química de productos naturales - udea
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Química de Productos Naturales
Alejandro Martínez M.
Química de Productos Naturales
Alejandro Martínez M. [email protected]
Fotografías de interior https://pxhere.com/
Medellín, Colombia 2020
Alejandro Martínez M.
Químico, con maestría y doctorado en química, egresado de La Universidad Nacional de Colombia.
Profesor e investigador del Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias, vinculado a La Universidad de Antioquia desde 1985.
Fundador del Grupo de Investigación Productos Naturales Marinos.
Orcid ID: https://orcid.org/0000-0001-7409-7990
i
Agradecimientos
Este trabajo está dedicado a los estudiantes y colegas que durante este tiempo han tenido
la paciencia de leerme y escucharme. También a personas que por internet me han sugerido
algunas modificaciones. A todos ellos muchas gracias, y mi reconocimiento personal.
A La Universidad de Antioquia y a La Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias, por
acogerme en sus aulas, laboratorios, oficinas, y tantos sitios tan hermosos y personas
amables, que pudieron soportarme durante estos años, a mis profesores, a mis compañeros
de oficina, de la Facultad y a los miles de estudiantes con quienes traté de aprender acerca
de los productos naturales. Siempre los llevaré en mi corazón con mucha humildad y eterno
agradecimiento.
A la profesora Carmenza Duque Beltrán, profesora emérita y distinguida de la Universidad
Nacional de Colombia. Por su paciencia, por todo su apoyo y su ejemplo de trabajo dedicado
a la docencia en química y a la investigación de la química de los productos naturales
marinos, que me han servido de modelo para el desarrollo no solo como investigador sino
como docente y como persona.
A los profesores y estudiantes del grupo de investigación Productos Naturales Marinos, de la
Universidad de Antioquia.
A mi familia, por todo el apoyo que me han dado no solo para este proyecto, sino para todos
los trabajos realizados en medio de diferentes dificultades.
Al SDBS, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan; por
permitir el uso de los datos espectrales referenciados dentro del texto.
Al sitio web NMRdb.org, por poner a libre disposición herramientas tan útiles para que más
personas puedan acceder a este campo inmenso de conocimiento como es el de la química
de los productos naturales, y la química orgánica en general.
A todas aquellas personas y entidades, que de alguna forma me animaron a desarrollar y
contribuyeron a cristalizar este proyecto.
Alejandro Martínez M.
Medellín, Colombia
2020
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Presentación
Este texto es una recopilación actualizada de las notas y documentos que, durante más de
30 años, el autor ha desarrollado como profesor en la Facultad de Ciencias Farmacéuticas
y Alimentarias de La Universidad de Antioquia.
El texto está dirigido, especialmente, a los estudiantes del pregrado de química
farmacéutica quienes han cursado previamente las asignaturas: química orgánica,
bioquímica y análisis instrumental, y pretende que tengan un acercamiento al extenso
campo que es la química de los productos naturales, además trata de cubrir en parte la
poca existencia de textos en español sobre el tema. No pretende ser un tratado completo
sobre los diferentes temas presentados, pues queda limitado a las posibilidades y
experiencia del autor, y está dirigido a los estudiantes de las asignaturas Farmacognosia II y
Fitoquímica.
El énfasis es dado a los aspectos químicos de los productos naturales pero también se
mencionan el potencial farmacéutico y el uso aprobado de algunas sustancias, drogas
vegetales o plantas; pero solo a manera de referencia para mostrar las posibilidades de los
productos naturales desde lo académico y lo relacionado a la investigación científica, nunca
para su uso o aprovechamiento comercial ni para suplir información ante los entes
regulatorios oficiales ni para engañar al ciudadano común en los diferentes medios de
comunicación, aspectos estos que están por fuera del interés y el alcance de este texto.
A manera de aproximación, y desde la experiencia del autor, se relaciona la presencia en las
sustancias estudiadas, de grupos funcionales como los hidroxilos fenólicos relacionándolos
con su potencial actividad antioxidante, y de grupos como los anillos lactónicos, los cuales
están presentes en muchas sustancias naturales bioactivas, como los cardiotónicos y las
sesquiterpénlactonas. A lo largo de los diferentes capítulos se referencia, preferiblemente
mediante publicaciones indexadas recientes, el uso potencial de los diferentes metabolitos
contra diferentes enfermedades, citando en muchos casos los nombres comunes y
binomiales de diferentes plantas y organismos, en los cuales se han encontrado y se
investigan estas sustancias.
Debido a que esta área del conocimiento es muy extensa y en continuo desarrollo por
nuevos hallazgos, en este texto los capítulos tienen alcances diferentes. Los capítulos 1 al
4, en particular, incluyen temas generales sobre la fitoquímica de los metabolitos
secundarios y tienen un desarrollo más completo sobre aspectos y metodología
iii
experimentales. Los demás capítulos cubren especialmente tópicos especiales sobre
algunos temas en los que el autor ha tenido experiencia docente e investigativa como los
productos naturales marinos, y otros temas que están emergiendo cada vez más como
fuentes de nuevas sustancias bioactivas como son los hongos. De estos tópicos algunos
tienen un desarrollo más extenso en cuanto a aspectos fitoquímicos, como son los capítulos
5 y 7. Los demás capítulos resumen solo algunos aspectos generales que, a juicio del autor,
pueden motivar a los estudiantes y lectores a trabajar en esas áreas de investigación.
En la introducción se realiza un ejercicio (o taller), en el cual se asignan a los estudiantes
diferentes tipos de estructuras químicas de metabolitos secundarios de estructura
relativamente simple. Con este ejercicio se pretende que el estudiante a partir de los
conocimientos previos de otras asignaturas, relacione lo allí aprendido con el caso de los
metabolitos secundarios que comienza a conocer. Además, se reafirman algunos conceptos
básicos de química orgánica, que son necesarios para el estudio y comprensión de la
química de los productos naturales.
El capítulo primero, trata de los métodos generales de extracción, aislamiento y
caracterización, y menciona tanto los métodos clásicos, y la evolución hacia el uso por
ejemplo con métodos de extracción más modernos, más eficientes y especialmente más
amigables con el medio ambiente y la salud. Inclusive se propone el remplazo en las técnicas
de extracción e identificación, de solventes tóxicos como cloroformo, diclorometano y
metanol, por unos menos dañosos para la salud y el medio ambiente como son el acetato
de etilo, y el etanol, y otros innovadores como son los solventes eutécticos viscosos. En las
técnicas de caracterización química se hace énfasis especial en la resonancia magnética
nuclear, para que el estudiante la aplique en la identificación y caracterización de
metabolitos secundarios.
El capítulo segundo trata sobre una gran clase de productos naturales como son los
compuestos fenólicos o aromáticos en general, y se enfatiza en dos grupos de sustancias
como son las antraquinonas y los flavonoides. Las primeras debido a su presencia en
muchas drogas vegetales aceptadas por diferentes farmacopeas, como laxantes; y las
segundas como antiinflamatorias de uso externo. Pero se menciona que más allá de su uso
aceptado, presentan grandes posibilidades para el desarrollo de nuevas terapias contra
diferentes enfermedades. Es de esperar que el estudiante con los diferentes aspectos
químicos y de actividad biológica mencionados para estas dos grandes clases de
compuestos fenólicos naturales, tenga herramientas para acercarse al conocimiento sobre
los compuestos fenólicos naturales en general. Se incluyen algunos ejercicios, con el fin de
que el estudiante sea capaz de resolver problemas de asignación de la estructura química
de algunos metabolitos con anillos aromáticos, haciendo uso especial de los datos de
iv
resonancia magnética nuclear, y predecir en algunos casos el origen biogenético y la
potencial actividad antioxidante, entre otras.
El capítulo tercero, está relacionado con otra gran cantidad de sustancias, que
generalmente no contienen en su estructura química el anillo aromático. El grupo más
representativo de estos son los terpenoides. Se profundiza en algunos aspectos de
compuestos tales como los esteroles, las saponinas y los cardiotónicos. Los esteroles y
saponinas son materias primas importantes en la industria farmacéutica para la producción
de una gran cantidad y diversidad de medicamentos esteroides. Los cardiotónicos, son
drogas aceptadas en diferentes farmacopeas y legislaciones porque estimulan la función
cardiaca. Además, recientemente se les han reportado otras actividades biológicas
interesantes. Se plantean algunos ejercicios sobre la determinación estructural de algunos
esteroides, a partir de datos de espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear,
para que el estudiante afiance su conocimiento sobre la química de estas sustancias.
El capítulo cuarto, trata acerca de los compuestos nitrogenados como son los alcaloides.
Estos constituyen una gran cantidad de compuestos naturales nitrogenados, que
presentan diferentes actividades biológicas, particularmente sobre el sistema nervioso. Se
dan algunos aspectos químicos generales de esta clase de compuestos.
El capítulo cinco, cubre algunos aspectos generales sobre los aceites esenciales, los cuales
además de su uso como aromatizantes, presentan diferentes propiedades biológicas como
antimicrobianos y antioxidantes, inclusive con uso potencial en enfermedades
cardiovasculares. Por tratarse en muchos casos de mezclas de compuestos con anillos
aromáticos y otros no aromáticos como terpenoides, no se incluye este tema en los
capítulos precedentes.
El capítulo seis es una breve revisión sobre los productos naturales marinos, mostrando
especialmente la gran variedad estructural y la complejidad química de estas sustancias,
con algunos ejemplos representativos recientes.
El capítulo siete trata brevemente varios aspectos químicos y de actividad biológica de las
sesquiterpénlactonas, las cuales son sustancias interesantes farmacéuticamente por sus
propiedades sobre las células. Otra vez es bueno precisar, que estos compuestos no se
incluyen el capítulo 3, debido a que el anillo lactónico está relacionado con actividades
biológicas relativamente específicas como la citotoxicidad, lo cual no es una característica
general de los compuestos o metabolitos mencionados en dicho capítulo 3, ni con los
aceites esenciales.
El capítulo ocho, menciona algunos tópicos básicos relacionados con otros derivados de la
acetilcoenzima-A, como son las prostaglandinas, las cadenas policetídicas y su papel como
precursores de antibióticos como las tetraciclinas, y otros compuestos aromáticos.
v
Los capítulos 9 y 10, tratan algunos aspectos básicos generales de metabolitos interesantes
de hongos y los glicósidos cianogénicos.
El capítulo 11, trata algunos aspectos generales de los compuestos azufrados naturales,
especialmente sobre los que se han reportado estudios químicos y actividad biológica, y
haciendo énfasis especial en los glucosinolatos, por sus estudios básicos reportados sobre
su potencial para la prevención de cáncer y enfermedades neurodegenerativas, y en
general sobre el sistema inmune.
La bibliografía se escogió considerando especialmente la más reciente y que está disponible
en las bases de datos de La Universidad de Antioquia, en La Biblioteca Central y en las del
formato de acceso abierto (open Access), esto con el objetivo que los estudiantes y demás
interesados, puedan tener acceso a los documentos, con los menores costos económicos.
También es importante la disponibilidad actual de herramientas de software en línea como
nmrdb.org, que permiten al estudiante avanzar en las técnicas de dilucidación estructural
de los productos naturales.
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Contenido
Introducción ....................................................................................................................................................... 1 Capítulo 1. Técnicas generales de aislamiento, separación, caracterización y cuantificación de metabolitos secundarios ....................................................................................................................................................... 18
Técnicas generales de extracción de metabolitos secundarios ......................................................................... 21 Compuestos solubles en agua y solventes polares ........................................................................................ 21 Compuestos solubles en solventes orgánicos de mediana y baja polaridad ................................................ 22 Compuestos solubles en soluciones acuosas alcalinas .................................................................................. 23 Compuestos solubles en soluciones acuosas ácidas ...................................................................................... 24 Extracción con solventes eutécticos viscosos (DES) y líquidos iónicos (IL) ................................................... 24 Extracción en fase sólida .................................................................................................................................. 28 Extracción Sohxlet ............................................................................................................................................ 29 Extracción asistida con ultrasonido ................................................................................................................. 30 Extracción con fluidos supercríticos y subcríticos .......................................................................................... 30 Extracción asistida con microondas ................................................................................................................ 31
Cromatografía en Capa Fina y en Columna (CCF y CC) ....................................................................................... 32 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (sigla inglesa HPLC) ........................................................................... 33 Técnicas generales de caracterización de metabolitos secundarios ................................................................. 34
Espectroscopia Ultravioleta-Visible (UV-vis) ................................................................................................... 35 Espectroscopia infrarroja (IR) .......................................................................................................................... 37 Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear ....................................................................................... 38 Espectrometría de masas................................................................................................................................. 47
Técnicas generales de cuantificación de metabolitos secundarios ................................................................... 50 Análisis fitoquímico preliminar ............................................................................................................................ 52
Ensayos de reconocimiento de alcaloides ...................................................................................................... 52 Ensayos de reconocimiento para compuestos fenólicos ............................................................................... 53 Ensayo de reconocimiento de flavonoides ..................................................................................................... 53 Ensayos de reconocimiento para terpenoides ............................................................................................... 54
Referencias bibliográficas .................................................................................................................................... 58 Capítulo 2. Metabolitos secundarios aromáticos .............................................................................................. 66
Compuestos fenólicos derivados del ácido shikímico ........................................................................................ 67 Biogénesis de fenilalanina y tirosina ............................................................................................................... 72 Biogénesis de compuestos C6 .......................................................................................................................... 76 Biogénesis de compuestos C6C1 ...................................................................................................................... 77 Biogénesis de compuestos C6C2 ...................................................................................................................... 79 Biogénesis de compuestos C6C3 (Fenilpropanoides) ...................................................................................... 79 Biogénesis de compuestos (C6C3)2 (Lignanos) y (C6C3)n Ligninas ................................................................... 80 Biogénesis de cumarinas .................................................................................................................................. 85
Antraquinonas y compuestos relacionados ........................................................................................................ 87 Nomenclatura ................................................................................................................................................... 89 Clasificación ...................................................................................................................................................... 90 Biogénesis ......................................................................................................................................................... 91 Biogénesis vía MalonilCoA ............................................................................................................................... 91 Biogénesis vía ácido shikímico + ácido mevalónico ........................................................................................ 93 Distribución y estado natural ........................................................................................................................... 94 Hechos estructurales ....................................................................................................................................... 95
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Métodos de extracción y aislamiento ............................................................................................................. 95 Valoración de antraquinonas y compuestos relacionados ............................................................................ 97 Ensayo de Bornträger ....................................................................................................................................... 98 Ensayo con Acetato de Magnesio alcohólico.................................................................................................. 98 Ensayo de reducción moderada ...................................................................................................................... 98 Espectroscopia Ultravioleta ............................................................................................................................. 98 Espectroscopia Infrarrojo ................................................................................................................................. 99 Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear .....................................................................................100 Espectrometría de masas...............................................................................................................................101 Actividad biológica .........................................................................................................................................102 Algunas drogas vegetales que contienen antraquinonas y compuestos relacionados ..............................102 Naftoquinonas ................................................................................................................................................106 Problemas .......................................................................................................................................................108
Flavonoides .........................................................................................................................................................116 Aspectos químicos y de actividad biológica de las diferentes clases de flavonoides .................................116 Distribución y estado natural .........................................................................................................................129 Propiedades físicas .........................................................................................................................................129 Biogénesis .......................................................................................................................................................130 Extracción y aislamiento ................................................................................................................................131 Cuantificación de flavonoides totales ...........................................................................................................133 Ensayo de Shinoda .........................................................................................................................................133 Reconocimiento de antocianinas ..................................................................................................................133 Espectroscopia ultravioleta-visible ................................................................................................................134 Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear .....................................................................................136 Espectrometría de masas...............................................................................................................................140 Hidrólisis ácida y alcalina ...............................................................................................................................147 Relaciones Estructura-Actividad Biológica ....................................................................................................147 Metabolismo ...................................................................................................................................................149 Drogas aceptadas en Colombia y otras plantas que contienen flavonoides ..............................................149 Fuentes de antocianinas ................................................................................................................................151 Problemas .......................................................................................................................................................152 Cannabis..........................................................................................................................................................155
Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................158 Capítulo 3. Metabolitos secundarios no aromáticos ....................................................................................... 170
Esteroles ..............................................................................................................................................................172 Distribución y estado natural .........................................................................................................................172 Nomenclatura .................................................................................................................................................173 Propiedades físicas .........................................................................................................................................175 Biogénesis .......................................................................................................................................................176 Hechos estructurales .....................................................................................................................................176 Extracción y aislamiento ................................................................................................................................179 Ensayo de Liebermann-Burchard ..................................................................................................................181 Espectroscopia infrarroja ...............................................................................................................................181 Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear .....................................................................................181 Espectrometría de masas...............................................................................................................................185 Espectroscopia ultravioleta-visible ................................................................................................................191 Correlaciones estructura y rotación específica ............................................................................................191 Utilidad farmacéutica .....................................................................................................................................192 Síntesis ............................................................................................................................................................194 Ejercicio ...........................................................................................................................................................194
Saponinas y sapogeninas esteroides .................................................................................................................201 Biogénesis .......................................................................................................................................................202 Hidrólisis .........................................................................................................................................................204
viii
Nomenclatura .................................................................................................................................................204 Ensayos de reconocimiento ...........................................................................................................................205 Ensayo de la espuma ......................................................................................................................................205 Ensayo de hemólisis .......................................................................................................................................205 Ensayo de Liebermann-Burchard ..................................................................................................................206 Extracción y aislamiento ................................................................................................................................206 Espectroscopia infrarrojo ...............................................................................................................................207 Espectrometría de masas...............................................................................................................................207 Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear .....................................................................................209 Regla de Klyne ................................................................................................................................................211 Método de Hakomori .....................................................................................................................................211 Distribución natural ........................................................................................................................................214 Importancia farmacéutica ..............................................................................................................................214
Glicósidos cardiotónicos ....................................................................................................................................218 Biogénesis .......................................................................................................................................................219 Distribución natural ........................................................................................................................................219 Ensayos de reconocimiento ...........................................................................................................................219 Hidrólisis .........................................................................................................................................................220 Hechos estructurales .....................................................................................................................................220 Extracción y aislamiento ................................................................................................................................222 Espectroscopia infrarrojo ...............................................................................................................................223 Espectroscopia ultravioleta ...........................................................................................................................223 Espectrometría de masas...............................................................................................................................223 Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear .....................................................................................225 Utilidad farmacéutica .....................................................................................................................................225 Algunas drogas vegetales que contienen cardiotónicos ..............................................................................226
Carotenoides .......................................................................................................................................................228 Clasificación ....................................................................................................................................................230 Biogénesis .......................................................................................................................................................230 Distribución y estado natural .........................................................................................................................230 Nomenclatura .................................................................................................................................................231 Extracción y aislamiento ................................................................................................................................232 Ensayos de reconocimiento ...........................................................................................................................234 Características espectrales ............................................................................................................................234 Actividad biológica .........................................................................................................................................237
Alcaloides esteroidales .......................................................................................................................................237 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................240
Capítulo 4. Alcaloides ...................................................................................................................................... 246 Definición ............................................................................................................................................................247 Función biológica ................................................................................................................................................253 Clasificación ........................................................................................................................................................254 Distribución y estado natural .............................................................................................................................256 Ensayos de reconocimiento ...............................................................................................................................256 Extracción ............................................................................................................................................................257 Técnicas de separación e identificación ............................................................................................................259 Biogénesis ...........................................................................................................................................................261 Interés farmacéutico de los alcaloides ..............................................................................................................265 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................270
Capítulo 5. Aceites esenciales ......................................................................................................................... 274 Definición ............................................................................................................................................................275 Clasificación ........................................................................................................................................................275 Distribución y estado natural .............................................................................................................................276 Monoterpenos y sesquiterpenos.......................................................................................................................277
ix
Biogénesis de terpenos ......................................................................................................................................278 Biogénesis del ácido mevalónico .......................................................................................................................279 Biogénesis de IPP y DMAPP................................................................................................................................280 Condensación cabeza-cola de IPP y DMAPP .....................................................................................................280 Biogénesis de monoterpenos en Mentha piperita ...........................................................................................281 Fenilpropanos .....................................................................................................................................................286 Biogénesis de fenilpropanos ..............................................................................................................................288 Extracción y aislamiento de componentes de aceites esenciales ...................................................................288 Métodos de separación y análisis ......................................................................................................................289 Ensayos de reconocimiento ...............................................................................................................................291 Espectroscopia infrarrojo ...................................................................................................................................291 Espectroscopia ultravioleta ................................................................................................................................291 Resonancia Magnética Nuclear .........................................................................................................................292 Espectrometría de Masas ..................................................................................................................................295 Ejemplos de drogas vegetales que contienen aceites esenciales ....................................................................296 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................301
Capítulo 6. Productos naturales marinos ........................................................................................................ 308 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................315
Capítulo 7. Sesquiterpénlactonas ................................................................................................................... 317 Definición ............................................................................................................................................................318 Nomenclatura .....................................................................................................................................................319 Clasificación ........................................................................................................................................................320 Biogénesis ...........................................................................................................................................................320 Distribución y estado natural .............................................................................................................................320 Extracción ............................................................................................................................................................321 Separación y análisis cromatográfico ................................................................................................................322 Espectrometría de Masas ..................................................................................................................................325 Resonancia Magnética Nuclear .........................................................................................................................327 Espectroscopía ultravioleta ................................................................................................................................330 Espectroscopía infrarroja ...................................................................................................................................330 Ensayos de reconocimiento ...............................................................................................................................330 Actividad biológica ..............................................................................................................................................331 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................334
Capítulo 8. Otros derivados de AcetilCoenzima-A .......................................................................................... 337 Ácidos grasos ......................................................................................................................................................338 Prostaglandinas y tromboxanos ........................................................................................................................343 Poliacetilenos ......................................................................................................................................................344 Tetraciclinas y anfotericinas ...............................................................................................................................349 Compuestos aromáticos derivados de cadenas policetídicas ..........................................................................351 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................354
Capítulo 9. Metabolitos de hongos ................................................................................................................. 356 Ciclosporinas .......................................................................................................................................................359 Metabolitos con potencial anti-cáncer .............................................................................................................360 Pigmentos ...........................................................................................................................................................367 Hongos marinos ..................................................................................................................................................368 Técnicas de separación e identificación ............................................................................................................369 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................369
Capítulo 10. Glicósidos cianogénicos .............................................................................................................. 373 Biogénesis ...........................................................................................................................................................376 Función biológica ................................................................................................................................................378 Hidrólisis enzimática ...........................................................................................................................................378 Ensayo de reconocimiento (Ensayo de Guignard) ............................................................................................379 Distribución natural ............................................................................................................................................379
x
Técnicas de aislamiento e identificación ...........................................................................................................379 Síntesis ................................................................................................................................................................381 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................381
Capítulo 11. Compuestos azufrados ............................................................................................................... 383 Glucosinolatos ....................................................................................................................................................387 Técnicas de análisis e identificación ..................................................................................................................388 Síntesis de glucosinolatos ..................................................................................................................................390 Referencias bibliográficas ..................................................................................................................................390
1
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Introducción
El conocimiento químico de los metabolitos secundarios permite determinar el uso potencial
de estas sustancias para diferentes fines farmacéuticos, así como determinar los tipos de
análisis a los que se pueden someter estas sustancias. Por eso es importante conocer y
aplicar algunos conceptos básicos adquiridos en otras asignaturas previas como química
orgánica, bioquímica y al análisis químico instrumental, especialmente.
En este capítulo se pretende que el estudiante a partir de la estructura química de tres
metabolitos secundarios dados, mediante un ejercicio o taller escrito, prediga de manera
precisa o aproximada según corresponda, aspectos como son las propiedades físicas como
estado, color, aroma; las propiedades químicas como su solubilidad en determinados
solventes, en ácidos y bases. Otros aspectos como su estabilidad térmica, su actividad óptica,
las técnicas analíticas que se pueden utilizar para su separación (HPLC, Cromatografía de
Gases), para su caracterización (Espectroscopia infrarrojo, ultravioleta, Espectrometría de
masas clásica y con la técnica electrospray, etc.). Además, se hace el ejercicio de inferir
posibles actividades biológicas como antioxidante y citotóxica, y determinar la ruta
biogenética que lo pudo originar en determinada planta u organismo. En la segunda parte
del ejercicio, el estudiante debe predecir estas propiedades y además comparar con las
propiedades determinadas experimentalmente, y que están reportadas en artículos de
revistas especializadas.
El manejo de estos conceptos básicos le servirán no solo para propósitos analíticos como el
control de calidad de preparados fitoterapéuticos y relacionados, sino también para inferir
posibles efectos citotóxicos y antioxidantes, además le servirán para la comprensión de los
temas a tratar en los capítulos posteriores.
El taller a desarrollar se presenta a continuación.
2
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Taller 1
Parte 1 (Predecir con base en la estructura molecular)
Para la sustancia X, dibujar su estructura molecular 2D y 3D con un editor molecular, además
escoja la mejor opción y complete si es necesario:
1. Es un sólido?
Sí_____ No_____
2. Es coloreada?
Sí_____ No_____ Color aprox.:_______________________
3. Posiblemente es soluble en agua abundante?
Sí_____ No_____
4. Es térmicamente estable?
Sí_____ No_____
5. Se puede determinar su espectro de masas ESI?
Sí_____ No_____ Ion pseudomolecular (ó cuasimolecular):
_______________
6. Se puede determinar su espectro de masas IE?
Sí_____ No_____ Ion molecular: _____________________
7. Se puede analizar por Cromatografía de Gases?
Sí_____ No_____
8. Se puede analizar por HPLC?
Sí_____ No_____
9. Se puede determinar su precursor biogenético?
Sí_____ No_____ Cuál es? __________________________
10. En su espectro infrarrojo se esperan bandas de absorción debidas a los
siguientes enlaces:
C=C ____ C-H____ =C-H____ O-H____ C-O____
C=O____ C-N____ N-H____ N-O____ C=N____ S-O____
11. Al analizarlo por cromatografía en capa fina y bajo la luz de una lámpara UV
254 nm se puede observar? Sí____ No____
12. Es posiblemente antioxidante?
Sí_____ No_____
3
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13. Es posiblemente citotóxico?
Sí_____ No_____
14. Esta sustancia es de tipo (marque las que correspondan):
Glicósido___ Aglicona ___ Aromático ___ No aromático ___ Nitrogenado ___
Ópticamente activo ___ Sal___
15. El número de carbonos de esta sustancia es ____, el número de hidrógenos es
____.
Para la sustancia Y, dibujar su estructura molecular 2D y 3D con un editor molecular,
además escoja la mejor opción y complete si es necesario.
1. Es un sólido?
Sí_____ No_____
2. Es coloreada?
Sí_____ No_____ Color aprox.: _______________________
3. Posiblemente es soluble en etanol abundante?
Sí_____ No_____
4. Es térmicamente estable?
Sí_____ No_____
5. Se puede determinar su espectro de masas ESI?
Sí_____ No_____ Ion pseudomolecular: _______________
6. Se puede determinar su espectro de masas IE?
Sí_____ No_____ Ion molecular: _____________________
7. Se puede analizar por Cromatografía de Gases?
Sí_____ No_____
8. Se puede analizar por HPLC?
Sí_____ No_____
9. Se puede determinar su precursor biogenético?
Sí_____ No_____ Cuál es? __________________________
10. En su espectro infrarrojo se esperan bandas de absorción debidas a los
siguientes enlaces:
C=C ____ C-H____ =C-H____ O-H____ C-O____
C=O____ C-N____ N-H____ N-O____
11. Aroma probable:
4
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Agradable____ Desagradable____
Característico________________
12. Es posiblemente antioxidante?
Sí_____ No_____
13. Es posiblemente citotóxica?
Sí_____ No_____
14. Esta sustancia es de tipo (marque las que correspondan):
Glicósido___ Aglicona ___ Aromático ___ No aromático ___ Nitrogenado ___
Ópticamente activo___
Parte 2 (Predecir con la estructura y comparar con lo reportado en el artículo asignado para
el acompañamiento, justificar cada respuesta, no basta con decir Sí o No)
Para la sustancia Z dibujar sus estructuras 2D y 3D con el editor molecular y escoja la mejor
opción y/o complete:
1. Es un sólido? Sí_____ No_____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
2. Posiblemente es soluble en: Agua_____ Ácidos____ Bases____
Acetato de etilo____ Etanol caliente____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
3. Es térmicamente estable? Sí_____ No_____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
4. Se puede determinar su espectro de masas ESI?
Sí_____ No_____ Ion pseudomolecular: _______________
5
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¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
5. Se puede determinar su espectro de masas IE?
Sí_____ No_____ Ion molecular: _____________________
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
6. Se puede analizar por Cromatografía de Gases? Sí_____ No_____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
7. Se puede analizar por HPLC? Sí_____ No_____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
8. Su precursor biogenético es (marque uno o varios según aplique):
Ácido shikímico_____ Acetilcoenzima-A___ Acido pirúvico___ Acido
mevalónico___ Mixto____ Aminoácido aromático ____
Aminoácido no aromático __ Escualeno___ MalonilCoenzima-A___
Otro______
9. En su espectro infrarrojo se esperan bandas de absorción debidas a los
siguientes enlaces:
C-C ____ C=C ____ C-H____ =C-H____ O-H____ C-O____
C=O____ C-N____ N-H____ N-O____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
6
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10. Es posiblemente antioxidante? Sí_____ No_____
11. Es posiblemente citotóxica? Sí_____ No_____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
11. Es de algún carácter: Acido____ Alcalino____ Neutro_____
¿Corresponde con lo experimental?
______________________________________________
12. El uso popular para la especie estudiada es:
___________________________________
13. La(s) actividad(es) biológica(s) ensayada(s) es(fueron):
______________________________________________________________
Referencia bibliográfica del artículo asignado:
Grupos ácidos: O-H fenólico, COOH
Grupos alcalinos: N-H, N-R (R diferente a C=O, N=O, S=O, etc.)
Grupos neutros: O-H alcohólico, amidas, lactonas, ésteres, aldehídos, cetonas, etc.
Para el desarrollo del taller, se asigna a cada estudiante un artículo de una revista
especializada (p. ej. Fitoterapia), y se le indican cuáles corresponden a sus compuestos X, Y y
Z.
A manera de ejemplo consideremos los compuestos mostrados a continuación:
7
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Estos cuatro compuestos, son representativos de diferentes tipos de sustancias naturales. El
mentol, es un monoterpeno presente en el aceite esencial de especies de plantas del género
Mentha como la yerbabuena. A condiciones normales de temperatura y presión atmosférica
es un aceite incoloro de aroma agradable. El ácido gálico por su parte es un sólido amarillo
que está presente en muchos vegetales y es un ejemplo de compuestos C6C1. La higrina es
un alcaloide no aromático de aroma desagradable. La arbutina es un glicósido aromático
presente en especies vegetales del género Salix.
Vamos a responder las preguntas del taller para cada una de estas sustancias. Aquí se debe
considerar que el taller está dirigido a estudiantes de pregrado en un primer curso de química
de productos naturales.
Pregunta 1. ¿Es un sólido?
Los estudiantes conocen que las sustancias orgánicas de bajo peso molecular de las
diferentes clases son gases o líquidos, por ejemplo, los alcanos, los alquenos, los alcoholes,
los éteres, etc. Entonces pueden relacionar el bajo peso molecular con el estado líquido de
muchas sustancias orgánicas. Pero también conocen que hay sustancias orgánicas de bajo
peso molecular que son sólidos, como la glucosa. Aquí se les recuerda que, aunque solo tiene
OH
Mentol
COOH
OHHO
OH
Acido gálico
N
O
Higrina
HO
O Glu
Arbutina
8
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6 carbonos, la molécula de glucosa contiene 5 grupos hidroxilo, y que junto con los grupos
amina, son de los grupos funcionales más polares presentes en compuestos naturales
orgánicos, y además que debido a esos grupos pueden formar fácilmente puentes de
hidrógeno, que de alguna manera favorecen su estado sólido.
Como una aproximación a lo que se puede considerar bajo peso molecular en los productos
naturales, pueden considerarse las sustancias con 25 carbonos o menos. Estas incluyen por
ejemplo los terpenoides, que muchos son aceites ó líquidos viscosos. Por otro lado, las
sustancias que contienen carbohidratos ligados, así sean de bajo peso molecular tienden a
ser sólidos. Esto permite clasificar muchas sustancias naturales en dos grandes grupos: los
glicósidos y las agliconas o formas libres. Los glicósidos son sustancias naturales que
contienen en su estructura una o más unidades de carbohidratos, por ejemplo, la arbutina.
Los otros tres compuestos al no tener carbohidratos en su estructura pueden considerarse
como formas libres o agliconas.
Entonces con las consideraciones anteriores, el estudiante puede considerar que el mentol
es un compuesto de bajo peso molecular, pero con un solo grupo polar como es el grupo
hidroxilo y 10 átomos de carbono, lo que lo hace mucho menos polar que por ejemplo la
glucosa. Además, es una aglicona, por lo cual se puede predecir que es un líquido a
condiciones normales.
La arbutina, al ser un glicósido debe ser un sólido. El ácido gálico por su parte, aunque tiene
bajo peso molecular tiene 4 grupos polares, y probablemente es un sólido. El alcaloide
higrina es una forma libre o aglicona, no tiene grupos polares (ni amino ni hidroxilo), y por su
bajo peso molecular y poca polaridad debe ser un líquido.
Pregunta 2. ¿Es coloreada?
Lo que determina el color de muchas sustancias naturales es la presencia en su estructura
de grupos cromóforos tales como los anillos aromáticos y los enlaces dobles C=C y C=O
conjugados. Aunque no existe una regla para determinar el color de una sustancia natural,
como aproximación se propone que si no tiene enlaces dobles conjugados es una sustancia
incolora. Según esto el mentol y la higrina son incoloros, pues no contienen ni anillos
aromáticos ni enlaces dobles conjugados. Cuando presentan un anillo aromático o un
sistema dieno conjugado (dos o tres enlaces dobles conjugados), muchas sustancias
naturales son amarillentas, pero si además cuentan con enlaces dobles que extienden la
conjugación, se tornan amarillos propiamente dichos. Según esto la arbutina debe ser
amarillenta, y el ácido gálico de color amarillo, debido al carbonilo. Otras sustancias naturales
con más de 4 enlaces dobles conjugados tendrán colores que van del naranja al rojo, como
se verá en capítulos posteriores relacionados con sustancias como ciertos flavonoides, las
quinonas y los carotenoides, entre otros.
9
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Pregunta 3. ¿Posiblemente es soluble en agua abundante?
La solubilidad en agua y en solventes orgánicos comunes depende de la polaridad, la cual
depende a su vez del número de grupos polares presentes en la sustancia. Aunque la
solubilidad es relativa y depende de factores como el volumen de solvente y la temperatura,
a manera de aproximación se puede inferir que sustancias polares como los glicósidos
tienden a ser más solubles en solventes polares como agua y alcohol, mientras que las
agliconas con pocos grupos polares son más solubles en solventes orgánicos de mediana o
baja polaridad como el cloroformo, el acetato de etilo y el hexano.
De acuerdo con lo anterior, de los cuatro compuestos aquí considerados, la arbutina, por ser
un glicósido es más soluble en agua o alcohol, y los otros tres compuestos son más solubles
en cloroformo y acetato de etilo.
Otro concepto básico es el carácter ácido o alcalino de las sustancias. Los grupos funcionales
ácidos presentes en muchas sustancias naturales son el grupo hidroxilo fenólico y el grupo
carboxilo. Los grupos funcionales alcalinos son grupos amino. De acuerdo con esto el mentol
es una sustancia de carácter neutro, pues su hidroxilo no es fenólico, sino alcohólico. El ácido
gálico es una sustancia de carácter ácido por sus tres grupos hidroxilos fenólicos además de
su grupo carboxilo. Entonces, a pesar de que el ácido gálico no es soluble en agua, es soluble
en soluciones acuosas alcalinas, por su capacidad de formar sales solubles con las bases
fuertes. Por otro lado, la higrina es una sustancia de carácter básico, y aunque no es soluble
en agua solamente, es soluble en soluciones acuosas de ácidos fuertes, por su capacidad de
formar sales solubles.
Pregunta 4. ¿Es térmicamente estable?
La estabilidad térmica de las sustancias naturales es importante para su análisis, por ejemplo,
con los métodos instrumentales. Los glicósidos debido a los carbohidratos ligados se pueden
calentar a temperaturas relativamente altas, pero generalmente no presentan un punto de
fusión, sino que se descomponen. Esto es debido a la inestabilidad térmica de los
carbohidratos. Esto determina que estas sustancias no se pueden analizar por métodos que
utilicen temperaturas muy altas como por ejemplo la cromatografía de gases, ni la
espectrometría de masas clásica (de impacto electrónico). En cambio, muchas de las
agliconas naturales son térmicamente estables y ebullen o se funden al calentarlas, pero sin
descomponerse, es decir son térmicamente estables.
De acuerdo con lo anterior, el mentol, el ácido gálico y la higrina son térmicamente estables,
mientras la arbutina es una sustancia térmicamente inestable.
Preguntas 5 y 6. Se puede determinar su espectro de masas ESI? ¿Se puede determinar su
espectro de masas IE?
10
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Para responder estas preguntas es necesario recabar en los estudiantes, que básicamente
existen dos técnicas generales para analizar por espectrometría de masas. La primera es la
primera desarrollada que es la espectrometría de masas clásica. En esta técnica las sustancias
vaporizadas son sometidas al disparo continuo de electrones con alta energía (impacto
electrónico). Para ser vaporizadas deben ser térmicamente estables. La segunda técnica es
de desarrollo más reciente y la más usada es la espectrometría de masas electrospray (sigla
inglesa ESI), en la cual la sustancia es sometida a la acción de campos eléctricos y magnéticos
para su rompimiento y detección, y se utiliza tanto para sustancias térmicamente estables
como para sustancias térmicamente inestables.
Por lo anterior, el mentol, la higrina y el ácido gálico se pueden analizar por espectrometría
de masas clásica, pero la arbutina no por su inestabilidad térmica. En cambio, cuando se
utiliza la técnica ESI, todos los compuestos se pueden analizar.
A la pregunta sobre el ión pseudomolecular o cuasimolecular, los espectros de masas de
impacto electrónico permiten en general obtener el ión de mayor relación m/z que
corresponde al ión molecular, el cual a su vez corresponde al peso molecular de la sustancia.
Por otro lado, mediante la técnica ESI, generalmente se observan los iones de mayor relación
m/z corresponden al peso molecular de la sustancia, pero con un átomo adicional que puede
ser H+, Na+ o K+.
Según esto, para el mentol su ión molecular es m/z 156, pero su ión cuasimolecular puede
ser m/z 157 (M+H+), 179 (M+Na+) ó 187 (M+K+).
La arbutina no presentará ión molecular por su inestabilidad térmica, pero en cambio
presentará su ión cuasimolecular, el cual puede ser m/z 273 (M+H+), 295 (M+Na+) ó 303
(M+K+).
Preguntas 7 y 8. Se puede analizar por Cromatografía de Gases? ¿Se puede analizar por
HPLC?
Para responder estas preguntas, nuevamente se debe considerar la estabilidad térmica de
las sustancias. Ya que las sustancias térmicamente estables en general pueden analizarse por
cromatografía de gases, porque se pueden vaporizar. Pero en cambio las sustancias
térmicamente inestables no se pueden analizar por cromatografía de gases, porque no se
pueden vaporizar o se descomponen al calentarlas. Por otro lado, la cromatografía líquida
HPLC permite analizar todo tipo de sustancias naturales, pues generalmente no requiere del
uso de altas temperaturas, y es una técnica de separación cromatográfica universal. No
obstante, lo anterior, más adelante se mencionará la utilidad de la cromatografía de gases
en el análisis de compuestos apolares como sustancias de tipo lipídico y en sustancias
presentes en aceites esenciales.
11
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De acuerdo con lo anterior, las cuatro sustancias (mentol, ácido gálico, higrina y arbutina),
se pueden analizar por HPLC, pero por cromatografía de gases solamente el mentol, el ácido
gálico y la higrina.
Pregunta 9. ¿Se puede determinar su precursor biogenético?
Para responder esta pregunta es necesario recabar en los estudiantes sobre lo aprendido en
el curso previo de bioquímica, en especial sobre los procesos de biosíntesis que ocurren en
las células y que son mediados por diferentes sistemas enzimáticos. Los estudiantes deben
comprender que los metabolitos secundarios, derivan de algunas sustancias provenientes
del metabolismo primario como son el ácido shikímico, el ácido pirúvico, la acetilcoenzima-
A, él ácido fosfoenolpirúvico, la eritrosa-4-fosfato y el metileritritol.
El esquema presentado a continuación es un resumen de las rutas biogenéticas, mediante
las cuales estas sustancias, dan origen a diferentes metabolitos secundarios de interés
farmacéutico.
De acuerdo con este esquema biogenético, los compuestos con anillos aromáticos orto-
dioxigenados, muchos compuestos C6C3 y los alcaloides aromáticos, se originan a partir del
ácido shikímico, el cual a su vez se origina a partir de fosfoenolpiruvato (PEP) y eritrosa-4-
fosfato (E4P).
Por otro lado, los compuestos aromáticos meta-dioxigenados se originan a partir de la
acetilcoenzima-A, por la via de la malonilcoenzima-A.
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Metabolismo primario
PO
COOH
PEP
POH
OHO
OH
E4P
COOH
OH
OH
HO
O
COOH
PIR
O
SCoA
AcetilCoA
Acido shikímico
O
SCoA
HO
O
MalonilCoA
HOOP
OH
OH
MEP
Terpenoides C10n
HOOCOP
OH
MVA
Comp. aromáticosorto-dioxigenados
Comp. (C6C3)n
Comp. aromáticosmeta-dioxigenados
Comp. aromáticosmeta- y orto-dioxigenados(p. ej. flavonoides)
Terpenoides C15n
Alcaloidesaromáticos
Figura 1. Cuadro general parcial del metabolismo secundario. PEP corresponde a fosfoenolpiruvato, E4P es eritrosa-4-fosfato, PIR es ácido pirúvico, AcetilCoA corresponde a acetilcoenzima-A, MEP corresponde a metileritritol-fosfato, MVA es ácido mevalónico, MalonilCoA es malonilcoenzima-A.
Los compuestos que contienen anillos aromáticos tanto orto- como meta-dioxigenados, se
originan por una ruta biogenética mixta derivada del ácido shikímico y de la acetilcoenzima-
A via malonilcoenzima-A. Un ejemplo de esto son los flavonoides.
Para el caso de muchos compuestos sin anillos aromáticos (compuestos no aromáticos), se
dan dos rutas probables a partir de ácido pirúvico. Una de estas es la ruta via acetilcoenzima-
A y ácido mevalónico, la cual explica el origen biogenético de muchos terpenoides C15n. La
otra ruta es la del metileritritol que explica el origen de muchos terpenoides C10n.
De acuerdo con lo anterior, el mentol es derivado biogenéticamente de la ruta del
metileritritol. El ácido gálico a su vez es derivado biogenéticamente del ácido shikímico.
13
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Para el caso de los alcaloides, algunos de ellos derivan del ácido shikímico y aminoácidos
aromáticos, otros sin anillos aromáticos derivan de aminoácidos no-aromáticos. Por lo cual,
la higrina debe originarse a partir de un aminoácido no aromático.
En el caso de la arbutina, aunque posee un anillo aromático, al no tener sino un sustituyente
oxigenado no es posible inferir su origen biogenético a partir de su estructura química.
Pregunta 10. En su espectro infrarrojo se esperan bandas de absorción debidas a los
siguientes enlaces:
C=C ____ C-H____ =C-H____ O-H____ C-O____ C=O____ C-N____
N-H____ N-O____ S=O____ S-H____ S-S____
Este punto se dedica a recabar en el estudiante, el uso cualitativo de los espectros infrarrojo
para el reconocimiento de grupos funcionales y otros, a partir de la estructura química de
cada sustancia natural orgánica. Los grupos incluyen los enlaces entre elementos más
comúnmente encontrados en las sustancias de estudio en este texto. Por ejemplo, para el
mentol, el estudiante debe marcar con una equis, los grupos C-H, O-H, C-O. Para el ácido
gálico se deben marcar los enlaces C=C, =C-H, O-H, C-O y C=O. Para el alcaloide higrina se
deben marcar C-H, C=O, C-N. Finalmente para la arbutina se deben marcar los enlaces C=C,
C-H, =C-H, O-H y C-O.
Pregunta 11. Aroma probable (si es líquido):
Agradable____ Amoniacal ____ Azufrado____
Característico____
Para responder esta pregunta, se debe tener en cuenta que muchos compuestos líquidos de
bajo peso molecular y que solo contienen carbono, hidrógeno y oxígeno en su estructura,
generalmente son de aroma agradable. Son ejemplos los monoterpenos, los sesquiterpenos,
los ésteres de bajo peso molecular, y otros componentes de los aceites esenciales.
Las sustancias nitrogenadas tienden a un aroma amoniacal relativamente desagradable, por
ejemplo, ciertos alcaloides. Las sustancias azufradas también presentan un aroma azufrado
relativamente desagradable que se puede ejemplificar con el ajo y la cebolla. Finalmente, el
aroma característico se constituye en un comodín, cuando no es posible predecir algún
aroma probable.
De acuerdo con esto, se puede predecir que el mentol si es un líquido es de aroma agradable,
la higrina si es un líquido es de aroma amoniacal. El ácido gálico y la arbutina son sólidos.
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Preguntas 12 y 13. Es posiblemente antioxidante? ¿Es posiblemente citotóxica?
Para responder a estas preguntas se tiene como referencia que muchos compuestos
naturales fenólicos presentan actividad antioxidante, así mismo muchos compuestos
alifáticos que contienen un número apreciable de enlaces dobles C=C conjugados, como los
carotenoides, tienen la capacidad de captar especies reactivas de oxígeno. Por otro lado,
muchas sustancias naturales que contienen en su estructura un anillo lactónico, presentan
alguna actividad citotóxica, son ejemplo de estas las terpénlactonas. Aquí es importante
tener en cuenta que es generalmente aceptado que para que una sustancia sea
biológicamente activa, debe serlo a muy bajas concentraciones.
De acuerdo con lo anterior, para el mentol no se espera que a muy bajas concentraciones
sea ni antioxidante ni citotóxico. El ácido gálico debe ser antioxidante pero no citotóxico. La
higrina no sea ni antioxidante ni citotóxica. Finalmente, la arbutina puede ser antioxidante
debido a su grupo hidroxilo fenólico.
Pregunta 14. Esta sustancia es de tipo (marque las que correspondan):
Glicósido___ Aglicona ___ Aromático ___ No aromático ___ Nitrogenado ___ Ópticamente
activo___
Esta pregunta tiene como fin que el estudiante se apropie de algunos términos como
glicósido y aglicona. Los términos aromático para las sustancias naturales con el anillo
bencénico, y no-aromático para las sustancias naturales sin anillos bencénicos. Y finalmente
afianzar el concepto de actividad óptica para que aplique conocimientos previos de la
química orgánica como es reconocer en cualquier metabolito secundario, los carbonos
quirales y su relación directa con la actividad óptica.
De acuerdo con lo anterior el mentol es una aglicona, no aromática y ópticamente activo. El
ácido gálico es una aglicona aromática, ópticamente inactivo. La higrina es una aglicona no
aromática, ópticamente activa. La arbutina es un glicósido aromático y es ópticamente activo
debido a que contiene un carbohidrato ligado, y los carbohidratos naturales presentan
actividad óptica debido a los carbonos quirales que contienen.
En la segunda parte del ejercicio, se pretende que el estudiante con la estructura química de
un metabolito asignado por el profesor, no solamente prediga algunas de sus propiedades,
sino que confronte sus predicciones con lo reportado en trabajos experimentales para el
mismo metabolito.
15
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Protones aromáticos y su multiplicidad
Adicionalmente, es importante que el estudiante con los elementos básicos aprendidos en
cursos previos relacionados con el análisis químico instrumental de sustancias orgánicas,
realice la predicción de las multiplicidades de las señales de los protones aromáticos. Esto
con el fin de afianzar los conocimientos previos y aplicarlo ahora a sustancias naturales, de
estructura más compleja.
Para esto se toman dos de los sistemas de protones aromáticos más comunes en metabolitos
secundarios, como son los sistemas I y II mostrados a continuación:
Y
X
Y
W
X
2
5
6
23
5
6
Sistema I Sistema II
En los anillos aromáticos los protones muestran señales entre 6 y 8 δ, y pueden presentar
acoplamientos con los protones vecinos en posición orto, en meta y en para. La constante
de acoplamiento orto es aprox. 8-9 Hz, la constante de acoplamiento meta es aprox. 2-3 Hz,
y la constante de acoplamiento para aprox. 0.5 Hz.
De acuerdo con esto, en el sistema I, el protón 2 acopla en orto con el protón 3, en meta con
el protón 6 y en para con el protón 5. Teóricamente su señal debe ser un doble-doble-
doblete (ddd), con constantes de acoplamiento orto, meta y para. Sin embargo, a nivel
práctico el acoplamiento para, por ser tan pequeña la constante, muchas veces no se
observa, y la señal se reduce a un doble-doblete (dd) con constantes de acoplamiento orto y
meta. En algunos casos se verá que muchos autores tampoco reportan el dd para el protón
2, sino solamente un doblete (d ancho) con constante de acoplamiento orto. Esto debido a
que en la práctica muchos experimentos de RMN no permiten observar el acoplamiento
meta.
En el caso de los protones 3, 5 y 6; si se realiza el mismo análisis anterior, y asumiendo que
X y Y son sustituyentes diferentes, a nivel práctico se observarán dobletes-orto(do) anchos
para todos estos protones, aunque teóricamente deben ser ddd.
Para el caso del sistema II, el protón 2 teóricamente es un doble-doblete meta-para, pero
nuevamente en la práctica no se observa en muchos casos el acoplamiento para, por lo cual
se debe observar solo como un doblete-meta (dm). A su vez, el protón 5, acopla con el protón
6, para generar un doblete-orto y otro doblete-para por su acoplamiento con el protón 2. En
16
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resumen, se espera un dd-orto-para, pero experimentalmente se observa generalmente un
doblete-orto (do). Finalmente el protón 6, se acopla en orto con el protón 5, y en meta con
el protón 2, lo que genera un dd-orto,meta (ddo,m). A manera de ejemplo, la figura 2 muestra
la región de protones aromáticos del espectro RMN-1H predicho para el compuesto orgánico
2,4-dihidroximetoxibenceno, que muestra el patrón de protones aromáticos del sistema II,
con una señal doblete-meta en δ 6.53 correspondiente al protón 6. La señal del protón 5 se
observa como un doble-doblete orto-meta, en δ 6.58. Finalmente, la señal del protón 2 se
observa como un doblete-orto, centrada en δ 6.73.
Y
X
Y
W
X
2
5
6
23
5
6
Sistema I Sistema II
do
do
do
do
dm
do
ddo,m
Figura 2. Región de protones aromáticos del espectro RMN-1H, predicho para el 2,4-dihixidroximetoxibenceno con el software en-línea disponible en nmrdb.org
Para el caso de experimentos de RMN en dos dimensiones (RMN-2D), y nuevamente para el
caso de protones aromáticos, al obtener el espectro COSY H-H para el compuesto 2,4-
dihidroximetoxibenceno, se observa la vecindad de los protones 5 y 6, en forma de manchas
de correlación que forman un cuadrado. A su vez, la señal del protón 2, no muestra
correlación con ninguno de los protones 5 y 6, debido a que no son vecinales al protón 2.
Para ilustrar esto, la figura 3 muestra el espectro COSY H-H predicho para el 2,4-
dihidroximetoxibenceno. En la región de protones aromáticos, se aprecia un pequeño
cuadrado con tres puntos azules y uno gris, y la señal de protones del metoxilo en δ 3.80 que
no correlaciona con ningún otro protón de la sustancia.
17
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Figura 3. Espectro COSY H-H predicho con el software en línea nmrdb.org, para el 2,4-dihidroximetoxibenceno.
Con estos elementos, se les plantea a los estudiantes, hacer la predicción de las señales
teóricas y experimentales para metabolitos con anillos aromáticos como la quercetina, la
podofilotoxina, la arbutina y el ácido gálico; y comparar dichas predicciones con un simulador
RMN.
18
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Capítulo 1
Técnicas generales de aislamiento, separación, caracterización y cuantificación
de metabolitos secundarios
19
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Introducción
Los procesos experimentales necesarios para la identificación, la cuantificación, el
aislamiento, y la caracterización de los metabolitos secundarios presentes en diversos
organismos vivos se han desarrollado y mejorado de una manera vertiginosa en los últimos
años. A finales del siglo XX, muchos de estos procesos requerían que se partiera de grandes
cantidades de muestras biológicas (del orden de varios kilogramos), con procesos largos de
fraccionamiento, purificación y caracterización. Estos procesos duraban inclusive años y se
requería de varias personas trabajando de manera colaborativa en diferentes universidades
o institutos de investigación. En cambio, actualmente, y gracias al avance de las técnicas de
análisis instrumentales, es posible realizar todos estos procesos con muestras más pequeñas
(del orden de los gramos), con separaciones más rápidas y eficientes, y hacer la identificación
y caracterización química mediante técnicas como la cromatografía líquida y la resonancia
magnética nuclear en dos dimensiones, y en tiempos comparativamente más cortos que
antes.
En algunos casos, y particularmente para los procesos de control de calidad de drogas, es
posible que se requiera de días u horas, es decir que se logran realizar análisis más rápidos,
y con el desarrollo de las técnicas acopladas de separación cromatográfica y análisis
espectral, como por ejemplo la cromatografía líquida de alta eficiencia (sigla inglesa HPLC),
acoplada a espectrometría de masas tándem, es posible realizar estudios de metabolómica
y estandarizar procesos de análisis de control de calidad de muestras complejas como son
las drogas naturales aceptadas en diferentes farmacopeas.
En este capítulo, se presentan en secuencia los procesos de extracción, separación,
identificación, caracterización y cuantificación. Para la caracterización química se utilizan a
manera de ejemplo las estructuras químicas de moléculas relativamente poco complejas
estructuralmente, esto con el fin de hacerlo de una forma didáctica y comprensible para el
lector. Se hace énfasis especial en el uso de la Resonancia Magnética Nuclear para la
caracterización de las sustancias, pues es la técnica analítica que da la información
estructural más fina de dichas sustancias.
Para una mejor comprensión, es importante considerar que los metabolitos secundarios, se
encuentran en los materiales biológicos, básicamente en dos formas: Una forma en la cual
una molécula no se encuentra ligada a carbohidratos, la cual se denomina aglicona o forma
libre; y la otra forma es en la que se encuentra una molécula ligada a una o varias unidades
de carbohidratos, denominada glicósido. Estas formas de aglicona y de glicósidos confieren
cada una a las sustancias naturales propiedades muy importantes en su estudio sistemático.
A manera de ejemplo mientras la gran mayoría de las formas libres (agliconas) son estables
al calentamiento moderado, a la hidrólisis ácida y son solubles en solventes o mezclas de
solventes de baja o media polaridad; las formas de glicósidos por el contrario, en su mayoría
20
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son inestables al calentamiento, a la hidrólisis ácida y son insolubles en solventes de poca
polaridad, pero en cambio solubles en solventes o mezclas de solventes de mayor polaridad.
La Figura 1.1. muestra ejemplos simples del mentol (una aglicona monoterpenoide), el ácido
gálico (una aglicona fenólica), la higrina (un alcaloide no aromático) y de la arbutina (un
glicósido aromático).
OH
Mentol
COOH
OHHO
OH
Acido gálico
N
O
Higrina
HO
O Glu
Arbutina
Figura 1.1. Estructuras de algunas sustancias naturales. La abreviatura Glu corresponde a la glucosa.
Aquí es importante resaltar que, dependiendo de lo que se pretenda analizar en una matriz
o muestra biológica, bien sea agliconas o glicósidos, cada caso determina la metodología y
las técnicas de análisis a utilizar. Por ejemplo, en condiciones normales, los glicósidos en
general son sólidos polares, solubles en etanol y agua, son térmicamente inestables (se
descomponen al tratar de fundirlos), todos son ópticamente activos (debido a la presencia
de carbohidratos). Los glicósidos se pueden analizar por cromatografía líquida, por
espectrometría de masas de ionización suave, en cambio las agliconas se pueden analizar
directamente por cromatografía de gases; y por otras técnicas que no sirven para los
glicósidos por su inestabilidad térmica, como la espectrometría de masas de ionización fuerte
(impacto electrónico). Es importante precisar, sin embargo, que los compuestos
21
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térmicamente inestables pueden ser derivatizados químicamente, para obtener compuestos
que son térmicamente estables y se pueden analizar por las técnicas como cromatografía de
gases y la espectrometría de masas de impacto electrónico. En la práctica la derivatización
es una técnica muy útil con glicósidos de bajo peso molecular, pero no con los de alto peso
molecular como por ejemplo las saponinas terpenoides.
A continuación, se describen de manera general, las técnicas experimentales más utilizadas
para los procesos de extracción, separación, identificación, caracterización y cuantificación
de metabolitos secundarios.
Técnicas generales de extracción de metabolitos secundarios
A condiciones normales de presión y temperatura, los metabolitos secundarios de interés
farmacéutico se encuentran en las muestras naturales generalmente en formas libres
(agliconas o geninas), en forma de glicósidos, y en menor proporción en forma de sales
(generalmente como sulfatos). La solubilidad de las sustancias naturales en agua, en
solventes orgánicos, en medio ácido o alcalino, nos permite afirmar que la mayoría de
metabolitos secundarios, pertenecen a alguna de las siguientes grandes clases de sustancias:
• Compuestos solubles en agua y solventes polares
• Compuestos solubles en solventes orgánicos de mediana y baja polaridad
• Compuestos solubles en soluciones acuosas alcalinas
• Compuestos solubles en soluciones acuosas ácidas
Compuestos solubles en agua y solventes polares
En los organismos vivos, se encuentran una gran cantidad y variedad de sustancias que por
su polaridad son más solubles en agua y en solventes polares, y en mezclas de agua y
solventes como el etanol. Estos compuestos incluyen los denominados glicósidos y las sales
(por ejemplo, saponinas, glicósidos terpenoides, flavonoides sulfatados, etc.). La afinidad por
el agua la determina la presencia de una o varias unidades de carbohidratos ligados y la
presencia de grupos con cargas positivas o negativas. Los glicósidos en general, además de
su polaridad y solubilidad presentan propiedades como la inestabilidad térmica, es decir su
fragilidad al calentamiento, que lleva a su descomposición. Además, desde el punto de vista
químico, sustancias como los glicósidos que tienen carbohidratos ligados a través de oxígeno
(O-glicósidos), se hidrolizan fácilmente con ácidos diluidos y con enzimas. Esto debe tenerse
en cuenta a la hora de su extracción, pues la presencia de sustancias ácidas puede favorecer
la hidrólisis y liberar las agliconas y carbohidratos correspondientes.
En general, los glicósidos se extraen a partir de material biológico fresco, debido a que
durante el proceso de secado se pueden hidrolizar por la acción enzimática, pero en algunas
ocasiones también se han reportado extracciones desde el material seco. Por lo anterior, el
22
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método de secado de la muestra biológica siempre recomendable es la liofilización, ya que
al eliminar el agua a muy bajas temperaturas, se evitan los procesos enzimáticos que
producen cambios químicos en las sustancias originales. Una vez seco el material se muele y
el producto puede almacenarse en recipientes adecuados o se puede someter al proceso de
extracción.
Una vez se cuente con el material seco y molido, es recomendable que este se someta a un
proceso previo de eliminación del material lipídico (desengrase), el cual puede realizarse en
un sistema Sohxlet. Se utilizan solventes como hexano para eliminar o separar los
compuestos lipídicos que de otra manera interferirían en la extracción de los glicósidos. Una
vez se haya eliminado el material lipídico, se procede a la extracción con agua o agua
mezclada con alcohol.
En este punto se utilizan actualmente varias metodologías que incluyen principalmente el
uso de agitadores mecánicos, magnéticos, ultrasonido y con microondas. Las técnicas con
microondas y ultrasonido disminuyen el tiempo de extracción, la cantidad de energía usada,
la cantidad de solventes utilizados, y por tanto las emisiones de dióxido de carbono al
ambiente. Estas técnicas amigables con el medio ambiente son cada vez más utilizadas por
los analistas e investigadores, para los diferentes tipos de metabolitos. Por ejemplo, en el
caso de las antocianinas, que son metabolitos solubles en agua y las cuales están presentes
en los pétalos coloreados de muchas flores, se han reportado métodos de extracción con
rendimientos altos al utilizar las microondas.
