentada ao Centro de Biociências
e Biotecnologia – CBB, da Universidade
Estadual do Norte Fluminense, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
Aprovada em 02 de fevereiro de 2011.
Comissão Examinadora:
___________________________________________________________________
Profa Regina Célia de Souza Campos Fernandes (Doutora em doenças infecciosas e parasitárias) – HEAA.
___________________________________________________________________
Profa Telma Nair Santana Pereira (Doutora em melhoramento de plantas) – UENF.
___________________________________________________________________
Prof. Álvaro Fabrício Lopes Rios (Doutor em genética e epigenética animal) – UENF.
___________________________________________________________________
Prof. Enrique Medina-Acosta (Doutor em parasitologia médica e molecular) – UENF.
(Orientador)
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta, coordenador geral do Núcleo de
Diagnóstico e Investigação Molecular – NUDIM, por toda orientação ao longo
destes anos, pela amizade, convívio, e pelo exemplo raro de dedicação científica,
que permitiram assim a formação do profissional que sou hoje.
Ao M.Sc. Filipe Brum Machado, pela co-orientação, pela amizade, conselhos e
discussões, que contribuíram de maneira efetiva para a realização deste projeto.
À Profa. Dra. Regina Célia de Souza Campos Fernandes, coordenadora clínica do
NUDIM, pelo exemplo diário de dedicação ao próximo e responsabilidade no
cumprimento do dever.
Aos Professores Dr. Álvaro Fabrício Lopes Rios e Dra. Telma Nair Santana
Pereira por aceitarem prontamente o convite para a participação como membros
titulares na banca para defesa desta dissertação, e por todas as sugestões e
correções que foram essenciais para a finalização deste trabalho.
À todo o corpo docente da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro - UENF, que direta ou indiretamente participaram efetivamente da minha
formação acadêmica.
À Profa. Érika Cristina Pavarino-Bertelli, e em especial a doutoranda Joice de
Mattos Biselli, por toda gentileza e forte colaboração com o envio das amostras
controle.
À toda equipe do NUDIM: Maria Emilce da Rosa Francelino, Hazel Nunes
Barboza, Thaís Louvain de Souza, Laís Gomes Sarlo, Cínthia Bernardes
Gomes, Viviane Lamin Lovatel e Luciana Vilar Falleiro, pelo convívio,
companheirismo, e aprendizado mútuo ao longo desses anos.
Aos amigos: Fabrício Moreira Almeida, Giliane da Silva de Souza, Renan
Modesto Monteiro, Monique Camila da Silva, Thatiana Lopes Biá Ventura,
vi
David Gitirana da Rocha e Raul Ramos Furtado Dias, pela amizade, convívio,
momentos de lazer, e por todo trabalho em equipe durante as disciplinas.
Aos amigos de mais de uma década, Sara Cristina da Silva Passos e Marcos
Vasconcelos Pinto, apesar da longa distância, por toda torcida, amizade e apóio.
Em especial...
À toda minha família, minha mãe Maria Célia, meu padrasto Rogério, minhas irmãs
Adriana e Camila, minha sobrinha Camilly, e meus afilhados Pablo e Adriano, por
todo carinho, apóio, força, e paciência, mesmo nos momentos em que precisei estar
ausente, o que foi de vital importância nesta longa caminhada.
Por último...
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF, em
particular ao Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, pela
oportunidade concedida.
À CAPES, FAPERJ, NUDIM, Hospital Escola Álvaro Álvim, e Fundação Benedito
Pereira Nunes, por todo auxílio técnico e financeiro.
vii
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................................ v
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................................ ix
LISTAS DE TABELAS ........................................................................................................................................ xi
LISTA DE GRÁFICOS ........................................................................................................................................ xii
LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................................................. xiii
RESUMO............................................................................................................................................................ xiv
ABSTRACT......................................................................................................................................................... xv
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................................................... 3
2.1 Aneuploidias humanas. .............................................................................................................................. 3
2.1.1 A síndrome de Down. ................................................................................................................................. 5
2.2 Aspectos moleculares e a expressão gênica na trissomia 21. ................................................................... 6
2.3 Fatores de risco para a não disjunção do cromossomo 21. ....................................................................... 9
2.4 Métodos usuais para o diagnóstico da síndrome de Down. ..................................................................... 12
2.5 Aplicação de marcadores STR na determinação das origens da não disjunção ..................................... 13
3. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................................. 23
3.1 Objetivos específicos. ............................................................................................................................... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................................... 24
4.1 Material biológico ...................................................................................................................................... 24
4.2 Métodos .................................................................................................................................................... 24
4.2.1 Identificação de marcadores de DNA do tipo STR no cromossomo 21. .................................................. 24
4.2.2 Predição do potencial polimórfico dos marcadores STR selecionados. .................................................. 26
4.2.3 Desenho de Iniciadores para os marcadores STR selecionados. ........................................................... 27
4.2.4 Construção de um mapa genético para os novos marcadores STR identificados. ................................. 28
4.2.5 Caracterização alélica dos novos marcadores STR identificados. .......................................................... 28
4.2.6 Determinação das origens da não disjunção e identificação dos eventos de recombinação em 21q. .... 29
4.2.7 Cálculo dos riscos relativos para a não disjunção do cromossomo 21 em MI e MII ............................... .30
4.2.8 Dados populacionais para os sistemas alélicos avaliados. ...................................................................... 30
4.2.9 Aspectos éticos. ........................................................................................................................................ 30
5. RESULTADOS ......................................................................................................................................... 31
5.1 Caracterização dos marcadores STR atualmente utilizados em análise de segregação alélica em núcleos familiares acometidos pela síndrome de Down. .................................................................................... 31
viii
5.2 Novos marcadores STR identificados na região pericentromérica do cromossomo 21. ......................... 42
5.3 Padronização do ensaio QF-PCR multiplex. ............................................................................................ 49
5.4 Validação experimental do Mpxcen21 na identificação dos eventos de recombinação. ......................... 51
5.5 Percentual de informativo do ensaio Mpxcen21 na determinação das origens da não disjunção do cromossomo 21. .................................................................................................................................................. 60
5.6 Determinação do risco relativo para a não disjunção de origem materna em MI e MII na população na coorte de estudo. ........................................................................................................................................... 62
5.7 Dados populacionais para os cinco marcadores STR incluídos no Mpxcen21. ...................................... 63
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................................. 67
7. CONCLUSÕES ......................................................................................................................................... 74
8. REFERÊNCIAS ........................................................................................................................................ 75
WEBSITES ............................................................................................................................................... 84
9. ANEXO ..................................................................................................................................................... 85
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares para a determinação dos
eventos meióticos de não disjunção do cromossomo 21.. ................................................................... 15
Figura 2: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares na identificação de
recombinação meiótica em núcleo familiar acometido pela trissomia 21.. ........................................... 16
Figura 3: Predição do polimorfismo in silico para uma marcador STR candidato.. ............................. 26
Figura 4: Sequência do produto de amplificação in silico para um marcador STR candidato.. .......... 27
Figura 5: Informações para a interpretação de um eletroferograma.. ................................................. 29
Figura 6: Eletroferogramas comparativos do perfil de amplificação de marcadores STR dinucleotídeo
e tetranucleotídeo em amostra dissômica (cariótipo 46,XY).. .............................................................. 31
Figura 7: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S369.. ............................ 34
Figura 8: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S215.. ............................ 35
Figura 9: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S1993.. .......................... 35
Figura 10: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador
D21S369.. .............................................................................................................................................. 37
Figura 11: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador
D21S215.. .............................................................................................................................................. 38
Figura 12: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador
D21S1993.. ............................................................................................................................................ 38
Figura 13: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico,
46,XY), marcador D21S369. ................................................................................................................. 39
Figura 14: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 718M2 (cariótipo
típico, 46,XX) para o marcador D21S369.. ........................................................................................... 40
Figura 15: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 356 (cariótipo
típico, 46,XY), marcador D21S215........................................................................................................ 40
Figura 16: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 707 para o marcador
D21S1993.. ............................................................................................................................................ 41
x
Figura 17: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico,
46,XY), marcador 21p10115899. .......................................................................................................... 45
Figura 18: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico,
46,XY), marcador 21p10159751. .......................................................................................................... 46
Figura 19: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico,
46,XY), marcador 21p9991707.. ........................................................................................................... 46
Figura 20: Alinhamento das sequências de referência do marcador 21q13539322.. ......................... 47
Figura 21: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico,
46,XY), marcador 21q13539322.. ......................................................................................................... 48
Figura 22: Eletroferograma representativo do primeiro ensaio da QF-PCR multiplex.. ...................... 49
Figura 23: Eletroferograma representativo do ensaio da QF-PCR multiplex otimizado.. .................... 50
Figura 24: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 03. .............................. 52
Figura 25: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 43. .............................. 53
Figura 26: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 24. .............................. 54
Figura 27: Localização dos marcadores STR mapeados em 21q. ...................................................... 57
xi
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1: Dados genômicos do cromossomo 21. .................................................................................. 7
Tabela 2: Relação de marcadores STR descritos na região 21q. ........................................................ 17
Tabela 3: Relação de marcadores STR mapeados na região pericentromérica em 21q. ................... 22
Tabela 4: Caracterização dos 20 marcadores STR descritos na região pericentromérica do cromossomo 21. .................................................................................................................................... 32
Tabela 5: Frequência alélica do marcador D21S369. .......................................................................... 41
Tabela 6: Frequência alélica do marcador D21S1993. ........................................................................ 42
Tabela 7: Caracterização dos marcadores STR inéditos mapeados entre as bandas cromossômicas 21p11.2-q21.1. ...................................................................................................................................... 43
Tabela 8: Descrição dos iniciadores específicos aos cinco novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21p. ........................................................................................................................... 45
Tabela 9: Descrição dos iniciadores específicos aos seis novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21q. ........................................................................................................................... 48
Tabela 10: Descrição dos parâmetros para otimização do ensaio Mpxcen21. .................................... 50
Tabela 11: Descrição dos marcadores STR incluídos no Mpx21. ....................................................... 51
Tabela 12: Dados comparativos quanto às origens da não disjunção para os ensaios Mpx21 e Mpxcen21. ............................................................................................................................................. 55
Tabela 13: Mapa combinado físico e de ligação para os marcadores STR utilizados no presente estudo e por Oliver et al. (2008). ........................................................................................................... 58
Tabela 14: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 09. ..................................................... 59
Tabela 15: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 14. ..................................................... 59
Tabela 16: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 23. ..................................................... 59
Tabela 17: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição idade materna no momento da concepção. .................................................................................................... 62
Tabela 18: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição recombinação ao longo de 21q. ............................................................................................................ 63
Tabela 19: Frequências alélicas para os marcadores STR 21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162 (n = 220 indivíduos). .................................................... 64
Tabela 20: Dados populacionais para o Grupo A (n = 100). ................................................................ 65
Tabela 21: Dados populacionais para o Grupo B (n = 120). ................................................................ 65
Tabela 22: Dados populacionais para o Grupo C (n = 220). ................................................................ 66
xii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Percentual de identidade entre o marcador D21S369 e sua cópia paráloga mapeada nos
cromossomos 18.. ................................................................................................................................. 36
Gráfico 2: Percentual de identidade entre o marcador D21S215 e sua cópia paráloga mapeada no
cromossomos 18.. ................................................................................................................................. 36
Gráfico 3: Percentual de identidade entre o marcador D21S1993 e sua cópia paráloga mapeada no
cromossomos 12.. ................................................................................................................................. 37
Gráfico 4: Percentual informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação do
estágio meiótico da não disjunção. ....................................................................................................... 61
Gráfico 5: Percentual de informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação
da origem parental da não disjunção. ................................................................................................... 61
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
APP – Amyloid Precursor Protein; Proteína precursora amilóide.
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool.
DSCAM – Down Syndrome Cell Adhesion Molecule; Molécula de adesão celular.
DSCR – Down Syndrome Critical Region; Região Crítica para Síndrome de Down.
ECLAMC – Estudo colaborativo latino-americano de malformações.
FAMERP – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto.
FISH – Fluorescent in situ hybridization; Hibridação in situ por fluorescência.
FMC – Faculdade de Medicina de Campos.
H – Heterozigose.
MI – Meiose I.
MII – Meiose II.
Mb – Megabase.
NCBI – National Center for Biotechnology Information; Centro Nacional de
Informações Biotecnológicas.
NUDIM – Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular.
Pb – Par de base.
PCR – Polymerase Chain Reaction; Reação em cadeia da polimerase.
PD – Poder de discriminação.
PE – Poder de exclusão.
PIC – Conteúdo de informação de polimorfismo.
QF-PCR – Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction; Reação
Quantitativa por Fluorescência em Cadeia da Polimerase.
RR – Risco relativo.
SD – Síndrome de Down.
SOD-1 – Superóxido Dismutase-1.
STR – Short Tandem Repeats.
UENF – Universidade Estadual do Norte Fluminense.
UCSC – University of California Santa Cruz; Universidade da Califórnia Santa Cruz.
UPGEM – Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular.
xiv
RESUMO A Trissomia 21 (síndrome de Down) é uma anomalia genética causada pela não
disjunção do cromossomo 21. Aproximadamente 95% dos eventos de não disjunção
ocorrem durante a meiose. O pareamento e a recombinação meiótica asseguram a
correta segregação dos homólogos e cromátides-irmãs durante a gametogênese.
Alterações nesses eventos são fatores de risco para a não disjunção;
particularmente, ausência de troca ou troca única telomérica, com desfecho em
meiose I (MI); e troca única pericentromérica, com desfecho em meiose II (MII). O
estágio meiótico da não disjunção e os padrões de recombinação podem ser
determinados por análise de segregação de marcadores polimórficos de DNA do tipo
STR (Short Tandem Repeats). Poucos marcadores STR têm sido descritos na região
pericentromérica e os três mais amplamente utilizados (D21S369, D21S215 e
D21S1993) não são únicos, tendo cópias parálogas nos cromossomos 18 e 12.
Visando contribuir para uma análise mais acurada do estágio meiótico e dos eventos
de recombinação na região pericentromérica, e assim investigar a possível
correlação desses eventos com os erros de não disjunção, neste trabalho
descrevemos cinco novos marcadores STR únicos (4 tetranucleotídeo e 1
pentanucleotídeo), identificados na região pericentromérica 21q21.1 por análise
computacional genômica comparada. Os novos marcadores exibiram taxas de
heterozigose entre 0,56-0,82 (n = 220 indivíduos), o que permitiu a correta
elucidação das origens da não disjunção e dos padrões de recombinação
pericentromérica em uma coorte de 60 núcleos familiares. Em 59 casos (98,33%) o
erro meiótico foi de origem materna; 43 (72,88%) ocorridos em MI, e 16 (27,12%) em
MII. Para identificação dos eventos de recombinação foram também genotipados 5
marcadores STR não pericentroméricos. A ausência de recombinação foi fator de
risco para não disjunção em MI (RR= 1,96 IC 95% 1,22-3,14; p=0,0005).
Recombinação (pericentromérica ou não pericentromérica) foi fator de risco para a
não disjunção em MII (RR= 4,31 IC 95%: 2,68-6,94, p=0,0172; RR= 3,25 IC 95%:
1,38-7,65; p=0,0114, respectivamente). Esses resultados indicam que ausência de
recombinação exerce um efeito protetor (RR=0,20; IC 95% 0,07-0,54; p=0,0005)
para a não disjunção em MII, enquanto que recombinação não pericentromérica um
efeito protetor para não disjunção em MI (RR=0,59; IC 95%: 0,37-0,93; p=0,0114).
Palavras-chave: Síndrome de Down, recombinação pericentromérica, não
disjunção, risco relativo.
xv
ABSTRACT Trisomy 21 (Down syndrome) is a genetic disorder caused by non-disjunction of
chromosome 21. Approximately 95% of non-disjunction events occur during
meiosis. The chromosome pairing and meiotic recombination ensure proper
segregation of homologues and sister chromatids during gametogenesis. Alterations
in these events are risk factors for non-disjunction, particularly, absence of exchange
or single telomeric exchange, with an endpoint in meiosis I (MI), and single
pericentromeric exchange with an endpoint in meiosis II (MII). The stage of meiotic
non-disjunction and recombination patterns can be determined by segregation
analysis of STR (Short Tandem Repeats) DNA polymorphic markers. Few STR
markers have been described in the pericentromeric region, and the three more
widely used (D21S369, D21S215 and D21S1993) are not unique, with paralogous
copies in chromosomes 18 and 12. Aiming at contributing to a more accurate
analysis of the stage and meiotic recombination events in the pericentromeric region,
and thus to investigate a possible correlation between those events and the errors of
non-disjunction, in this work we describe five new unique STR markers (4
tetranucleotide and one pentanucleotide) identified in the pericentromeric 21q21.1
region by comparative genomics computational analysis. The new markers exhibited
rates of heterozygosity ranging 0.56 to 0.82 (n = 220 individuals), which allowed a
correct elucidation of the origins of non-disjunction and patterns of pericentromeric
recombination in a cohort of 60 nuclear families. In 59 cases (98.33%) the meiotic
error was of maternal origin; 43 (72.88%) occurred in MI, and 16 (27.12%) in MII. To
identify recombination events five non-pericentromeric STR markers were also
genotyped. Absence of recombination was a risk factor for non-disjunction in MI (RR
= 1.96 95% CI 1.22 to 3.14, p = 0.0005). Recombination (pericentromeric or not
pericentromeric) was a risk factor for non-disjunction in MII (RR = 4.31 95% CI 2.68
to 6.94, p = 0.0172; RR = 3.25 95% CI 1.38 to 7.65, p = 0.0114, respectively). These
results indicate that absence of recombination exerts a protective effect (RR = 0.20,
95% CI 0.07-0.54, p = 0.0005) for non-disjunction in MII, whereas non
pericentromeric recombination a protective effect for non-disjunction in MI (RR =
0.59, 95% CI: 0.37 to 0.93, p = 0.0114).
Keywords: Down Syndrome, pericentromeric recombination, non-disjunction, relative
risk.
1
INTRODUÇÃO
A síndrome de Down (SD), também conhecida como trissomia 21, é a
aneuploidia autossômica mais frequentemente observada, afetando em média 1/660
neonatos (Wiseman et al., 2009). Somente na Índia, nascem por hora pelo menos
três crianças acometidas por essa anomalia cromossômica (Malini e Ramachandra,
2006).
A elevada frequência da trissomia 21 torna-se ainda mais expressiva,
considerando que indivíduos nascidos vivos acometidos representam uma
proporção relativamente pequena, todavia mais de 80% dos conceptos aneuploides
são abortados ainda no primeiro trimestre de gestação (Hassold e Sherman, 2000).
A não disjunção raramente ocorre após a fertilização (4% dos casos), porém
preferencialmente nos processos meióticos durante a gametogênese. Estima-se que
88% dos eventos de não disjunção são de origem materna; 75% destes
correspondem a erros na meiose I (MI). Erros de segregação cromossômica de
origem paterna correspondem a 8%, sem nenhuma diferença significativa entre
meiose I e II (Hassold e Hunt, 2001; Antonarakis et al., 2004).
Atualmente dois fatores de risco para não disjunção de origem materna são
amplamente referenciados: (i) idade materna avançada (>34 anos) no momento da
concepção (Lamb et al., 2005; Alves Da Silva et al., 2008); e (ii) padrões alterados
de recombinação, caracterizados por ausência de recombinação, ou trocas
genéticas sob um mecanismo de formação de quiasmas com configurações
susceptíveis a erros de segregação, os quais foram primeiramente preditos por
ocorrerem sem qualquer relação direta com a idade materna (Lamb et al., 1996;
Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Sherman et al., 2006).
Apesar da elevada ocorrência da SD, ainda pouco se conhece sobre as
causas genéticas e ambientais que estão associadas com os eventos de não
disjunção. Nas últimas décadas um grande avanço foi obtido a partir da análise de
segregação de marcadores STR em núcleos familiares com progênie acometida
(Lamb et al., 1996; Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Lamb et al., 2005;
Sherman et al., 2006; Ghosh et al., 2009).
2
Uma das estratégias para melhor compreensão deste fenômeno foi à tentativa
de uma associação entre diferentes variáveis epidemiológicas, como padrões
alterados de recombinação (Sherman et al., 2006), idade parental (Sherman et al.,
2007), e polimorfismos genéticos associados ao metabolismo anormal do folato e
hipometilação do DNA (Biselli et al., 2009) com as origens parental e meiótica da
não disjunção, as quais ocorrem em proporções variadas entre as diferentes
trissomias (Hassold e Hunt, 2001).
Quanto ao fator de risco idade materna avançada os estudos mais amplos em
termos populacionais são dos relatórios anuais online do Registro Citogenético
Nacional de Síndrome de Down da Inglaterra (http://www.wolfson.qmul.ac.uk/ndscr/).
