Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante

a recombinação V-(D)-J do a recombinação V-(D)-J do locuslocus da imunoglobulina da imunoglobulina

Fabrício SoutoFabrício SoutoGiuliano BonfáGiuliano BonfáJuliana UedaJuliana Ueda

Recombinação e expressão gênica da imunoglobulina

Cada clone de linfócitos B ou T produz um receptor com uma particular estrutura de ligação ao antígeno e a variabilidade de rearranjos possíveis ~107

Desenvolvimento da célula B e a recombinação dos segmentos gênicos de imunoglobulinas (Ig)

Célula pró-B precoce

Célula pró-B tardia

Célula pré-B grande

Célula pré-B pequena

Célula Bimatura

Célula Bmadura

Desenvolvimento da célula B e a recombinação dos segmentos gênicos de imunoglobulinas (Ig)

Os genes RAG possuem importantes propriedades

As proteínas RAG1 e RAG2 são específicas para determinado tipo celular, sendo produzidas

somente em linfócitos T e B;

Os genes RAG são expressos somente nos linfócitos B e T imaturos, mas não em células B e T

maduras;

Os genes RAG são expressos nas fases G0 e G1 do ciclo celular e são silenciados nas células em

proliferação.

Controle da recombinação por mecanismos epigenéticos

Histonas: H3K9ac; H3K4me2; H3K4me3 (marcadores de histonas ativas)

Os loci de Igh e Ig estão posicionados na região central do núcleo no estágio pro-B

Locus da cadeia pesada da imunoglobulina (Igh)

A interação RAG - RSS leva a clivagem do DNA permitindo a

recombinação entre V e DJ e exclusão dos genes V não relevantes

Retirada do circulo de

DNA

V2V2

V3V3

V4V4V8V8

V7V7V6V6

V9V9

V5V5

DDJJV1V1 CC

DDJJV2

V3

V4

V8

V7 V6

V5

V9

V1V1 RAG1/2RAG1/2

RAG1/2 RAG1/2CC

Cadeia Pesada IgCadeia Pesada Ig

Formação do loop,

retirada do DNA

Fatores envolvidos na contração e looping da cromatina

Fator de ligação CCCTC (CTCF)Atividade de insulator (impede a atividade dos enhancers ou impede a condensação da cromatina)

Giuliano Bonfá

CTCF e cohesina são necessários durante a recombinação dos genes da imunoglobulina??

Fator de transcrição envolvido no rearranjo da Ig

Conhecido como proteína ativadora de células B

(BASP, B-cell activator protein)

Fator de transcrição envolvido na contração do locus Igh

A contração do locus Igh é dependente de Pax5

Juliana Ueda

Objetivo:

Identificar fatores nucleares responsáveis por regular a contração cromossômica e formação dos “loops”, favorecendo a recombinação V(D)J em um determinado estágio de desenvolvimento das células B.

Animais e metodologia

RAG-/-

µ+RAG-/-

µ+RAG-/- com gene IgH rearranjado (pré-B)

B6 Timócitos

ChIP qPCR

B6 MEF

B6 MEF fibroblastos embrionários de camundongos B6

RAG-/-

µ+RAG-/-

medula ósseaCD19+

ChIP-chip (MAT software)

medula ósseaCD19+

ChIP-chip

Author: Thomas Hentrich

Qual a localização dos sítios de ligação para CTCF no cromossomo 12?

Cromossomo 12ChIP-chip Affymetrix mouse tiling array E

Sítios de CTCF estão espalhados em todo cromossomo, com maior frequência no locus Igh em células pró e pré-B.

Sítios de CTCF estão espalhados em todo cromossomo, com maior frequência no locus Igh em células pró e pré-B.

locus Igh

Qual a localização dos sítios de ligação para CTCF no locus Igh?

VH=53

ChIP-chip

Dois sítios posicionados na porção 5’ do gene DH e os demais espalhados no locus VH ,principalmente na porção

distal.

Dois sítios posicionados na porção 5’ do gene DH e os demais espalhados no locus VH ,principalmente na porção

distal.

8 CTCF 12 CTCF 33 CTCF

Qual a diferença de ligação de CTCF em células pró-B, pré-B e Timócitos no locus Igh?

ChIP qPCR

B6 MEF fibroblastos embrionários de camundongos B6

A ligação de CTCF no locus VH é similar nos diferentes tipos celulares

A ligação de CTCF no locus VH é similar nos diferentes tipos celulares

Coesina (Rad21) participa do complexo, ligando-se à sítios de CTCF no locus Igh?