En el caso de metabolitos tales como los carbohidratos, en especial los polisacáridos, los
cuales son de interés por las diferentes actividades biológicas que han mostrado, las cuales
a su vez incluyen la actividad antioxidante, inmuno moduladora, antidiabética, antibiótica,
antiinflamatoria, entre otras; y debido a su complejidad, se requiere del uso de varias
técnicas combinadas para su extracción. El proceso de extracción generalmente inicia con
agitación a baja temperatura utilizando como solvente extractor el agua. Luego la solución
acuosa es combinada con diferentes volúmenes de alcohol, lo que produce la precipitación
de los compuestos. Estos carbohidratos se pueden recuperar por procesos de centrifugación.
Compuestos solubles en solventes orgánicos de mediana y baja polaridad
A diferencia de los compuestos de mayor polaridad como los glicósidos, muchos metabolitos
secundarios que se conocen como formas libres, agliconas o geninas; son insolubles en agua,
pero solubles en solventes orgánicos de baja o mediana polaridad como el cloroformo. Este
solvente en particular es de amplio uso en los laboratorios, pero además de costoso es tóxico
y contamina el medio ambiente, por lo cual se sugiere remplazarlo en los procesos de
extracción, por solventes menos tóxicos como el acetato de etilo.
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Dentro de estos compuestos se incluyen los terpenoides, alcaloides, flavonoides,
compuestos fenólicos, en forma libre o esterificada con ácidos orgánicos.
Para la extracción, el material biológico se puede secar por liofilización o por calentamiento
a temperaturas no mayores de 60°C, para evitar los cambios químicos de las sustancias de
interés. Una vez seco, el material se muele y se somete a extracción con un solvente orgánico
de mediana o baja polaridad, dependiendo de la polaridad de las sustancias a analizar.
Como en el caso de los compuestos polares, los métodos de agitación mecánica, magnética,
ultrasonido y microondas son también útiles para este tipo de compuestos, y nuevamente
se resaltan las ventajas económicas, de tiempo, y ambientales de la extracción con
microondas. También se han reportado sistemas de extracción más eficientes como el
denominado Sistema de Extracción Continuo con Solventes Presurizados (sigla inglesa CPSE).
Este utiliza un solvente como el etanol, el cual se hace pasar con ayuda de una bomba de
HPLC a través de una columna empacada con arena de Ottawa y la muestra biológica a
extraer. Al sistema se le puede incorporar un sistema de calentamiento para mejorar el
proceso de extracción. Este sistema ha mostrado una mayor eficiencia de extracción para
compuestos como carotenoides y ácidos grasos.
Compuestos solubles en soluciones acuosas alcalinas
Una buena cantidad de compuestos naturales, que clasifican dentro de las dos categorías
anteriores, presentan en su estructura grupos ácidos como el carboxilo y el hidroxilo fenólico.
Estos compuestos tienden a formar sales solubles en agua, cuando se neutralizan con bases
fuertes. Para el caso de los compuestos de bajo peso molecular, puede entonces utilizarse la
extracción con una solución acuosa alcalina, pero en general no se utiliza mucho la extracción
con bases fuertes, debido a que muchos compuestos son inestables y se descomponen,
como es el caso de muchos flavonoides poli hidroxilados y otros compuestos fenólicos. Al
revisar la literatura científica no se encuentran muchos ejemplos de la utilización de la
extracción con bases, con excepción de algunas técnicas de extracción y análisis de
compuestos fenólicos simples con soluciones de bases como el bicarbonato de sodio y para
la extracción de alcaloides. Para estos últimos, las muestras biológicas se muelen y se
humedecen con una solución alcalina (generalmente amoniaco acuoso diluido), para
liberarlos de su forma de sales, a su forma básica alcalina. Sin embargo, el uso de tiempos
largos de interacción entre los alcaloides y las bases puede llevar a procesos indeseables
como su isomerización.
Para el caso de los compuestos fenólicos en general, se recomienda la extracción a partir de
material fresco con alcohol en ebullición, pero hay que considerar que no todos los
compuestos fenólicos presentan la misma complejidad estructural, la cual es importante de
tener en cuenta si se desea establecer unas condiciones óptimas para su extracción. Aquí es
24
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importante anotar que, en los procesos de extracción, se utiliza en muchos trabajos el
metanol, pero al considerar los riesgos para la salud y el ambiente de este alcohol, es
recomendable que se utilice en su remplazo el etanol.
Compuestos solubles en soluciones acuosas ácidas
Dentro de esta categoría están los compuestos nitrogenados, específicamente los alcaloides
con nitrógeno amínico. El par electrónico libre del átomo de nitrógeno, determina que estas
sustancias, generalmente insolubles en agua, son bases débiles y por tanto pueden formar
sales solubles en agua, al tratar la muestra biológica con soluciones de ácidos fuertes diluidos
como el ácido clorhídrico. Este comportamiento ácido-base de los alcaloides amínicos, es el
fundamento para su extracción por métodos clásicos como la maceración y partición líquido-
líquido. Sin embargo, más recientemente se han incorporado métodos más rápidos, más
económicos y más amigables con el medio ambiente como la extracción con fluidos
supercríticos (SFE), y la extracción con solventes presurizados (SPE). Es de esperar en el
futuro que se disponga comercialmente de equipos para su uso rutinario, pero aún todavía
los métodos de extracción líquido-líquido resultan útiles para muchos propósitos.
En general se encuentra al revisar la literatura científica, que la extracción de metabolitos se
realiza fundamentalmente con solventes como el agua, el alcohol y cloroformo;
dependiendo de la polaridad de los compuestos a analizar. También se observa la tendencia
cada vez mayor de reducir las emisiones contaminantes al medio ambiente. Aquí vale la pena
revisar sobre el uso de solventes menos contaminantes, y remplazar el uso de solventes
como el cloroformo y el diclorometano, por ejemplo, por otros de polaridad similar como el
acetato de etilo. En el caso del alcohol, lo más recomendable es utilizar preferiblemente
etanol, en lugar de metanol; por los efectos tóxicos de este último, nuevamente teniendo en
cuenta que tienen una polaridad similar.
Extracción con solventes eutécticos viscosos (DES) y líquidos iónicos (IL)
Aunque para muchos propósitos analíticos, la simple extracción con etanol a bajas
temperaturas (menos de 50°C) proporciona extractos enriquecidos en metabolitos
secundarios, en los últimos años se ha incrementado el interés en minimizar los efectos
negativos en el medio ambiente, de todas las actividades humanas, y esto incluye el uso en
grandes volúmenes de productos químicos, como los solventes orgánicos. Para esto se han
buscado nuevas alternativas al uso de estos materiales los cuales son usados desde hace
muchas décadas en todos los laboratorios y empresas que los requieren para sus productos
y procesos.
Una primera aproximación ha sido el reducir el uso de grandes cantidades de los solventes
orgánicos, por ejemplo, en los procesos de extracción y separación. Esto en gran parte
debido al avance y desarrollo de las técnicas analíticas instrumentales, los cuales permiten
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trabajar con cantidades más pequeñas de muestras y por tanto reducir el consumo de estos
solventes. Además, se han desarrollado técnicas de extracción como las denominadas
técnicas de micro extracción en fase líquida (sigla inglesa LPME).
Más recientemente se han comenzado a utilizar los denominados solventes eutécticos
viscosos (sigla inglesa DES) y los líquidos iónicos (IL). Por definición, los líquidos iónicos se
obtienen al combinar cationes orgánicos con aniones orgánicos e inorgánicos, mientras los
solventes DES se obtienen al combinar dos o más compuestos orgánicos sólidos que no
necesariamente son todos sales, como por ejemplo combinar una sal de amonio cuaternaria
como el cloruro de colina con sacarosa. La mezcla resultante presenta un punto de fusión
más bajo que el de cada una de las dos sustancias aisladas, de ahí el nombre de líquidos
eutécticos. Los líquidos o solventes DES, se preparan al mezclar por ejemplo una sal de
amonio cuaternaria con otra sustancia donora de enlaces de hidrógeno HBD como son los
ácidos, las amidas, los alcoholes, las aminas, etc. La figura 2.2, esquematiza la formación de
un solvente DES entre una molécula de prolina (HBA, aceptor de H) y una molécula de ácido
málico (HBD, donor de H). La formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares y las
interacciones de Van der Waals entre otros, son los factores que llevan a la disminución del
punto de fusión de la mezcla DES. Es importante mencionar que algunos autores denominan
NADES a los solventes eutécticos preparados para la extracción de productos naturales.
COOHO
OH
O
H
N
COOH
H
COOHO
OH
O
N
COOH
H
H
Prolina Ácido málico DES Prolina/Acido málico 1:1
Figura 2.2. Formación de un solvente DES a partir de prolina y ácido málico.
La tabla 1.1, muestra algunas de los solventes DES más utilizados, junto con algunas de sus
características físico-químicas más importantes como son la temperatura de congelación, la
densidad y la viscosidad. Además, se les vienen determinando otras propiedades como el
índice de refracción, la tensión superficial, la capacidad calorífica, la conductividad eléctrica,
etc. La sal rotulada como ChCl corresponde al cloruro de colina y es el aceptor de enlaces de
hidrógeno más utilizado. Algunos autores asignan nombres a las mezclas DES como por
ejemplo la mezcla de ChCl con urea la denominan relina, la mezcla ChCl con etilenglicol la
denominan etalina, la mezcla de ChCl y ácido málico la denominan malicina, y la mezcla ChCl
con glicerina, la denominan glicelina.
La viscosidad de los solventes DES se puede disminuir agregándoles agua y aumentando la
temperatura. En cuanto a la cantidad de agua, se reportan valores hasta del 30-50% máximo,
26
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debido a que el exceso de agua disminuye la estabilidad del líquido DES por el rompimiento
de los enlaces de hidrógeno intermoleculares.
Como se anotó anteriormente, los solventes DES se producen fácilmente en el laboratorio
mediante la combinación adecuada de una sal de amonio cuaternaria como el cloruro de
colina, reconocida con la sigla inglesa ChCl; y otro componente, que puede ser un ácido
orgánico como el malónico, un carbohidrato, un ácido graso como el ácido decanoico, un
terpeno como el mentol, etc.
Tabla 1.1. Lista de algunos solventes DES y de algunas de sus propiedades físico-químicas.
HBA HBD Proporción molar Sal/HBD
Temperatura congelación (°C)
Densidad (g/ml, 25°C)
Viscosidad η/mPa s
ChCl Urea 1:2 12 1.25 750 (25°C)
ChCl Glicerina 1:2 40 1.18 259 (25°C)
ChCl Glicerina 1:3 - 1.20 450 (20°C)
ChCl Etilénglicol 1:2 66 1.12 37 (25°C)
ChCl Ácido malónico 1:2 - 1.25 1124 (25°C)
EtNH3Cl CF3CONH2 1:1.5 - 1.273 256 (40°C)
EtNH3Cl Acetamida 1:1.5 - 1.041 64 (40°C)
EtNH3Cl Urea 1:1.5 29 1.140 128 (40°C)
ZnCl2 Urea 1:3.5 - 1.63 11340 (25°C)
ZnCl2 Acetamida 1:4 303.15 1.36 -
Al revisar la literatura científica existente, se encuentran varios procedimientos para la
preparación de solventes DES, entre los cuales están el método con evaporación y el método
con calentamiento. En el método evaporativo los dos sólidos se disuelven en agua y se
evaporan a 50°C en un rotavapor. El líquido resultante se pone en un desecador con sílica
gel hasta que alcance un peso constante. En el método con calentamiento los dos sólidos, y
la cantidad calculada de agua se ponen en un recipiente con una barra de agitación
magnética y se calienta con agua a temperaturas menores de 50°C. Se agita hasta cuando se
obtiene un líquido claro (generalmente entre 30 y 90 min).
Otras variantes de estos métodos reportadas incluyen las siguientes:
1. La mezcla se calienta a 50-100°C o se liofiliza, y el resultado es un líquido a
condiciones normales.
2. Al moler en un mortero los dos sólidos, a temperatura ambiente, se logra al final
obtener un líquido DES.
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3. Mezclando los dos sólidos con calentamiento a 50 o 100°C.
4. Se prepara la mezcla de HA y HB con el agua en un recipiente de vidrio, por ejemplo,
en proporción 1:1:10. Se mezclan con ayuda de un agitador vortex durante 1 min.
Después se pone en un baño ultrasonido durante 30 min. Se vuelve a homogenizar
con ayuda del vortex y nuevamente se somete al ultrasonido durante 15 min. El
líquido obtenido se guarda en un desecador a temperatura ambiente.
El uso de diferentes compuestos mezclados con el cloruro de colina, produce líquidos
eutécticos espesos de diferentes polaridades y diferentes propiedades, con los cuales es
posible realizar la extracción de los diferentes metabolitos presentes en fuentes naturales.
La combinación del cloruro de colina con varios productos naturales como ácido láctico,
glicerina, glucosa, sacarosa, prolina, etc., produce los solventes eutécticos viscosos naturales,
denominados con la sigla inglesa NADES. Además del cloruro de colina, se utilizan otros
compuestos como betaína, ácido láctico, ácido málico, ácido cítrico, prolina, serina, ácido
glutámico, glucosa y alanina. La viscosidad de estos solventes se disminuye al agregarles
agua, y se utilizan cada vez más para la extracción de un amplio rango de metabolitos,
inclusive macromoléculas como el ADN, proteínas, polisacáridos, etc., con la ventaja de que
no son tóxicos ni dañinos al medio ambiente y son relativamente económicos. Para el caso
de la extracción de metabolitos apolares se utilizan mezclas de mentol (un terpenoide) con
ácido acético (1:1), ácido pirúvico (1:2), ácido láctico (1:2) y ácido laúrico (2:1).
Los estudios in silico de las propiedades fisicoquímicas de las sales de amonio más
comúnmente utilizadas como son el cloruro de colina, la betaina y cloruro de
tetrametilamonio, con varios donores de hidrógeno (HBD) muestran que la combinación de
betaina con cafeína es la más promisoria de acuerdo con los valores calculados de densidad,
coeficiente de actividad, reactividad y energías de interacción.
Dentro de la gran cantidad de metabolitos secundarios, en el grupo de los compuestos
fenólicos en particular, los más reportados son los flavonoides con la extracción DES, lo que
muestra que es una técnica útil, incluyendo tanto las agliconas como los glicósidos por
ejemplo con DES de cloruro de colina con ácido láctico, cloruro de colina con ácido cítrico, y
cloruro de colina con 1,4-butanodiol, entre otros, sin embargo se encuentran trabajos
reportados para la extracción de otras clases de metabolitos como ácidos grasos, terpenos,
carbohidratos, etc. La Tabla 1.2, presenta algunos ejemplos de solventes DES reportados y
sus aplicaciones en diferentes clases de metabolitos secundarios.
Para la aplicación a escala industrial de estos solventes DES es necesario conocer sus
propiedades físicas y su estabilidad térmica.
Finalmente, es importante mencionar que algunos investigadores están evaluando mezclas
ternarias, que denomina TGES (sigla inglesa de Ternary Green Extraction Solvents), que a
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diferencia de los solventes DES, no se preparan con dos compuestos, sino con tres, y se logra
cambiar propiedades físicas como la viscosidad.
Tabla 1.2. Algunos ejemplos de solventes DES y su utilidad en la extracción de diferentes metabolitos.
DES (HBA/HBD) Aplicaciones/Metabolitos
ChCl: Acido málico Extracción de antocianinas
ChCl: Acido láctico Microencapsulación de antocianinas, extracción de compuestos fenólicos, agliconas y glicósidos flavonoides
ChCl: Acido decanoico Extracción de ácidos grasos
ChCl: Acido cítrico Extracción de compuestos fenólicos
ChCl: Acido butírico y ChCl: Acido fenilpropiónico
Extracción de compuestos fenólicos
ChCl: ácido oxálico Extracción de compuestos fenólicos
ChCl: 1,4-butanodiol y ChCl: 1,2-propanodiol
Extracción de flavonoides
Betaína/Etilénglicol (1:4) Flavonoides
Cloruro de tetrabutilamonio: Acido decanoico 1:3
Quercetina
Betaína: Glicerina: Glucosa 4:20:1 Rutina, catequina, extractos de té verde, cosméticos
Acido láctico: Glucosa 5:1 Comp. fenólicos
Mentol: Acido acético 1:1 Cannabinoides
Varios Extracción de compuestos fenólicos, aceites esenciales, terpenoides, astaxantina, etc.
Varios Extracción de proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos y fosfolípidos
Extracción en fase sólida
Para muchos procesos de análisis, se han desarrollado dispositivos y materiales que permiten
el análisis más rápido de metabolitos presentes en matrices biológicas, los cuales son muy
útiles en actividades como el control de calidad de materias primas vegetales. El ejemplo
más claro de esto son los cartuchos de extracción, que son dispositivos cilíndricos empacados
con diferentes fases estacionarias que interactúan con soluciones de muestras o extractos
vegetales, que al pasar a través de ellos separan las sustancias presentes por interacciones
lipofílicas, por ejemplo, con fases estacionarias de cadenas hidrocarbonadas C-8 ó C-18, o
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por interacciones polares con fases estacionarias polares. Estas clases de cartuchos de
extracción de fase reversa son las más utilizadas, se las conoce por la sigla inglesa SPE (Solid
Phase Extraction), aunque existen en el mercado cartuchos con otras fases estacionarias
modificadas químicamente, de acuerdo al tipo de metabolitos para los que se vayan a usar.
Extracción Sohxlet
La extracción Sohxlet utiliza un sistema de evaporación y condensación continua sobre una
muestra generalmente seca y molida previamente. Se utilizan solventes orgánicos de
mediana o baja polaridad como hexano, diclorometano, entre otros. Es muy utilizada para la
extracción de sustancias de mediana y baja polaridad, particularmente lípidos tales como
triglicéridos, terpenoides, etc. Presenta como ventaja que al ser un proceso continuo se
pueden realizar extracciones exhaustivas de las sustancias de interés, a las temperaturas de
ebullición de los solventes usados.
La extracción Sohxlet permite el trabajo con muestras de 10 a 30 g, no requiere de filtración
después de la extracción, y no requiere generalmente que esté presente el analista todo el
tiempo durante el proceso de extracción. Las desventajas incluyen los tiempos largos de
extracción (dependiendo del tamaño de la muestra hasta 24-48 horas), los volúmenes
grandes de solventes orgánicos necesarios, y la necesidad de concentrar (evaporar) grandes
volúmenes de solventes.
La figura 2.2 muestra un esquema simplificado de un sistema de extracción Sohxlet.
Figura 2.2. Esquema simplificado de un dispositivo de extracción Sohxlet. En la parte superior hay un sistema de refrigeración a través de la circulación de un líquido enfriador, el cual condensa los vapores del solvente utilizado para extraer y el líquido condensado cae nuevamente sobre la muestra. El recipiente del medio contiene un compartimento en el cual se coloca la muestra seca y molida dentro de un dedal poroso, evitando que las partículas de esta muestra se caigan en el matraz de extracción que contiene el solvente extractor. En la parte de abajo un sistema de calentamiento y agitación magnética.
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Extracción asistida con ultrasonido
Aunque para muchos propósitos de extracción se utilizan ampliamente métodos como la
maceración con solventes orgánicos, generalmente acompañada de procesos de agitación
mecánica o magnética; o procesos como la extracción Sohxlet, especialmente para obtener
los componentes liposolubles; más recientemente se han incorporado las técnicas que
involucran el ultrasonido y las microondas para facilitar el proceso de extracción de los
metabolitos.
En el caso de los métodos asistidos con ultrasonido, se disminuyen los tiempos de extracción,
además que presentan beneficios ambientales y de seguridad, al no requerir de cantidades
altas de solventes orgánicos, por ejemplo, como los organoclorados, y de solventes
inflamables como el acetato de etilo, entre otros. Una revisión reciente, muestra como para
muchas matrices vegetales como son los extractos antioxidantes del fruto de la granada; los
carotenoides del tomate, los componentes del aroma del ajo, los extractos antioxidantes de
uvas, los aceites de semillas de papaya, de almendras, de soya, de pistachos; los extractos de
romero, de mejorana, etc.; se utilizan solventes como agua, etanol, hexano, que producen
menos emisiones de dióxido de carbono y menos vapores tóxicos. En la actualidad ya se
consiguen extractores a nivel industrial que utilizan el ultrasonido.
La extracción con ayuda de ultrasonido es comparativamente más rápida que la extracción
Sohxlet, ya que, para muestras de menos de 30 g, se requieren tiempos de extracción de
menos de una hora. Además, permite la extracción de muestras relativamente grandes con
menores costos, pero como la extracción Sohxlet, requiere de mayores tiempos y
operaciones en la filtración y la evaporación.
Extracción con fluidos supercríticos y subcríticos
Debido a que muchos de los procesos de extracción usados tradicionalmente para obtener
sustancias naturales incluyen el uso de solventes orgánicos, especialmente los halogenados
como el cloroformo y el diclorometano, como ya se mencionó anteriormente; se han
diseñado técnicas de extracción menos dañinas para la salud y el medio ambiente. Este es el
caso de la extracción con fluidos supercríticos. Un fluido supercrítico podemos definirlo
simplemente como una sustancia que, en condiciones normales de presión atmosférica y
temperatura, es un gas, pero que al comprimirlo se convierte en un líquido. Este estado
líquido se mantiene en recipientes de acero inoxidable resistentes a altas presiones y bajas
temperaturas. Este líquido al hacerlo pasar a través de una muestra biológica, puede
utilizarse como cualquier solvente orgánico para extraer los metabolitos de las muestras
biológicas. La sustancia más utilizada para este propósito es el dióxido de carbono, cual es
una sustancia abundante en la naturaleza, es relativamente poco costoso, y se puede
comprimir adecuadamente a altas presiones (73 atm) y bajas temperaturas (31°C). El
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proceso de extracción con CO2 supercrítico, requiere de un montaje que incluye un cilindro
con CO2 gaseoso, conectado a un compresor de alta potencia y con control de la
temperatura. Una vez sometido el material vegetal al contacto con el fluido supercrítico, se
solubilizan las sustancias, se transportan a una interfase con una matriz sólida sobre la cual
se absorben las sustancias extraídas, y se libera la presión para eliminar el CO2 en forma
gaseosa. Esta técnica de extracción ya está disponible comercialmente no solo para fines de
investigación sino también para fines de producción a nivel comercial no solo de extractos
sino también para extraer los diferentes metabolitos de interés farmacéutico o alimentario
como esencias, fragancias, colorantes, antioxidantes, drogas vegetales, pesticidas,
descafeinado, desengrase de productos alimenticios, extracción de lúpulo, etc.
El dióxido de carbono no es tóxico, no es inflamable y relativamente amigable con el medio
ambiente. Además, permite el uso de sustancias modificadoras que se añaden y que pueden
controlarse variando la presión y temperatura del sistema.
En los últimos años se han venido desarrollando nuevos dispositivos para la extracción,
utilizando fluidos subcríticos. En este caso se utilizan solventes como agua o etanol, que se
calientan y comprimen a temperaturas y presiones por debajo del punto crítico.
Nuevamente, se considera un método no solo novedoso sino menos contaminante. Un
ejemplo de estos trabajos es la extracción con etanol subcrítico de los flavonoides de
Moringa oleifera, en la cual se obtienen además extracciones más rápidas, con menor gasto
de energía.
Extracción asistida con microondas
La búsqueda constante para lograr métodos de extracción más rápidos, eficientes,
económicos y amigables del medio ambiente ha llevado a considerar también el uso de las
radiaciones de microondas como un medio físico para facilitar los procesos de extracción de
los metabolitos de las diferentes matrices biológicas, facilitando su disolución en un solvente.
Los métodos de extracción asistidos por microondas (sigla inglesa MAE), utilizan microondas
que pueden penetrar fácilmente a través de los poros de las muestras, haciendo que el
solvente quede atrapado en dichos poros permitiendo que el solvente se caliente más
rápidamente al absorber las microondas. Esta técnica de extracción es rápida (por ejemplo
en 20-30 min se pueden procesar unas 12 muestras, además se utilizan menores cantidades
de solventes comparada con el uso de ultrasonido y la extracción Sohxlet, además permite
el control total de los parámetros de extracción tales como el tiempo, la energía y la
temperatura. Además, permite utilizar temperaturas relativamente altas, permite la
agitación y no requiere de agentes de secado porque el agua absorbe microondas muy
rápido y permite así ayudar en el calentamiento de la muestra.
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Las desventajas de la extracción asistida con microondas incluyen que los extractos deben
ser filtrados después de la extracción, se requieren solventes polares y el equipo necesario
es costoso.
El efecto de las microondas en el proceso de extracción muestra resultados positivos por
ejemplo en el caso de metabolitos tales como los flavonoides. Otro ejemplo es el análisis de
la marrubiina, un diterpenoide furánico presente en el marrubio blanco Marrubium vulgare,
aceptado en las farmacopeas europeas y con reportes de efectos antihipertensivo,
antioxidante, antinflamatorio, antidiabético, efectos en el sistema respiratorio, estimulante
digestivo, antiasmático, hipolipidémico, antibacteriano y anti hongos.
En general, la tendencia actual es a la utilización de solventes menos contaminantes, en
menores volúmenes, y al uso de una o varias de las técnicas de extracción asistida con
microondas, ultrasonido y fluidos supercríticos.
Cromatografía en Capa Fina y en Columna (CCF y CC)
Desde que se descubrió el uso de las técnicas de CCF y CC en los inicios del siglo 20, para la
separación y análisis de metabolitos secundarios vegetales; ambas técnicas se constituyeron
en herramientas fundamentales para el trabajo experimental de aislamiento y
caracterización de los metabolitos secundarios.
Estas técnicas han sido mejoradas a través de los años, con el desarrollo de nuevos
materiales para utilizar como fase estacionaria; sin embargo, la sílica gel, en sus diferentes
presentaciones y especificaciones, y su derivado de fase inversa el octadecilsilano; ambos se
utilizan ampliamente en los laboratorios de docencia, investigación, control de calidad y
plantas de producción.
La CCF con sílica gel, es una técnica muy útil para la separación de mezclas de compuestos
de mediana y baja polaridad, es decir sustancias tipo aglicona. La separación se da por las
interacciones entre los grupos polares de los compuestos y los grupos hidroxilos ligados a
átomos de silicio, presentes en la sílica gel. Esta cromatografía conocida también como
Cromatografía Normal, donde la fase estacionaria es polar. En contraparte, y especialmente
para el caso de los glicósidos, se utiliza más la cromatografía en fase inversa con
octadecilsilano. En esta técnica, los grupos hidroxilos de la sílica, se modifican químicamente
remplazando el hidrógeno del hidroxilo, por cadenas hidrocarbonadas, de 8, 18 y más
átomos de carbono, o por otros grupos funcionales químicos. Cuando se tienen estas sílicas
modificadas con cadenas hidrocarbonadas, se habla de Cromatografía en Fase Reversa, ó
Fase Inversa. En este caso, la separación se da por las interacciones lipofílicas entre las
porciones apolares de los compuestos de la mezcla, y las cadenas hidrocarbonadas de la fase
estacionaria.
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Una referencia importante para el caso del análisis por cromatografía en capa fina de drogas
vegetales es el libro clásico Análisis de Drogas Vegetales de Bladt y col.
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (sigla inglesa HPLC)
Sin duda la técnica de separación cada vez más utilizada es la cromatografía líquida de Alta
Eficiencia, comúnmente nombrada con la sigla inglesa HPLC. Esta técnica instrumental
supera ampliamente en cuanto a la capacidad de separación de los componentes de una
mezcla, a la CCF. Además, al ser automatizada y controlada por procesadores
computarizados, facilita los procesos de no solo de separación, conservación digital de los
resultados, sino también de cuantificar los componentes de una muestra biológica.
La cromatografía HPLC desde su desarrollo inicial, ha venido siendo mejorada no solo en
cuanto a las especificaciones básicas de las columnas, sino especialmente en cuanto a su
acoplamiento con diferentes detectores. El tamaño de partícula de la fase estacionaria
generalmente es de 2 a 5 µm, pero más recientemente se han incorporado tamaños de
partícula menores a 2 µm, lo que se traduce en una separación más eficiente, pero se
requiere de bombas de presión de mayor capacidad (más de 6.000 psi), por lo que a ésta se
la denomina UPLC, ó UHPLC, hablándose de ultra-HPLC. Aparte del detector UV-visible,
ampliamente utilizado para muchos propósitos analíticos; los detectores universales como
el ELSD también permiten el análisis de sustancias naturales que no son observables con los
detectores UV-visible. Además de estos detectores, se cuenta con detectores como los de
arreglo de diodos, conocidos por la sigla inglesa DAD, los cuales permiten a la vez que ocurre
la separación cromatográfica, la obtención de los correspondientes espectros UV-visible.
Pero indudablemente la técnica más utilizada actualmente para propósitos analíticos y de
investigación es la cromatografía HPLC acoplada a detectores de masas. Mediante esta
técnica además de obtener las mejores separaciones de mezclas de metabolitos, y a la vez
se obtienen los correspondientes espectros de masas. Comercialmente se dispone de
sistemas que integran ultra-HPLC, con detectores de masas electrospray, que permiten
determinar espectros de masas que se pueden analizar y comparar con los disponibles en las
bases de datos, permitiendo analizar e identificar muchas sustancias naturales. Además, con
los detectores de masas disponibles, se pueden obtener no solo los espectros de masas de
primer orden, sino de segundo, tercero y más ordenes (espectrometría de masas tándem),
lo que permite identificar con mayor precisión cada sustancia.
Más recientemente se han venido desarrollando equipos de HPLC acoplados a
espectrómetros de RMN, con lo cual se pueden caracterizar químicamente muchos
compuestos naturales. Estos sistemas que incorporan no solo nuevos desarrollos
tecnológicos sino bioinformáticos, además de servir como técnicas de control de calidad
avanzado, son útiles en tareas como la quimio taxonomía y la metabolómica de los productos
34
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naturales. Un ejemplo de la utilidad de estas técnicas combinadas es el análisis de inyectables
XueBiJing®. Este producto de base herbaria está aprobado por la Administración de Drogas
y Alimentos China para el tratamiento de sepsis y varios síndromes disfuncionales orgánicos.
Este fitoterapéutico se obtiene de cinco plantas chinas: flores de Carthami, raíces de
Paeoniae rubra, rizomas de Chuanxiong, raíces de Salviae miltiorrhizae y raíces de Angelicae
sinensis. Mediante la combinación de UHPLC y espectrometría de masas, se pueden
determinar rápidamente hasta 30 componentes. También se cuenta ya con sistemas
integrados por el cromatógrafo HPLC, con el detector de arreglo de diodos y el
espectrómetro de masas, con los cuales la identificación de muchos compuestos naturales
como los carotenoides en diferentes muestras, es más eficiente, más rápida y confiable.
Otra técnica actualmente usada es la cromatografía de contracorriente CCC, en la que se
utilizan dos líquidos inmiscibles a manera de fase móvil y fase estacionaria, lo que evita los
procesos de degradación química del compuesto de interés, la adsorción irreversible en la
fase móvil, y la pérdida de muestra durante el proceso de aislamiento. En esta técnica, la fase
estacionaria es retenida en la columna de separación por la fuerza centrífuga, mientras la
fase móvil es bombeada a través de la fase estacionaria a una velocidad de flujo determinada.
La muestra sufre partición de manera repetida a lo largo de la columna, entre ambas fases.
Los compuestos presentes en la muestra eluyen a diferentes tiempos, dependiendo de sus
coeficientes de partición, lo que determina su separación al final.
Actualmente las variantes más utilizadas incluyen la HSCCC (Cromatografía de
Contracorriente de Alta Velocidad), y la CPC (Cromatografía Centrífuga de partición). La
HSCCC cuenta con instrumentos que retienen más grandes cantidades de fase estacionaria
contra mayores velocidades de flujo de la fase móvil (utiliza mayores niveles de fuerza G)
bajo condiciones de alta velocidad rotacional, lo que acelera el proceso de separación frente
a la CCC convencional.
Técnicas generales de caracterización de metabolitos secundarios
Las técnicas instrumentales se han venido desarrollando y avanzando paulatinamente, y
permiten de una manera rápida y confiable el trabajo de caracterización de muchas
sustancias naturales, inclusive las que están en muy baja concentración en las fuentes
naturales. Estas técnicas además presentan muchas ventajas sobre los métodos de
caracterización e identificación usados por los químicos de productos naturales del siglo
pasado, como por ejemplo las pruebas o ensayos químicos, los cuales requieren de
cantidades de muestras mucho más grandes que las que requieren las técnicas
instrumentales. Además, muchas pruebas o ensayos químicos requieren el uso extensivo de
reactivos y materiales tóxicos y adicionalmente muy contaminantes para el medio ambiente,
como es el caso de muchos solventes orgánicos (cloroformo, diclorometano, benceno, etc.).
35
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Un ejemplo de estos son los ensayos de reconocimiento de alcaloides, los cuales requieren
el uso de sales de metales pesados. Estas limitaciones y dificultades justifican ampliamente
el uso preferente de las técnicas instrumentales, sobre otras técnicas de identificación;
aunque en muchas ocasiones pueden resultar aún muy útiles los ensayos químicos, con las
debidas precauciones del manejo de los reactivos y sus desechos.
A continuación, se presentan algunos aspectos más relacionados con el uso de las técnicas
instrumentales para fines de dilucidación estructural, como son las técnicas espectroscópicas
ultravioleta-visible (UV-vis), infrarrojo (IR), espectrometría de masas (EM) y Resonancia
Magnética Nuclear (RMN), todas enfocadas a la identificación o caracterización de productos
naturales, particularmente los denominados metabolitos secundarios.
Espectroscopia Ultravioleta-Visible (UV-vis)
Entre las decenas de miles de metabolitos secundarios que actualmente se conocen, se
encuentran fundamentalmente dos tipos de sustancias. Las primeras son sustancias que no
absorben luz ultravioleta en el rango de trabajo normal de 195 a 380 nm, ni tampoco en la
región visible. Se trata de sustancias como una gran cantidad de terpenoides que no
contienen en su estructura grupos cromóforos. Son ejemplos de estas (figura 1.2), los
esteroides como el estigmasterol, triterpenoides como la amirina, monoterpenos como el
mentol, muchos ácidos grasos, etc. Estas sustancias son trasparentes en la región ultravioleta
de trabajo, y su análisis por esta técnica es muy limitado.
Las otras sustancias, incluyen muchas sustancias con grupos que absorben en la región
ultravioleta de trabajo, como son las que poseen en su estructura a los anillos aromáticos.
Además, también muchas sustancias que, aunque no tienen anillos aromáticos, poseen
enlaces dobles carbono-carbono conjugados (denominados grupos dieno conjugados), o
enlaces dobles carbono-carbono conjugados a grupos carbonilos (denominados grupos
enona conjugados). Estas incluyen a los compuestos fenólicos, y a algunos terpenoides. Son
ejemplo de estas sustancias el flavonoide quercetina, el lignano podofilotoxina, el
carotenoide β-caroteno, el esteroide ergosterol, etc.
Es importante mencionar que la espectroscopia UV-vis, no solo ayuda al reconocimiento de
compuestos naturales con ciertos grupos cromóforos, también es una técnica útil en el
proceso de aislamiento, identificación y cuantificación de estas sustancias. Por ejemplo,
permite reconocer los compuestos con grupos cromóforos en las placas de cromatografía, y
en los sistemas HPLC con detectores bien sea de longitud de onda fija, de onda variable o la
opción más moderna que es el detector de arreglo de diodos (sigla inglesa DAD). Finalmente,
vale mencionar que es una técnica no destructiva, por lo cual la muestra analizada puede
utilizarse para otros procesos analíticos o experimentales.
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HO
Estigmasterol
OH
Mentol
HO
Amirina
37
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O
O
HO
OH
OH
OH
OH
Quercetina
HO
Ergosterol
Figura 1.2. Estructuras químicas de algunos metabolitos secundarios con y sin grupos cromóforos.
Espectroscopia infrarroja (IR)
La espectroscopia infrarroja, es una técnica instrumental analítica muy útil para el
reconocimiento de los grupos funcionales y algunas características estructurales de los
metabolitos secundarios. Como la espectroscopia UV-vis, no es destructiva, y las muestras
pueden recuperarse y utilizarse para otros propósitos experimentales.
Aunque por sí sola, es una técnica que no permite la identificación completa (caracterización)
de una sustancia, sí es muy útil para ayudar en la caracterización no solo de metabolitos
conocidos, sino de otros nuevos. Para esto es una técnica complementaria junto a técnicas
instrumentales de caracterización como la Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
Es relativamente fácil reconocer a simple vista observando el espectro infrarrojo, cuando se
tienen sustancias con y sin anillos aromáticos, en este último caso como son la mayoría de
terpenoides. El espectro IR de sustancias con anillos aromáticos, muestra una mayor
cantidad de bandas definidas, debido a los tonos y sobre tonos de las bandas de vibración de
dichos compuestos. Comparativamente, los espectros IR de moléculas no aromáticas,
muestran menos bandas de absorción, y generalmente son anchas y menos definidas.
38
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Al observar el espectro infrarrojo de la 2-metilantraquinona (compuesto con dos anillos
aromáticos); en la base de datos del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial
Avanzada de Japón https://sdbs.db.aist.go.jp; pueden verse bandas de absorción muy
definidas y agudas, mientras que el espectro de un compuesto sin anillos aromáticos y sin
grupos cromóforos como el esteroide colesterol muestra menos bandas y estas son más
anchas. El espectro infrarrojo del colesterol también está disponible en la base de datos
mencionada.
Aunque el uso de otras técnicas espectroscópicas como la espectroscopia UV combinada con
HPLC, es de amplio uso para el análisis de muestras biológicas, también se encuentran
aplicaciones de la técnica de infrarrojo para el análisis de matrices vegetales complejas.
Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear
La Resonancia Magnética Nuclear (RMN), es la técnica más útil en la caracterización química
de una sustancia natural orgánica. En el caso de los productos naturales, el uso de los
experimentos unidimensionales con protones y carbonos ha permitido durante varias
décadas, la dilucidación estructural de muchos de ellos. El acceso más reciente a técnicas
RMN de alta resolución, y a diferentes experimentos bidimensionales homonucleares y
heteronucleares, ha permitido no solo avanzar en la caracterización de sustancias naturales
no conocidas, sino en resolver la asignación estructural completa de otras conocidas
previamente. Además, la disponibilidad de mejores simuladores RMN comerciales, permite
actualmente la predicción y confirmación estructural de los compuestos orgánicos en
general.
Para propósitos ilustrativos a continuación se hace la predicción y el análisis RMN de una
sustancia con anillos aromáticos como es la 2-metilantraquinona. No se considerarán los
solventes para simplificar la explicación.
La figura 1.3 muestra la estructura y enumeración de la 2-metilantraquinona. En RMN-1H, los
protones aromáticos resuenan y sus señales se observan aprox. entre 6 y 8 ppm,
dependiendo de los grupos vecinos. Las constantes de acoplamiento de los protones
aromáticos generalmente oscilan entre 2-3 Hz para los protones acoplados en disposición
meta entre sí; y entre 8 y 9 Hz, para los protones en disposición orto entre sí. Tomando esto
en cuenta se puede predecir que el H-1 debe ser un doblete con constante de acoplamiento
meta, debido a su acoplamiento con el H-3. Por simplicidad de ahora en adelante lo
denominaremos doblete-meta (dm). Aunque el protón H-1, acopla con el protón H-4, en
posición relativa para, la constante de acoplamiento para es muy pequeña, cercana a cero,
y en la práctica generalmente no se observa.
39
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O
O
12
3
45
6
7
8
Figura 1.3. Estructura y enumeración de la molécula de 2-metilantraquinona.
Continuando con la predicción para los otros protones aromáticos, el H-3 debe originar una
señal doble doblete, con constantes de acoplamiento orto y meta; debido a que el H-3 acopla
con el H-4 en orto, y con el H-1 en meta. Es decir, en resumen es un doble doblete-orto,meta
(ddo,m).
El protón H-4 debe originar un doblete orto, debido a su acoplamiento con el protón H-3. Es
decir, debe ser un doblete-orto (do).
El protón H-5 debe ser un ddo,m, igual que su similar H-8. Los protones H-6 y H-7, deben ser
dobles tripletes orto-meta, debido a que por ejemplo el H-6 acopla en orto con los protones
H-5 y H-7, lo que genera un triplete-orto. Un análisis similar permite predecir que el H-7 es
muy similar al H-6, y ambos deben generar señales dto,m. En resumen, podemos predecir
para la 2-metilantraquinona, los datos calculados presentado en la tabla 1.
Tabla 1. Valores de desplazamiento y multiplicidades predichas para la 2-metilantraquinona por simple observación de la estructura química.
Protón(es) Desplazamiento químico (ppm) Multiplicidad y constantes de acoplamiento
H-1 6-8 Doblete J=2-3 Hz (dm)
H-3 6-8 Doble doblete J=2-3 y 8-9 Hz (ddo,m)
H-4 6-8 Doblete J= 8-9 Hz (do)
H-5 y H-8 6-8 Doble doblete J= 2-3 y 8-9 Hz (ddo,m)
H-6 y H-7 6-8 Doble triplete J= 2-3 y 8-9 Hz (dto,m)
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Una vez hecha la predicción anterior, vamos a revisar lo que se predijo, frente a espectros
simulados disponibles en línea y en software comercial (20, 21).
Al obtener el espectro simulado en línea (Figuras 1.4 y 1.5), utilizando el predictor en línea,
se obtienen los valores mostrados en la tabla 2.
Tabla 2. Valores de desplazamiento y multiplicidades predichas para la 2-metilantraquinona junto a los valores calculados con el software en línea www.nmrdb.org
Protón(es) Desplazamiento químico (ppm)
Desplazamiento Calc. Software en línea
Multiplicidad y constantes de acoplamiento
Multiplicidad y constantes de acoplamiento calc. Con software en línea
H-1 6-8 7.99 doblete J=2-3 Hz (dm)
ddm, J=1.59 Hz
H-3 6-8 7.32 doble doblete J=2-3 y 8-9 Hz (ddo,m)
ddo.m, J=7.73, 1.59 Hz
H-4 6-8 7.62 doblete J= 8-9 Hz (do)
dd, J= 7.73 Hz
H-5 y H-8 6-8 7.86 doble doblete J= 2-3 y 8-9 Hz (ddo,m)
dd, J= 7.77, 1.29 Hz
H-6 y H-7 6-8 7.63 doble triplete J= 2-3 y 8-9 Hz (dto,m)
dd, J= 7.77, 1.29 Hz
Figura 1.4. Espectro RMN-1H de la 2-metilantraquinona calculado en línea con la aplicación de www.nmrdb.org
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Figura 1.5. Ampliación de la región de protones aromáticos de la 2-metilantraquinona, a partir del espectro simulado en nmrdb.org
De acuerdo con los datos presentados en la tabla 2, la predicción de los desplazamientos
químicos por simple observación se ajusta a lo calculado con el software en línea nmrdb.org,
pues todos los valores de desplazamiento calculados están dentro del rango esperado de 6
a 8 ppm.
Cuando se utiliza la versión comercial del software predictor de AcdLabs® versión 11, se
obtienen los valores obtenidos se presentan en la tabla 2.3.3.
Tabla 3. Valores de desplazamiento predichos para la 2-metilantraquinona junto a los valores calculados con el software en línea www.nmrdb.org, y el módulo predictor NMR de AcdLabs®
Protón (es)
Desplazamiento químico esperado (ppm)
Desplazamiento Calc. Software en línea (nmrdb.org)
Desplazamiento Calc. ACDLabs NMR-predictor®
H-1 6-8 7.59 8.02
H-3 6-8 7.32 7.54
H-4 6-8 7.62 8.12
H-5 y H-8 6-8 7.86 8.29
H-6 y H-7 6-8 7.63 7.77
Al observar el espectro RMN-1H de la 2-metilantraquinona en cloroformo deuterado,
disponible en la base de datos SDBS https://sdbs.db.aist.go.jp ; se pueden apreciar las señales
de los protones aromáticos entre 7.5 y 8.5 ppm. Los protones del grupo metilo ligado al
carbono-2 se observan como un singlete a 2.5 ppm. El protón 1 se observa como un doblete
en 8.05 ppm. El protón 3 se observa como un doblete en 7.56 ppm. El protón 4 se observa
como un doblete en 8.15 ppm. Las señales restantes entre 7.7 y 8.3 ppm corresponden a las
de los protones 5 y 8. La Tabla 4 resume todos los desplazamientos químicos esperados,
calculados y reportados.
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Tabla 4. Valores de desplazamiento predichos para la 2-metilantraquinona junto a los valores calculados con el software en línea www.nmrdb.org, el módulo predictor NMR de AcdLabs® y los reportados en la base de datos de la SDBS.
Protón
(es)
Desplazamiento químico esperado (ppm)
Desplazamiento Calc. Software en línea (nmrdb.org) (ppm)
Desplazamiento Calc. ACDLabs NMR-predictor®
(ppm)
Desplazamiento químico reportado en la base de datos SDBS Japón
(ppm)
H-1 6-8 7.59 8.02 8.05
H-3 6-8 7.32 7.54 7.56
H-4 6-8 7.62 8.12 8.15
H-5 y H-8 6-8 7.86 8.29 8.25-8.27
H-6 y H-7 6-8 7.63 7.77 7.76
De acuerdo con la tabla 4, las diferencias entre los valores de desplazamiento calculados y
los reportados, oscilan entre 0 y 0.5 ppm aproximadamente, demostrando así la utilidad de
los programas de computador disponibles, para complementar el análisis estructural de las
sustancias, como la 2-metilantraquinona.
Al realizar la misma secuencia, para el caso del espectro RMN-13C, de la misma 2-
metilantraquinona, se obtienen los resultados mostrados en la Tabla 5.
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Tabla 5. Valores de desplazamiento predichos para la 2-metilantraquinona junto a los valores calculados con el software en línea www.nmrdb.org, el módulo predictor NMR de AcdLabs® y los reportados en la base de datos de la SDBS.
Carbono
(es)
Desplazamiento químico esperado (ppm)
Desplazamiento Calc. Software en línea (nmrdb.org) (ppm)
Desplazamiento
Calc. ACDLabs NMR-predictor®
(ppm)
Desplazamiento químico reportado en la base de datos SDBS Japón
(CDCl3, ppm)
C-1 120-140 127.6 126.96 127.43
C-2 120-140 140.0 144.75 145.24
Me-C-2 21.4 20.9 21.38 21.90
C-3 120-140 131.8 133.83 134.90
C-4 120-140 127.2 126.93 127.38
C-5 120-140 126.7 126.30 N.A.
C-6 120-140 132.4 133.10 133.88
C-7 120-140 132.4 134.00 134.00
C-8 120-140 126.7 126.30 127.10
C-9 195 183.3 182.55 182.88
C-10 195 181.3 182.53 183.32
C-1a 120-140 133.4 133.00 133.29
C-4a 120-140 133.2 130.60 131.19
C-8a 120-140 133.0 132.00 133.51
C-5a 120-140 133.0 132.80 133.48
Los valores de desplazamiento químico esperados se refieren a rangos de valores de
desplazamiento conocidos para este tipo de carbonos.
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Figura 1.6. Espectro RMN-13C de la 2-metilantraquinona simulado con la aplicación en línea de
NMRdb.org
Figura 1.7. Espectro RMN13C de la 2-metilantraquinona, región ampliada de señales de carbonos aromáticos.
De acuerdo con los valores mostrados en la tabla 5, los desplazamientos calculados
comparados con los reportados, oscilan entre 0 y 5 ppm aproximadamente, en este caso
para la 2-metilantraquinona; demostrando nuevamente la gran utilidad de estas
herramientas computacionales.
Es importante tener en cuenta que además la RMN-13C, permite determinar el número de
protones ligados a cada carbono, mediante el experimento denominado RMN-13C
parcialmente desacoplado, en el cual se pueden observar en lugar de las solas señales
singlete, las señales cuartete (q) para carbonos metílicos, triplete para carbonos metilénicos,
doblete para carbonos metínicos y singlete para carbonos sin protones ligados. Otro
experimento muy útil es el DEPT (de la sigla inglesa: Distortionless Enhancement through
Polarization Transfer), el cual permite observar en el espectro RMN-13C, las señales de los
carbonos metílicos y metínicos se observan como señales positivas, las de los carbonos
metilénicos se observan como señales negativas, y no se observan las señales de carbonos
sin protones ligados.
Actualmente, además de los experimentos RMN unidimensionales, se usan ampliamente los
experimentos de RMN-2D. Entre los experimentos más usados para los metabolitos
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secundarios, están los experimentos COSY (del inglés Correlation Spectroscopy), HMQC (sigla
inglesa para Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) y HMBC (sigla inglesa de
Heteronuclear Multiple Bond Correlation). El experimento COSY, básicamente muestra un
espectro bidimensional con señales de correlación entre protones vecinos (a 3 enlaces). El
espectro HSQC muestra señales de correlación entre señales de protones y carbonos
directamente ligados. El experimento HMBC muestra al igual que el experimento HSQC, las
correlaciones entre señales de carbonos y protones directamente unidos, pero
adicionalmente muestra señales de correlación heteronucleares a 2 y 3 enlaces.
Para entender de una manera sencilla estos espectros, vamos a predecirlos a partir de una
molécula sencilla como es el 1-propanol.
Para predecir el espectro COSY, se requiere del espectro unidimensional RMN protónico del
1-propanol. Este puede consultarse en la base de datos National Institute of Advanced
Industrial Science and Technology, disponible en la página web: http://sdbs.db.aist.go.jp, y
muestra cuatro señales definidas: δ 0.94 (s, 3H, H-1), 1.57 (sextete, 2H, H-2), 2.26 (s, H
hidroxilo), y 3.582 (t, 2H, H-3).
La figura 1.8 muestra un dibujo del espectro COSY esperado para el 1-propanol. Se pueden
observar manchas de correlación (picos cruzados) entre las señales de los protones de C-1 y
la de los protones de C-2, por ser vecinos. No se observan manchas de correlación entre las
señales de los protones de C-1 y C-3, porque estos no son protones vecinos. Finalmente, se
observa correlación entre las señales de protones de C-2 y C-3, por ser vecinos. Por este
comportamiento diferentes autores se refieren a COSY como un experimento que determina
la vecindad de protones en una molécula.
Figura 1.8. Espectro COSY esperado para la molécula de 1-propanol. Se observa la diagonal de color verde, y señales de correlación en colores azul (protones vecinos H-2 y H-3) y violeta (protones vecinos H-1 y H-2) para facilitar su interpretación relativa a la vecindad de protones.
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La figura 1.9 muestra el espectro COSY calculado con el software disponible en-linea en el
sitio www.nmrdb.org. Se observan señales de correlación entre el triplete de los protones
del C-1 (0.9 ppm), y el multiplete de los protones del C-2 (1.7 ppm); y además muestra
señales de correlación entre el multiplete de los protones del C-2 (1.7 ppm), y el triplete de
los protones del C-3 (3.3 ppm). La figura 1.10 muestra con flechas dobles los protones
vecinales.
Figura 1.9. espectro COSY H-H de 1-propanol calculado con el software en línea nmrdb.org. Las líneas azules fueron añadidas para visualizar la vecindad o correlación entre los protones.
OH
HH
H H
H
HH
12
3
Figura 1.10. Esquema de las correlaciones entre protones vecinos del 1-propanol.
Otro experimento de RMN-13C, es el espectro HSQC. La figura 1.11, muestra un modelo
simplificado del espectro HSQC esperado para el 1-propanol.
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Figura 1.11. Espectro 2D HSQC esperado para el 1-propanol.
El espectro HSQC, muestra señales de correlación entre los carbonos y protones
directamente ligados, es decir que permite asignar cada señal de protones con cada señal
del espectro de RMN-13C. Normalmente se dice que permite observar señales de correlación
hetero nuclear a la distancia de 1 enlace (1J).
Es muy importante tener en cuenta que las técnicas RMN no solo son útiles para los procesos
de caracterización química de los metabolitos secundarios, sino también para su
cuantificación. Un ejemplo de esto es la cuantificación de L-dopa, una sustancia utilizada para
el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Esta sustancia es abundante en las semillas
de Mucuna pruriens.
Actualmente, con el uso de técnicas combinadas es posible el análisis rápido de extractos
vegetales, como por ejemplo las técnicas utilizadas para el reconocimiento de 131
metabolitos de un extracto de Polygonum multiflorum, los cuales incluyeron ácidos fenólicos,
estilbenos, flavonas, antraquinonas, naftalenos y derivados. Los autores utilizaron las
técnicas combinadas UHPLC y Espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MS-TOF), y
UHPLC con Espectrometría de masas tándem (MS/MS). Para propósitos preparativos la
combinación de técnicas como la cromatografía en contracorriente (CCC) combinada con la
RMN-13C, también muestra resultados muy interesantes.
Espectrometría de masas
Las técnicas espectrométricas como la RMN, sin duda constituyen unas de las herramientas
más valiosas en la identificación y caracterización química de los metabolitos secundarios;
pero son muy bien complementadas con técnicas como las de espectrometría de masas, las
cuales además de informar sobre pesos moleculares, informan en muchos casos aspectos
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estructurales muy importantes. Un ejemplo de esto último es el uso de los espectros de
masas de alta resolución y los espectros de masas tándem ms/ms, que combinados con bases
de datos como Reaxys®, Chemspider® y otras, permiten la asignación estructural de
productos naturales.
Para el caso de los metabolitos no glicósidos, comúnmente denominados agliconas o formas
libres, la espectrometría de masas clásica, como se llama a la espectrometría de masas
basada en el efecto del impacto de electrones sobre la sustancia de interés, es una
herramienta muy valiosa, pues se conocen los mecanismos de fragmentación de muchas
sustancias, y se cuenta con bases de datos digitales con los espectros de muchas sustancias
naturales.
Pero en el caso de los metabolitos glicosilados, estos compuestos no son estables desde el
punto de vista térmico, y por tanto no pueden analizarse con la espectrometría de masas
clásica. Esto debido a que esta técnica requiere que la sustancia o las sustancias a analizar,
se puedan vaporizar sin descomponerse. Para estos compuestos entonces se requiere de
técnicas de ionización más suaves, las cuales generan espectros de masas relativamente más
simples, pero con información del peso molecular a través de los iones pseudomoleculares
(también denominados iones cuasimoleculares) que se forman por la unión del ion molecular
con iones como el Na+ el K+, el H+; los cuales se utilizan (en forma de sales) en los procesos
de ionización para generar los espectros de masas.
El desarrollo de dispositivos que acoplan la separación cromatográfica por HPLC ó ultra-HPLC
(uHPLC), con detectores de masas, ha permitido un desarrollo notable en los procesos de
análisis y control de calidad de metabolitos, inclusive actualmente se están ofreciendo a nivel
comercial detectores de masas de bajo costo, lo que beneficia a los laboratorios que trabajan
con productos naturales. Aquí es importante destacar el amplio uso de las técnicas que
combinan la separación con la identificación de los componentes de una mezcla, conocidas
en inglés como Hyphenation Techniques, y muy especialmente la combinación de la
cromatografía líquida con la espectrometría de masas (sigla inglesa LC-MS). Estas técnicas se
han desarrollado notablemente en los últimos años, y son útiles para la separación e
identificación de los metabolitos secundarios de diferentes polaridades. Las interfases entre
la columna cromatográfica y los detectores o analizadores de masas usan fundamentalmente
dos procesos de ionización conocidos con las siglas inglesas ESI (ElectroSpray Ionization) que
corresponde a Ionización por Electro-Aspersión; y a APCI (Atmospheric Pression Chemical
Ionization), que corresponde en español a Ionización Química a Presión Atmosférica. En los
sistemas que usan ESI, la interfase incluye un sistema de electrodos que genera un campo
eléctrico muy fuerte que vaporiza la fase móvil. En sistemas con APCI en lugar de electricidad,
se utiliza calor para vaporizar la fase móvil.
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Las interfases ESI permiten la obtención y análisis de espectros de masas en modos positivo
y negativo. El modo positivo es recomendado para metabolitos de carácter alcalino, y por el
contrario para los metabolitos de carácter acido se recomienda el modo negativo.
En general las interfases APCI son más efectivas para el análisis de moléculas de rangos de
masa cercanos a 2000 Da, y especialmente para aquellas de menor polaridad, mientras que
ESI presenta ventajas como el análisis de moléculas de más alto peso molecular.
En cuanto a los analizadores de masas, se cuenta con analizadores de cuadrupolo, de trampa
de iones, y de tiempo de vuelo.
Los analizadores de cuadrupolo, permiten obtener y seleccionar iones (sigla inglesa SIM,
Selective Ion Monitoring), lo cual los hace ventajosos para procesos de identificación y
cuantificación. Los de triple cuadrupolo (sigla inglesa QqQ), son los más recientemente
desarrollados.
Los analizadores de trampa de iones permiten atrapar ciertos iones y someterlos a una
fragmentación posterior, permitiendo obtener un nuevo espectro de masas, lo que lleva a la
técnica denominada espectrometría de masas tándem, conocida por la sigla inglesa MS/MS.
Los espectros así obtenidos proporcionan mayor información de los procesos de
fragmentación, lo que es muy útil para la dilucidación estructural de los metabolitos
secundarios, además que presentan la ventaja de utilizar los mecanismos de formación de
iones de la espectrometría de masas clásica, que usa impacto de electrones.
El analizador de masas de tiempo de vuelo (sigla inglesa ToF), prácticamente no tiene
limitaciones en cuanto al rango de masas de las sustancias a analizar, y es muy útil para
sustancias de alto peso molecular como las proteínas.
Aquí es importante mencionar que se vienen desarrollando técnicas alternativas, que
permitirían el uso de las bases de datos de espectros de masas de impacto electrónico
disponibles, como es el caso de la técnica cromatografía líquida-espectrometría de masas
con haces moleculares supersónicos (sigla inglesa: EI-LC-MS with SMB), y la técnica de
cromatografía de gases-espectrometría de masas de impacto electrónico en frío (sigla
inglesa: GC-MS with Cold EI). También es importante mencionar el uso cada vez más
extendido de las redes de datos moleculares como por ejemplo la red social global de
productos Naturales (Global Natural Products Social Molecular Network, GNPS), que
combinada con otras herramientas disponibles en línea como LipidsXplorer, permite la
desreplicación, identificación y caracterización estructural de diferentes productos naturales
como lípidos y alcaloides esteroidales.
La combinación de las técnicas de RMN y espectrometría de masas, junto con el uso de las
bases de datos, facilita mucho el análisis de los metabolitos ya conocidos, así como ayuda en
el hallazgo de otros nuevos. En la literatura científica se encuentran reportes de usos de esta
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técnica combinada para el análisis de diferentes metabolitos como iridoides, lignanos,
flavonoides, alcaloides, otros terpenoides. Además, esta técnica permite a través de los
espectros RMN 1D y 2D, determinar aspectos importantes como la estereoquímica.
Técnicas generales de cuantificación de metabolitos secundarios
El desarrollo de las técnicas de análisis químico instrumental permite además de los análisis
cualitativos de los metabolitos secundarios, su cuantificación, esto teniendo en cuenta que
muchos de estos compuestos naturales, se encuentran en sus fuentes biológicas en
concentraciones muy bajas, generalmente de menos del 0.1%.
Entre las técnicas de análisis cuantitativo, indudablemente la cromatografía HPLC y sus
diferentes variantes como UPLC, permiten en tiempos muy cortos no solo la separación,
identificación de metabolitos secundarios en muestras naturales, sino también su
cuantificación. Con esta técnica, y si se cuenta con una sustancia de referencia (también
denominada marcador), el proceso se reduce a la elaboración de una curva de calibración
(curva de absorbancia vs. concentración), con la sustancia a cuantificar. Las áreas de los picos
se miden para hacer una correlación entre dichas áreas y la concentración del marcador.
Luego se analiza la muestra y por interpolación del área del pico de interés, se determina la
concentración en la muestra. La sensibilidad de este método es determinada por el tipo de
sustancia y por el detector, por ejemplo, las sustancias que absorben luz ultravioleta; como
es el caso de muchos compuestos con anillos aromáticos y sistemas insaturados conjugados,
se pueden cuantificar con detectores sencillos como el detector UV de longitud de onda fija.
En cambio, las sustancias que no contienen grupos cromóforos, y que no absorben en la
región ultravioleta del espectro electromagnético, como es el caso de muchos terpenoides y
derivados de ácidos grasos, requieren su derivatización química o el uso de detectores
universales como un refractómetro diferencial ó un detector ELSD, que son menos sensibles
que los detectores ultravioleta. Un ejemplo del uso de HPLC con estos tipos de detectores es
el reportado para la cuantificación de flavonoides y pinitol en la droga ayurvédica Saraca
asoca. Es interesante anotar que muchas sustancias sin grupos cromóforos, como esteroides
pueden detectarse en longitudes de onda como 210 nm, es decir cerca al límite del rango de
detección. Además del método de la curva de calibración, pueden utilizarse otras variantes
como el estándar interno, de acuerdo a cada necesidad de análisis cuantitativo en particular.