Esses estudos ao longo dos anos confirmam que a idade materna >34 anos no
momento da concepção é fator de risco para não disjunção.
Quanto aos possíveis padrões alterados de recombinação, ausência de troca
ou evento único de recombinação na região telomérica são considerados fatores de
risco para não disjunção em MI, em contraste, evento único na região
pericentromérica é considerado fator de risco para não disjunção em meiose II (MII).
Contudo a presença de eventos duplos de recombinação em regiões proximais e
medianas parece de certa forma estabilizar a tétrade susceptível (Lamb et al., 1996;
Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Oliver et al., 2008; Ghosh et al., 2009).
Para o estudo dos eventos de recombinação são utilizados, por motivos
históricos, predominantemente um conjunto de 21 marcadores STR distribuídos em
6 intervalos de igual extensão física em 21q; porém, 85,7% desses STR são
repetições de di- e trinucleotídeos. A tipagem destes STR apresenta limitações
técnicas importantes: (i) a amplificação de subprodutos denominados stutters, que
são múltiplos dos alelos verdadeiros que dificultam a designação alélica; e (ii)
amplificação preferencial do alelo menor, com impacto importante no diagnóstico
molecular, levando a resultados falsos positivos e negativos (Alves Da Silva et al.,
2009).
Ademais a distribuição equivocada desses STR entre os 6 intervalos em 21q,
baseada na posição física de cada marcador, e a utilização de marcadores
pericentroméricos (D21S369, D21S215 e D21S1993) não únicos, com sequências
parálogas mapeadas nos cromossomos 21, 18 e 12, podem gerar resultados de
3
difícil interpretação, e a designação inconsistente de certos padrões de
recombinação na região pericentromérica do cromossomos 21, particularmente
aqueles descritos como fatores de risco para a não disjunção cromossômica (Alves
Da Silva, 2010).
Visando contribuir para a resolução desta problemática, no presente estudo,
através de análise genômica computacional comparada, foi identificado na região
pericentromérica 21p11.2-q21.1 um novo painel de marcadores STR, para o rastreio
da trissomia 21, a elucidação do estágio meiótico da não disjunção, e a identificação
de possíveis padrões de recombinação associados com os eventos de não
disjunção do cromossomo 21 na SD.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Aneuploidias humanas.
As aneuploidias humanas são anomalias genéticas, associadas à alteração
no número dos cromossomos, as quais conduzem ao estado de trissomia ou
monossomia. Estas alterações numéricas podem ser originadas por dois eventos
distintos: por erros mitóticos, que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário,
ou mais frequentemente como consequência de erros meióticos durante a formação
dos gametas (Hassold e Hunt, 2001).
Este fenômeno tipicamente resulta em incompatibilidade para a vida, e,
portanto espera-se que a não disjunção meiótica seja um evento de rara ocorrência.
Em organismos modelos, tal como Drosophila melanogaster, a probabilidade desse
evento ocorrer é relativamente baixa, em torno de 1:6000 a cada processo meiótico.
Não obstante, em modelos murinos a taxa de aneuploidia não ultrapassa 2% na
ovogênese (Hassold e Hunt, 2001).
Os processos meióticos são extraordinariamente conservados entre os
diferentes organismos. Contudo, em humanos, as divisões meióticas são
extremamente susceptíveis a erros de segregação cromossômica, tanto que a
elevada incidência dos eventos de não disjunção observada desvia-se grandemente
do que tem sido descrito para outros organismos (Hassold e Hunt, 2001).
4
Embora a base nos processos meióticos seja a mesma, a gametogênese
entre homens e mulheres apresenta diferenças intrínsecas, como: o tempo de início,
duração e número na formação de gametas viáveis (Hunt, 2006).
Em mulheres, as divisões meióticas iniciam-se durante o desenvolvimento
fetal, por volta da nona semana de gestação. Os ovócitos imaturos progridem de
maneira semi-sincronizada entre os diferentes subestágios da prófase durante a MI,
perdurando até poucas semanas após o nascimento (Bendsen et al., 2006).
No paquíteno (subestágio da prófase caracterizado pela sinapse e
recombinação entre os cromossomos homólogos), os ovócitos imaturos entram em
um estado de meiose suspensa. A primeira divisão meiótica completa-se em
mulheres sexualmente maturas, antecedendo o período da ovulação, assim sendo a
finalização da MI pode levar cerca de 10 a 50 anos. Adicionalmente, a segunda
divisão meiótica caracteriza o processo de ovulação,e completa-se apenas após a
fertilização (Hunt, 2006).
O prolongado período de suspensão da MI conduz ao acúmulo de efeitos
tóxicos que conduzem a erros de segregação tanto em MI quanto em MII, estes
incluem: (i) insultos ambientais; (ii) degradação de proteínas importantes para o
aparato meiótico; e (iii) funcionamento subótimo dos ovários por desbalanço
hormonal (Sherman et al., 2007).
Diferentemente da ovogênese, a espermatogênese inicia-se na puberdade,
progredindo de maneira contínua, sem atrasos entre a MI e MII, assim,
espermatócitos maturos são produzidos continuamente durante a fase adulta (Hunt,
2006).
Em ambos os sexos, erros podem ocorrer na gametogênese, contudo com
uma maior prevalência na ovogênese (20%) quando comparado a espermatogênese
(2%) (Hassold e Hunt, 2001).
Estima-se que 20-30% dos ovócitos humanos fertilizados sejam aneuplóides.
As implicações clínicas desse fenômeno são bastante notórias, visto que
correspondem a cerca de 1/3 dos abortos espontâneos (Hassold e Hunt, 2001;
Nagaishi et al., 2004; Hunt, 2006).
5
As causas mais comuns de morte fetal decorrentes destas alterações
cromossômicas são: a monossomia do alossomo X e as trissomias dos autossomos
16, 21 e 22, que juntas constituem 50% das alterações numéricas identificadas em
todos os abortamentos (Hassold e Hunt, 2001).
No entanto, algumas aneuploidias podem ser compatíveis com a
sobrevivência fetal, sendo responsáveis por diferentes síndromes, das quais se
destacam: Turner (45,X), Klinefelter (47,XXY), Patau (47,+13), Edwards (47,+18) e
Down (47,+21) (Adinolfi e Sherlock, 2001).
2.1.1 A síndrome de Down.
O primeiro relato da SD ocorreu ainda no século XIX no ano de 1866, através
de uma descrição detalhada dos aspectos clínicos observados em pacientes
pediátricos com semelhantes graus de dismorfismo facial e retardo mental, pelo
médico britânico John Langdon Haydon Down. Contudo, a verdadeira causa
genética só foi encontrada no século XX no ano de 1959 pelo médico francês
Jérôme Lejeune. Lejeune e colaboradores observaram que pacientes com
característica faciais semelhantes às descritas por John Down, apresentavam uma
cariótipo atípico (47,+21) composto por uma cópia extra do cromossomo 21 (OMIM
#190685).
A trissomia 21, classifica-se como a alteração numérica de maior ocorrência
no ranking das aneuploidias humanas, com uma incidência de 1 em cada 660
recém-nascidos vivos (Wiseman et al., 2009).
Entre os nascidos vivos, a apresentação clínica é complexa; algumas
características ocorrem em graus diferenciados de um indivíduo para outro, incluindo
o retardo mental e o dismorfismo facial característico. Em geral, entre os achados
clínicos reconhecíveis estão: braquicefalia, face achatada, olhos com fendas
palpebrais oblíquas e voltadas para cima, lobo auricular anormal, com implantação
baixa das orelhas, pescoço curto, boca significativamente pequena, língua protrusa,
e mãos com dedos relativamente curtos, baixa estatura e hipotonia muscular (Roper
e Reeves, 2006; Lyle et al., 2009).
A trissomia 21 está associada a inúmeras doenças; ela está entre as
principais causas de leucemia na infância. Os indivíduos trissômicos apresentam um
risco aumentado em 20 e 600 vezes de desenvolver leucemia linfoblástica aguda e
6
leucemia megacariocítica aguda, respectivamente (Fong e Brodeur, 1987; Izraeli et
al., 2007; Xavier et al., 2010). Adicionalmente, as doenças congênitas do coração
são bastante prevalentes, com uma ocorrência de 40 a 50% (Baptista et al., 2000;
Mcelhinney, 2002; Weijerman et al., 2010).
2.2 Aspectos moleculares e a expressão gênica na trissomia 21.
A trissomia 21 pode ser classificada de acordo com o tamanho do segmento
cromossômico triplicado em três categorias: trissomia livre, trissomia parcial e
microtrissomia (Dutta et al., 2005).
A trissomia livre, também conhecida como trissomia completa, é caracterizada
pela ocorrência de uma cópia inteira do cromossomo 21, como resultado de erros
meióticos ou mitóticos. A trissomia parcial consiste de um segmento triplicado acima
de 5 Mb, resultante de segregação meiótica anormal em indivíduos com rearranjo
cromossômico balanceado, sendo assim menos comum do que a trissomia livre. A
microtrissomia consiste da ocorrência de pequenas duplicações (entre 3-5 Mb),
originada por recombinação desigual durante a meiose, mediado por duplicações
intercromossômicas (Dutta et al., 2005).
O cromossomo 21 é um cromossomo acrocêntrico, e o menor entre os
autossomos, representando assim cerca de 1-1.5% do genoma humano. Desde a
descoberta da associação do estágio de trissomia deste cromossomo com a SD,
aproximadamente 20 locos foram inicialmente traçados como candidatos a uma
variedade de doenças de fundo genético, o que levou a intensivos estudos
envolvendo tanto a análise da estruturação cromossômica quanto o conteúdo
gênico. Consequentemente, o primeiro mapa de ligação, a ser descrito de maneira
ampla foi para o cromossomo 21 (Mclnnis et al., 1993). Dados de sequenciamento
indicam que este cromossomo possui 278 genes codificadores de proteínas
conhecidas (Tabela 1).
7
Tabela 1: Dados genômicos do cromossomo 21.
Dados de anotações do cromossomo 21 Comprimento (pb) 48129895
Genes codificadores de proteínas conhecidas 278
Genes codificadores de novas proteínas 2
Pseudogenes 141
Genes de rRNA 5
Genes de snRNA 13
Genes de miRNA 16
Genes de snoRNA 14
Genes de Misc RNA 8
(*) Fonte: http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Chromosome?r=21:1-48129895
Diversos estudos sugerem um aumento na expressão de muitos genes no
estado de trissomia 21. O desequilíbrio na expressão gênica pode resultar em
muitos fenótipos que caracterizam a SD. Contudo somente alguns genes são vistos
como sensíveis a dose, tal que o fenótipo provocado por estes genes é alterado pelo
numero de cópias (Yahya-Graison et al., 2007; Wiseman et al., 2009).
Um estudo envolvendo a análise de expressão gênica em linfoblástos em
pacientes SD e indivíduos com cariótipo típico, foi observado que no estágio de
trissomia, 71% dos genes ativos, são expressos sob um mecanismo de
compensação de dose. Apenas 29% dos genes ativos nesse tipo celular apresentam
um aumento na expressão no estágio de trissomia. Sendo que 22% apresentaram
um taxa de expressão dentro do esperado, na proporção 1,5:1,0 entre indivíduos
trissômicos e controle, enquanto em 7% foi observado uma amplificação da
expressão, em uma proporção superior a 1,5 (Yahya-Graison et al., 2007).
A maior parte dos genes superexpressos está contida entre as regiões 21q21
e 21q22, denominada Região Crítica para a síndrome de Down (Down Syndrome
Critical Region, DSCR) (Dutta et al., 2005).
O conceito de região crítica, que sugere que a maioria dos fenótipos são
sensíveis à dosagem gênica, tem dominado o campo das pesquisas em SD na
última década (Korenberg et al., 1990; Korenberg et al., 1994). A descrição mais
precisa da região crítica é de aproximadamente 6,7 megabases desde o limite
proximal entre os marcadores D21S17 (região 21q22.12; posição física 35.892.325-
35.892.536 pb) e D21S55 (região 21q22.13; posição física 38.012.252-38.012.412
8
pb) até um limite distal na região 21q22.3 entre os genes MX1 (homólogo do gene
em camundongos para resistência a Myxovirus; posição física 41.720.024-
41.753.008 pb) e TFF1 (trefoil factor 1, 42.655.460-42.659.713 pb) (Lyle et al.,
2009).
Contudo, um estudo em camundongos transgênicos para a região DSCR de
humanos relatou que essa região inesperadamente não causa fenótipos específicos
de dismorfismo craniofacial na versão murina (Olson et al., 2004).
Outro estudo, fundamentado no acompanhamento de pacientes com trissomia
21 e monossomia 21 parciais, demonstrou que 82% dos acometidos apresentavam
um retardo mental moderado. O segmento triplicado nesses pacientes permitiu o
mapeamento de uma região mínima para esta característica, no segmento que se
estende de 37-38 Mb, o qual esta incluso na DSCR, porém outro grupo de
acometidos onde o retardo mental também foi evidenciado o segmento triplicado
estava localizado em 26 Mb, o que contraria o conceito da existência de uma única
região crítica para SD, segundo os autores o que existe são regiões de
susceptibilidade fenotípica (Lyle et al., 2009).
Na trissomia 21 os principais genes localizados na região DSCR encontrados
de forma superexpressa são:
(i) o gene que codifica a enzima superóxido dismutase-1 (SOD-1), presente
na banda 21q22, que gera um quadro de agressão endógena constante, dada à
aceleração da reação de formação de peróxido de hidrogênio (H2O2), com a
consequente oxidação dos grupos sulfídricos e a peroxidação dos lipídios
insaturados causando assim dano celular (Dutta et al., 2005);
(ii) o gene que codifica uma molécula de adesão celular (DSCAM), localizado
entre as bandas cromossômicas 21q22.2 e 21q22.3, expresso no coração durante o
desenvolvimento cardíaco, e portanto associado às doenças congênitas do coração
(Dutta et al., 2005);
(iii) o gene que codifica a proteína precursora amilóide (APP), localizado entre
as bandas 21q11.2-21.05, é expresso no cérebro do embrião, resultando em placas
amilóides, as quais estão associadas com o retardo mental. A produção destas
placas amilóides além de contribuir para anormalidades no aprendizado conduzem a
9
uma redução na capacidade de memorização, assim, a super expressão do gene
APP constitui um fator de risco para a manifestação precoce dos sintomas da
doença de Alzheimer nos indivíduos acometidos pela SD (Dutta et al., 2005;
Wiseman et al., 2009).
(iv) o gene DYRK1A, o qual codifica uma proteína quinase (dual-specificity
proline-directed serine/threonine kinase) é super expressa no cérebro no estágio de
trissomia, sendo descrito como um dos genes correlacionados com o distúrbio
cognitivo entre os pacientes SD (Dowjat et al., 2007).
2.3 Fatores de risco para a não disjunção do cromossomo 21.
Atualmente, dois fatores de risco são amplamente aceitos para a não
disjunção do cromossomo 21: (i) idade materna avançada no momento da
concepção (>34 anos) (Morris et al., 2002) e (ii) padrões alterados de recombinação
(Sherman et al., 2006; Sherman et al., 2007; Allen et al., 2009)
Quanto ao fator de risco “idade materna avançada”, os estudos mais amplos
em termos populacionais são dos relatórios anuais online do Registro Citogenético
Nacional de Síndrome de Down da Inglaterra (http://www.wolfson.qmul.ac.uk/ndscr/).
Esses estudos ao longo dos anos confirmam que a idade materna >34 anos
no momento da concepção é fator de risco para não disjunção. O efeito idade
materna avançada está restrito aos casos de origem materna. Os casos de origem
paterna ou de origem mitótica (pós-zigótica) são independentes da idade parental
(Lamb et al., 2005).
Na Inglaterra, a frequência de acometidos pela trissomia 21 nascidos de
mulheres < 25 anos de idade é de aproximadamente 2%; aos 36 anos de idade sobe
para 10%, alcançando 33% aos 42 anos de idade (Alberman, 2002; Morris et al.,
2002).
Segundo o Estudo Colaborativo Latino-Americano de Malformações
(ECLAMC), 40% dos acometidos nascem de mulheres com idades entre 40 e 44
anos, embora mulheres nesta faixa etária sejam responsáveis por apenas 2% do
total de nascimentos (Castilla et al., 1998; Castilla e Orioli, 2004).
10
Quanto ao fator de risco “padrões alterados de recombinação”, são apontados
“ausência de recombinação ou evento único de recombinação na região telomérica”
como fator de risco para a não disjunção em MI. Para os erros em MII, uma alta
frequência de recombinação, restrita a região pericentromérica tem sido sugerida
como fator de risco para não disjunção neste estágio meiótico (Lamb et al., 1996;
Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Craig e Choo, 2005; Lamb et al., 2005;
Sherman et al., 2006; Oliver et al., 2008; Ghosh et al., 2009).
Contudo, eventos duplos de recombinação, com trocas simultâneas nas
regiões proximais e medianas foram descritos por serem capazes de estabilizar a
tétrade susceptível a não disjunção (Hassold e Sherman, 2000).
Lamb et al. (1996) descreveram um modelo idade-relacionado de dois pontos,
para a elevada frequência de não disjunção de origem materna em MI. O primeiro
ponto, envolve, no ovário fetal, a formação de um bivalente susceptível a não
disjunção (com ausência de troca ou troca única na região telomérica),o qual seria
um processo idade materna-independente. O segundo ponto, envolve, no ovário
adulto, um processamento anormal de um bivalente com configuração susceptível a
erros de não disjunção em metáfase I, e este evento seria idade-dependente,
causado pelo somatório do evento de degeneração das células ovarianas na fase
adulta, causado pelo deficit de oxigênio e aumento da concentração de gás
carbônico, e redução do pH intracelular do ovócitos.
A degeneração ovariana conduz a perda de proteínas de constituição do
aparato meiótico, como as proteínas formadoras de quiasmas e as proteínas
coesinas, as quais executam um papel fundamental para segregação normal dos
cromossomos (Brown et al., 2000).
Durante a MI, a segregação preferencial e bem sucedida dos cromossomos
homólogos sobre as cromátides-irmãs, requer um comportamento singular dos
cromossomos, que engloba: (1) a manutenção de conexões físicas entre os
homólogos na anáfase I, papel realizado pelos sítios de recombinação ou quiasmas
(Smith e Nicolas, 1998), e (2) presença de uma constrição física nos centrômeros
das cromátides-irmãs, mantendo-as anexadas uma a outra de maneira que possam
migrar para um mesmo pólo em MI (Uhlmann, 2003).
11
Neste estágio meiótico, as coesinas localizadas distalmente aos quiasmas
garantem a união dos cromossomos homólogos e provê a resistência à força
necessária exercida no alinhamento correto dos bivalentes. Até que isto ocorra, o
ponto de checagem de montagem do fuso meiótico, SAC do inglês spindle assembly
checkpoint, mantém as células em metáfase I. Uma vez que todos os bivalentes
estão corretamente alinhados, o SAC é silenciado e permite a clivagem de
complexos de coesinas localizadas ao longo dos braços dos cromossomos. A perda
desta população de coesinas permite a movimentação dos cromossomos homólogos
para pólos opostos em anáfase I. A retenção simultânea de coesinas ao redor de
centrômeros impede que as cromátides-irmãs separarem-se prematuramente,
mantendo-as unidas até o estágio de anáfase II (Craig e Choo, 2005).
Recentemente, o mosaisismo gonadal foi apontado como um importante fator
de risco para a não disjunção do cromossomo 21 (Hultén et al., 2008; Hultén et al.,
2010a; Hultén et al., 2010b). Estes autores, analisaram 12,000 células testiculares
fetais de 4 fetos masculinos (Hultén et al., 2010b), e 12,634 ovócitos de oito fetos
femininos aparentemente normais com idade gestacional entre 14-22 semanas
(Hultén et al., 2008). Embora nenhuma evidência de mosaicismo gonadal tenha sido
detectado através da análise das células germinativas primitivas masculinas
(espermatogônia), entre as células constituintes da reserva ovariana dos fetos
femininos (ovogônia), foi observado um percentual significativo de células
trissômicas para o cromossomo 21, entre 0,20-0,88%.
Em outras palavras estes dados sugerem que este tipo de mosaicismo
ovariano seja uma característica constitucional de nossa espécie, e portanto uma
das causas principais para ocorrência de concepções com trissomia 21 de origem
materna.
Este fenômeno desvia-se do dogma amplamente aceito, em que a não
disjunção primária ocorre em MI e envolve a não segregação de dois cromossomos
homólogos. Porém, segundo esses autores na realidade em MI ocorre
obrigatoriamente uma não disjunção secundária de três cromossomos 21 pré-
existentes, gerados por erros de não disjunção mitótica durante a replicação das
células germinativas primitivas femininas (ovogônias) no período embrionário,
processo que antecede as divisões meióticas que caracterizam a gametogênese
(Hultén et al., 2010a).
