recombinação em estreptomicetos
TRANSCRIPT
UERGS
Prof. Dra Adriana Dantas
Características gerais do Gênero Streptomicetos Streptomices são bacterias Semelhança a genética de fungos Bactérias gram positivas Apresentam esporos Produzem colônias com micélio septado Colônias brancas tornando-se acizentadas pela
formação dos esporos Hifas aéreas
Importância para estudos genéticos Distância taxônomica em relação a
outra bactérias Complexidade morfológica Papel aplicado a industria de
antibióticos
Genética de Streptomyces
Cromossomo de Streptomycetos Um procarioto – apresenta um único
cromossomo sem extremidades Mapeamento de genes do S. coelicolor:
262 centimorgans Genes equivalentes se distanciam a
180° Origem provável do cromossomo
S. coelicolor por duplicação cromossômica
Marcos geneticos no cromossomo de Streptomyces coelicolor (180°)
leu A
cys A
ser B
whi B
met Bleu B
CysC; cysD
ser A
whi A
met A
Streptomyces coelicolor é um representante do grupo de solo-moradia, bactérias filamentosas responsáveis pela produção de antibióticos naturais mais utilizados na medicina humana e veterinária.
8.667.507 pares de bases do cromossomo linear deste organismo, que contém o maior número de genes até agora descobertos em uma bactéria.Os 7.825 genes previstos incluem mais de 20 agrupamentos de codificação para conhecidos ou previstos metabólitos secundários.
O genoma contém uma proporção sem precedentes de genes reguladores.
Um sintenia antiga foi revelado entre o "núcleo" central do cromossomo eo cromossomo inteiro de patógenos Mycobacterium tuberculosis e Corynebacterium diphtheriae.
A sequência do genoma vai aumentar muito nossa compreensão da vida microbiana no solo, bem como auxiliando na geração de novos fármacos por engenharia genética.
A
B
C
D
A´
B´
C´
D´
A
D
C
B
A´
B´
C´
D´
A´
B´ C´
D´
A
B
C
D
Origem do cromossomo Streptomyces
Mutantes em Streptomices
Auxotróficosserina, metionina, leucina, cisteína, etc
Resistentes a agentes inibidores: Ultra violeta, streptomicina
Morfológicos bald=micélio aéreo, white=colônia branca, sem
esporos
Resistentes a bacteriófagos Mutantes sensíveis a temperatura (t.o.30°C)
Conjugação Sermonti e Spada-Sermonti (1955) Recombinação sexual
S. colicolor, S rimosus, S fradie, S griseoflavus e S. scabies
Alguns cruzamento chegam a 0,001% de recombinantes
Três tipos de linhagensNF (normal fertility), IF (initial fertility), UF (ultra
fertility)
Plasmidio SCP1 – fator sexual
Transferência por conjugação de replicons circular e linear (a) cromossomo circular plasmídeo (F) e
circular (HFR) em E. coli: em ambos os casos, F-proteínas específicas realizar um evento nicking priming-a ORIT na F DNA, onde a extremidade 5‘ é covalentemente ligado a um das proteínas de transferência (TRAI), e um círculo rolante replicação é iniciada no final do 3.
Em células Hfr, o DNA cromossômico é liderado pela seqüência de F para a célula recipiente como um exogenote.
(b) Linear plasmídeos e cromossomos lineares de Streptomyces. As extremidades TP-capped pode agir como a origem da transferência (ORIT), onde o suposto TP-preparado de replicação é iniciada, e 5 ‘ TP-bound é deslocado e transferido, como para F / Hfr.
Conjugação IF tem plasmidio, SPC1 autônomo: SPC1+ e F+
Perda de IF – origina UF (sem plasmidio) UF sem plasmidio SPC1: F-
IF x UF – transferência de 100% do plasmidio, mas com 0,001% de recombinação
NF tem SPC1 integrado ao cromossomo: Hfr NF x UF – transferência plasmidio e fragmentos
do cromossomoCruzamento Fertilidade
IF x UF 0,01% recombinantes
NF x UF 100% fertilidade
UF x UF 0,001% recombinantes
NF x NF 1% de fertilidade
IF x IF 0,01% fertilidade
NF x IF 10% fertilidade
Reconhecimento dos tipos de fertilidade: Técnica de uma placa-mestra com 24 colônias
-o-o-o-o-o-o--o-o-o-o-o-o--o-o-o-o-o-o--o-o-o-o-o-o-
Placa-mestra (24 colônias)
Crescem:
NF ()IF ()
Crescem:IF ()UF ()
NF ()
Placa testadora: UF
Placa testadora: NF
Transferência Transferência para MM
Transferência para MM
Transferência
Tipos possíveis de cruzamentos
Cruzamento* % recombinação
Fragmentos transferidos
Direção**
SCP1- x SCP1- 0,001 Acaso Não-polarizada
SCP1+ x SCP1+ 0,01 Acaso Não-polarizada
SCP1+ x SCP1- 0,01 Heteroclone Misturada
SCP1 X SCP1 1 Acaso Não-polarizada
SCP1 x SCP1+ 10 Não ao acaso Polarizada
SCP1 x SCP1+ 100 Não ao acaso Polarizada
*SCP1- = UF; SCP1+ = IF; SPC1 = NF**Polarizada = há um doador; Não-polarizada = ambos pais atuam como doador e receptor
Técnicas de cruzamento Cultura mista
duas linhagens auxotróficas, com duas marcas, inoculadas em estria, uma sobre a outra em meio inclinado
Três dias a 30°C Filtragem em açlgodão
adiciona-se 2 mL água destilada esterilizada com
0,01% de espalhante,
Transferência novo tubo, centrifugação: 107 esporos / mL
Cada 106 aparece 103 recombinantes
Seleção dos recombinantes:Semeadura em meios mínimos (MM) com suplementação apropriadaOnde a¯, b¯, c¯ e d¯ são genes para requisitos
nutricionais
Cruza-se: a¯b¯ X c¯d¯
Semea-se:
MM + a + c
MM + a + d
MM + b + c
MM + b + d
Formação dos Heteroclones
Sermonti, Mancinelli e Spada-Sermonti (1960)São colônias pequenas vindas de culturas mistas e
dão esporos recombinantesSão merozigotos, crescem mal em MM
Métodos para marcas próximas e em repulsão : met2 phe1 str1 X his1 ura1
Colônias strr (resistentes) Colônias strs (suscetíveis)
met, ura 5his, ura 17ura 1met 2his 1met, ura, phe 1
met, ura 5his, ura 15ura 3met 0his 0met, ura, phe 0
Heterocariose
Fusão de hifas e transferência de cromossomos para um citoplasma
Ocorre entre linhagens da mesma espécie e entre diferente espécies de mesmo gênero
Obtida por meio de mistura de esporos Apenas parte do genoma é transferido Progênies da mistura de duas linhagens:
Heterocário (segregantes iguais aos pais)Merozigoto (heteroclone)
Formação do merozigoto dando recombinante diretamente ou heteroclone
A´
A A´
A
RecombinantePermuta dupla (ou par)
A
A´
Permuta simples
A