Otras técnicas espectrofotométricas que se usan para cuantificar metabolitos secundarios
de manera aproximada incluyen la espectroscopía ultravioleta-visible. Este es el caso de
compuestos fenólicos, los cuales se pueden cuantificar mediante espectroscopia uv-visible,
debido a que forman complejos de color azul con sales complejas de metales pesados como
el reactivo de Folin-Ciocalteau. Estos compuestos se pueden cuantificar a longitudes de onda
como 765 y 790 nm. La figura 1.12 muestra el esquema general de la reacción, que explica
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la formación de los compuestos de color azul. Como estándar de referencia se utiliza el ácido
gálico, y los valores calculados se expresan en términos de dicho compuesto.
OH
+ Acido fosfomolíbdicotungstico
(H3PO4, Mo, W)-OH
O
Mo+n
W+m
complejo de color azul
( 765 nm)
Solución de color amarillo
Figura 1.12. Reacción general de compuestos fenólicos con el reactivo de Folin.
Para el caso del grupo de compuestos denominados flavonoides, se utiliza el cloruro de
aluminio, del cual se conoce su afinidad por compuestos que tienen el anillo pirona. Aunque
no todos los flavonoides contienen el anillo pirona, los más distribuidos naturalmente como
las flavonas y flavonoles, sí lo contienen, y forman complejos que absorben luz visible a 510
nm. Como estándar de referencia se utiliza el flavonoide quercetina.
El desarrollo de métodos quimiométricos, permite la cuantificación simultánea de varios
compuestos en una muestra, utilizando equipos fácilmente disponibles en los laboratorios
de control de calidad. Un ejemplo de esto es la cuantificación simultánea de quercetina,
miricetina y kaempferol, tres flavonoides de interés farmacéutico, mediante el método de
ondícula continua (en inglés: Continous Wavelet Transform CWT).
Finalmente, es importante tener en cuenta, que los avances y desarrollo de las técnicas
instrumentales como la resonancia magnética nuclear, permiten actualmente no solo el
análisis de mezclas complejas de metabolitos, usadas con otras técnicas como la
espectrometría de masas y las técnicas cromatográficas instrumentales. Estas técnicas han
dado lugar a un área de investigación como es la metabolómica, la cual redundará en
procesos y tiempos de análisis más rápidos, más eficientes y menos contaminantes para el
medio ambiente. Sin embargo, el uso de técnicas clásicas de análisis como la cromatografía
de capa fina de alta resolución (sigla inglesa HPTLC), por ejemplo utilizando como fase móvil
la mezcla acetato de etilo–etilmetilcetona– ácido fórmico 98%–agua (50:30:10:10), con
reveladores comunes como son el reactivo de Liebermann-Burchard y el reactivo de
anisaldehído/ácido sulfúrico; todavía es útil en laboratorios de control de calidad para el
reconocimiento de drogas vegetales, donde no se disponga de las técnicas instrumentales.
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Análisis fitoquímico preliminar
Aunque las técnicas de análisis instrumentales modernas han desplazado casi
definitivamente el uso de las técnicas clásicas o convencionales utilizadas para la
identificación de los metabolitos secundarios, para muchos propósitos se utilizan todavía los
análisis fitoquímicos preliminares, también conocidos como marchas fitoquímicas. Estos
procedimientos analíticos se han usado durante muchos años, para tratar de identificar en
un solo proceso experimental y de manera preliminar en muestras vegetales, la presencia o
nó de diferentes metabolitos de interés farmacéutico como los alcaloides, los esteroides, los
compuestos fenólicos, los flavonoides, las quinonas, etc. Los más usados utilizan una
secuencia de procedimientos experimentales relativamente simples, que incluyen técnicas
como los ensayos de coloración con diferentes reactivos químicos, los cuales permiten el
reconocimiento preliminar de diferentes sustancias naturales, y se fundamentan en las
propiedades ácido-base, la solubilidad y la polaridad de las clases principales de compuestos.
A continuación, se describen algunos de estos ensayos, y al final se presenta una propuesta
de marcha fitoquímica simplificada, que toma en cuenta mucho de lo presentado sobre la
polaridad y solubilidad de los diferentes metabolitos secundarios.
Ensayos de reconocimiento de alcaloides
Los alcaloides propiamente dichos, son de carácter alcalino, y pueden formar sales con
ácidos diluidos. Estas sales de alcaloides son solubles en medio acuoso ácido, pero cuando
reaccionan con sales de metales pesados tienden a insolubilizarse formando precipitados.
Los ensayos químicos usados para el reconocimiento incluyen varios ensayos de
precipitación, con diferentes reactivos como son el reactivo de Dragendorff, el reactivo de
Mayer, el reactivo de Valser, el reactivo Reineckato de amonio, el reactivo de Wagner, entre
otros. Teniendo en cuenta la toxicidad de muchos de estos reactivos, que utilizan sales de
metales pesados como el mercurio, es recomendable el uso del reactivo de Wagner.
Figura 1.13. Reacción química que explica la formación de complejos insolubles entre un alcaloide y una sal de metal pesado.
N
R
+ M+n
(sal de metal pesado)
H+ac.
Alcaloide
n
Comp. coordinación insoluble
N
R
N
R
M+n N
R
N
R
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Ensayos de reconocimiento para compuestos fenólicos
Debido a la gran cantidad y variedad estructural de las diferentes clases de compuestos
fenólicos naturales, se utilizan diferentes ensayos de coloración para su reconocimiento
preliminar en muestras biológicas. El ensayo más utilizado es el del cloruro férrico. En este
ensayo una solución acuosa o alcohólica de una muestra vegetal, se hace reaccionar con una
solución de cloruro férrico acuoso o alcohólico, en concentración del 1%. Los compuestos
fenólicos tienden a formar complejos de diferentes colores con el catión Fe+3, la formación
de color o precipitados oscuros es aceptada como un resultado positivo sobre la presencia
de compuestos fenólicos. No obstante, hay compuestos fenólicos de baja polaridad que no
dan resultado positivo con este ensayo, por lo que se requiere otro tipo de análisis diferente.
OHFe+3
O
FeO
O
Comp. fenólico
Complejo fenol-Fe (coloreado)
Figura 1.14. Reacción de formación de complejos coloreados de un compuesto fenólico con una sal de hierro III.
Ensayo de reconocimiento de flavonoides
Dentro de la gran cantidad de compuestos fenólicos, los flavonoides representan un grupo
importante de sustancias con propiedades antioxidantes. Los flavonoides que contienen en
su estructura un sistema anular γ-benzopirona (también denominado croman-4-ona),
reaccionan con iones Mg+2 y ácido, para formar complejos coloreados de color rojo o violeta.
Por tanto, la formación de coloraciones rojo o violeta, es considerada un resultado positivo
que permite inferir la presencia de flavonoides en la muestra analizada. A este ensayo se le
conoce como ensayo de Shinoda, entre otros. Es importante mencionar que algunas clases
de flavonoides como las chalconas y las catequinas, no dan resultado positivo con este
ensayo.
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O
O
Sistema benzopirona
Adicionalmente, los compuestos fenólicos se pueden observar fácilmente en los análisis por
cromatografía en capa fina, pues bajo la luz ultravioleta de 254 nm, presentan absorción de
dicha radiación, lo que permite visualizarlos fácilmente y detectarlos en las muestras
biológicas.
Ensayos de reconocimiento para terpenoides
Los terpenoides comprenden una gran cantidad de sustancias naturales con estructuras
desde las más simples (monoterpenos y sesquiterpenos) hasta otras de gran complejidad
estructural (esteroides, triterpenoides, etc.). La mayoría de estas sustancias contienen
grupos funcionales tales como enlaces dobles carbono-carbono, hidroxilos alcohólicos,
puentes de éter, grupos carboxilos, grupos éster. Con la excepción del carboxilo, los demás
grupos funcionales son relativamente poco reactivos para detectarlos mediante ensayos
químicos rápidos y confiables. Además, generalmente no poseen grupos cromóforos, que
permitan detectarlos con luz ultravioleta de 254 nm. Sin embargo, se pueden reconocer
cuando las muestras se extraen con solventes de mediana o baja polaridad (en el caso de las
agliconas), al analizarlos por cromatografía en capa fina, revelando las placas
cromatográficas con varios reactivos que contienen ácido sulfúrico y calentamiento. El ácido
sulfúrico reacciona con muchos terpenoides produciendo manchas coloreadas de color
pardo, rojo o violeta.
Los terpenoides que contienen en su estructura enlaces dobles carbono-carbono
conjugados, se pueden reconocer mediante el ensayo de Liebermann-Burchard. En este
ensayo, a una solución anhidra obtenida de la muestra vegetal, se le agrega en su orden
anhídrido acético y una gota de ácido sulfúrico concentrado. La prueba se considera positiva,
si se forman coloraciones verdes, azules, rojas, violetas, entre otras. Algunos terpenoides
como el colesterol que no poseen en su estructura estos enlaces dobles conjugados dan
resultado positivo debido a que pueden formar estos dienos conjugados durante la reacción,
por deshidratación.
Los terpenoides que contienen en su estructura sistemas cíclicos tipo lactona α,β-insaturada,
producen coloraciones violáceas con varios reactivos nitroaromáticos en medio alcalino. Se
utilizan varios reactivos como son el reactivo de Kedde (m-dinitrobenceno), el de Raymond
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(ácido m-dinitrobenzoico) y el nitroprusiato de sodio. Producen resultado positivo sustancias
tales como terpénlactonas, los cardiotónicos (también denominados cardenólidos) y
acetogeninas con anillos lactónicos α,β-insaturados.
Adicionalmente, los terpenoides de bajo peso molecular están presentes en los aceites
esenciales de muchas plantas, por lo cual son reconocidos preliminarmente por su aroma
agradable, especialmente los monoterpenos y los sesquiterpenos.
Las saponinas terpenoides, tienen la capacidad de disminuir la tensión superficial de sus
soluciones acuosas, y se pueden reconocer por la formación de espuma estable, al agitar una
solución acuosa de la muestra, aunque algunas proteínas de bajo peso molecular también
pueden producir un resultado similar.
La figura 1.15. presenta un esquema propuesto de marcha fitoquímica simplificada, que
puede ser útil en el análisis preliminar de diferentes metabolitos secundarios y que ayuda a
inferir su presencia en muestras biológicas. La muestra seca y molida se extrae inicialmente
con un solvente de baja polaridad como es el acetato de etilo (abreviado: AcOEt), con el cual
se extraen metabolitos de baja polaridad como son muchas agliconas o formas libres de
diferentes clases de metabolitos. Luego el residuo se extrae con etanol (abreviado: EtOH),
para extraer metabolitos secundarios de mayor polaridad, y finalmente se extrae con agua,
en el cual son solubles compuestos tales como diferentes clases de glicósidos y sustancias
como polisacáridos. Los alcaloides se extraen a partir de una muestra separada, realizando
una extracción directa con HCl al 5%, teniendo en cuenta que la mayoría de alcaloides forman
sales con ácidos diluidos. Con este procedimiento es posible inferir la presencia de
metabolitos tales como compuestos fenólicos, terpenoides, alcaloides, flavonoides, lactonas,
polisacáridos, saponinas, etc.
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Figura 1.15. Esquema propuesto para una marcha fitoquímica simplificada.
La interpretación de los resultados obtenidos se realiza de la siguiente manera:
En el filtrado 1 concentrado, al analizar primero por CCF se puede observar:
A simple vista manchas amarillas de Rf alto probablemente corresponden a compuestos tales
como carotenoides. Si hay manchas de color verde pueden deberse a la presencia de
clorofilas.
A 254 nm se observan compuestos con anillos aromáticos y otros grupos cromóforos como
sistemas dieno conjugados, en este caso de poca polaridad debido al solvente extractor.
A 365 nm pueden observarse como manchas de fluorescencia rosada las clorofilas, y con
fluorescencia azul claro, compuestos como cumarinas.
Con el revelador Vainillina-ácido sulfúrico seguido de calentamiento a unos 110°C, se
observan manchas de diferentes tonalidades de rojo, violeta, azul, pardo, características de
muchos compuestos terpenoides en general. Con el revelador ácido sulfúrico y
calentamiento, se observan manchas rojizas para muchos terpenoides.
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El resto de extracto se evapora a sequedad, y se redisuelve en 5 ml de etanol. Con esta
solución se hacen ensayos para compuestos fenólicos, flavonoides y lactonas de mediana y
baja polaridad, especialmente agliconas.
El ensayo con el cloruro férrico diluido produce diversas coloraciones con compuestos
fenólicos.
El ensayo de Shinoda produce coloraciones hacia el rojo y el violeta con varias clases de
flavonoides.
El ensayo de lactonas se puede realizar con el reactivo de Kedde. La formación de
coloraciones violeta o azul permite inferir que la muestra contiene compuestos lactónicos,
que incluyen cardenólidos, sesquiterpénlactonas, etc.
En el filtrado 2, se realizan ensayos de precipitación para alcaloides. Se observan precipitados
cuando la muestra contiene alcaloides, aunque algunos residuos de proteínas y otras
sustancias pueden ser falsos positivos. También se puede ensayar el reconocimiento de
polisacáridos por precipitación con etanol.
En el filtrado 3:
Los metabolitos secundarios que no se solubilizaron en el acetato de etilo, pero que son de
mayor polaridad y solubles en etanol, se analizan en este filtrado. El ensayo con el cloruro
férrico produce diversas coloraciones con compuestos fenólicos.
El ensayo de Shinoda produce coloraciones hacia el rojo y el violeta con varias clases de
flavonoides.
Luego de realizar la CCF, el extracto se evapora a sequedad, se redisuelve en 5 ml de etanol
y se le realizan los ensayos para compuestos fenólicos, flavonoides y compuestos lactónicos.
En el filtrado 4, por su naturaleza de mayor polaridad, es posible detectar compuestos tipo
glicósidos y polisacáridos. En este caso un resultado positivo con el ensayo del cloruro férrico
permite inferir la presencia probable de compuestos fenólicos glicósidos. Un resultado
positivo para flavonoides permite inferir la presencia de glicósidos flavonoides, y un
resultado positivo para lactonas, permite inferir la presencia de compuestos que además de
contener anillos lactona, son glicósidos. Por otro lado, al agitar fuertemente en un tubo de
ensayo, un pequeño volumen del filtrado, si se observa formación de espuma estable, se
puede inferir la presencia probable de saponinas terpenoides. Los polisacáridos se precipitan
al agregar al menos un volumen de etanol.
Estas pruebas dan resultados positivos siempre y cuando los metabolitos analizados se
encuentren en concentraciones adecuadas en las muestras, ya que, si están en
concentraciones muy bajas, se pueden obtener resultados negativos, por esto muchos
autores los denominan ensayos o pruebas de inferencia, ya que permiten inferir, pero no
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descartar la presencia, o no, de diferentes metabolitos. En algunos casos se pueden también
obtener resultados falsos positivos, debido a la complejidad y cantidad de metabolitos
presentes en las muestras biológicas. Un ejemplo son las pruebas de precipitación de
alcaloides, y la prueba de la espuma para saponinas. En el primer caso, hay muchas
sustancias que no son alcaloides pero que también producen precipitados como algunas
lactonas. En el caso del ensayo de la espuma, además de las saponinas, las proteínas de bajo
peso molecular también pueden formar espuma en la solución acuosa.
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66
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Capítulo 2
Metabolitos secundarios aromáticos
67
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Dentro de los metabolitos secundarios, los compuestos con anillos aromáticos constituyen
junto con los metabolitos no-aromáticos y los alcaloides, uno de los tres grandes grupos de
sustancias naturales, muchos de ellos con grupos hidroxilos fenólicos, por lo que muchos
autores los refieren como compuestos fenólicos, aunque estrictamente hablando, algunos
de ellos tengan anillos aromáticos, pero no hidroxilos fenólicos. Un ejemplo de estos es la
podofilotoxina, un lignano. Estos metabolitos varían estructuralmente, desde moléculas
pequeñas con un solo anillo aromático, hasta estructuras con muchos anillos aromáticos,
como varios polímeros fenólicos de alto peso molecular.
A continuación, se presentan diferentes aspectos que incluyen aspectos biogenéticos de
sustancias derivadas del ácido shikímico; después se presentarán algunos aspectos
relevantes de dos clases de compuestos presentes en muchas drogas vegetales como son las
antraquinonas y los flavonoides.
Compuestos fenólicos derivados del ácido shikímico
La gran mayoría de estos metabolitos contienen una o varias unidades básicas, denominadas
fenilpropanos, que están constituidas por un anillo aromático ligado a una cadena de tres
átomos de carbono, en términos simplificados se refieren simplemente como compuestos
C6C3, donde C6 se refiere al anillo aromático y C3, a la cadena propanoide. Las figuras 2.1., 2.2
y 2.3 muestran la estructura básica de estos y otros metabolitos secundarios aromáticos, con
algunos ejemplos representativos.
68
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Figura 2.1. Ejemplos estructurales de algunos compuestos C6, C6C1, y C6C3. Nótese los sustituyentes oxigenados sobre el anillo aromático con patrones de sustitución orto y di-orto, característicos de derivados del ácido shikímico.
69
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Figura 2.2. Ejemplos estructurales de algunos compuestos C6C3, y (C6C3)2
70
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Figura 2.3. Ejemplos estructurales de algunos compuestos aromáticos derivados de la acetilcoenzima-A y del ácido shikímico. La cumarina umbeliferona es derivada del ácido shikímico. La antraquinona emodina es derivada de la acetilcoenzima-A (anillo aromático meta-dioxigenado), y el flavonoide quercetina, es derivado de las dos rutas metabólicas secundarias (metabolismo mixto). Nótese que el anillo aromático de la izquierda es meta-dioxigenado y el de la derecha es orto-dioxigenado.
Umbeliferona (una cumarina)
Emodina (una antraquinona)
Quercetina (un flavonoide)
71
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Desde el punto de vista de su origen biológico, estos compuestos son biosintetizados por los
organismos que los producen, mediante rutas biosintéticas que incluyen la del ácido
shikímico, la de la acetil coenzima-A, o la combinación de estas (metabolismo mixto) (1-3). A
continuación, se tratará del caso de los compuestos originados a través del ácido shikímico,
enfatizando en su ruta de biogénesis, y con algunos ejemplos representativos de los
principales grupos de compuestos.
El ácido shikímico se aisló inicialmente de la planta asiática Illicium sp. (Fam. Iliciáceas) y es
reconocido como un compuesto que es el punto de partida para un vasto número de
compuestos naturales de muchas clases. Su existencia como un discreto constituyente
vegetal ha sido observada ampliamente solo a finales del siglo XX, pero no hay duda de que
es un metabolito universal de las plantas superiores y de muchas clases de organismos no
mamíferos. El ácido shikímico se extrae comercialmente a partir del anís estrellado Illicium
verum y es precursor industrial para la obtención del medicamento antiviral Tamiflu®.
E1 ácido shikímico es el precursor de la mayoría de constituyentes vegetales que contienen
anillos aromáticos diferentes de los formados en la ruta del acetato-malonato. En muchos
casos puede observarse un patrón estructural claro que permite reconocer los compuestos
derivados del ácido shikímico. Este es el patrón de oxigenación del anillo aromático. En com-
puestos derivados de la ruta del Acetato-Malonato los grupos oxigenados generalmente
están en disposición meta entre sí, o sea que los polifenoles son derivados tipo resorcinol.
En compuestos aromáticos derivados del ácido shikímico, los patrones de oxigenación son
generalmente tipo catecol (orto) o pirogalol (di-orto), y así por ejemplo los fenoles mono
oxigenados de orígen shikímico son generalmente p-hidroxi-compuestos.
La formación del ácido shikímico ocurre a partir de precursores de 3 y 4 átomos de carbono
como son el ácido fosfoenol-pirúvico (PEP) y la eritrosa-4-fosfato (E4P) a través de una serie
de etapas que se resumen en la Figura 2.4. El precursor inmediato es el ácido quínico.
72
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Figura 2.4. Biogénesis del ácido shikímico a partir de PEP y 4EP.
Biogénesis de fenilalanina y tirosina
La reacción posterior del ácido shikímico con PEP seguida de las transformaciones que se
muestran en el esquema de la Figura 2.5a, llevan por la vía del ácido corísmico intermedio al
ácido prefénico. La deshidratación, descarboxilación y transaminación del ácido prefénico,
llevan al ácido fenilpirúvico y al aminoácido fenilalanina (Figura 2.5b). La deshidrogenación,
descarboxilación y transaminación del ácido prefénico, llevan al aminoácido aromático
tirosina. Ambos aminoácidos fenilalanina y tirosina, son punto de partida para diversos
metabolitos.
73
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Figura 2.5a. Esquema biogenético para mostrar el origen del ácido corísmico y prefénico, a partir del ácido shikímico.
74
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HOOC
COOH
OH
OHOOC
COOH
O
O
-2H
COOH
O
COOH
NH2
Fenilalanina
Transaminación
COOH
O
OH
-CO2
Arom.
COOH
OH
NH2
Transaminación
Tirosina
-CO2
Arom.Reduc.
Figura 2.5b. Esquema biogenético que explica el origen de los aminoácidos aromáticos fenilalanina y
tirosina a partir del ácido prefénico.
75
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E1 ácido corísmico es el precursor inmediato no solo de1 ácido prefénico sino también del
ácido antranílico y se aisló inicialmente de una cadena mutante de Aerobacter aerogenes.
El ácido prefénico, el ácido fenilpirúvico y el p-hidroxifenilpirúvico son los precursores de
fenilalanina y tirosina. La fenilalanina es un constituyente universal de proteínas y es
precursor de una extensa clase de alcaloides y además es punto de partida para la secuencia
biosintética que lleva a los llamados compuestos C6C3.
La ruta principal para la producción de los ácidos cinámico y p-cumárico a partir de
fenilalanina o tirosina respectivamente, se explica mediante la remoción de amoníaco de la
fenilalanina o tirosina. La figura 2.6 esquematiza el proceso. La fenilalanina-amonia-liasa PAL,
elimina amoníaco y general doble enlace C=C para dar origen al ácido cinámico; mientras la
tirosina-amonia-liasa TAL, elimina amoníaco y genera el enlace C=C que da origen al ácido p-
cumárico.
R
COOH
NH2R
COOH
PALóTAL
-NH3
R = H, fenilalaninaR = OH, tirosina
R = H, ácido cinámicoR = OH, ácido p-cumárico
Figura 2.6. Esquema biogenético que explica la desaminación de los aminoácidos para dar origen a los denominados ácidos cinámicos. PAL corresponde a la sigla inglesa de Phenylalanine Ammonia Lyase, y TAL a Tyrosine Ammonia Lyase.
Las evidencias experimentales muestran que la enzima fenilalanina-amonialiasa (PAL) se
encuentra ampliamente distribuida en los vegetales, mientras que la tirosina-amonialiasa
(TAL) se encuentra principalmente en ciertas gramíneas. Estas enzimas son esteroespecíficas
ya que son capaces de desaminar los L-aminoácidos pero no los D-aminoácidos. Los ácidos
cinámicos proporcionados por acción de los amonialiasas constituyen el punto de partida
para una cantidad enorme de procesos metabólicos secundarios.
76
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Biogénesis de compuestos C6
Relativamente pocos compuestos con solo 6 átomos de carbono en un anillo bencénico han
sido aislados de la naturaleza. Los más comunes son la arbutina (el -D-glucopiranósido de
la hidroquinona) y su éter metílico. La arbutina es derivada de la ruta del ácido
shikímico→fenilalanina. Esto se comprobó por experimentos en los cuales se administró
fenilalanina, ácido cinámico, tirosina y ácido shikímico marcados con 14C a hojas de Pyrus
communis (Pera, familia rosáceas. Estos experimentos demostraron que la arbutina era
originada a partir de estos precursores ya que efectivamente se aisló arbutina radiactiva.
Estos resultados y la posterior demostración experimental de la formación de arbutina a
partir de fenilalanina marcada en Grenvillea robusta (Fam. proteáceas) confirmaron este
hallazgo. Esta biogénesis se esquematiza en la Figura 2.7.
COOH
OH
OH
HO
COOH
OH
-CO2
OH
OH
oxid.
Glucosilación
OH
OGlu
Arbutina
Figura 2.7. Biogénesis de arbutina.
77
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Biogénesis de compuestos C6C1
A partir de los ácidos cinámicos las plantas pueden generar compuestos aromáticos C6C1,
formando inicialmente el éster de la coenzima A y e1 ácido cinámico (o p-cumárico), el cual
puede sufrir degradación de la cadena lateral de 3 átomos de carbono mediante un proceso
enzimático similar a la -oxidación de los ácidos grasos. El esquema de este proceso es e1
descrito en la Figura 2.8.
COOH
R
COOH
OH
OHHO
Acido shikímico
R
COOH
OH
H
H2O
R
COOH
O
H
- 2H
R
OH
O
Compuestos C6C1
Figura 2.8. Esquema para la biogénesis de compuestos C6C1
El derivado ácido benzoico así originado puede ser descarboxilado para generar compuestos
C6, o sufrir una o varias etapas de hidrogenación para generar derivados tipo benzaldehído,
alcohol bencílico y compuestos tipo tolueno (Figura 2.9.).
78
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R
COOH
OH
OH
HO
COOH
R
CHO- 2H
R
CH2OH
- 2H
R
CH3
- 2H
Figura 2.9. Esquema biogenético que explica el origen de compuestos C6C1 con diferente grado de oxidación (R puede ser H u OH, dependiendo del aminoácido precursor).
La Figura 2.10 muestra algunos ejemplos de compuestos naturales C6 y C6C1.
79
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OH
COOH
OH
COOH
OMeOH
COOH
OMeMeO
COOH
OH
OH
COOH
OH
OH
COOH
OHHO
Acido p-hidroxibenzoico Acido vanílico Acido siríngico
Acido salicílico Acido protocatécuico Acido gálico
Figura 2.10. Estructuras de varios compuestos naturales C6 y C6C1
Biogénesis de compuestos C6C2
Muchos derivados feniletilamina (considerados por algunos autores como protoalcaloides)
se derivan de la fenilalanina y la tirosina, presumiblemente por una descarboxilación del
aminoácido, seguida (o precedida) por modificaciones simples tales como N-metilación (por
metionina) y oxidación.
Una clase de compuestos C6C2 que provienen de compuestos C6C3 por el proceso de -
oxidación seguido de descarboxilación del resultante -cetoácido, son derivados tipo
acetofenona, de los cuales son ejemplos típicos: pungenósido, piceína y androsina.
Biogénesis de compuestos C6C3 (Fenilpropanoides)
La importancia fundamental de la secuencia de reacciones ácido shikímico → ácido prefénico
→ fenilalanina (o tirosina) → ácidos cinámicos, y la amplia distribución natural de los ácidos
cinámicos y sus productos de biodegradación, lleva a la conclusión de que muchos compues-
tos naturales que contienen cadenas laterales de 3 átomos de carbono ligados a núcleos
fenólicos, son productos de reducciones biológicas de los ácidos cinámicos. La naturaleza
ofrece muchos ejemplos de casi todos los niveles de oxidación de la cadena lateral de estos
compuestos.
80
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Una característica estructural general en este tipo de sustancias es la presencia frecuente de
funciones oxigenadas en posiciones 4 y 3, 4 (Figura 2.11).
Es interesante anotar también que en ciertos casos los isómeros alil y propenil se encuentran
juntos en algunas plantas. Por ejemplo, el safrol y el isosafrol se encuentran juntos en
Cananga odorata (Fam. annonáceas), y la miristicina junto con la isomiristicina se encuentran
juntas en Myristica fragrans (Fam. miristicáceas).
Biogénesis de compuestos (C6C3)2 (Lignanos) y (C6C3)n Ligninas
Los lignanos y la lignina son una clase de compuestos fenilpropanoides ampliamente
distribuidos en la naturaleza cuyas estructuras sustentan la visión de que se forman por
dimerización oxidativa o polimerización de unidades C6C3. En la figura 2.12 se dan las
estructuras de algunos ejemplos típicos de lignanos naturales La figura 2.13, explica el
mecanismo probable de formación de un núcleo característico de lignanos, mediante u8n
acoplamiento oxidativo de fenoles. La figura 2.14 muestra una estructura parcial del
polímero lignina, característico de la madera de muchos árboles.
81
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O H
C H O
O M e
H O
O H
O M e
H OM eO
O M e
H O
O
O
O M e
G lu O
O H
O
O
M eO
O
O
M eO
O M e
O
O
M eO
O
O
A lco ho l
h id roc inam ílico A lcoh o l
con ife rílico
C inam aldeh íd o
O
E ug en o l Iso eu gen o l A n is-ce ton a
S afro l Iso safro l C on ife rin a
M iris tic in a Isom iris tic in a A p io l
Figura 2.11. Ejemplos estructurales de sustancias naturales C6C3 derivadas biogenéticamente del
ácido shikímico vía fenilalanina y tirosina.
82
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H O
M eO
O M e
O H
A cido guaiaré tico
O
O
O
O
O
O
H inok in ina
O
O
O M e
O H
H O
M eO
P ino resino l
O
O
M eO
H O
O M e
O H
C on idend rina
Figura 2.12. Ejemplos de estructuras químicas de lignanos naturales.
83
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HO
OH
O
O
-H
OH
HO
2
2'
Figura 2.13. Esquema de la formación de un lignano por acoplamiento oxidativo de dos unidades C6C3
84
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O
C H O
O H
O HO H
M eO
O
O
O M e
O
O H
H O
O
O
M eO
H O
etc .
Figura 2.14. Estructura parcial de la molécula de lignina, un polímero [C6C3]n
85
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Biogénesis de cumarinas
Las cumarinas son otra clase de compuestos C6C3 de los cuales una gran cantidad derivan
biogenéticamente del ácido shikímico. La Figura 2.15 muestra varios ejemplos de cumarinas
naturales originadas vía shikímico.
La biogénesis de las cumarinas simples derivadas de ácido shikímico se explica según el
esquema de la Figura 2.16.
Además de las cumarinas simples citadas antes, también se originan a partir del ácido
shikímico las llamadas cumarinas piránicas y furánicas. La biogénesis de estas cumarinas
relativamente complejas en su estructura, puede proceder vía una ciclización de una
cumarina simple previamente prenilada.
OH O O OM eO O OM eO O
U m b elife ro na L ern ie rina A escu le tin a
OG lu O O
M eO
OH O O
M eO
OH O O
M eO
O M eE sco po lin a F rax e tina
Iso frax id ina
OO O
M eO
O M e
O O
M eO
P u beru lin a
E sco p o le tin a-p ren ilé te r
OH O O
O H
D afn etina
Figura 2.15. Estructuras químicas de algunas cumarinas naturales.
86
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A cid o sh ik ím ico
C O O H
R
R = H , ác id o c in ám ico
R = O H , ác id o p -cu m árico
isom .
RO H
O
H O
o xid .
- H 2O
OR O
Figura 2.16. Esquema biogenético que explica la biogénesis de cumarinas simples.
87
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Antraquinonas y compuestos relacionados
Se denomina quinonas a las sustancias naturales que contienen un anillo de seis carbonos
con dos grupos carbonilo vecinales u opuestos; a las primeras se las denomina orto-quinonas
y a las segundas para-quinonas. Dentro de estas últimas se incluyen las antraquinonas, las
cuales presentan la estructura básica mostrada en la figura 2.17.
Figura 2.17. Núcleo básico de las antraquinonas con enumeración utilizada para propósitos de nomenclatura.
Las antraquinonas son una clase de metabolitos secundarios con una funcionalidad p-
quinoide en un núcleo antracénico. La figura 2.18. muestra las estructuras de varias
antraquinonas naturales como fisción, emodina, rheína, y otros compuestos químicamente
relacionados.
88
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O
O
OHOH
R2 R1
R1 R2 Compuesto
CH3 OH Rheum-Emodina
CH3 OCH3 Fisción
CH3 H Crisofanol
CH2OH H Aloé-emodina
COOH H Rheína
O
O
OHOR
R1O CH3
R R1 Compuesto
Glucosil Ramnosil Glucofrangulina-A
Glucosil Apiosil Glucofrangulina-B
H Ramnosil Frangulina-A
H Apiosil Frangulina-B
O OHOH
CH2OR
O
HH
HO
CH2OH
HOHO
10
O OHOH
CH2OR
OHO
CH2OH
HOHO
H
10
Aloína-A
Aloinósido-A
Aloína-B
Aloinósido-B
R Compuesto
H Aloínas A y B
Ramnosil Aloinósidos A y B
89
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Figura 2.18. Estructuras de varios compuestos antracénicos naturales.
Nomenclatura
A estos productos naturales se les denomina comúnmente con nombres vulgares con la
terminación "ina" en el caso de las agliconas, u "ósido" en el caso de los glicósidos.
Para una nomenclatura sistemática sencilla de estas sustancias se debe asignar la
terminación antraquinona, precedida de los correspondientes sustituyentes, y siguiendo la
enumeración dada en la figura 2.16. A manera de ejemplo, el nombre sistemático para la
endocrocina (Figura 2.19) será: 4,5,7-trihidroxi-3-carboxi-2-metilantraquinona.
90
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COOH
O
O
OHOH
HO
Figura 2.19. Estructura química de la antraquinona natural endocrocina.
En el caso de los glicósidos, como en el caso de la glucofrangulina-A, el nombre sistemático
será: 4-hidroxi-5-O-glucosil-7-O-ramnosil-2-metilantraquinona.
Clasificación
Los compuestos antracénicos vegetales pueden clasificarse según su estado de oxidación en
siete grupos estructurales:
a. Antraquinonas
b. Antronas
c. Diantronas
d. Antranoles
e. Oxantronas
f. Naftodiantronas
g. Antrahidroquinonas
La Figura 2.20 muestra las estructuras básicas de estas siete clases de compuestos
antracénicos. Puede observarse en el caso de las diantronas (dímeros de las antronas), que
el enlace que une las dos unidades básicas, es decir el enlace entre los carbonos 10 y 10',
genera la posibilidad de isómeros CIS y TRANS a través del mismo. Además, si las dos
unidades básicas son idénticas, se dice que son HOMODIANTRONAS (por ejemplo, las
senidinas A y B), mientras que, si son diferentes, se las llama HETERODIANTRONAS (por
ejemplo las senidinas C y D).
91
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Biogénesis
Las antraquinonas y demás compuestos antracénicos citados, son biosintetizados por la ruta
de la malonilCoenzima A en el caso de los hongos, líquenes y plantas superiores de las
familias ramnáceas, poligonáceas y leguminosas; mientras que, en las rubiáceas, las
gesneriáceas, las escrofulariáceas, las verbenáceas y las bignoniáceas, se biosintetizan a
partir de ácido shikímico y ácido mevalónico.
Biogénesis vía MalonilCoA
En este proceso, una molécula de AcetilCoA se condensa sucesivamente con 7 moléculas de
MalonilCoA para producir una cadena policetídica de 16 carbonos u octacétido. Luego, el
octacétido se pliega de la manera mostrada en la figura 2.21, y se cicliza por condensaciones
entre los grupos metilenos y sus vecinos carbonilos para dar el triciclo cetónico. Este
intermedio enoliza para generar el núcleo de las antronas. El núcleo de las antronas puede
dimerizarse enzimáticamente para producir diantronas, o puede oxidarse para dar
antranoles y/o antraquinonas.
92
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Figura 2.20. Núcleos básicos de compuestos antracénicos.
O OH
O
O
ANTRONAS ANTRANOLES
ANTRAQUINONAS
O
OH
OXANTRONAS
OH
OH
ANTRAHIDROQUINONAS
O
O
DIANTRONAS
O
O
NAFTODIANTRONAS
93
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Figura 2.21. Biogénesis de compuestos antracénicos vía MalonilCoA.
Biogénesis vía ácido shikímico + ácido mevalónico
La Figura 2.22 esquematiza el proceso de biogénesis de antraquinonas por combinación de
las rutas del ácido shikímico y la acetilCoA (a través de su derivado ácido mevalónico).
Inicialmente, una molécula de ácido shikímico se condensa con una molécula de ácido -
cetoglutárico (proveniente del ciclo de los ácidos cítricos). Posteriormente, el anillo del ácido
shikímico es deshidratado y aromatizado. Luego, ocurre una condensación intramolecular
entre el carbonilo proveniente del ácido shikímico y el metileno al grupo carbonilo
proveniente del ácido -cetoglutárico, para formar el biciclo. Después, al biciclo se une una
cadena de 5 carbonos denominada isopentenilo (proveniente de AcetilCoA vía ácido
mevalónico). Esta cadena se cicliza al anterior anillo formado, y luego de procesos de
oxidación y aromatización se llega a las antraquinonas.
O
O
AcetilCoA + 7 MalonilCoA
SCoAOOO
O
O O O O
SCoA
O
O O O O
-3H2O
SCoA
OO OHOH
HO Enoliza
Dimeriza
O OHOH
HO
O
COOH
1. [O]
2. H+
Otros compuestosantracénicos
94
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Figura 2.22. Biogénesis de compuestos antracénicos vía ácido shikímico y AcetilCoA.
Distribución y estado natural
Las antraquinonas están ampliamente distribuidas en plantas, y en menor proporción en
microorganismos (p. ej. hongos marinos), equinodermos e insectos.
En las plantas se conocen unas 200 antraquinonas. Las familias vegetales que contienen
compuestos antracénicos incluyen las rubiáceas, las ramnáceas, las fabáceas,
xantorroeáceas y las poligonáceas; y en una menor proporción las liliáceas, leguminosas,
bignoniáceas, melastomatáceas, droseráceas, vismiáceas, etc.
En las plantas inferiores como los líquenes se conoce una gran variedad de antraquinonas,
incluyendo antraquinonas halogenadas como p.ej. la 7-cloroemodina.
Estas sustancias pueden encontrarse en diferentes partes de la planta como hojas, tallos,
madera y frutos.
Se las encuentra principalmente en forma de glicósidos (por ejemplo, las senidinas y la
barbaloína), y en menor proporción en forma libre o agliconas (por ejemplo, alizarina y
crisofanol). También se han reportado compuestos antracénicos sulfatados. Se las pueda
encontrar también en forma dimérica.
HO
OH
HO
OH
O
OH
O
OH
-2H2O O
COOH
O
O COOH
OOH
HOO
-CO2
HOO
COOH
OH
OH
COOH
OOH
-H2O
OH
OOH
-CO2
OPP
OH
OOH
OH
OOH
OH
OOH
95
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Sin embargo, existen todavía dudas acerca del verdadero estado natural de estas sustancias,
pues existen evidencias experimentales de ciertas plantas, las cuales demuestran que las
antraquinonas no se encuentran como tales en ellas, sino que son productos de degradación
enzimática de las correspondientes formas reducidas (es decir, las antronas y los antranoles).
Según esto, las antraquinonas aisladas corresponden a productos de oxidación o
dimerización de antronas o antranoles.
En el caso de las antraquinonas aisladas de organismos marinos tales como las anénomas de
mar, se tienen evidencias experimentales que estas sustancias son producidas por bacterias
asociadas que conviven con estos organismos marinos, como son los ejemplos de la
lupinacidina-A y la galvaquinona-B.
Hechos estructurales
Las antraquinonas naturales generalmente presentan las siguientes características
estructurales:
a. Tienen grupos OH en C-4 y C-5.
b. Generalmente contienen un grupo metilo, hidroximetileno o carboxilo sobre el carbono 2.
c. Las antraquinonas originadas por la vía de la malonilcoenzima-A generalmente contienen
un grupo OH u OMe en los carbonos C-5 y C-7. Las originadas por la vía del ácido shikímico
tienen sustituyente oxigenado en C-5.
d. Los carbohidratos ligados son principalmente glucosa, ramnosa y rutinosa.
e. Los O-glicósidos tienen los carbohidratos ligados a través de C-5 o C-7.
Métodos de extracción y aislamiento
Los procedimientos para el aislamiento de estas sustancias dependen del tipo de núcleo de
interés, es decir si se desea obtener las agliconas, los glicósidos, las formas reducidas, las
formas oxidadas, etc. Para aislar efectivamente las agliconas, la muestra vegetal se extrae
con solventes poco polares como acetato de etilo. Los compuestos glicosídicos se extraen ya
sea con etanol, agua o mezclas de etanol-agua. Cuando se desee extraer las formas
reducidas, debe tenerse precaución especial, ya que la sola presencia del oxígeno del aire
produce la oxidación, en este sentido es aconsejable trabajar en atmósferas inertes como,
por ejemplo, una atmósfera de nitrógeno. El proceso de oxidación es también bastante
rápido en soluciones alcalinas, y en estas condiciones se forman diantronas, poliantronas y
por supuesto antraquinonas.
En cuanto se refiere al método de extracción, el uso de ultrasonido y microondas, son los de
mejores resultados en cuanto a tiempos de extracción, facilidad de uso, y efectos contra el
medio ambiente.
96
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Luego de la extracción, los glicósidos deben concentrarse bajo presión reducida para obtener
los cristales crudos. Estos cristales pueden purificarse por recristalizaciones sucesivas en
mezclas acetona-agua. Los O-glicósidos se hidrolizan fácilmente al calentarlos con ácido
acético o clorhídrico alcohólico diluido (por ejemplo, al 5%). La hidrólisis ocurre en una hora
calentando a 70°C. Luego de la hidrólisis se añade una mezcla 1:1 de acetato de etilo-etanol,
y se diluye con HCl al 0.5% acuoso. La capa orgánica que contiene las agliconas, se separa.
Las agliconas obtenidas ya sea por hidrólisis o por extracción directa de la planta, pueden
purificarse por extracción de la fase acetato de etilo con un álcali diluido, seguido de
precipitación con un ácido (las agliconas con grupos -COOH libres pueden extraerse desde la
fase acetato de etilo haciendo una primera extracción con una solución de bicarbonato de
sodio, y una segunda extracción con solución de KOH o NaOH, para remover las sustancias
menos ácidas). Este precipitado crudo se cristaliza desde acetato de etilo o alcohol.
La cromatografía en capa fina con sílica gel G y varios eluentes, ha sido una técnica muy útil
especialmente en la valoración de drogas vegetales con compuestos antracénicos, tanto en
su variante normal, como de alta resolución. Se cuenta con excelentes referencias de
sistemas cromatográficos a utilizar para el caso de las drogas vegetales más usadas, siendo
las cromatoplacas de sílica gel y el eluente acetato de etilo/metanol/agua 100/13.5/10, el
más utilizado.
Cuando se desea aislar las antraquinonas, la mejor técnica es la cromatografía en
contracorriente con fases móviles como diferentes mezclas de hexano/acetato de
etilo/alcohol/agua, combinando también esta técnica con HPLC en fase reversa con
detectores como el de arreglo de diodos DAD, o con espectrómetros de masas. Aunque
también se ha reportado el uso de otras técnicas como la electroforesis capilar, con buenos
resultados.
Las antraquinonas se pueden detectar sobre las placas cromatográficas por sus colores
visibles y bajo luz Ultravioleta. Al rociar las placas con KOH al 10% metanólico, los colores
amarillos y pardos originales cambian a rojos, violetas, verdes o púrpuras. El reactivo de
Borntrager, es muy útil para reconocer las antraquinonas hidroxiladas, y consiste en una
solución de NaOH/KOH al 5% en metanol, que produce manchas de colores que varían entre
el naranja, hasta el rojo y el púrpura. Los valores Rf de algunas antraquinonas naturales se
presentan en la Tabla 1.
97
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Tabla 1. Valores Rf y máximos de absorción de algunas antraquinonas (eluente: acetato de etilo-
metanol-agua 100:13.5:10).
Valoración de antraquinonas y compuestos relacionados
Existen métodos fisico-químicos y biológicos para la valoración cuantitativa de compuestos
antracénicos naturales, especialmente para drogas que los contengan.
La muestra vegetal seca y pulverizada se extrae exhaustivamente con agua o una mezcla
etanol-agua. El filtrado se lava con un solvente orgánico apolar e inmiscible con el solvente
de extracción. La fase orgánica se desecha si no se van a cuantificar las agliconas. La fase
acuosa o acuo-etanólica se somete a los siguientes tratamientos por reflujo:
• Con cloruro férrico en medio ácido
• Con un ácido mineral
El tratamiento con el cloruro férrico en medio ácido tiene como fin romper las uniones C-
glicósido y ayudar a la oxidación de las formas reducidas hasta antraquinonas. El tratamiento
con un ácido mineral es con el fin de hidrolizar todos los glicósidos, y dejar libres las agliconas.
Luego de estos tratamientos, se recuperan las agliconas por extracción con un solvente
orgánico como el acetato de etilo. La fase acetato de etilo se separa y se elimina el solvente
por evaporación bajo presión reducida. Las agliconas se redisuelven en una solución estándar
de KOH o NaOH, y se lee colorimétricamente a 500 nm contra una curva patrón.
Cuando se desea hacer una cuantificación aproximada del contenido de antraquinonas en
muestras vegetales se utiliza la espectroscopia ultravioleta.
ANTRAQUINONA RfX100 MAXIMOS DE ABSORCION (nm)
Emodina 95 223, 254, 267, 290, 440
Crisofanol - 225, 258, 279, 288, 432
Fisción - 226, 255, 267, 288, 440
Aloé-emodina - 225, 258, 279, 289, 430
Reína 15-25 230, 260, 432
Ácido emódico - 227, 252, 274, 290, 444
98
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Ensayo de Bornträger
Las antraquinonas y sus formas reducidas pueden reconocerse en muestras vegetales a
través del denominado Ensayo de Bornträger.
En este ensayo, una porción del material vegetal se pone en ebullición con una solución de
KOH acuoso diluido, durante varios minutos. Este tratamiento no solo hidroliza los glicósidos
antracénicos, sino que también oxida las antronas y antranoles hasta antraquinonas. La
solución alcalina se deja enfriar, se acidifica y se extrae con acetato de etilo. Cuando la fase
orgánica se separa y se pone en contacto con una solución acuosa diluida de un álcali, la fase
orgánica pierde su color amarillo, y la fase acuosa se torna de color rojo si la muestra
contiene antraquinonas. El ensayo no es específico para las antraquinonas ya que las
naftoquinonas también dan coloraciones rojas. Si la muestra contiene antraquinonas
parcialmente reducidas, la solución original no se torna roja inmediatamente después de
hacerla alcalina, pero se torna de color amarillo con una fluorescencia verdosa, y poco a poco
se va tornando roja, a medida que ocurra la oxidación. Si se desea, la oxidación puede
acelerarse añadiendo un poco de peróxido de hidrógeno al 3% acuoso. La reacción
colorimétrica puede utilizarse también como base para la valoración cuantitativa de estas
sustancias en diferentes muestras. Es posible también reconocer con la ayuda de un
espectrofotómetro ultravioleta si la muestra contiene formas reducidas u oxidadas, ya que
las primeras absorben alrededor de 360 nm, mientras las segundas absorben alrededor de
440 nm. Por otro lado, las 1,4-dihidroxiantraquinonas pueden reconocerse porque al
disolverlas en solución de ácido acético presentan fluorescencia.
Ensayo con Acetato de Magnesio alcohólico
Al tratar las soluciones que contienen antraquinonas puras con una solución de acetato de
magnesio en alcohol, se producen coloraciones características dependiendo del patrón de
hidroxilación de la sustancia. Las quinonas meta-dihidroxiladas producen color amarillo
naranja, las para-hidroxiladas color púrpura, y las orto-hidroxiladas producen coloraciones
violetas.
Ensayo de reducción moderada
Las antraquinonas se reducen fácilmente en presencia de un metal y un ácido mineral,
perdiendo su coloración original; pero al dejar expuesto al aire el producto de reducción,
este se oxida por el oxígeno del aire y reaparece la coloración original.
Espectroscopia Ultravioleta
Las antraquinonas en general presentan en solución etanólica hasta cuatro bandas de
absorción entre 220 y 290 nm (=9000-3000), otra entre 300 y 350 nm (=3000-6000), y
99
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otra entre 400 y 500 nm (=2000-9000). La Tabla 1 muestra los máximos de absorción en el
Ultravioleta de varias antraquinonas conocidas.
La presencia de grupos hidroxilos en posiciones 1, 4, 5 y 8 del núcleo antraquinónico
(también denominados grupos hidroxilos peri), puede detectarse en el espectro UV, ya que
al añadir cloruro de aluminio en solución etanólica a la solución alcohólica de la
antraquinona, se observa un notable desplazamiento bato crómico del espectro, el cual se
mantiene aún después de añadir un ácido mineral. El desplazamiento bato crómico es debido
a la formación de un quelato estable tal como se ilustra en la Figura 2.23.
Espectroscopia Infrarrojo
El espectro infrarrojo de las antraquinonas muestra bandas de absorción en 1695-1650 y
1640-1595 cm-1, debidas al grupo dicarbonilo ,ß-insaturado. En el caso de los grupos
carbonilos vecinos a hidroxilos peri (en 1, 4, 5 u 8), estos absorben alrededor de 1630 cm-1,
mientras los grupos carbonilos no vecinos a hidroxilos peri absorben alrededor de 1660
cm-1.
O
O
H O
H O
O
O O
O
A l
O
C l
A l
C l C l
A lC l3
O
O O
H O
H O
A l
C l C l
H C l
Figura 2.23. Formación de quelatos con cloruro de aluminio, de grupos hidroxilo peri y orto-dihidroxilos de antraquinonas. Nótese como el quelato con los hidroxilos orto es inestable al agregar el ácido.
100
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Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear
En el espectro de resonancia magnética protónica de las antraquinonas libres, se observan
las señales características de protones aromáticos (6-8 ppm), alifáticos (MeO-Ar 3.8-4.1 ppm;
Me-Ar 2.2-2.5 ppm, etc.) y de grupos Ar-CH2-OH, Ar-COOH y Ar-CHO. Además, y en una forma
similar a lo que ocurre en el espectro UV con cloruro de aluminio, los protones de los grupos
hidroxilos en posiciones 1, 4, 5 y 8 (grupos hidroxilo peri), algunas veces se observan como
singletes en la región de 12 a 14 ppm, debido al efecto desprotector de los carbonilos.
Aquí es importante mencionar que para los protones hidroxílicos no siempre se observan sus
señales en el espectro RMN. El desplazamiento químico de estos protones hidroxílicos
permite reconocer la distribución en la molécula de otros sustituyentes tales como metoxilos
y metilos, de acuerdo con sus efectos los cuales pueden predecirse con las reglas empíricas
de Schripsema y Dagnino. Por ejemplo, para la antraquinona:
Para calcular el del hidroxilo-1:
Valor base: 13.14 (Tabla 2 del artículo de Schripsema-Dagnino, 1996; para antraquinonas
1,3-dihidroxi-2-metoxiladas) + 0.13 (Tabla 1 del mismo artículo, para cuando existe un OH en
5), entonces el valor calculado para el OH en 1 es 13.27
Y para calcular el del hidroxilo-5, simplemente se gira la molécula a:
O
O
O H
O M e
O H
O H
1
2
3
45
101
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De esta manera el OH en 5 se convierte en el OH en 1, y aplicando los valores de las tablas 1
y 2 del artículo de Schripsema-Dagnino para antraquinonas 1-hidroxiladas, pero sin
sustituyentes en 2, ni en 3 ni en 4:
Valor base: 12.69
+5-OH: 0.13
+6-OMe: 0.13
+7-OH: -0.09
Y el calculado para el OH-5 es 12.86 ppm.
En el espectro de RMN-13C se aprecian las señales de los carbonilos quinoides alrededor de
180 ppm (C=O no quelatados) y 185 ppm (C=O quelatados).
Los carbonos de metilos ligados a C aromáticos resuenan alrededor de 15-25 ppm, los de
metoxilos se observan alrededor de 55-65 ppm, los carbonos aromáticos protonados
alrededor de 100-135, los carbonos aromáticos hidroxilados y metoxilados alrededor de 140-
165 ppm.
Espectrometría de masas
Los espectros de masas de impacto electrónico de las agliconas antraquinónicas muestran
un ion molecular intenso. Además, se observan las pérdidas de una o dos moléculas de
monóxido de carbono (M-CO, M-2CO) acompañadas de la pérdida de un hidrógeno (M-COH,
M-2CO-H). En el caso de los espectros de masas ESI, por ejemplo, la alizarina (1,2-
dihidroxiantraquinona), muestra fragmentos similares, pero a partir del ión cuasimolecular
m/z 241, es decir se observan m/z 213 (M – CO) y m/z 185 (M – 2CO).
Los espectros de masas FAB además de proporcionar el peso molecular, permiten reconocer
también los carbohidratos ligados. También se utilizan los espectros de masas de ionización
O
O
O H
O H
M e O
H O1
2
3
45
6
7
102
Ir al índice
química (CIMS). Los espectros de masas ESI muestran iones cuasimoleculares como M-H+,
M-H+ y M+Na+.
Actividad biológica
Las antraquinonas se destacan por sus notables actividades biológicas: anticancerígena,
antiinflamatoria, diurética, antiartrítica, antifúngica, antibacteriana y antipalúdica. Estas
sustancias también tienen aplicaciones en química analítica y procesos industriales para la
producción de celulosa. Se pueden usar como colorantes, agroquímicos y prototipos para el
desarrollo de nuevas moléculas con actividades biológicas. Las drogas vegetales que
contienen antraquinonas poseen según la dosis acciones usos terapeúticos aceptados como
colagogos, laxantes o purgantes.
Las 4,5-dihidroxiantraquinonas son los principios activos de drogas laxantes como el sen, el
ruibarbo, la cáscara sagrada y la penca sábila.
Los compuestos antracénicos más activos son los O-glicósidos de diantronas y
antraquinonas, y los C-glicósidos de antronas con el grupo metileno C-10 libre. Para la acción
catártica se requiere que la antraquinona posea dos grupos hidroxilos en C-1 y C-8, un grupo
metilo, hidroximetileno o carboxilo en C-3, y un grupo hidroxilo o metoxilo en C-6.
Las geninas antracénicas se absorben en el intestino grueso a nivel del colon con efectos
irritantes e indeseables, mientras que los glicósidos por ser más polares se absorben menos.
Una vez que traspasan la pared intestinal estas sustancias excitan las terminaciones
nerviosas locales del Sistema nervioso autónomo, induciendo una acción neuroperistáltica.
Sin embargo, se han hecho estudios más recientes, y se tiene evidencia de actividades
hepatoprotectoras para fisción, aloé-emodina, xanthorina, crisofanol, etc.; anticancerígena
para nordamnacanthal, alizarina-1-metiléter, rubiadina, soranjidiol, morindone, etc.;
antimicrobiana y antimicótica; antivirales como el crisofanol y aloé-emodina; propiedades
antidiabéticas para crisofanol y emodina; y propiedades antioxidantes para emodina, fisción,
rheina y como fotosensibilizantes. También es importante mencionar que se están
obteniendo mediante síntesis química, algunos compuestos híbridos que contienen una
antraquinona y una chalcona, con actividad contra leucemia.
Algunas drogas vegetales que contienen antraquinonas y compuestos relacionados
Sen
Comercialmente se conocen el "Sen de Alejandría", el cual corresponde a la especie Cassia
senna (Leguminosae); el "Sen de Tinnevelly o de la India" el cual corresponde a Cassia
angustifolia (Leguminosae); y otras especies como C. acutifolia y C. obovata.
103
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La droga la constituyen las hojas y frutos secos.
El país de origen parece ser Arabia, y los principales productores son Sudán, India, Pakistán
y Egipto.
La droga muchas veces es falsificada o adulterada con otras especies de Cassia.
Los componentes de las hojas son glicósidos antraquinónicos, glicósidos de antronas, 2.5 a
5% de senósidos A, B, C y D. Además, aloé-emodina, reína y 2-naftalénglucósidos, y más
recientemente se han reportado las sustancias volátiles presentes. La farmacopea europea
Vol I. especifica que la droga debe contener no menos de un 2.5% de componentes
antracénicos, calculados como senósido B.
De los frutos existen dos drogas comerciales: El "sen de Alejandría" debe contener no menos
de 3.6% de compuestos antracénicos, según la farmacopea europea el "sen de Tinnevelly"
debe contener no menos de 2.5% de componentes antacénicos calculados como senósido
B. Los componentes principales son los glicósidos diantrónicos Senósidos A/B, aunque
también están presentes los senósidos C y D; mono- y diglicósidos de reína y emodina.
Estas drogas se utilizan como laxantes y purgantes, en forma de tisanas, polvos, extractos,
sales cálcicas de los senósidos A y B cristalizadas, etc. Sin embargo, se ha reportado que el
uso prolongado de esta droga conlleva a arritmia cardiaca. En el caso de mujeres
embarazadas, existen evidencias experimentales del uso seguro de esta droga para casos de
constipación.
La acción laxante de las 1,8-dihidroxiantraquinonas presentes en el sen depende del número
de moléculas de azúcar ligadas, siendo las agliconas prácticamente inactivas.
Es importante anotar que esta droga (y otras como Rheum, Aloe y Andira) presenta
genotoxicidad y carcinogenicidad potencial por lo cual se usa con restricciones en Alemania.
Actualmente se cuenta también con técnicas como RAPD (Ramdom Amplified Polymorphic
DNA), para verificar la autenticidad de esta droga.
Frángula (o Arraclán)
Esta droga la constituye la corteza desecada de Rhamnus frangula, Rhamnaceae, una planta
de origen europeo, y cuyos principales productores son la región balcánica y Rusia.
La falsificación más común de esta droga se hace con espino cerval Rhamnus catartica.
La droga contiene 5-10% de O-glicósidos de antraquinonas como los glucofrangulósidos A y
B, los frangulósidos (o frangulinas) A y B, emodin-diantrona, palmidina-C, palmidina-C-
monoramnósido, emodín-diantrona-monoramnósido, y emodín-8-O-ß-gentiobiósido.
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Esta droga se usa ampliamente en Europa como laxante en forma de tisanas, formas
galénicas, y para la extracción de las frangulinas y glucofrangulinas. Sin embargo, se reportan
evidencias de genotoxicidad, por lo cual los autores recomiendan su uso laxante con
precaución.
Cáscara sagrada
La droga la constituye la corteza desecada de Rhamnus purshiana, Ramnáceas. Es una planta
originaria de América, y cuyos principales productores son Oeste de Canadá y Estados
Unidos, y Kenia.
Normalmente, esta droga es falsificada con otras especies como R. alnifolia, R. crocea, R.
californica, R. fallax, etc.
La droga contiene 6-9% de derivados antracénicos (tanto O- como C-glicósidos), de los cuales
los principales son los cascarósidos A, B, C y D; barbaloína, crisaloína, emodín-oxantrona,
aloé-emodina, crisofanol, emodina; y las palmidinas A, B y C.
Esta droga es utilizada especialmente en países anglosajones como laxante en forma de
tisanas, formas galénicas, extractos titulados de cascarósidos (elíxires), extracto seco en
comprimidos. También es usada en veterinaria. El estudio del contenido de antraquinonas
en varias especies del género Rhamnus, muestra que además de sus propiedades
antioxidantes, tienen propiedades antimicrobianas; y que especies como R. alaternus y R.
fallax, presentan altos contenidos de crisofanol, fisción y emodina.
Ruibarbo
La droga la constituyen las raíces desecadas de Rheum palmatum, Poligonáceas. Es una
planta originaria de la China y producida principalmente en Asia.
La droga es falsificada con otras especies como R. rhaponticum, R. officinale, R. emodi, R.
webbianum, R. coreanum.
La composición de la droga es bastante compleja e incluye antraquinonas sin grupo carboxilo
(crisofanol, aloé-emodina, emodina y fisción) y sus heterósidos (p. ej. crisofaneína y
glucoaloé-emodina), antraquinonas con un grupo carboxilo (reína y glucoreína), antronas o
diantronas de crisofanol, emodina, aloé-emodina y fisción, glucósidos de reína (Senósidos A
y B) y sus oxalatos (Senósidos E y F), heterodiantronas: palmidinas A y B, crisofanol-antrona,
palmidina-C, reín-antrona (senidina C y senósido C), crisofanol-antrona (reidina B), fisción-
antrona (reidina C) y otras sustancias como oxalato de calcio, almidón, catequinas, etc.
Esta droga se la utiliza como amargo estomáquico, purgante o laxante ocasional. También se
ha reportado que el extracto acetónico presenta alguna acción contra el bitiligo. Sin
embargo, se reporta que el ruibarbo crudo puede causar diarrea severa y toxicidad renal y
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hepática, por lo cual en la medicina tradicional china se están usando diferentes procesos
para reducir estos efectos laterales.
Hay un ensayo cualitativo para reconocer esta droga. En este, se refluja varios minutos una
porción de la droga pulverizada con una solución acuosa de cloruro férrico en ácido
clorhídrico. Enseguida se hace partición con un solvente orgánico. La fase orgánica se pone
en contacto con una solución diluida de amoníaco, y esta toma color rosado a rojo cereza.
En el caso particular de R. officinale, esta droga es utilizada para el tratamiento de fiebres,
infecciones, como antiinflamatorio, y contra el cáncer en China, Japón y Corea.