12
2.4 Métodos usuais para o diagnóstico da síndrome de Down.
A confirmação diagnóstica da suspeita da SD pode ser feita pelo exame de
cariotipagem por banda G, o teste laboratorial diagnóstico padrão ouro, que consiste
na visualização citogenética da cópia extra do cromossomo 21 através da coloração
por Giemsa (Shaw et al., 2008), uma vez corados, os cromossomos passam a
apresentar padrões de bandas distintos, de acordo com os níveis de condensação
do DNA. Os cromossomos corados são visualizados como uma série contínua de
bandas claras e escuras, assim, cada cromossomo, de acordo com a sua
morfologia, pode ser identificado e consequentemente quantificado.
Em países desenvolvidos, o diagnóstico pré-natal ou pós-natal é sempre
confirmado pelo teste citogenético clássico (Alberman, 2002). Enquanto, nos países
em desenvolvimento, a grande maioria dos casos é diagnosticada tardiamente, após
o parto por causas diversas, particularmente, a falta de acesso aos exames
específicos.
Na última década, visando à redução no tempo de espera para obtenção dos
resultados nos casos de suspeita clínica, que em citogenética clássica pode levar de
7-14 dias, técnicas em biologia molecular foram introduzidas para auxiliar no
diagnóstico definitivo da SD. Por exemplo: (i) a técnica de hibridação fluorescente in
situ (FISH), a qual utiliza sondas de DNA marcadas com fluorocromos, específicas a
determinadas regiões do cromossomo 21. Após hibridação das sondas, quando o
núcleo celular normal é analisado por microscopia de fluorescência, dois sinais, um
para cada cromossomo são visualizados, enquanto para as células trissômicas são
observados três sinais; e (ii) a dosagem de marcadores polimórficos de DNA do tipo
STR (Short Tandem Repeats), através da utilização da técnica de reação em cadeia
da polimerase convencional (Polimerase Chain Reaction – PCR) ou quantitativa por
fluorescência (Quantitative Fluorescence Polimerase Chain Reaction – QF-PCR),
que permite uma confirmação diagnóstica precisa e rápida da trissomia 21 (Adinolfi e
Sherlock, 2001; Nicolini et al., 2004; Ogilvie et al., 2005).
Em vários países desenvolvidos a confirmação diagnóstica por QF-PCR é
também ofertada no pré-natal (Ogilvie et al., 2005). Diferentemente da citogenética
clássica, a tipagem de marcadores STR altamente polimórficos (isto é, informativos)
em núcleos familiares (mãe, pai e acometido) permite além do diagnóstico,
determinar com precisão a origem parental e meiótica da não disjunção
13
cromossômica, e evidenciar eventos de recombinação (Hassold e Sherman, 2000;
Machatkova et al., 2005).
2.5 Aplicação de marcadores STR na determinação das origens da não disjunção e identificação dos eventos de recombinação ao longo de cromossomos 21 não disjuntos.
Os marcadores STR são sequências curtas de DNA repetidas em série
altamente polimórficas, formados por unidades de repetição constituídas por mono-
,di-, tri-, tetra-, penta- ou hexanucleotídeos. Tais marcadores de DNA não variam
somente no número ou extensão de suas unidades de repetição, mas também no
padrão de organização e distribuição destas unidades, assim, são divididos em três
categorias: marcadores STR simples (formados por unidades de repetição
idênticas); marcadores STR compostos (formados por dois tipos de unidades de
repetição); e marcadores STR complexos (formadas por diversos blocos, com
comprimento variado entre as unidades de repetição, e variação nas sequências
consenso) (Butler, 2005).
Estima-se que os marcadores STR estejam presentes em todos os
organismos eucariotos, porém ausentes na maioria dos procariotos. Os diversos
marcadores STR variam em extensão devido a inserções ou deleções (indels) de
uma ou mais unidades de repetição, que são causadas por um fenômeno molecular
conhecido como polimerase slippage. Este fenômeno é responsável por elevadas
taxas de mutação (~0,1% por loco) que conduzem à elevados graus de
polimorfismos entre este tipo de marcadores (Leclercq et al., 2007).
Este polimorfismo deriva principalmente da variabilidade em extensão destas
unidades repetição do que de sua sequência consenso primária. Não obstante
marcadores STR apresentam elevada taxa de heterozigose e presença de alelos
múltiplos. Esta característica faz desses marcadores, sequências altamente
informativas, e por isso, esses tipos de marcadores são a primeira escolha para
diversos estudos, como: mapeamento gênico, investigação de parentesco,
desequilíbrio de ligação, e diagnóstico direto e indireto de anomalias genéticas
(Ellegren, 2004).
Na SD as origens parental e meiótica de cromossomos não disjuntos podem
ser determinadas por meio da tipagem de marcadores STR, seguido do
subsequente confronto entre os genótipos observados para cada indivíduo
14
pertencente a um determinado núcleo familiar (Hassold e Hunt, 2001; Alves Da
Silva, 2007).
Para facilitar uma melhor compreensão das análises dos perfis alélicos
apresentados pelos marcadores STR, requeridos para a elucidação das origens da
não disjunção e dos eventos de recombinação, é consenso observar o raciocínio
metodológico revisado por Thomas e Hassold (2003):
(i) Se para um determinado marcador o acometido apresentar três alelos
diferentes “abc”, enquanto que o progenitor A os alelos “ab” e o progenitor B os
alelos “cd”, conclui-se que a cópia extra do cromossomo 21 foi herdada do
progenitor A, visto que o acometido apresenta ambos os alelos observados em seu
perfil, que neste caso estão ausentes no progenitor B;
(ii) Se para um determinado marcador o acometido apresentar dois alelos
diferentes “ac" em proporções quantitativas 2:1, enquanto que o progenitor A os
alelos “ab” e o progenitor B os alelos “cd” conclui-se que a cópia extra do
cromossomo 21 foi herdada do progenitor A, visto que o acometido apresenta duas
cópias do alelo “a”, que neste caso estão ausentes no progenitor B. Segue-se que
permutações deste cenário aplicam o mesmo raciocínio;
(iii) Caso os progenitores apresentem para um determinado marcador um alelo
em comum (progenitor A – “ab” e progenitor B – “ad"), o sistema alélico não é
informativo para a determinação da origem parental no acometido “aad”. Portanto,
outros sistemas alélicos devem ser analisados;
(iv) O estágio meiótico da não disjunção é convencionalmente designado usando
marcadores pericentroméricos, determinando se a heterozigose observada no
progenitor de origem é mantida (não disjunção dos cromossomos homólogos) ou
reduzida a homozigose (não disjunção das cromátides irmãs). Se a heterozigose for
mantida, conclui-se que o erro ocorreu durante a MI. Se for reduzida, o erro ocorreu
na MII ou após a formação do zigoto. Por exemplo, se o progenitor A apresentar os
alelos “ab” e o progenitor B os alelos “cd” enquanto o acometido os alelos “abc” para
o marcador STR analisado conclui-se que a não disjunção ocorreu na MI, visto que a
heterozigose do progenitor A foi mantida. Seguindo este raciocínio, caso o
acometido apresente dois alelos diferentes “ac" em proporções quantitativas 2:1,
15
conclui-se que a heterozigose observada no progenitor A foi reduzida, o que significa
que a não disjunção ocorreu na MII (figura 1).
Figura 1: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares para a determinação dos eventos meióticos de não disjunção do cromossomo 21. No cenário 1, o acometido possui para o marcador X um perfil trialélico (com dosagem de 1:1:1) caracterizado pelo genótipo abc. Neste exemplo a heterozigose do progenitor A (alelos ab) foi mantida no acometido. Este cenário é informativo de não disjunção cromossômica em MI. No cenário 2, o acometido possui para o marcador X um perfil dialélico (com dosagem de 2:1) caracterizado pelo genótipo ac. Neste exemplo a heterozigose do progenitor A foi reduzida a homozigose no acometido. Este cenário é informativo de não disjunção cromossômica em MII.
16
(v) os eventos de recombinação podem ser identificados através da observação da
transição do estado de heterozigose parental para homozigose (ou processo
inverso) entre dois marcadores adjacentes no acometido (figura 2).
Figura 2: Esquema representativo da aplicação de marcadores moleculares na identificação de recombinação meiótica em núcleo familiar acometido pela trissomia 21. Neste exemplo, o acometido possui para o marcador X um perfil trialélico (alelos a/b/c) gerado pela manutenção da heterozigose do progenitor A. Para o marcador Z o acometido apresenta um perfil dialélico (alelos f/f/h) gerado pela redução da heterozigose do progenitor A no acometido. A transição da heterozigose do progenitor A observada no marcador X para homozigose no marcador Z, é indicativo da ocorrência de um evento de recombinação entre estes dois marcadores.
17
Atualmente, para este tipo de análise existem 155 marcadores STR já
descritos ao longo da região 21q (tabela 2).
Tabela 2: Relação de marcadores STR descritos na região 21q.
Marcador STR (a)
referência NC_000021.7
(b) Referência AC_000064.1
(c) Referência AC_000153.1
(d)
Localização física (pb) Localização física (pb) Localização física (pb)
D21S369 13678220-13678394 (*)
S/A 402556-402636
D21S215 13719788-13719968 49839-49993 444023-444177
D21S1993 14375677-14375805 611042-611170 823371-823499
D21S258 14548154-14548345 783531-783722 996658-996846
D21S1228 14565099-14565350 800475-800726 1013598-1013855
D21S408 14606578-14606736 841950-842109 1055105-1055263
D21S120 14684025-14684337 919395-919705 1132516-1132826
D21S16 14752283-14752521 1000256-1000494 1213376-1213614
D21S236 14787711-14787832 1035686-1035789 1248802-1248905
D21S1911 15062607-15062732 1310468-1310595 1523505-1523632
D21S13E 15378594-15378712 1625847-1625965 1839151-1839269
D21S1431 15394402-15394573 1641655-1641826 1854959-1855130
D21S1904 15432268-15432423 1679519-1679676 1892825-1892984
D21S192 15705975-15706170 1954369-1954564 2163319-2163514
D21S1231 15749237-15749460 1997623-1997834 2206576-2206787
D21S415 15764913-15765053 2013287-2013426 2222240-2222374
D21S1234 15765779-15765935 2014152-2014308 2223100-2223260
D21S172 15860364-15860514 2108734-2108884 2317685-2317833
D21S1432 16265317-16265448 2513666-2513805 2722716-2722855
D21S1410 16357767-16357974 2606162-2606369 2814994-2815201
D21S1886 16651614-16651846 2900200-2900425 3109686-3109907
D21S225 16906408-16906776 3154724-3155092 3365288-3365656
D21S1256 18244636-18244754 4501229-4501347 4711933-4712049
D21S364 18505260-18505388 4759105-4759237 4971438-4971570
D21S406 18602486-18602628 4856316-4856458 5068700-5068842
D21S1433 18690830-18691069 4944347-4944590 5156891-5157134
D21S1899 18989654-18989820 5243116-5243292 5455619-5455795
D21S366 19258789-19258958 5512259-5512428 5724536-5724707
D21S11 19476134-19476354 5729555-5729775 5941412-5941636
D21S1414 19476187-19476473 5729608-5729894 5941469-5941755
D21S145 (*)
S/A 6093779-6094011 6311737-6311969
D21S1905 19866516-19866712 6114093-6114289 6332056-6332232
D21S1436 20264336-20264513 6513263-6513440 6729585-6729750
D21S2053 20277992-20278249 6526926-6527183 6743238-6743503
D21S1282 20524608-20524782 6773846-6774020 6990172-6990346
D21S1437 20568710-20568831 6817947-6818068 7034273-7034402
GGAA2D10 20568718-20568831 6817955-6818068 7034281-7034402
D21S1261 20795101-20795294 7044305-7044498 7260749-7260946
18
Tabela 2: (continuação).
Marcador STR (a)
referência NC_000021.7
(b) Referência AC_000064.1
(c) Referência AC_000153.1
(d)
Localização física (pb) Localização física (pb) Localização física (pb)
D21S273 20951765-20952034 7200946-7201215 7418262-7418458
D21S1441 21166842-21166993 7416041-7416197 7633309-7633466
D21S1281 21193557-21193731 7442764-7442936 7660036-7660208
D21S1922 21220691-21220840 7469903-7470052 7687170-7687319
D21S414 21350649-21350816 7599824-7599997 7817174-7817347
D21S1884 21549025-21549217 7801691-7801879 8018648-8018832
D21S214 21637395-21637637 7890058-7890300 8107325-8107577
D21S1994 22068916-22069169 8321717-8321970 8538784-8539041
D21S368 22155385-22155532 8408179-8408324 8625162-8625307
D21S1918 22224971-22225151 8479352-8479532 8696325-8696505
D21S222 22680207-22680336 8940728-8940857 9158135-9158265
D21S1409 23270598-23270778 9531119-9531315 9749093-9749289
D21S232 23661784-23661904 9921401-9921517 10139281-10139397
D21S1257 23735731-23735882 9996397-9996555 10214347-10214521
D21S1250 23868595-23868932 10128952-10129289 10346958-10347295
D21S1892 24158728-24158992 10418989-10419253 10637314-10637578
D21S1244 24191004-24191254 10451260-10451510 10670242-10670488
D21S272 24300394-24300602 10561280-10561484 10780526-10780728
D21S367 24500930-24501038 10761685-10761794 10981050-10981164
D21S1914 24544272-24544482 10805028-10805238 11024422-11024636
D21S1264 24681586-24681706 10943315-10943441 11161392-11161518
D21S230 24746377-24746487 11008119-11008229 11225873-11225983
D21S1907 25488483-25488656 11750256-11750429 11970045-11970218
D21S221 25686727-25686830 11948515-11948618 12168297-12168400
D21S265 25841422-25841597 12102955-12103133 12322692-12322867
D21S1268 26113710-26113903 12375257-12375450 12594907-12595100
D21S1253 26356304-26356485 12617849-12618030 12838956-12839133
D21S1443 26444700-26444938 12706242-12706496 12927338-12927592
D21S1896 26746000-26746210 13007569-13007779 13228692-13228902
D21S1435 26770745-26770917 13032313-13032488 13253437-13253597
D21S260 26893332-26893630 13154896-13155194 13376002-13376302
D21S269 26923055-26923318 13184607-13184866 13405716-13405975
D21S217 27340523-27340802 13601943-13602221 13823167-13823446
D21S1442 27740350-27740591 14001743-14001992 14223396-14223645
D21S2052 27740433-27740559 14001826-14001960 14223479-14223613
D21S1258 27741790-27741932 14003191-14003343 14224844-14224996
D21S210 27852150-27852267 14113672-14113789 14335360-14335477
D21S1916 27902951-27903187 14164449-14164688 14386152-14386391
D21S1915 28041889-28042062 14303293-14303466 14525323-14525496
D21S1419 28373189-28373355 14634607-14634773 14856310-14856476
D21S1226 28532166-28532283 14793538-14793661 15015210-15015333
19
Tabela 2: (continuação).
Marcador STR (a)
referência NC_000021.7
(b) Referência AC_000064.1
(c) Referência AC_000153.1
(d)
Localização física (pb) Localização física (pb) Localização física (pb)
D21S1265 28651028-28651139 14912385-14912498 15134114-15134231
D21S1227 28866980-28867104 15128406-15128526 15350083-15350203
D21S1223 29225224-29225461 15486086-15486323 15708045-15708282
D21S1421 29638786-29639026 15900035-15900275 16125059-16125299
D21S1901 29768509-29768723 16029746-16029968 16254817-16255039
D21S213 30122098-30122244 16383348-16383494 16609035-16609181
D21S226 30263502-30263663 16524761-16524922 16750463-16750620
D21S1270 30628632-30628821 16889901-16890087 17115651-17115837
D21S1239 30883957-30884213 17145516-17145772 17370979-17371235
D21S263 31143791-31144116 17404885-17405210 17630838-17631163
D21S1908 31164942-31165157 17426037-17426252 17651981-17652196
D21S1913 31350135-31350253 17611235-17611353 17838227-17838335
D21S1909 31455187-31455426 17716281-17716520 17943263-17943508
D21S1280 31504664-31505039 17765759-17766134 17992753-17993122
D21S223 32163321-32163406 18423813-18423898 18650210-18650295
D21S261 32218415-32218540 18478849-18478974 (*)
S/A
D21S262 32738177-32738324 18999936-19000083 19225655-19225802
D21S1413 32769974-32770145 19031733-19031904 19257451-19257626
D21S224 32778121-32778253 19039879-19040011 19265546-19265678
D21S1898 33531101-33531319 19795240-19795458 20074864-20075078
IFNAR 33638892-33639126 19907108-19907342 20185849-20186087
D21S1910 33871644-33871911 20149408-20149675 20428191-20428446
D21S219 34005791-34005967 20283543-20283719 20561986-20562160
D21S216 34018221-34018337 20295973-20296089 20574381-20574497
D21S235 34172099-34172275 20449813-20449989 20728299-20728469
D21S1920 34619062-34619285 20896761-20896984 (*)
S/A
D21S65 35010955-35011146 21288658-21288849 21568068-21568259
D21S1895 35272929-35273190 21550574-21550839 21829958-21830223
D21S1921 35344051-35344258 21621696-21621907 21901076-21901287
D21S1221 35801246-35801481 22078756-22078991 22357917-22358138
D21S211 35948327-35948422 22225666-22225761 22505081-22505172
D21S1283 36002398-36002582 22279737-22279921 22559134-22559316
D21S1252 36748743-36748880 23025253-23025380 23302717-23302848
D21S1222 36849899-36850135 23126384-23126612 23403692-23403920
D21S167 37117684-37117837 23394197-23394352 23671556-23671711
D21S267 37389425-37389535 23665919-23666029 23943187-23943297
D21S1900 37395390-37395639 23671884-23672133 23949157-23949408
D21S270 37752391-37752595 24028910-24029114 24306217-24306441
D21S1439 38063405-38063724 24340102-24340421 24614596-24614918
D21S1440 38063497-38063658 24340194-24340355 24614688-24614852
D21S1917 38264295-38264515 24540995-24541217 24815609-24815839
20
Tabela 2: (continuação).
Marcador STR (a)
referência NC_000021.7
(b) Referência AC_000064.1
(c) Referência AC_000153.1
(d)
Localização física (pb) Localização física (pb) Localização física (pb)
D21S1883 38420538-38420767 24696867-24697096 24968367-24968596
D21S1255 38716838-38716945 24992831-24992938 25264794-25264905
D21S1809 38811931-38812147 25087786-25088002 25360168-25360384
D21S156 39257650-39257726 25533556-25533644 25806261-25806349
D21S1891 39343298-39343403 25619200-25619305 25891873-25891970
D21S343 39428914-39429147 25704797-25705030 25977457-25977690
D21S268 39501203-39501402 25777005-25777216 26049657-26049864
HMG14 39638883-39638954 (*)
S/A (*)
S/A
D21S1412 39672158-39672587 25947976-25948405 26219072-26219489
D21S1246 39792974-39793244 26068799-26069069 26341186-26341456
D21S168 39867392-39867505 26143124-26143237 26414930-26415045
D21S416 39869555-39869677 26145287-26145409 26417095-26417219
D21S2055 40113290-40113481 26388901-26389065 26660735-26660890
D21S1893 40278478-40278588 26554342-26554454 26826066-26826178
D21S1889 40746665-40746930 27023652-27023917 27295122-27295401
D21S1906 41050684-41050855 27327298-27327471 27599347-27599520
D21S1887 41137140-41137282 27413741-27413883 27685711-27685843
D21S1235 41387325-41387436 27663633-27663762 27934415-27934544
D21S198 41397232-41397345 27673550-27673663 (*)
S/A
D21S266 41606447-41606603 27882763-27882919 28153414-28153584
D21S1224 41649801-41649948 27926178-27926325 28196834-28196981
D21S1260 41717912-41718121 27994239-27994444 28264896-28265101
D21S212 42026060-42026294 (*)
S/A (*)
S/A
D21S1225 42536520-42536738 28810958-28811174 29081903-29082121
D21S49 42772864-42773018 29048747-29048901 29317058-29317212
D21S1411 43033739-43034036 29310290-29310587 29575876-29576145
D21S1890 43672606-43672758 29954432-29954586 30216721-30216887
D21S1885 43684538-43684722 29966376-29966540 30228679-30228843
D21S1912 44402316-44402488 30683542-30683714 30948715-30948919
PFKL 44543467-44543601 30824291-30824425 31089608-31089746
D21S171 44817095-44817214 31100337-31100456 31366489-31366598
D21S1575 46860787-46861096 33149527-33149836 33416287-33416602
D21S1446 46862013-46862233 33150753-33150973 33417519-33417739
(a) Nomenclatura do marcador STR. Por convenção os marcadores de DNA extragênicos são nomeados de acordo com sua posição no cromossomo, seguindo um padrão ordinal (Butler, 2005). Por exemplo, o marcador STR D21S11, corresponde ao décimo primeiro marcador identificado no cromossomo 21. Sendo o prefixo “D” abreviação de DNA, “21” ao número do cromossomo, “S” abreviação do inglês single copy sequence (sequência com cópia única) e “11” a ordem na identificação deste marcador. Marcadores de DNA intragênicos são usualmente denominados de acordo com o gene no qual estão mapeados. Por exemplo o marcador STR IFNAR, vem do inglês interferon alpha receptor, pois, está mapeado no gene que codifico o receptor1 de interferon alfa.