ChIP qPCR

Coesina co-localiza com CTCF em todo o locus Igh, preferencialmente em pro-B

Coesina co-localiza com CTCF em todo o locus Igh, preferencialmente em pro-B

Como estão distribuídos os sítios para CTCF no cromossomo 6?

Cromossomo 6

Os sítios para CTCF no cromossomo 6 são distribuídos igualmente nas células pro e pre-B

Os sítios para CTCF no cromossomo 6 são distribuídos igualmente nas células pro e pre-B

ChIP-chip Affymetrix mouse tiling array F

Como estão distribuídos os sítios para CTCF no locus Igκ?

locus IgκChIP-chipSis elemento regulador negativo do rearranjo

Poucos sítios CTCF em comparação com Igh, com 11 em pre-B e apenas 4 em pro-B na região Vκ

Poucos sítios CTCF em comparação com Igh, com 11 em pre-B e apenas 4 em pro-B na região Vκ

11 CTCF Vκ

4 CTCF Vκ

ChIP qPCR

Qual a diferença de ligação de CTCF e Coesina em células pró-B, pré-B e Timócitos no locus

Igκ?

Células pre-B apresentam maior ligação de CTCF e coesina no locus Igκ

Células pre-B apresentam maior ligação de CTCF e coesina no locus Igκ

Há sítios de CTCF presentes no locus Igλ?

locus IgλChIP-chip

Em pro e pre-B há poucos (3), mas fortes sítios para CTCFEm pro e pre-B há poucos (3), mas fortes sítios para CTCF

3 CTCF

Qual a diferença de ligação de CTCF e Coesina no locus Igλ?

ChIP qPCR

CTCF e coesina ligam-se mais em pre-B nos 2 sítios 5’CTCF e coesina ligam-se mais em pre-B nos 2 sítios 5’

“Modelo Roseta”

Conclusão CTCF está presente em todos loci da Ig;

CTCF é estágio-específico apenas nos loci κ e λ ;

Coesina co-localiza com CTCF e juntas são estágio-

especifica e linhagem-específica para todos os loci da Ig;

Juntas são importantes na formação dos “loops” e

contração do locus V.

Objetivo: Identificar elementos reguladores no locus da Igh

ImunoprecipitaçãoH3K4me2H3K9ac

H3K4me3Pax5

CTCF

Camundongo RAG-/-

Célula Pró-B Pax5 -/-

Camundongo RAG-/- Pax5-/-

Célula Pró-B Pax5+/+

Medula óssea CD220+ CD19+ C-Kit+ CD25- IgM-

Elementos reguladores geralmente estão presentes em regiões de cromatina ativa

Cultivadas 4-5dIL-7

Há regiões intergênicas com cromatina ativa nas porções central e proximal do locus Igh?

- Poucas regiões intergênicas com cromatina ativa nas porções central e proximal do locus Igh- Ausência da histona H3K4me3: promotor não ativo

Diferentes famíliasPreto: VHJ558Rosa: VH3609

Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh?

Família VH3609: únicos genes da porção distal que possuem cromatina ativa

Genes VH3609+ H3K4me2+ H3K9ac

Identificação regiões com cromatina ativa upstreamgenes VH3609

+ H3K4me2+ H3K9ac+ H3K4me3 (promores ativos)

Pax5 -/-

Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh?

Pax5 : sítios de ligação nos genes VH3609

Céls Pró-B Pax5 -/-Genes VH3609 continuam com cromatina ativa: Independente de Pax5

Pax5: sítios de ligação nas regiõesupstream

Céls Pró-B Pax5 -/-Regiões upstream deixam de apresentar cromatina ativaDependente de Pax5

CTCF: sítios de ligação nas regiõesupstream, independente de Pax5

Pax5 -/-

Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh?

Presença de elementos associados aos genes VH3609Com sítios de ligação Pax5 e CTCFCromatina ativa é dependente de Pax5

Genes família VH3609

Estes dados indicam…Porção distal do locus Igh:

Esses elementos associados aos genes VH3609 são conservados?

Identificados 14 cópias de sequências repetidas conservadas na região distal do locus da Igh• Ausentes no restante do genoma murino

Elementos depentendes de Pax5 para indução de cromatina ativa nas céls pró-B: PAIRPAIR: Pax5-Activated Intergenic Repeats

11 PAIRs upstream VH3609 genes

CTCF: liga-se a todos PAIR85 sítios (distal e proximal)

PAX5: 14 Síitos de ligação 1/3 distal 7:central/proximal 4 região 3’ locus

Esses elementos associados a VH3609 são conservados?