Penca sábila (Acíbar, Aloe)
La droga la constituye el jugo desecado de las hojas de varias especies de Aloe (Familia
Liliáceas). Los principales productores son Sudáfrica (Aloe capensis, "Aloé del Cabo"), Kenia,
Curazao, Aruba, Bonaire (Aloe barbadensis).
Las falsificaciones son otras especies de Aloe.
Las farmacopeas describen varios tipos de Aloe ("Aloe del Cabo" y "Aloe de Curazao"), y como
drogas comerciales ("Aloes de Uganda, Kenia y de la India").
Comercialmente se encuentran las drogas denominadas "Extracto de Aloe", "Aloe
barbadenses", "Aloe capensis" y "Aloe perryi".
El "Extracto de aloe" contiene aloína (10-C-ß-glucopiranósido de Aloé-emodin-antrona)
principalmente como una mezcla de los esteroisómeros _- y ß-; aloinósidos A y B
(estereoisómeros de 11-_-L-ramnosilaloína); aloesinas A y B (denominadas "Aloé resina" y
sin acción purgante). La aglicona es la aloé-emodina, que tiene propiedades antiagregantes
de proteínas por lo que tiene potencial contra enfermedades como diabetes, y
enfermedades de Hungtinton y Alzheimer.
La droga "Aloé barbadensis" contiene no menos de un 28% de derivados hidroxiantracénicos
calculados como aloína incluyendo aloína y las aloesinas A y B.
La droga "Aloe capensis" contiene no menos de un 18% de derivados hidroxiantracénicos
calculados como aloína. El "Aloe del Cabo tipo A" proviene de la especie Aloe ferox MILLER,
y contiene aloína, aloinósidos A/B, y aloesinas A/B.
El "Aloe del Cabo tipo B" contiene solamente aloína y aloesinas A/B.
La droga "Aloe socotrina" proviene de la especie Aloe perryi BAKER, y contiene aprox. un 14%
de derivados hidroxiantracénicos calculados como aloína. Los componentes son aloína,
aloinósidos A/B y aloesinas A/B.
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Estas drogas se utilizan como purgantes y son componentes de la "tintura de Benjuí
compuesta" ("Bálsamo de Friari"). También se ha mencionado el uso del Aloe para el
tratamiento de heridas, quemaduras e infecciones.
Para el reconocimiento de estas drogas además de la cromatografía en capa fina, existen los
siguientes ensayos:
El aloe presenta diferentes actividades como anti cáncer, antioxidante, antimicrobiana,
antialérgica, antiinflamatoria, inmunomodulatoria, hepatoprotectora, anti ulcera y
antidiabética, sin embargo, los mecanismos por los cuales actúan sus componentes, aún se
desconocen. Además, se debe tener en cuenta sus efectos tóxicos, los cuales también son
tema de investigación.
Hierba de San Juan
Esta droga corresponde a Hypericum perforatum (Hypericaceae), contiene naftodiantronas
(sin acción purgante): hipericina, isohipericina y protohipericina. Además, los flavonoides
rutina e hiperósido, y ácido clorogénico. Se menciona su uso para el tratamiento de heridas,
contra la depresión inclusive contra el sida. Se han reportado interacciones con
medicamentos como anticonceptivos orales, y el posible desarrollo del denominado
síndrome serotoninérgico.
Cochinilla hembra
El "Carmín" es un preparado comercial que contiene aprox. 50% de ácido carmínico. Este se
obtiene de la hembra de la cochinilla, el insecto Coccus cacti (Dactylopius coccus), del orden
de los hemípteros, originario de América Central. Los principales productores son Perú, Islas
Canarias, Argelia y Honduras.
El "Carmín" es un material de color rojo que contiene 10% de ácido C-glucosilcarmínico, y el
cual es falsificado o adulterado con otros materiales coloreados orgánicos e inorgánicos.
El "Carmín" se utiliza como agente colorante de sólidos y líquidos, y como indicador, aunque
como colorante ha sido poco a poco reemplazado por otros colorantes sintéticos. También
ha mostrado propiedades antimicrobianas y antitumorales.
La valoración de la droga se hace colorimétricamente a 530 nm y a un pH de 8.
Además del carmín se han aislado otras antraquinonas como el ácido 4-aminocarmínico de
este insecto.
Naftoquinonas
Las naftoquinonas, a diferencia de las antraquinonas, han sido menos estudiadas
químicamente debido a que solo se han aislado en años recientes. Los métodos utilizados
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para su aislamiento, reconocimiento y caracterización son prácticamente los mismos de las
antraquinonas. Al igual que las antraquinonas pueden biosintetizarse bien sea por la ruta de
la malonilCoA o por la ruta del ácido shikímico conjugada con la del ácido mevalónico. Se las
ha encontrado en diferentes partes vegetales (especialmente corteza de tallos y raíces) de
plantas pertenecientes a las familias litráceas, bignoniáceas, melastomatáceas,
boragináceas, droseráceas, juglandáceas, plumbagináceas, poligonáceas, ebenáceas, etc. En
esta última familia se las encuentra en forma dimérica.
Por otro lado, las características espectrales de las naftoquinonas son similares a las de las
antraquinonas, aunque a diferencia de estas pueden observarse acoplamientos alílicos entre
protones de un carbono ligado al carbono 2, y el protón ligado al carbono 3 (y viceversa), con
constantes de acoplamiento de 1.5 a 3 Hz en el espectro RMN-1H. En el espectro de masas
de impacto electrónico también se observan fragmentos debidos a pérdidas de una o dos
moléculas de CO, entre otros. Se han reportado procedimientos para la síntesis del núcleo
naftoquinona. Varias de estas sustancias presentan actividad biológica, entre otras algunas
tienen actividad antimalárica, antipsoriática, antitumoral y contra la lepra. En particular se
han preparado diferentes derivados con actividad potencial contra glioblastomas.
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Problemas
1. De las raíces de Cassia singueana, fabáceas; se aisló por métodos cromatográficos
una sustancia denominada islandicina que presenta las siguientes características
espectrales:
RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ 13.51 (s, 1H), 12.35 (s, 1H), 12.30 (s, 1H), 7.91 (dd, J = 1.2, 8.0,
1H), 7.73 (t, J = 8.0, 1H), 7.33 (dd, J = 1.2, 8.0, 1H), 7.18 (s, 1H), 2.40 (s, 3H).
RMn-13C (100 MHz, CDCl3): δ 190.4, 186.3, 162.5, 157.8, 157.7, 141.8, 136.6, 129.0, 124.5,
119.3, 116.5, 111.6, 110.8, 110.6, 16.5.
Determine la estructura más probable para esta sustancia y compare los datos RMN con los
calculados con el software en línea nmrdb.org
2. De las raíces de Cassia singueana, fabáceas; se aisló por métodos cromatográficos
una sustancia denominada xanthorina que presenta las siguientes características
espectrales:
RMN-1H (400 MHz, CDCl3): δ 13.61 (s, 1H), 12.83 (s, 1H), 12.32 (s, 1H), 7.71 (bs, 1H), 7.12 (bs,
1H), 6.70 (s, 1H), 4.03 (s, 3H), 2.50 (s, 3H).
RMn-13C (100 MHz, CDCl3): δ 187.4, 186.1, 162.6, 160.2, 157.0, 149.7, 147.1, 132.1, 124.6,
118.8, 113.5, 111.8, 106.3, 104.9, 56.1, 21.1.
Determine la estructura más probable para esta sustancia. Calcule los desplazamientos
químicos de las señales de los protones de los hidroxilos peri, utilizando las reglas de
Schripsema-Danigno. Compare los datos RMN con los calculados con el software en línea
nmrdb.org
3. De Streptocarpus dunni, familia gesneriáceas; se aisló por métodos cromatográficos
una sustancia que cristaliza en agujas amarillas de P.F. 183-4°C y con las siguientes
características espectrales:
UV (MeOH): 226(4.24), 247(4.40), 254(4.42), 279(4.02), 325(3.43), 408(3.74) nm
IR (KBr): 1660, 1625, 1580 cm-1, etc.
RMN-1H: 2.37δ (s, 3H), 7.51 (d, J = 8Hz, 1H), 7.74 (d, J = 8 Hz, 1H), 7.73-7.86 (m, 2H), 8.20-
8.35 (m, 2H), 12.93 (s, 1H).
%C = 75.4 %H = 4.1
EMIE: M+. = 238
109
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Determine la estructura más probable para esta sustancia, emule el espectro RMN y
compare con los datos experimentales, describa su biogénesis a partir de AcetilCoA, y
asígnele el correspondiente nombre sistemático.
4. De las raíces de Abrus cantoniensis, familia leguminosas; se aisló por métodos
cromatográficos una sustancia cristalina amarilla de P.F. 194-6°C, con las siguientes
características:
%C = 70 %H = 4
UV (MeOH): 226(4.61), 257(4.38), 279(4.04), 289(4.07), 433(3.93)
IR (KBr): 1680, 1631 cm-1, etc.
RMN-1H (CDCl3): 2.45 δ (s, 3H), 7.1 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.2-8.1 (m, 3H), 12.25 (s, 1H), 12.35
(s, 1H).
EMIE: m/z: 254 (M+., 100%)
Determine la estructura más probable para esta sustancia, emule y compare los datos
experimentales RMN, y asígnele el correspondiente nombre sistemático. Describa la
biogénesis de esta sustancia a partir del precursor básico correspondiente.
5. Del extracto acetónico de las raíces de Polygonum cuspidatum, familia poligonáceas;
se aisló mediante métodos cromatográficos una sustancia que cristaliza en agujas
amarillas desde metanol con P.F. 299-302°C. Esta sustancia produce una coloración
amarillo-naranja al tratarla con acetato de magnesio en solución, y posee las
siguientes características espectrales:
UV (EtOH): 204 (4.26), 224 (4.49), 250.5 (4.10), 269 (h, 4.16), 286.5 (4.29), 422 (3.86), 443
(3.86) nm.
IR (Nujol): 1670, 1635, 1605, 1570 cm-1, etc.
RMN-1H (CDCl3 + DMSO-d6): 2.42 δ (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 6.81 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.33 (d, J =
2.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.50 (d, J = 2 Hz, 1H), 13.31 (s, 1H).
EMIE: M+. = 284
Determine la estructura más probable para esta sustancia y asígnele el correspondiente
nombre sistemático. Describa su biogénesis a partir del precursor básico correspondiente.
6. Del extracto acetónico de la corteza de la raíz de Ventilago calyculata, ramnáceas; se
aisló una sustancia cristalina amarilla de P.F. 252°C, la cual posee además las
siguientes características:
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UV (MeOH): 230(4.48), 257(4.32), 295(4.01), 440(4.02) nm
IR (CHCl3): 1635, 1685, 3500 cm-1, etc.
RMN-1H: 2.43δ (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 6.70 (s, 1H), 7.04 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.59 (d, J
= 2 Hz, 1H), 12.05 (s, 1H), 12.95 (s, 1H).
EMIE: m/z (%IR): 314.0787 (100), 299 (79), 297 (62), 296 (52), 286 (58), 285 (82), 284 (46),
271 (67), 269 (50), 258 (21), 230 (48).
Determine la estructura más probable para esta sustancia.
7. Las raíces secas de Polygonum cuspidatum ("kojo-kon" o "Hadori-kon"), familia
poligonáceas, han sido utilizadas para el tratamiento de la dermatitis supurativa,
gonorrea, pie de atleta e hiperlipidemia en la medicina tradicional china y japonesa.
Del extracto acetónico de esta droga se aislaron por métodos cromatográficos dos
sustancias A y B. La sustancia A cristaliza en agujas amarillas desde metanol y tiene
P.F. 181.5-3.5°C. Esta sustancia produce coloración roja al tratarla con amoníaco
acuoso, y un color violeta oscuro al tratarla con cloruro férrico. Además, posee las
siguientes características:
UV (CHCl3): 242.5 (4.29), 290 (4.28), 427 (3.87) nm
IR (Nujol): 1700, 1680, 1625, 1595 cm-1, etc.
RMN-1H (CDCl3): 2.36δ (s, 3H), 2.58 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 6.13 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 12.64 (s,
1H).
EMIE m/z (% IR): 260 (100), 245, 232, 217, 43, etc.
La sustancia B corresponde al fallacinol, funde a 232-4°C, con acetato de magnesio produce
coloración rojo naranja y posee las siguientes características espectrales:
UV (EtOH): 203 (4.24), 224.5 (4.49), 255 (4.20), 266.5 (4.22), 288.5 (4.19), 432.5 (4.02), 4.56
(3.97) nm
IR (Nujol): 3550, 3450, 1670, 1630, 1620, 1570, 1560 cm-1, etc.
RMN-1H (DMSO-d6, 90 Mhz): 3.92δ (s, 3H), 4.63 (d, J = 5 Hz, 2H), 5.57 (1H, t, J = 5.0 Hz), 6.78
y 7.11 (1H c/u, d, J = 2.5 Hz), 7.26 y 7.64 (1H c/u, d, J = 2.5 Hz), 12.03 y 12.14 (1H c/u, s).
Determine la estructura más probable para estas dos sustancias.
8. Del extracto éter de petróleo de la corteza de Tectonia grandis, verbenáceas; se aisló
un sólido amarillo cristalino que posee las siguientes características espectrales:
UV (EtOH): 215, 248 (h), 270, 298, 400 nm
111
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IR (CCl4): 2860-2820, 1660, 1340, 1320, 1230 cm-1, etc.
RMN-1H (400 Mhz, CDCl3): 2.19δ (d, J = 1.5 Hz, 3H), 4.06 (s, 3H), 4.08 (s, 3H), 6.80 (c, J = 1.5
Hz, 1H), 7.73 (t, J = 7 Hz, 1H), 7.76 (t, J = 7 Hz, 1H), 8.38 (dd, J = 1 y 7 Hz, 1H), 8.40 (dd, J = 1
y 7 Hz, 1H).
EMIE m/z (% IR): 282.0890 (100), 267 (20), 254 (60), 253 (44), 239 (24), 211 (12), 210 (13),
57 (98), etc.
Determine la estructura más probable para esta sustancia.
9. Determine la estructura más probable para una sustancia vegetal denominada
Rhinacantina-A que posee las siguientes características:
Agujas de color naranja P.F. 186.5-7 °C
[]D: -12.9° (CHCl3, c = 0.25)
Análisis elemental: %C = 69.5 %H = 5.5
UV (MeOH): 245.5 (h, 4.59), 250.4 (4.83), 280.8 (4.35), 332.1 (3.70)
IR (KBr): 3550, 1670, 1655, 1620, 1600 cm-1, etc.
EMIE m/z (% IR): 258 (100), 243 (18), 240 (11), 225 (29), 200 (14), 197 (18), 189 (18), 188
(29), 187 (25), 172 (18), 171 (18), 160 (18), 159 (29), 115 (32), 105 (25), 104 (21), 72 (82).
RMN-13C: 184.35 (s), 179.42 (s), 157.73 (s), 133.93 (d), 133.08 (d), 131.97 (s), 121.01 (s),
126.36 (d), 125.96 (d), 118.17 (s), 80.48 (s), 68.29 (d), 25.73 (t), 26.48 (q), 21.76 (q).
10. Determine la estructura para una sustancia aislada de dos plantas de la familia
juglandáceas con las siguientes características:
EMIE m/z (% IR): 176 (100), 148 (18), 147 (15), 121 (29), 120 (83), 92 (41), 63 (16).
RMN-1H: 3.0-3.2 (4H, m), 7.26 (1H, dd, J = 8.2 y 1.4 Hz), 7.55 (1H, dd, J = 7.4 y 1.4 Hz), 7.66
(1H, dd, J = 8.2 y 7.4 Hz), 12.12 (s, 1H).
11. Del extracto clorofórmico de la corteza de Pera nitida, familia euforbiáceas; se
aisló una sustancia amarilla con las siguientes características:
P.F. 77-78°C
Ensayo con cloruro férrico: Color rojo
Ensayo con NaOH: Color violeta
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Ensayo de reducción con Zn/AcOH: Desaparece el color rojo, pero reaparece por oxidación
al aire.
EMIE (70 Ev): m/z (% IR): 188 (100), 189 (11.97), 190 (1.39), 170 (28), 160 (34), 131 (57), 120
(47), 92 (54), 77 (20), 63 (36).
ESPECTROS UV:
MeOH: 420 (1550), 263 (4608), 253 (4475), 208 (12675) nm
NaOH: 515 (1713), 268 (4150), 211 (13760), 204 (13800) nm
NaOH+HCl: 420 (1520), 265 (4590), 253 (4490), 208 (11995) nm
AlCl3: 493 (1725), 278 (4100), 272 (4215), 216 (11490) nm
AlCl3+HCl: 493 (1725), 276 (3730), 270 (4140), 216 (9340), 211 (10500) nm
IR (KBr): 3440, 1670, 1650, 1610, 1455, 1365, 1260, 1230, 900, 840, 760 cm-1.
RMN-1H (60 Mhz, CCl4): 2.10 (d, 3H, J = 1.8 Hz), 6.70 (c, 1H, J =1.8 Hz), 7.20 (dd, 1H, J = 9 y
3 Hz), 7.35-7.65 (m, 2H), 11.9 (s, 1H).
Determine la estructura más probable para esta sustancia. Emule el espectro RMN y
compare con los datos experimentales.
12. De los extractos diclorometano y n-butanol de las raíces de Galium sinaicum
(rubiáceas) se aislaron sustancias citotóxicas con las siguientes características:
a) P.F.: 177-180°C
UV (MeOH): 206, 286, 306h, 380h.
IR (KBr): 3450, 2925, 1662, 1630, 1580, 1517, 1460, 1320, 1240, 1220, 1180, 1105, 1060,
982, 880, 772, 620 cm-1.
EMIE: 300 (100), 281 (12), 257 (13), 229 (19), 212 (5), 186 (18), 155 (7), 136 (14), 109 (5), 91
(12), 69 (19).
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): 3.98 (s, 3H), 4.01 (s, 3H), 6.55 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.17 (d, 1H,
J = 2.2 Hz), 7.59 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 12.95 (s, 1H).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6): 56.1 (dos carbonos), 105.2, 107.3, 111.3, 108.2, 108.3, 127.8,
127.5, 134.8, 153.3, 153.6, 164.7, 166.9, 181.2, 184.5 ppm.
113
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b) P.F.: 270-3°C
UV (MeOH): 205, 288, 328, 400 nm
IR (KBr): 3425, 2920, 2310, 1660, 1630, 1595, 1517, 1450, 1320, 1220, 1160, 1117, 1060,
1000, 895, 817, 760, 605 cm-1.
EM-FAB: m/z 301 (M+H, 30%), 300 (6), 243 (6), 223 (31), 207 (30), 185 (48), 153 (10), 131
(32), 115 (100).
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): 2.06 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 7.18 (s, 1H), 7.46 (s, 1H), 7.59 (s, 1H),
13.28 (s, 1H).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6): 8.0, 55.9, 107.3, 108.5 (dos carbonos), 112.6, 116.7, 125.9,
128.0, 131.8, 152.7, 162.1 (dos carbonos), 162.5, 181.2, 185.6 ppm.
c) P.F.: 237-9°C
UV (MeOH): 216, 284, 406 nm.
IR (KBr): 3400, 2945, 1660, 1627, 1588, 1495, 1465, 1430, 1365, 1315, 1297, 1275, 1235,
1200, 1130, 1100, 1070, 1025, 1002, 917, 860, 740, 620 cm-1.
EM-FAB: 331 (M+H, 78%), 330 (22), 315 (100), 299 (65), 285 (33), 264 (28), 235 (18), 223
(43), 205 (31), 193 (24), 181 (15), 164 (22), 151 (56), 137 (55), 115 (79).
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): 3.80 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 4.62 (s, 2H), 7.57 (s, 1H), 7.64 (d, 1H,
J = 7.8 Hz), 7.82 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 12.94 (s, 1H).
RMN-13C/DEPT (100 MHz, DMSO-d6): 56.1c, 57.3t, 60.5c, 105.8d, 114.2s, 118.2d, 121.0s,
124.7s, 132.6s, 133.2d, 136.7s, 147.8s, 148.3s, 152.4s, 157.8s, 180.3s, 187.4s.
d) P.F.: 244-6°C
UV (MeOH): 209, 245h, 284 nm
IR (KBr): 3370, 2925, 1700, 1664, 1592, 1560, 1498, 1381, 1342, 1283, 1140, 1085, 983, 880,
800, 720 cm-1.
EMIE: 328 (47), 310 (34), 281 (28), 252 (13), 214 (25), 181 (42), 152 (12), 123 (56), 91 (32),
69 (100).
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): 3.81 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 7.55 (s, 1H), 8.13 (d, 1H, J = 8.0 Hz),
8.27 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.59 (s, 1H).
114
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RMN-13C/DEPT (100 MHz, DMSO-d6): 56.5c, 61.0c, 106.3d, 121.0s, 126.2d, 126.7s, 127.5d,
134.0d, 134.3s (dos carbonos), 139.0s, 147.0s, 148.2s, 152.8s, 167.0s, 181.0s, 181.7s.
Determine las estructuras más probables para estas sustancias. Emule los espectros RMN y
compárelos con los datos experimentales.
13. De las raíces de Morinda elliptica se aisló una sustancia con las siguientes
características:
Cristales de color naranja, PF 183-185°C (CHCl3)
UV (EtOH): 229, 278, 331, 407 nm
UV (EtOH+NaOH): 229, 280, 308, 531 nm
IR (KBr): 3448, 1696, 1676, 1638, 1592, etc.
EMIE: m/z 252 (57%), 224 (100), 196 (11), 168 (30), etc.
RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 13.26 (s, 1H), 10.63 (s, 1H), 8.35 (m, 1H), 8.32 (m, 1H), 8.23 (d,
1H, J=8 hz), 7.89 (1H, d, J=8 hz), 7.88 (2H, m).
RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 164.5, 128.4, 135.4, 118.7, 127.7, 134.7, 135.3, 127.1, 188.9,
181.8, 133.3, 134.8, 117.4, 137.2, 188.0 ppm.
Determine la estructura más probable para esta sustancia vegetal.
14. De la madera de un árbol, se aisló una sustancia con las siguientes características
espectrales:
UV (EtOH): 220, 230, 275, 370h, 430 nm
IR (KBr): 3200-3150, 1.670, 1630 cm-1
RMN-1H (DMSO-d6): 13.00 (s, 1H), 8.10 (d,10Hz, 1H), 8.00 (d, 10Hz, 1H), 7.15 (d, 10Hz, 1H),
6.80 (d, 10Hz, 1H), 4.00 y 3.80 (s, 6H), 2.40 (s, 3H)
MS m/z (rel. int.): 298 (70), 283 (85), 281 (85), 280 (60), 270 (35), 269 (20), 242 (100), 186
(90), 165 (30), 137 (,15), 136 (70) y 108 (20%)
Con anhídrido acético y piridina produce un derivado acetato (PF 138-140°C), con
dimetilsulfato produce un derivado metiléter (PF 122-4°C, desde éter). La oxidación crómica
produce ácido 3,4-dimetoxiftálico (PF 172-73°C).
Determine la estructura más probable para esta sustancia.
115
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15. De la madera de un árbol, se aisló una sustancia con las siguientes características
espectrales:
UV (EtOH) 255, 282h, 415 nm
IR (KBr) 3210-3180, 1675 cm-1
RMN-1H (DMSO-d6): 9.90 (bs, 1H), 8.06 (d, 8 Hz, 1H), 7.58 (d, 2 Hz, 1H), 7.44 (d, 3 Hz, 1H),
7.12 (dd, 8 y 3 Hz, 1H), 7.08 (d, 3Hz, 1H), 4.03 (s, 3H) y 2.49 (s, 3H)
MS m/z (rel. int.): 268 (100), 253 (70), 251 (1.5), 250 (50), 240 (10), 239 (20), 212 (80), 156
(85), l49 (55), 1 12 (18), 121 (27) y 93 (10%). Con anhídrido acético y piridina produce un
derivado acetato (PF 147-8°C), con dimetilsulfato produce un derivado metiléter (PF 160-
3°C). La oxidación crómica produce ácido 4-hidroxiftálico (PF 203-4°C). Determine la
estructura más probable para esta sustancia.
116
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Flavonoides
Los flavonoides son un gran grupo de sustancias vegetales que fueron descubiertas por el
premio Nobel en Bioquímica Dr. Albert Szent-Gyorgi, quien les denominó como "vitamina P".
El Dr. Szent-Gyorgi descubrió que los flavonoides favorecen la función de la vitamina C,
mejorando su absorción y protegiéndola de la oxidación. Los flavonoides comprenden varias
clases de sustancias naturales, entre las cuales están muchas de las que les confieren colores
amarillo, naranja, rojo, violeta y azul, a muchas flores, hojas y frutos, especialmente. Cuando
usted amigo lector está observando una rosa roja, además de disfrutar la gracia artística de
su diseño, está disfrutando de su color, ese color es debido a los flavonoides; cuando se
obaserva una fresa jugosa, una uva roja ó morada, una flor amarilla, se está observando ni
más ni menos a sustancias flavonoides. Esos colores que disfruta nuestro cerebro al
percibirlos son en su gran mayoría debidos a los flavonoides.
Aspectos químicos y de actividad biológica de las diferentes clases de flavonoides
Los flavonoides tienen una estructura química muy definida, como se muestra en la figura
2.23. Puede observarse que de manera general son moléculas que tienen dos anillos
bencénicos (o aromáticos) unidos a través de una cadena de tres átomos de carbono, puesto
que cada anillo bencénico tiene 6 átomos de carbono, los autores los denominan
simplemente como compuestos C6C3C6. La Figura 2.25 muestra la estructura química de uno
de los flavonoides más comunes: La quercetina.
O
O
HO
OH
OH
OH
OH
Figura 2.25. Estructura básica de los flavonoides y estructura del flavonoide quercetina a la derecha.
La Figura 2.25 muestra una de las maneras más utilizadas por los químicos para representar
las moléculas de los flavonoides en dos dimensiones, sin embargo, existen otras maneras de
117
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representarlas de manera más real, esto es en tres dimensiones como se ilustra por ejemplo
en la Figura 2.26.
Figura 2.26. Estructura química en tres dimensiones del flavonoide quercetina. Representación en esferas: átomos de carbono de color azul, átomos de oxígeno en color rojo y átomos de hidrógeno en color blanco.
Para su estudio sistemático los más de 9000 flavonoides naturales se han clasificado en varias
clases de acuerdo con las variantes estructurales que presenta la cadena central C3 (Figura
2.27). De acuerdo con esto los flavonoides se clasifican en varios grupos: Chalconas, flavonas,
flavonoles, flavanonas, flavanonoles, antocianidinas, catequinas, epicatequinas, auronas,
isoflavonoides, pterocarpanos, rotenoides, flavolignanos, etc.
118
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Figura 2.27. Estructuras básicas de varias clases de flavonoides. El color es para enfatizar que compuestos como los flavonoles son generalmente de coloración amarilla, mientras que las antocianinas son de coloraciones rojo, violeta o azul.
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Figura 2.27. (Cont.) Estructuras básicas de varias clases de flavonoides. El color es para enfatizar que compuestos como los flavonoles son generalmente de coloración amarilla, mientras que las antocianinas son de coloraciones rojo, violeta o azul.
La mayoría de los flavonoides poseen nombres triviales con la terminación INA, OL ú ÓSIDO.
Estos nombres les han sido asignados por los investigadores que los han ido descubriendo
uno a uno en la naturaleza. Por ejemplo, la acacetina (Figura 2.26) se identificó por primera
vez en una planta del género Acacia y se clasifica como una flavona. La quercetina es un
120
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flavonol identificado inicialmente en una planta del género Quercus. La naringenina es una
flavanona aislada inicialmente en la naranja. El eriodictiol es una flavanona y se aisló
inicialmente en una planta del género Eriodictyon. Sin embargo, esta clase de nombres no es
muy útil cuando se requiere información sistemática de estas sustancias, por lo cual los
químicos han convenido llamarlos con nombres que representen su estructura química. Así
por ejemplo la acacetina corresponde a la 5,7-dihidroxi-4'-metoxiflavona; la quercetina al
5,7,3',4'-tetrahidroxiflavonol; la naringenina a la 5,7,4'-trihidroxiflavanona, etc.
Hasta ahora hemos visto aspectos relacionados con la estructura simple de los flavonoides,
sin embargo, dentro de las plantas los estudios han mostrado que estas sustancias se
encuentran la mayoría de las veces, ligados a moléculas de carbohidratos. A este tipo de
combinación núcleo flavonoide básico + una o varias unidades de carbohidratos, se les
denomina GLICOSIDOS, y cuando no tienen ligadas moléculas de carbohidratos se las
denomina AGLICONAS FLAVONOIDES. Por ejemplo, los que mencionamos anteriormente
(acacetina, eriodictiol, quercetina, naringenina, etc.) son agliconas flavonoides. Un ejemplo
de glicósido es la vitexina que corresponde al 8-C-β-D-glucopiranósido de apigenina. En este
caso una forma de nomenclatura sistemática sencilla para la vitexina es denominarla
apigenina-8-C-glucósido.
Las diferentes clases de flavonoides encontradas en la naturaleza son objeto de investigación
por sus propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, anti-cáncer, anti diabetes, contra la
enfermedad de Alzheimer, antibacterianas, etc.
La figura 2.28. muestra las estructuras de varias flavonas naturales. La flavona chrisina se
encuentra en plantas como Passiflora caerula, en la miel y en propóleos. Se ha reportado su
acción preventiva de tumores en ensayos preclínicos y su capacidad para aumentar la
potencia de los quimioterapéuticos en líneas tumorales tanto resistentes como no-
resistentes. También se ha reportado su potencial uso para disminuir la generación de
cataratas inducida por diabetes.
O
O
R7
R5
R4'
R3'
R6
121
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NOMBRE TRIVIAL R3’ R4’ R5 R6 R7 Fuente
Crisina - - OH - OH Populus
Baicaleína - - OH OH OH Scutellaria
Apigenina - OH OH - OH Petroselinum
Acacetina - OMe OH - OH Robinia
Escutelarína - OH OH OH OH Scutellaria
Hispidulina - OMe OH OH OH Ambrosia
Luteolina OH OH OH - OH Reseda
Crisoeriol OMe OH OH - OH Eriodictyon
Diosmetina OH OMe OH - OH Diosma
Figura 2.28. Estructuras químicas y fuentes naturales de varias flavonas naturales.
La baicaleina (5,6,7-trihydroxi-2-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona) se encuentra en raíces de
Scutellaria baicalensis. Se ha utilizado en terapias como antioxidante, antiviral,
antibacteriano, antiinflamatorio y antialérgico. Más recientemente la baicaleina ha sido
reportada de poseer actividad contra una de las formas de cáncer más prevalentes y fatales
como el carcinoma hepatocelular y contra virus como el chikunguya.
La apigenina (4′, 5, 7-trihidroxiflavona) se encuentra en diferentes plantas y constituye la
aglicona de muchos glicósidos como apigetrina, vitexina e isovitexina. Muchas frutas y
verduras son ricas en apigenina como el perejil, apio y manzanilla, en los cuales la apigenina
equivale al 68% de los flavonoides totales. Se ha reportado que los efectos benéficos para la
salud se deben a sus efectos antioxidante, antiinflamatoria, antibacteriano, antiviral,
antimicótica, cardio protectora y anti cáncer. Entre sus propiedades anti-cáncer se incluye
su efecto contra células de cánceres de hígado, páncreas, colorrectal, sanguíneo, de
próstata, de seno, de pulmón, de tiroides, de la piel, del cuello, de la cabeza y de los huesos.
También se ha reportado que las mezclas de varios C-glicósidos relacionados con la
apigenina, tienen utilidad potencial para tratar hepatomas.
La apigenina, junto con otros flavonoides como luteolina, quercetina y chrisina, son
estudiados por su potencial para el mantenimiento del genoma y en quimio prevención.
122
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La luteolina se encuentra en plantas como apio, perejil, pimiento y orégano. Muchos estudios
preclínicos han reportado que esta sustancia tiene diversas actividades biológicas que
incluyen actividad antioxidante, anti-cáncer y antiinflamatoria. También se la considera con
potencial para la terapia de la enfermedad de Alzheimer, con potencial para terapia de
cáncer y como inhibidora de metástasis de tumores.
La hispidulina (4’, 5, 7-trihidroxi-6-metoxiflavona) es una flavona natural hallada en
diferentes materiales vegetales como Saussurea involucrata Kar. et Kir., una droga
tradicional China poco conocida. También está presente en varias especies de los géneros
Artemisia y Salvia. Varios estudios in vitro han mostrado sus propiedades potentes como
antioxidante, antiinflamatoria, anti mutagénica y anti neoplásica. También se ha identificado
como un ligando potente de receptores de la benzodiacepina, es capaz de penetrar la barrera
hemato-encefálica y posee actividad anticonvulsivante en el sistema nervioso central.
Además, se reportan propiedades anti micobacterianas, anti-asma, antimicrobianas, anti
proliferativas y larvicidas. Se reporta que es cien veces más potente que la teofilina en su
capacidad de inhibir la agregación plaquetaria.
La escutelarina ha sido reportada para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares,
como la hipertensión, fibrosis miocardial, y ha mostrado actividad contra células de
carcinoma hepático. Por esto se han preparado y evaluado derivados con potencial uso
contra este tipo de cáncer.
La figura 2.29. muestra la estructura química y las fuentes de varios flavonoles naturales.
La fisetina (3,7,3′,4′-tetrahidroxiflavona) puede aislar de plantas como Rhus verniciflua, y de
frutas y verduras como fresas, manzanas, uvas, cebolla y pepino cohombro. Se reportan
estudios que muestran sus actividades anti-cáncer, antioxidante y antiinflamatoria. También
presenta reportes de uso potencial para el tratamiento de artritis ósea, y actividad senolítica,
la cual está relacionada con el envejecimiento y procesos asociados como la osteoporosis, la
fragilidad y enfermedades cardiovasculares.
123
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O
O
R3'
R4'
R5'
OH
R5
R7
R8
R6
NOMBRE TRIVIAL R3’ R4’ R5’ R5 R6 R7 R8 Fuente
Galangina - - - OH - OH - Alpinia
Fisetina OH OH - - - OH - Rhus
Kaemferol - OH - OH - OH - Delphinium
Herbacetina - OH - OH - OH OH Gossypium
Quercetina OH OH - OH - OH - Quercus
Ramnetina OH OH - OH - OMe - Rhamnus
Quercetagetina OH OH - OH OH OH - Tagetes
Gossipetina OMe OH - OH - OH OH Gossypium
Isorramnetina OH OMe - OH - OH - Cheiranthus
Miricetina OH OH OH OH - OH - Vitis
Figura 2.29. Estructuras químicas y fuentes de varios flavonoles naturales.
La quercetina es un flavonol ampliamente distribuido en diferentes plantas. Es uno de los
compuestos naturales más investigados por su potencial contra diferentes enfermedades.
En la cebolla es el flavonoide más abundante representando el 10% de los flavonoides
presentes, presenta potencial para la prevención del cáncer colorrectal.
124
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El kaempferol (KMF), está presente en plantas alimenticias como el broccoli, repollo, tomate,
arvejas, fresas, manzanas y col rizada. Se ha reportado que tiene potencial contra
enfermedades como el cáncer de ovarios.
La miricetina es un flavonol presente en diferentes frutas, verduras, tés, cerezas y vinos. Se
ha reportado que, junto a otros flavonoides como quercetina, kaemferol y luteolina, muestra
interesantes propiedades biológicas como su potencial contra la enfermedad de Alzheimer.
La presencia del grupo hidroxilo en C-3, ha sido relacionada con su potencial para inhibir
gliomas malignos. La miricetina ha sido reportada como un inhibidor potente de la
endonucleasa 1 por lo cual puede tiene potencial contra células de cáncer de colon HT-29.
La Figura 2.30. muestra las estructuras de varias antocianidinas y algunas de sus fuentes
naturales. Es de tener en cuenta que cuando se trata de las agliconas se las denomina
antocianidinas, y cuando se trata de los glicósidos se las nombra como antocianinas.
Estas sustancias están presentes en los tejidos de coloraciones que van del rojo hasta el
violeta y el azul, de muchas plantas, especialmente en sus flores y frutos. Son sales solubles
en agua, y cambian su color de acuerdo al pH, lo que las hace ser indicadores de pH naturales
lo que a su vez ha llevado a considerar su utilidad como indicadores en empaques para
alimentos. Por su solubilidad en agua, y su inestabilidad, se trabaja también en la obtención
de derivados más liposolubles, como es el caso con las antocianinas de la flor de Jamaica.
Las antocianinas son reconocidas por su actividad antioxidante, pero también se están
evaluando sus usos potenciales en enfermedades cardiovasculares, cáncer y enfermedades
inflamatorias y también con potencial inmuno modulatorio.
Las antocianinas están siendo consideradas como compuestos de interés dietario además se
evalúa su potencial en la terapia de diabetes y como cardio protector.
OR7
R5
R4'
R3'
R5'
R3
X
125
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NOMBRE TRIVIAL R3’ R4’ R5’ R3 R5 R7 Fuente
Apigenidina - OH OH - OH - Rechsteineria
Luteolinidina OH OH OH - OH - Rechsteineria
Pelargonidina - OH OH OH OH - Pelargonium
Cianidina OH OH OH OH OH - Centaurea
Peonidina OMe OH OH OH OH - Paeonia
Delfinidina OH OH OH OH OH OH Delphinium
Petunidina OMe OH OH OH OH OH Petunia
Malvidina OMe OH OMe OH OH OHe Malva
Figura 2.30. Estructuras y algunas fuentes de varias antocianidinas naturales.
La figura 2.31. muestra las estructuras y algunas fuentes de flavanonas naturales.
OR7
R5
R4'
R3'
R6
O
126
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NOMBRE TRIVIAL R3’ R4’ R5 R6 R7 Fuente
Pinocembrina - - OH - OH Pinus
Liquiritigenina - OH - - OH Glycyrrhiza
Naringenina - OH OH - OH Prunus
Sakuranetina - OH OH - OMe Prunus
Eriodictiol OH OH OH - OH Eriodictyon
Hesperetina OH OMe OH - OH Prunus
Figura 2.31. Estructuras químicas y algunas fuentes de flavanonas naturales.
La naringenina, es la aglicona de la naringina presente en diferentes plantas, esta sustancia
ha presentado resultados importantes contra la nefrotoxicidad inducida por terapias con cis-
platino. La sakuranetina ha mostrado potencial actividad contra diabetes.
La hesperetina, se encuentra en frutos cítricos. En forma de glicósido se denomina
hesperidina. Presenta varias actividades las cuales incluyen su acción captadora de radicales
libres, así como efectos antioxidantes, neuro protectores, anti-Alzheimer, neuro
farmacológicos, antiinflamatorios, en la prevención de enfermedades cardio vasculares y
antidepresivos. Por su capacidad inhibitoria sobre la α-glucosidasa, se considera
potencialmente útil para la terapia de diabetes tipo 2.
Es importante anotar que varias clases de flavonoides contienen en su estructura el núcleo
cromona, que está presente en muchos compuestos naturales bioactivos, y que se ha
sugerido como una estructura clave en el estudio y desarrollo de nuevos compuestos
biológicamente activos.
Otros flavonoides como la puerarina, un isoflavonoide, se ha reportado como un compuesto
con potencial uso en terapia del cáncer de seno. Un éster de la isoorientina y ácido cafeico
presenta potentes actividades antioxidante e inhibidora de la enzima α-glucosidasa, lo que
sugiere su potencial para prevenir y tratar enfermedades como diabetes mellitus.
La dihidromiricetina es un flavonoide de las hojas de Ampelopsis grossedentata, que
presenta efectos protectores antioxidantes y antiinflamatorios. Además, se reportan
actividades anti-cáncer, mejora de la sensibilidad a la insulina y reducción de la pérdida
neuronal dopaminérgica de la enfermedad de Alzheimer, y contra isquemias cerebrales.
Otros flavonoides, como los flavolignanos del gingko, también muestran potencial contra
este tipo de enfermedades.
127
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Un glicósido flavonoide que se encuentra en muchas plantas es la rutina, para esta sustancia
se han reportado propiedades antioxidantes y anticancerígenas. Además, la rutina reduce
también la fragilidad capilar, previene la aterogénesis, y alivia la citotoxicidad del colesterol-
LDL oxidado. También se ha reportado que puede reducir de manera significativa los
triglicéridos hepáticos y los niveles de colesterol en animales con dietas altas en grasas.
Otras actividades reportadas para los flavonoides incluyen su acción antidepresiva y anti
genotóxica.
Es también interesante mencionar, la consideración de los flavonoides como componentes
de la dieta, en especial por las propiedades que se les atribuyen por diferentes autores, sobre
el envejecimiento del cerebro y la pérdida de la memoria. Aunque el índice terapeútico de
los flavonoides no está bien definido, algunos autores mencionan valores de ingesta diaria
en la dieta de 250 a 400 mg/día.
Además de las clases de flavonoides mencionadas anteriormente, se encuentran en algunas
plantas unas sustancias denominadas flavolignanos. Para definir estos flavolignanos, es
importante aclarar primero lo que son los lignanos. Estas sustancias son otra gran clase de
compuestos fenólicos naturales derivados biosintéticamente del ácido shikímico, y que
poseen una estructura básica (C6C3)2. Es decir, tienen dos anillos aromáticos y dos cadenas
de 3 átomos de carbono. Existen dos grandes grupos, los lignanos propiamente dichos, como
se muestra en la 2.32, y los neolignanos. Son ejemplos de ellos la podofilotoxina y la
eusiderina (Figura 2.33).
12
3
1'2' 3'
O
O
1
2
3
1'
2'
3'
Figura 2.32. Estructuras básicas de algunos lignanos y neolignanos. En los lignanos (imagen de la izquierda), la unión de las dos unidades C6C3 se dá a través de la cadena propanoide, y en los neolignanos las dos unidades C6C3 se unen a través de la cadena propanoide de una y el anillo aromático de la otra.
128
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OH
O
O
O
OMe
OMe
MeO
O
O
O
OMe
OMe
HO
MeO
Podofilotoxina Eusiderina
Figura 2.33. Estructuras químicas de la podofiloxina (un lignano) y la eusiderina (un neolignano).
Las estructuras químicas de algunos flavolignanos se presentan en la 2.34. Puede observarse
el núcleo característico de los flavonoides hacia la izquierda, y la cadena propanoide adicional
en la posición superior derecha.
OO
O
OH
HO
CH2OH
O
OHOH
O
OO
O
OH
HO
CH2OH
O
OHOH
O
OO
O
OH
HO
CH2OH
O
OHOH
O
OO
O
OH
HO
CH2OH
O
OHOH
O
Dehidrosilibina-A Silibina-A
Dehidrosilibina-B Silibina-B
Figura 2.34. Estructuras químicas de flavolignanos presentes en la silimarina, un extracto de Sylibum marianum.
129
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La planta Sylibum marianum, es conocida como la fuente de una droga natural con
propiedades hepatoprotectoras. La droga es un extracto de la planta que contiene varios
flavolignanos como los mostrados en la figura 2.34, además de flavonoides como la
quercetina y la taxifolina. Además de sus propiedades antimicrobianas y anti cancer. En
experimentos con animales se ha observado que esta droga puede proteger además el
corazón, el cerebro y los riñones contra isquemias.
Distribución y estado natural
Los flavonoides se encuentran ampliamente distribuidos en las plantas verdes
(especialmente las angiospermas), y sólo algunos pocos se han detectado en hongos y algas.
En el medio marino se han reportado hasta ahora unos cien flavonoides, especialmente tipo
flavonas y flavonoles. En este caso se trata de plantas acuáticas que incluyen las familias
hidrocaritáceas, zosteráceas, rhodomeláceas, juncáceas y tamaricáceas. Se han encontrado
en las diferentes partes de las plantas, especialmente en las flores, frutos, hojas y tallos; y se
les encuentra en forma libre (también llamados agliconas flavonoides), como glicósidos (la
mayoría de las veces), como sulfatos, clorados e incluso nitrogenados en plantas marinas.
Algunas veces como dímeros y polímeros. Los glicósidos pueden ser de dos clases: con los
carbohidratos ligados a través de átomos de oxígeno (enlace hemiacetal) es decir como O-
glicósidos; o con los carbohidratos ligados a través de enlaces C-C, es decir como C-glicósidos.
De todas estas formas naturales, los O-glicósidos son los más comunes de hallar. Las
antocianinas por su parte se encuentran como sales principalmente en flores, frutos y tejidos
con coloraciones que van del rojo hasta el violeta y el azul.
Propiedades físicas
Las propiedades físicas dependen de la clase de flavonoide considerado y su forma (libre,
glicósido ó sulfato). Por ejemplo, las flavonas, flavonoles y auronas, debido al sistema de
enlaces dobles C=C conjugados que contienen, son compuestos sólidos con colores que
comprenden desde el amarillo muy tenue hasta el anaranjado. Las antocianidinas son de
colores rojo intenso, morado, violeta y azul. Las flavanonas y flavanonoles debido al carbono
quiral C-2 presentan el fenómeno de la rotación óptica. Los glicósidos son en general sólidos
amorfos, mientras que las agliconas y los altamente metoxilados son cristalinos.
La solubilidad depende de la forma en que se encuentren y el número y clase de
sustituyentes presentes. Los glicósidos, las antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua
y alcohol. Las agliconas flavonoides altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol,
metanol y n-butanol), mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes como éter
etílico, acetato de etilo y acetona. Las agliconas flavonoides altamente metoxiladas son
solubles en solventes menos polares como el éter de petróleo y el cloroformo.
130
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Los flavonoides con hidroxilos fenólicos son solubles en soluciones alcalinas, pero algunos
altamente hidroxilados se descomponen por acción de las bases fuertes, un hecho que
permite reconocerlos y diferenciarlos de otros, y que hace años se utilizó para su dilucidación
estructural.
Los glicósidos flavonoides son sólidos amorfos que se funden con descomposición, mientras
que las correspondientes agliconas son sólidos cristalinos.
Biogénesis
Como se mencionó anteriormente los flavonoides son metabolitos secundarios vegetales de
origen biosintético mixto: el anillo A proviene de la ruta de la malonilcoenzima A y el anillo B
y la cadena C3 provienen de la ruta del ácido shikímico. Un tricétido se cicliza y se condensa
con una molécula de ácido p-cumárico. La enolización del ciclo proveniente de la ruta de la
malonilCoA da origen al anillo aromático A en las chalconas y flavanonas. Estas a su vez son
los precursores de las demás clases de flavonoides. Es importante recalcar que este proceso
de biosíntesis sustenta el hecho de que en la mayoría de flavonoides el anillo A sea meta-
dioxigenado, es decir como es característico de los anillos aromáticos originados por la vía
de la malonilCoA; y, por otro lado, el anillo B proveniente de la ruta del ácido shikímico,
generalmente es orto-dioxigenado. La figura 2.35 describe la biogénesis de las chalconas, las
cuales a su vez dan origen a los demás flavonoides.
Para el caso de la biosíntesis de los isoflavonoides los experimentos realizados por diversos
investigadores sugieren que hay rutas alternativas, pero que de todas maneras involucran al
ácido shikímico y la malonilcoenzima-A, como precursores.
131
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Figura 2.35. Esquema de la biogénesis de flavonoides a partir de ácido shikímico y acetilcoenzima-A.
Extracción y aislamiento
Los flavonoides en general se extraen de muestras secas y molidas. La muestra se desengrasa
inicialmente con éter de petróleo ó n-hexano, y el marco se extrae con etanol puro o del
70%. Este último es recomendado para garantizar la extracción de los más polares. El
132
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extracto obtenido se evapora con calentamiento no superior a los 50°C y se le hacen
particiones sucesivas con éter etílico, acetato de etilo y n-butanol. Los flavonoides apolares
quedan en la fase etérea, los medianamente polares en la fase acetato de etilo y los más
polares en el n-butanol. Cada una de estas tres fracciones se puede analizar por
cromatografía en capa fina (CCF) y HPLC en fase reversa.
Actualmente se están desarrollando nuevas alternativas de extracción más eficientes, menos
costosas en tiempo y materiales, y especialmente con menores efectos contaminantes del
medio ambiente. Estas técnicas incluyen el uso de sistemas de microondas, y ultrasonido. La
comparación de los métodos clásicos de extracción con técnicas como la asistida con
ultrasonido presenta las ventajas mencionadas, y es útil en general para diferentes clases de
metabolitos secundarios, incluidos los flavonoides. También se ensayan otras mezclas
extractoras como Tritón X100-NaCl-HCl que permiten obtener rápidamente las fracciones de
alcaloides y flavonoides de muestras vegetales. Como se anotó en el capítulo 1, la utilización
de solventes eutécticos viscosos (DES), es una de las técnicas más utilizadas actualmente
para extraer compuestos fenólicos como los flavonoides, por las ventajas sobre el uso de los
solventes orgánicos convencionales.
Para el análisis por CCF de las agliconas se utilizan mezclas n-hexano/acetato de etilo en
diferentes proporciones, estas pueden ser alternativas menos contaminantes que por
ejemplo la mezcla cloroformo/acetato de etilo 60:40 utilizada por diferentes autores para el
análisis de drogas vegetales.
Para el análisis por HPLC de los glicósidos pueden utilizarse columnas RP-18, detectando a
254 nm y eluyendo con mezclas con ácido acético o fórmico diluidos, un alcohol, acetonitrilo
y agua en diferentes proporciones. El ácido previene la formación de picos asimétricos en el
cromatograma. Para el análisis cuantitativo HPLC de las agliconas también se usan columnas
RP-18, detección a 254 nm y elución con mezclas de acetonitrilo/agua con ácido acético al
1%. Utilizando estas condiciones cromatográficas y UHPLC con columna C-18 y acoplada con
RMN, se pueden identificar de manera eficiente muchas flavonas y flavonoles comunes.
Aunque como en muchas plantas los flavonoides se encuentran en mezclas con otros
metabolitos, se vienen desarrollando técnicas que combinan la cromatografía en contra
corriente CCC, y la resonancia magnética de carbono-13, para su análisis cualitativo y
cuantitativo.
En el caso de las antocianinas, estas se pueden extraer de las muestras vegetales con etanol
55.10% acuoso y asistido con ultrasonido a 70°C. El extracto se puede separar por HPLC con
detector de arreglo de diodos DAD, utilizando columnas de fase reversa C-18, y eluyendo con
mezclas de etanol y ácido fórmico al 5% 20:80. Esta constituye una metodología rápida,
confiable y amigable con el medio ambiente.
133
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Cuantificación de flavonoides totales
Aunque los flavonoides presentes en las plantas y drogas vegetales en general están
mezclados con diferentes metabolitos, y pueden ser de diferentes clases, no existe un
método exacto para su cuantificación. Una aproximación es el método de Chang. En este
método colorimétrico. El extracto alcohólico de la muestra con flavonoides se mezcla con
etanol al 75%, con cloruro de aluminio en solución y con una sal como acetato de potasio. La
reacción produce un complejo coloreado que se puede leer a 415 nm, y se utiliza como
referencia una curva estándar de quercetina. Los resultados se expresan como equivalentes
de quercetina. Otro método similar utiliza nitrito de sodio NaNO2, y cloruro de aluminio AlCl3,
también con lectura espectrofotométrica a 415 nm y utilizando como sustancia de referencia
la quercetina.
El contenido de flavonoides y fenoles totales se puede determinar colorimétricamente
mediante el uso del reactivo de Folin-Ciocalteau, con ácido gálico como marcador de
referencia.
Ensayo de Shinoda
Los flavonoides con el núcleo benzopirona o 4-cromenona (p. ej. flavonas, flavonoles,
flavanonas, etc.) producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o
alcohólicas se les adiciona magnesio seguido de HCl concentrado. Aunque no se conoce el
mecanismo de esta prueba, es muy utilizada para reconocer esta clase de compuestos. Es
importante tener en cuenta que varias clases de flavonoides como las auronas y las
chalconas, no dan resultados positivos con esta prueba, debido a que no contienen el sistema
anular benzopirona o 4-cromenona, y que otras sustancias diferentes a los flavonoides en
cambio dan la prueba positiva, debido a que contienen el sistema benzopirona o 4-
cromenona.
Reconocimiento de antocianinas
Las antocianinas se comportan como indicadores ácido-base debido al proceso mostrado en
la figura 2.36. A pH ácido presentan coloraciones rojas, violetas y moradas; mientras que a
pH alcalino presentan coloraciones verdes y azules.
134
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Figura 2.36. Estructuras químicas y cambio de color de la antocianina cianina con el pH.
Con esta prueba se pueden diferenciar entre las antocianinas y las betacianinas (pigmentos
nitrogenados de colores rojos y violeta de plantas del orden Centrosperma, como p. ej. los
pigmentos de la remolacha Beta vulgaris, Fam. quenopodiáceas y también presentes en
otras plantas como la Phytolacca americana, Fam. Fitolacáceas). Las betacianinas, hacen
parte de un grupo de sustancias nitrogenadas denominadas betalaínas, y estas se dividen a
su vez en dos grupos, las betacianinas de colores rojo al violeta, y las betaxantinas de color
amarillo. Estas sustancias son de interés actualmente por ser pigementos con potencial uso
como colorantes de alimentos, y por sus propiedades antimicrobianas y antivirales (69).
Espectroscopia ultravioleta-visible
Los espectros UV de los flavonoides en metanol presentan bandas características debidas a
los sistemas conjugados de los anillos aromáticos. A continuación, se presenta información
relacionada con la espectroscopia UV de flavonas y flavonoles.
Las flavonas y flavonoles en particular, muestran dos bandas definidas: La banda I, de mayor
longitud de onda en el rango 300-400 nm asociada con la funcionalidad cinamoílo, y la banda
II, entre 240-285 nm debida al anillo aromático A (funcionalidad benzoílo), aunque a veces
se observan otras bandas de absorción. La posición de la banda I depende del tipo de
flavonoide: las flavonas la muestran en 304-350 nm, los flavonoles 3-O-sustituídos en 330-
360 nm, y los flavonoles en 352-385 nm. A manera de ejemplo la quercetina muestra
máximos de absorción en 371, 268h, 257 nm; la luteolina en 350, 267, 254 nm, y la 3-O-
metilquercetina en 358, 253 nm.
Para el caso de las flavonas y flavonoles, la presencia de hidroxilos fenólicos en diferentes
posiciones de la molécula puede establecerse estudiando el comportamiento del espectro
UV metanólico al añadirle los denominados reactivos de desplazamiento: metóxido de sodio
(NaOMe), acetato de sodio (NaOAc), cloruro de aluminio (AlCl3) con y sin HCl, y ácido bórico
(H3BO3).
135
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El NaOMe es una base fuerte que ioniza los hidroxilos fenólicos presentes en la molécula y
particularmente permite reconocer la existencia de grupos hidroxilo en 3 y 4'. Las flavonas
4'-hidroxiladas y los flavonoles 3-O-sustituídos presentan desplazamiento bato crómico de
45-65 nm para la banda I al añadir NaOMe, y la intensidad de la banda no decrece. Los
flavonoles (ó 3-hidroxiflavonas) sin hidroxilo en 4', también presentan el mismo
desplazamiento batocrómico de 45-65 nm, pero la intensidad de la banda se ve disminuida.
En los flavonoles 3,4'-dihidroxilados, orto-dihidroxilados y diorto-trihidroxilados, el espectro
se descompone en pocos minutos luego de añadir el NaOMe. La aparición de una banda
alrededor de 330 nm (banda III) es característica de flavonas 7-hidroxiladas.
El NaOAc es una base más débil que el NaOMe, y ioniza solo los hidroxilos fenólicos más
ácidos: 3, 4' y 7. La ionización del hidroxilo en 7 afecta la banda II y por lo tanto el NaOAc es
un reactivo útil para determinar la presencia de dicho hidroxilo. Si al añadir el NaOAc se
observa un desplazamiento batocrómico de 5-20 nm en la banda II se trata de una flavona o
flavonol 7-hidroxilado. Las flavanonas 5-hidroxiladas presentan un desplazamiento
batocrómico de 35 nm. Los flavononoles (sin 5-OH) presentan un desplazamiento
batocrómico de 60 nm. Sin embargo, Heinz y col. han reportado que se debe tener
precaución en la obtención del espectro con NaOAc.
El H3BO3 en medio alcalino forma quelatos con hidroxilos fenólicos en posición relativa orto
(Figura 2.37).
Figura 2.37. Reacción de formación de quelato entre grupos hidroxilos en posición orto y el ácido bórico. La reacción ocurre en medio alcalino.
La formación del quelato produce desplazamiento batocrómico en la banda I. Si el
desplazamiento es de 12-36 nm se trata de un flavonoide (flavona, flavonol, aurona o
chalcona) orto-dihidroxilado en el anillo B, pero si el desplazamiento batocrómico es menor
es un flavonoide orto-dihidroxilado en el anillo A. Las isoflavonas, flavanonas y flavononoles
orto-dihidroxiladas en el anillo A muestran desplazamiento batocrómico de 10-15 nm, pero
en la banda II.
El AlCl3 anhidro también forma quelatos con flavonoides orto-dihidroxilados, 3-hidroxilados
y 5-hidroxilados (hidroxilos peri). En el caso de los orto-dihidroxilados el quelato es inestable
136
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a pH ácido, mientras que los quelatos formados con 3- y/o 5-hidroxilados son estables. La
figura 2.38. esquematiza el proceso químico que ocurre.
Figura 2.38. Reacción de formación de quelatos entre el cloruro de aluminio y grupos hidroxilo peri y orto de flavonoides.
Por lo anterior, si al determinar el espectro con AlCl3 y HCl se mantiene un desplazamiento
batocrómico de 35-55 nm en la banda I (comparando con el espectro metanólico) se trata
de una flavona o un flavonol 5-hidroxilado. Si el desplazamiento es de 17-20 nm se puede
tratar de una flavona o un flavonol 5-hidroxilado y 6-oxigenado. Si el desplazamiento es de
50-60 nm se trata de una flavona o un flavonol 3-hidroxilado (con o sin 5-OH).
En el caso de flavonoides (flavonas y flavonoles) orto-dihidroxilados en el anillo B (sin 3-OH
ni 5-OH) al añadir el cloruro de aluminio se obtiene un desplazamiento batocrómico de la
banda I de 30-40 nm, el cual se pierde al añadir el HCl. Los orto-dihidroxilados en A (sin 3-OH
ni 5-OH) muestran un desplazamiento de la misma banda de 20-25 nm, el cual se pierde
también al añadir el HCl.
Otros flavonoides como las flavanonas, isoflavonas y flavanonoles presentan
desplazamientos batocrómicos, pero en la banda II. Las auronas, chalconas y antocianidinas
también presentan desplazamientos batocrómicos en la banda I.
Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear
El desarrollo de las técnicas como espectrometría de masas y, especialmente la resonancia
magnética nuclear, facilita la asignación estructural de las diferentes clases de flavonoides.
El espectro de RMN-1H de los flavonoides permite reconocer características estructurales
importantes. Un resumen de los desplazamientos químicos observados para los tipos de
protones más comúnmente hallados se presenta en la tabla 3.
137
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Tabla 3. Desplazamientos químicos de varias clases de protones presentes en los flavonoides.
(ppm) Tipos de protones
0.0 Tetrametilsilano
0.0-0.5 Trimetilsililo
1.0-1.2 Metilo de la ramnosa (doblete ancho)
1.7 Metilos del grupo isopentenilo
1.9-2.0 Metilos de acetatos alifáticos (de azúcares)
2.2-2.4 Metilos de acetatos aromáticos
2.7-3.1 H-3 de flavanonas (multiplete)
3.0-4.8 Protones de carbohidratos
3.5 Metileno del grupo isopentenilo
3.7-4.1 Metoxilos aromáticos
4.1-4.6 Protones 2 y 3 de isoflavanonas
4.2-6.0 Protón 1 de carbohidratos, protón 2 de flavanonoles y flavanonas (doble doblete)
5.4 Protón 2 de flavanonoles y flavanonas (dd)
6.0-6.8 Protones 3, 6 y 8 de flavonas
6.8-8.0 Protones aromáticos del anillo B
7.5-8.0 Protón 2 de isoflavonas
8.9 Protón 4 de antocianinas
12.0-14.0 Protón del hidroxilo 5 (hidroxilo peri)
Las antocianinas se pueden reconocer en sus espectros RMN-1H por la señal alrededor de δ
9 (s, H-4) y las señales características de otros protones aromáticos como en los glicósidos
de la delfinidina.
Las flavanonas se reconocen por las señales dd en δ 5.4-6.0 (H-2, J=13 y 2-3 Hz), 3.1-3.3 (H-
3eq, J=13 y 17 Hz) y 2.7-2.8 (H-3ax, J=17 y 2-3 Hz).
Las isoflavanonas se pueden reconocer por RMN-1H por las señales: δ 4.6 (H-2a, dt), 4.5 (H-
2b, dd) y 4.3 (H-3, dd).