21
(b) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano primário de referência, disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso NC_000021.7.
(c) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano alternativo de referência, baseado no genoma Celera e disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso AC_000064.1.
(d) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano alternativo de referência, baseado no genoma HuRef e disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso NC_000153.1.
(*) S/A – Sem anotações
Contudo, devido a um maior potencial informativo na discriminação inter
individual, para análise de recombinação ao longo de cromossomos 21 não disjuntos
é utilizado por diversos estudos um painel reduzido, que compreende 14 a 40
marcadores STR (Lamb et al., 2005; Oliver et al., 2008; Ghosh et al., 2009; Ghosh,
2009; Ghosh et al., 2010).
Adicionalmente, somente para a região pericentromérica do cromossomo 21
são descritos 20 marcadores STR, destes um conjunto constituído por nove
marcadores (D21S369, D21S215, D21S1993, D21S258, D21S120, D21S1911,
D21S1431, D21S1904 e D21S1432) são amplamente utilizados para os estudos de
determinação da origem meiótica da não disjunção, e dos padrões alterados de
recombinação na região pericentromérica apontados como fatores de risco para a
não disjunção em MII. Contudo a grande maioria destes marcadores são pouco
informativos, apresentando heterozigose inferior a 60% (tabela 3).
22
Tabela 3: Relação de marcadores STR mapeados na região pericentromérica em 21q.
Marcadores STR (a)
Localização física Heterozigose Observada (%)
NC_000021.7 (b)
Mapa Rutgers (c)
D21S369 13678220-13678394 pb 59%
D21S215 13719788-13719968 pb (*)
S/A
D21S1993 14375677-14375805 pb 47%
D21S258 14548154-14548345 pb (*)
S/A
D21S1228 14565099-14565350 pb (*)
S/A
D21S408 14606578-14606736 pb 51%
D21S120 14684025-14684337 pb 65%
D21S236 14787711-14787832 pb 69%
D21S1911 15062607-15062732 pb 53%
D21S13E 15378594-15378712 pb 54%
D21S1431 15394402-15394573 pb 50%
D21S1904 15432268-15432423 pb 52%
D21S1231 15749237-15749460 pb (*)
S/A
D21S415 15764913-15765053 pb (*)
S/A
D21S1234 15765779-15765935 pb 69%
D21S172 15860364-15860514 pb 74%
D21S1432 16265317-16265448 pb 69%
D21S1410 16357767-16357974 pb 35%
D21S1886 16651614-16651846 pb 34%
D21S225 16906408-16906776 pb (*)
S/A
(a) Nomenclatura do marcador STR pericentromérico.
(b) Posição física do marcador STR em pares de base de acordo com informações obtidas no genoma humano primário de referência, disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o número de acesso NC_000021.7.
(c) Heterozigose observada na construção do mapa genético humano Rutgers (Rutgers Map Vs.2, (Matise, 2007). O mapa Rutgers é o mapa mais denso até o momento, incluindo o maior conjunto de marcadores STS e SNP, totalizando um número de 28.121 marcadores polimórficos. Este mapa combina dados de genotipagem dos bancos CEPH e deCODE.
(*) S/A – Sem anotações.
Assim, torna-se de grande importância a identificação de novos marcadores
STR na região pericentromérica, a fim de desenvolver um ensaio mais acurado para
o rastreio dos eventos de recombinação e determinação dos estágios meióticos da
não disjunção.
23
3. OBJETIVO GERAL
Determinar a frequência de recombinação na região pericentromérica do
cromossomo 21 e sua possível associação com a não disjunção
cromossômica na síndrome de Down.
3.1 Objetivos específicos.
Identificar por análise genômica computacional comparada novos marcadores
STR altamente informativos na região pericentromérica 21p11.2-21q21.1.
Desenhar iniciadores específicos para as regiões flanqueadoras aos novos
marcadores STR selecionados.
Validar o ensaio em reação multiplex por QF-PCR para tipagem dos novos
marcadores STR.
Criar um banco de frequências alélicas referente aos novos marcadores STR
para a população de estudo.
Determinar o estágio meiótico da não disjunção e identificar eventos de
recombinação ao longo do cromossomo 21.
Avaliar os fatores de risco “idade materna avançada” e “padrões alterados de
recombinação” calculando os riscos relativos para não disnjunção em MI e MII
na coorte de estudo.
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material biológico
Para análise de recombinação pericentromérica, foram tipadas amostras de
DNA referentes a uma coorte de 60 núcleos familiares acometido pela SD, referidas
pelo Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de São José do Rio
Preto, como parte de uma colaboração.
Para análise de frequências alélicas foram tipadas amostras de DNA de 100
indivíduos não relacionados geneticamente, pertencentes aos do bando de DNA do
NUDIM, gerado a partir de testes de parentesco, e 120 indivíduos referentes aos
genitores dos 60 núcleos familiares avaliados.
4.2 Métodos
4.2.1 Identificação de marcadores de DNA do tipo STR no cromossomo 21.
Para a identificação de marcadores STR na região pericentromérica do
cromossomo 21, foi realizado uma análise genômica computacional comparada
utilizando as informações para três sequências de referência para o cromossomo 21
presentes no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas
dos Estados Unidos – NCBI (National Center Information for Biotechnology) NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), disponíveis com os seguintes números de acesso:
NC_000021.7 para o genoma primário de referência, AC_000064.1 e AC_000153.1
para as sequências alternativas de referência, basedas nos genomas Celera e
HuRef, respectivamente.
Para tal, foi utilizado o programa Tandem Repeat Finder (Benson, 1999),
disponível online (http://tandem.bu.edu/trf), calibrado com o parâmetro de
estringência de alinhamento de {2,7,7} para correspondência, não correspondência
entre as cópias, respectivamente. Este programa utiliza um algoritmo capaz de
encontrar os elementos repetitivos pelo percentual de identidade e pela frequência
de indels (inserções e/ou deleções) comparado a uma sequência referência com
repetições perfeitas em série. Quanto maior for o número de repetições e o tipo de
repetição, maior será a pontuação final. Por exemplo: 10 repetições perfeitas de
tetranucleotídeos apresentam pontuação igual a 80 enquanto 10 de dinucleotídeos
apresentam pontuação 40. Vinte repetições dinucleotídicas fazem 80 pontos. As
sequências imperfeitas possuem pontuação menor do que as perfeitas com o
25
mesmo número de repetições, exemplo: a sequência [ACACACATACACACAC]
possui pontuação menor do que a sequência [ACACACACACACACAC] pela
descontinuidade [TA]. Os descontos na pontuação final dependem da proporção dos
erros de pareamento com uma sequência perfeita. Os parâmetros de busca das
repetições {2,3,5}, {2,5,5}, {2,5,7}, {2,7,7}) também influenciam na pontuação final. O
parâmetro que desconta o menor valor da pontuação final devido às imperfeições é
o {2,3,5}; portanto, o mais permissivo. Por outro lado, o parâmetro {2,7,7} é o mais
restritivo.
No quadro 1 está ilustrado um exemplo do resultado do programa TRF na
identificação e caracterização in silico de candidatos a marcadores STR sob o
parâmetro {2,7,7}.
Indice (a)
Período (b)
Número
Identidade % (d)
Indels % (e)
Pontuação (f)
Conteúdo ACGT (%)
de cópias (c)
A C G T
9991707--9991797 4 22.8 93 0 155 27 0 47 25
9991697 AAGAGACGTG
* *
9991707 TGGA TGGA TGGA TGAA TGGA TGGA TGGA TGAA TGGA TGGA TGGA TGGA
1 TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA
*
9991755 TGGA TGGA TGAA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGG
1 TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGGA TGG
9991798 GGTATACTTG
(a) Posição física do candidato a marcador STR em pares de base.
(b) Extensão em pares de base da unidade de repetição contituínte do marcador STR candidato (consenso TGGA).
(c) Número de cópias da unidade de repetição constitutiva do marcador STR candidato.
(d) Percentual de homologia encontrado no alinhamento da sequência referência submetida e a sequência virtula gerada pelo programa.
(e) Percentual de inserções e deleções.
(f) Valor dado pela razão e desconto das penalidades referentes ao tipo de período, número de cópias e percentual de identidade da sequência de interesse.
Quadro 1: Identificação e caracterização in silico de candidatos a marcadores STR. O programa TRF (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html) possui um algoritmo capaz de encontrar os elementos repetitivos pelo percentual de identidade e pela frequência de indels (inserções e/ou deleções) comparado a uma sequência referência com repetições perfeitas em série. Realçado em cinza a sequência referência submetida, e abaixo a sequência perfeita, com a mesma unidade de repetição gerada virtualmente pelo programa. Asteriscos realçados em negrito representam os polimorfismos entre as sequências. Para cada polimorfismo encontrado, penalidades são geradas (de acordo com o parâmetro utilizado), seguidas da redução da pontuação total.
26
Após varredura da região pericentromérica, em uma primeira triagem, foram
selecionados os marcadores STR do tipo tetranucleotídeo e pentanucleotídeo com
pontuação mínima de 80 e identidade igual ou superior a 85%.
Para a verificação da unicidade dos marcadores STR selecionados, foi
realizada uma análise genômica comparada através de alinhamento de sequências
utilizando a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
disponível no banco de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information,
USA – www.ncbi.nlm.nih.gov).
4.2.2 Predição do potencial polimórfico dos marcadores STR selecionados.
Para a predição do potencial polimórfico dos marcadores STR selecionados,
foi realizado uma análise genômica comparada através do alinhamento das três
sequências referências disponíveis para o cromossomo 21 (NC_000021.7,
AC_000064.1 e AC_000153.1) utilizando o recurso online Multiple Sequence
Alignment por CLUSTALW (http://align.genome.jp/). Para tal, foi elaborada uma
escala com índice de 1-3, índice 1 para uma única forma alélica, índice dois para
duas variações alélicas, e índice 3 para três variações alélicas nos três genomas
referência (figura 3).
Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 181 pb
Sequência 2: ref|AC_000064.1|cromossomo_21 155 pb
Sequência 3: ref|AC_000153.1|cromossomo_21 150 pb
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
**************************************************
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACT
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACTC--------------------A--
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACA-------------------------A--
**********************
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CTCAGTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ----GTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 ----GTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
**********************************************
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
******************************
Figura 3: Predição do polimorfismo in silico para uma marcador STR candidato. As sequências referências NC_000021.7, AC_000064.1 e AC_000153.1 foram alinhadas e comparadas para a identificação de variações alélicas. Para tal, foi utilizado o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). O polimorfismo é destacada em realce amarelo. Em realce vermelho as variações alélicas determinadas. O índice de polimorfismo deste candidato a marcador STR é três em uma escala de um a três.
27
4.2.3 Desenho de Iniciadores para os marcadores STR selecionados.
Para o desenho de iniciadores específicos aos marcadores selecionados,
foram utilizados os programas livres e online: OligoPerfect™ Designer da
Invitrogen™ (http://www.invitrogen.com/) e o OligoCalc - Oligonucleotide Properties
Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html).
Os iniciadores foram sintetizados pela Applied Biosystems, USA, com as
seguintes fluorescências 6-FAMTM, VICTM, NEDTM e PETTM.
Para avaliar a complementaridade específica de cada par de iniciadores as
regiões flanqueadoras dos marcadores de interesse, foi utilizada a ferramenta online
iPCR – UCSC ( in silico PCR University of California Santa Cruz, USA –
http://www.genome.ucsc.edu).
Na figura 4, está ilustrado um exemplo da validação in silico de iniciadores
pelo programa iPCR – UCSC.
>chr21:9991594+9991944 351bp CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA
CATGCAGGCTCCTGAGAGTAaattccacaaatgtccaccagtctcctttc
tctttggtctatgtttccatcatgtgcatggattagtttgtgtaagtgtg
ttgaagagacgtgtggatggatggatgaatggatggatggatgaatggat
ggatggatggatggatggatgaatggatggatggatggatggatggatgg
atggggtatacttgctcatgtgcctgtgtgtgtatagttctatgcacact
tatgctgacgggtgactttaactatttattgctcacctttctttcgcagg
tgcctcctcggttgctcctttaaattcacTTGTCTGTGGACTAGTGGATG
A
>chr13:18965345+18965652 308bp CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA
CATGCAGGCTCCTGAGAGTAaatttcacaaacctccatcagtctcctttc
tccttggtctatgtttccatcatgtgcatggattagtttgtgtacgcgtg
ttgaagagaagtgtggatggatggatggatggatggatggatggatggat
ggatggatatatttgctcatatgcctgtgtgtgtgtatagttctatgcac
acttatgctgacgggtgactttatttaactatttattacttacctttctt
tcgcaggtgcctcctcggttgttcctttaaattcgtTTGTCTGTGGACTA
GcGGATGA
>chrY:27070580-27070891 312bp CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA
CATGCAGGCTCCTGAGAGTAaattccacaaatgtccatcagtctcctttc
tctttggtctgtttccatcatgtgcatggattagtttgtgtacatgtgtt
gaagagaagtgtggatggatggatggatggatggatggatggatggatgg
atcgatggatggatatatttgctcatgtgcctgtgtgtgtatagttctat
gcacacttatgctgacggatgactttatttaactatttattactcacgtt
tctttcgcaggtgtctcctcggttgtgcctttaaattcatTTGTCTGTGG
ACTAGTGGATGA
Figura 4: Sequência do produto de amplificação in silico para um marcador STR candidato. Em realce amarelo alocalização física desta sequência no genoma primário de referência NC_000021.7. Em realce azul e vermelho, as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. O par de iniciadore utilizado gerou in silico dois fragmentos, um de 308pb no cromossomo 13, e outro de 312pb no cromossomo Y, e programa utilizado foi o iPCR do browser da UCSC (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start.
28
4.2.4 Construção de um mapa genético para os novos marcadores STR identificados.
Para a construção do mapa genético foram utilizadas as informações do
Rutgers Map, mapa combinado físico e de ligação do genoma humano elaborado
por pesquisadores da Universidade Rutgers - Filadélfia (Kong et al., 2004; Matise,
2007), também disponível online (http://compgen.rutgers.edu/maps/). O Rutgers é o
mapa de ligação mais denso e informativo existente até o presente. Somente para o
cromossomo 21, existem informações sobre o mapeamento de 425 marcadores, 140
do tipo PCR-específico ou STS do inglês Sequence Tagged Site; e 285 com
polimorfismo de base única ou SNP do inglês Single Nucleotide Polymorphism.
Essas informações foram utilizadas para, por meio de interpolação, estimar a
distância genética de cada marcador selecionado neste estudo, uma vez conhecida
a posição física de cada marcador candidato.
4.2.5 Caracterização alélica dos novos marcadores STR identificados na região pericentromérica do cromossomo 21.
Os novos marcadores STR foram tipados pelo método da reação em cadeia
da polimerase quantitativa por fluorescência (QF-PCR) em sistema multiplex
(amplificação simultânea de diversos locos em uma única reação).
Aos produtos de amplificação foram adicionados formamida (Hi-Di
Formamida, Applied Biosystems) e o padrão de peso molecular GeneScan LIZ 500,
marcado com o fluorocromo LIZTM (fluorescência laranja) (Applied Biosystems). Os
produtos de amplificação foram separados por eletroforese em capilar com o
polímero POP 4 (contendo 4% de acrilamida), utilizando o sequênciador ABI PrismTM
310 Genetic Analyzer.
Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando os programas
GeneScanTM e GenotyperTM (Applied Biosystems).
Os alelos tipados foram designados de acordo com o tamanho em pares de
base do fragmento amplificado. As informações para a interpretação de um
eletroferograma estão resumidas na figura 5.
29
Figura 5: Informações para a interpretação de um eletroferograma. No eixo X, representado em A, escala em número de pares de base (pb). Em B, informações alélicas representadas, caracterização dos alelos em pares de base e dosagem alélica dada pela proporção da área do sinal de fluorescência. Em C, identificação da amostra analisada. No eixo Y, representado em D, escala da intensidade de fluorescência em unidades arbitrárias. A intensidade de fluorescência está diretamente relacionada com a quantidade de produto amplificado.
4.2.6 Determinação das origens da não disjunção e identificação dos eventos de recombinação em 21q.
Após caracterização do perfil alélico de cada núcleo familiar, a determinação
da origem parental caracterizou-se pelo confronto entre os genótipos do genitores
materno e paterno com o genótipo do indivíduo acometido, uma vez identificado no
acometido a cópia extra do cromossomo 21 e sua correspondência com o genótipo
de uma ou outro genitor, a origem parental foi então inferida (Thomas e Hassold,
2003; Alves Da Silva, 2007; Ramírez et al., 2007; Ghosh et al., 2010).
Para a determinação do estágio meiótico de não disjunção, seguiu-se o
critério da observação da manutenção ou redução da heterozigose do parental que
originou a trissomia no acometido. Se mantida, foi inferido um evento de não
disjunção durante a MI (erro de segregação entre cromossomos homólogos). Se
reduzida, foi inferido um evento de não disjunção durante a MII (erro de segregação
entre cromátides-irmãs) (Thomas e Hassold, 2003; Alves Da Silva, 2007; Ramírez et
al., 2007; Ghosh et al., 2010).
30
A identificação dos eventos de recombinação baseou-se no critério da
observação da transição da heterozigose para homozigose (do parental que originou
a trissomia), ou processo inverso, no acometido entre dois marcadores adjacentes.
Se observada esta transição de informações quanto ao estágio meiótico entre dois
marcadores foi inferido um eventos de recombinação entre esses dois pontos
(Thomas e Hassold, 2003; Alves Da Silva, 2007; Ramírez et al., 2007; Ghosh et al.,
2010).
4.2.7 Cálculo dos riscos relativos para a não disjunção do cromossomo 21 em MI e MII.
Para a verificação da existência de forças de associação, e
consequentemente calcular o risco relativo (RR) para a não disjunção, os dados
obtidos com a tipagem dos marcadores STR foram subdivididos de acordo com as
variáveis observadas, e gerenciados utilizando o programa Epidata versão
3.1(Lauritsen e Bruus, 2008) e analisados com o programa Epidata Analysis
v2.2.1.171.
4.2.8 Dados populacionais para os sistemas alélicos avaliados.
Dados populacionais relevantes: PD, poder de discriminação; PIC, conteúdo
de informação de polimorfismo; PE, poder de exclusão; H, heterozigose observada,
e as frequências alélicas para cada marcador STR analisado, foi estabelecido,
através do programa PowerStats, um programa executável em uma planilha de
Microsoft Excel (http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats/).
O teste exato do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p >0.05) foi executado
utilizando o programa DNAView (Brenner, 1997), os genótipos observados e
esperados foram analisados através de 30.000 simulações de Monte Carlo.
4.2.9 Aspectos éticos.
Todas as amostras de DNA foram coletas perante assinatura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (anexo). A coleta foi realizada por profissional
autorizado que referenciou o estudo com o encaminhamento para o NUDIM.
O presente estudo foi aprovado sob a folha de rosto nº 347482, pelo Comitê
de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Campos – FMC, devidamente
constituído nos termos das resoluções nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde.
31
5. RESULTADOS
5.1 Caracterização dos marcadores STR atualmente utilizados em análise de segregação alélica em núcleos familiares acometidos pela síndrome de Down.
Para a caracterização dos marcadores STR amplamente utilizados em análise
de segregação alélica em núcleos familiares acometidos pela SD, foi realizado
primeiramente uma revisão bibliográfica destes marcadores.
Ao longo da região 21q foram encontradas na literatura informações sobre
155 marcadores STR. A análise genômica computacional comparada, revelou que
64,5% (n=100) destes marcadores são dinucleotídeos, 2,6% (n=4) trinucleotídeos,
14,2% (n=22) tetranucleotídeos e 18,7% (n=29) correspondem a marcadores com
sequências complexas, constituídas por dinucleotídeos associados a diferentes tipos
de unidade de repetição.
Destes marcadores STR, 85% correspondem a um conjunto de sequências
simples e complexas de di- e trinucleotídeos. Estes apresentam após amplificação
por PCR, perfis de difícil interpretação, devido a limitações técnicas intrínsecas a
amplificação de marcadores di- e trinucleotídeos, que consistem em: (i) formação
de produtos stutters (múltiplos do alelo verdadeiro); (ii) amplificação preferencial do
alelo menor, que em testes moleculares pode conduzir a resultados falsos positivos
ou falsos negativos (figura 6).