PAIR: 470bp4 subfamílias

Associação subfamílias PAIRs com genes VH3609

Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5?

CTCFForte footprint PAIR4Fraco footprint PAIR6 e 7

Ausente Macrófagos

In vivo footprint: Macrófago (MO), pró-B (Rag2-/- Pax5+/+ ou Pax5-/-) tratamento DMS + piperidina

DMS: dimethyl sulfate

E2APadrão footprint semelhante entre os PAIRs

In vivo footprint

Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5?

Interação de CTCF, E2A e Pax5em diferentes PAIRs no início do desenvolvimento de céls B CTCF ---- E2A ----Pax5

In vivo footprint

Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5?

Os sítios de ligação dos fatores de transcrição são conservados nos diferentes PAIRs?

10 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do CTCF10 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do EA29 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do Pax5

Oligonucleotídeos não marcados

Confirmando a ligação dos fatores de transcrição nestas regiões….

Extrato nuclear (pró-B)Sonda (PAIR7)*Competidores Ensaio de mobilidade

eletroforética

PAIR7 tem afinidade (alta) semelhante aos sítios presentes em uE5 ekE2 (1989)

Oligonucleotídeos não marcados

Extrato nuclear (pró-B) Sonda (PAIR7)*Competidores Ensaio de mobilidade

eletroforética

O sítio de ligação de Pax5 em PAIR7 possui a mesma afinidade que sítio “referência”(promotor Cd19)e que uma única substituição de nucleotídeos (PAIR10), inserção de um resíduo A (PAIR8) ou substituiçãode 3pb (PAIR7M) inibe ligação de PAx5

Confirmando a ligação dos fatores de transcrição nestas regiões….

Cél Pró-B Rag2-/-Isolamento RNA Poly A+

RT-PCR éxons 1 e 2 (antisense)Unspliced (u)Spliced (s)

Investigação da atividade transcricional antisense dos PAIRs

Facilitar ligação RAGMenor transcriçãoMenor rearranjo

Céls Pró-B, Pré-B, células B imaturas, cél T DP (sorted)Extração RNART-PCR éxons 1 e 2 (antisense)Unspliced (u)Spliced (s)

A transcrição antisense originada pelos PAIRs analisados é dependente de Pax5e restrita ao estágio de célula pró-B

Investigação da atividade transcricional antisense dos PAIRs

Atividade transcricional de PAIR4 e PAIR7

Esses PAIRs funcionam como elementos reguladores da transcrição em células pró-B transfectadas

Ensaio de transcrição transienteCél pró-BTransfecção PAIR4 + promotor luciferase24 horas : quantificação transcrição gene luciferase

* Mutação sítio de Pax5

Funciona como um enhancer dependente de Pax5

Investigação da atividade transcricional dos PAIR4

CTCF:Menor PAIR4= PAIR 6 e 7

Na célula pré-B:

E2A:Semelhante

Pax5Ausente

Pax5 se liga de forma eficiente em células pró-B, mas não nos estágios seguintes de desenvolvimento, fazendo com que esses elementos permaneçam inativos nas céls pré-B

Estes fatores de transcrição ligam-se aos PAIRs ns próximos estágios de desenvolvimento da célula B?

Rag-/-Céls Pró-B (MO), células B maduras (LN), cél T DP (T)ChiPAnticorpo anti-CTCF

Padrão e intensidade de ligação similar de CTCF e Rad21 na região regulatória 3’RRe na região proximal dos genes Vh nos 3 tipos celulares

Quais são os sítios de ligação de CTCF nos próximos estágios de desenvolvimento da célula B?

CTCF: interage com todos os PAIRs (cél pró-B), com eficiência diferenteRad21: mesmo padrão CTCFCTCF: redução/ausência de ligação nos estágio cél B madura e cél T DP (exc. PAIR4)CTCF e Rad21: interagem preferencialmente nos elementos PAIRs em células pró-B

Quais são os sítios de ligação de CTCF nos próximos estágios de desenvolvimento da célula B?

Região distal do locus da Igh:Elementos reguladores dependentes de Pax5Sítios de ligação para CTCF, E2A e Pax5Transcrição antisense dependente de PAx5 (pró-B)

Regulação da recombinação distal VhH- DJ no locus da Igh

Conclusão