Los protones de los grupos hidroxilos generalmente no se observan en los espectros cuando
estos se determinan en solventes próticos, pero algunas veces se observa la señal del
hidroxilo en C-5, entre 12.0 y 14.0 ppm, en forma de un singlete ancho.
138
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En el espectro de RMN-13C se pueden reconocer varios tipos de carbonos, en la Tabla 4 se
presentan los rangos de desplazamiento químico para varios de ellos.
Tabla 4. Desplazamientos químicos de varios tipos de carbonos de flavonoides.
(ppm) Tipos de carbonos
18 C-6 de ramnosa
30 C-4 de flavan-3-oles
42-46 C-3 de flavanonas
56-61 Metoxilos
60-80 C-OH de carbohidratos
70-75 C-3 de flavanonoles
80 C-2 de flavanonas
85 C-2 de flavanonoles
100-115 C-3 de flavonas, C-1 de carbohidratos, C-10 de
flavonas 5-hidroxiladas
115-128 C aromáticos con H
130-140 C aromáticos sulfatados
145 C-3 de flavonoles, C-5 de flavonas 5-hidroxiladas, C-3 y C-4 de antocianinas
150-165 C aromáticos hidroxilados y metoxilados, C-1a de flavonas,
C-2 de antocianinas, C-2 de flavonas, C-4' oxigenado,
C-9 de flavonas
175-178 carbonilo C-4 sin OH en C-5 en flavonas, C-4 de flavonoles
182 carbonilo C-4 con OH en C-5 de flavonas
190-196 carbonilo C-4 de flavanonas
197-200 carbonilo C-4 de flavanonoles
139
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Es posible también diferenciar entre un C-glicósido flavonoide y un O-glicósido flavonoide.
En los O-glicósidos, el C-1 resuena alrededor de 100 ppm para los carbohidratos más
comunes, mientras que en los C-glicósidos resuena alrededor de 75 ppm.
A manera de ejemplo, y con el fin de ilustrar la utilidad de la RMN y herramientas
informáticas disponibles para la asignación estructural de flavonoides, a continuación, se
comparan los espectros RMN reportado y calculado para la quercetina.
La Tabla 5, presenta los desplazamientos químicos y las multiplicidades de las señales de
protones y carbonos de la quercetina. Los valores calculados se obtuvieron al utilizar la
herramienta en línea de la página http://www.nmrdb.org
Tabla 5. Señales de protones y carbonos observadas en espectros de RMN-1H y RMN-13C, reportadas
y calculadas para la quercetina. *La herramienta en línea predice dd, debido a los acoplamientos
meta y para, este último a nivel práctico no se observa generalmente.
C/H Señales de protones, reportadas
Señales de protones, calculadas
Señales de carbonos reportadas
Señales de carbonos, calculadas
2 - - 156.8 144.2
3 - - 135.8 136.8
4 - - 175.9 175.0
5 - - 161.1 161.8
6 6.21, d, J = 2.0 Hz 6.27, d, J = 1.9 Hz 97.8 97.8
7 - - 164.2 164.6
8 6.41, d, J = 2.0 Hz 6.44, d, J = 1.9 Hz 93.0 94.7
9 - - 147.4 157.1
10 - - 103.1 105.1
1’ - - 122.7 123.8
2’ 7.76, d, J = 2.2 Hz 7.40, d, J = 1.8 Hz* 114.8 115.7
3’ - - 144.8 145.6
4’ - - 146.6 146.6
5’ 6.91, d, J = 8.5 Hz 6.74, d, J = 8.4 Hz* 114.6 115.9
6’ 7.66, dd, J = 2.2 y 8.5 Hz 7.69, dd, J = 1.8 y 8.4 Hz 120.2 122.6
140
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Espectrometría de masas
La espectrometría de masas, acoplada a técnicas de separación como HPLC, es una
combinación de técnicas muy utilizada para la separación e identificación de flavonoides y
en general de metabolitos secundarios en muestras vegetales. A continuación, se mencionan
algunos elementos de la espectrometría de masas clásica de agliconas.
Las agliconas flavonoides presentan fragmentos característicos en su espectro de masas de
impacto electrónico IE. Por ejemplo, las flavonas y flavonoles presentan generalmente los
fragmentos M+., [M-H]+, y [M-CO]+. uno o varios de los fragmentos A1+., [A1+H]+, B1
+. y B2+ los
que se originan por rompimientos Retro-Diels-Alder, como lo ilustra la figura 2.39.
Figura 2.39. Esquema general de la fragmentación por espectrometría de masas clásica de flavonas y flavonoles.
Las flavonas e isoflavonas generalmente muestran los fragmentos A1+., [A1+H]+, B1
+. y B2+. Los
flavonoles muestran [A1+H]+ y B2+; además el fragmento [M-CHO]+. Las 3-metoxiflavonas
muestran A1+., [A1+H]+ y B1
+.. Además, se observa el fragmento [M-CO-Me]+.
Las flavanonas muestran A1+., [A1+H]+, [B1+2H]+. y los fragmentos [M-anillo B]+ y B3
+.,
formados mediante esquemas como se ilustra en la figura 2.40.
141
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O
OR5
R7
R4'
M+.
O
R5
R7
OH
[M-B]+
R4'
B3+.
Figura 2.40. Esquema para la formación de fragmentos característicos en espectrometría de masas de impacto electrónico de flavanonas.
Los flavanonoles muestran A1+. y los fragmentos mostrados en la figura 2.41.
O
OR5
R7
R4'
OH
M+.
R4'
OH
R4'
OH
+CH2
R4'
B4+. B5+. B6+
Figura 2.41. Esquema para la formación de fragmentos característicos en espectromtría de masas de
flavanonoles.
Las chalconas tienden a producir fragmentos originados por ruptura a cada lado del
carbonilo. La figura 2.42 esquematiza el proceso de fragmentación y formación de algunos
iones observados.
142
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OR5
R7
R4'
R5
R7
R4'
[M-28]+.
OR5
R7
R5
R7
A2+ [A2-28]+
O
R4'
R4'
B7+.
[B7-28]+.
Figura 2.42. Esquema para la formación de fragmentos característicos en espectrometría de masas de chalconas.
Las 2'-hidroxichalconas pueden isomerizarse a flavanonas y generar los fragmentos
característicos de estas.
En general las agliconas flavonoides con uno o varios grupos metoxilo presentan el
fragmento [M-Me]+, el cual es especialmente intenso en flavonoides 6- y 8-metoxilados.
En los flavonoides 2'-hidroxilados también se aprecia a veces el fragmento [M-OH]+, mientras
que los 2'-metoxilados presentan el fragmento [M-OMe]+.
El fragmento [M-agua]+ es común en flavonoles, flavan-3,4-dioles y C-glicósidos.
El fragmento [M-55]+ o [M-56]+. indica la presencia de un sustituyente isopentenilo.
143
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Es importante anotar que algunos autores reportaron que es posible diferenciar 5-hidroxi-,
6,7-dimetoxi-, 7,8-dimetoxi-, 5,6,7-trimetoxi- o 5,7,8-trimetoxiflavonas con base en las
intensidades relativas de los iones M y M-15.
Como actualmente, se utilizan técnicas acopladas como HPLC y uHPLC con detectores de
masas, es interesante anotar como en estudios de fragmentaciones MS/MS fragmentos
como los descritos A1+., B1
+., y B2+, de flavonas y flavonoles, también se observan utilizando
espectrómetros de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS), como en el caso de la quercetina,
en la cual se observan los iones relacionados m/z 151, 149 y 137. La fragmentación por
espectrometría de masas tándem MS/MS ha sido descrita por diferentes autores.
La tabla 6 resume los fragmentos característicos en espectrometría de masas clásica de
agliconas de flavonas y flavonoles y su interpretación respecto al número de sustituyentes
hidroxilos y metoxilos en los anillos A y B:
Tabla 6. Valores m/z de fragmentos obtenidos a partir de rupturas de las moléculas de flavonas y flavonoles.
m/z Número de sustituyentes en el ANILLO A Número de sustituyentes en el ANILLO B
OH H OMe OH H OMe
105 - - - 0 5 0
120 0 4 0 - - -
121 0 4 0 1 4 0
135 - - - 0 4 1
136 1 3 0 - - -
137 1 3 0 2 3 0
150 0 3 1 - - -
151 0 3 1 1 3 1
152 2 2 0 - - -
153 2 2 0 3 2 0
165 - - - 0 3 2
166 1 2 1 - - -
167 1 2 1 2 2 1
168 3 1 0 - - -
169 3 1 0 4 1 0
144
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m/z Número de sustituyentes en el ANILLO A Número de sustituyentes en el ANILLO B
180 0 2 2 - - -
181 0 2 2 1 2 2
182 2 1 1 - - -
183 2 1 1 3 1 1
184 4 0 0 - - -
185 4 0 0 5 0 0
195 - - - 0 2 3
196 1 1 2 - - -
197 1 1 2 2 1 2
198 3 0 1 - - -
199 3 0 1 4 0 1
210 0 1 3 - - -
211 0 1 3 1 1 3
212 2 0 2 - - -
213 2 0 2 3 0 2
226 1 0 3 - - -
227 1 0 3 2 0 3
240 0 0 4 - - -
241 0 0 4 1 0 4
255 - - - 0 0 5
Para los glicósidos y flavonoides sulfatados, aunque inicialmente se obtenían los espectros
de masas a partir de sus derivados permetilados, y trimetilsililéteres, posteriormente se
utilizaron las técnicas de espectrometría de masas de ionización suave, particularmente la
denominada espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos, correspondiente
a la sigla inglesa FAB “fast atom bombardment”. El espectro de masas FAB permite reconocer
los flavonoides sulfatados ya que presentan además del ion pseudomolecular (M+H+ en
modo positivo, ó M-H- en modo negativo), pérdidas sucesivas de 80, 160, 240, etc. unidades
de masa debidas a la pérdida de 1, 2, 3 ó más grupos sulfato. Por ejemplo, la figura 2.43,
presenta la estructura de 3,3’-disulfato de gossipetina-7,8-dimetiléter. Se muestra el ion
145
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pseudomolecular m/z 505 (M-H) +, y los fragmentos m/z 425 y 345, correspondientes a las
pérdidas de una y dos unidades de sulfato, respectivamente. En la actualidad la técnica FAB
ha sido desplazada por la espectrometría de masas ESI.
O
O
O
O H
O
O M e
M e O
O M e
S O3
H
S O3
H
3,3'-disulfato de gossipetina-7,8-dimetiléter
Figura 2.43. Estructura química de un flavonoide sulfatado.
Para el caso de las agliconas flavonoides los espectros de masas ESI, presentan fragmentos
muy similares a los observados en los obtenidos en los espectros de impacto electrónico. En
modo negativo se aprecian los iones [M-H]-, y en modo positivo [M+H]+. La figura 2.44.
muestra un esquema que incluye los fragmentos que son característicos de la luteolina
(3’,4’,5,7-tetrahidroxiflavona) tanto en el espectro de masas de impacto electrónico IE como
en el espectro de masas ESI. Puede observarse que los tres fragmentos en la parte superior
corresponden a fragmentos del espectro de masas de impacto electrónico m/z 134 y 152,
que en el caso del espectro ESI se observan protonados, y corresponden en este caso a m/z
135 y 153.
146
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O
O
OH
OH
OH
HO
O
O
HO
OH
OH
OH
O
OH
OH
A1+.
m/z 152
IE IE
B1+.
m/z 134
B2+
m/z 137
IE
OH+
O
HO
OH
m/z 153
ESI
[A1+.] + H+
OH
OH
ESI
[B1+.] + H+
m/z 135
O
OH
OH
B2+
m/z 137
ESI
Figura 2.44. Esquema que muestra los fragmentos A1+., B1
+. y B2+, característicos de la luteolina, una
aglicona flavonoide, en espectrometría de masas de impacto electrónico (arriba) y espectrometría de masas ESI (abajo).
El espectro ESI MS/MS del kaemferol, muestra de manera similar los iones m/z 287 [M+H]+,
153 [A1+.+H]+ y 121 [B2+H]+.
En el caso de los espectros de masas ESI de glicósidos, estos ya permiten reconocer
compuestos tales como C-glicósidos, por fragmentos característicos como la pérdida de
C4H8O4 (120 Da). Además, estos espectros ESI, muestran fragmentos de los O-glicósidos
flavonoides como son las pérdidas de una o más unidades de carbohidratos ligados. Por
ejemplo, el espectro de masas de la hesperidina muestra un pico ión cuasimolecular m/z 611
y los fragmentos m/z 465 [M+H−146] y 303 [M+H−308]+ por la pérdida de una unidad de
ramnosa (146 Da) y una de rutinosa (308 Da) respectivamente. El espectro de masas ESI de
la flavanona isosakuranetina-7-O-apiósido, muestra el ión cuasimolecular m/z 581 (M + H+)
y los fragmentos m/z 449 (M – pentosa), 419 (M – hexosa) y 287 (M – pentosa – hexosa).
147
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Cuando se utilizan otras técnicas de ionización como la ionización química a presión
atmosférica APICMS, junto con técnicas de separación HPLC y espectrometría de masas
tándem MS/MS, se obtienen los iones [M- H]+, y [M – azúcar – agua – H]+. Por ejemplo, para
la miricetina-3-O-galactósido, se obtienen los iones m/z 479 y 317, correspondientes a los
iones [M-H]+ y el peso de la correspondiente aglicona [M – galactosa – agua – H]+. Para la
quercetina-3-glucósido, se observan los iones m/z 463 y 301, correspondientes a los iones
[M-H]+ y el peso de la correspondiente aglicona [M – glucosa – agua – H]+.
Para el caso de las antocianinas, la técnica ESI-MS/MS, permite también no solo la
determinación del peso molecular sino la determinación de los carbohidratos ligados. Por
ejemplo, en el espectro ESI-MS/MS de delfinidina-3-O-(2-O-glucopiranósil-
arabinopiranósido), se observan el ión cuasimolecular m/z 599.1199 y el ion m/z 303.0431,
correspondiente al peso de la sola aglicona. Además, estas modernas técnicas de
espectrometría de masas permiten el análisis más rápido de las antocianinas en muestras
vegetales.
Hidrólisis ácida y alcalina
Los O-glicósidos flavonoides se pueden hidrolizar en presencia de ácidos para liberar los
carbohidratos ligados y la correspondiente aglicona flavonoide. En general se utiliza HCl 2N:
metanol 1:1 reflujando durante 1 hora. Los O-glucurónidos flavonoides requieren
condiciones más fuertes para su hidrólisis y ésta se realiza con HCl 2N reflujando a 100°C
durante 2 horas. Los C-glicósidos no se hidrolizan en estas condiciones, pero pueden sufrir
el reordenamiento de Wessley-Moser, como en el caso de la vitexina.
En condiciones alcalinas fuertes (p. ej. reflujo con NaOH 2N, 100°C, 1 hora) el núcleo
flavonoide se rompe por el anillo central, liberando sustancias de menor peso molecular.
Relaciones Estructura-Actividad Biológica
Las diferentes actividades biológicas reportadas para las diferentes clases de flavonoides son
tema de revisión permanente por diferentes autores. La presencia o ausencia de algunas
características químicas determina la mayor o menor actividad biológica. De los estudios in
vitro, se resume que en general, el enlace doble C=C entre los carbonos 2 y 3, el carbonilo en
C-4 y los grupos hidroxilos en 3’ y 4’ (grupo catecol); son muy importantes para las
actividades antiviral, antibacteriana, antioxidante, anti cáncer, antinflamatoria, anti
diabética, cardio protectora, anti neuropatológica, inhibidora de enzimas, etc. Otras
características como la presencia de grupos metoxilos, la presencia de carbohidratos ligados
y el número de hidroxilos presentan resultados variables en cuanto a las actividades
biológicas mencionadas, especialmente la glicosilación, la cual lleva a la disminución de varias
de estas actividades biológicas.
148
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La presencia de grupos hidroxilos en C-5, C-7 muestra relación con la actividad inhibidora de
enzimas como la carbonil reductasa-1 CBR1; que es un inconveniente en la quimioterapia del
cáncer; contra la glutaminil ciclasa QC, importante en la patogénesis de la enfermedad de
Alzheimer; y sobre peroxidasa, lo cual puede ser útil para enfermedades asociadas a la
glándula tiroides.
Por otro lado, la presencia de grupos hidroxilos en C-3 y C-3’ se ha asociado a la actividad
cardíaca de algunos flavonoides como quercetina y fisetina.
Varios autores mencionan la presencia del sistema 4-cromenona (también denominado 4-
benzopirona), como una característica común importante de no solo varios flavonoides, sino
otros compuestos naturales, con actividad anti cáncer.
Para el caso particular de la actividad antioxidante, en la literatura científica se encuentran
gran cantidad de procedimientos para medir esta actividad no solo en los flavonoides o las
muestras que los contengan, sino para muchos otros compuestos naturales. No obstante, un
ensayo inicial que sirve de indicio de la actividad antioxidante es el ensayo con el reactivo
comúnmente denominado DPPH, que es la abreviatura del nombre inglés del 2,2-difenil-1-
picrilhidrazilo. Este reactivo de color violáceo en solución alcohólica, cuando se pone en
contacto con sustancias que captan radicales libres, se reduce y cambia a una coloración
amarilla en solución. Por lo tanto, los cambios de la absorbancia pueden medirse con un
espectrofotómetro UV-visible, y se puede determinar la mayor o menor actividad captadora
de radicales libres, de extractos o sustancias de origen natural. La quercetina se utiliza
generalmente como control positivo. La solución de DPPH se obtiene disolviendo 4 mg de
DPPH en 50 ml de metanol. Se puede realizar un ensayo cualitativo, simplemente analizando
las muestras por cromatografía en capa fina. Luego del desarrollo cromatográfico, se elimina
la fase móvil, y se rocían las placas con la solución de DPPH al 0.1 % p/v en metanol en la
oscuridad. Se dejan reposar durante 5 minutos, luego de lo cual las manchas de los
componentes activos se observan de color blanco o amarillento, sobre un fondo de color
violeta.
Para el ensayo cuantitativo, se prepara una solución patrón de los extractos crudos en
metanol, a una concentración de 10 mg/mL. A partir de esta solución se preparan diluciones
hasta obtener soluciones de concentraciones 5x10-2, 5x10-3, 5x10-4, 5x10-5, 5x10-6, 5x10-7,
5x10-8, 5x10-9, 5x10-10 mg/mL. Las muestras y el estándar de referencia se preparan a una
concentración de 10 mg/mL. 1.00 mL de cada muestra y solución estándar diluida, se mezcla
con 1.00 ml de solución de DPPH, y se deja actuar durante 30 minutos. La absorbancia UV-
visible de estas soluciones se lee a 517 nm.
149
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Metabolismo
Aunque aún existen muy pocos estudios sobre el metabolismo en humanos de los
flavonoides, se encuentran algunos reportes de estudios in vivo relacionados con el consumo
de jugos de cítricos en Estados Unidos, Australia, Brasil y China. En este último caso se
observa que después de 4-12 horas de su consumo, los flavonoides como hesperetina y
naringenina se metabolizan en cerca de un 80%, y en la orina se observan unos 35
catabolitos. El estudio Blue Mountains Eye, realizado durante 14 años con la participación de
2349 personas, demuestra que el consumo moderado a alto de flavonoides naturales en la
dieta, es benéfico para la salud.
Drogas aceptadas en Colombia y otras plantas que contienen flavonoides
La legislación colombiana, a través del Instituto para la Vigilancia de Medicamentos y
Alimentos, Invima, tiene establecido un listado de plantas medicinales aceptadas con fines
terapéuticos. Este listado el cual es revisado periódicamente contiene una gran cantidad de
plantas, que actualmente se saben que contienen dentro de sus metabolitos secundarios, a
los flavonoides. A continuación, y a manera de ejemplo se citan solo algunas de ellas, y se
mencionan otras que no están incluidas en el listado.
Abedul. Las hojas de Betula sp. (Betuláceas) contienen glicósidos de quercetina y miricetina.
Acacia. Las flores de Robinia pseudoacacia (Fabáceas) contienen robinina.
Árnica. Las flores de Arnica montana (asteráceas) contienen quercetina-3-O-glucósido,
luteolina-7-O-glucósido y kaemferol-3-O-glucósido entre otros. Esta droga es de venta libre
en Colombia y se usa como antiinflamatorio y analgésico de uso externo.
Bastoncillo dorado. Solidago virgaurea (Asteráceas) contiene glicósidos de quercetina y
kaemferol.
Bodas de Plata. Corresponde a la Potentilla anserina (Rosáceas) que contiene glicósidos de
quercetina y miricetina.
Cactus. Las flores de Cereus grandiflorus (Cactáceas) contienen glicósidos de iso-ramnetina
y rutina.
Caléndula. Las flores de Calendula officinalis (Asteráceas) contienen glicósidos de iso-
ramnetina y quercetina. En Colombia fue aprobada por el Ministerio de Salud para su uso
medicinal como antiinflamatorio. El extracto alcohólico mostró efecto positivo en el
tratamiento de úlceras varicosas y lesiones en la piel.
Cardo mariano. Los frutos de Sylibum marianum (Asteráceas) contienen flavolignanos,
silibina, silicristina, silidianina, silimarina, etc. La silimarina es hepatoprotector y se utiliza en
150
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el tratamiento de trastornos digestivos funcionales. En Colombia está aprobado como
coadyuvante en cuadros de hepatotoxicidad e insuficiencia hepatobiliar.
Cidra (cáscara). El pericarpio del fruto de Citrus medica (Rutáceas) contiene eriocitrina,
rutina, etc.
Cola de caballo. Las partes aéreas de Equisetum arvense (Equisetáceas) contienen glicósidos
de luteolina, isoquercitrina y equisetrina. En Colombia están aprobadas las especies
Equisetum bogotense y Equisetum giganteum L. para uso como diuréticos.
Endrino. Las flores de Prunus spinosa (Rosáceas) contienen glicósidos de quercetina y
kaemferol.
Espino. La droga la constituyen las hojas, flores y frutos de Crataegus sp. (Rosáceas).
Contiene glicósidos de quercetina y apigenina.
Herniaria. Herniaria sp. (Cariofiláceas) contiene rutina y narcisina.
Infusión madre. Leonorus cardiaca (Lamiáceas) contiene rutina.
Lespedeza. Corresponde a Lespedeza capitata (Leguminosas). El extracto alcohólico se usa
como estimulante de la eliminación renal.
Limón (cáscara). Además del aceite esencial, el cual ha sido utilizado en la elaboración de
diferentes fragancias y saborizantes, el pericarpio del fruto de Citrus limon (Rutáceas)
contiene hesperidósido el cual se utiliza en el tratamiento de hemorroides.
Manzanilla Romana. Las flores de Anthemis nobilis (Asteráceas) contienen apigenina-7-O-
glucósido y luteolina-7-O-glucósido.
Manzanilla. Las flores de Matricaria chamomilla (Asteráceas) contienen quercimeritrina,
glicósidos de apigenina, luteolina y patuletina. Esta es una planta medicinal aprobada en
Colombia y se usa para trastornos digestivos y en el tratamiento de inflamaciones e
irritaciones de la piel y las mucosas.
Naranja amarga. El pericarpio del fruto de Citrus aurantium (Rutáceas) contiene eriocitrina,
rutina, naringenina, naringina, etc.
Nogal. Las hojas de Juglans regia (Juglandáceas) contienen hiperósido y otros glicósidos
flavonoides. En Colombia está aprobada Juglans cinerea (nogal blanco), cuyas hojas se usan
como antidiarréico.
Ortosifonis. Las hojas de Orthosiphon spicatus (Lamiáceas) contienen sinensetina,
escutelareína y eupatorina.
Pensamiento. Corresponde a Viola tricolor (Violáceas). Contiene glicósidos de quercetina. Es
una planta medicinal aceptada en Colombia. Sus hojas y flores se usan como antitusivo.
151
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Pie de gato. Las flores de Helichrysum arenarium (Asteráceas) contienen glicósidos de
naringenina, kaemferol, apigenina y luteolina.
Primavera. Las flores de Primula sp. (Primuláceas) contienen glicósidos de quercetina,
gossipetina y kaemferol.
Pycnogenol®. El pycnogenol es un extracto de la corteza del pino marino francés Pinus
maritima Lamk. (Pináceas), que contiene bioflavonoides, catequina, ácidos fenólicos y
procianidinas (también denominadas leucoantocianidinas). Entre sus efectos están la
inhibición de la agregación plaquetaria y la inhibición de formación de trombos. Es
comparativamente más activo contra los radicales libres, que el té verde y el gingko. Existen
estudios sobre su acción benéfica en pacientes con insuficiencia venosa crónica, con
manifestaciones como las venas várices.
Reina de los prados. Las flores de Filipendula ulmaria (Rosáceas) contienen espiracósido,
hiperósido y avicularina.
Retama. Sarothamnus scoparius (Fabáceas) contiene escoparina y vitexina.
Ruda. Ruta graveolens (Rutáceas) contiene rutina. En Colombia está aprobado el uso de las
partes aéreas como emenagogo.
Sauco. Las flores de Sambucus niger (Caprifoliáceas) contienen glicósidos de quercetina,
rutina, hiperósido, etc. En Colombia se usan flores y frutos maduros como expectorante. Las
hojas como laxante y coadyuvante en el tratamiento de estreñimiento.
Sofora. Las yemas de Sophora japonica (Fabáceas) contienen rutina (ca. 20%).
Tilo. Las flores de Tilia sp. (Tiliáceas) contienen glicósidos de quercetina, kaemferol y
miricetina.
Trigo sarraceno. Las flores de Fagopyrum sculentum (Poligonáceas) están aprobadas en
Colombia y se usan contra la fragilidad capilar.
Tusílago. Las flores de Tussilago farfara (Asteráceas) contienen glicósidos de quercetina.
Verónica. Veronica officinalis (Escrofulariáceas) contiene luteolina-7-O-glucósido y rutina.
Yerbasanta. Corresponde a Eriodictyon glutinosum (Hidrofiláceas). Contiene homoeridictiol,
eriodictiol, etc.
Fuentes de antocianinas
Las antocianinas debido a sus propiedades como verdaderos pigmentos vegetales y a que
son fácilmente degradados en el intestino, se utilizan principalmente como colorantes de
medicamentos y alimentos. Se extraen de plantas comestibles como las uvas negras (Vitis
vinifera, ampelidáceas), la mora, la fresa, el repollo morado, el pericarpio del rábano rojo, el
152
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grosellero negro (Ribes nigrum, saxifragáceras), etc. Las antocianinas de los frutos y hojas del
arándano, Vaccinium myrtillus L., ericáceas, presentan propiedades vasoprotectoras y contra
desórdenes oftalmológicos, y se comercializa el extracto con el nombre de Myrtocyan®.
Problemas
1. Del extracto metanólico de la planta entera Polanisia dodecandra, se aisló por
métodos cromatográficos una sustancia con actividad antimitótica potente y con las
siguientes características:
Prismas amarillos P.F. 176-7°C
UV (MeOH): 257, 278, 345 nm
UV (MeOH+NaOMe): 280, 396 nm
EMIE: 404.1110 (74%), 389 (100), 371 (8), 359 (10), 331 (12), 303 (8), 275 (9), 211 (14), 202
(8), 183 (13), 164 (10), 151 (17), 123 (5).
RMN-1H (CDCl3, 300 MHz) ⸹ 3.88 (s, 3H), 3.95 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 4.11 (s, 3H),
7.00 (d, 1H, J=7.0 Hz), 7.77 (d, 1H, J=2.2 Hz), 7.78 (dd, 1H, J=2.2 y 7.0 Hz), 12.40 9s, 1H).
RMN-13C (CDCl3, 75 MHz): 56.1, 60.1, 61.2, 61.7, 62.1, 107.5, 110.5, 114.6, 121.6, 123.7,
132.9, 136.2, 138.9, 144.9, 145.6, 149.0, 149.1, 152.9, 155.8, 179.4 ppm.
Determine la estructura más probable para esta sustancia. Simule sus espectros RMN y
compárelos. Compare la potencial actividad antioxidante de esta sustancia y la de la
quercetina.
2. De la fracción soluble en n-butanol del extracto metanólico de las partes aéreas de
Lysionotus pauciflorus (Gesneriáceas) se aisló la nevadensina una sustancia que ha
sido reportada como poseedora de actividad antiinflamatoria e hipotensora. Sus
características son las siguientes:
P.F. 198-199°C
UV(metanol): 283, 330 nm
UV (AlCl3): 210, 352 nm
UV (AlCl3/HCl): 308, 351 nm
UV (NaOAc): 283, 273 nm
UV (H3BO3/NaOAc): 283, 321 nm
153
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EMIE: m/z 344, 329, 277, 197, 169, 133
RMN-1H (CDCl3, 360 MHz) ⸹ 3.90 (s, 3H), 4.02 (s, 3H), 4.04 (s, 3H), 6.59 (s, 1H), 7.03 (2H, d,
J=8.9 Hz), 7.89 (2H, d, J=8.9 Hz), 11.82 (s, 1H).
RMN-13C (CDCl3, 90 MHz) 55.6, 60.2, 61.2, 103.0, 103.1, 114.7, 123.0, 128.0, 128.2, 131.6,
145.4, 148.4, 150.9, 162.4, 163.1, 182.3 ppm.
Determine la estructura más probable y el nombre sistemático de esta sustancia. Compare
su potencial actividad anttinflamatoria con la del kaempferol.
3. Una sustancia vegetal presenta las siguientes características espectrales:
Espectro de masas de impacto electrónico:
m/z = 300 (100%), 299 (12), 272 (4), 257 (10), 155 (3), 121 (13), 93 (4).
Espectro de RMN-1H (60 MHz, CCl4): 3.83 (3H, s); 6.18 (d, 1H, J=2 Hz); 6.47 (d, 1H, J=2 Hz);
6.85 (d, 2H, J=8 Hz), 8.00 (d, 2H, J=8 Hz).
Espectros UV: MeOH: 366, 266 nm; NaOMe: 418 nm (desc.); AlCl3: 423, 270 nm; AlCl3/HCl:
426, 267 nm; NaOAc: 369, 265 nm; H3BO3/NaOAc: 366, 265 nm
Determine la estructura más probable para esta sustancia, asigne las señales de RMN y el
correspondiente nombre sistemático. Simule su espectro RMN y compare con el dado en el
problema.
4. Una sustancia vegetal presenta las siguientes características espectrales:
Espectro de masas de impacto electrónico: m/z = 316 (100%), 301 (24), 288 (19), 285 (27),
273 (28), 271 (28), 166 (5), 137 (15), 109 (11).
Espectro de RMN-1H (60 MHz, DMSO-d6): 3.90 (3H, s); 6.33 (d, 1H, J=2 Hz); 6.65 (d, 1H, J=2
Hz), 6.85 (d, 1H, J=8 Hz); 7.62 (dd, 1H, J=8 y 2 Hz); 7.58 (d, 1H, J=2 Hz); 12.45 (s, 1H).
Espectros UV: MeOH: 372, 255 nm; NaOMe: 418, 294 nm; AlCl3: 455, 275 nm; AlCl3/HCl:
425, 268 nm; H3BO3/NaOAc: 386, 259 nm
Determine la estructura más probable para esta sustancia, asigne las señales de RMN y el
correspondiente nombre sistemático. Compare su actividad anticáncer de seno potencial
contra la fisetina.
154
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5. Del extracto de la corteza de Colebrookea oppositifolia (Labiadas), usada en China
para el tratamiento de fracturas, heridas y artritis reumatoide, se aislaron dos
compuestos con las siguientes características:
Compuesto A:
Polvo amarillo, []D25 = -27° (DMSO, c 0.48).
IR (KBr): 3270, 1650, 1600, 1580, 1485, 1441, 1350, 1290, 1196, 1112, 1065, 1045, 840, 800,
765, 680 cm-1.
EM-FAB: m/z 447 [M+H].
EMIE: m/z 284 (100), 266 (41), 238 (44), 181 (15), 153 (35), 139 (32), 102 (48).
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): 12.89 (s, 1H), 8.10 (2H, dd, J=7.6 y 1.6 Hz), 7.60 (3H, m),
6.98 (1H, s), 7.03 (1H, s), 5.05 (1H, d, J=7.6 Hz), 3.90 (s, 3H).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6): 56.56, 60.91, 69.95, 74.13, 76.54, 77.21, 91.77, 102.05,
104.93, 105.16, 126.35 (dos carbonos), 128.31, 129.05 (dos carbonos), 130.62, 132.01,
151.60, 152.75, 158.99, 163.39, 182.31 ppm.
Compuesto B:
Polvo amarillo, []D25 = -48° (DMSO, c 0.36).
IR (KBr): 3430-3240, 1650, 1610, 1560, 1500, 1442, 1350, 1280, 1240, 1162, 1075, 1040,
850, 830, 751, 740 cm-1.
EM-FAB: m/z 432 [M+].
EMIE: m/z 432, 280, 270, 242, 152, 124, 118.
RMN-1H (400 MHz, DMSO-d6): 12.88 (s, 1H), 7.87 (1H, d, J=8.1 Hz), 7.53 (1H, dd, J=8.4 y
7.4 Hz), 7.33 (1H, d, J=8.4 Hz), 7.20 (1H, dd, J=7.5 y 7.8 Hz), 7.00 (1H, s), 6.45 (1H, s), 6.20
(1H, s), 5.10 (1H, d, J=8 Hz).
RMN-13C (100 MHz, DMSO-d6): 60.63, 69.62, 73.28, 76.73, 77.12, 93.69, 98.76, 100.26,
103.77, 110.19, 115.53, 120.32, 121.91, 129.00, 132.73, 155.35, 157.64, 160.76, 161.36,
164.30, 181.79 ppm.
Determine las estructuras más probables para estas dos sustancias. Asígneles el nombre
sistemático y compare su potencial actividad antioxidante.
155
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6. Prediga, simule y compare los espectros RMN-1H de los siguientes compuestos: ácido
gálico, ácido elágico, ácido clorogénico, ácido 3,4-dihidroxibenzoico, vainillina,
anetol, podofilotoxina, 3,5,7,3’,4’-pentehidroxiflavona, 3,5,7,3’,4’-
pentametoxiflavona, 4,5,7-trihidroxi-2-metilantraquinona, 4,5,7-trimetoxi-2-
metilantraquinona.
Cannabis
La marihuana corresponde a la especie vegetal Cannabis sativa. El uso terapéutico de esta
planta se ha incrementado recientemente, y a diferencia de muchos medicamentos actuales
no surgió de un desarrollo científico, sino que es usado por muchas personas con propósitos
recreativos, en vaporizaciones, en tés, e inclusive en galletas y otros alimentos.
Se tienen registros físicos del uso de la marihuana desde el año 2727 AC, en ellos se describe
su uso psicoactivo y medicinal. Fue utilizada durante muchos años en Asia y Europa, y fue
traída a América en 1619 para uso en la industria textil. A principios del siglo 19, era común
encontrar en las farmacias norteamericanas las tinturas de marihuana, y en la farmacopea
americana se describía su uso contra la migraña, la depresión y el dolor; pero en 1937 se
prohibió su venta y uso en los Estados Unidos. En 1970 se incluyó en la lista de sustancias
controladas del Departamento de Control de Drogas y Estupefacientes de los Estados Unidos
(DEA), por considerarla una sustancia altamente peligrosa y muy adictiva. En 1996 el estado
de California fue el primero en legalizar el uso de la marihuana para fines medicinales.
Dentro de las casi 500 sustancias reportadas en la droga (incluyendo terpenos, aminoácidos,
ácidos grasos, hidrocarburos, flavonoides, carbohidratos, etc.); están unos 70 compuestos
C21 que son a la vez terpenos y compuestos fenólicos denominados canabinoides. Los más
conocidos y estudiados, son los compuestos tetrahidrocannabinol THC, el cual es un
compuesto psicoactivo, y el cannabidiol CBD, al cual se le atribuyen propiedades benéficas
para la salud. El contenido de THC se utiliza para clasificar las plantas de marihuana en dos
variedades: como droga y como planta fibrosa. Si el contenido de THC es menor del 0.2% se
la considera como variedad fibrosa, y si es mayor se la considera variedad como droga.
Es interesante anotar que a pesar de que ya se vende comercialmente una versión sintética
del tetrahidrocannabinol THC, esta presenta mayores efectos colaterales indeseables, que el
obtenido por extracción de la planta. La droga es usada para reducir el vómito en los
tratamientos de quimioterapia del cáncer, para mejorar el apetito en personas con sida, para
el tratamiento del dolor crónico, contra la epilepsia y para los espasmos musculares.
Los cannabinoides se extraen a partir de la droga con diferentes solventes que incluyen el
alcohol (metanol o etanol), cloroformo, butano, hexano, etc.; pero más recientemente se
utilizan métodos como la extracción con fluidos supercríticos con dióxido de carbono y
etanol, con rendimientos hasta del 92%. También con solventes eutécticos (DES), se
156
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encuentra que la mezcla 1:1 de cloruro de colina y tartrato de dietilo se obtienen buenos
rendimientos para la extracción del CBD, con condiciones de temperatura de extracción de
48°C y tiempo de extracción de 55 minutos. Siendo esta última técnica recomendable por los
beneficios en cuanto a rendimiento, los costos bajos y la poca contaminación ambiental, que
se generan.
Los cannabinoides se pueden analizar mediante técnicas como la cromatogafía de gases y
HPLC acopladas a espectrometría de masas.
Para los análisis mediante la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, se
preparan los derivados trimetilsililados (TMS). En el caso de algunos canabinoides que
contienen el grupo carboxilo, los espectros de masas de los derivados trimetilsililados
presentan fragmantaciones características. Por ejemplo, el espectro de masas del derivado
TMS del ácido cannabigerólico (CBGA), muestra los iones m/z 576 (M+.), 561 (M+. – metilo,
muy intenso), 486 (M+. – TMSO), 453 (M+. – 123), 417 (M+. – 159), 147, 73 (TMS+), entre otros.
El espectro de masas del derivado TMS del ácido tetrahidrocannabinólico (THCA) muestra
los iones m/z 502 (M+.), 487 (M+. – metilo, muy intenso), 413 (M+. – TMSO), 147, 73 (TMS+).
La figura 2.45. esquematiza la formación de algunos de estos iones.
OSi
OSi
O
Si
O
CBGA
- Metilo
m/z 576
m/z 561
- TMSOH
m/z 486
Si
OSi
OSi
+CH2
O
Si
O
m/z 453
m/z 73
O
CH2+
Si
OSi
O
Si
O
m/z 519
Figura 2.45. Esquema de la formación de algunos iones en espectrometría de masas de impacto electrónico del ácido cannabigerólico (CBGA).
157
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Mediante el uso de la técnica de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
de ionización electrónica, desarrollada recientemente, es posible obtener espectros de
masas bien definidos del cannabinol CBN, el cannabidiol y el tetrahidrocannabinol. También
se pueden analizar los canabinoides mediante HPLC con un detector de arreglo de diodos
Los espectros ultravioletas de compuestos con el cromóforo tipo meta-dihidroxibenceno,
como el cannabidiol, muestran máximos de absorción en 210, 230i, 275 nm. Mientras los
que tienen cromóforos tipo ácido 2,4-dihidroxibenzoico, como es el caso del ácido
cannabigerólico, muestran máximos de absorción alrededor de 225, 270 y 305 nm.
O
HOH
HOH
HO
H
Tetrahidrocannabinol (THC) Cannabidiol (CBD)
Desde el punto de vista biogenético, teniendo en cuenta la estructura química de estas
sustancias, se reconocen dos partes, a la izquierda se puede apreciar un monoterpeno, y la
parte derecha de la molécula es derivada de una cadena policetídica, lo que permite
establecer que se trata de sustancias originadas desde la acetilcoenzima-A, a través de dos
vías: la del ácido mevalónico y la de la malonilcoenzima-A a través de las cadenas
policetídicas. La figura 2.46, muestra un esquema propuesto para la biogénesis de ambos
compuestos.
158
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O
SCoA
AcetilCoA
O
SCoAHOOC
MalonilCoA
OPP
GeranilPP
COOH
O O
O
O
O
Cadena policetídica
Monoterpeno
COOH
O
O
O
O
THC, CBD, etc.
Figura 2.46. Esquema biogenético que explica la formación de los canabinoides a partir de acetilcoenzima-A.
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170
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Capítulo 3
Metabolitos secundarios no aromáticos
171
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Además de la gran cantidad y diversidad estructural encontrada en los metabolitos con
anillos aromáticos, presentes en las fuentes naturales hasta ahora estudiadas, existe otra
gran cantidad y diversidad estructural de metabolitos, que en su gran mayoría no contienen
anillos aromáticos. Estos incluyen un gran grupo de sustancias con un número de átomos de
carbono que generalmente es múltiplo de cinco, inicialmente llamadas isoprenoides, y
actualmente denominadas terpenoides y que van de sustancias de bajo peso molecular
como los monoterpenos presentes en diferentes aceites esenciales hasta polímeros de más
de 4.000 átomos de carbono, como el caucho. Además de las notables variaciones
estructurales, presentan propiedades que las hacen útiles como materias primas
fundamentales para muchos productos y procesos industriales, alimentarios y
farmacéuticos.
Los terpenoides incluyen sustancias que contienen 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, y un mayor
número de carbonos, pero el aprovechamiento para fines farmacéuticos y alimentarios,
actualmente está más relacionado a los que tienen 10, 15 y 30 átomos de carbono. Estos son
los monoterpenos, los sesquiterpenos y los triterpenoides. Los monoterpenos y
sesquiterpenos más conocidos son los presentes en los aceites esenciales y fragancias que
producen diferentes vegetales, y además de su uso cosmético tienen algunos usos
farmacéuticos. Los triterpenoides, incluyen una gran cantidad de sustancias importantes en
la industria farmacéutica como son los esteroides, y con nuevas perspectivas para el
desarrollo de nuevos productos contra el cáncer. Los de 25 átomos de carbono son
denominados sesterterpenoides, y se aislaron inicialmente de organismos marinos como las
esponjas. Los de 40 átomos de carbono incluyen un grupo interesante como son los
carotenoides, que cumplen papeles importantes para la salud. Sobre los mono- y
sesquiterpenos, se ampliará en el capítulo 5. A continuación se profundizará sobre varias
clases de esteroides naturales como son los esteroles, las saponinas esteroides, los
cardiotónicos, los carotenoides y los alcaloides esteroidales.
172
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Esteroles
Distribución y estado natural
Los esteroles se encuentran ampliamente distribuidos en los reinos animal y vegetal; y se les
encuentra en forma libre (También llamados agliconas esteroides), como ésteres o como
glicósidos. Todos contienen un núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno y presentan un
grupo hidroxilo en el carbono 3. La mayoría de esteroles naturales poseen una cadena lateral
de 8 a 10 átomos de carbono y un enlace doble en el C-5 (Figura 3.1).
HO
1
2
3
45
6
7
89
10
11
12
13
14 15
16
17
18
19
2021 22
23
24
25
26
27
Figura 3.1. Enumeración de los átomos de carbono en la molécula de colesterol.
En los animales superiores se encuentra principalmente el colesterol, el cual es un
constituyente importante de membranas y precursor de sustancias fisiológicamente
importantes (hormonas, ácidos biliares, vitaminas D, etc.).
En las plantas superiores se encuentran principalmente los denominados fitosteroles: -
sitosterol, campesterol y estigmasterol (Figura 3.2). Un esterol menos común es el
173
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fucosterol, el cual es el esteroide principal de muchas algas pardas y también se le ha
detectado en el coco (Cocus nucifera L.).
En los hongos y levaduras se encuentra principalmente el ergosterol, que, a diferencia de los
mencionados anteriormente, posee un grupo dieno conjugado, el cual determina muchas de
sus propiedades químicas y biológicas, muy especialmente su actividad como precursor de
vitaminas D, que son importantes en procesos tales como la calcificación de los huesos.
En cambio, los animales inferiores (Principalmente invertebrados marinos tales como
esponjas, estrellas, corales, etc.) y ciertas plantas filogenéticamente poco evolucionadas
(P.ej. algunas orquidáceas) contienen mezclas complejas de esteroles con modificaciones
estructurales variadas tales como núcleos sin el carbono 4 (A-nor-esteroles), sin el carbono
19 (19-Nor-esteroles), con varias insaturaciones; cadenas laterales con más de 10 carbonos,
con anillos ciclopropano, con enlaces alénicos, etc. En la Figura 3.2 se presentan algunos
ejemplos de los más comunes.
HO
R22
24
5
3
HO
22
24
5
37
R = H, Colesterol (mamíferos)R = Me, Campesterol (plantas superiores)R = Et, Sitosterol (plantas superiores)R = Et, insat. C-22, Estigmasterol (plantas superiores)R = Et, insat C-24, Fucosterol (algas)
Ergosterol (hongos y levaduras)
Figura 3.2. Estructuras básicas de algunos esteroles naturales.
Nomenclatura
Aunque a la mayoría de esteroles se les conoce por sus nombres vulgares (P.ej. colesterol,
estigmasterol, ß-sitosterol, brassicasterol, poriferasterol, etc.) se usa una forma más
sistemática para llamar a todas estas clases de sustancias. Para ello, se considera a la mayoría
de esteroles relacionados con la estructura del colestano (Figura 3.3).
174
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35
6
7
18
19
21 22 24
25
26
27
Figura 3.3. Estructura química del núcleo esteroidal tipo colestano.
A continuación de dan algunas instrucciones para asignar el nombre sistemático de esteroles
comunes. No se toman en cuenta aquí, aspectos como la fusión de los anillos en el núcleo
esteroidal.
El nombre sistemático consta de cuatro partes:
-el esqueleto básico
-la posición de las insaturaciones
-la posición del grupo hidroxilo
-la estereoquímica
Por ejemplo, veamos el nombre sistemático del colesterol (Figura 3.2). Su estructura química
incluye:
• El esqueleto básico es el del colestano, entonces: COLEST-
• Tiene un enlace doble sobre el carbono 5, entonces: 5-én-
• Tiene un grupo hidroxilo sobre el carbono 3, entonces: 3-OL
Y por lo tanto el nombre correcto es: Colest-5-én-3-ol
• Cuando el esterol posee más de un enlace doble se escribe COLESTA en vez de
COLEST.
• Cuando posee dos o más enlaces dobles se nombra respectivamente: dién, trién,
tetraén, etc.
175
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• Cuando posee 2, 3, 4, etc. grupos hidroxilos se nombra respectivamente: diol, triol,
tetraol, etc.
• Cuando posee sustituyentes, estos se nombran como prefijo del esqueleto básico,
p.ej. para el Campesterol (figura 3.2), el nombre inicia con 24-metilcolest; para el
Sitosterol el nombre inicia con 24-etilcolest, etc.
A manera de ejemplo el nombre para el ergosterol es: 24-Metilcolesta-5,7,22-trién-3-ol.
Los esteroles que poseen un anillo contraído, por ejemplo, algunos esteroles marinos en los
cuales el anillo A es de 5 carbonos, se les denomina nor-esteroles, por ejemplo: A-
norcolesterol. Los que poseen un anillo expandido se les denomina homo-esteroles. Los
esteroles con un enlace roto o ausente en alguno de los anillos se los denomina seco-
esteroles.
Es importante tener en cuenta que, debido a su estructura, los esteroides naturales
presentan varios carbonos quirales, que definen su estereoquímica. Para lograr esto, basta
con añadir luego del número correspondiente las letras R, S, E, Z, ó ß, según se trate de
epímeros R o S, isómeros E o Z o configuraciones ó ß, respectivamente. Generalmente, los
esteroles naturales poseen la configuración 3ß-hidroxi, siendo pocas las excepciones. De
acuerdo con esto el nombre sistemático del colesterol es colest-5-én-3β-ol. El sitosterol tiene
dos estructuras que son 24R-etilcolest-5-én-3β-ol y el 24S-etilcolest-5-én-3β-ol.
Propiedades físicas
La gran mayoría de esteroles conocidos son sólidos cristalinos incoloros, solubles en
solventes orgánicos relativamente apolares (acetato de etilo, cloroformo, benceno, etc.),
menos solubles en alcoholes de bajo peso molecular, y que funden sin descomponerse (en
forma libre o esterificada). Presentan además actividad óptica debido a los carbonos quirales
que poseen. Los esteroles se pueden recristalizar en metanol caliente o en la mezcla
metanol-tetrahidrofurano 10:1, formando cristales en forma de agujas brillantes incoloras.
Los que presentan dobles enlaces conjugados son de color amarillento y tienden a
descomponerse por acción de la luz como por ejemplo los esteroles con insaturaciones en
C-5 y C-7, los cuales son susceptibles a la reacción de oxidación fotoquímica ilustrada en la
figura 3.4.
176
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Figura 3.4. Reacción de ciclo adición [4+2] de un esterol con grupo dieno conjugado y oxígeno, en presencia de luz. El producto es un epidioxiesteroide, o esteroide con un grupo endoperóxido entre los carbonos C-6 y C-8.
Biogénesis
Los esteroles se derivan biogenéticamente de la acetilcoenzima-A (Ruta del Acetato) vía
mevalonato y escualeno, por una ruta compartida con los denominados triterpenoides. Los
esteroles vegetales tienen como precursor inmediato al cicloartenol, mientras que los
animales tienen al lanosterol (Figura 3.5). De una forma análoga se originan los
triterpenoides.
En la biogénesis de los esteroles también están implicados procesos tales como
hidrogenaciones y deshidrogenaciones C-C, metilaciones (vía S-adenosilmetionina),
hidroxilaciones, etc.
El conocimiento de la biosíntesis de esteroides ha contribuido al desarrollo de la
Quimotaxonomía vegetal, particularmente en el caso de las algas, y ha servido para
correlacionar la estructura de estas sustancias con aspectos evolutivos.
Por otro lado, el conocimiento de la biosíntesis de esteroles como el colesterol, ha llevado a
evaluar diferentes sustancias con el fin de inhibir el proceso de ciclación del óxido de
escualeno, lo que llevaría a inhibir la biosíntesis del colesterol y su potencial para el desarrollo
de nuevos medicamentos antiparasitarios, antihongos, hipocolesterolemiantes y anticáncer.
Hechos estructurales
Los esteroles naturales más conocidos presentan las siguientes características estructurales:
a. Los enlaces dobles en el núcleo se presentan principalmente en C-5, C-7, C-8 y C-9, en su
orden.
b. Los enlaces dobles en la cadena lateral se presentan especialmente en C-22, y con menor
frecuencia en C-24 y C-25.
c. Además de los grupos metilos 18, 19, 21, 26 y 27, es frecuente encontrar grupos metilo en
C-24, menos frecuente en el C-4.
H O
R
H O
R
OO
O 2
hv
177
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d. La cadena lateral presenta grupos alquilo (metilo, etilo, isopropilo, propilo, etc.)
principalmente en C-24.
e. Algunos organismos poco evolucionados como los organismos invertebrados marinos,
presentan esteroles con modificaciones en la cadena lateral (anillos ciclopropano, dobles
enlaces alénicos, metilaciones en C-26 y C-27, ausencia del C-25, etc.), y con núcleos
modificados.
178
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Figura 3.5. Esquema biogenético para los esteroles vegetales.
O P P
AcetilCoA
Farnesil-PP
EscualenoO
[O]
H O
H O
H O
Cicloartenol
Esterolesvegetales
179
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Extracción y aislamiento
El método más utilizado para la extracción de esteroles libres y esterificados es el de Bligh y
Dyer. El material biológico seco y molido se extrae a temperaturas menores de 40°C, con un
volumen suficiente de una mezcla cloroformo: metanol 2:1. Sin embargo, dada la toxicidad
y el impacto ambiental negativos de estas sustancias, más recientemente se han propuesto
mezclas de extracción como 2-metiltetrahidrofurano:alcohol isoamílico 2:1. Estos dos
solventes se obtienen a partir del procesamiento industrial de residuos de la industria de la
caña de azúcar, mientras que el cloroformo es derivado de la industria petroquímica y es
neurotóxico. También se utilizan otras mezclas de solventes como hexano: diclorometano
1:1. Toda esta mezcla se filtra y al filtrado obtenido se le hace partición con un volumen
adecuado de agua. La fase clorofórmica contiene entonces todos los compuestos
liposolubles tales como esteroides, triglicéridos, otros terpenoides, ácidos grasos, etc. No
obstante, es recomendable evaluar otros solventes extractores, menos tóxicos que el
diclorometano y el cloroformo, como por ejemplo el acetato de etilo mezclado con hexano,
y utilizar el ultrasonido o la extracción asistida por microondas, con el fin de acelerar los
procesos de extracción y reducir la contaminación del medio ambiente.
Cuando se sabe de antemano que la muestra contiene glicósidos esteroides, y se desea
estudiar sus respectivas agliconas, entonces el material vegetal se extrae con alcohol o con
una mezcla alcohol: agua, y el extracto obtenido se hidroliza con HCl 2M.
A nivel comercial el colesterol se obtiene de la espina dorsal de las reses, y el fitosterol a
partir de residuos de la industria papelera, y del procesamiento de la caña de azúcar.
Para la separación y purificación de esteroles a partir de extractos lipídicos, se emplean con
buenos resultados la cromatografía en columna y la cromatografía en capa cina (CCF), con
sílica gel y eluentes como mezclas de n-hexano-acetato de etilo, y mezclas de ellos. Una
mezcla recomendable es n-hexano-acetato de etilo 4:1. Existen varias clases de reveladores
incluido el ácido fosfomolíbdico, el de Liebermann-Burchard, uno con cloruro de berberina y
carbazol-ácido sulfúrico.
Sin embargo, no siempre estas técnicas en forma aislada permiten la obtención de esteroles
puros, sobre todo en el caso de mezclas de esteroles, por lo cual deben complementarse con
otras técnicas de separación y purificación más eficientes como son: La CCF argéntica (placas
de sílica gel impregnadas con una solución de nitrato de plata al 10% en acetonitrilo), la
Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (CLAE o HPLC en inglés) y la Cromatografía de Gases
(CG).
En la CCF argéntica, se impregna la sílica con soluciones concentradas de nitrato de plata en
agua:alcohol; y como resultado los esteroles se separan sobre dicha sílica por retención
diferencial de acuerdo al número de enlaces dobles C=C que contengan en su estructura
180
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(P.ej. el ergosterol con 3 enlaces dobles es más retenido que el colesterol, el cual solo posee
un enlace doble).
La CLAE (sigla inglesa: HPLC) permite las mejores separaciones de mezclas esterólicas y se
obtienen más rápidamente esteroles puros. Son muy utilizadas columnas de Octadecilsilano
(Fase Reversa) y eluentes tales como: etanol, metanol, mezclas alcohol: agua, mezclas
acetonitrilo: agua, etc. Además, la integración de la CLAE con la Espectrometría de masas es
una excelente técnica porque a la vez que separa mezclas de esteroles, permite obtener
información estructural a partir de los espectros de masas, inclusive es posible hacer
diferenciación entre epímeros debido a su retención diferencial. Adicionalmente, la
combinación de la CLAE con espectrómetros UV (de longitud de onda variable o arreglo de
diodos) e infrarrojo con transformada de Fourier, permite la obtención de los
correspondientes espectros UV e IR. La figura 3.6. muestra el cromatograma CLAE de la
fracción de esteroles libres de la esponja marina Ircinia campana.
Otras técnicas utilizadas para el análisis de esteroles en muestras biológicas es la
combinación de cromatografía líquida-cromatografía de gases- espectrometría de masas, ya
utilizada para diferentes plantas.
Figura 3.6. Cromatograma HPLC de la fracción de esteroles libres de la esponja marina Ircinia campana.
La Cromatografía de Gases con diferentes fases estacionarias como OV-17 (1%, 3%, 5%), SE-
54, etc., con temperaturas de 250-280°C, permite una buena separación y análisis de mezclas
esterólicas. Además, si esta se acopla con un espectrómetro de masas de impacto
181
Ir al índice
electrónico, se obtienen los respectivos espectros de masas, los cuales facilitan la
identificación.
Ensayo de Liebermann-Burchard
Los esteroles se pueden reconocer fácilmente en los análisis fitoquímicos preliminares de
muestras vegetales y animales mediante el ensayo de Liebermann-Burchard. En este ensayo,
a una solución en acetato de etilo de la muestra que se analiza, se le agrega un volumen igual
de anhídrido acético y una gota de ácido sulfúrico concentrado (98%). Si hay esteroles, se
producen coloraciones verdes, violetas, rojas o azules.
Aunque no se conoce el mecanismo de esta prueba, es muy utilizada. Diferentes autores
aseguran que la prueba la dan positiva solamente los esteroles que tengan en su estructura
grupos dieno conjugados reales o potenciales (por ejemplo en los 5-3-hidroxiesteroides la
deshidratación genera un 3,5 dieno, mientras que los 7-3-hidroxiesteroides requieren de
la deshidratación seguida de isomerización del enlace doble formado hasta conjugarse con
el enlace C=C en C-7). El ensayo de Liebermann-Burchard es la la base del método de Abell-
Kendall, el cual se utilizó durante muchos años para la cuantificación de colesterol en
muestras sanguíneas, sin embargo, actualmente se utilizan métodos instrumentales como la
espectrometría de masas con imágenes (MSI Mass Spectrometry Imaging), que inclusive
permite localizar la presencia de colesterol directamente sobre los tejidos que lo contienen.
Espectroscopia infrarroja
Los espectros infrarrojos de la mayoría de esteroles naturales son bastante simples y
similares a los de alcoholes alifáticos saturados o insaturados. Generalmente se observan:
Una banda de tensión O-H alrededor de 3600 cm-1, bandas de tensión de enlaces C-H
saturados alrededor de 2960-2780 cm-1, bandas de tensión de enlaces =C-H alrededor de
3125-3030 cm-1, bandas de flexión de enlaces saturados C-H alrededor de 1440 y 1380 cm-
1 y bandas de tensión de enlaces C=C olefínicos alrededor de 1670 cm-1 (Generalmente es
una banda débil). Otra utilidad de la espectroscopia infrarrojo es que permite diferenciar por
ejemplo entre los ésteres de esteroles y otros tipos de sustancias como los triglicéridos y los
fosfolípidos.
Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear
En los espectros de resonancia magnética nuclear protónica de los esteroles, en general se
observan las señales de protones metílicos en la región de 0-1 ppm con constantes de
acoplamiento de 6-7 Hz cuando tienen carbonos saturados vecinos. El protón ligado al
carbono 3 se observa a 360 MHz como un multiplete alrededor de 3.53 ppm cuando el
182
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hidroxilo está en posición 3, mientras que se observa como un quintete cuando el hidroxilo
está en posición 3.
En el caso de los esteroles con enlace doble entre los carbonos 5 y 6, el protón del carbono
6 se observa como un "doblete" ancho alrededor de 5.35 ppm.
En el caso de esteroles con enlaces dobles en C-5 y C-7 (esteroles con núcleo tipo ergosterol)
los protones H-6 y H-7 se observan como multipletes en 5.4 y 5.5 ppm.
En general, los espectros RMN permiten asignaciones estereoquímicas a partir de su análisis
detallado y por comparación con los espectros de esteroles de estructura completamente
conocida.
En el caso de los derivados acetilados de esteroles, la presencia del grupo acetato sobre el
carbono 3, desplaza la señal del protón ligado al mismo carbono hasta valores de 4.5 ppm,
además en el espectro aparece la señal del grupo metilo del acetato alrededor de 1.8 ppm.
La región de protones metílicos (0-1.2 ppm) es conocida para varios esteroles naturales, y
permite asignaciones estereoquímicas precisas de la cadena lateral.
La tabla 3.1 presenta para propósitos comparativos las señales del espectro RMN-1H del 7-
deshidrocolesterol aislado de la esponja marina Ircinia campana. Así como los
desplazamientos químicos calculados con el software comercial ACD-Labs NMR Predictors
versión 11®, y con la aplicación en línea nmrdb.org.
183
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Tabla 3.1. Desplazamientos químicos experimentales y calculados para señales de protones seleccionadas del espectro RMN-1H del 7-deshidrocolesterol.
HO
3
6
7
18
19
2126
27
Protón δ exp. δ calc. ACD-Labs® δ calc. Nmrdb.org
H-3 3.7 m 3.61 4.19
H-6 5.4 m 5.39 4.85
H-7 5.6 m 5.56 5.39
H-18 0.62 s 0.65 0.65
H-19 0.95 s 0.94 0.94
H-21 0.90 d 0.87 0.87
H-26 0.85 d 0.80 0.80
H-27 0.86 d 0.79 0.79
La espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear de carbono-13 ha facilitado mucho la
dilucidación estructural de esteroides. Es muy fácil reconocer en estos espectros las señales
características de esteroles como, por ejemplo, la señal del carbono 3 aparece alrededor de
72 ppm en esteroles con núcleos 5- y 7-3-hidroxiandrosteno. Además, los esteroles con
núcleo 5-3-hidroxiandrosteno presentan las señales de los carbonos 5 y 6 en 141 y 122 ppm
aproximadamente, la señal del metilo 18 a 12 ppm, y la del metilo 19 a 20 ppm. Los esteroles
con núcleo 7-3- hidroxiandrosteno muestran las señales de los carbonos 7 y 8 a 130 y 140
ppm, y las señales de los metilos 18 y 19 alrededor de 12 ppm aproximadamente. La tabla 4
resume los desplazamientos químicos aproximados para varios tipos de carbonos
característicos de los esteroides naturales:
184
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Tabla 3.2. Rangos de desplazamiento químico en RMN-13C para varios tipos de carbonos característicos de esteroides naturales.