Figura 6: Eletroferogramas comparativos do perfil de amplificação de marcadores STR dinucleotídeo e tetranucleotídeo em amostra dissômica (cariótipo 46,XY). Em (A) foi utilizado o marcador STR D21S1270, o qual apresenta uma sequência complexa formada pelo consenso (TG)n/(ATAG)n. Setas em vermelho na vertical evidenciam os produtos stutters formados durante o processo de amplificação, e seta em azul na horizontal evidencia a amplificação preferencial do alelo menor, inerente a amplificação deste tipo de repetição. Em (B) foi utilizado o marcador D21S226, o qual apresenta uma sequência simples formada pelo consenso (ATAA)n. Setas na vertical demonstram a ausência de formação de produtos stutters na amplificação deste marcador.
32
Quanto a região pericentromérica, foram encontrados referenciados na
literatura 20 marcadores STR mapeados na região 21q21.1. Destes, 75% são
dinucleotídeos,10% trinucleotídeos e 15% tetranucleotídeos.
A análise genômica computacional comparada dos três genomas de
referência, NC_000021.7; AC_000064.1 e AC_000153.1, disponibilizados pelo
Centro Nacional de Biotecnologia – NCBI, revelou que embora 95% desses
marcadores STR apresentassem um alto potencial polimórfico in silico, dos 14
marcadores com validação da frequência alélica (Mapa Rutgers) apenas 35%
apresentaram heterozigose > 60% (tabela 4).
Tabela 4: Caracterização dos 20 marcadores STR descritos na região pericentromérica do cromossomo 21.
Marcador Período
(b)
Sequência Número Identidade (e)
Pontuação
(f)
Índice de Heterozigose (%)
STR (a)
Consenso (c)
de cópias (d)
(%) Polimorfismo (g)
Mapa Rutgers (h)
D21S369 2 (TA) * (TG) 33.5/15.5 87/100 35/62 2 59%
D21S215 2 (CA) 20.5 100 82 2 (*)
S/A
D21S1993 3 (TTA) * (TAG) 5.0/10.7 100/100 30/64 1 47%
D21S258 2 (GT) 25.0 100 100 2 (*)
S/A
D21S1228 2 (TA) * (TG) 10.0/7.5 100/100 40/30 2 (*)
S/A
D21S408 2 (AC) 9.5 100 38 2 51%
D21S120 2 (TG) 18.0 100 72 2 65%
D21S236 2 (AC) 19.5 100 78 2 69%
D21S1911 2 (AC) * (CA) 12.5/8.5 100/100 50/34 2 53%
D21S13E 2 (GT) 17.0 100 68 1 54%
D21S1431 3 (CTA) * (TGT) 10.3/2.6 100/88 62/40 1 50%
D21S1904 2 (TG) 15.5 100 62 3 52%
D21S1231 2 (TG) * (TA) 7.5/7.5 100/100 30/30 2 (*)
S/A
D21S415 2 (AC) * (AG) 19.5/10.5 100/100 78/42 3 (*)
S/A
D21S1234 2 (AC) 19.5 100 78 2 69%
D21S172 2 (TG) 20.0 100 80 3 74%
D21S1432 4 (TATC) 15.5 87 92 2 69%
D21S1410 4 (ATCT) 14.5 85 80 1 35%
D21S1886 2 (GT) 22.0 100 88 3 34%
D21S225 4 (AAAT) 8.8 100 70 1 (*)
S/A
33
(g) Nomenclatura do STR pericentromérico.
(h) Período do marcador STR, dado pela extensão em nucleotídeos da unidade de repetição. Por exemplo, período igual a 2, corresponde a uma unidade de repetição constituída por um dinucleotídeo.
(i) Sequência primária em nucleotídeos da unidade de repetição constitutiva do marcador STR.
(j) Número de cópias das unidades de repetição constitutiva do marcador STR.
(k) Percentual de homologia dado pelo alinhamento da sequência referência de interesse com
outra perfeita constituída por período, unidade consenso e número de cópias idênticos.
(l) Valor dado pela razão e desconto das penalidades referentes ao tipo de período, número de cópias e percentual de identidade da sequência de interesse.
(m) Predição do polimorfismo in silico, dado pela análise combinada dos três genomas humanos
de referência disponíveis no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob os códigos de acesso: NC_000021.7, AC_000064.1 e AC_000153.1. Para esta análise foi estipulada uma escala de 1-3, sendo índice 1 para a observação de uma única forma alélica, índice 2 para duas variações alélicas, e índice 3 para três variações alélicas em um determinado loco.
(n) Heterozigose observada na construção do mapa genético humano Rutgers (Rutgers Map
Vs.2, (Matise, 2007). O mapa Rutgers é o mapa mais denso até o momento, incluindo o maior conjunto de marcadores STS e SNP, totalizando um número de 28.121 marcadores polimórficos. Este mapa combina dados de genotipagem dos bancos CEPH e deCODE.
(*) S/A – Sem anotações.
34
Adicionalmente, os três marcadores STR descritos mais próximos à região
centromérica, D21S369, D21S215 e D21S1993 (figuras 7, 8 e 9) não são únicos ao
cromossomo 21. Cópias parálogas foram identificadas nos cromossomos 18
(D21S369 e D21S215) e 12 (D21S1993). A análise computacional comparada por
alinhamento de sequências específicas, revelou correspondências alélicas entre os
marcadores D21S369 e D21S215 para os genomas referência NC_000018.8
(cromossomo 18), AC_000064.1 e AC_000153.1 (cromossomo 21) (figura 7 e 8).
Sequência 1: ref|NC_000021.7|cromossomo_21 175 pb
Sequência 2: ref|NC_000153.1|cromossomo_21 81 pb
Sequência 3: ref|NC_000018.8|cromossomo_18 81 pb
1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCATCTATTTATACATATATATAT
2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCATCTATT---------------
3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCATCTATT---------------
***********************************
1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 ACACACATATATATGTGTGTATATATATATACACACACATATATATATAT
2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 --------------------------------------------------
3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 --------------------------------------------------
1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 ATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATATATATATATTCAACT
2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 -----------------------------TATATATATATATATTCAACT
3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 -----------------------------TATATATATATATATTCAACT
* *******************
1) ref|NC_000021.7|cromossomo_21 AGATTCAGCATTTAGCCAAGGCCAT
2) ref|NC_000153.1|cromossomo_21 AGATTCAGCATTTAGCCAAGGCCAC
3) ref|NC_000018.8|cromossomo_18 AGATTCAGCATTTAGCCAAGGCCAC
************************
Figura 7: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S369. As sequências alélicas correspondentes a um fragmento de 175pb para o genoma referência NC_000021.7, e 81pb para os genomas referência AC_000153.1 e NC_000018.8 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. Correspondência do alelo 81 foi observada entre as sequências de referência AC_000153.1 e NC_000018.8.
35
Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 181 pb
Sequência 2: ref|AC_000064.1|cromossomo_21 155 pb
Sequência 3: ref|AC_000153.1|cromossomo_21 155 pb
Sequência 4: ref|AC_000018.8|cromossomo_18 155 pb
Sequência 5: ref|AC_000150.1|cromossomo_18 173 pb
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 TCTAAAACAGTGTGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAAA
**************************************************
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACT
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACTC--------------------A--
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 TTATATGTCACACACACACACACACTC--------------------A--
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 TTATATGTCACACACACACACACACTC--------------------A--
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 TTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACAC--------T
************************* *
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CTCAGTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ----GTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 ----GTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 ----GTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 CTCAGTCACCTAATCAGAAAAACAAGAAACTGATTTTCTTTAGATTCTCA
**********************************************
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GAGTGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 GAATGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 GAGTGACAACACTCACAACTGTCACGTCAGC
** ****************************
Figura 8: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S215. As sequências alélicas correspondentes a um fragmento de 181pb para o genoma referência NC_000021.7, 155pb para os genomas referência AC_000064.1, AC_000153.1 e NC_000018.8, e 173pb para o genoma AC_000150.1 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente. Correspondência do alelo 155 foi observada entre as sequências de referência AC_000064.1, AC_000153.1 e NC_000018.8.
Sequência 1: ref|NC_000021.7|cromossomo_21 129 pb
Sequência 2: ref|NC_000012.11|cromossomo_12 115 pb
1)ref|NC_000021.7|cromossomo_21 CCGAGATTGCACCATTACTCTCCAGCCTGGGCAAGAAGAGTGAAACTCCG
2)ref|NC_000012.11|cromossomo_12 CCGAGATTGCACCATTACTCTCCAACCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCG
************************ ********* ***** *********
1)ref|NC_000021.7|cromossomo_21 TATCCAAAATACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTAATAATAATA
2)ref|NC_000012.11|cromossomo_12 TATCCAACATAATAG---------------TAACAATAATAATAAAATAA
******* *** ** ** * ** ****** * *
1)ref|NC_000021.7|cromossomo_21 ATAAAAAATGAGTTTCCAGGAAAAAAGAA-
2)ref|NC_000012.11|cromossomo_12 AAAATAAGCGAGTCTCCAGGAAAAAAGAAA
* ** ** **** ***************
Figura 9: Alinhamento das sequências de referência para o marcador D21S1993. As sequências alélicas correspondentes a um fragmento de 129pb para o genoma referência NC_000021.7, 115pb para o genoma referência NC_000012.11 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente.
36
Visando reduzir os possíveis erros de interpretação originados na tipagem
de marcadores STR não únicos, os iniciadores para os marcadores D21S369,
D21S215 e D21S1993 foram redesenhados.
Devido ao elevado percentual de identidade das sequências que
flanqueiam os elementos repetitivos que compõem estes marcadores STR e suas
cópias parálogas nos cromossomos 12 e 18, o qual se mantém acima de 70% em
um fragmento que se estende até 500pb a montante e a jusante (compreendendo
1kb) nos três marcadores (gráficos 1, 2 e 3), não foi possível desenhar iniciadores
exclusivos as sequências mapeadas no cromossomo 21, assim, foram selecionados
os pares de iniciadores que apresentaram menor percentual de identidade com suas
cópias parálogas nos respectivos cromossomos, figuras 10, 11 e 12.
Gráfico 1: Percentual de identidade entre o marcador D21S369 e sua cópia paráloga mapeada nos cromossomos 18. Dados obtidos a partir do alinhamento das sequências primárias de referência NC_000021.7 e NC_000018.8. Para tal, foi utilizada a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Gráfico 2: Percentual de identidade entre o marcador D21S215 e sua cópia paráloga mapeada no cromossomos 18. Dados obtidos a partir do alinhamento das sequências primárias de referência NC_000021.7 e NC_000018.8. Para tal, foi utilizada a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
98,50%
96,50%
97,50%
89,75%
93,16% 93,16%
88%
90%
92%
94%
96%
98%
100%
Início ←100pb→ ←200pb→ ←300pb→ ←400pb→ ←500pb→
Marcador D21S369
Identidade %
93%
97,66%98,33%
99% 99%
98,12%
93%
95%
97%
99%
Início ←100nt→ ←200nt→ ←300nt→ ←400nt→ ←500nt→
Marcador D21S215
Identidade %
37
Gráfico 3: Percentual de identidade entre o marcador D21S1993 e sua cópia paráloga mapeada no cromossomos 12. Dados obtidos a partir do alinhamento das sequências primárias de referência NC_000021.7 e NC_000012.10. Para tal, foi utilizada a ferramenta online BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 205 pb
Sequência 2: ref|AC_000153.1|cromossomo_21 111 pb
Sequência 3: ref|AC_000018.8|cromossomo_18 111 pb
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ********************CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCAT
2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 ********************CTAAGCTGATATAGTAAGTACATTTATCAT
3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 -------TTCAAACTTCCTGAAAGAAAGTGGCCTTGGCTAAATGCTGAAT
* * * * * * * * ** ** **
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CTATTTATACATATATATATACACACATATATATGTGTGTATATATATAT
2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 CTATT---------------------------------------------
3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 CTAGT---------------------------------------------
*** *
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ACACACACATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 -------------------------------------------------T
3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 -------------------------------------------------T
*
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GTATATATATATATTCAACTAGATTCAGCATTTAG---************
2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 ATATATATATATATTCAACTAGATTCAGCATTTAG---************
3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 GAATATATATATATATAAATAGATGATAAATGTACTTACTATATCAGCTT
************ ** ***** ** ** * * * **
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ********----
2) ref|AC_00153.1|cromossomo_21 ********----
3) ref|AC_000018.8|cromossomo_18 AGAAACATGCCT
**
Figura 10: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador D21S369. As sequências dos novos iniciadores para o marcador D21S369 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho, estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 18 (genoma referência AC_000018.8) e as sequências referências dos novos iniciadores (NC_000021.8 e AC_000153.1).
77%
84%
80%81%
77,50%
80,15%
76%
78%
80%
82%
84%
86%
Início ←100nt→ ←200nt→ ←300nt→ ←400nt→ ←500nt→
Marcador D21S1993
Identidade %
38
Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 151 pb
Sequência 2: ref|AC_000064.1|cromossomo_21 125 pb
Sequência 3: ref|AC_000153.1|cromossomo_21 125 pb
Sequência 4: ref|AC_000018.8|cromossomo_18 125 pb
Sequência 5: ref|AC_000150.1|cromossomo_18 143 pb
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ********************GCTTTAG---AGTCACACTT-CTAAA---A
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ********************GCTTTAG---AGTCACACTT-CTAAA---A
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 ********************GCTTTAG---AGTCACACTT-CTAAA---A
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 ----GGAATTCTGATCTTTACTTTGAGGAAAGTTTCACTTGCTGACGTGA
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 ----GGAATTCTGATCTTTACTTTGAGGAAAGTTTCACTTGCTGACGTGA
* * * * * ** ** *** ***** ** * *
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CAGTG--------TGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAA
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 CAGTG--------TGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAA
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 CAGTG--------TGTCTAGCAAAGAGTCATCAAGTAGTGATTTTTAAAA
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 CAGTTGTGAGTGTTGTCATTCTGAGAATCTAAAGAAAATCAG-TTTCTTG
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 CAGTTGTGAGTGTTGTCACTCTGAGAATCTAAAGAAAATCAG-TTTCTTG
**** **** * *** ** * * * * ***
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ATTATATGTCACACACACACACACACACACACACACACACACA*******
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ATTATATG--------------------------TCACACACA*******
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 ATTATATG--------------------------TCACACACA*******
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 TTTTTCTG----------------------------ATTAGGTGACTGAG
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 TTTTTCTG----------------------------ATTAGGTGACTGAG
** * ** * ** *
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 ****************----------
2)ref|AC_000064.1|cromossomo_21 ****************----------
3)ref|AC_000153.1|cromossomo_21 ****************----------
4)ref|AC_000018.8|cromossomo_18 TGTGTGTG------------------
5)ref|AC_000150.1|cromossomo_18 AGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
* **
Figura 11: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador D21S215. As sequências dos novos iniciadores para o marcador D21S215 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 18 (genomas referência NC_000018.8 e AC_000150.1) e as sequências referências dos novos iniciadores (NC_000021.8, AC_000064.1 e AC_000153.1).
Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 173 pb
Sequência 2: ref|AC_000012.11|cromossomo_12 159 pb
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 -********************ATGTCACTAT--------TGGTTTTATTT
2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 AAAGGAGAATTACTTGAACCCAGGAGACAGAGGTTGCGGTGAGCCGAGAT
***** * * ** * * ** ** * *
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TTTTCTTTTTTCCTGGAAACTCATTTTTTATTATTATTATTAGTAGTAGT
2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 TGCACCATTACTCTCCAACCTGGGCAACAAGAGCGAAACTCCGTATCCAA
* * ** ** ** ** * * * ***
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 AGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTATTTTGGATACGGAGTTTCACTCTTCTTG
2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 CATAATAGTAACAATAATAATAAAATAAAAAATAAG--------------
** ***** * ** ** ** * * * **
1)ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CCCAGGCTGGAG********************
2)ref|AC_000012.11|cromossomo_12 -CGAGTCTCCAGGAAAAAAGAAAA--------
* ** ** ** ** * *
Figura 12: Alinhamento das sequências de referência dos novos iniciadores para o marcador D21S1993. As sequências dos novos iniciadores para o marcador D21S1993 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 12 (genomas referência NC_000012.11) e a sequência referência dos novos iniciadores (NC_000021.7).
39
Após a síntese, os novos iniciadores para os marcadores D21S369,
D21S215 e D21S1993 foram validados experimentalmente. Para avaliar a
especificidade ao cromossomo 21 gerado pela percentual de identidade reduzido
entre as sequências dos novos iniciadores para as sequências mapeadas no
cromossomo 21 e suas cópias parálogas localizadas nos cromossomos 12 e 18,
os novos iniciadores foram submetidos a um gradiente de temperatura de
anelamento de 59ºC - 69ºC. Para o marcador D21S369 na temperatura de 59 ºC
foi possível observar a amplificação simultânea dos alelos correspondentes aos
cromossomos 18 e 21, porém em temperaturas mais elevadas >67ºC apenas os
alelos específicos ao cromossomo 21 foram observados (figuras 13 e 14).
Figura 13: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY), resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os novos iniciadores específicos ao marcador D21S369. Em (A) está ilustrado o ensaio da QF-PCR correspondente a amplificação das sequências alvos sob uma temperatura de anelamento dos iniciadores de 59ºC. O pseudo-perfil dialélico com dosagem alélica de 2:1 para os alelos 107pb e 202pb reflete a amplificação simultânea das sequências mapeadas nos cromossomos 18 e 21. Setas em vermelho evidenciam os alelos cromossomo 18 específicos. Os ensaios (B), (C) e (D) correspondem a amplificação da sequência alvo sob as temperaturas de anelamento dos iniciadores de 65ºC, 67ºC e 69ºC, respectivamente. O aumento da especificidade na amplificação dos alelos cromossomo 21 específicos, e consequentemente a redução na amplificação dos alelos correspondentes ao cromossomo 18 foi obtida nos ensaios com temperaturas de anelamento superiores a 59ºC.
40
Figura 14: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 718M2 (cariótipo típico, 46,XX) para o marcador D21S369. Em (A) está ilustrado o ensaio da QF-PCR correspondente a temperatura de anelamento dos iniciadores de 59ºC. O pseudo-perfil trialélico com dosagem alélica de ~ 3:1:1 para os alelos 107pb, 200pb e 208pb reflete a amplificação simultânea das cópias parálogas mapeadas nos cromossomos 18 e 21. O ensaio (B) corresponde a amplificação da sequência alvo sob a temperatura de anelamento dos iniciadores de 67ºC. O quadrante vermelho evidencia o aumento da especificidade na amplificação dos alelos cromossomo 21 específicos, e consequentemente a redução na amplificação dos alelos correspondentes ao cromossomo 18 à níveis não detectáveis na temperatura de anelamento de 67ºC.
Quanto aos iniciadores para o marcador D21S215, ao longo de todo
gradiente de temperatura de anelamento dos iniciadores, foi observado a
amplificação simultânea dos alelos correspondentes aos cromossomos 18 e 21
(figura 15).
Figura 15: Eletroferograma representativo do perfil alélico do indivíduo heterozigoto 356 (cariótipo típico, 46,XY), resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os novos iniciadores específicos ao marcador D21S215. Em (A) está ilustrado o ensaio da QF-PCR correspondente a temperatura de anelamento dos iniciadores em 59ºC. O pseudo-perfil trialélico com dosagem alélica inicialmente de 1:1:1 para os alelos 119pb, 121pb e 133pb reflete a amplificação simultânea das cópias parálogas mapeadas nos cromossomos 18 e 21. Setas em vermelho evidenciam o aumento da especificidade na amplificação dos alelos cromossomo 21 específicos, e consequentemente a redução na amplificação dos alelos correspondentes ao cromossomo 18 nas temperaturas de anelamento de 65ºC - 69ºC.
41
Interessantemente, para o marcador D21S1993, apenas os alelos
específicos ao cromossomo 21 foram amplificados ao longo de todo gradiente de
temperatura (dados não mostrados), o resultado sob a temperatura de
anelamento de 67ºC está representado na figura 16.
Figura 16: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 707 para o marcador D21S1993. Nesse ensaio o indivíduo acometido apresenta um perfil trialélico, caracterizado pelos alelos 165pb e 177pb herdados do genitor materno, e o alelo 180pb herdado do genitor paterno. A dosagem alélica de ~1:1 no genitor materno, e de ~1:1:1 no acometido é indicativo da elevada especificidade do novo par de iniciadores ao cromossomo 21.
Após padronização das condições dos ensaios de amplificação e
discriminação dos alelos cromossomo 21 específicos para os marcadores STR
D21S369 e D21S1993, 20 indivíduos não aparentados geneticamente, foram
selecionados aleatoriamente no banco de DNA NUDIM para tipagem desses
marcadores. As frequências alélicas para cada marcador foram calculadas
utilizando o programa PowerStats, tabelas 5 e 6.