Tipo de carbono Desplazamiento químico (ppm)
CH3 sat. 12-24
CH2 sat. 20-41
CH sat. 35-57
C sat. 27-43
C-OH sat. 65-91
C=C olefínico 119-172
C=O 177-220
Por otro lado, el desarrollo de la RMN Bidimensional permite hacer una asignación más fácil
de las señales y por ende de la estructura.
La tabla 3.3 presenta algunas de las señales de RMN-13C experimentales y calculadas para el
7-deshidrocolesterol.
Tabla 3.3. Desplazamientos químicos experimentales y calculados para señales de carbonos
seleccionadas del espectro RMN-13C del 7-deshidrocolesterol.
Carbono δ exp. δ calc. ACD-Labs® δ calc. Nmrdb.org
C-3 70.44 70.50 71.2
C-5 139.73 139.80 140.7
C-6 119.57 119.70 119.4
C-7 116.21 116.08 116.7
C-8 141.47 140.57 140.6
C-18 11.80 19.55 12.0
C-19 16.27 20.08 16.0
C-21 18.83 18.70 18.9
C-26 22.54 22.62 22.6
C-27 22.85 22.62 22.6
185
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Espectrometría de masas
Los espectros de masas de impacto electrónico (70 eV) de los esteroles libres proporcionan
información estructural muy útil y existen mecanismos de fragmentación verificados
experimentalmente con esteroles marcados con isótopos tales como deuterio.
Teniendo en cuenta que la mayoría de esteroles naturales poseen 4 clases de núcleos
tetracíclicos: 5-3-hidroxiandrosteno, 0-3-hidroxiandrostano, 7-3-hidroxiandrosteno,
5,7-3-hidroxiandrostadieno y 5,7,9(11)-3-hidroxiandrostatrieno, y que muchos de ellos
tienen cadenas laterales hidrocarbonadas saturadas o monoinsaturadas en los carbonos 22,
24 o 25; pueden establecerse las siguientes características estructurales a partir de su
espectro de masas I.E.:
a. Los esteroles libres con núcleo 5-3-hidroxiandrosteno y la cadena lateral saturada
presentan en sus espectros de masas normalmente los fragmentos: M (Ion molecular), M-
Metilo, M-Agua, M-Metilo-Agua, M-85, M-111, 273, 255, 231, 213 y 145. Además, si
contienen un grupo isopropilo terminal se observan también los fragmentos M-Isopropilo y
M-Isopropilo-Agua. Los derivados acetilados muestran los fragmentos M, M-AcOH, M-AcOH-
Metilo, 255 (M-AcOH-R), 213 y 145. Los derivados Trimetilsililéteres (TMS) muestran los
fragmentos M, M-TMSOH, M-TMSOH-15, 255 (M-TMSOH-R), 213, 145 y 129. La figura 3.7.
esquematiza el origen de algunos de estos iones.
b. Los esteroles libres con núcleo 5-3-hidroxiandrosteno y la cadena lateral hidrocarbonada
(No oxigenada) insaturada presentan además de los fragmentos citados en (a), los
fragmentos m/z=300, 271, 253, 229 y 211, si son monoinsaturados en el carbono 22. Si la
insaturación es en el carbono 24, se observa además el fragmento intenso m/z=314.
Finalmente, si la insaturación es en el carbono 25, se observa además el fragmento m/z: 328
intenso. Estos fragmentos intensos de masa par se originan por rupturas tipo McLafferty
(Figura 3.7).
c. Los esteroles libres con núcleo 0-3-hidroxiandrostano y la cadena lateral hidrocarbonada
(No oxigenada) saturada presentan los fragmentos: M, M-Metilo, M-Agua, M-Metilo-Agua,
m/z: 233, 215 y 147, generalmente. Además, como en el caso de los anteriores, si poseen un
grupo isopropilo terminal presentan los fragmentos: M-Isopropilo y M-Isopropilo-Agua. Los
derivados acetilados presentan los fragmentos: M, M-AcOH, M-AcOH-Metilo, 257 (M-AcOH-
R), 215 y 147. Los derivados TMS-éteres muestran los iones M, M-TMSOH, M-TMSOH-15,
257, 215 y 147. La figura 3.8 esquematiza la formación de algunos de estos iones.
d. Los esteroles con núcleo 0-3-Hidroxiandrostano y la cadena lateral hidrocarbonada (No
oxigenada) monoinsaturada, presentan además de los fragmentos citados en (c), a los
fragmentos: m/z: 302, 231, 211; si la insaturación es en el carbono 22. Si la insaturación es
186
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sobre el carbono 24, se aprecia además el fragmento intenso m/z: 316. Y finalmente, si la
insaturación es sobre el carbono 25, se observa el fragmento intenso m/z: 330 (figura 3.8).
e. Los esteroles libres con núcleo 7-3-hidroxiandrosteno y la cadena lateral hidrocarbonada
(No oxigenada) saturada, presentan en sus espectros de masas los fragmentos: M, M-Metilo,
M-Agua, M-Metilo-Agua, 273, 255, 246, 231 y 213. Además, si tienen un grupo isopropilo
terminal, a veces se observan los fragmentos: M-Isopropilo y M-Isopropilo-Agua. Los
derivados acetilados muestran los fragmentos: M, M-AcOH, M-AcOH-Metilo, M-AcOH-R y
213, por lo cual no es posible diferenciarlos de los derivados acetilados de esteroles con
núcleo 5-3-Hidroxiandrosteno. Los derivados TMS muestran fragmentos de m/z iguales a
los descritos para los derivados TMS de esteroles 5. La figura 3.9 presenta un esquema de
formación probable de estos iones.
h) Los esteroles con núcleo 7-3-Hidroxiandrosteno y la cadena lateral Hidrocarbonada (No
oxigenada) monoinsaturada, presentan en sus espectros de masas, además de los
fragmentos citados en (e), los siguientes fragmentos: m/z: 300, 271, 253, 229 y 211, si la
insaturación es sobre el carbono 22. Si la insaturación es sobre el carbono 24, se observa
además el fragmento intenso m/z: 314. Y finalmente, si la insaturación es sobre el carbono
25, se observa además el fragmento intenso de masa m/z: 328 (Ver figura 3.9).
i) Los esteroles con núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno y la cadena lateral hidrocarbonada
(No oxigenada) saturada, presentan en sus espectros de masas los fragmentos: M, M-Metilo,
M-Agua, M-Metilo-Agua, 271, 253, 229, 211, 158, 143 y 128. Además, si tienen un grupo
isopropilo terminal, a veces se observan los fragmentos: M-Isopropilo y M-Isopropilo-Agua.
Cuando la cadena lateral es insaturada en lugar de m/z: 158 se observa m/z: 157. Los
derivados acetilados muestran los fragmentos: M, M-AcOH, M-AcOH-Metilo, M-AcOH-R,
211, 158 (Si R saturada), 157 (Si R insaturada), 143 y 128. Los derivados TMS-éteres muestran
los iones M, M-TMSOH, M-TMSOH-15, 253, 211 y 143. La figura 3.10 presenta la formación
probable de estos iones.
j) Los esteroles con núcleo 5,7,9(11)-3-Hidroxiandrostatrieno y la cadena lateral
hidrocarbonada (No oxigenada) saturada, presentan en sus espectros de masas los
fragmentos: M, M-Metilo, M-Agua, M-Metilo-Agua, 251, 209 y 141. Además, si tienen un
grupo isopropilo terminal, a veces se observan los fragmentos: M-Isopropilo y M-Isopropilo-
Agua. Los derivados acetilados muestran los fragmentos: M, M-AcOH, M-AcOH-Metilo, M-
AcOH-R, 209 y 141 (ver figura 3.10).
Más recientemente se han revisado los patrones de fragmentación para varios esteroles y
esteroides naturales, mediante la preparación y análisis de espectrometría de masas de los
187
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derivados trimetilsilil-oxima, que muestran que estos derivados presentan ventajas como por
ejemplo una mayor sensibilidad para su análisis instrumental.
Figura 3.7. Algunos fragmentos característicos del espectro de masas IE de esteroles con el núcleo 5-androsteno (X = H, Ac, Me, TMS).
R
XO
-XOH
R
M-XOH
-R
M+.
X=H
HO
m/z 273
-H2O
-CH3[M-CH3]+
[M-AcOH-41] + X=Ac
-CH3
m/z 145
R
H
-CH3
[M-XOH-15] +
m/z 213
m/z 300 siinsat. en C-22X=H
m/z 314 siinsat. en C-24X=H
m/z 328 siinsat. en C-25X=H
-R
X=H[M-85]+
[M-111]+
m/z 255
188
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XO
R
XO
M
m/z 233 (X = H)
M - CH3
R- H2O
- H2O
m/z 215
M - XOH
- CH3
m/z 147
R
- CH3
m/z 215
m/z 302si insat. C-22R = H
m/z 316si insat. C-24R = H
m/z 330si insat. C-25R = H
Figura 3.8. Algunos fragmentos característicos del espectro de masas IE de esteroles con el núcleo 0-androstano (X = H, Ac, Me, TMS).
189
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Figura 3.9. Algunos fragmentos característicos del espectro de masas IE de esteroles con el núcleo 7-androsteno (X = H, Ac, Me, TMS).
R
X O
-XOH
R
M-XOH
-R
m/z 255
M+.
X=H
m/z 246
-CH 3[M-CH 3 ]+
[M-AcOH-41] + X=Ac
-CH 3
m/z 145
R
H
-CH 3
[M-XOH-15] +
m/z 213
m/z 300 siinsat. en C-22X=H
m/z 314 siinsat. en C-24X=H
m/z 328 siinsat. en C-25X=H
H O
190
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Figura 3.10. Algunos fragmentos característicos del espectro de masas IE de esteroles con el núcleo
5,7-androstadieno (X = H, Ac, Me, TMS).
R
X O
-XOH
R
M-XOH
-R
M+.
X=H
m/z 271
-CH 3[M-CH 3 ]+
[M-AcOH-41] + X=Ac
-CH 3
m/z 143
R
H
-CH 3
[M-XOH-15] +
m/z 211
H O
-R
m/z 253
-H 2 O
m/z 158
-CH 3
m/z 128
191
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En el caso de esteroles dihidroxilados, sus espectros de masas muestran fragmentos que
incluyen las pérdidas de dos moléculas de agua, en general se observan M (generalmente
muy débil), M-agua, M-Me-H2O, M-2H2O, M-2H2O-Me, M-R-H2O, M-R-2H2O, M-R-D-H2O,
M-R-D-2H2O, etc.
Espectroscopia ultravioleta-visible
Debido a que la mayoría de esteroles naturales contienen grupos funcionales tales como
enlaces dobles C=C y el grupo hidroxilo, sus espectros ultravioleta en metanol (200-360 nm)
únicamente muestran un máximo de absorción alrededor de 205 nm, debido a transiciones
-* del enlace doble aislado. Sin embargo, para esteroles con grupos dienos conjugados
como por ejemplo el ergosterol, estos sí absorben intensamente en la región citada y la
posición de los máximos de absorción se puede predecir con las reglas de Woodward-Fieser
para dienos conjugados. Por ejemplo, los esteroles con núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno
presentan máximos de absorción alrededor de 240, 270, 280 y 290 nm, mientras que los
esteroles con núcleo 5,7,9(11)-3-hidroxiandrostatrieno presentan máximos de absorción
alrededor de 310, 325 y 340 nm. Los valores en negrilla corresponden a los de máximos de
absorción de mayor absorbancia. Los esteroides con el cromóforo 4-3-oxa muestran un
máximo característico alrededor de 240 nm.
Correlaciones estructura y rotación específica
Se han hecho estudios donde se correlaciona la rotación específica de soluciones de
esteroles con sus características estructurales. La Tabla 3.4 muestra estas correlaciones.
Tabla 3.4. Correlaciones entre la rotación específica y las características estructurales del esteroide.
ROTACIÓN ESPECÍFICA
[]D20
TIPO ESTRUCTURAL EJEMPLO
Menor de -90° Enlaces dobles conjugados en el anillo B Ergosterol (-135°)
-70° a -50° Enlaces dobles C5-C6 y C22-C23 Estigmasterol (-55.6°)
-45° a -30° Enlace doble C5-C6 Colesterol (-39.5°)
-25° a +10° Enlace doble C7-C8 y posiblemente C22-C23 Asterosterol
+10° a +30° Núcleo saturado Colestanol (+20°)
+40° a +50° Enlace doble C8-C9 y posiblemente en la cadena lateral
Zimosterol
192
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Utilidad farmacéutica
Aunque en general a los esteroles naturales se les asocia más con funciones biológicas como
componentes estructurales de las membranas celulares, como precursores de hormonas,
vitaminas y ácidos cólicos, entre otras; a nivel de la industria farmacéutica son precursores
importantes de diferentes clases de medicamentos esteroides. Para el caso de los
monohidroxiesteroides, como el colesterol y relacionados, se ha reportado actividad
hipocolesterolemiante, antiinflamatoria potencial, citotóxica y antimicótica, pero es más
común encontrar en la literatura científica que son los polihidroxiesteroides (esteroides con
más de un grupo hidroxilo en el núcleo), los que presentan diferentes actividades las cuales
incluyen actividad citotóxica, antiinflamatoria y antimicrobiana. El desarrollo de nuevos
métodos para evaluar la actividad biológica de compuestos tan apolares ha permitido
demostrar por ejemplo que el sitosterol presente en Moringa oleífera, muestra acción anti
inflamatoria in vitro.
En el caso de esteroles con el núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno como el ergosterol, estos
son convertidos en vitamina D la cual desempeña un papel importante en el metabolismo de
minerales como el calcio y fósforo, y esta puede ser convertida en otros análogos
hidroxilados que son activos contra la psoriasis y cáncer de tipo epitelial. Algunos esteroles
con grupos funcionales peróxido y epóxido, como los aislados del micelio del hongo
Cordyceps sinensis, presentan actividad antitumoral.
Como se mencionó anteriormente, la mayor importancia de los esteroles naturales es para
la industria farmacéutica, en especial la dedicada a la producción de medicamentos
esteroides. La Figura 3.11 esquematiza el proceso de conversión mediante reacciones de
síntesis química y procesos de fermentación, del estigmasterol en medicamentos
fluorocorticoides, la figura 3.12 muestra el proceso de conversión de sitosterol y colesterol
en esteroides acetilénicos y la figura 3.13 esquematiza el proceso de obtención de hormonas
esteroides a partir de los esteroles de la caña de azúcar.
193
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HO
Estigmasterol
O
CHO
O
N
2 etapas
O
O
O
O
HO
F R
O
O
OAc
OHHO
9 etapas
Figura 3.11. Esquema del proceso de conversión química y microbiológica de estigmasterol en fluorocorticoides.
HO
R
O
O
2 etapas
R = H, ColesterolR = Et, Sitosterol
F
Androstenodiona
O
OH
Etisterona
O
OHCOOH
etc.
Figura 3.12. Esquema del proceso químico y microbiológico para la conversión de colesterol y sitosterol en medicamentos esteroides.
194
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Figura 3.13. Esquema del proceso de obtención de 11-oxiesteroides a partir de los esteroles de la caña de azúcar.
Síntesis
Una gran cantidad de esteroides naturales y sus derivados se pueden obtener mediante
reacciones con paladio como catalizador.
Los esteroles con la cadena lateral oxigenada son objeto de investigación porque están
implicados en varios procesos biológicos importantes que incluyen la síntesis de ácidos
biliares, la regulación y transporte de colesterol, la modulación de la función de receptores
estrogénicos, la apoptosis; y se cree que son potencialmente útiles para el desarrollo de
productos contra los males de Alzheimer y Parkinson, la esclerosis múltiple la enfermedad
de Niemann-Pick tipo C, y las cataratas.
Ejercicio
Proponer la estructura más probable para los esteroles cuyos espectros se presentan a
continuación:
Bagazo de la
caña de azúcar
O
O
Arthrobacter sp.
O
O
H O
Aspergillus
ochraeus
195
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a) Espectro RMN-1H (400 MHz, CDCl3):
196
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Espectro de RMN-13C (100 MHz, CDCl3):
197
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Espectro de masas (70 eV):
b) Espectro de masas (70 eV):
198
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Espectro de RMN-1H (400 MHz, CDCl3):
199
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Soluciones a los problemas
Problema 1a
El espectro de masas muestra el ion molecular en m/z 384 consistente con la fórmula
molecular C27H44O. También pueden observarse los iones m/z 369 (pérdida de un grupo
metilo), 366 (pérdida de una molécula de agua) y 351 (pérdida de un grupo metilo y una
molécula de agua), característicos de esteroles. Los iones m/z 271 (pérdida de la cadena
lateral), 253 (pérdida de la cadena lateral y una molécula de agua), 253 (pérdida de la cadena
lateral y una molécula de agua) y 211 (fisión del anillo D menos agua), indican claramente la
presencia de dos insaturaciones en el núcleo, y los iones m/z 158 (fisión entre anillos B y C),
143 (158 menos un grupo metilo) y 128 (158 menos dos grupos metilo) hacen evidente que
las insaturaciones están en el C-5 y en el C-7 (ver Figura 6.d). La diferencia entre el ion
molecular y el ion m/z 271 (pérdida de la cadena lateral) indica que la cadena lateral de este
esterol es saturada con la fórmula C8H17. Todo este análisis lleva a la conclusión de que este
compuesto es un esterol con núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno con una cadena lateral
saturada de ocho átomos de carbono.
El espectro de RMN-1H confirma el núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno por las señales
multiplete en 5.4 y 5.6 ppm integrando cada una para un protón, correspondientes a los
protones olefínicos H-6 y H-7, un multiplete (7 señales) en 3.65 ppm correspondiente al
protón H-3 y dos singletes en 0.62 y 0.95 ppm, correspondientes a los metilos H-18 y H-19.
Las señales de los CH3-26 y CH3-27 se observan como dobletes en 0.85 y 0.86 ppm, y los
protones del CH3-21 se observan como un doblete en 0.9 ppm. Estos datos corresponden a
un esterol con el núcleo
5,7-3-hidroxiandrostadieno con una cadena lateral con un grupo isopropilo terminal. La
configuración 3ß-hidroxi la confirma la multiplicidad de la señal del H-3, la cual corresponde
a un multiplete extendido 42 Hz originado por acoplamientos de los protones axiales de H-3
con H-2 y H-4, y a los acoplamientos entre H-3 y los protones ecuatoriales H-2 y H-4,
mientras que la configuración 3-hidroxi genera un 'quintete' extendido 28 Hz, originado por
acoplamientos protónicos axial-ecuatorial y ecuatorial-ecuatorial de H-3 con H-2 y H-4. El
espectro de RMN-13C muestra 27 señales entre las cuales cuatro corresponden a los
carbonos olefínicos C-5 (139.73 ppm), C-6 (119.57 ppm), C-7 (116.21 ppm), C-8 (141.47 ppm)
y una al carbono hidroxilado C-3 (70.44 ppm), confirmando la existencia de un esterol con
núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno, las demás señales corresponden a 38.34 (C-1), 31.96
(C-2), 40.74 (C-4), 46.20 (C-9), 36.97 (C-10), 21.08 (C-11), 39.14 (C-12), 42.90 (C-13), 54.47
(C-14), 23.00 (C-15), 28.08 (C-16), 55.84 (C-17), 11.80 (C-18), 16.27 (C-19), 36.10 (C-20),
200
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18.83 (C-21), 36.11 (C-22), 23.84 (C-23), 39.47 (C-24), 27.99 (C-25), 22.54 (C-26) y 22.85 (C-
27).
Con este análisis se llega a la conclusión de que este esterol es el colesta-5,7-dién-3-ol
(comúnmente llamado 7-dehidrocolesterol).
Problema 1b
El espectro de masas muestra el ion molecular m/z: 410 consistente con la fórmula C29H46O.
También se observa el fragmento m/z 377 (M-metilo-agua) característico de esteroles. Los
iones m/z 271 (M-cadena lateral), 253 (271-agua) y 211 (fisión del anillo D y pérdida de una
molécula de agua) indican claramente la presencia de dos insaturaciones en el núcleo y los
iones m/z 128, 143 y 158 hacen evidente que estas insaturaciones están en el C-5 y el C-7.
La diferencia entre el ion molecular y el ion m/z 271 (M-cadena lateral) indica que la cadena
lateral de este componente es monoinsaturada con una fórmula C10H19. Todo este análisis
lleva a la conclusión de que este es un esterol con un núcleo 5,7-3-hidroxiandrostadieno
con una cadena lateral monoinsaturada.
El espectro de RMN-1H muestra las señales 0.638 (s, CH3-18), 0.950 (s, CH3-19), 3.6 (m, H-
3), 5.389 (m, H-6), 5.576 (m, H-7). Las señales 5.046 (dd, J=15.6 y 8.7 Hz) y 5.181 (dd, J=15.1
y 6.4 Hz) corresponden a los protones H-22 y H-23 con geometría E. La señal 0.811 (t, J=7.3
Hz) es la del grupo CH3-29 que está ligado a un grupo metileno. Este análisis permitió asignar
la estructura del (22E,24)-24-etilcolesta-5,7,22E-trién-3ß-ol para esta sustancia.
HO
H O
201
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Saponinas y sapogeninas esteroides
En la naturaleza de encuentran sustancias que básicamente son glicósidos terpenoides, que
tienen la propiedad de disminuir la tensión superficial de las soluciones acuosas, y que se las
denomina comúnmente como saponinas. Se han estudiado dos grandes grupos de ellas
como son las saponinas triterpenoides y las saponinas esteroides. Las primeras, aunque son
ampliamente distribuidas en las plantas, y se les han atribuido inicialmente propiedades
antinutricionales por sus propiedades hemolíticas, membranolíticas y tóxicas contra hongos;
más recientemente se están estudiando por sus propiedades benéficas para la salud, como
potencial protección contra el riesgo de cáncer, la disminución de los niveles de colesterol y
azúcar en la sangre, además de propiedades anti inflamatorias, hipocolesterolemiantes e
inmuno modulatorias.
Por otro lado, las saponinas esteroides, comparativamente se encuentran menos distribuidas
en los vegetales que los esteroles, pero constituyen desde hace muchos años junto ellos, una
materia prima importante para la producción de medicamentos esteroides. No obstante, se
han reportado estudios que demuestran que presentan actividades biológicas interesantes
como por ejemplo citotóxica, anti cáncer, antinflamatoria, anti hongos, hemostática, etc.
Las saponinas esteroides son glicósidos con un núcleo espirostano (Figura 3.14) que tienen
la propiedad de hemolizar los glóbulos rojos y forman espuma abundante y estable al agitar
sus soluciones acuosas.
202
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O
O
RO
R = H, Sapogenina esteroideR = carbohidrato(s), Saponina esteroide
Figura 3.14. Estructura química general de sapogeninas y saponinas esteroides tipo espirostano.
Biogénesis
Aunque prácticamente no existen estudios reportados sobre la biosíntesis de sapogeninas
esteroides, se especula que la porción esteroide de las saponinas esteroides (también
denominada sapogenina o aglicona esteroide) se origina por la ruta de la acetil coenzima A,
vía ácido mevalónico (en citosol) o metileritritol (en plastidios) y escualeno. La figura 3.15
resume esquemáticamente el proceso. Una vez formado un precursor esteroide con 27
átomos de carbono (p.ej. colesterol), este es deshidrogenado para originar 3-colestanona.
La colestanona es hidroxilada en los carbonos 16, 22 y 27. Este intermedio altamente
hidroxilado en la cadena lateral puede sufrir una deshidratación entre los hidroxilos 16 y 22,
lo que origina 3-furostanona; o puede sufrir además otra deshidratación entre los hidroxilos
22 y 27 restantes, lo que da lugar al anillo espirostano propiamente dicho. La 3-espirostanona
puede ser reducida a 3-espirostanol, el cual puede sufrir procesos enzimáticos de
glicosilación mediados por glicosiltransferasas para originar las saponinas esteroides.
203
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O
AcetilCoA -> -> Acido mevalónico -> -> Escualeno -> -> Cicloartenol
beta-amirina
Saponinas triterpenoides
O
OH
OH
Oxid.
O
O
-H2O
O
O
OHOH
Furastanona
Oxid.
O
O
O
-H2O
Reduc.
Glicosiltransferasa
Sapogenina esteroide
O
O
GliO
Saponina esteroide
Lanosterol
Colesterol
Esteroles vegetales
Figura 3.15. Esquema biogenético de sapogeninas y saponinas esteroides.
204
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Hidrólisis
Como O-glicósidos, las saponinas esteroides se hidrolizan fácilmente en medio ácido o
enzimáticamente. Ambos procesos liberan una o varias unidades de carbohidratos ligados, y
la denominada aglicona o sapogenina esteroide. Las saponinas y sapogeninas presentan las
características generales de los glicósidos y agliconas, mencionadas en el capítulo 1.
Para la hidrólisis ácida a 20 mg de saponina se adiciona HCl 2N metanólico. Se refluja al
menos durante una hora. Se neutraliza con una base diluida y se extrae la sapogenina
mediante partición con acetato de etilo.
Nomenclatura
Muy comúnmente, a las saponinas esteroides se las denomina con nombres vulgares con la
terminación ina u ósido, como por ejemplo dioscina, hecogenina, sarsaporrillósido, etc. La
nomenclatura sistemática establece el nombre de estas a partir del núcleo básico
ESPIROSTANO, de manera muy similar a como se hace con los esteroles. Es decir, se nombran
primero los sustituyentes alquílicos, seguidos la palabra espirost, espirosta, o espirostán,
según tengan un solo enlace doble C=C, dos o más enlaces dobles C=C, ó si no tienen enlaces
dobles C=C, respectivamente. Luego se nombran los enlaces dobles C=C y su posición en la
estructura, y se termina con el o los grupos hidroxilos presentes según corresponda: ol, diol,
triol, etc. La figura 3.16 y la tabla 3.5. muestran las estructuras básicas de varias saponinas
esteroides naturales.
O
O
RO
R2
R1
R12
5
3
Figura 3.16. Estructura química básica de varias saponinas y sapogeninas esteroides. Para descripción de los sustituyentes referirse a la tabla 3.5.
205
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Tabla 3.5. Algunas saponinas y sapogeninas naturales y sus fuentes naturales más conocidas.
R R1 R2 R12 C-5 NOMBRE COMÚN FUENTE
3Glu-1Ram H H H C-C Sarsaporrillósido Smilax sp., Liliáceas
3Glu H H H C=C Dioscina Dioscorea sp., Dioscoráceas, por ejemplo "Ñame"
H H H H C=C Diosgenina Dioscorea sp., Dioscoráceas, por ejemplo "Ñame"
H OH H H C=C Ruscogenina Ruscus sp., Liliáceas
H H H O C-C Hecogenina Agave sp., Agaváceas, por ejemplo "Fique"
H H H H C=C Yamogenina -
H H OH H C-C Digitogenina Digitalis sp., Escrofulariáceas
Para el caso de la sapogenina de la dioscina, la cual se conoce con el nombre común de
diosgenina, su nombre sistemático es (24R)-espirost-5-én-3ß-ol. Por otro lado, para la
hecogenina (la sapogenina de la heconina) su nombre sistemático es: (24R)-11-oxa-
espirostán-3-ol.
Ensayos de reconocimiento
Las saponinas esteroides se pueden reconocer fácilmente en los análisis fitoquímicos
preliminares mediante los ensayos de la espuma, hemólisis de glóbulos rojos, Liebermann-
Burchard y ensayos para carbohidratos.
Ensayo de la espuma
Al agitar una solución acuosa de una muestra que sea o contenga saponinas, se forma una
espuma estable como la obtenida al agitar la solución acuosa de un jabón. Puesto que existen
otras sustancias que pueden formar también espuma, se debe asumir este ensayo como una
prueba presuntiva de la presencia de saponinas esteroides.
Ensayo de hemólisis
Este ensayo es más confiable que el de la espuma. A una suspensión de glóbulos rojos en
solución salina diluida, se añade una solución de la muestra que se presume que es o que
contiene saponinas. Si los glóbulos rojos se rompen (lisan o hemolizan), se asume que la
prueba es positiva. Este ensayo puede realizarse en tubo de ensayo, en cajas de Petri con
206
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agar-sangre o en cajas de Petri con gelatina-sangre. Cuando la muestra contiene taninos,
deben eliminarse antes de realizar la prueba ya que la interfieren. Esto se logra por
tratamiento repetido de la muestra con óxido de magnesio, el cual forma complejos
insolubles con los taninos, por lo cual es fácil eliminarlos por filtración.
Este ensayo, junto con el de la espuma, cuando ambos resultan positivos en una muestra
vegetal (extracto, fracción ó sustancia pura) permiten establecer que la muestra es ó
contiene saponinas. La sola prueba de espuma positiva no es concluyente para determinar
la presencia de saponinas. Además, hay sustancias que interfieren estas dos pruebas como
son los taninos. Si la muestra contiene taninos, estos pueden eliminarse pues se absorben
en MgO.
Ensayo de Liebermann-Burchard
Por la porción esteroide que poseen las saponinas esteroides, este ensayo puede confirmar
su presencia por ejemplo en muestras y extractos vegetales, tal como se indicó
anteriormente para los esteroles, pero debe tenerse en cuenta que al igual que en el caso
de los esteroles -y los esteroides en general- solamente dan un resultado positivo los que
tengan grupos dienos conjugados reales o potenciales. Sin embargo, se debe tener en cuenta
que muchos compuestos naturales, como los carotenoides, que contienen enlaces dobles
C=C conjugados, también dan resultado positivo con este ensayo.
Extracción y aislamiento
Las saponinas esteroides por su carácter glicosídico, son insolubles en solventes apolares.
Para obtenerlas de las plantas o animales, el material seco y molido se desengrasa
previamente con un solvente apolar (generalmente éter de petróleo o n-hexano). El marco
se extrae con etanol, metanol, n-butanol, ó mezclas de diferentes proporciones de estos
alcoholes y agua. El extracto acuoso (libre de alcohol) se liofiliza o se concentra en rotavapor,
y se hace pasar por resinas de intercambio iónico a fin de eliminar sustancias iónicas. El
eluato acuoso se pasa luego a través de materiales como el Sephadex LH-20 para separar las
saponinas de otras moléculas como péptidos y macromoléculas que dificultan su purificación
cromatográfica. Una vez obtenidas las saponinas crudas, se pueden purificar por
cromatografía en columna o líquida de alta eficiencia. En el caso de la cromatografía en
columna, se puede utilizar sílica gel y eluentes como los denominados BAW, es decir mezclas
de butanol, ácido acético y agua.
La determinación de los carbohidratos ligados se hace mediante la hidrólisis ácida. Los
carbohidratos liberados se identifican por cromatografía en papel frente a muestras
auténticas o por cromatografía de gases de derivados estables (p. ej. trimetilsililéteres,
metiléteres, etc.). Ciertos derivados como los éteres TMS-(+)-butilglicósidos permiten
además identificar los isómeros D y L.
207
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La técnica combinada cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) permite
también el reconocimiento de los carbohidratos ligados en forma de derivados
trimetilsililéteres de alditoles-MBA mediante el método de Hakomori, como se explica más
adelante.
Para el caso de mezclas complejas de saponinas, el uso de técnicas como HPLC con detector
ELSD, junto a las técnicas de espectrometría de masas electrospray HRESI-MS, ha permitido
facilitar el proceso de aislamiento y caracterización de estas sustancias.
Espectroscopia infrarrojo
Además de las bandas de absorción características de las sustancias esteroides, las saponinas
y sapogeninas esteroides presentan varias bandas originadas por tensiones C-O de los anillos
pirano y furano, localizadas alrededor de 850, 900, 920 y 987 cm-1. Por otro lado, la
intensidad relativa entre las bandas a 900 y 920 cm-1 permite determinar la estereoquímica
del carbono 25. De acuerdo con esto si la banda alrededor de 900 es más intensa que la de
920 cm-1, la configuración del carbono 25 es R, y en el caso inverso es S. Algunos
procedimientos para la detección y valoración de sapogeninas esteroides se basan en estas
bandas de absorción.
Espectrometría de masas
Las sapogeninas esteroides presentan espectros de masas de impacto electrónico, en los
cuales pueden apreciarse el ion molecular y los fragmentos m/z: 115 y 139, siendo alguno
de estos el pico base del espectro. La figura 4 muestra los mecanismos de fragmentación que
explican la formación de estos dos últimos iones. Budzikiewicz y col. también racionalizaron
los mecanismos de formación probable para iones M-114, M-129 y M-143, la figura 3.17
describe los mecanismos de formación de los iones característicos m/z 115 y 139. Se ha
reportado que, utilizando la técnica de espectrometría de masas con trampa de iones y triple
cuadrupolo lineal, se forma un fragmento similar al m/z 139, pero con valor m/z 144 Da.
208
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O
Oa
b
M+.
O
OO
O
b
a
O
HO
O
O
O
m/z 139
O
OH
HO
O
m/z 115
Figura 3.17. Mecanismos de formación de los iones m/z 115 y 139, característicos en el espectro de
masas 70 eV de sapogeninas espirostánicas.
Para el análisis e identificación de las saponinas esteroides se están utilizando actualmente
técnicas combinadas como ultra-HPLC con espectrometría de masas ESI. Estos espectros
permiten la determinación no solo del peso molecular a través del ión pseudomolecular
formado con especies como el ión amonio, sino que también permiten determinar las
209
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unidades de azúcares ligados, como en el caso del fistulósido-C identificado en
Anemarrhena asphodeloides. De esta planta se aisló también la timosaponina-AIII, que
muestra en su espectro el ión pseudomolecular m/z 741 (M+H+), junto con los fragmentos
m/z 579 (pérdida de una molécula de glucosa), 417 (pérdida de una molécula de glucosa y
una de galactosa), 399 (417 – agua), 273 (rompimiento del anillo D) y 255 (273 – agua). Estos
estudios permitieron establecer que si los iones m/z 417, 255 y 273 se observan en el
espectro MS/MS la saponina no tiene hidroxilos en los anillos A, B, C y D. Por otro lado, si se
observan los iones m/z 433 y 415, la saponina debe tener un hidroxilo en alguno de los anillos
A, B, C o D.
OH+
O
Glu-GalO
Timosaponina- AIII
m/z 741 [M+H+]
- Glucosa
m/z 579
- Galactosa
m/z 417
-H2O
m/z 399
HO
Romp.anillo E
m/z 273m/z 255
- H2O
Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear
Las sapogeninas esteroides pueden reconocerse en sus espectros de Resonancia Magnética
Protónica por las señales de los protones localizados sobre los carbonos unidos a átomos de
oxígeno como son: C-16, C-3, C-26, C-18 y C-19. La señal del protón 16 aparece alrededor de
4.0-4.5 en forma de un cuartete o un doble doblete. La señal del protón 3 aparece alrededor
de 3.5 cuando en el carbono 3 existe un grupo hidroxilo. Los protones del C-26 resuenan
en 3.3-4.0 (H-26 ecuatorial dd, J=10 y 2-3 Hz; H-26 axial dd, J=10 y 10 Hz). Los protones del
210
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metilo-18 resuenan como un singlete en 0.7-0.8 ppm y los del metilo-19 en 0.9-1.2 ppm,
también en forma de singlete. El desplazamiento químico de los protones de los metilos 21
y 27 depende de la estereoquímica del C-25. Así, estos resuenan como dobletes (J=7 hz)
alrededor de 1.08 y 0.98 ppm respectivamente en isómeros 25S, mientras que en los
isómeros 25R resuenan en 0.96 y 0.78 ppm respectivamente. La figura 3.18 resume estas
anotaciones. Al realizar el cálculo del espectro RMN-1H, con la herramienta en línea
nmrdb.org, se obtienen valores de desplazamiento de las señales de los protones mostrados
en la figura 3.18. con una aproximación de ± 0.5 ppm.
O
O
RO
R = H, Sapogenina esteroideR = carbohidrato(s), Saponina esteroide
3.5 m
0.9 - 1.2 s
0.7 - 0.8 s
4.5 m
3.3 - 4.0 m0.96 d (25R)1.08 d (25S) 0.78 d (25R)
0.98 d (25S)
Figura 3.19. Desplazamientos químicos RMN de varios protones del sistema espirostano.
En los espectros de Resonancia Magnética de Carbono-13, se aprecian las señales de los
carbonos 16, 22, 25, 26 y 27, alrededor de 80, 110, 30, 65 y 17 respectivamente. En el caso
del isómero 25S los carbonos C-25, C-26 y C-27 resuenan alrededor de 27, 65 y 16 ppm
respectivamente si no tienen sustituyentes oxigenados, mientras que en el isómero 25R
resuenan alrededor de 30, 67 y 17 ppm, respectivamente. La figura 3.20 resume los
desplazamientos químicos observados para varios de los carbonos característicos de los
compuestos con el sistema espirostano. Al realizar el cálculo con la herramienta en línea
nmrdb.org se obtienen despalzamientos químicos muy similares a los mostrados en la figura
3.20, con aproximación de ± 3 ppm.
211
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O
O
RO
R = H, Sapogenina esteroideR = carbohidrato(s), Saponina esteroide
110
65 (25S)67 (25R)
16 (25S)17 (25R)
80
Figura 3.20. Desplazamientos químicos de las señales de RMN-13C de varios carbonos presentes en el sistema espirostano.
Regla de Klyne
A partir de las rotaciones ópticas de la saponina y la sapogenina correspondiente, es posible
determinar si los carbohidratos ligados están enlazados a través de un enlace - ó -
glicosídico.
Para esto se convierten los valores []D de la saponina y la sapogenina en valores de
rotaciones moleculares [M]D mediante la fórmula:
[M]D = []D . M / 100
donde M es el peso molecular. Con estos valores se determina la diferencia:
C = [M]D saponina - [M]D sapogenina
La regla de Klyne establece que si C es alrededor de +305°, el enlace glicosídico es , pero
si es alrededor de -61°, el enlace glicosídico es .
Método de Hakomori
Debido a que muchas saponinas esteroides contienen más de un monosacárido ligado,
generalmente en el C-3, para poder establecer las uniones glicosídicas entre ellos y asignar
la estructura total de tales compuestos se utiliza el denominado método de Hakomori. Este
método se basa en que al hacer una metilación exhaustiva del glicósido, todos los grupos
hidroxilos libres presentes en los carbohidratos ligados son convertidos en grupos metoxilos.
En cambio, los enlaces glicosídicos y hemiacetal permanecen estables. La hidrólisis ácida del
producto de metilación libera los grupos hidroxilos que participan en los enlaces glicosídicos
a determinar y rompe los enlaces hemiacetal generando un grupo carbonilo y un hidroxilo
212
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libre en cada molécula de carbohidrato. Luego de esto se hace una reducción con NaBH4, en
la cual los grupos carbonilos obtenidos a partir de los enlaces hemiacetal son reducidos hasta
grupos metileno. La acetilación de esta mezcla lleva a que los hidroxilos formados por la
hidrólisis de los enlaces hemiacetal, y los hidroxilos obtenidos por la reducción del enlace
éter formen los correspondientes acetatos. Los productos obtenidos corresponden a los
denominados alditoles metilados y acetilados, y el patrón de metilación/acetilación permite
establecer las uniones entre ellos. Estos derivados son lo suficientemente estables y se
pueden identificar por CG-EM, y utilizando fases estacionarias quirales se pueden reconocer
si se trata de derivados alditoles de monosacáridos isómeros D ó L.
Para comprender mejor este método supongamos que se tiene una saponina como la
siguiente:
(R = aglicona esteroide)
O
O
O
O R
HO
HO OHHO
HO OH
61
1
Al someter a metilación exhaustiva esta saponina se produce:
Al someter a hidrólisis ácida este producto se rompen los enlaces glicosídico (1→6) y (1→O-
aglicona), y los dos enlaces hemiacetal de los dos monosacáridos, se obtiene:
O
O
O
O R
M e O
M e O O M eM e O
M e O O M e
(R = aglicona esteroide)
213
Ir al índice
Al tratar esta mezcla de derivados con borohidruro de sodio se reducen los grupos carbonilo
y se obtiene:
La acetilación de esta mezcla produce:
Al analizar por CG-EM esta mezcla se obtiene por un lado el tiempo de retención el cual es
característico de este tipo de derivados (denominados derivados alditol) y el espectro de
masas, el cual también es característico de cada uno de estos derivados, y se comparan con
compuestos de referencia. De esta manera se identifica con precisión cada uno de ellos.
Volviendo al ejemplo, el derivado alditol I corresponde al 1,5-diacetato de 2,3,4-trimetoxi-
ramnitol con un peso molecular de 306 g/mol, y el derivado alditol II corresponde al 1,5,6-
triacetato de 2,3,4-trimetoxi-glucitol con un peso molecular de 336 g/mol. El que un derivado
sea 1,5-diacetilado y el otro sea 1,5,6-triacetilado sugiere que en la saponina natural el C-6
de uno de los dos monosacáridos está implicado en el enlace glicosídico con el otro
monosacárido, y descartando el C-5 (presente en la mayoría de carbohidratos luego de
romper el enlace hemiacetal), se puede establecer que la unión glicosídica entre los dos
carbohidratos en este caso es (1→6).
O
O HM e O
M e O O M e
O HO
O H
O M eM e O
M e O
H OO H
R-OH+ +
++R-OHO H
O M eM e O
M e O
H OO H
O HM e O
M e O O M e
O H
++R-OAcO A c
O M eM e O
M e O
A c OO A c
O A cM e O
M e O O M e
O A c
I II
214
Ir al índice
Distribución natural
Las saponinas esteroides se encuentran principalmente en varias familias de la clase
monocotiledónea, como son: Liliáceas, dioscoreáceas y amarilidáceas (agaváceas). En las
dicotiledóneas, se las ha encontrado en las familias solanáceas y escrofulariáceas. En el reino
animal, las estrellas de mar constituyen un ejemplo de animales con saponinas esteroides.
Importancia farmacéutica
Aunque las investigaciones más recientes muestran que algunas saponinas esteroides tienen
actividades biológicas tales como antimicrobiana, citotóxica, anticáncer ictiotóxica,
molusquicida, insecticida, antihelmíntica, expectorante, diurética, cardiovascular,
antiinflamatoria, anti-úlcera, espermicida, analgésica, antipirética, sedante, antifertilidad,
antihepatotóxica, hemolítica, antimicótica, etc.); fundamentalmente se han constituido
desde hace bastante tiempo, como precursores únicos para la producción industrial de
muchos medicamentos esteroides tales como hormonas sexuales, corticoides,
contraceptivos orales y diuréticos. La producción industrial de estas sustancias requiere una
serie de procesos microbiológicos de fermentación y una serie de conversiones químicas
relativamente complejas y en su gran mayoría patentadas por importantes laboratorios
farmacéuticos. La Figura 3.21, muestra un esquema parcial de la producción de hormonas
esteroides a partir de la diosgenina obtenida de los rizomas de Dioscorea sp. La Figura 3.22
muestra una parte del esquema de la producción de medicamentos corticoides a partir de la
hecogenina acetilada. La Figura 3.23 describe la obtención de medicamentos esteroides a
partir del denominado "compuesto s" que es el intermedio clave para varias clases de
medicamentos esteroides.
215
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AcO
O
O
AcO
O
OAc
AcO
O
O
O
OAc
AcO
O
Br
OH
BrBr
O
O
HO OH
OH
Hidrocortisona
O
O
O OH
OH
Prednisona
Figura 3.21. Esquema del proceso de obtención de medicamentos esteroides a partir de diosgenina.
216
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AcO
O
OO
AcO
O
O
Br
O
OH
AcO
OO
Acetato de 11-cetopregnenolona
O
O
R
HO
F
9-fluorocorticoides
Figura 3.22. Esquema de la conversión de acetato de hecogenina en medicamentos fluorocorticoides.
217
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OH
OH
O
O
Compuesto S
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
HO
Rhizopus
O
O O
Testololactona
Aspergillus
Hidrocortisona
Streptomyces
14-hidroxicortisona
Curvularia
Figura 3.23. Algunas conversiones microbianas del denominado compuesto "S" un intermedio clave en la producción de medicamentos esteroides.
218
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Glicósidos cardiotónicos
A lo largo de la historia de la ciencia, se ha mostrado que numerosas naturales además de su
uso en diferentes actividades humanas que incluyen la caza y la guerra. Pero también se les
han atribuido a muchas de ellas, propiedades mágico-religiosas. Esos usos y costumbres han
servido para el desarrollo y conocimiento de muchas drogas y medicamentos. En el caso
particular de algunas sustancias obtenidas de plantas y animales, que algunas comunidades
han utilizado para la elaboración de sus armas primitivas como lanzas y flechas. Es conocido
por ejemplo el caso de indígenas que, en las puntas de sus flechas y lanzas, depositan
pequeñas cantidades de venenos obtenidos de ranas, que producen parálisis cuando dan en
el blanco de animales como algunas especies de monos que se constituyen en sus presas de
caza. Otro ejemplo es el uso de preparaciones a base de plantas que se depositaban en la
punta de las lanzas y flechas por comunidades indígenas para sus labores de caza y para la
guerra, muchos años después cuando se investigaron los componentes químicos de estas
plantas se encontraron sustancias que tenían efecto directo en el corazón. Históricamente
se han conocido los primeros como “venenos de sapo”, y los últimos como “venenos de
flecha”. Actualmente, se conoce que la producción de sustancias tóxicas es un sofisticado
mecanismo de defensa utilizado por muchas plantas, microrganismos y animales tanto
marinos como terrestres, para defenderse de sus depredadores incluido el hombre.
A continuación, se presentan diferentes aspectos químicos y de actividad biológica de
algunos de las sustancias presentes en estos venenos, y que tienen aplicación farmacéutica.
Los glicósidos cardiotónicos son sustancias constituidas de una porción esteroide, una
porción glicosídica y un anillo de -lactona ,ß-insaturada o -lactona-,ß-insaturada, que
actúan sobre el músculo cardiaco y por tanto se utilizan como medicamentos contra la
insuficiencia cardiaca. Se conocen entonces según el anillo lactónico dos grandes clases de
cardiotónicos: los cardenólidos, con anillo de -lactona, y los bufanólidos o escilanólidos, con
anillo de -lactona. La figura 3.26 muestra la estructura estereoquímica general de los
cardenólidos y bufanólidos.
219
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RO
O
O
RO
O
O
Figura 3.26. Estructura general de cardiotónicos. Cardenólidos a la izquierda, bufanólidos a la derecha (R = H, agliconas; R = carbohidratos, glicósidos).
Biogénesis
Se tienen evidencias experimentales de que la progesterona es un intermedio en el proceso.
La progesterona formada se condensa con una unidad C2 para dar origen a una cadena lateral
de 4 carbonos típica de los cardenólidos. La posterior oxidación y deshidratación origina el
anillo - lactona-,ß-insaturado.
Distribución natural
Los cardiotónicos son sustancias naturales menos distribuidas que los esteroles y las
saponinas, y se encuentran principalmente en las hojas de plantas de las familias
Escrofulariáceas, Apocináceas (especialmente los géneros Nerium, Thevetia, Cerbera,
Apocynum y Strophanthus), Liliáceas, Ranunculáceas y Moráceas.
Los bufanólidos se han encontrado también en ranas del género Bufus, y en las alas de
mariposas monarca, han sido considerados de interés por su potencial anticancerígeno.
Ensayos de reconocimiento
Los cardenólidos se pueden reconocer en muestras biológicas mediante los ensayos de
coloración con varios reactivos nitro, tal como se anotó para las sesquiterpenlactonas;
específicamente con los reactivos de Kedde, Legal y Raymond. Al igual que las saponinas
esteroides, dan resultados positivos con el reactivo de Liebermann-Burchard, lo que permite
diferenciarlos de las lactonas terpénicas y las cumarinas.
Por otro lado, los carbohidratos ligados incluyen generalmente a la D-glucosa, L-rhamnosa y
desoxiazúcares. Estos últimos pueden reconocerse mediante el ensayo de Keller-Kiliani.
220
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Hidrólisis
Los glicósidos cardiotónicos se hidrolizan fácilmente en soluciones ácidas liberando la
sapogenina y los carbohidratos ligados. En medio alcalino, además de liberarse la sapogenina
puede ocurrir la epimerización sobre el carbono 17 y apertura del anillo lactónico.
Hechos estructurales
Los cardiotónicos naturales en su gran mayoría, poseen:
-un anillo lactónico ,ß-insaturado en posición 17ß
-un grupo hidroxilo o glicosilo en posición 3ß
-un grupo hidroxilo en posición 14ß
-configuración cis entre los anillos A/B y C/D
-otros grupos hidroxilo en 1, 5, 12, 16, etc.
-el grupo metilo 19 algunas veces oxidado hasta alcohol o
aldehído
-1 a 4 unidades de carbohidrato ligadas al oxígeno del
carbono 3
-los carbohidratos ligados son principalmente glucosa y
desoxiazúcares como digitoxosa, cimarosa, etc.
Los desoxiazúcares son una característica importante de los glicósidos cardiotónicos, ya que
esta clase de carbohidratos se encuentra prácticamente restringida a estas sustancias
naturales. La Figura 3.27 muestra algunos ejemplos de cardiotónicos naturales y
desoxiazúcares más comunes.
221
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O
OH
digdig(acetildig)gluO
O
O
OH
SarO
O
HO
Digilánido-ADigitalis purpurea
SarmentocimarinaStrophantus spp.
222
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OH
GluO
O
O
O
O
EscilirósidoScila maritima
CHO
OHH
HCH3O
HHO
OHH
CH3
CHO
HH
OCH3H
OHH
OHH
CH3
CHO
HH
OHH
OHH
OHH
CH3
CHO
HH
OCH3H
HHO
OHH
CH3
D-Digitalosa D-Cimarosa D-Digitoxosa D-Sarmentosa
Figura 3.27. Algunos ejemplos de cardiotónicos y desoxiazúcares naturales (dig = digitoxosa).
Extracción y aislamiento
Al igual que las saponinas esteroides y otros glicósidos terpenoides, los cardiotónicos pueden
aislarse en forma glicosídica o como sapogeninas. En el primer caso se utiliza el método ya
descrito para las saponinas esteroides (desengrase, extracto polar, resina de intercambio
iónico, Sephadex y cromatografía HPLC), mientras que en el segundo caso se realiza una
hidrólisis ácida seguida de partición con un solvente orgánico (generalmente cloroformo) y
cromatografía en sus diferentes formas, especialmente con sílica gel. Otros métodos
incluyen la fermentación del material vegetal, para la obtención de las agliconas. Como se
mencionó en el capítulo 1, los métodos de extracción con ultrasonido y con sistemas de
microondas, presentan ventajas sobre los métodos clásicos de extracción, tanto en
eficiencia, como rapidez, y menos efectos sobre el medio ambiente.
Para el fraccionamiento por cromatografía en columna con sílica gel pueden utilizarse
mezclas de solventes como diclorometano/metanol/agua 91:22:68. Luego de este
fraccionamiento e hidrólisis ácida, las geninas pueden analizarse y separarse por HPLC-fase
223
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reversa; mientras que los carbohidratos ligados pueden analizarse por cromatografía en
papel eluyendo con la mezcla Butanol/Acido Acético/Agua 4:1:5.
Con las técnicas acopladas como HPLC-Espectrometría de masas se pueden analizar
extractos crudos que contienen glicósidos cardiotónicos o saponinas, mediante técnicas
combinadas como LC-TMS (HPLC combinada con Espectrometría de masas con interface
termospray) y LC-CF/FAB (HPLC combinada con Espectrometría de masas FAB de flujo
continuo), entre otras.
Espectroscopia infrarrojo
Los cardiotónicos además de las bandas características de la funcionalidad esteroide,
presentan bandas de absorción características del grupo carbonilo lactónico ,ß-insaturado
alrededor de 1715-1745 cm-1.
Espectroscopia ultravioleta
El cromóforo -lactona ,ß-insaturada muestra un máximo de absorción alrededor de 215-
225 nm.
Espectrometría de masas
Los espectros de masas de impacto electrónico (70 eV) de las agliconas de cardenólidos
presentan el fragmento característico m/z 111, el cual se origina por el mecanismo ilustrado
en la Figura 3.28. Además, se observa la pérdida de CO2 (M-44).
Para los glicósidos se utiliza actualmente la espectrometría de masas con ionización electro-
spray (ESI-MS).
224
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Figura 3.28. Mecanismo de formación de los fragmentos m/z 111 y M-44, característicos de cardenólidos.
O
O
H
R
O
O
R
a
b
C H 2+
O
O
a
m/z 111
R
[M-CO 2 ]+
225
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Figura 3.29. Esquema de fragmentos FAB del 9-hidroxiescilifaeósido.
Espectrometría de Resonancia Magnética Nuclear
Los cardenólidos se reconocen por RMN-1H por las señales del protón 3 (4.4 ppm, m), del
metilo 18 (0.9, s), del metilo 19 (1.1, s), el protón 17 (2.8-3.5 ppm), el protón del hidroxilo 14
(5.0-6.0 ppm, s), los protones 21a y 21b (4.8-5.8 ppm, dd, J=18 y 2 Hz) y el protón olefínico
22 (6.0-6.4 ppm, s ancho). En el espectro de RMN-13C se observan las señales características
en 74 (C-3), 64 (C-14 hidroxilado), 36 (C-21), 96 (C-22), 119 (C-20) y 214 (C-23).
Los bufanólidos se reconocen por RMN-1H por las señales del protón 3 (4.0-5.5 ppm,
quintete ancho), del metilo 18 (0.9, s), del metilo 19 (1.1, s), el protón 21 (7.3, d, J=2-3.5 Hz),
el protón 22 (8.0, dd, J=10 y 2-3.5 Hz) y el protón 23 (6.3 ppm, d, J=10 Hz). En el espectro de
RMN-13C se observan las señales características en 76 (C-3), 16-20 (C-18 y C-19), 119-125
(C-20), 150 (C-21 y C-22), 112-116 (C-23) y 165 (C-24).
Los desoxiazúcares presentes en los glicósidos cardiotónicos presentan espectros RMN
característicos.
Utilidad farmacéutica
Los cardenólidos son conocidos inhibidores de la enzima Na/K-atpasa, por esto tienen acción
inotrópica positiva, es decir, incrementan las fuerzas de contracción del músculo cardíaco.
Por esta propiedad las drogas que contienen este tipo de sustancias se utilizan en algunos
países, particularmente de Europa para el tratamiento de dolencias cardiacas.
O
O(L )R a m nos il
O H
O H
O
O H
m/z 415
m/z 561 (M-H) -
226
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Pero más recientemente se ha comprobado que tanto los cardenólidos como los
bufanólidos, presentan actividad anti cáncer. Los bufadienólidos en particular, tienen
además actividades biológicas que incluyen la regulación del tono cardíaco, efecto
anestésico, regulación de la presión sanguínea y estimulación respiratoria. Los
bufadienólidos aislados de anfibios, algunos de ellos en vía de extinción, emergen como una
clase de compuestos naturales de biodiversidad química impresionante. Tienen selectividad
moderada contra células tumorales humanas, especialmente las de la piel de sapo como
bufalina, cinobufagina, telocinobufagina y marinobufagina. Los estudios de relación
estructura-actividad antitumoral para los bufadienólidos muestran que el tamaño y la
electronegatividad de los sustituyentes presentes en los carbonos 1, 3, 5, 10, 11, 12, 15 y 16
determina la mayor o menor actividad antitumoral.
Los cardenólidos como la digoxina, la cual es una droga usada clínicamente, inducen
apoptosis de células de cáncer mamario, de pulmón y de próstata. También se ha reportado
su potencial acción antiviral.
Algunas drogas vegetales que contienen cardiotónicos
Azuceno de la habana
Corresponde al Nerium oleander (Fam. Apocináceas). Esta planta es cultivada para fines
ornamentales, y es común verla en diferentes sitios de la ciudad de Medellín, con flores
rosadas o blancas. La variedad de flores blancas tiene reportados usos como antídoto,
antibacterial, antiepiléptico, anticancerígeno, cardiotónico y como depresor del Sistema
Nervioso Central (SNC). De las raíces, Huq y col., aislaron un cardenólido que además de
cardiotónico es antibacterial. Las hojas contienen varios cardenólidos con acción depresora
sobre el sisema nervioso central SNC.
Bulbo de escila
La droga la constituyen los bulbos de Drimia maritima (Fam. liliáceas). Contiene bufanólidos
como el escilareno-A el cual produce irritación gástrica la que a su vez induce la secreción de
los bronquiolos, por lo cual se usa como expectorante.
Estrofanto
Esta droga la constituyen las semillas desecadas de varias especies de plantas del género
Strophantus, y es usada como veneno de flechas por los nativos de algunas tribus de Africa.
Esta droga contiene el glicósido estrofantina.
Heléboro negro
Corresponde a Helleborus niger (Fam. Ranunculáceas).
227
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Hojas de digital
La droga la constituyen las hojas desecadas de Digitalis purpurea (Fam. escrofulariácea). Esta
planta es cultivada en Europa, pero en Colombia es más bien escasa y se utiliza con fines
ornamentales. Se la conoce con el nombre vulgar de "campanitas" o "dedalera" y crece
silvestre en localidades como a orillas de la autopista Medellín-Bogotá en el sector de
Sasaima. Los principios activos son una mezcla de glicósidos cardiotónicos denominados
purpureaglicósidos, en los cuales la sapogenina es la digitoxigenina. Uno de estos es el
purpureaglicósido A.
La especie relacionada Digitalis lanata, también contiene glicósidos cardiotónicos, pero con
la característica particular de que uno de los carbohidratos ligados posee un grupo hidroxilo
acetilado. Esta especie contiene los denominados lanatósidos.
La especie D. lanata, aunque es originaria de Europa, también se encuentra en nuestro país,
específicamente en la sabana de Bogotá.
Estas drogas vegetales se comercian en Europa bajo nombres comerciales como Digitalina,
Cardinatina, Cristalloxina, Digoxina, etc.
Lirio de los valles
La droga la constituyen las partes aéreas de Convallaria majalis (Fam. liliáceas). Esta contiene
varios cardiotónicos, entre ellos la convalatoxina.
Thevetia peruviana
Las semillas de esta planta contienen cardiotónicos como el peruvósido.
Especies relacionadas existentes en Colombia
La especie Digitalis purpúrea se introdujo antes de 1850 a Bogotá y se fué extendiendo a los
climas fríos de la cordillera oriental. El "lirio de los valles" Convalaria majalis se cultiva como
ornamental y se conoce con el nombre de "campana de mayo". El "catapé" ó "cobalonga"
es ornamental en poblaciones de clima cálido y corresponde a la Thevetia neriifolia. El
"azuceno de la habana" Nerium oleander se encuentra en varios pisos climáticos p. ej. en
Cartagena y en Medellín, y es utilizado para fines ornamentales. El "rajalgar" corresponde a
Asclepias curasavica, cuya savia es utilizada en preparados para aflojar los dientes. La "fruta
de culebra" es una apocinácea: Rauwolfia tetraphylla, de la cual se obtiene también un
alcaloide hipotensor.
228
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Carotenoides
Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 átomos
de carbono derivados biosintéticamente a partir de dos unidades de geranil-geranil-
pirofosfato, en su mayoría son solubles en solventes apolares y de coloraciones que oscilan
entre el amarillo (por ejemplo, el ß-caroteno) y el rojo (por ejemplo, el licopeno). El nombre
de carotenoides está relacionado con el hecho de que los primeros aislados fueron de la
zanahoria Daucus carota. La estructura general es la de una cadena hidrocarbonada central,
con dos anillos de seis carbonos en los extremos, con excepción del licopeno. La Figura 3.30
muestra algunos ejemplos de los carotenoides más distribuidos en la naturaleza.
229
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Figura 3.30. Ejemplos de carotenoides naturales ampliamente distribuidos.
230
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Clasificación
Los carotenoides se clasifican en dos grupos: carotenos y xantofilas. Los carotenos solo
contienen carbono e hidrógeno (por ejemplo, el ß-caroteno, el licopeno, etc.), mientras que
las xantofilas contienen además oxígeno (por ejemplo, la luteína). Los apocarotenoides, son
carotenoides que no contienen los anillos de los extremos de la cadena, por ejemplo, la
crocetina.