Tabela 5: Frequência alélica do marcador D21S369.
Marcador D21S369
Frequência alélica Alelos 200 202 204 206 208 210
0,05 200 0
0,4 202 0 5
0,1 204 0 1 1
0,1 206 0 1 0 1
0,325 208 2 4 1 1 2
0,025 210 0 0 0 0 1 0
nº de cromossomos 40
Heterozigose observada 55%
42
Tabela 6: Frequência alélica do marcador D21S1993.
Marcador D21S1993
Frequência alélica Alelos 165 177 180
0,025 165 0
0,7 177 1 9
0,275 180 0 9 1
nº de cromossomos 40
Heterozigose observada 50%
5.2 Novos marcadores STR identificados na região pericentromérica do cromossomo 21.
Inserido no objetivo principal deste trabalho, que consiste em uma abordagem
metodológica que conduza a identificação de um novo painel de marcadores STR
altamente informativos para a elucidação inequívoca da origem meiótica da não
disjunção e dos padrões de recombinação na região pericentromérica do
cromossomo 21, foi gerado um mapa combinado físico e de ligação restrito ao
intervalo de 5,4 Mb entre as bandas cromossômicas 21p11.2 e 21q21.1. A análise
dessa região, por genômica computacional comparada, previamente descrita em
materiais e métodos, gerou um painel de 36 marcadores STR inéditos, sendo 10 na
região 21p e 26 na região 21q, tabela 7.
43
Tabela 7: Caracterização dos marcadores STR inéditos mapeados entre as bandas cromossômicas 21p11.2-q21.1.
Marcador Período
(b)
Sequência Localização física (pb) Número Identidade Pontuação
(g)
Índice de
STR (a)
Consenso (c)
NC_000021.7 (d)
de cópias (e)
(%) (f)
Polimorfismo (h)
21p9795799 5 GAATG 9795799-9882591 17326.4 68 29212 1
21p9991707 4 TGGA 9991707-9991797 22.8 93 155 1
21p10017403 4 ATAC 10017403-10017449 11.8 100 94 1
21p10115899 4 AAAT 10115899-10115947 12.3 100 98 1
21p10130327 5 AAAAT 10130327-10130384 11.8 88 91 1
21p10132551 5 TGGTT 10132551-10132602 10.4 100 104 1
21p10139479 4 TAGA 10139479-10139968 122.3 69 244 1
21p10158763 4 GATA 10158763-10159053 78.3 70 164 1
21p10159751 4 TCTT 10159751-10159860 27.5 85 134 2
21p10163941 4 ATAG 10163941-10165344 362.3 65 195 1
21q13295315 4 AAAG 13295315-13295388 18.3 94 130 1
21q13326787 5 AAAAT 13326787-13326846 11.6 92 102 1
21q13519091 5 AAAAC 13519091-13519139 9.8 90 80 1
21q13539322 4 AAAG 13539322-13539456 34.0 89 213 1
21q13562016 4 AAAT 13562016-13562062 11.8 100 94 1
21q13846825 5 TTTTA 13846825-13846952 24.8 87 114 1
21q13889887 5 TTTAT 13889887-13889945 11.6 96 109 1
21q13953231 4 TTCC 13953231-13953337 26.5 92 169 1
21q13997652 4 AAGA 13997652-13997773 31.5 85 168 2
21q14081492 4 GAAA 14081492-14081697 51.5 84 249 2
21q14341331 5 GAGTG 14341331-14341399 13.4 87 84 1
21q14371352 4 GAAA 14371352-14371490 36.0 80 96 2
21q14446264 4 TTTA 14446264-14446310 11.8 100 94 2
21q14507484 4 TTCC 14507484-14507530 11.8 100 94 2
21q14591269 4 TTTA 14591269-14591355 22.8 85 110 3
21q14597752 5 AAAAT 14597752-14597803 10.4 97 86 1
21q14618215 4 AGAA 14618215-14618350 34.3 86 156 3
21q14626534 4 GGAA 14626534-14626709 44.8 75 87 1
21q14649447 4 AAAG 14649447-14649514 17.0 100 136 2
21q14719508 5 TTTTA 14719508-14719560 10.8 95 99 1
21q14770335 4 AAAG 14770335-14770667 82.8 87 319 2
21q14900000 4 ATTT 14900000-14900047 12.0 100 96 1
21q15282614 4 TAGA 15282614-15282681 16.8 90 100 2
21q15311075 4 AAAG 15311075-15311190 28.8 84 128 1
21q15368162 5 TTCTC 15368162-15368262 21.4 93 160 3
21q15414442 4 ATCT 15414442-15414503 15.8 93 108 1
44
(a) Nomenclatura dos novos marcadores STR identificado na região pericentromérica 21p11.2-q21.1. Os novos marcadores foram nomeados de acordo com a região cromossômica seguido da posição física inicial em pares de base de acordo com o genoma primário de referência disponível no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob o código de acesso NC_000021.7.
(b) Período do marcador STR, dado pela extensão em nucleotídeos da unidade de repetição. Por exemplo, período igual a 2, corresponde a uma unidade de repetição constituída por um dinucleotídeo.
(c) Sequência primária em nucleotídeos da unidade de repetição constitutiva do marcador STR.
(d) Localização física em pares de base dos marcadores STR, baseado no genoma humano primário de referência NC_000021.7.
(e) Número de cópias das unidades de repetição constitutiva do marcador STR.
(f) Percentual de homologia dado pelo alinhamento da sequência referência de interesse com
outra perfeita constituída por período, unidade consenso e número de cópias idênticos.
(g) Valor dado pela razão e desconto das penalidades referentes ao tipo de período, número de cópias e percentual de identidade da sequência de interesse.
(h) Predição do polimorfismo in silico, dado pela análise combinada dos três genomas humanos
de referência disponíveis no banco de dados do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob os códigos de acesso: NC_000021.7, AC_000064.1 e AC_000153.1. Para esta análise foi estipulada uma escala de 1-3, sendo índice 1 para a observação de uma única forma alélica, índice 2 para duas variações alélicas, e índice 3 para três variações alélicas em um determinado loco.
(*) S/A – Sem anotações.
Para o desenho dos iniciadores específicos a cada novo marcador STR
identificado, primeiramente uma seleção criteriosa foi realizada de acordo com os
seguintes parâmetros restritivos: (i) mapeados em 21p, somente marcadores STR
com unidades de repetição constituída por sequências simples de tetranucleotídeos
ou pentanucleotídeos, e com número de cópias <35; (ii) mapeados em 21q, somente
marcadores com índice de polimorfismo in silico ≥2, constituídos por sequências
simples de tetranucleotídeos ou pentanucleotídeos, e com número de cópias <35.
A análise genômica computacional da região 21p pericentromérica, revelou
um grau considerável de homologia desta região com outras regiões mapeadas ao
longo do genoma humano (dados não mostrados).
Devido a este elevado grau de homologia, com exceção dos marcadores
21p10115899 e 21p10159751, não foi possível desenhar iniciadores únicos para os
demais marcadores mapeados em 21p, assim, foram selecionados pares de
iniciadores que apresentaram o menor percentual de identidade entre as sequências
45
específicas ao cromossomo 21 e suas cópias parálogas nos demais cromossomos.
Os iniciadores selecionados para os cinco marcadores mapeados em 21p, e o
produto de amplificação esperado para cada marcador estão resumidos na tabela 8.
Tabela 8: Descrição dos iniciadores específicos aos cinco novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21p.
Marcador Iniciador A Iniciador B Fluorocromo
Produto (pb)/localização STR (Sentido) (Anti-sentido)
21p9991707 CATGCAGGCTCCTGAGAGTA TCATCCACTAGTCCACAGACAA 6-FAM
351pb/cromossomo 21
308pb/cromossomo 13
312pb/cromossomo Y
21p10017403 CCTGGATGACATAGTGAGACC CAGCAATCAGGTTTTATAAGGAAA VIC 362pb/cromossomo 21
342pb/cromossomo 7
21p10115899 CTGCAAGGAGCCATGATTG ATGTGCAGTTTTGCCAGAGG 6-FAM 150pb/cromossomo 21
21p10132551
GGGAGACAGTGAGAAGGTTG CCTGGACAATGGAGCAAGAC
NED
158pb/cromossomo 21
123pb/cromossomo 22
GGGAGACAGTGAGAAGGTTG CCAGCCTGGACAATGGAG 161pb/cromossomo 21
126pb/cromossomo 22
GGGAGACAGTGAGAAGGTTG ACTGTACTCCAGCCTGGACAATG 173pb/cromossomo 21
138pb/cromossomo 22
21p10159751 TGGCACCTTCCTGCTAAATC TGGGCGATAGAGCAAGACTC PET 235pb/cromossomo 21
Para a validação experimental dos novos iniciadores em 21p, um primeiro
ensaio baseado em um gradiente de temperatura de anelamento de 59ºC – 69ºC foi
realizado. Embora a validação por BLAST (Basic Local Alignment Search Tool -
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) dos marcadores 21p10115899 e 21p10159751 tenham
os definido como únicos ao cromossomo 21, os dados experimentais demonstraram
a amplificação de múltiplos sítios mesmo em temperatura de anelamento de 69ºC
(figura 17 e 18).
Figura 17: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY). Em (A) e (B) está representado o perfil alélico referente a amplificação do marcador 21p10115899 sob as temperaturas de anelamento de 59ºC e 69ºC. Em ambos os ensaios, múltiplos sítios foram amplificados. Setas em vermelho evidenciam a redução na detecção de produtos inespecíficos na temperatura de anelamento de 69ºC.
46
Figura 18: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY). Em (A) e (B) está representado o perfil alélico referente à amplificação do marcador 21p10159751 sob as temperaturas de anelamento de 59ºC e 69ºC. Em ambos os ensaios, múltiplos sítios foram amplificados.
Quanto aos demais marcadores sabidamente não únicos selecionados em
21p, apenas para o marcador 21p9991707 foi observado a redução na amplificação
de produtos inespecíficos como indicativo do aumento da especificidade ao
cromossomo 21 na temperatura de anelamento >65ºC (figura 19).
Figura 19: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY) resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os iniciadores específicos ao marcador 21p9991707. Em (A), (B), (C) e (D) estão ilustrados os ensaios com as temperaturas de anelamento de 59ºC, 65ºC, 67ºC e 69ºC, respectivamente. No retângulo em vermelho estão delimitados os alelos 354pb e 358pb, os quais são específicos ao cromossomo 21. As setas em vermelho nos ensaios (B), (C) e (D) enfatizam a redução na detecção de produtos inespecíficos em temperaturas de anelamento > 59ºC.
47
Quanto aos marcadores selecionados em 21q, apenas o 21q13539322
mostrou-se não único por validação computacional, com cópia paráloga mapeada no
cromossomo 2 (figura 20).
Sequência 1: ref|AC_000021.7|cromossomo_21 354 pb
Sequência 2: ref|AC_000002.10|cromossomo_2 309 pb
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 *********************AACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCC
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 *********************AACCTGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCC
**************************************************
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GAGGTCACGCCATTGTACTACAGCCTGAGTGACAGGAGAAAAACTCCATC
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 GAGGTCATGCCATTGTACTACAGCCTGAGTGATAGGAGCAAAACTCCATC
******* ************************ ***** ***********
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 TCAAAAAAAAGAAAGAAAGAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGA
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 TCAAAAAAAAGAAAGAAAGAGGAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAGAGAGAGA
****************************************** *** ***
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 AAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAAAAG
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 AAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGCAAGCAA----
*************************************** *** **
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 AAAGAAAGAGAGAAAGAGAGAAAGAGAAAGAAAGAAAGAAAGCTAATAAA
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 -----------------------------------------GCTAATAAA
*********
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CACCATAACAATGTTTCTTTCTCTGAATTCTTTTAGAACTTGCTAAGCAT
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 CACCATAACAATGTTTCTTTCTCTGAATTCATTTAGAACTTGCTAAGCAT
****************************** *******************
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 CCTAATGTAGTTATCAATGAGGAATCGTATACT*****************
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 CCTAATGAAGTTATCAATGAGGAATCGTATACT*****************
******* ******************************************
1) ref|AC_000021.7|cromossomo_21 GCGA
2) ref|AC_000002.10|cromossomo_2 GCAA
** *
Figura 20: Alinhamento das sequências de referência do marcador 21q13539322. As sequências referência para o marcador 21q13539322 foram comparadas utilizando o programa ClustalW (http://align.genome.jp/). Em realce azul e vermelho estão as sequências dos iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, e em amarelo as regiões sem correspondência entre a cópia paráloga mapeada no cromossomo 12 (genoma referência NC_000002.10) e a sequência referência no cromossomo 21 (NC_000021.7).
A validação experimental com os iniciadores para o marcador 21q13539322
em um gradiente de temperatura, demonstrou o aumento da especificidade para o
cromossomo 21 na temperatura de anelamento de 67 ºC (figura 21).
48
Figura 21: Eletroferograma representativo do perfil alélico da amostra controle 356 (cariótipo típico, 46,XY), resultante de um gradiente de temperatura de anelamento para os iniciadores específicos ao marcador 21q13539322. Em (A), (B) e (C) estão ilustrados os ensaios correspondentes as temperaturas de anelamento de 59ºC, 67ºC e 69ºC, respectivamente. Setas em vermelho evidenciam os alelos cromossomo 18 específicos. A redução na amplificação dos alelos 310pb e 314pb no ensaio (C) é indicativo do aumento da especificidade do par de iniciadores à região mapeada no cromossomo 21 nas temperaturas de anelamento superiores a 59ºC.
Informações sobre os iniciadores específicos ao marcador 21q13539322, e
aos demais STR pericentroméricos selecionados na região 21q estão resumidas na
tabela 9.
Tabela 9: Descrição dos iniciadores específicos aos seis novos marcadores pericentroméricos selecionados em 21q.
Marcador Iniciador A Iniciador B Fluorocromo
Produto (pb)/localização STR (Sentido) (Anti-sentido)
21q13539322 CTGAGGCTGGAGATTGGTGT TCGCACATCTTCTTACAATGC VIC 354pb/cromossomo 21
309pb/cromossomo 2
21q14446264 TGGTTAGGAAAAACACTCCAATG TTGAACCCAGGAGGTGGA VIC 205pb/cromossomo 21
21q14507484 TTGGCCAACCTCCTTTCCT TTCAGTACCTAAGACAATCTTTGACA 6-FAM 235pb/cromossomo 21
21q14591269 GACCTGGCTAATTTTCATTTTGA GGAGGAAAAATGTGATTCAGG NED 308pb/cromossomo 21
21q14618215 GGAGCTGAAGAACCTGCCTA TTCCTGTCTCCTCCCCTCTT NED 210pb/cromossomo 21
21q15368162 TCCCAGGAGGACTAATCCAG ATTGCCTGAGCCCCAGAG PET 362pb/cromossomo 21
49
5.3 Padronização do ensaio QF-PCR multiplex para a tipagem dos cinco novos marcadores pericentroméricos únicos identificados na região 21q.
Para a padronização de um ensaio multiplex (reação de amplificação
simultânea de múltiplos locos) para a tipagem dos marcadores 21q14446264,
21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162, cada par de iniciadores
a uma concentração de 0,8µM foi validado experimentalmente com gradientes de
temperatura de anelamento de 58ºC – 63ºC, concentrações de MgCl2 de 0,5 mM – 2
mM e concentrações de DNA alvo de ~1 – 4 ng. Individualmente, os melhores
resultados foram: (i) temperatura de anelamento igual a 59ºC; (ii) concentração de
MgCl2 igual a 2 mM; e (iii) concentração de DNA de ≈2ng, e estes foram os
parâmetros para o primeiro ensaio multiplex (figura 22).
Figura 22: Eletroferograma representativo do primeiro ensaio da QF-PCR multiplex. Os marcadores utilizados foram: 21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162. As condições deste ensaio foram mantidas em: (i) concentração de 0,8µM de cada par de iniciadores; (ii) concentração de 2ng de DNA alvo; (iii) concentração de 2mM de Mgcl2; (iv) ciclos térmicos com temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão dos iniciadores de 94ºC, 59ºC e 72ºC, respectivamente.
Para a otimização do ensaio da QF-PCR multiplex, um segundo teste foi
realizado baseado em uma curva de concentração dos iniciadores de 0,08µM-
1,2µM. Ao final dos testes, o ensaio denominado Mpxcen21 (figura 23) foi otimizado
nas seguintes condições: (i) concentração dos iniciadores de 0,8µM (21q14446264),
0,64µM (21q14507484), 0,32µM (21q14591269), 0,08µM (21q14618215) e 1,2µM
(21q15368162); (ii) Tampão pH 8,3 com 15mM de Tris-HCl, 50mM KCl e 2mM de
50
MgCl2, (iii) 1,25 U da enzima Taq Gold polimerase, (vi) ciclos térmicos com hotstart a
95ºC por 11 minutos, desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento a 59ºC por 1
minuto, extensão 72ºC por 1 minuto, e extensão final a 60ºC por 60 minutos (tabela
10)
Tabela 10: Descrição dos parâmetros para otimização do ensaio Mpxcen21.
Ensaio Mpxcen21
Iniciadores: Concentração (µM)
21q14446264 0,8µM
21q14507484 0,64µM
21q14591269 0,32µM
21q14618215 0,08µM
21q15368162 1,2µM
Tampão: 15mM de Tris-HCl
50mM KCl
2mM de MgCl2
pH 8,3
Enzima Taq Gold Polimerase: 1,25U
Volume final da reação: 12,5µL
Ciclos térmicos: 28X
Desnaturação 94˚C/1min
Anelamento 59˚C/1min
Extensão 72˚C/1min
Extensão final 60˚C/60min
Figura 23: Eletroferograma representativo do ensaio da QF-PCR multiplex otimizado. As condições ótimas deste ensaio foram: (i) concentração de 2ng de DNA alvo; (ii) concentração de 2mM de Mgcl2; (iii) ciclos térmicos com temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão dos iniciadores de 94ºC, 59ºC e 72ºC, respectivamente. (vi) concentração dos iniciadores em 0,8µM para o marcador 21q14446264; 0,64µM para o 21q14507484; 0,32µM para o 21q14591269; 0,08µM para o 21q14618215; e 1,2µM para o 21q15368162.
51
5.4 Validação experimental do Mpxcen21 na identificação dos eventos de recombinação e na determinação das origens da não disjunção do cromossomo 21.
Para a validação do Mpxcen21 (21q14446264, 21q14507484, 21q14591269,
21q14618215 e 21q15368162) foi utilizada uma coorte composta por 60 núcleos
familiares com pelo menos um acometido pela SD. Para análise global de
recombinação ao longo da região 21q foram adicionados a este estudo cinco
marcadores STR amplamente utilizados no diagnóstico da trissomia 21: D21S11,
D21S226, D21S1270, IFNAR e D21S1411. A tipagem desses marcadores foi
otimizada em ensaio multiplex, e este ensaio foi denominado Mpx21. Informações
sobre os marcadores STR incluídos no Mpx21 estão resumidas na tabela 11.
Tabela 11: Descrição dos marcadores STR incluídos no Mpx21.
Marcador Mapa físico (pb) Iniciador A Iniciador B Fluorocromo Referência
STR NC_000021.7 (Sentido) (Anti-sentido)
D21S11 19.476.380 TTTCTCAGTCTCCATAAATATGTG GAGAACATTGACTAATACAACATC 6-FAM (Mann et al., 2001)
D21S226 30.263.730 GCAAATTTTGCTGGATGGGATTAACAG AGAATAACTACAGACATTTAGCTT 6-FAM (Mann et al., 2001)
D21S1270 30.628.990 CTATCCCACTGTATTATTCAGGGC TGAGTTTCCAGGTTGCAGGTGACA VIC (Mann et al., 2001)
IFNAR 33.639.130 CATTTGATCTTAGCCATCTATTGC TAGTCTTTCAAATGGCTGCATAGT PET (Mann et al., 2001)
D21S1411 43.034.040 ATGATGAATGCATAGATGGATG AATGTGTGTCCTTCCAGGC NED (Mann et al., 2001)
De acordo com a tipagem do Mpxcen21, dos 60 núcleos familiares
analisados, em 59 casos (98,33%) os eventos de não disjunção foram determinados
como erros de origem materna. Destes, 72,88% foram correspondentes a erros em
MI e 27,12% a erros em MII.
Nas Figuras 24, 25 e 26 estão representados os eletroferogramas de alguns
núcleos familiares analisados.
Na tabela 12, estão resumidos a distribuição da idade materna, as origens da
não disjunção do cromossomo 21 e os eventos de recombinação identificados na
população de estudo. Realçados em cinza estão os eventos de recombinação
observados. Realçados em vermelho os eventos de recombinação inferidos pela
transição da heterozigose parental para homozigose no acometido, ou processo
inverso, entre os ensaios Mpx21 e Mpxcen21.
52
Figura 24: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 03 para os marcadores 21q14507484, 21q14618215 e IFNAR. Nos cenários 1 e 2 estão ilustrados os perfis alélicos para os marcadores 21q14507484 e 21q14618215 (Mpxcen21), respectivamente. Em ambos os cenários a heterozigose materna, correspondente aos alelos 232pb/248pb (21q14507484) e 188pb/194pb (21q14507484) foi mantida no acometido. Estes dados são indicativos de não disjunção de origem materna durante a MI. No cenário 3 estão ilustrados os perfis alélicos para o marcador IFNAR (Mpx21). Neste cenário, a heterozigose materna, correspondente aos alelos 395pb/400pb foi reduzida a homozigose no acometido (alelo 400pb em dose dupla). Este evento de transição da heterozigose materna (perfil alélico - 395pb/400pb) para homozigose (perfil alélico – 400pb) no acometido é indicativo da ocorrência de um evento de recombinação na região delimitada pelos marcadores 21q14507484 e IFNAR.
53
Figura 25: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 43 para os marcadores 21q14507484 e 21q14618215. Nos cenários 1 e 2 estão ilustrados os perfis alélicos para os marcadores 21q14507484 e 21q14618215 (Mpxcen21), respectivamente. Em ambos os cenários a heterozigose materna, correspondente aos alelos 236pb/244pb (21q14507484) e 200pb/208pb (21q14507484) foi reduzida a homozigose no acometido. Estes dados são indicativos de não disjunção de origem materna durante a MII.
54
Figura 26: Eletroferograma representativo do perfil alélico do núcleo familiar 24 para os marcadores 21q14507484 e 21q15368162. Nos cenários 1 e 2 estão ilustrados os perfis alélicos para os marcadores 21q14507484 e 21q15368162 (Mpxcen21), respectivamente. Em ambos os cenários a heterozigose paterna, correspondente aos alelos 228pb/240pb (21q14507484) e 349pb/367pb (21q15368162) foi reduzida a homozigose no acometido. Estes dados são indicativos de não disjunção de origem paterna durante a MII.
55
Tabela 12: Dados comparativos quanto às origens da não disjunção para os ensaios Mpx21 e Mpxcen21.
Núcleo Origem parental Idade materna
Origem Meiótica
Familiar Mpx21 Mpxcen21
nº 01 Materna 15,1 Meiose I Meiose I
nº 02 Materna 14,1 Recombinação Meiose II
nº 03 Materna 35 Recombinação Meiose I
nº 04 Materna 44,2 Meiose I Meiose I
nº 05 Materna 27,8 Meiose I Meiose I
nº 06 Materna 38,6 Meiose I Meiose I
nº 07 Materna 39,9 Recombinação Meiose I
nº 08 Materna 26,2 Meiose II Meiose II
nº 09 Materna 24 Meiose I Meiose II - Recombinação
nº 10 Materna 28,8 Meiose I Meiose I
nº 11 Materna 22,1 Meiose I Meiose II
nº 12 Materna 40,1 Recombinação Meiose I
nº 13 Materna 29,4 Meiose I Meiose I
nº 14 Materna 40,1 Recombinação Meiose II - Recombinação
nº 15 Materna 36,1 Meiose I Meiose I
nº 16 Materna 38,9 Meiose I Meiose I
nº 17 Materna 33,4 Meiose I Meiose I
nº 18 Materna 27,7 Meiose I Meiose I
nº 19 Materna 26,8 Recombinação Meiose I
nº 20 Materna 25,8 Meiose II Meiose II
nº 21 Materna 40 Recombinação Meiose I
nº 22 Materna 37,3 Recombinação Meiose I
nº 23 Materna 38,6 Meiose I Meiose II - Recombinação
nº 24 Paterna 19,1 Recombinação Meiose II
nº 25 Materna 40,9 Meiose I Meiose II
nº 26 Materna 41,6 Recombinação Meiose II
nº 27 Materna 40,4 Meiose I Meiose I
nº 28 Materna 29,5 Meiose I Meiose I
nº 29 Materna 30,9 Meiose I Meiose I
nº 30 Materna 37 Recombinação Meiose I
56
Tabela 12: (continuação).
Núcleo Origem parental Idade materna
Origem Meiótica
Familiar Mpx21 Mpxcen21
nº 31 Materna 39,2 Recombinação Meiose II
nº 32 Materna 34 Meiose I Meiose I
nº 33 Materna 22 Meiose I Meiose I
nº 34 Materna 39 Meiose I Meiose I
nº 35 Materna 42,8 Recombinação Meiose I
nº 36 Materna 27,6 Meiose I Meiose I
nº 37 Materna 28,9 Meiose I Meiose I
nº 38 Materna 38,9 Meiose I Meiose I
nº 39 Materna 28 Meiose I Meiose II
nº 40 Materna 24,3 Meiose I Meiose II
nº 41 Materna 23,8 Meiose I Meiose I
nº 42 Materna 18,3 Meiose I Meiose I
nº 43 Materna 30,3 Meiose II Meiose II
nº 44 Materna 39,9 Meiose I Meiose I
nº 45 Materna 37,5 Recombinação Meiose I
nº 46 Materna 46,9 Meiose I Meiose I
nº 47 Materna 32,1 Meiose I Meiose I
nº 48 Materna 40,8 Meiose I Meiose I
nº 49 Materna 39,3 Meiose I Meiose II
nº 50 Materna 18,3 Meiose I Meiose I
nº 51 Materna 13,1 Meiose I Meiose I
nº 52 Materna 38,7 Meiose I Meiose I
nº 53 Materna 30,6 Recombinação Meiose II
nº 54 Materna 36,6 Meiose I Meiose I
nº 55 Materna 44 Recombinação Meiose I
nº 56 Materna 15,9 Meiose I Meiose I
nº 57 Materna 23,3 Meiose I Meiose I
nº 58 Materna 36 Meiose I Meiose II
nº 59 Materna 29,2 Meiose I Meiose I
nº 60 Materna 29,3 Meiose I Meiose I
Para uma melhor compreensão da distribuição dos marcadores STR utilizado
para o rastreio dos eventos de recombinação em 21q, estes foram agrupados nos 6
intervalos propostos por Oliver et al. (2008), figura 27.
57
Para predição da freqüência e localização dos eventos de recombinação
entre os marcadores utilizados nesse estudo, um mapa genético foi construído
através de informações do mapa combinado físico e de ligação para o genoma
humano (Rutgers Map). Para efeitos de comparação foram somados a este mapa
genético os marcadores STR utilizados por Oliver et al. (2008), tabela 13.
Figura 27: Localização dos marcadores STR mapeados em 21q, incluídos no Mpxcen21 e Mpx21. A região foi dividida em seis intervalos conforme os critérios usados por Oliver et al. (2008) para efeitos de comparação.
58
Tabela 13: Mapa combinado físico e de ligação para os marcadores STR utilizados no presente estudo e por Oliver et al. (2008).
Marcador Posição física (pb)* Distância genética para
mulheres(cM)** Distância genética para
homens(cM)** Distância genética média
para os sexos(cM)**
D21S369 13678220-13678394 0 0 0
D21S215 13719788-13719968 0,1681 0,0999 0,1548
D21S1993 14375677-14375805 3,9302 0,9448 2,6063
21q14446264 14446264-14446310 4,3029 1,0443 2,8524
21q14507484 14507484-14507530 4,6232 1,1318 3,0629
D21S258 14548154-14548345 4,8377 1,1905 3,2013
21q14591269 14591269-14591355 5,0571 1,2532 3,3467
21q14618215 14618215-14618350 5,1935 1,2926 3,437
D21S120 14684025-14684337 5,5219 1,3899 3,655
21q15368162 15368162-15368262 8,608 2,4732 5,7487
D21S1431 15394402-15394573 8,7157 2,5186 5,8243
D21S1904 15432268-15432423 8,8692 2,5849 5,9329
D21S192 15705975-15706170 9,9278 3,089 6,702
D21S1432 16265317-16265448 11,7337 4,0975 7,9371
D21S11 19476134-19476354 25,3931 6,6734 15,8638
D21S2053 20277992-20278249 27,481 7,3185 17,1451
D21S1914 24544272-24544482 37,2615 12,092 24,4582
D21S226 30263502-30263663 48,239 17,3844 32,613
D21S1270 30628632-30628821 48,423 17,7298 32,8716
D21S1908 31164942-31165157 48,9783 18,4077 33,48
D21S224 32778121-32778253 51,5302 21,6772 36,2912
IFNAR 33638892-33639126 54,0974 22,2069 37,8937
D21S1222 36849899-36850135 61,0122 29,244 44,9195
D21S168 39867392-39867505 65,9523 35,1464 50,3245
D21S212 42026060-42026294 76,3695 41,9333 58,7195
D21S1411 43033739-43034036 79,8246 45,7786 62,4449
D21S1890 43672606-43672758 80,3927 47,3282 63,5396
D21S1446 46862013-46862233 81,5108 59,2376 69,9721
(*) Localização física em pares de base dos marcadores STR disponível no banco de dados do Centro Nacional
de Informações Biotecnológicas – NCBI (National Center Information for Biotechnology) sob os códigos de
acesso: NC_000021.7.
(**) Distância genética dos marcadores STR dada pelo mapa genético humano Rutgers (Rutgers Map Vs.2, (Matise, 2007). Para os novos marcadores STR pericentroméricos identificados no presente estudo as distâncias genéticas (em centiMorgan – cM) foram estipuladas por meio de interpolação das distâncias físicas e genéticas dos marcadores STR já descritos.
59
Eventos de recombinação na região pericentromérica foram identificados em
3 casos com não disjunção de origem materna em MII. Em 2 casos foi possível
determinar com precisão o ponto de recombinação entre dois marcadores
adjacentes, 21q14618215 e 21q15368162 (fragmento cromossômico de 749Kb). Os
perfis alélicos determinados para cada núcleo familiar estão resumidos nas tabelas
14, 15 e 16.
Tabela 14: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 09.
(*) Alelos Caracterizados
Marcador Genitor
Materno Acometido
Genitor Paterno
Estágio Meiótico
21q14446264 199 199 199 199 199 199 199 Não informativo
21q14507484 228 228 228 228 244 232 244 Não informativo
21q14591269 297 301 297 297 305 297 305 MII
21q14618215 182 204 182 182 196 194 196 MII
21q15368162 349 359 349 359 373 353 373 MI
Tabela 15: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 14.
(*) Alelos Caracterizados
Marcador Genitor
Materno Acometido
Genitor Paterno
Estágio Meiótico
21q14446264 199 203 199 203 203 199 203 Não informativo
21q14507484 232 236 232 232 232 232 232 Não informativo
21q14591269 301 305 301 301 301 297 301 Não informativo
21q14618215 188 196 196 196 200 200 202 MII
21q15368162 357 363 357 363 357 353 359 MI
Tabela 16: Perfil alélico determinado para o núcleo familiar nº 23.
(*) Alelos Caracterizados
Marcador Genitor
Materno Acometido
Genitor Paterno
Estágio Meiótico
21q14446264 199 203 199 199 199 199 203 MII
21q14507484 232 232 232 232 234 232 234 Não informativo
21q14591269 305 305 305 305 305 301 305 Não informativo
21q14618215 196 196 196 196 198 198 202 Não informativo
21q15368162 357 367 357 367 357 357 357 MI
De acordo com a distância genética predita (para mulheres) por interpolação
do mapa combinado físico e de ligação, entre os marcadores 21q14618215 e
21q15368162 incluídos no Mpxcen21, são esperados 3,7% de recombinação.
60
De maneira mais ampla, entre a região total delimitada pelo Mpxcen21
(21q14446264 – 21q15368162) são esperados 4,3% de recombinação. Assim
sendo, os eventos de recombinação observados entre os marcadores 21q14446264
– 21q15368162 (5%) e 21q14618215 e 21q15368162 (3,38%) estão de acordo com
a freqüência esperada.
Dentre todos os casos de origem materna, eventos de recombinação na
região mediana e distal delimitadas pelo Mpx21, foram identificados em 15 (25,4%)
indivíduos acometidos. Em seis casos foi possível determinar com precisão o ponto
de recombinação. Destes, um evento de recombinação (1,7%) foi observado entre
os marcadores D21S11 e D21S226; um evento (1,7%) entre os marcadores
D21S1270 e IFNAR; e quatro eventos (6,8%) entre os marcadores IFNAR e
D21S1411.
De acordo com o mapa genético gerado por interpolação para mulheres, as
freqüências esperadas de eventos de recombinação entre os marcadores D21S11 e
D21S226; D21S1270 e IFNAR; IFNAR e D21S1411 são de 22,8%, 5,7% e 26,7%,
respectivamente.
A frequência reduzida de eventos de recombinação entre os marcadores
mapeados na região não pericentromérica, que se afasta grandemente do
percentual de eventos de recombinação esperado, pode ser explicado pelo grande
número de casos recombinantes não informativos quanto ao ponto de
recombinação.
5.5 Percentual de informativo do ensaio Mpxcen21 na determinação das origens da não disjunção do cromossomo 21.
O Mpxcen21 apresentou um elevado potencial informativo na determinação
das origens da não disjunção. Quanto à origem meiótica, em 100% dos casos
analisados pelo menos um marcador STR foi informativo (gráfico 4).
Quanto à origem parental, em 95% dos casos pelo menos um marcador STR
foi informativo (gráfico 5). Para os 5% dos casos restantes, onde o Mpxcen21 não
foi informativo, a origem parental foi determinada através da análise dos marcadores
incluídos no Mpx21.
61
Gráfico 4: Percentual informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação do estágio meiótico da não disjunção.
Gráfico 5: Percentual informativo dos marcadores STR incluídos no Mpxcen21 na determinação da origem parental da não disjunção.
100% 98%
77%
43%
17%
60 5946
26
10
1 2 3 4 5
Número de marcadores informativos
Frequência Relativa Frequência absoluta
5%
95%
65%
32%
12%2%3
57
39
19
71
0 1 2 3 4 5
Número de marcadores informativos
Frequência relativa Frequência absoluta
62
5.6 Determinação do risco relativo para a não disjunção de origem materna em MI e MII na população de estudo.
Para o cálculo do RR na população de estudo, os 59 casos de origem
materna foram subdivididos de acordo com as variáveis dependentes e de desfecho.
Foram considerados como variável de desfecho os estágios meióticos da não
disjunção (MI e MII), e como variáveis de exposição ao risco, idade materna no
momento da concepção (subdividida em três faixas etárias: <29; 29-34, >34 anos), e
perfis de recombinação (recombinação pericentromérica, recombinação não
pericentromérica, e ausência de recombinação).
Para análise estatística foram aferidas as frequências das variáveis de
exposição ao risco (idade materna e perfis de recombinação) e realizadas análises
bivariadas com as variáveis de desfecho (MI e MII).
Quanto a variável idade materna no momento da concepção, não houve
diferença significativa entre as faixas etárias materna, com valor de p igual a 0,543,
0,7128, e 0,7765 para as faixas etárias materna <29, 29-34, e >34 anos,
respectivamente (tabela 17).
Tabela 17: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição idade materna no momento da concepção.
Variável Idade Materna
Total MI Total MII
n (%) n (%) RR (a)
(IC 95%) p n (%) n (%) RR (a)
(IC 95%) p
< 29 anos 43 (100) 14 (32,55) 0,87 (95% CI: 0,62-1,24) 0,543 16 (100) 7 (43,75) 1,41 (95% CI: 0,61-3,23) 0,543
29 - 34 anos 43 (100) 8 (18,60) 1,12 (95% CI: 0,78-1,60) 0,7128 16 (100) 2 (12,50) 0,70 (95% CI: 0,19-2,61) 0,7128
> 34 anos 43 (100) 21 (48,85) 1,06 (95% CI: 0,77-1,44) 0,7765 16 (100) 7 (43,75) 0,86 (95% CI: 0,37-2,01) 0,7765
(a) Risco relativo.
Quanto às variáveis de exposição ao risco: recombinação pericentromérica e
não pericentromérica, e ausência de recombinação, diferenças significativas foram
observadas entre os desfechos em MI e MII. Nos casos com desfecho em MI, houve
associação entre as variáveis, ausência de recombinação com RR= 1,96 (IC 95%:
1,22-3,14; p=0,0005) atuando como fator de risco, e recombinação não
pericentromérica, com RR <1 (RR=0,59; IC 95%: 0,37-0,93; p=0,0114)
caracterizando um efeito protetor para a não disjunção. Enquanto, nos casos com
63
desfecho em MII, houve associação entre as variáveis “recombinação
pericentromérica”, com RR= 4,31 (IC 95%: 2,68-6,94, p=0,0172), e “recombinação
não pericentromérica”, com RR= 3,25 (IC 95%: 1,38-7,65; p=0,0114) atuando como
fator de risco, e “ausência de recombinação”, com RR <1 (RR=0,20; IC 95% 0,07-
0,54; p=0,0005), caracterizando um efeito protetor (tabela 18).
Tabela 18: Risco relativo para a não disjunção em MI e MII associado à variável de exposição recombinação ao longo de 21q.
Variável Recombinação Total MI MII
n (%) n (%) RR (a)
(IC 95%) p n (%) RR (a)
(IC 95%) p
Recombinação Global
Presença 22 (37,2) 10 (23,3) 0,51 (0,32-0,82) 0,0005 12 (75) 5,05 (1,85-13,73) 0,0005
Ausência 37 (62,7) 33 (76,7) 1,96 (1,22-3,14) 0,0005 4 (25) 0,20 (0,07-0,54) 0,0005
Recombinação Pericentromérica
Presença 3 (5,1) 0 (0) 0
3 (18,75) 4,31 (2,68-6,94) 0,0172
Ausência 56 (94,9) 43 (100) NA
13 (81,25) 0,232 (0,144 to 0,374) 0,025
Recombinação não Pericentromérica
Presença 20 (33,9) 10 (23,3) 0,59 (0,37-0,93) 0,0114 10 (62,5) 3,25 (1,38-7,65) 0,0114
Ausência 39 (66,1) 33 (76,7) 1,692 (1,07-2,676) 0,012 6 (37,5) 0,308 (0,131-0,725) 0,012
Total 59 (100) 43 (72,9) 16 (27,1)
(a) Risco relativo.
5.7 Dados populacionais para os cinco marcadores STR incluídos no Mpxcen21.
Para a determinação das frequências alélicas dos cinco marcadores STR:
21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162, que
constituem o Mpxcen21, foram utilizados 220 indivíduos não relacionados
geneticamente, 100 indivíduos provenientes do banco de DNA do Núcleo de
Diagnóstico e Investigação Molecular (NUDIM), e 120 indivíduos correspondentes
aos genitores dos 60 núcleos familiares pertencentes a este estudo. Na tabela 19,
está resumida as frequências alélicas observadas para o Mpxcen21.
64
Tabela 19: Frequências alélicas para os marcadores STR 21q14446264, 21q14507484, 21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162 (n = 220 indivíduos).
Alelos Marcador Marcador Marcador Marcador Marcador
21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162
168
0,002
172
0,002
178
0,005
180
0,005
182
0,03
184
0,032
186
0,016
188 0,025
0,059
190 0,036
192
0,068
194 0,02
0,093
196
0,141
198 0,359
0,098
200
0,164
202 0,543
0,059
204
0,136
206 0,016
0,023
208
0,048
212
0,014
216
0,002
0,007
220
0,005
224
0,061
228
0,136
232
0,386
236
0,1
240
0,198
278
0,005
296
0,198
300
0,216
304
0,582
325
0,002
335
0,023
340
0,011
345
0,05
350
0,136
355
0,168
360
0,225
365
0,168
370
0,175
375
0,034
378
0,002
380 0,005
65
Para efeitos de comparação a população de estudo foi dividida em 3 grupos:
(i) somente os 100 indivíduos do banco de DNA NUDIM; (ii) somente os 120
indivíduos provenientes dos genitores dos núcleos familiares FAMERP; e (iii) a soma
do primeiro e segundo grupo, totalizando 220 indivíduos. Interessantemente, o
percentual de heterozigose e o nível de equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foi
variável entre os grupos A, B e C, tabelas 20, 21 e 22. Isto pode ser devido ao
pequeno tamanho amostral, que influencia particularmente as frequências de alelos
raros (isto é, a aparente ocorrência de alelos privativos em cada grupo). Também
não pode ser excluída a possibilidade de existirem diferenças intrínsecas a cada
população. Por exemplo, diferentes graus de endogamia, levando a um excesso de
homozigotos e portanto à frequências elevadas desses alelos nas populações.
Ressalta-se que o fato de alguns marcadores se encontrarem em desequilíbrio de
Hardy-Weinberg (DHW) não impede a sua utilização em diagnóstico molecular das
origens parentais da não disjunção.