Biogénesis
La biosíntesis de los carotenoides en las plantas y algas fotosintéticas está asociada a la ruta
del metileritritol-4-fosfato (sigla inglesa: MEP). Dos moléculas de geranil-geranil-pirofosfato
(sigla inglesa: GGPP) se condensan enzimáticamente para formar el intermedio 15-cis-
fitoeno, con la participación de la enzima denominada fitoeno-sintasa. El fitoeno es
convertido luego en licopeno. El licopeno a su vez genera dos subrutas biosintéticas, una con
la participación de la licopeno-ε-ciclasa y la otra con la licopeno-β-ciclasa. En el primer caso
da origen a ⸹-caroteno, α-caroteno, zeinoxantina y luteina. En el segundo caso, se originan
γ-caroteno, β-caroteno, zeaxantina, astaxantina, anteraxantina, capsantina, violaxantina,
capsorubina y neoxantina.
Distribución y estado natural
Los carotenoides se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal, en bacterias,
y muy pocos se han reportado en animales (por ejemplo, los colores rojizos de las plumas del
flamenco son debidos a la cantaxantina, un carotenoide), y particularmente invertebrados
marinos como las esponjas, estrellas de mar, pepinos de mar, erizos de mar, y otros.
En los animales superiores el ß-caroteno es un requerimiento dietario esencial pues es
precursor de la vitamina A.
A los carotenoides se les encuentra en forma libre, como ésteres de ácidos grasos o como
glicósidos. Sin embargo, los glicósidos carotenoides son muy raros, un ejemplo de estos
últimos es la crocina.
Los carotenoides se encuentran principalmente en partes aéreas de las plantas,
especialmente en hojas, tallos y flores, en frutos (por ejemplo, tomate, pimentón, etc.), y en
menor proporción en raíces (por ejemplo, la zanahoria).
Es importante mencionar que, aunque se conocen muchos carotenoides de fuentes
naturales, en la medida que las técnicas analíticas evolucionan, estas permiten no solo la
identificación de los que están presentes en concentraciones mayores, sino de muchos no
conocidos pero que están presentes en concentraciones menores inclusive a nivel de trazas.
Un ejemplo es un estudio reciente que muestra como en el azafrán Crocus sativus, utilizando
231
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una combinación de técnicas como la cromatografía HPLC y la espectrometría de masas ESI
tándem; se identificó la norcrocetina, un compuesto nuevo.
Nomenclatura
Como es el caso con muchas sustancias naturales, en la medida que se han ido descubriendo,
se les ha dado nombres comunes, y generalmente relacionados con las fuentes naturales
desde donde se obtienen. Para propósitos del estudio de los carotenoides, se cuenta con
una nomenclatura semi sistemática. Esta tiene en cuenta los anillos y porciones de los
extremos de la estructura molecular, y las geometrías de los enlaces dobles (E o Z). La figura
3.31, muestra los siete grupos terminales que se encuentran en los carotenoides (44). De
acuerdo con esto el β-caroteno, corresponde por sus extremos al β,β-caroteno; el licopeno
corresponde al ψ,ψ-caroteno (psi,psi-caroteno).
Beta Epsilon Gamma
Kappa Fi Chi
Psi
Figura 3.31. Estructuras químicas de los siete grupos terminales presentes en carotenoides naturales
(43).
232
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Extracción y aislamiento
Los carotenoides debido a la alta conjugación de enlaces dobles presentes en sus moléculas
se descomponen por efecto de la luz, la temperatura y el aire. La luz favorece reacciones
fotoquímicas que cambian la estructura original del carotenoide (por ejemplo, isomerismo
cis y trans) es un factor a considerar al momento de realizar su extracción. El calor también
favorece reacciones térmicas de degradación. El aire debido al oxígeno favorece la
oxigenación de los enlaces dobles a funciones epóxido, hidroxilos y peróxidos, entre otros.
Por estas razones la extracción de carotenoides se debe preferiblemente realizar en
condiciones de ausencia de luz, a temperatura ambiente o menor, y en ausencia de oxígeno
(por ejemplo, con una atmósfera artificial de nitrógeno). Además, se debe realizar lo más
rápido posible, y a partir de tejidos frescos, para evitar la degradación por la acción conjunta
de estos factores adversos.
Debido a que los carotenoides en su mayoría son de baja polaridad y carácter liposoluble, y
que se deben obtener de los tejidos vegetales frescos, en los cuales, el agua constituye más
de un 80%, es necesario secar la muestra antes de la extracción. El mejor método de secado
de muestras vegetales es la liofilización, la cual garantiza que no ocurren cambios químicos
en los compuestos durante el proceso de secado. Para muestras pequeñas, y cuando no se
cuenta con la liofilización, un procedimiento recomendable es deshidratar los tejidos con
etanol a ebullición seguido de filtración. El tejido deshidratado se puede entonces extraer
con un solvente apolar.
Si en el extracto existen carotenoides esterificados, estos se pueden hidrolizar disolviendo el
extracto en un volumen pequeño de KOH 60% alcohólico. Esta mezcla se deja en la oscuridad
durante la noche, con atmósfera de nitrógeno, a temperatura ambiente y con agitación
magnética, con lo cual los carotenoides son liberados. Si se desea un proceso más rápido, es
aconsejable la ebullición durante 5-10 minutos, acompañada de ultrasonido.
Las mezclas de carotenos y las xantofilas mono- y dihidroxiladas pueden separarse agitando
una solución en éter de petróleo con un volumen de metanol al 90%. Las xantofilas
dihidroxiladas quedan en la fase metanólica, las monohidroxiladas y los carotenos quedan
en la fase etérea. Repitiendo este proceso con la fase etérea se separan en la fase metanólica
las xantofilas monohidroxiladas, y en la fase etérea quedan los carotenos. Las xantofilas
separadas en las fases metanólicas pueden recuperarse extrayéndolas con éter etílico.
Debido a que los extractos de carotenoides generalmente están impurificados por otras
sustancias como los esteroles, estos se pueden eliminar dejando el extracto concentrado en
solución de éter etílico, tapado y a -10°C durante la noche. De esta manera los esteroles se
precipitan y pueden ser retirados por centrifugación o filtración.
233
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Actualmente se están estudiando métodos alternativos a estos procesos de extracción,
teniendo en cuenta especialmente que el proceso de extracción sea más rápido, más
eficiente, y menos costoso desde los puntos de vista económico y ambiental. En el caso de
los carotenoides de las microalgas marinas, se trabajan métodos que incluyen el uso de
electricidad para la desintegración de las células que contienen los carotenoides, como es el
caso de la extracción asistida con campos eléctricos pulsados, conocida por la sigla inglesa
PEF, la cual requiere de menores volúmenes de solventes orgánicos. También la extracción
asistida con microondas MAE, y la extracción asistida con ultrasonido UAE, que disminuyen
los tiempos de extracción; y la extracción con fluidos supercríticos SFE con dióxido de
carbono, que tiene uso no solo para propósitos analíticos sino a nivel industrial. Una
alternativa al uso de solventes orgánicos es usar mezclas de estos con otras sustancias como
por ejemplo los triglicéridos. Al mezclar los triglicéridos por ejemplo con el acetato de etilo,
se disminuye su viscosidad y se facilita su extracción.
Una vez obtenido el extracto o los extractos de carotenoides, estos se pueden separar y
analizar por cromatografía en capa fina, en papel o en columna. El método más usado es la
cromatografía en capa fina con varias clases de fases estacionarias que incluyen: óxido de
magnesio activado, sílica gel, hidróxido de calcio y fosfato de magnesio entre otros.
Para la separación y aislamiento cromatográfico con sílica gel algunos autores recomiendan
alcalinizar la sílica con KOH al 3% para prevenir la isomerización durante el desarrollo
cromatográfico. Además, como los carotenoides comienzan a descomponerse al secarse la
placa por la evaporación del eluente, recomiendan trabajar con atmósfera de un gas inerte.
Para proteger los colores contra la oxidación, las placas cromatográficas pueden rociarse con
una solución de aceite de parafina al 5% en éter de petróleo.
Más recientemente y gracias al avance de los métodos cromatográficos instrumentales es
posible el aislamiento rápido de carotenoides puros. En este sentido, la cromatografía líquida
de alta eficiencia (HPLC) es muy utilizada actualmente, debido a que se puede trabajar a bajas
temperaturas, en ausencia de luz y aire, y es muy sensible por los grupos dienos conjugados
abundantes en las estructuras de los pigmentos carotenoides. Aunque se han utilizado
columnas de fase normal, son más utilizadas las de fase reversa, especialmente las de
octadecilsilano (columnas C-18). La utilización de detectores como el de arreglo de diodos
DAD, y espectrómetros de masas; facilita el proceso de separación e identificación de los
carotenoides presentes en las mezclas de carotenoides presentes en las plantas.
En la actualidad, el procedimiento de análisis e identificación de los carotenoides en
muestras biológicas se realiza en tres etapas principales. En la primera, se obtiene el extracto
crudo. Posteriormente, el extracto es sometido a extracción en un cartucho con una fase
sólida (de sílica gel para eliminar interferencias polares, o de octadecilsilano u octilsilano,
234
Ir al índice
para eliminar impurezas apolares, ó ambos). El extracto se recupera nuevamente por elución
con un solvente adecuado, y finalmente se somete a análisis y/o fraccionamiento preparativo
por CLAE. La identificación puede hacerse por comparación con los tiempos de retención de
carotenoides estándares, o en el caso preparativo los carotenoides aislados se someten a
análisis espectrales de masas, RMN, etc.
El desarrollo reciente de interfaces CLAE-Espectrometría de masas, y detectores como los de
arreglo de diodos, permiten obtener los correspondientes espectros de masas y UV-visible,
los cuales facilitan el proceso de identificación. A manera de ejemplo, un estudio mediante
HPLC-DAD-MS, en los cálices de Hibiscus sabdariffa permitió determinar el contenido de los
carotenoides más abundantes como son luteína y β-caroteno. La luteína muestra máximos
de absorción UV-Vis en 418, 444 y 471 nm. El β-caroteno, en 421, 451 y 476 nm. En el
espectro de masas la luteína muestra ión pseudomolecular m/z 569 [M+H]+, y el β-caroteno,
muestra m/z 537 [M+H]+.
Como muestras de referencia pueden obtenerse ß-caroteno, canthaxantina y crocina (del
azafrán), luteína, violaxantina y neoxantina (de las hojas de cualquier planta superior),
licopeno (del tomate rojo o de salsa ó pasta de tomate comercial), y capsantina del pimentón
rojo.
Es importante anotar que existen métodos reportados de análisis de carotenoides en plasma
sanguíneo, a partir de muestras de solo 10 µl.
Ensayos de reconocimiento
Los carotenoides como se anotó anteriormente son en su mayoría pigmentos liposolubles
de colores amarillo, naranja y rojo. Por lo cual se les puede reconocer fácilmente en los
extractos vegetales con ayuda de la CCF. Al adicionarle ácido sulfúrico concentrado a las
manchas sobre la placa cromatográfica, o a una solución anhidra en un solvente como
cloroformo o diclorometano; los carotenoides toman coloraciones azulosas. Debido a la
presencia de varios enlaces dobles C=C conjugados, reaccionan también con el reactivo de
Liebermann-Burchard, usado para el reconocimiento de esteroides y/o triterpenoides, por
lo tanto debe tenerse en cuenta que los carotenoides son falsos positivos para esteroides
y/o triterpenoides, sin embargo la presencia de los carotenoides en una muestra vegetal se
reconoce por sus colores característicos (amarillo-naranja-rojo), mientras que la mayoría de
esteroides y triterpenoides conocidos hasta hoy son incoloros.
Características espectrales
Como se anotó anteriormente, aunque es relativamente fácil identificar la mayoría de
carotenoides por comparación de muestras y estándares mediante la CCF y la CLAE, cuando
235
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se tienen carotenoides que no es posible identificar por tales métodos, es necesario recurrir
a los métodos espectrales como UV-visible, IR, EM y RMN.
El espectro visible de los carotenoides es bastante característico en el rango de 350 a 550
nm. Se observa un máximo alrededor de 450 nm y generalmente se aprecian dos máximos u
hombros a cada lado. La Tabla 3.6 presenta los datos de los espectros visible de algunos
carotenoides, en n-hexano y en cloroformo. Sin embargo, recientemente se ha comenzado
a investigar la relación que existe entre la geometría E/Z de los carotenoides y una banda de
absorción que se observa entre 265 y 300 nm, a la que se denomina banda uv lejana.
Tabla 3.6. Máximos de absorción del espectro visible y datos de espectrometría de masas
de varios carotenoides naturales.
PIGMENTO MÁXIMOS DE ABSORCIÓN (nm) m/z
n-Hexano ó
éter de p.
Cloroformo
-Caroteno 422, 444, 473 454, 485 536 (M+)
-Caroteno 425h, 451, 482 466, 497 536 (M+), 537.4 (M+H+) APCIMS
-Caroteno 437, 462, 494 447, 475, 508 537 (M+H+), 467 [M-69]+, 444 [M-92]+
δ-Caroteno 428, 455, 481 - 537 [M+H+], 481 [M + H-56]+, 444 [M-92]+
-Caroteno 419, 444, 475 418, 442, 471 (Etanol) -
Licopeno 446, 472, 505 456, 485, 520 536 (M+), 537 (M+H+) APCIMS
Luteína 420, 447, 477 428, 456, 487 568 (M+), 569 [M+H+], 551 (M+H-H2O)+, 533, 495, 477, 463, 459
Violaxantina 443, 472 424, 452, 482 601 [M+H+], 583, 565, 509, 491, 221
Zeaxantina 423, 451, 483 429, 462, 494 569.4 (M+H+), 551.4 (M-H2O+H+),
236
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PIGMENTO MÁXIMOS DE ABSORCIÓN (nm) m/z
n-Hexano ó
éter de p.
Cloroformo
Neoxantina 415, 437, 466 421, 447, 477 601 ([M+H]+, 583 [M-H2O + H]+, 547, 509, 221
13-cis-neoxantina - 326, 418, 443, 471 583 [M H-18]+, 565, 509 [M+H-92]+, 491 [M+H-18-92]+, 221
Rubixantina 432, 462, 494 439, 474, 509 -
Fucoxantina 425, 450, 478 457, 492 -
Criptoxantina 425, 451, 483 433, 463, 497 552 (M+)
Astaxantina 378, 400, 424 - 597 (M+H+)
Bixina 432, 456, 490 433, 470, 502 -
Canthaxantina 466 482 565 (M+H+)
Capsantina 450, 475, 505 - 585 (M+H+)
Capsorubina 445, 479, 510 - -
Crocina 999. 3 (M+Na+)
Crocetina 400, 422, 450 413, 435, 462 -
El espectro IR generalmente no es muy útil para la caracterización de la mayoría de
carotenoides, sin embargo, puede servir para el reconocimiento de carotenoides raros, pues
proporciona información sobre la presencia de otros grupos funcionales como grupos
carbonilo y enlaces triples C-C.
Debido a la baja volatilidad de los carotenoides, sus espectros de masas de impacto
electrónico son de difícil interpretación y no proporcionan el ion molecular, por lo cual
prácticamente no se usan. Sin embargo, gracias al desarrollo de las técnicas de ionización
suave, se obtiene información estructural muy valiosa.
Como en la gran mayoría de metabolitos secundarios, en lo correspondiente a la
caracterización química, la mejor técnica para la elucidación estructural de los carotenoides
es la RMN en sus diferentes modalidades mono- y bidimensionales.
237
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Actividad biológica
Los carotenoides son pigmentos naturales presentes en plantas, algas y bacterias
fotosintéticas, no son biosintetizados por el organismo humano y por tanto deben ingerirse
en los alimentos o mediante suplementos. En el organismo humano desempeñan diferentes
funciones que incluyen su actividad antioxidante. De manera individual carotenoides como
el β-caroteno es un precursor de la vitamina A (función pro-vitamina A). La luteína, la
astaxantina y la zeaxantina hacen parte del pigmento macular de los ojos. La luteína reduce
la degeneración macular producida por el envejecimiento. Además, se tienen algunas
evidencias de que los carotenoides mejoran la función cognitiva y la salud cardiovascular, y
también pueden ayudar a prevenir algunos tipos de cáncer como el licopeno.
Los carotenoides en general son reconocidos por ser precursores de la vitamina-A (o retinol),
y los denominan provitaminas. No todos presentan la misma capacidad provitamina-A,
mientras el todo trans-β, β-caroteno, tiene una actividad relativa del 100%, pues su clivaje
por la parte central genera 2 moléculas de vitamina A, otros carotenoides como el 9-cis-α-
caroteno, solo tiene una actividad relativa del 16%.
Además de su papel como provitamina A, los carotenoides están siendo investigados en
cuanto a otras actividades biológicas que incluyen su actividad antioxidante, la cual se ha
encontrado que puede ser útil en prevenir el riesgo de enfermedades degenerativas como
Alzheimer y Parkinson, o enfermedades como el cáncer. En particular, β-caroteno,
astaxanthina, cantaxanthina y zeaxanthina promueven la reducción en tamaño y cantidad de
neoplasias del hígado en experimentos in vivo. La astaxanthina, muestra un potencial
interesante como protector del miocardio. La sifonoxanthina, aislada de un alga, presenta
una interesante actividad antileucémica in vitro.
El ß-caroteno suplementado en la dieta ha mostrado alguna evidencia de acción antitumoral
en ratas. Las bastadinas aisladas de esponjas marinas presentan acción antitumoral, contra
el cáncer de la piel y en leucoplasias orales. El Vesanoid, es un derivado de la vitamina A
que presenta acción citotóxica, y es usado para el tratamiento de leucemia promielocítica
aguda.
Alcaloides esteroidales
Diversas plantas de familias como las solanáceas, especialmente las del género Solanum, son
conocidas como fuentes de sustancias estructuralmente muy relacionadas con las saponinas
esteroides y son los alcaloides esteroidales, por ejemplo, la tomatidina, presente en las hojas
del tomate Lycopersicon esculentum (Figura 3.32).
238
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Estas sustancias poseen características tanto de esteroides como de alcaloides, este es el
caso de la solasodina presente en frutos de la especie colombiana Solanum marginatum
(figura 3.32).
Para su análisis cromatográfico existen métodos reportados por HPLC, como por ejemplo
para los alcaloides de la papa Solanum tuberosum.
En cuanto a sus características espectrales, las agliconas con el núcleo espirosolano se
reconocen en sus espectros de masas de impacto electrónico por los fragmentos m/z 114 y
138, los cuales se originan por el mismo mecanismo de los iones m/z 115 y 139 de las
sapogeninas esteroides, solo que en lugar del átomo de oxígeno del anillo pirano, los
alcaloides tipo espirosolano, contienen un átomo de nitrógeno (ver figura 3.17).
Los alcaloides con núcleo 3-aminoespirosolano también se reconocen en sus espectros de
masas por los fragmentos m/z 56, 114 y 138.
En el espectro de RMN-1H (determinado generalmente en metanol perdeuterado) el H-3
resuena alrededor de 3.5 ppm como un multiplete, si existe un sustituyente 3-O-glicosilo, o
resuena alrededor de 2.6 ppm si existe un grupo 3-amino. El protón H-16 se observa como
un multiplete alrededor de 4.3 ppm; y los protones H-26 resuenan en señales separadas
alrededor de 2.6 ppm. En el espectro de RMN-13C el C-3 resuena alrededor de 80 ppm si es
un compuesto 3-Oglicosilado, o alrededor de 52 ppm si es un compuesto 3-aminado. El C-16
resuena alrededor de 79 ppm, el C-22 alrededor de 100 ppm, y el C-26 alrededor de 56 ppm.
239
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HO
O
N
Solasodina (tipo solasodano)
HO
O
N
Tomatidina
Figura 3.32. Estructuras químicas de alcaloides esteroidales naturales.
En Colombia existen varias especies de Solanum potencialmente útiles para la obtención de
precursores esteroides para la síntesis de medicamentos. Por ejemplo, “cujaca" Solanum sp.
es muy usado en el departamento de Nariño para el lavado de ropas (machacando las frutas).
El "friega-platos", Solanum mammosum, es una planta venenosa también conocida como
"mata-cucarachas", y el "lulo'e perro" Solanum marginatum, un arbusto que abunda en los
basurales y lotes baldíos de la Sabana de Bogotá.
240
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NH
NH
O
Sarcorucinina-F (tipo alcaloide pregnano)
Figura 3.33. Estructura química de la sarcorucinina-F, aislada de Sarcococca ruscifolia, activa contra células de varias líneas de células cancerosas.
Los alcaloides esteroidales presentan diversas actividades biológicas que incluyen su acción
antimicrobiana, antifúngica y antimalárica. También se les ha encontrado potencial contra el
cáncer. pero también se reporta su neurotoxicidad.
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246
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Capítulo 4
Alcaloides
247
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En los organismos vivos se encuentran además de los metabolitos primarios nitrogenados,
como las proteínas y los aminoácidos, muchas sustancias secundarias nitrogenadas, entre
las cuales son de interés farmacéutico los alcaloides, por sus notables actividades biológicas,
particularmente sobre el sistema nervioso.
Se conocen más de 25.000 alcaloides naturales, que comprenden desde estructuras
simples como la coniina, un alcaloide de la cicuta, hasta estructuras complejas como la
neurotoxina batracio toxina de la piel de una rana colombiana (Figura 4.1).
Coniina Batraciotoxina
Figura 4.1. Estructuras químicas de dos alcaloides naturales: coniina y batraciotoxina.
El interés por estos compuestos es debido a que desde tiempos antiguos han sido utilizados
para la caza, la guerra, como euforizantes, psicodélicos, estimulantes, o como remedios
contra diferentes enfermedades, además por sus propiedades farmacológicas y tóxicas
comprobadas son muy importantes para el conocimiento del químico farmacéutico.
A continuación, se profundizará sobre aspectos relacionados con la biogénesis, los métodos
de análisis y la identificación o caracterización, como una aproximación al conocimiento
químico de este amplio grupo de sustancias naturales.
Definición
Los alcaloides naturales son sustancias de origen biológico que además de carbono,
hidrógeno, y oxígeno; contienen nitrógeno. Como definición, puede afirmarse que:
Los alcaloides son sustancias:
• De carácter alcalino (como su nombre lo indica)
• Con por lo menos un átomo de N en un heterociclo
N H
H
O R H
O
N
H O
O
H H O
248
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• Que presentan actividad biológica
• Que se encuentran especialmente en las plantas superiores
Un ejemplo de estas sustancias es la cocaína (figura 4.2). Existen sin embargo sustancias
nitrogenadas naturales que no cumplen alguna de estas cuatro características, como por
ejemplo la piperina, presente en las semillas de la pimienta negra, que tiene carácter
neutro, y la mezcalina que contiene nitrógeno, pero en una cadena (no en un anillo); sin
embargo, ambas sustancias tienen actividad biológica.
O NH2
O
Mescalina
Figura 4.2. Estructuras químicas de alcaloides: cocaína, piperina y mescalina.
La Figura 4.3. muestra las estructuras químicas de algunos alcaloides naturales presentes
en drogas vegetales.
O
O
N
O O
C o c a í n a
O
O
N
P i p e r i n a
O
249
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250
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251
Ir al índice
252
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253
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Figura 4.3. Estructuras químicas de varios alcaloides naturales.
Función biológica
Existen evidencias experimentales obtenidas a través de diferentes estudios, que sugieren
que los alcaloides con producidos por muchas plantas, para defenderse de diferentes
plagas y depredadores, es decir como mecanismo de defensa vegetal. Esto explica los
hallazgos de que muchas de estas sustancias naturales presentan actividades
antibacteriana, antimicótica, paralizante, etc.
Otras hipótesis sugieren que algunos alcaloides naturales son productos de desecho del
metabolismo vegetal, o que son reservas químicas de nitrógeno para los procesos de
crecimiento y desarrollo de las plantas que los producen.
254
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Clasificación
Debido a la gran cantidad de alcaloides que se han aislado e identificado de fuentes
naturales, se hizo necesario clasificarlos para su estudio. Existen fundamentalmente dos
sistemas de clasificación basados en la fuente biológica o en aspectos estructurales
químicos.
La clasificación biológica, los clasifica por el género y familia especialmente, y así entonces
se habla de los alcaloides de las amarilidáceas, los alcaloides del peyote, los alcaloides del
opio, los alcaloides del tabaco, etc.
La clasificación química toma en cuenta la presencia de ciertos núcleos químicos, por
ejemplo:
• Alcaloides pirrolizidínicos (p. ej. europina)
• Alcaloides pirrolidínicos (p. ej. higrina)
• Alcaloides piridínicos (p. ej. nicotina)
• Alcaloides piperidínicos (p. ej. conhidrina)
• Alcaloides tropánicos (p. ej. cocaína)
• Alcaloides indólicos (p. ej. gramína)
• Alcaloides β-carbolínicos (p. ej. harmina), etc.
Otra clasificación muy útil desde el punto de vista bioquímico clasifica los alcaloides de
acuerdo a su aminoácido precursor biosintético:
1. Alcaloides alifáticos
• derivados de la ornitina (pirrolidinas, tropánicos, pirrolizidínicos)
• derivados de la lisina (piperidinas, quinolizidínicos)
2. Alcaloides aromáticos
• derivados del ácido nicotínico (piridinas)
• derivados de la fenilalanina y la tirosina (isoquinoleinas)
• derivados del triptófano (indólicos, quinoleinas)
• derivados del ácido antranílico (quinoleinas)
• derivados de la histidina (imidazoles)
3. Alcaloides de origen diverso
• alcaloides terpénicos y esteroidales
255
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• alcaloides diversos (purinas, macrociclos, etc.)
Otra clasificación, que es útil para fines experimentales, clasifica los alcaloides dentro de
cuatro grupos: alcaloides amínicos, alcaloides fenólicos, alcaloides de amonio cuaternario y
alcaloides N-óxido.
Los alcaloides amínicos, son aquellos que contienen nitrógeno en grupos funcionales amina
primaria, secundaria o terciaria, por lo que son de carácter alcalino, son solubles en
solventes orgánicos de mediana polaridad, son insolubles en agua, y forman sales con
ácidos minerales.
Un ejemplo es la anabasina (Figura 2).
Los alcaloides fenólicos, como su nombre lo indica, son aquellos que contienen en su
estructura uno o varios hidroxilos fenólicos. Estos alcaloides son generalmente solubles en
soluciones acuosas de bases minerales fuertes, pero insolubles en soluciones acuosas de
bases débiles. Además, son solubles en solventes orgánicos de mediana polaridad,
insolubles en agua, y forman sales con ácidos minerales diluidos en agua. Son ejemplos la
tiramina, la dopamina, laurifolina, etc.
Los alcaloides de amonio cuaternario contienen un átomo de nitrógeno tetra sustituido
(funcionalidad de amonio cuaternario), siendo por lo tanto sustancias iónicas. Por lo
anterior, estos son en soluciones acuosas ácidas, básicas y neutras, ya que permanecen
ionizadas en todo el rango de pH. Son insolubles en la mayoría de solventes orgánicos. Un
ejemplo es el hidróxido de berberina.
Algunos autores clasifican los alcaloides naturales de acuerdo con su precursor biosintético,
por ejemplo: alcaloides derivados de fenilalanina, alcaloides derivados de tirosina, alcaloides
derivados de triptófano, alcaloides derivados de ácido glutámico, alcaloides derivados de
ácidos nucleicos, alcaloides derivados de terpenoides, alcaloides derivados de policétidos,
etc.
Finalmente, es importante mencionar que varios autores, dividen los alcaloides en cuatro
grandes grupos:
• Alcaloides verdaderos
• Protoalcaloides
• Pseudoalcaloides
• Alcaloides imperfectos
256
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Los alcaloides verdaderos cumplen estrictamente con las características de la definición de
alcaloide: son formados a partir de aminoácidos, tienen siempre un nitrógeno intracíclico,
son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal.
Los protoalcaloides son aminas simples con nitrógeno extracíclico, de carácter básico y son
productos del metabolismo de los aminoácidos.
Los pseudoalcaloides presentan algunas de las características de la definición de alcaloide,
pero no son derivados de aminoácidos.
Los alcaloides imperfectos son derivados de bases púricas, no precipitan con los reactivos
específicos para alcaloides.
No se consideran alcaloides los aminoácidos, las betalaínas, los péptidos, los amino
azúcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas, algunas bases como la tiamina
ampliamente distribuida en los seres vivos y las alquilaminas de bajo peso molecular.
Distribución y estado natural
Los alcaloides naturales se encuentran principalmente en plantas angiospermas, en forma
de sales de ácidos orgánicos como láctico, tartárico, málico, cítrico, etc.; y también enlazados
a carbohidratos (glicósidos).
Se les puede encontrar en diferentes partes de la planta. Las familias de plantas más
destacadas incluyen las euforbiáceas, las rubiáceas, las compuestas, las solanáceas, las
boragináceas, las apocináceas, las ramnáceas, las cactáceas, rutáceas, leguminosas,
lauráceas, anonáceas, menispermáceas, berberidáceas, ranunculáceas, etc.
Ensayos de reconocimiento
Los alcaloides se pueden reconocer rápidamente en el laboratorio, mediante ensayos de
precipitación y cromatografía en capa fina.
Los ensayos de precipitación se basan en la capacidad de los átomos de nitrógeno de
muchos alcaloides, para unirse a metales pesados, formando sólidos insolubles en agua
acidificada. Por esto se les denomina ensayos de precipitación. La figura 4.4. muestra la
probable reacción que ocurre entre los alcaloides y los metales pesados, por formación de
complejos insolubles.
Los ensayos de precipitación han sido muy utilizados en la búsqueda y el hallazgo de
muchos de los alcaloides naturales conocidos. Existen muchos reactivos, dentro de los
cuales se destacan los reactivos de Dragendorff, de Mayer, de Valser, el reineckato de
amonio, etc. Es muy importante tener en cuenta que, por contener metales pesados, este
tipo de ensayos deben usarse de manera racional y adecuadamente, por los efectos tóxicos
para la salud y el medio ambiente de estos metales pesados; por esto lo recomendable es
257
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utilizar solo uno de ellos como el reactivo de Wagner (solución de yodo y yoduro de
potasio), de acuerdo a las necesidades de análisis.
Figura 4.4. Formación de los complejos insolubles por reacción de los alcaloides con los metales
pesados utilizados en los ensayos de precipitación.
Extracción
Por la propiedad alcalina que presentan la mayoría de alcaloides, debido al nitrógeno
amínico; los alcaloides pueden formar fácilmente sales con ácidos minerales como el ácido
clorhídrico, el ácido sulfúrico, etc. Estas sales son solubles en agua e insolubles en solventes
orgánicos de mediana polaridad; mientras que las formas básicas (alcaloides base), son
solubles en solventes de mediana polaridad, e insolubles en agua. Esta característica es
muy útil en los procesos de extracción, a partir de muestras biológicas.
Antes de la extracción, generalmente la muestra vegetal se seca y se muele, y luego se
somete a un proceso de eliminación de las sustancias lipídicas (desengrase), las cuales
interfieren la formación de sales con soluciones acuosas de ácidos minerales. Para estos
procesos iniciales de extracción, también se utilizan los cartuchos de extracción en fase
sólida, los cuales contienen diferentes materiales porosos que permiten una extracción
más selectiva de los compuestos de interés.
Extracción con alcohol
Una vez desengrasado el material biológico, se puede someter a extracción con alcohol,
preferiblemente etanol, dada su baja toxicidad frente al metanol. Este proceso puede
realizarse a temperatura ambiente o con calentamiento, y con agitación. El extracto crudo
que se obtiene además de contener los alcaloides solubles en alcohol, contiene otras
sustancias no alcaloidales, por lo cual es recomendable combinar esta técnica de extracción
con otra como la extracción con ácidos o bases, para obtener extractos alcaloides libres de
258
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otras sustancias neutras. La extracción con ultrasonido y etanol al 52%, a temperatura
ambiente, ha sido reportada como muy eficiente para el caso de alcaloides tipo berberina.
Extracción con solventes eutécticos NADES
El uso de los solventes orgánicos generalmente usados para la extracción de alcaloides,
como el cloroformo y el diclorometano, los cuales son costosos, tóxicos y contaminantes
del medio ambiente, se está viendo desplazado gracias al uso de los solventes eutécticos
DES. El solvente DES obtenido de combinar cloruro de colina con ácido levulínico y agua, es
un ejemplo de un solvente extractor para alcaloides naturales.
Extracción con ácidos
Una vez desengrasada la muestra, se somete a agitación con soluciones acuosas diluidas
de un ácido mineral como el HCl. El tiempo de extracción y la cantidad de solución ácida a
utilizar, los determina el tamaño de la muestra a extraer. Además de la agitación mecánica,
el uso de un baño ultrasonido o un sistema de extracción asistido con microondas,
favorecen la formación de las sales de alcaloides solubles en agua, acelerando y haciendo
más eficiente el proceso de extracción. Luego de esto la suspensión se filtra y el material
vegetal residual se puede re-extraer nuevamente con más solución ácida, hasta extraer
todo el material alcaloidal de la muestra. El filtrado ácido se basifica, con soluciones acuosas
de amoniaco o una base mineral como NaOH, hasta llevar la solución a un pH mayor de 8.
En estas condiciones los alcaloides recuperan su forma básica, se hacen insolubles en el
medio acuoso alcalino, y se pueden extraer por partición con un solvente orgánico, el cual
generalmente es cloroformo o diclorometano. La fase orgánica se recupera, se seca con un
desecante como el sulfato de sodio anhidro, y se lleva a sequedad para obtener el extracto
total de alcaloides (extracto crudo de alcaloides). Este método es recomendado por
algunos autores para extraer alcaloides de hojas y ramas. La 4.5. muestra un diagrama
simplificado de este método de extracción.
Figura 4.5. Diagrama de flujo que resume el proceso de extracción de alcaloides naturales con soluciones acuosas de ácidos minerales diluidos.
259
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Extracción con bases
La muestra vegetal desengrasada, se somete a agitación con soluciones acuosas de bases
como el amoniaco o NaOH. De esta manera, los alcaloides que se encuentren naturalmente
en forma de sales son convertidos a sus formas básicas, por lo que este método de
extracción es más ventajoso para cuando se desea hacer análisis de control de calidad,
especialmente en muestras vegetales con bajo contenido de alcaloides.
Una vez basificado el material vegetal y liberados lo alcaloides del mismo, se puede
proceder a acidificar la mezcla para formar las sales solubles en agua, filtrar, y la fase acuosa
ácida trabajarla como en el método de extracción con ácidos. La figura 4.6 resume este
método de extracción.
Figura 4.6. Diagrama de flujo simplificado para la extracción de alcaloides naturales con soluciones
acuosas de bases minerales diluidas.
Extracción con fluidos supercríticos
Esta técnica de extracción presenta ventajas sobre los métodos clásicos de extracción
descritos anteriormente, por ejemplo, es ambientalmente segura, y permite la extracción
de compuestos térmicamente inestables. Como fluido supercrítico se utiliza ampliamente
el dióxido de carbono, para extraer cafeína del café, alcaloides tipo pirrolizidina, quinolina,
isoquinolina, piridínicos, indólicos, fenantrénicos, etc.
Técnicas de separación e identificación
Las técnicas clásicas de análisis y separación cromatográfica incluyen la cromatografía en
capa fina en cromatoplacas de sílica gel. Se cuenta además con diferentes eluentes para el
análisis de los alcaloides en drogas vegetales. La tabla 1 muestra una serie de algunas de
las fases móviles más utilizadas para este propósito.
260
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Tabla 1. Fases móviles utilizadas para el análisis CCF de alcaloides de diferentes drogas vegetales.
Para determinar cuantitativamente el contenido de alcaloides de una muestra biológica, o
de un producto fitoterapéutico que contenga alcaloides, la mejor opción de análisis es la
técnica de cromatografía HPLC, mejor aún si está acoplada a otras técnicas de identificación
como la espectroscopia UV (detectores de arreglo de diodos DAD), y la espectrometría de
masas.
Con el desarrollo de las técnicas cromatográficas instrumentales, particularmente la
técnica HPLC, se cuenta con mejores sistemas y condiciones experimentales para la
separación y asilamiento de alcaloides naturales. Adicionalmente, el uso de técnicas
acopladas como HPLC a diferentes detectores como espectrómetros ultravioleta-visible
UV-VIS, detectores de arreglo de diodos DAD, y espectrómetros de masas, permite análisis
y separaciones más rápidas y más eficientes, que las obtenidas con las técnicas
cromatográficas clásicas. Una técnica interesante y novedosa combina la CCF con
espectrometría de masas, se ha desarrollado para determinar los adulterantes de la cocaína
como son cafeína, benzocaína, lidocaína y fenacetina. Otra técnica combina la CCF de alta
resolución (sigla inglesa: HPTLC) con un detector de fluorescencia para cuantificar
alcaloides tipo ergotamina.
Al revisar la literatura científica más reciente, se encuentra que la técnica combinada de
HPLC bien sea en su forma normal, o en su forma ultra-HPLC, con espectrómetros de masas
que permiten obtener los espectros de masas tándem MS/MS, es cada vez más utilizada.
Con estas técnicas es posible no solo la separación, sino también la cuantificación e
identificación de los alcaloides por sus espectros de masas. Este tipo de dispositivos se
utiliza con excelentes resultados para la separación e identificación de alcaloides de
diferentes fuentes naturales, y para estudios farmacocinéticos. Por ejemplo, para
alcaloides del acónito, del tropano, de sófora, tipo estricnina, tipo colchicina y de
Equisetum.
261
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Además de las técnicas con HPLC, también se cuenta con técnicas analíticas como la
cromatografía en contracorriente y la electroforesis capilar.
Cuando no se cuente con estas técnicas instrumentales, se pueden utilizar otras técnicas
para realizar análisis cuantitativos aproximados, como por ejemplo la valoración mediante
técnicas volumétricas basadas en las propiedades ácido-base de los alcaloides
(valoraciones ácido-base), y mediante técnicas como la espectroscopia UV-visible mediante
curvas de calibración con estándares de referencia (marcadores). Estas últimas permiten
determinar el contenido de alcaloides totales, con buena aproximación y con utilidad para
muchos procesos de control de calidad de productos que contengan alcaloides.
Un ejemplo de métodos sencillos es la valoración del contenido del alcaloide boldina, a
partir de la droga seca. En este procedimiento se extrae la droga de acuerdo a la
metodología de Bladt-Rickl, se fracciona por CCF preparativa una porción pesada del
extracto. Se recupera la banda de Rf correspondiente a la boldina, y se cuantifica
disolviendo en un volumen conocido de solvente, y leyendo la absorbancia a 315 nm. El
porcentaje de boldina en la droga se calcula por interpolación en una curva de calibración
realizada con un estándar de boldina.
Para el proceso de caracterización de los alcaloides, las técnicas de RMN protónica y de
carbono-13, se constituyen en herramienta indispensable, especialmente para los trabajos
de investigación relacionados con el hallazgo de nuevos compuestos. Tanto las versiones
en una dimensión como la RMN bidimensional, son muy utilizadas para propósitos de la
caracterización de los alcaloides y los productos naturales en general. Es importante anotar
el gran potencial que tiene el desarrollo de las nuevas estrategias experimentales sobre el
metabolismo vegetal, en especial las que involucran la resonancia magnética nuclear y los
estudios de metabolómica, ya que estos desarrollos permitirán contar con procesos
experimentales más rápidos y confiables para el estudio de los alcaloides y los productos
naturales en general.
Biogénesis
El origen biosintético de muchos alcaloides ha sido establecido gracias al uso de elementos
marcados como el carbono-13, el cual se puede seguir por RMN de carbono-13. Sin
embargo, algunas etapas intermedias son hipotéticas, por lo que hablaremos de ahora en
delante de biogénesis.
Los alcaloides naturales derivan principalmente de aminoácidos como ornitina, lisina,
fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido antranílico, ácido nicotínico; y en menos proporción
asparagina, prolina y ácido glutámico. Fenilalanina, tirosina y ácido antranílico, derivan del
ácido shikímico; mientras que el triptófano deriva del ácido antranílico, es decir también de
ácido shikímico.
262
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Las figuras 4.7 y 4.8 muestran esquemas simplificados de la biogénesis de alcaloides
aromáticos tipo BIQ bencilisoquinolinas, BBIQ bisbencilisoquinolinas, aporfinas, morfina
(opio) y relacionados, etc.
Otros alcaloides aromáticos, como alcaloides tipo quinolina, indólicos, tipo harmano, se
originan según el esquema de la figura 4.9.
COOH
OH
OH
HO
COOH
NH2
R
R = H, FenilalaninaR = OH, Tirosina
BIQ, BencilisoquinolinasBBIQ, BisbencilisoquinolinasAporfinasMorfina, etc.
Figura 4.7. Esquema biogenético que explica el origen de diferentes clases de alcaloides a
partir del ácido shikímico y los aminoácidos aromáticos fenil alanina y tirosina.
263
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Figura 4.8. Esquema de la biogénesis del núcleo característico de alcaloides tipo bencilisoquinolina
BIQ, a partir de ácido shikímico y los aminoácidos aromáticos fenilalanina (R = H) y tirosina (R = OH).
COOHHO
HO
OH
COOH
NH2 NH
COOH
NH2
Acido shikímico Acido antranílico Triptófano
Alcaloides indólicos,tipo harmano, etc.N N
Quinolinas Acridinas
Figura 4.9. Esquema biogenético general que explica el origen de alcaloides tipo quinolina, acridina, indólicos, harmano, etc.; a partir de ácido shikímico, y con intermedios como los aminoácidos triptófano y ácido antranílico.
264
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Por otro lado, a partir de los aminoácidos no aromáticos ornitina (figura 4.10) y lisina (figura
4.11), se originan diversos alcaloides que tienen los anillos N-metilpirrolidina (anillo de 5)
y piperidina (anillo de 6), como son los alcaloides tipo pirrolidina, pirrolozidina, del tropano,
esparteína y lupina, del licopodio, entre otros (18).
Figura 4.10. Esquema biogenético que explica la formación del anillo N-metilpirrolidina, característico de diferentes alcaloides naturales, a partir del aminoácido ornitina.
265
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Figura 4.11. Esquema biogenético que explica la formación del anillo N-metilpiperidina,
característico de diferentes alcaloides naturales, a partir del aminoácido lisina.
La biogénesis de alcaloides aromáticos como bencilisoquinolinas y no aromáticos como
monoterpenindólicos, es motivo de investigación para el aprovechamiento industrial de los
alcaloides naturales.
Interés farmacéutico de los alcaloides
Sin duda, dentro de las diferentes clases de productos naturales estudiados, los alcaloides
constituyen no solo un grupo abundante de sustancias con variaciones estructurales
diversas y con diferentes actividades biológicas. Al revisar la literatura científica se
encuentran abundantes trabajos relacionados con el uso y el potencial de muchos
alcaloides contra diferentes enfermedades.
La tabla 4.1. resume los nombres y los usos de diferentes alcaloides naturales.
266
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Tabla 4.1. Nombres de algunos alcaloides naturales y usos reportados.
Alcaloide Fuente Actividad farmacológica más destacada
Aconitina Aconitum variegatum, ranunculáceas
Antinociceptiva, efectos cardio vasculares
Alcaloides de areca Areca catechu, arecáceas Activación de la función cerebral
Atropina Atropa belladonna, solanáceas
Anti colinérgica
Barbamina Berberis amurensis, berberidáceas
Efectos leucogénicos
Berberina Gén. Berberis, berberidáceas Anti diabética
Brucina Strychnus nux-vomica, loganiáceas
Analgésica, antiinflamatoria
Bufotenina Amanita muscaria (hongo), amanitáceas
Incrementa la presión sanguínea
Cafeína Thea sinensis, teáceas; Coffea sp, rubiáceas
Analgésica y estimuladora Sistema Nervioso Central (SNC)
Capsaicina Capsicum annum y C. frutescens, solanáceas
Activa sobre neuronas sensoras
Catuabina-A Trichillia catigua, meliáceas Mejora el balance nutricional y tiene efectos anti depresivos
Colina Amplio número de plantas Componente de membrana mitocondrial y de acetilcolina
Cytisina Laburnum anagyroides, leguminosas
Disminuye riesgos en la salud cardio vascular y respiratoria de fumadores
Cocaína Erythroxylon coca y E. truxillense, eritroxiláceas
Estimulante del sistema nervioso central SNC
267
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Alcaloide Fuente Actividad farmacológica más destacada
Codeína Papaver somniferum, papaveráceas
Analgésico opioide
Coniína Conium maculatum, umbelíferas
Estimulante SNC
Cuscohigrina Atropa belladona, solanáceas
Inhibe células nerviosas y disminuye la actividad neuronal
Dihidroquinina Cinchona officinalis, rubiáceas
Inhibe sistema nervioso parasimpático
Dihidroquinidina Cinchona officinalis, rubiáceas
Inhibe sistema nervioso parasimpático
Ecgonina Erythroxylon coca, eritroxiláceas
Estimulante SNC
Efedrina Gén. Ephedra, efedráceas Estimulante del sistema simpático
Emetina Psychotria ipecacuanha, rubiáceas
Antiviral, anticáncer, antiparasitara, contraceptiva
Equimidina y equihumilina Alkanna orientalis, boragináceas
Antiinflamatoria, demulcente, anestésico local, anti plasmodial
Ergina Argyreia nervosa, convolvuláceas
Psicodélica
Ergotamina Claviceps purpurea, clavicipitáceas (hongo parásito)
Vaso constrictor y α-adrenoreceptor antagonista
Escopolamina Hyocyamus niger, solanáceas
Efectos sedantes, antieméticos y amnésicos
Esparteína Cystisus scoparium y Lupinus luteus, fabáceas
Antibacterial, anti hongos y anti arrítmica
Estaquidrina Chrysantemum morifolium, compuestas
Efecto cardiovascular, antipirético y antibacterial
268
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Alcaloide Fuente Actividad farmacológica más destacada
Estricnina Strychnus nux-vomica, loganiáceas
Estimulante del cerebelo
Higrina Erytroxilon coca, eritroxiláceas
Estimulante del SNC y tonificador del tracto gastrointestinal
Hordenina Hordeum vulgare, poáceas Promueve la energía cognitiva
Lobelina Lobelia inflate, lobeliáceas Bronquitis crónica y asma
Mescalina Laphophora williamsii, cactáceas
Liberación de neurotrasmisores
Morfina Papaver somniferum, papaveráceas
Analgésico opioide
Narcotina Papaver somniferum, papaveráceas
Control medular de la tos
Narceína Papaver somniferum, papaveráceas
Analgésica, antitusiva
Nicotina Nicotiana tabacum, solanáceas
Efectos modificadores del comportamiento
Oxiacantina Berberis asiática, berberidáceas
Inhibición de per oxidación lipídica
Pancratistatina Amarilidáceas Anti cáncer
Papaverina Papaver somniferum, papaveráceas
Relajación muscular
Peletierina Punica granatum, litráceas Antiparasitaria
Pilocarpina Pilocarpus microphyllus, rutáceas
Estimulante del sistema parasimpático
Quinina Cinchona officinalis, rubiáceas
Antimalárica, anti pirética, analgésica, anti inflamatoria, anti viruela
269
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Alcaloide Fuente Actividad farmacológica más destacada
Quinidina Cinchona officinalis, rubiáceas
Antimalárica
Reserpina Rauwolfia serpentina, apocináceas
Anti hipertensiva
Ricinina Ricinus communis, euforbiáceas
Estimulante SNC, antibacterial
Sanguinarina Sanguinaria canadensis, Argemone mexicana, papaveráceas
Antimicrobiana, anti hongos, anti inflamatoria, adrenolítica, simpatolítica
Senecionina Senecio vulgaris, compuestas
Antidiabética, antihipertensiva
Swainsonina Swainsona canescens, fabáceas
Inhibidora de α-mannosidasa
Tebaína Papaver somniferum, papaveráceas
Anti inociceptiva
Veratrina Veratrum sabadibla, melantiáceas
Estimulante de secreción de renina
Vinblastina Cataranthus roseus, apocináceas
Anti cáncer, enfermedad de Hodgkin
Vincristina Cataranthus roseus, apocináceas
Antineoplásica
Yohimbina Pausinystalia yohimbe, rubiáceas
Colinérgica (parasimpático) y adrenérgica (simpático)
En el caso particular del cáncer, se presentan estudios de potencial uso terapéutico.
También se investigan otros usos potenciales que incluyen actividad contra tuberculosis,
antiinflamatorios, antiparasitarios, anti Alzheimer y anti microbianos, entre otros. Es
interesante anotar que se ha observado sinergia entre ciertos alcaloides como los tipo
camptotecina con flavonoides como la quercetina, contra cáncer mamario, e inclusive se
han sintetizado alcaloides flavonoides con potencial acción antidiabética.
Los alcaloides en general tienen diferentes actividades biológicas sobre el organismo
humano. Incrementan la actividad de la corteza prefrontal, el tálamo, y el sistema visual,
270
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efecto anti colinérgico como inhibidores competitivos del receptor muscarínico de
acetilcolina. Se usan en la estimulación del sistema simpático porque actúan directamente
sobre receptores α y β, generando actividades anti psicótica e anti hipertensiva, como
agentes bloqueadores α2-adrenérgicos, con actividad anti diurética media, y como agentes
neoplásicos. Además, muestran propiedades antiinflamatorias, demulcentes,
bloqueadoras de ganglios, antiplasmódicas, insecticidas y hepatoprotectoras.
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Capítulo 5
Aceites esenciales
275
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Muchos vegetales producen sustancias de aroma y sabor agradables. Estas sustancias
generalmente se encuentran como mezclas complejas de sustancias con diferente grado de
volatilidad. Aunque no es posible actualmente definir límites claros en cuanto a dicha
volatilidad, utilizaremos como aproximación para definir estas sustancias en tres grandes
categorías: Flavor, perfumes y aceites esenciales. El término inglés flavor, equivale en
español a la suma de dos efectos en nuestros sentidos: aroma y sabor. Es el efecto que
sentimos por ejemplo al masticar una fruta, y muchos autores se refieren al flavor de las
frutas frescas, en lugar del aceite esencial o perfume de las frutas frescas. El término perfume
está más asociado a las sustancias de aroma agradable que se obtienen especialmente de
flores frescas. Por último, el término aceite esencial o esencia, está principalmente referido
a las mezclas de sustancias de aroma agradable, que se obtienen indistintamente de todas
las partes de las plantas, especialmente de hojas, semillas y tallos, y pueden obtenerse
muchos de ellos a partir de las muestras secas. Aunque para muchos autores es indistinto
referirse a esencias y a perfumes. En términos de volatilidad, el flavor es más volátil que el
perfume, y este a su vez es más volátil que un aceite esencial. De acuerdo con lo anterior es
posible referirse mejor al flavor del maracuyá, que al aceite esencial o al perfume de
maracuyá. Es más conveniente referirse al aceite esencial de la hierbabuena, que al flavor o
el perfume de la hierbabuena. Finalmente, es más conveniente referirse al perfume de
jazmín (flores), que al flavor del jazmín.
Definición
Se definen generalmente como aceites esenciales las fracciones líquidas, generalmente
destilables por arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del
aroma de las plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y
aromatizantes), de alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéutica (saborizantes,
antioxidantes, aromaterapia).
Los aceites esenciales son mezclas complejas de hasta más de 50 componentes que incluyen:
Compuestos alifáticos de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas,
ésteres y ácidos), monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos.
Clasificación
Los aceites esenciales se clasifican con base en diferentes criterios: consistencia, origen y
naturaleza química de los componentes mayoritarios.
De acuerdo con su consistencia los aceites esenciales se clasifican en esencias fluidas,
bálsamos y oleorresinas. Las esencias fluidas son líquidos a temperatura ambiente. Los
bálsamos son de consistencia más espesa, y propensos a sufrir reacciones de polimerización,
276
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son ejemplos el bálsamo de copaiba, el bálsamo del Perú, Benjuí, bálsamo de Tolú,
estoraque, etc. Las oleorresinas tienen el aroma de las plantas en forma concentrada y son
típicamente líquidos muy viscosos o sustancias semisólidas (caucho, gutapercha, chicle,
balata, oleorresina de paprika, de pimienta negra, de clavero, etc.).
De acuerdo a su origen los aceites esenciales se clasifican como naturales, artificiales y
sintéticas. Los naturales se obtienen directamente de la planta y no sufren modificaciones
físicas ni químicas posteriores, debido a su rendimiento tan bajo son muy costosas. Los
artificiales o sintéticos se obtienen a través de procesos de enriquecimiento de la misma
esencia con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de esencias de rosa,
geranio y jazmín enriquecida con linalool, o la esencia de anís enriquecida con anetol. Estos
son más económicos y por lo tanto son mucho más utilizados como aromatizantes y
saborizantes (esencias de vainilla, limón, etc.).
Desde el punto de vista químico y a pesar de su composición compleja con diferentes tipos
de sustancias, los aceites esenciales se pueden clasificar de acuerdo con el tipo se sustancias
que son los componentes mayoritarios. Según esto los aceites esenciales ricos en
monoterpenos se denominan aceites esenciales monoterpenoides (p.ej. hierbabuena,
albahaca, salvia, etc.). Los ricos en sesquiterpenos son los aceites esenciales
sesquiterpenoides (p.ej. copaiba, pino, junípero, etc.). Los ricos en fenilpropanos son los
aceites esenciales fenilpropanoides (p.ej. clavo, canela, anís, etc.).
Aunque esta clasificación es muy general nos resultará útil para propósitos de estudiar
algunos aspectos fitoquímicos de los monoterpenos, los sesquiterpenos y los fenilpropanos,
sin embargo, existen clasificaciones más complejas como la de González Patiño que tienen
en cuenta otros aspectos químicos.
Distribución y estado natural
Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en unas 60 familias de plantas
que incluyen las compuestas, labiadas, lauráceas, mirtáceas, pináceas, rosáceas, rutáceas,
umbelíferas, etc. Se les puede encontrar en diferentes partes de la planta: en las hojas
(ajenjo, albahaca, buchú, cidrón, eucalipto, hierbabuena, limoncillo, mejorana, menta,
pachulí, quenopodio, romero, salvia, toronjil, etc.), en las raíces (angélica, asaro, azafrán,
cálamo, cúrcuma, galanga, jengibre, sándalo, sasafrás, valeriana, vetiver, etc.), en el
pericarpio del fruto (limón, mandarina, naranja, etc.), en las semillas (anís, cardamomo,
eneldo, hinojo, comino, etc.), en el tallo (canela, caparrapí, etc.), en las flores (arnica,
lavanda, manzanilla, piretro, tomillo, clavo de olor, rosa, etc.) y en los frutos (alcaravea,
cilantro, laurel, nuez moscada, perejil, pimienta, etc.).
277
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Los monoterpenoides se encuentran principalmente en plantas de los órdenes ranunculales,
violales y primulales, mientras que son escasos en rutales, cornales, lamiales y asterales. Por
el contrario, los sesquiterpenoides abundan en magnoliales, rutales, cornales y asterales.
Aunque en los aceites esenciales tanto los mono-, los sesquiterpenos y los fenilpropanos se
les encuentra en forma libre, más recientemente se han investigado los que están ligados a
carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos del aceite como tal.
A continuación, se presentan algunos aspectos químicos y de actividad biológica generales
sobre las clases de compuestos más comúnmente encontrados en diferentes aceites
esenciales como son los monoterpenos, los sesquiterpenos y los fenilpropanos.
Monoterpenos y sesquiterpenos
Los monoterpenos y sesquiterpenos son terpenos de 10 y 15 átomos de carbonos
respectivamente, derivados biosintéticamente de geranilpirofosfato (GPP) y
farnesilpirofosfato (FPP) respectivamente. La Figura 5.1 muestra ejemplos de monoterpenos
y sesquiterpenos naturales. De acuerdo con su estructura se les clasifica según el número de
ciclos como acíclicos, monocíclicos, bicíclicos, etc.
278
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OH
Geraniol (C10) Limoneno (C10)
OH
Mentol (C10)
Bisaboleno (C15)
O
Ionona (C15)
Figura 5.1. Ejemplos de mono- y sesquiterpenos naturales.
Biogénesis de terpenos
Hasta hace algunos años se aceptaba que los monoterpenos y en general todos los
compuestos terpenoides naturales se biosintetizaban por la ruta de la acetilcoenzima a
través de un intermedio común que es el ácido mevalónico (sigla inglesa MVA). Sin embargo,
recientemente se tienen evidencias que algunos terpenoides no se originan solo por esta
ruta, sino también por dos rutas alternas, una ruta que se denomina la ruta modificada del
ácido mevalónico y una ruta alterna que puede involucrar piruvato, gliceraldehído-3-fosfato
y un intermedio de 5 átomos de carbono: el metileritritolfosfato (sigla inglesa MEP). La figura
5.2. resume dos de las tres rutas conocidas ahora, y muestra como la ruta clásica del ácido
mevalónico ocurre en el citosol de las células vegetales y da origen a terpenoides C15n (n =
impar), mientras que la ruta del metileritritol fosfato ocurre en los plastidios y da origen
especialmente a terpenoides C10n.
279
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O
COOH
O
SCoA
Acido pirúvico
AcetilCoA
HO
OH
OP
OH
Metileritritol fosfato (MEP)
HOOP
OH
O
Mevalonil fosfato
(Plastidios)
(Citosol)Terpenoides
Terpenoides
C15n (n impar)
C10n
Figura 5.2. Esquema biogenético para dos rutas que conducen a terpenoides.
Biogénesis del ácido mevalónico
La Figura 5.3 esquematiza el proceso de biogénesis del ácido mevalónico. Inicialmente se
condensan dos moléculas de acetilCoA, con la participación hipotética de una ß-cetotiolasa
y una enzima condensante. Enseguida esta unidad es atacada por otra unidad de acetilCoA
que ha perdido un H-. La hidrólisis de una de las dos funciones tioéster da lugar a la ß-
hidroxi-ß-metilglutarilcoenzima-A. Una segunda hidrólisis del otro grupo tioéster seguida de
dos reducciones sucesivas con una reductasa NADPH-dependiente se llega al ácido
mevalónico.
280
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Biogénesis de IPP y DMAPP
El ácido mevalónico es el precursor de las dos unidades básicas que dan origen a los
terpenoides: Isopentenilpirofosfato (IPP) y γ,γ -dimetilalilpirofosfato (DMAPP) tal como se
esquematiza en la Figura 5.4.
Inicialmente, una molécula de ácido mevalónico es pirofosfatada por dos unidades de ATP
para originar mevalonil-pirofosfato. Enseguida la molécula sufre un proceso concertado de
descarbonatación con la participación de otra molécula de ATP. De esta manera se origina
una molécula de Isopentenilpirofosfato (IPP). La simple isomerización del enlace doble del
IPP da origen a la unidad de DMAPP. Estos dos intermedios también son generados a través
de las rutas alternas del ácido mevalónico modificado, y del metileritritol fosfato.
Condensación cabeza-cola de IPP y DMAPP
Una unidad de IPP puede condensarse con muchas unidades DMAPP mediante un proceso
de condensación comúnmente denominado condensación "cabeza-cola", siendo la cabeza
la función pirofosfato y la cola el extremo donde están ubicados los metilos. La Figura 5.5
esquematiza el proceso de condensación de dos moléculas de 5 átomos de carbono (IPP y
DMAPP) para dar origen a una molécula de 10 átomos de carbono: Geranilpirofosfato. Esta
sustancia es el precursor inmediato de todos los monoterpenos naturales. La condensación
de geranilpirofosfato con una nueva unidad IPP da origen al farnesilpirofosfato, el cual es el
precursor de todos los sesquiterpenos naturales.
O
SCoACH2
O
SCoA
SCoA
O O
CH2
O
SCoA
SCoA
O
CoAS
OH O
OH
O
HO
OH O
H
O
HO
OH O
H2O
Red.OH
O
HO
OH
Acido mevalónico
(MVA)
Acido meváldico
Figura 5.3. Biogénesis del ácido mevalónico.
281
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OH
O
HO
OH2ATP
2ADP
OPP
O
HO
OH
OPP
O
O
OH
P
OH
O
OPPHO
OPP
Isopentenil pirofosfato
IPP
OPP
Dimetilalil pirofosfato
DMAPP
Isom.
Figura 5.4. Biogénesis de las unidades isoprénicas básicas: Isopentenilpirofosfato (IPP) y ,-Dimetilalilpirofosfato (DMAPP).
Biogénesis de monoterpenos en Mentha piperita
La Figura 5.6. esquematiza las relaciones biogenéticas entre varios componentes
monoterpenoides del aceite esencial de Mentha piperita. Nótese como la piperitona puede
originarse por tres rutas diferentes.
282
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OPP
H
OPPOPP
OPP
H
OPP
OPP
H
DMAPP
IPP
GeranilPP
FarnesilPP
Monoterpenos
Sesquiterpenos
OPP
OPP
H
Geranil-GeranilPPDiterpenos
Geranil-FarnesilPP Sesterterpenos
Hasta compuestos de aprox.