Tabela 20: Dados populacionais para o Grupo A (n = 100).
(*) Marcador Marcador Marcador Marcador Marcador
21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162
N 200 200 200 200 200
H 0,52 0,77 0,65 0,84 0,81
PD 0,723 0,915 0,746 0,97 0,945
PIC 0,48 0,75 0,53 0,87 0,83
PE 0,206 0,545 0,355 0,675 0,618
p 0,09047 0,58273 0,00782 0,86403 0,00233
Tabela 21: Dados populacionais para o Grupo B (n = 120).
(*) Marcador Marcador Marcador Marcador Marcador
21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162
N 240 240 240 240 240
H 0,608 0,775 0,533 0,817 0,8
PD 0,716 0,908 0,749 0,975 0,944
PIC 0,5 0,72 0,5 0,9 0,8
PE 0,301 0,553 0,218 0,63 0,599
p 0,11123 0,88887 0,7479 0,0001 0,9119
66
Tabela 22: Dados populacionais para o Grupo C (n = 220).
(*) Marcador Marcador Marcador Marcador Marcador
21q14446264 21q14507484 21q14591269 21q14618215 21q15368162
N 440 440 440 440 440
H 0,566 0,733 0,586 0,827 0,805
PD 0,728 0,915 0,754 0,979 0,951
PIC 0,5 0,74 0,51 0,89 0,82
PE 0,254 0,549 0,275 0,651 0,608
p 0,04562 0,5095 0,02143 0,1345 0,12447
()Definições segundo Butler, 2005.
N: Número de Cromossomos.
H: Heterozigose, calculada pelo percentual de indivíduos heterozigotos na
população de estudo.
PD: Poder de discriminação, probabilidade de discriminação, é igual a 1 menos a
soma do quadrado das frequências dos genótipos (PD = 1-P1).
PIC: Conteúdo de informação de polimorfismo, reflete a probabilidade de um dos
descendentes de um dos progenitores portador de um alelo não frequente em
um determinado lócus, permitir a dedução do genótipo parental neste loco. O
valor PIC é determinado pela soma das frequências de cruzamentos
multiplicada pela probabilidade de que um descendente seja informativo.
PE: Poder de exclusão, probabilidade de exclusão pode ser determinada pela
fórmula PE = H2 (1-(1 – H)H2, onde H é a heterozigose.
p: Teste exato de equilíbrio de Hardy-Weinberg. A interpretação de p é,
assumindo equilíbrio, qual fração dos genótipos aleatórios (isto é, entre um
número definido de simulações) poderia ser menos provável que a fração de
genótipos observados. Se os valores de p forem menores que 0,05, deve-se
duvidar da hipótese. Se os valores p forem maiores que 0,95, os dados estão
muito perfeitos para serem verdadeiros.
67
6. DISCUSSÃO
Os eventos de pareamento e recombinação meiótica são fundamentalmente
importantes para assegurar a correta segregação dos cromossomos homólogos e
cromátides-irmãs durante a gametogênese humana (Robles, 2007)
Alterações nesses eventos foram primeiramente descritos por Lamb et al.
(1996) como fatores de risco para a não disjunção do cromossomo 21 na síndrome
de Down.
Diversos estudos posteriores envolvendo a análise de segregação alélica de
marcadores STR em diferentes populações observaram de maneira consistente a
existência de alguns padrões de recombinação ao longo da região 21q de
cromossomos não disjuntos, caracterizados por ausência de troca, e trocas únicas
na região pericentromérica ou telomérica (Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman,
2000; Lamb et al., 2005; Sherman et al., 2006; Ghosh et al., 2009).
Contudo, em todos esses estudos, por motivos históricos, foi
predominantemente utilizado um conjunto de 14-40 marcadores STR distribuídos
entre 6-12 intervalos de igual extensão física em 21q(Lamb et al., 2005; Sherman et
al., 2006; Oliver et al., 2008; Ghosh, 2009; Ghosh et al., 2010), porém de maneira
aleatória no que se refere à distância genética (em centiMorgan - cM) entre eles.
Aproximadamente 85,7% deste conjunto de marcadores STR amplamente
utilizados são do tipo dinucleotídeo e trinucleotídeo. Limitações técnicas importantes,
intrínsicas à amplificação de marcadores com estes períodos podem ser
observadas. Estas consistem na amplificação de subprodutos denominados stutters,
múltiplos dos alelos verdadeiros que dificultam a designação alélica (Ellegren, 2004),
e a amplificação preferencial do alelo menor.
Adicionalmente, a utilização dos marcadores STR dinucleotídeos, não únicos,
D21S369, D21S215 e D21S1993 podem conduzir a falsos resultados no diagnóstico
da trissomia 21, na determinação das origens da não disjunção, e não menos
importante, no estabelecimento dos padrões de recombinação na região
pericentromérica, particularmente aqueles preditos como fatores de riscos para a
não disjunção.
68
Por exemplo, em um estudo no Canadá, foram analisadas quatro gerações de
uma família com quatro casos de síndrome de Down. Perfis dialélico na proporção
de 2:1 para o marcador D21S369 e trialélico na proporção de 1:1:1 para o marcador
D21S215 foram caracterizados na mãe e na avó materna de um indivíduo
acometido. Com base nesses dados, os autores especularam sobre a existência de
uma duplicação dessa região que poderia estar associada com alterações nos
eventos de recombinação e consequentemente com a frequência de trissomia 21
observada neste núcleo familiar. Contudo, os próprios autores não confirmaram esta
hipótese, visto que esta observação não foi consistente para os outros três casos
(Gair et al., 2005).
No presente estudo, utilizando os marcadores D21S369 e D21S215, um
cenário idêntico com dosagem alélica de 2:1 e 1:1:1 foi observado em casais
fenotipicamente normais com prole não acometida. Assim, este perfil genético deve
ser atribuído a alelos adicionais derivados de cópias parálogas destes marcadores
STR nos cromossomos 18 e 21, como validado computacionalmente, e não a uma
duplicação dessa região no cromossomo 21, contrário ao sugerido no estudo de Gair
et al. (2005).
Por análise computacional comparada foi possível mensurar o percentual de
identidade das sequências destes marcadores e suas cópias parálogas. Em
fragmentos que se estendem 500pb a montante e a jusante, similariedades entre os
cromossomos 21, 18 e 12 estão em torno de 93,16%, 98,12% e 80,15% para os
marcadores D21S369, D21S215 e D21S1993, respectivamente.
Este elevado percentual de identidade pode ser atribuído a presença de
genes truncados gerados por duplicação cromossômica, e sequências repetidas
interespaçadas do tipo LTR (Long Terminal Repeat) e Alu, acumuladas na região
pericentromérica do cromossomo 21 por transposição durante o processo evolutivo
dos primatas (Brun et al., 2003).
Assim, a região pericentromérica do cromossomo 21 apresenta homologia
com diversas outras regiões no genoma. No presente estudo, esta alta densidade
de cópias parálogas foi um fator limitante na identificação de novos marcadores STR
únicos na região 21p11.2-q21.1.
69
Dos 36 marcadores STR identificados, apenas cinco mapeados em 21q
apresentaram unicidade ao cromossomo 21: 21q14446264, 21q14507484,
21q14591269, 21q14618215 e 21q15368162.
Os marcadores 21p9991707 e 21q13539322 apesar de não serem únicos,
devido a correspondência incompleta dos iniciadores entre a sequência alvo e suas
cópias parálogas, com a aplicação de variações nas condições de amplificação foi
possível discriminar de maneira acurada os alelos cromossomo 21 específicos,
validando a utilização desses marcadores na construção de mapas genéticos, visto
que o marcador 21p9991707 é o primeiro marcador STR mapeado em 21p
enquanto o marcador 21q13539322 o primeiro mapeado em 21q.
Um estudo recente, envolvendo a análise de recombinação em ovócitos
através da detecção por imunofluorescência de proteínas participantes dos
processos de permuta genética, demonstrou que em 21p eventos de recombinação
ocorrem com uma freqüência 2,4% (Cheng et al., 2009). Assim sendo, o marcador
21p9991707 é um bom candidato no rastreio desses eventos, os quais, devido à
escassez de marcadores nessa região, são negligenciados nos mapas genéticos
amplamente utilizados.
No presente trabalho, para o estudo das origens de não disjunção e eventos
de recombinação ao longo da região 21q, foram tipados cinco marcadores STR
pericentroméricos inéditos (21q14446264, 21q14507484, 21q14591269,
21q14618215 e 21q15368162), e cinco não pericentroméricos (D21S11, D21S226,
D21S1270, IFNAR e D21S1411) em uma coorte de 60 núcleos familiares
acometidos pela SD.
Dos 60 núcleos familiares analisados, 59 casos (98,33%) foram identificados
como sendo de origem materna. Destes, 43 (72,9%) foram consistentes com erros
em MI e 16 (27,1%) com erros em MII. Distribuições semelhantes foram observadas
em diferentes populações (Muller et al., 2000; Machatkova et al., 2005; Ghosh et al.,
2009).
Não obstante, Ramírez et al., (2007) descreveram discrepâncias importantes
nessas frequências; em suas análises 46,1% dos erros de não disjunção entre os
cromossomos maternos ocorreram durante a MI, e 53,9% durante a MII. Os dois
marcadores proximais utilizados nesse estudo foram o D21S1432 e D21S11, os
70
quais estão afastados da região centromérica a uma distância de 11 cM e 25 cM,
respectivamente. A falta de resolução dos padrões de manutenção da heterozigose
parental a montante do marcador D21S1432, e consequentemente a não
identificação de eventos de recombinação ocorridos nessa região, podem ter
contribuído para alterações da frequência esperada para os erros de não disjunção
em MI. No entanto, os mesmos autores atribuem esse desvio ao tamanho reduzido
da população estudada.
A elevada prevalência dos casos de origem materna observada neste estudo,
com uma maior frequência em MI, está de acordo com o que tem sido descrito em
diversos estudos (Lamb et al., 1997; Hassold e Sherman, 2000; Lamb et al., 2005;
Sherman et al., 2006; Ghosh et al., 2009; Ghosh et al., 2010).
Dentre os casos de não disjunção de origem materna, o fator de risco mais
bem documentado é a idade materna avançada (Yoon et al., 1996; Castilla et al.,
1998; Egan et al., 2004; Freeman et al., 2007). Contudo, no presente estudo, 55%
dos acometidos avaliados, nasceram de mães jovens, incluídas abaixo da faixa
etária considerada de risco (>34 anos).
A média da idade materna manteve-se em torno de 31,8 anos, o que sugere
que para esta coorte, outros fatores, que não a idade materna, no momento da
concepção, estejam associados com os eventos de não disjunção observados, como
por exemplo, o que tem sido descrito como padrões alterados de recombinação
(Lamb et al., 1996; Yoon et al., 1996; Lamb et al., 1997; Lamb et al., 2005; Sherman
et al., 2006).
Os padrões alterados de recombinação caracterizam-se pela formação de
bivalentes susceptíveis a não disjunção. Estas configurações de susceptibilidade
consistem em: (i) bivalentes aquiasmáticos (não recombinados) e bivalentes com
formação de quiasmas restrita a região telomérica os quais são frequentemente
observados na não disjunção em MI; (ii) bivalentes com formação de quiasmas
restrita a região pericentromérica os quais são frequentemente observados entre os
erros de segregação em MII (Lamb et al., 1996; Lamb et al., 2005; Oliver et al.,
2008; Ghosh et al., 2009; Ghosh et al., 2010).
No presente estudo, dos 43 casos de origem materna com não disjunção em
MI, em 33 casos (76,7%) não foram observados eventos de recombinação. Nos 10
71
casos (23,3%) restantes eventos de recombinação foram identificados apenas nas
região não pericentromérica do cromossomo 21.
Quanto aos 16 casos de origem materna com não disjunção em MII, em dois
casos (12,5%) eventos de recombinação foram observados apenas na região
pericentromérica; em nove casos (56,2%) apenas nas não pericentroméricas; e em
um caso (6,2%) foi observado um evento duplo de recombinação, um na região
pericentromérica e outro na região telomérica. Nos quatro casos (25,1%) restantes
nenhum evento de recombinação foi observado ao longo do cromossomo 21.
De acordo com estes resultados, a força de associação e o risco relativo (RR)
da variável recombinação (pericentromérica, não pericentromérica, e ausência de
recombinação) para o desfecho em MI e MII foram calculados e a sua significância
estatística estimada pelo teste exato de Fisher e intervalo de confiança de 95%.
Nos casos com desfecho em MI, o principal fator de risco observado para a
não disjunção foi a variável ausência de recombinação, com RR= 1,96 (IC 95%:
1,22-3,14; p=0,0005). Interessantemente, eventos de recombinação não
pericentroméricos, apresentaram RR com valor <1, (RR=0,59; IC 95%: 0,37-0,93;
p=0,0114), o que caracteriza um efeito protetor para a não disjunção.
Nos casos com desfecho em MII, o principal fator de risco observado para a
não disjunção foi a variável recombinação pericentromérica, com RR= 4,31 (IC 95%:
2,68-6,94, p=0,0172), seguido pela variável recombinação não pericentromérica,
com RR= 3,25 (IC 95%: 1,38-7,65; p=0,0114). Interessantemente, ao contrário do
observado para os casos com desfecho em MI, a variável ausência de
recombinação apresentou um valor RR <1 no desfecho em MII (RR=0,20; IC 95%
0,07-0,54; p=0,0005), o que caracteriza um efeito protetor.
Embora, eventos de recombinação na região pericentromérica, os quais
correspondem a fatores de risco para a não disjunção em MII, sejam considerados
como padrões alterados de recombinação, no presente estudo, nenhum desvio na
frequência esperada desses eventos foi observado.
Assim, é possível especular que possíveis divergências na frequência dos
eventos de recombinação esperados e observados na maioria dos estudos possam
72
ser em parte devido a discrepâncias pontuais existentes nos mapas de
recombinação preditos para cromossomos disjuntos e não disjuntos.
No estudo de Oliver et al., (2008) o primeiro ponto no mapa de recombinação
para indivíduos dissômicos é referente ao marcador SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) rs990141, o qual está afastado aproximadamente a 5 cM (distância
genética interpolada para mulheres com base no mapa Rutgers) do primeiro
marcador STR D21S369 do mapa estipulado para indivíduos trissômicos.
O mesmo pode ser observado no mapa de recombinação estipulado para
indivíduos dissômicos descrito por Lamb et al. (2005), o primeiro marcador,
D21S120 está afastado 5,26 cM (distância genética interpolada para mulheres com
base no mapa Rutgers) do primeiro marcador D21S369 do mapa de recombinação
para indivíduos trissômicos.
Diante deste cenário, sem considerar o número de marcadores informativos e
não informativos, no mínimo 5% dos eventos de recombinação esperados na região
pericentromérica podem ter sido omitidos no mapa genético estipulado para
cromossomos normalmente disjuntos nesses dois estudos. Em outras palavras, até
mesmo os mapas utilizados como referência para padrão normal de recombinação
podem ser imprecisos.
Oliver et al. (2008), analisando 253 casos de não disjunção de origem
materna em MII, observaram uma frequência de 29,4% de recombinação no
intervalo 1 (mapa estipulado para cromossomos não disjuntos).
No presente estudo, dos 16 casos ocorridos durante a MII, foi observada uma
frequência de 18,8% de recombinação na região pericentromérica. Este resultado,
assim como o observado por Oliver et al. (2008) para casos de não disjunção em
MII, desvia-se grandemente dos 2% de recombinação pericentromérica predito por
esses autores para cromossomos normalmente disjuntos.
Contudo, analisando a frequência global de recombinação pericentromérica,
de maneira independente, sem agrupamentos no que se refere a idade parental e
estágio meiótico da não disjunção, assim como o realizado na geração de mapas
genéticos em cromossomos normalmente disjuntos, no presente estudo, entre os 59
73
casos de origem materna foi observada uma frequência de 5% de recombinação na
região pericentromérica.
De acordo com o mapa genético Rutgers, a distância genética (interpolada
para mulheres) entre o primeiro marcador, 21q14446264, e o último marcador
analisado, 21q15368162, são de 4,3 cM, portanto são esperados 4,3% de
recombinação nesta região, o que está próximo ao observado.
Seguindo o mesmo raciocínio, de acordo com a distância genética interpolada
no mapa Rutgers (estimada para mulheres) entre o primeiro marcador, D21S369, e
o último marcador, D21S1432, que delimitam o intervalo 1 proposto por Oliver et al.
(2008), é de 11,7 cM, e portanto, são esperados 11,7% de recombinação.
Considerando a frequência global dos eventos de recombinação observados nos
868 casos analisados por esses autores, foram observados no intervalo 1 cerca de
8,64% de recombinação.
Estes dados sugerem que padrões de recombinação considerados alterados
na literatura têm relação com interpretações equivocadas, geradas por discrepâncias
pontuais nos mapas de recombinação, e a inclusão de variáveis (agrupamentos por
idade parental e estágio meiótico da não disjunção) nas análises dos eventos de
recombinação identificados em cromossomos não disjuntos e normalmente
disjuntos.
74
7. CONCLUSÕES
A análise computacional genômica comparada mostrou-se extremamente
precisa na identificação de novos candidatos a marcadores STR na região
pericentromérica do cromossomo 21. Adicionalmente, a predição por
bioinformática do potencial polimórfico foi positivamente aplicável na seleção
de marcadores altamente informativos.
O ensaio Mpxcen21 mostrou-se robusto e acurado na determinação do
estágio meiótico da não disjunção, sendo em 100% dos casos informativo
para pelo menos um marcador STR.
O ensaio Mpxcen21 mostrou-se altamente eficiente na determinação da
frequência dos eventos de recombinação na região pericentromérica, a qual
revelou uma força de associação significativa para os eventos de não
disjunção em MII.
Recombinação pericentromérica ao longo do cromossomo 21 é um fator de
risco para a não disjunção em MII, enquanto que ausência de recombinação
confere um efeito de proteção.
Ausência de recombinação ao longo do cromossomo 21 é um fator de risco
para a não disjunção em MI, enquanto que eventos de recombinação não
pericentromérica conferem um efeito de proteção.
Os mapas genéticos atualmente utilizados na caracterização dos eventos de
recombinação ao longo de 21q são inconsistentes. A fragmentação e
discrepâncias pontuais entre mapas genéticos estipulados para cromossomos
normalmente disjuntos e não disjuntos conduzem a interpretações
equivocadas quanto ao perfil de recombinação ao longo do cromossomo 21.
75
8. REFERÊNCIAS
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9. ANEXO ATENDIMENTO ESPECIALIZADO GRATUITO
Projeto de Pesquisa: Rastreio de cromossomopatias: Sublinha: Pesquisa genética laboratorial sobre anomalias numéricas por meio da técnica da PCR Quantitativa de Fluorescência (QF-PCR).
Objetivo: A tipagem de DNA proposta nesta investigação laboratorial tem por finalidade confirmar ou afastar a suspeita de aneuploidia ou caracterizar os cromossomos sexuais na criança ----------------------------------------, que foi diagnosticada pela abordagem clínica como suspeita portadora de --------------------------------------------. O estudo visa à determinação e identificação de marcadores genéticos, cuja dosagem atípica está associada a cromossomopatias ou a caracterização do sexo cromossômico, a partir de amostra biológica. A amostra será doada pelos assistidos ao Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular NUDIM da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro UENF, sediado no Hospital Escola Álvaro Alvim HEAA da Fundação Benedito Pereira Nunes.
Prof. Dr. Enrique Medina-Acosta. M.Sc., Ph.D.
Coordenador Científico
Dra. Regina Célia de Souza Campos Fernandes, MD, M.Sc., Ph.D.
Coordenadora de Pesquisa Clinica
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu -------------------------------------------------------------------- ( ) MÃE, ( ) PAI e/ou ( ) RESPONSÁVEL LEGAL da criança ---------------------------------------, tendo sido satisfatoriamente informado(a) sobre o exame supracitado, e seus objetivos gerais, declaro por livre e espontânea vontade que concordo em participar do mesmo. Declaro estar ciente de que a identidade do(a) meu(minha) filho(a) será mantida sob sigilo absoluto, e que todas as dúvidas que porventura ocorram durante o processo desta pesquisa laboratorial serão devidamente esclarecidas, e que não haverá nenhum tipo de constrangimento ou ação em contra, caso decida por revogar a autorização aqui concedida para utilização das informações obtidas a partir dos estudos da amostra biológica coletada, a qualquer momento. Declaro não ter nenhum tipo de interesse econômico, em qualquer época, sobre os possíveis resultados alcançados durante as etapas subsequentes do andamento deste exame, deixando claro ser o meu interesse particular nessa pesquisa somente o de colaborador anônimo para o desenvolvimento científico em benefício do(a) meu(minha) filho(a).Em Campos (RJ), ---- de --------- de 2010.
________________________________________________________
Assinatura (mãe, pai e/ou responsável legal)