5000 carbonos
IPP
Figura 5.5. Formación biogenética de los terpenoides a partir de IPP y DMAPP.
283
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Figura 5.6. Relaciones biogenéticas de monoterpenos presentes en el aceite esencial de Mentha piperita.
Ejemplos de monoterpenos y sesquiterpenos naturales
La Figura 5.7 muestra varios ejemplos de monoterpenos naturales representantes de varias
clases de esqueletos como el mentano, pinano, canfano, etc.
284
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La Figura 5.8 muestra ejemplos de sesquiterpenos naturales con varias clases de esqueletos
(bisabolano como el bisaboleno, cadinano como el α-cadineno, etc.)
Figura 5.7. Ejemplos de monoterpenos.
CH2OH CHO
O
CH2OH
Nerol Geraniol Citronelal Limoneno
ThuyonaCar-3-eno
OH
AlcoholFenchílico
O
Fenchona
alfa-Pineno
O
HO
gama-Thuyaplicina
O
O
Nepetalactona
O
Alcanfor
285
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Figura 5.8. Ejemplos de sesquiterpenos.
HOCH2
OH
FarnesolNerolidol gama-Bisaboleno
alfa-Cadineno beta-Selineno Cariofileno
HO
Carotol
OCOOH
OH
Acido abscísico
286
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Fenilpropanos
Los fenilpropanos son sustancias naturales ampliamente distribuidas en los vegetales
caracterizadas por un anillo aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados
biosintéticamente del ácido shikímico. La Figura 5.9 muestra varios ejemplos de
fenilpropanoides ampliamente distribuidos. Nótese como la cadena lateral puede presentar
varios estados de oxidación (grupos metilo, hidroximetileno, aldehído y carboxilo) e
insaturación. El anillo aromático generalmente está sustituido en los carbonos 3, 4 y 5, siendo
estos sustituyentes grupos hidroxilo, metoxilo o metiléndioxi, principalmente.
287
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Figura 5.9. Ejemplos de fenilpropanos naturales presentes en aceites esenciales.
O H
Alcohol hidrocinamílico
O H
H O
O C H 3
Alcohol coniferílico
C H O
Cinamaldehído
OC H 3 O
Anís-cetona
H O
O C H 3
EugenolIsoeugenol
H O
O C H 3
O
O
O
O
Safrol Isosafrol
C H 3 O
O
O
Isomiristicina
C H 3 O
O
O
Miristicina
O H
G luO
O C H 3
Coniferina(glicósido)
C H 3 O
O
O
O H
Apiol
H O
O H
H O
Elemicina
C H 3 O
Anetol
288
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Biogénesis de fenilpropanos
Los fenilpropanos presentes en los aceites esenciales se originan biogenéticamente a partir
del ácido shikímico, como se describió en el capítulo 2.
Extracción y aislamiento de componentes de aceites esenciales
Los aceites esenciales se pueden extraer de las muestras vegetales mediante varios métodos
como son: expresión, destilación con vapor de agua, extracción con solventes, enfleurage,
con fluídos supercríticos y con solventes eutécticos.
En el método de expresión, el material vegetal es exprimido para liberar el aceite y este es
recolectado y filtrado. Este método es utilizado para el caso de las esencias de cítricos.
En la destilación por arrastre con vapor de agua, la muestra vegetal generalmente fresca y
cortada en trozos pequeños, es encerrada en una cámara inerte y sometida a una corriente
de vapor de agua sobrecalentado, la esencia así arrastrada es posteriormente condensada,
recolectada y separada de la fracción acuosa. Esta técnica es muy utilizada especialmente
para esencias fluidas. Se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, a la pureza del
aceite obtenido y porque no requiere tecnología sofisticada.
En el método de extracción con solventes, la muestra seca y molida se pone en contacto con
solventes tales como alcohol, cloroformo, etc. Este proceso se hace generalmente mediante
un dispositivo Sohxlet, o también con ayuda de un microondas o un equipo de ultrasonido.
Estos solventes solubilizan la esencia, pero también solubilizan y extraen otras sustancias
tales como grasas y ceras, obteniéndose al final una esencia impura. Se utiliza a escala de
laboratorio pues a nivel industrial resulta costoso por el valor comercial de los solventes,
porque se obtienen esencias impurificadas con otras sustancias, y además por el riesgo de
explosión e incendio característicos de muchos solventes orgánicos volátiles. Esta técnica de
extracción es muy utilizada también para la obtención de aceites vegetales ricos en
triglicéridos. Sin embargo, es factible el remplazar los solventes orgánicos tóxicos por otros
líquidos menos contaminantes y menos riesgosos para la salud y el medio ambiente. Por
ejemplo, para la extracción se pueden utilizar mezclas de diferentes proporciones de un
aceite vegetal con un solvente orgánico. Esta mezcla tiene al menos tres ventajas sobre el
uso de solo solventes orgánicos para la extracción, la primera es que permite disminuir la
viscosidad del aceite vegetal, para facilitar el análisis del aceite esencial obtenido. Por otro
lado, al tener un punto de ebullición más alto el aceite vegetal, se pueden usar mayores
temperaturas para la extracción, lo que favorece la solubilización de los diferentes
componentes de los aceites esenciales. Los solventes orgánicos más usados tienen puntos
de ebullición más bajos, y no permiten el uso de temperaturas más altas. Adicionalmente, se
disminuirían los costos al usar aceites vegetales para remplazar total o parcialmente los
solventes orgánicos para la extracción.
289
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En el método de enflorado o enfleurage, el material vegetal (generalmente flores) es puesto
en contacto con un aceite vegetal. La esencia es solubilizada en el aceite vegetal que actúa
como vehículo extractor. Se obtiene inicialmente una mezcla de aceite esencial y aceite
vegetal la cual es separada posteriormente por otros medios fisico-químicos. Esta técnica es
muy usada para la obtención de perfumes florales (rosa, jazmín, azahar, etc.).
El método de extracción con fluidos supercríticos es de desarrollo más reciente. El material
vegetal cortado en trozos pequeños, licuado o molido, se empaca en una cámara de acero
inoxidable y se hace circular a través de la muestra un líquido supercrítico (por ejemplo,
bióxido de carbono líquido), las esencias son así solubilizadas y arrastradas y el líquido
supercrítico que actúa como solvente extractor y se elimina por descompresión progresiva
hasta alcanzar la presión y temperatura ambiente, y finalmente se obtiene una esencia pura.
Aunque presenta varias ventajas como rendimiento alto, es ecológicamente compatible, el
solvente se elimina fácilmente e inclusive se puede reciclar, y las bajas temperaturas
utilizadas para la extracción no cambian químicamente los componentes de la esencia, sin
embargo, el equipo requerido es relativamente costoso, ya que se requieren bombas de alta
presión y sistemas de extracción también resistentes a las altas presiones. Actualmente se
utiliza en procesos de obtención a nivel industrial.
Además de la extracción con fluidos supercríticos, existen técnicas de extracción novedosas
como la extracción asistida por microondas y con ultrasonido. Estos métodos se reconocen
como métodos eficientes de extracción, y reducen significativamente los tiempos de
extracción, aumentan el rendimiento y la calidad de los aceites esenciales. Aunque son
métodos muy utilizados a nivel de laboratorio, también se utilizan a escala industrial.
Más recientemente se está investigando el uso potencial de los solventes eutécticos viscosos
(sigla inglesa DES). Un ejemplo de esto es el uso de los líquidos DES preparados con cloruro
de colina y alcanodioles como el propanodiol y el butanodiol. Estos solventes resultan muy
ventajosos desde los puntos de vista económico, ambiental y para la salud.
Métodos de separación y análisis
Como se mencionó, la mayoría de monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos se
encuentran presentes en los aceites esenciales de diversas plantas. A partir de dichos aceites
es posible realizar su aislamiento mediante la utilización de uno o varios métodos
cromatográficos tales como la cromatografía en columna, en capa fina y HPLC. Para las
cromatografías en columna y en capa fina se utiliza ampliamente la sílica gel como fase
estacionaria. Como fase móvil se emplean solventes apolares puros o mezclados tales como:
Tolueno-acetato de etilo 93:7, y mezclas hexano-acetato de etilo en diferentes proporciones,
una mezcla recomendable es hexano-acetato de etilo 4:1. Es importante mencionar que en
la literatura científica se encuentran reportes de casos específicos, en los cuales se utilizan
290
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ciertos solventes para separar componentes de aceites esenciales, este es el caso del 1,3-
butanodiol, con el cual se pueden separar el limoneno (terpeno no oxigenado) y el linalool
(terpeno oxigenado), mediante un proceso de extracción líquido-líquido.
Los fenilpropanos de aceites esenciales se extraen con la misma metodología descrita
anteriormente para mono- y sesquiterpenos. Sin embargo, debido a su anillo aromático
presentan ventajas en su detección por CCF y HPLC pues absorben luz ultravioleta (254 nm)
y no requieren ser revelados con agentes químicos, ni necesitan ser derivatizados, y por lo
tanto pueden aislarse y analizarse más fácilmente.
La técnica de análisis utilizada más ampliamente en el análisis de la composición química de
los aceites esenciales es la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. Sin
embargo, también se utilizan técnicas de separación más eficientes y rápidas como la
cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC, y la cromatografía de gases (CG), así como
también combinaciones "ON-LINE" HPLC-CG-EM. Estos mismos métodos se utilizan para el
análisis de los perfumes florales.
La cromatografía de gases, gracias al desarrollo de columnas capilares de alta resolución
permite analizar mezclas complejas presentes en aceites esenciales, e identificar los
componentes a partir de los tiempos de retención a través de los denominados Indices de
Retención de Kovats (Ik). Estos valores son característicos para cada componente y existen
bases de datos con los índices de muchos componentes de aceites esenciales.
Los valores Ik se determinan en dos columnas cromatográficas una polar (por ejemplo,
CARBOWAX 20M) y una apolar (por ejemplo, OV-101 también llamada DB-1).
Adicionalmente, la técnica acoplada Cromatografía de Gases-Espectrometría de masas,
permite obtener el espectro de masas de cada componente con el cual se obtiene el peso
molecular e información estructural. Así mismo existen bases de datos con los espectros de
masas de muchos componentes, por lo cual el índice de Kovats (determinado en dos
columnas de diferente polaridad) y el espectro de masas son criterios para la asignación
química de muchos componentes de aceites esenciales, no solo monoterpenos sino también
otros tipos de sustancias características de dichos aceites.
Más recientemente se han desarrollado columnas cromatográficas quirales para la
separación de componentes ópticamente activos, y se han desarrollado métodos para el
análisis combinado HPLC-Espectrometría de Masas y HPLC-RMN de mezclas de
sesquiterpenos.
291
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Ensayos de reconocimiento
Debido a la diversidad de grupos funcionales que pueden estar presentes en los
componentes mono- y sesquiterpénicos de un aceite esencial no existe una prueba
específica para su reconocimiento. Sin embargo, existen unos pocos procedimientos
experimentales que permiten reconocer algunos de ellos por su coloración con diferentes
reactivos, su absorción de luz UV de 254 nm y su Rf en cromatografía en capa fina.
Otros reactivos útiles para revelar monoterpenos y sesquiterpenos son anisaldehído-ácido
sulfúrico, vainillina-ácido sulfúrico y ácido fosfomolíbdico.
Los monoterpenos y sesquiterpenos en un buen número se pueden caracterizar
químicamente a partir de los datos de cromatografía de gases y los espectros de masas tal
como se anotó anteriormente, pero cuando existen dudas de tal caracterización se recurre
a los métodos espectrales como Infrarrojo, Ultravioleta y Resonancia Magnética Nuclear.
Espectroscopia infrarrojo
El espectro infrarrojo permite detectar la presencia de grupos hidroxilo, carbonilo, anillos
aromáticos, enlaces dobles C=C cis y trans, etc. Para determinar el espectro basta con colocar
una gota del componente en una celda de NaCl. Por ejemplo, en el espectro infrarrojo del 3-
p-menten-7-al presente en el aceite de comino. La banda intensa en 1725 cm-1 indica un
grupo carbonilo no conjugado. La banda a 2710 cm-1 se asigna a la tensión C-H de un protón
aldehídico. El doblete centrado en 1375 cm-1 indica un grupo isopropilo, y la banda de
intensidad media en 817 cm-1 indica un enlace doble trisustituído.
Para el caso de los fenilpropanos, y por tratarse de sustancias con anillo aromático, sus
espectros infrarrojos muestran las señales características de estos compuestos y dan
información sobre el tipo de sustitución del anillo aromático además de los grupos
funcionales presentes en la molécula. Por ejemplo, el espectro IR del eugenol muestra entre
otras bandas en 3500 (ancha) debida al grupo hidroxilo, 1510 característica de aromáticos, y
tres bandas en 990, 920 y 938 cm-1 características de un grupo vinilo mono sustituido. El
espectro IR del cinamaldehído muestra bandas en 3330 (débil), 3050, 2820, 2750, 1660
(intensa, debida al grupo carbonilo), 975, 740 y 695 cm-1 entre otras.
Espectroscopia ultravioleta
El espectro UV de los monoterpenos y sesquiterpenos permite el reconocimiento de grupos
funcionales y grupos cromóforos. Por ejemplo, el limoneno presenta un máximo de
absorción en 262 nm.
A diferencia de la mayoría de mono- y sesquiterpenos, los fenilpropanos absorben luz UV
con máximos alrededor de 254 nm dependiendo de los grupos cromóforos presentes en la
292
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molécula. Por ejemplo, el isoeugenol muestra máximos en 260 (15850) y 305 (7000), el safrol
en 286 nm, la miristicina en 276 nm, el isosafrol en 264 nm, el ácido trans-cinámico en 273
nm y el ácido cis-cinámico en 264 nm.
Resonancia Magnética Nuclear
Gracias a los desarrollos de la RMN se cuenta con bases de datos de los espectros,
especialmente de RMN-13C para los monoterpenos y sesquiterpenos más distribuidos.
Además, con el desarrollo de software comercial para la predicción de los espectros de RMN,
se cuenta ya con herramientas muy útiles en la asignación estructural de compuestos como
monoterpenos y sesquiterpenos, y de todos los metabolitos secundarios en general. A
continuación, se presentan como referencia los desplazamientos químicos de los carbonos
de varios monoterpenos como son: geraniol, linalool, mirceno, cis-citral, trans-citral,
mentano, mentol, -terpineol, -pineno, ß-pineno, limoneno, carvona, cineol, alcanfor, -
terpineno y pulegona; y varios sesquiterpenos como: Farnesol, ß-bisaboleno, trans-retinal,
9-cis-retinal y 11-cis-retinal.
Los espectros de RMN-1H de los fenilpropanos muestran señales de protones aromáticos
alrededor de 6-8 ppm cuyas multiplicidades y constantes de acoplamiento permiten realizar
una asignación estructural clara aún con espectros de baja resolución. En el espectro RMN-1H del anetol, se aprecia una señal doblete alrededor de 1.9 ppm debida a los protones del
grupo metilo, un singlete en 3.9 debido a los protones del grupo metoxilo, una señal
compleja alrededor de 6.1 ppm debida a los dos protones olefínicos en disposición trans
entre sí, y un doble doblete alrededor de 6.9 ppm característico de los 4 protones de un
anillo aromático p-di sustituido.
Los espectros de RMN-13C son muy útiles para la asignación estructural de los componentes
de aceites esenciales. Las figuras 5.10 y 5.11 muestran los desplazamientos químicos de las
señales de los carbonos de varios ejemplos estructurales comunes de mono- y
sesquiterpenos.
293
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Figura 5.10. Desplazamientos químicos (ppm) de varios mono- y sesquiterpenos.
OH
FARNESOL
OH
GERANIOL
OH
LINALOOL
MIRCENO
CHO
cis-CITRAL trans-CITRAL
CHO
OH
MENTOL TERPINEOL
OH
LIMONENO
CARVONA
O
TERPINENO
O
ALCANFOR
17.6
131.1
25.6 124.4
26.8
39.8
16.1
136.9
125.3
58.6
25.6
131.5
17.6
124.5
27.7
42.2
22.8
73.3
145.1
111.5
17.4
130.8
25.4 125.0
26.9
39.7
134.9
13.7
124.3
25.6
39.8
137.1
15.9
124.7
58.6
115.5
139.0
112.9
145.9
30.8
26.1
124.4
17.1
131.0
25.1
17.4
132.9
26.3 123.1
27.2
32.5
24.4
162.1
128.7
189.4
17.4
132.2
25.3 123.5
26.0
40.5
17.0
162.1
127.5
190.0
22.3
31.9
45.6
70.9
50.4
25.8
16.021.0
23.5
35.0
23.1
132.9
30.9
23.6
44.6
71.9
26.7 27.1
120.7
25.9
23.8
133.2
30.9
28.0
41.2
149.7
20.5 108.4
30.6
120.8
15.4
135.2
197.7
43.1
42.7
147.2
110.320.2
31.3
143.8
22.2
131.5
28.5
24.8
140.9
34.0
20.620.6
116.5
119.6
19.5
20.0
46.69.7
57.0
214.7
43.2
43.2
27.4
30.1
294
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Figura 5.11. Desplazamientos químicos (ppm) de varios mono- y sesquiterpenos.
A manera de ejemplo de la utilidad de los softwares predictores de RMN, se presentan a
continuación en la figura 5.12. los desplazamientos químicos en ppm para el limoneno
reportado en la literatura, el calculado con el software predictor ACD labs/CNMR, y el
calculado con la herramienta en línea nmrdb.org:
23.8
133.230.9
28.041.2
120.8
30.6
20.5 108.4
149.7
23.4
133.1
30.6
27.9
41.0
109.720.7
149.3
30.7
120.8
23.3
133.5120.8 30.9
28.0
41.2149.3
110.020.6
30.6
REPORTADO ACDLABS PRED. NMRDB.ORG
Figura 5.12. Valores de desplazamientos químicos de las señales de carbono-13 del limoneno, reportados y calculados con software pedictor.
Adicionalmente, el desarrollo reciente de los métodos bidimensionales homo- y
heteronucleares, ha permitido la determinación estructural fina de los terpenoides y demás
sustancias naturales, eliminando la ambigüedad en la asignación de las señales observadas.
alfa-IONONA
O
beta-BISABOLENO
O
beta-IONONA
alfa-PINENO beta-PINENO
23.0
132.6
30.4
27.9
120.6
31.0
39.2
152.9
107.034.5
26.4
124.1
17.2
130.2
25.2
26.8 26.8
32.4
28.7
23.2
122.5
132.3
31.5
54.3
132.7
147.5
196.0
27.5
27.0 27.0
32.6
38.4
17.5
31.8
133.4
19.7
134.7
140.7
130.7
195.5
25.2
20.8
22.8
26.4
38.1
31.5
47.3144.2
116.1
31.541.0
106.0
21.8
26.1
40.5
27.0
40.5
23.6
23.6
151.851.7
295
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Espectrometría de Masas
Como se mencionó anteriormente, para determinar la composición de los aceites esenciales,
tanto desde el punto de vista cualitativo como cuantitativo, el método más usado es la
combinación de las técnicas instrumentales de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas. Además, los instrumentos disponibles cuentan con acceso a bases
de datos extensas que incluyen los espectros de masas de muchos de los componentes
presentes, por lo cual el análisis es automatizado y muy preciso. La figura 5.13, muestra los
iones característicos del espectro de masas de impacto electrónico del compuesto p-cimen-
8-ol, el cual está presente en la corteza de Bursera slechtendalii, a la cual se le da uso popular
como calmante.
Más recientemente, con el uso de los métodos quimiométricos, con los cuales es posible
extraer más información de los datos experimentales, por ejemplo, el procesamiento de las
señales de los cromatogramas en dos y tres dimensiones obtenidos. Con estos métodos es
posible detectar e identificar más componentes en una mezcla, por ejemplo cuando hay
solapamiento de señales.
Debido también a su anillo aromático, los fenilpropanos presentan espectros de masas con
iones moleculares intensos, lo que facilita la determinación de su peso molecular.
En el caso de compuestos con grupos carboxilo e hidroxilo es conveniente derivatizarlos para
obtener sustancias más volatilizables y térmicamente más estables, ya que esto facilita por
ejemplo su análisis en mezclas mediante la Cromatografía de Gases o la combinación
Cromatografía de Gases-Espectrometría de masas.
OH
p-cimen-8-ol
M = 150
OH
m/z 135 (pico base)
m/z 91
Figura 5.13. Esquema de fragmentación en espectrometría de masas de impacto electrónico del p-cimen-8-ol.
296
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Ejemplos de drogas vegetales que contienen aceites esenciales
Alcanfor
El alcanfor es obtenido de la corteza de Cinnamomum camphora L., nativo de Asia. Se ha
usado ampliamente como analgésico, antiséptico, antipruritico, estimulante, abortifaciente,
y como supresor de lactancia. Se usa como ingrediente activo en ungüentos e inhalantes
para tratar resfriados y dolor muscular. Su aplicación en la piel produce sensación de calor.
Se reporta su toxicidad por ingestión accidental o mala administración. Se absorbe
rápidamente a nivel intestinal y produce irritación, dolor abdominal, náuseas, y convulsiones.
Albahaca
El aceite de albahaca se obtiene de Ocimum basilicum y ha sido utilizado en la medicina
tradicional como un estimulante del sistema nervioso central y para el tratamiento de
desórdenes nerviosos menores, dolor de cabeza y dolores musculares. Es de gran valor en
estados de ansiedad, ya que se dice que clarifica y fortalece la mente.
Es un repelente de insectos y suaviza las picaduras. Tiene actividad antimicrobiana a bajas
diluciones. En ensayos realizados en la India mostró buenos resultados en el tratamiento
antibacterial del acné. También se usa como enjuague bucal contra el mal aliento. En las
zonas rurales africanas se usa una infusión de las hojas para tratar las quemaduras causadas
por el sol.
Las plantas del género Ocimum, presentan potencial para el tratamiento de hiperglicemias,
posiblemente debido a la presencia del eugenol, inclusive se ha incorporado extractos
acuosos de estas plantas en nanopartículas de plata, con resultados interesantes de
potencial anti diabetes. El aceite de la especie Ocimum gratissimum, muestra también
propiedades anti leishmaniasis.
Anís
Las semillas de Pimpinella anisum L. contienen aceite esencial cuyo componente principal es
el trans-anetol y presenta actividad insecticida.
A nivel farmacéutico, la semilla de anís se usa como resaltador del sabor de preparados
medicinales. La Farmacopea Europea determina que la droga debe contener 2% de aceite
esencial, el cual contiene de 75-95% de trans-anetol. El aceite contiene además cantidades
menores de metilchavicol, p-anisaldehído, γ-himacaleno, α-zingibereno, trans-2-
metilbutirato de pseudoisoeugenol y 2-metilbutirato de epoxipseudoeugenilo.
Se tienen reportes del aceite esencial como carminativo, antiséptico, diurético, y digestivo.
En la medicina popular se usa para el insomnio y la constipación. El aceite incrementa la
resistencia pulmonar en eventos de congestión broncopulmonar. También presenta efectos
297
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antifúngicos y antibacteriales. El trans-anetol incrementa la movilidad intestinal. El extracto
acuoso de semillas de anís también muestra actividad citotóxica contra células de melanoma.
Bergamota
Citrus bergamia, es una fruta típica que abunda en la región de Calabria (Italia). Es conocida
como una fuente importante de flavonoides y limonoides. Se ha reportado el uso potencial
del jugo de la fruta en la terapia contra la artritis, y para dislipidemias.
Buchú
Corresponde al aceite obtenido de Agathosma betulina que tiene no solo una fragancia
agradable, sino que es de importancia cosmética para la piel. Se han realizado diferentes
estudios que muestran que los extractos y el aceite esencial presentan buena actividad
antimicrobiana contra varios patógenos como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis y Candida albicans. También se reporta que
presenta buena actividad antioxidante y propiedades antiinflamatorias. Por cromatografía
en capa fina de alta resolución se puede diferenciar esta especie de otras del mismo género.
Canela
La droga corresponde a la corteza desecada de Cinnamomum zeylanicum, Laurácea. El aceite
esencial contiene cinamaldehído y eugenol entre otros. El aceite esencial de la especie
relacionada Cinnamomum cassia, junto con el de timo han mostrado potencial uso contra el
hongo Aspergillus flavus, el cual es conocido por producir sustancias cancerígenas.
Cardamomo
Corresponde al aceite obtenido de las semillas de Elettaria cardamomum, el cual ayuda a la
digestión y estimula el apetito. Se le atribuyen propiedades afrodisíacas y que ayuda a aclarar
la mente de ruido y confusión. El extracto metanólico de las semillas de esta planta presenta
potencial como ansiolítico.
Cidrón
Corresponde a Aloysia citriodora (sinónimo Lippia citriodora), además del uso como
aromatizante de la esencia de esta planta se ha evaluado su uso como insecticida, junto a
otros aceites esenciales.
Cilantro
Corresponde a Coriandrum sativum L. Las hojas y tallos de esta planta han mostrado
actividad larvicida sobre Aedes aegypti. Se reporta también que las hojas frescas pueden ser
útiles para el manejo de la enfermedad de Alzheimer, para disminuir los niveles de colesterol
en sangre y su actividad anticolinesterasa. Además de su uso como aromatizante, las hojas y
tallos presentan propiedades antioxidantes, antibacterianas y antifúngicas.
298
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Clavo
El clavo Syzigium aromaticum L. tiene un gran potencial como preservativo de alimentos
especialmente contra bacterias patogénicas. El clavo comercial son las flores secas, que se
usan ampliamente como condimento o especial en muchos alimentos y aplicaciones
farmacéuticas. El aceite esencial se usa para el cuidado dental. Es activo contra bacterias
asociadas a las caries dentales y la enfermedad periodontal. También es activo contra
bacterias como Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella enterica, Salmonella
enteritidis, Campylobacter jejuni, y Staphylococcus aureus. También se reportan estudios
sobre actividades antifúngica, antialérgica, anti cáncer, anti mutagénica y contra
Tripanosoma cruzi.
Comino
Corresponde a las semillas de Cuminum cyminum L., de la familia de las umbelíferas. Su aceite
esencial contiene -pineno, ß-pineno, mirceno, -felandreno, -terpineno, limoneno, ß-
felandreno, 1,8-cineol, p-cimeno, -terpineno, 3-p-menten-7-al, mirtenal, cuminaldehído,
felandral, 1,3-p-mentadien-7-al, cis-sabineno hidrato, trans-sabineno hidrato, -terpineol,
alcohol cuminílico, ß-cariofileno, ß-farneseno y ß-bisaboleno.
Se ha reportado que el cuminaldehído tiene efectos protectores sobre la enfermedad
neurodegenerativa de Parkinson. También se reportan estudios in vivo e in vitro de la
actividad anticancerígena potencial del aceite esencial. La actividad antioxidante está
relcionada con los flavonoides presentes en la planta. También se mencionan propiedades
anti diabéticas, anti hipertensivas, inmuno modulatorias y anti candidiasis del aceite.
Hierba de limón
Corresponde a Cymbopogum citratus. Se han reportado propiedades antimicrobianas y anti
inflamatorias, por lo cual se elaboran productos para uso tópico en el tratamiento de lesiones
de la piel y de las mucosas. El extracto de la planta entera, presenta potencial actividad
antimalárica.
Eucalipto
En las diferentes especies del género Eucalyptus, el aceite esencial contiene como
componente mayoritario al 1,8-cineol. Este compuesto presenta propiedades interesantes
como por ejemplo protección contra el virus de influenza. También se usa como remedio
analgésico y antipirético contra la gripa, el resfriado y la congestión nasal.
Jengibre
Corresponde a Zingiber officinalis. El rizoma de esta planta es usado ampliamente como
condimento. El aceite esencial contiene sesquiterpenos, compuestos carbonílicos, alcoholes,
299
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monoterpenos, los cuales contribuyen al aroma y sabor del jengibre. El extracto de jengibre
también se utiliza ampliamente como medicina herbaria, con propiedades anti inflamatorias,
anti cancerosas, y antimicrobianas. El efecto saludable del jengibre se atribuye a la presencia
de metabolitos secundarios que reducen los niveles de colesterol en el plasma sanguíneo, en
el hígado, y en la placa ateroesclerótica de la aorta. Además, los compuestos tales como los
gingeroles, shogaoles, paradoles y la zingerona, presentan actividad antioxidante.
Lavanda
El aceite esencial de Lavandula angustifolia contiene 1,8-cineol, cis-β-ocimeno, linalool,
acetato de 1-octen-3-ilo, alcanfor, linalool, acetato de linalilo y acetato de lavandulilo. La
planta es ampliamente conocida como medicina herbaria por sus propiedades antioxidantes,
anti fúngicas, bactericidas, citotóxicas, antisépticas, anti inflamatorias y analgésicas.
El aceite de lavanda está aprobado por la Agencia de Medicinas Europea EMA como una
hierba medicinal contra el estrés y la ansiedad. La acción ansiolítica del linalool ha sido
comparada a la producida por el valium™.
Matricaria
Corresponde a Matricaria chamomilla. Es una droga vegetal de aplicación medicinal amplia,
principalmente por sus propiedades anti inflamatorias, antisépticas, y antiespasmódicas. Se
aplica en campos como la dermatología, otorrinolaringología, gastro enterología,
neumología, pediatría y radioterapia. El aceite esencial contiene como componentes
mayoritarios óxidos de bisabolol A y B, óxido de bisabolona A, y camazuleno.
Menta
Entre las diferentes especies, Mentha piperita contiene un aceite esencial que se utiliza para
saborizar alimentos y bebidas. Este aceite ha demostrado resultados prometedores para
inhibir hongos patógenos, como los que afectan productos post cosecha. Los compuestos
comúnmente encontrados incluyen el mentol, eucaliptol, acetatoe de mentilo y limoneno.
Este aceite es reconocido para uso seguro y de bajo riesgo para los consumidores.
Naranja
El aceite de la cáscara de naranja Citrus aurantium, y de otras especies del mismo género,
contienen citral, α-terpineol, citronelal, geraniol, y linalool. En general los aceites esenciales
de diferentes especies de Citrus se reconocen por sus propiedades ansiolíticas. El extracto
de las flores de esta planta presenta propiedades anti inflamatorias y anti complemento.
300
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Orégano
Corresponde a Origanum vulgare, Labiatae, su aceite esencial contiene principalmente
sabineno, β-cariofileno, espatulenol, γ-eudesmol, germacreno-D, p-cimeno, terpinén-4-ol,
entre otros. El aceite presenta propiedades anti bacterianas.
Perejil
El aceite esencial de Petroselinum crispum, contiene miristicina, apiol, α- y β-pineno y
limoneno entre otros. El apiol, que es uno de los más abundantes, es considerado de riesgo
cancerígeno y genotóxico, pero menos que su similar el safrol.
Pino
Existen alrededor 115 especies de pinos, género Pinus, familia Pináceas. Los pinos son
conocidos por el uso de su madera y por sus aceites esenciales característicos. La especie
Pinus nigra contiene en su aceite esencial α-cadinol, óxido de manool, germacreno-D, E-
cariofileno, limoneno, α-terpineol, α-pineno, entre otros. Pero la composición química del
aceite varía de especie a especie y de acuerdo a la ubicación geográfica.
Ruda
La planta Ruta graveolens ha mostrado actividades biológicas que incluyen: antihelmíntica,
abortiva, antiparasitaria, antiinflamatoria, antidiarreica, anti-reumática, antifebril, anti
ulcera, repelente, antidiabética y antimicrobiana. Dos compuestos cetónicos constituyen el
80% del aceite esencial: 2-undecanona y 2-nonanona.
Salvia
Salvia officinalis es una muy conocida hierba aromática utilizada como té. Se reconoce su uso
para el tratamiento de resfriados y enfermedades bronquiales. También se ha encontrado
que sus extractos tienen propiedades antioxidante, antimicrobiana, antinflamatoria y
antidiabética. Los metabolites más abundantes incluyen los monoterpenos β-tuyona, 1,8-
cineol, y alcanfor, los cuales se usan como agentes antimicrobianos.
Sándalo
El sándalo como ocurre con otros aceites esenciales corresponde a las esencias de varias
especies de planta del género Santalum. La esencia de sándalo contiene como componentes
principales al α- y β-santalol. Al evaluar la acción hipoglicémica in vivo, tanto del aceite como
del α-santalol, se encuentra evidencias de sinergismo con los otros componentes del aceite.
Los otros componentes incluyen: cis y α-trans-bergamotol, cis-epi-β-santalol, cis-lanceol, cis-
nuciferal, β-santaleno, entre otros. También se ha reportado su potencial para la curación de
heridas. Tambien se reporta que α-santalol y el aceite entero tienen acción potencial contra
cáncer e infecciones por hongos en la piel.
301
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Toronjil
Melissa officinalis ha sido utilizada desde hace mucho tiempo por sus propiedades sedativas,
digestivas, analgésicas, antibacteriales, antivirales y antioxidantes.
Esta planta ha sido utilizada ampliamente como fragancia para vino, té y cerveza, y como
planta medicinal contra diferentes enfermedades como desórdenes gastrointestinales y
nerviosos, y contra el reumatismo, especialmente en Europa. El eugenol presente en su
aceite esencial tiene actividad antiespasmolítica, y una fracción de taninos presentó
actividad antiviral.
La esencia contiene principalmente limoneno, β-citronelal, β-citral, α-citral, cariofileno y
germacreno-D, y muestra potencial para uso contra diabetes. Es importante recordar que la
composición química del aceite es variable dependiendo del sitio de recolección, por ejemplo
una muestra recolectada en Marruecos, contiene entre sus componentes mayoritarios el
acetato de geranilo, y presentó actividad contra diferentes microorganismos.
Yerba mate
Corresponde a las hojas del Ilex paraguayensis, Fam. aquifoliaceae. En la fracción arrastrada
por destilación con vapor de agua se identificaron entre otros: linalool, -ionona, ß-ionona,
-terpineol, geraniol, nerolidol, geranilacetona y eugenol, siendo el nerolidol activo contra
la bacteria Streptococcus mutans causante de las caries dentales.
Ylang-Ylang
La planta denominada Ylang-ylang corresponde a Cananga odorata, y es nativa del sur de
Asia. Se reportan usos para dolor abdominal, curación de heridas, recuperación postparto,
diarrhea, malaria y dolor en la espalda. También se usa su esencia como antidepresivo y
contra la menopausia. Entre los componentes de la esencia se han reportado: acetato y
benzoato de metilo, éter metílico de p-cresol, acetato de 3-metil-2-butén-1-ilo, entre otros.
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Capítulo 6
Productos naturales marinos
309
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A diferencia de los metabolitos secundarios de las plantas y organismos terrestres, el estudio
químico y de actividad biológica de los metabolitos secundarios de los organismos marinos,
es de desarrollo más reciente. Esto debido principalmente, a la dificultad de acceso que se
ha tenido para su recolección. Adicionalmente, mientras con los productos terrestres, existe
todo un bagaje histórico de uso para muchos de ellos, lo que ha determinado y permitido
legalizar su uso para fines farmacéuticos, bien sea como materias primas o como productos
activos (drogas vegetales); pero este no es el caso de la química de los productos naturales
marinos. No obstante, lo anterior, es conocido que la biodiversidad marina es mayor que la
biodiversidad terrestre, con organismos de tamaños tan variables que oscilan desde los
microorganismos más simples hasta los más grandes cetáceos como las ballenas, con toda
una gama de tamaños intermedios y de diversidad biológica. Además, gracias a que las
técnicas de recolección de organismos marinos cada vez permiten el estudio de organismos
marinos de los mares profundos, se están comenzando a investigar dichos organismos, lo
que vislumbra un potencial de encontrar nuevos metabolitos como por ejemplo antibióticos
con menor resistencia por parte de bacterias causantes de enfermedades.
Aparte de lo anterior y si se considera que en el extenso mundo marino se presentan
interacciones entre los microrganismos como la simbiosis de invertebrados con
microorganismos, estas relaciones simbióticas derivan en la obtención de nuevos
metabolitos con diferentes actividades biológicas
Esta abundancia en biodiversidad, y los hallazgos logrados muestran que los organismos
marinos, comparados con los organismos terrestres estudiados; contienen una mayor
diversidad y cantidad de sustancias naturales, con muchas y diferentes actividades biológicas
y con muchas variaciones en sus estructuras químicas.
Dentro de los organismos marinos más estudiados están las esponjas marinas, otros
invertebrados marinos y las algas marinas. Las esponjas en particular son atractivas para su
conocimiento químico, pues contienen una gran diversidad de metabolitos secundarios que
incluyen especialmente terpenoides, y a diferencia de la mayoría de terpenoides terrestres,
los marinos contienen halógenos, lo cual parece ser una característica distintiva de ambas
fuentes naturales.
En el caso de las algas marinas, muchas de ellas son utilizadas como alimento,
particularmente en los países de oriente como la China y Japón, pero adicionalmente son
utilizadas en la elaboración de productos cosméticos y nutracéuticos, por sus propiedades
biológicas.
Otra fuente inagotable de productos naturales son los microorganismos marinos, que se
constituyen en verdaderas mini fábricas de metabolitos con diversas estructuras químicas y
actividades biológicas y propiedades industriales únicas. Un ejemplo de esto son los hongos
310
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marinos, los cuales se reconocen como una fuente de sustancias promisorias para su uso
farmacéutico.
Los artículos de revisión que se publican sobre la química de los productos naturales marinos,
han ido cubriendo año tras año, el creciente número de publicaciones e investigaciones. Un
ejemplo de ello, son los interesantes y completos trabajos de revisión como los de Blunt y
col. Estas revisiones se refieren a organismos tales como fitoplancton, algas verdes, pardas y
rojas, esponjas, cnidarios, briozoos, moluscos, tunicados, equinodermos, manglares y otras
plantas intertidales, y microorganismos. En forma general muestran como a diferencia de
los organismos terrestres, muchos organismos marinos contienen por ejemplo m[as
metabolitos halogenados, lo cual es de esperarse dada la abundancia de los halógenos en el
medio marino. Sin embargo, estos trabajos muestran no solo una gran cantidad de sustancias
con estructuras novedosas y algunas con una gran complejidad estructural, al compararlas
con sus contrapartes terrestres; sino que también presentan una amplia gama de actividades
biológicas, lo que las hace sustancias atractivas para la investigación y desarrollo de nuevos
medicamentos.
Desde el punto de vista de su actividad biológica, existen muchas sustancias aisladas de
fuentes marinas, que se evalúan a nivel preclínico por su potencial antibacterial,
antidiabético, antifúngico, anti-inflamatorio, antiparasitario, anti tuberculosis, y antiviral;
que afectan los sistemas inmune y nervioso. Algunos de ellos se encuentran en fase clínica
III, otros han sido aprobados por entidades como la FDA de los Estados Unidos. Hasta 2016,
estaban disponibles comercialmente ocho medicamentos con actividad antiviral y anti
cáncer, especialmente. La citarabina, un nucleósido que tiene el nombre comercial de
Cytosar-U™, aprobado en 1969 contra el cáncer, la vidarabina, otro nucleósido registrado
comercialmente como Vira-A™, aprobado en 1976 contra cáncer; el Ziconotide, registrado
comercialmente como Prialt™, es un peptido anti cáncer aprobado en 2004; los esteres
etílicos de ácidos grasos omega-3, registrados como Lovaza™, y aprobados en 2004 para
tratar la hipertrigliceridemia; la trabectedina, registrada comercialmente como Yondelis™,
un alcaloide tetrahidroisoquinolínico aprobado en 2007 para el tratamiento de cáncer; el
mesilato de eribulina, una cetona macrocíclica comercialmente registrada como Halaven™,
y aprobada en 2010 para el tratamiento de cáncer; la brentuximab vedotina, conocida
comercialmente como Adcetris™, y que es un conjugado con un anticuerpo, aprobado en
2011 contra cáncer; y el iota-carragenano, comercialmente conocido como Carragelose™,
que es una mezcla de polímeros sulfatados de galactosa, aprobado en 2013 como antiviral.
En cuanto a la metodología utilizada actualmente, esta es básicamente la misma mencionada
en el capítulo 1, pero en particular cada día se están utilizando más las técnicas combinadas
de cromatografía líquida y espectrometría de masas. Esto es muy útil y conveniente para los
procesos de bioprospección. Un ejemplo de estos es la técnica combinada de cromatografía
311
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líquida HPLC con espectrometría de masas con ionización laser y espectrometría de masas
de ionización electrospray, cuya sigla inglesa corresponde a LC-ICP-MS/ESI-MS.
A nivel general se conoce que los organismos marinos son fuente industrial de metabolitos
tales como carotenoides, ácidos grasos polinsaturados (p. ej. ω-3) y compuestos fenólicos;
todos ellos con propiedades útiles para la salud humana especialmente, pero además en
estos organismos se siguen encontrando nuevos compuestos con potencial contra diferentes
enfermedades. A continuación, se presentan algunos ejemplos representativos de las
diferentes clases de metabolitos secundarios presentes en organismos marinos. Estos
incluyen esteroides y terpenoides, quinonas, compuestos bromados, compuestos con
nitrógeno heterocíclico, compuestos con nitrógeno y azufre.
Entre la gran cantidad de esteroides aislados está el fucosterol, el cual se ha reportado como
no tóxico, y que reduce los niveles de colesterol en la sangre y presenta actividad
antidiabética, además presenta potencial contra enfermedades neurodegenerativas. A los
esteroles también se les atribuye la capacidad de reducir la grasa en el hígado y la
acumulación excesiva de grasa en el corazón. Un esterol hidroxilado en el carbono 16,
recientemente se aisló de la esponja marina Monanchora sp., y presenta propiedades
inmuno modulatorias.
HO
Fucosterol
HO
OH
Esterol de esponja Monanchora sp.
312
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La cefalostatina-20 se aisló como un componente minoritario del gusano marino
Cephalodiscus gilchristi. Al comparar esta sustancia con las cefalostatinas más potentes, esta
sustancia es entre 100 y 1000 veces menos citotóxica.
N
N
O
OOH
HO
OH
OH
OH
O
HO
HO OH
O
Cefalostatina-20
Los limonoides son una clase de terpenoides. La moluccensina-J junto con otros limonoides,
aislados de plantas de manglares como Ceriops tagal presentan actividad antiviral in vitro y
contra leucemia in vivo. En el caso de los carotenoides, de la estrella de mar apodada “corona
de espinas” Acanthaster planci, se aisló el carotenoide nuevo 6’-epigobiusxantina.
O
O
OAcO
MeCOO
OH
O
Moluccensina-J
313
Ir al índice
OH
HO
HO
6'-epigobiusxantina
La esponja marina Ircinia felix, contiene sesterterpenos como la variabilina. Estos
compuestos han mostrado ser una mezcla potente inhibidora de quorum sensing.
OO
O
OH
Variabilina
De la esponja Smenospongia aurea se aislaron meroterpenoides tipo friedodrimano, con
mediana citotoxicidad a células tumorales. La presencia del grupo iminoquinona no tiene
precedentes en la naturaleza.
N
O
O
MeO
OEt
O
O
HO
Meroditerpenos tipo friedodrimano
314
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La presencia de los halógenos en las estructuras de diferentes metabolitos secundarios
marinos es una característica distintiva frente a su contraparte terrestre, por ejemplo, el
diterpeno bromado antraesfaerol, aislado de un alga roja Laurencia sp.
La penicilivicina, es un compuesto con nitrógeno en heterociclo aislado de un hongo
Penicillium sp., y presenta actividad antimigratoria potente de cáncer de seno.
La eustidina-A, aislada del tunicado Eudistoma sp., tiene potencial terapéutico para el
tratamiento de tumores.
La stelletapectina-A, es un depsipéptido aislado de la esponja Stelleta sp. Presenta potencial
contra el virus del sida.
OH
Br
Antrasfaerol
HN
N
O
O
O
Penicilivinacina
N
N
N
N
HO
OMe
Eustidina-A
315
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NH
O
O
N
NH
NH
O
N
NH
O
O
O
O
O
MeO
CONH2
OH
OMe
NH O
CONH2HN
O
NH O
CONH2NH
O
NH
OOHOHH2NOC
OH
H2N
Stelletapectina-A
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317
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Capítulo 7
Sesquiterpénlactonas
318
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En la búsqueda de sustancias naturales para el diseño y elaboración de nuevos
medicamentos, hay diferentes sustancias terpenoides que contienen un anillo lactónico,
generalmente α,β-insaturado. Estas sustancias presentan diferentes actividades biológicas,
siendo particularmente citotóxicas. Aquí se incluyen terpenoides de varias clases como
sesquiterpenos, diterpenos, sesterterpenos y esteroides; que además contienen un anillo
lactónico. A estas sustancias se las denomina como sesquiterpénlactonas, diterpénlactonas
(p. ej. gingkólidos), sesterterpénlactonas (p. ej. ácidos tetrónicos de esponjas marinas);
withanólidos, etc. La presencia del anillo lactona en todas estas sustancias está relacionada
con su actividad biológica, otro ejemplo de esto son los cardiotónicos, los cuales son
esteroides naturales con un anillo lactónico, como se mencionó en el capítulo 3.
Pero son las sesquiterpénlactonas, una de las clases más estudiadas y evaluadas, y que
además muestra un potencial notable para el desarrollo de nuevos medicamentos contra
enfermedades como el cáncer. Por esto en este capítulo se profundizará sobre algunos
aspectos químicos y de actividad biológica de estas interesantes sustancias, de las cuales, al
año 2015 se habían reportado más de 6.000 en la naturaleza.
Definición
Se definen como sesquiterpénlactonas a los sesquiterpenoides (Terpenoides C15) que
contienen en su estructura el grupo funcional de éster cíclico, más comúnmente llamado
anillo lactónico. La figura 7.1. muestra ejemplos de varias sesquiterpénlactonas naturales.
O
O
O
O
OH
O
Eremantólido-C
OO
H
HHO
O
Cynaropicrina
O
O
Costunólido
O
O
OO
OH
HO
O
8-O-Metacriloilisoelefanpano
O
O
O
Asteriscunólido-A
O
O
O
Parthenólido
Figura 7.1. Estructuras químicas de algunas sesquiterpénlactonas naturales.
319
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Nomenclatura
Debido a la gran diversidad estructural de las sesquiterpénlactonas, no se cuenta con unas
normas claras para su nomenclatura, por esto se acostumbra a denominarlas con nombres
comunes p.ej. helenalina, mexicanina, artemisinina, etc.; aunque algunos autores las
nombran relacionando el núcleo básico y los sustituyentes. También se utilizan nombres
comunes con la terminación ólido, la cual se usa para toda sustancia natural que posea un
anillo lactónico p. ej. parthenólido, costunólido, etc.
La Figura 7.2. muestra varios núcleos de sesquiterpénlactonas, y la manera como se
enumeran los átomos de carbono del núcleo básico.
Figura 7.2. Estructuras y enumeración de los carbonos en seis núcleos de sesquiterpénlactonas.
O
O
1
2
3
4
56
7
8
9
10
11
13
12
14
15
H
O
O1
2
3
4
5
6
7
8
910
14
15
13
11
12
Germacranólidos Pseudoguaianólidos
O
O
Eremofilanólidos
1
5
15
10
14
11
12
13
O
O
1
10
14
15
11
12
13
Eudesmanólidos
O O1
2
3
6
15
Lancifólidos
O
O
12
3
15
5
89
10
14
11
12
13
Onoseriólidos
320
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Clasificación
Las sesquiterpenlactonas se clasifican comúnmente de acuerdo con el tipo de núcleo que
poseen y agregándoles la terminación ólido que indica la existencia de un grupo funcional
lactona (Figura 7.2); por ejemplo, las que contienen el núcleo tipo germacrano se las llama
germacranólidos; las que tienen el núcleo tipo eremofilano son eremofilanólidos, las que
contengan núcleo tipo eudesmano son eudesmanólidos, heliangólidos, fukinanólidos, etc.
Biogénesis
Las sesquiterpenlactonas se originan a partir de farnesilpirofosfato como los demás
sesquiterpenos naturales. Es generalmente aceptado que la ruta principal para esto es a
través del ácido mevalónico, pero también se propone que es la del metileritritol (1). La
Figura 7.3 esquematiza la biogénesis de los intermedios I, II, III y IV, a partir de los cuales se
propone el origen de la mayoría de sesquiterpenos.
La lactonización del precursor sesquiterpenoide parece producirse por un mecanismo de
oxidación de un grupo metilo hasta carboxilo, la oxidación de un carbono adyacente y
finalmente la deshidratación entre los grupos carboxilo e hidroxilo formados. La Figura 7.4
describe este proceso.
En una forma similar se sugiere que se originan las otras clases de sesquiterpénlactonas. La
Figura 7.5 muestra las relaciones biogenéticas propuestas para las diversas clases de
sesquiterpénlactonas, donde se sugiere que los germacranólidos, son los precursores de
varias clases de sesquiterpénlactonas. La Figura 7.6 muestra un esquema propuesto para la
biogénesis de ambrosanólidos y helenanólidos.
Distribución y estado natural
Las sesquiterpénlactonas son constituyentes característicos de plantas, particularmente de
la familia de las compuestas, aunque se han encontrado en otras plantas de familias como
magnoliáceas, umbelíferas y lauráceas. Las concentraciones de sesquiterpénlactonas
pueden variar entre el 0.01 y el 8% del peso seco, y se las encuentra generalmente en hojas
y partes aéreas. Se las puede encontrar en forma libre principalmente, y raramente en forma
glicosídica
321
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Figura 7.3. Biogénesis de los cuatro cationes precursores de sesquiterpenos.
Extracción
Debido a que la gran mayoría de sesquiterpénlactonas naturales se encuentran en forma
libre en las plantas que las poseen, tienen las propiedades de solubilidad características de
la gran mayoría de terpenoides, y son por lo tanto solubles en solventes relativamente
apolares como cloroformo, diclorometano, benceno, éter etílico, etc. Aunque el cloroformo
es el solvente más usado para su extracción, es recomendable remplazarlo por uno como el
acetato de etilo, teniendo en cuenta que este último es menos tóxico y menos contaminante
que los solventes halogenados. También se utiliza para la extracción el etanol, una vez
obtenido el extracto etanólico, este se concentra y se suspende en agua caliente. Al hacer
partición con acetato de etilo se obtiene en la fase orgánica, el extracto crudo de
sesquiterpénlactonas. Más recientemente se están comenzando a utilizar solventes
eutécticos para la extracción como los obtenidos con ácido málico-ChCl (1:1), ácido málico -
glucosa (1:1), ChCl-glucosa (5:2), ácido málico-prolina (1:1), glucosa-fructosa-sacarosa
(1:1:1) y glicerina-prolina-sacarosa (9:4:1).
322
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Figura 7.4. Biogénesis del anillo lactónico de sesquiterpenlactonas.
Separación y análisis cromatográfico
Las sesquiterpénlactonas pueden separarse y analizarse bien sea por cromatografía en
columna o cromatografía en capa fina, utilizando sílica gel y diferentes eluentes, pero sin
duda los métodos instrumentales como la cromatografía de gases y especialmente la
cromatografía líquida HPLC, combinadas con detectores de ultravioleta, espectrómetros de
masas, y con resonancia magnética nuclear, son los más convenientes por su eficiencia y
rapidez para los análisis).
Como agente visualizador (o revelador) para los análisis por cromatografía en capa fina
pueden utilizarse una solución de cloruro de aluminio al 5% en etanol, y calentamiento a
120°C durante 10-15 minutos. En estas condiciones las sesquiterpénlactonas se observan
como manchas pardas o violeta, que fluorescen de color amarillo, pardo o verde bajo la luz
de 366 nm. También se usa el reactivo de Zimmerman, que produce manchas de color gris
a violeta.
C H 2 O HC O O H
C O O HO H
Germacranólidos,etc.
O
O
O
-H [O]
[O]
[O]
-H 2 O
323
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Figura 7.5. Interrelaciones biogenéticas entre varias clases de sesquiterpenlactonas.
O
O
O
O
O
O
O
O
Germacranólidos
Elemanólidos
Eudesmanólidos
O
O
seco-Eudesmanólidos
O
O
Eremofilanólidos
O
O
Bakkenólidos
O
O
Cadinanólidos
O
O
Guaianólidos
O
O
Xanthanólidos
seco-Germacranólidos
O
O
O
O
Helenanólidos
seco-Helenanólidos
O
O
Crimaranólidos
Ambrossanólidos
O
O
O
O
seco-Ambrossanólidos
324
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Figura 7.6. Biogénesis de Ambrosanólidos y Helenanólidos.
O P P
trans-FPP
H
X
OH
H
H
X
HO
HO
X
H
H
HH O
O H
HH O
O H
HO
X
H
H
H
OH
OO
O
Ambrossanólidos
H
OH
O
O
O
Helenanólidos
325
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Para el caso del análisis de mezclas de sesquiterpénlactonas, por cromatografía líquida de
alta eficiencia, la longitud de onda de detección usada es 215 nm.
La estructura química de las sesquiterpénlactonas se dilucida a partir de datos obtenidos
principalmente de los análisis por espectroscopía infrarrojo, ultravioleta, espectrometría de
masas y de Resonancia Magnética Nuclear. A continuación, se mencionan algunos aspectos
relacionados con el uso de estas técnicas.
Espectrometría de Masas
Debido a la gran diversidad estructural encontrada en las sesquiterpénlactonas naturales, no
se cuenta como en el caso de otras sustancias, de estudios de fragmentación que ayuden a
identificar estas sustancias. La técnica de ionización electrospray (sigla inglesa ESI), en modo
positivo, permite la obtención de los iones moleculares M+ y los iones pseudomoleculares
(también llamados cuasi moleculares) que contienen un protón adicional [M+H]+, o carecen
de un protón [M-H]+, pero, además, permite la obtención de otros iones como [M+m]+,
donde m es un metal como sodio o potasio. Cuando se utiliza una celda de colisión, se
pueden obtener fragmentos provenientes de estos iones, que en el caso de los iones M+
permiten obtener a partir de ellos nuevas fragmentaciones que se pueden interpretar con
los mecanismos de la espectrometría de masas clásica, esta técnica se conoce como
espectrometría de masas tándem y se reconoce por la sigla inglesa MS/MS. Adicionalmente,
en el caso de los iones pseudomoleculares, se pueden obtener fragmentaciones con
retención o migración de la carga. En general se observan fragmentos correspondientes a la
pérdida de una o varias moléculas de agua, monóxido de carbono, formaldehído, dióxido de
carbono y metanol, pero estos dependen de cada estructura en particular, y de si se utiliza
ESI en modo positivo o negativo.
Las figuras 7.7 y 7.8 muestran a manera de ejemplo, los posibles mecanismos de
fragmentación en espectrometría de masas clásica, de las sesquiterpénlactonas grosmicina,
canina y rupinas A y B.
326
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Figura 7.7. Mecanismo de formación del ión m/z 136 de la grosmicina.
Figura 7.8. Mecanismo de formación del ión m/z 111 en los espectros de masas de canina y las rupinas A y B.
O
O
OO
O
H
O H
HO
O
O
O
OH
O
m/z 136
O
O
R
O HO
O
O
O
R
O HO
O
O
O
O
O
O
H
RO
O H
m/z 111 (100%)
R=H, CaninaR=OH, Rupina AR=OAc, Rupina B
327
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Resonancia Magnética Nuclear
En general, los espectros de RMN-1H de las sesquiterpénlactonas muestran señales
características:
a) Los grupos metileno terminales aparecen como 2 dobletes entre 6.0-6.2 y 5.7-5.5 ppm,
con constantes de acoplamiento de aprox. 2 – 4 Hz.
b) Los grupos metilos ligados al anillo saturado aparecen como dobletes J = 7 Hz, alrededor
de 1.1 ppm.
c) En el sistema:
El protón 6 aparece como doblete (J=10 hz) entre 4.4-5.0 ppm.
El protón 7 aparece como multiplete alrededor de 3.4 ppm.
d) En el sistema:
Los protones 6 y 7 aparecen a 4.5 y 2.2 ppm.
La figura 7.9 muestra las señales características del espectro RMN-1H, reportado para
Artemisia anomala. En color azul se aprecian los valores calculados con la herramienta en
línea NMRdb.org, y en negro los valores experimentales reportados. Puede observarse la
O
HH
O
5
67
8
O
HH
O
5
67
8
328
Ir al índice
buena aproximación entre los valores calculados y los experimentales, con diferencias que
no sobrepasan las 0.5 unidades de desplazamiento químico.
O
O
O
O
O
O
H
6.23 bs
2.13 s 3.17 bd
4.17 bd
6.22 d, 5.59 d
5.15 td
2.46 / 2.29 dd
2.41 s
1.78 s
1.45 s
1.92 / 2.25 2.09 s
5.54
6.21, 5.73
4.48
3.172.25
6.11
Figura 7.9. Desplazamientos químicos RMN-1H reportados y calculados para una sesquiterpénlactona citotóxica aislada de Artemisia anomala.
En el caso de RMN-13C, esta técnica es de gran utilidad para sustancias sin el anillo aromático,
como son en general los terpenoides. La figura 7.10 muestra los desplazamientos químicos
de dos sesquiterpénlactonas, tanto experimentales como los calculados con el software
Chemwind®, de Biorad Labs®. La figura 7.11. muestra los desplazamientos químicos
experimentales y calculados con NMRdb.org de los carbonos para la misma
sesquiterpénlactona de la figura 7.9. En este último caso, puede observarse la buena
aproximación entre los valores calculados y los experimentales, con diferencias que no
sobrepasan las 5.0 unidades de desplazamiento químico.
329
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Figura 7.10. Desplazamientos químicos en RMN-13C de dos sesquiterpenlactonas.
a) Valores hallados experimentalmente,
b) Valores calculados con el programa Chemwind®.
128.7
203.3
145.3
85.4
12.1
121.413.8145.9
165.0
36.425.6
25.7
37.474.8
64.7128.7
203.3
145.3
85.4
12.1
121.413.8
145.9
165.0
36.425.6
25.7
37.474.8
64.7
O
O
O
OH
O
O
O
OH
a.
b.
O
O
O
OH
O
O
O
OH
163.5
130.9
210.4
58.9
84.0
40.3
18.2
29.7
28.3
44.078.9
121.5
140.0
170.7
17.4
163.5
130.5
207.8
57.2
83.1
37.8
14.8
25.8
31.7
41.7
120.4
170.0
138.7
79.6
17.6
330
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O
O
O
O
O
O
H
21.2
64.9199.8
128.3
159.7
17.5
52.3
79.3
169.1
121.9136.9
48.8
69.8
170.2
21.0
40.063.8
18.7
65.241.2
64.0
200.1
133.8
169.0
21.2
48.5
77.5
55.0
135.9
122.1
169.6
69.0
175.8
21.0
Figura 7.11. Desplazamientos químicos RMN-13C reportados y calculados para una sesquiterpénlactona citotóxica aislada de Artemisia anómala.
Espectroscopía ultravioleta
Las sesquiterpénlactonas ,-insaturadas absorben entre 205-235 nm debido al grupo
carbonilo lactónico.
Espectroscopía infrarroja
El grupo carbonilo de las lactonas α,β-insaturadas absorbe alrededor de 1750-1770 cm-1;
con desplazamientos hasta 1795 cm-1 cuando hay variaciones estructurales como p.ej.
fusiones trans de los anillos.
Ensayos de reconocimiento
Aunque no existe una prueba específica para reconocer sesquiterpenlactonas en muestras
biológicas, son muy utilizados los ensayos de reconocimiento de anillos lactónicos con
reactivos nitro como son los ensayos de Kedde, Legal y de Raymond. Aquí es importante
tener en cuenta que hay otras sustancias como los cardiotónicos y algunas acetogeninas que
también producen resultado positivo, debido a que también contienen anillos lactónicos. Se
han sugerido varios mecanismos para explicar la coloración violeta que se produce con los
reactivos nitro, una de ellas es la formación de los denominados complejos de Meisenheimer
(Figura 7.12).
331
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O
O
R
NO2
O2N COOH
NaOH
O
O
R
NO2
O2N COONa
Compuesto
lactónicoAcido 3,5-dinitrobenzoico
(reactivo de Kedde)
Complejo de Meisenheimer
(color violáceo)
Figura 7.12. Formación de complejos de Meisenheimer, entre un compuesto lactónico y el reactivo de Kedde.
Ensayo de Legal
Las sesquiterpenlactonas con anillos -lactona ,-insaturados producen coloración rosa
cuando se disuelven en piridina, se añade nitroprusiato de sodio y un álcali. La prueba
también la dan positiva las lactonas ,-insaturadas cuando no se controla el pH, ya que se
isomerizan en medio alcalino. La prueba también la dan positiva las metiléncetonas.
Ensayo de Kedde
A la muestra disuelta en alcohol se añade ácido 3,5- dinitrobenzoico y KOH. Se producen
coloraciones violetas o azules que desaparecen después de una hora.
Ensayo de Raymond (o de Marthoud)
A la muestra disuelta en alcohol se agrega m-dinitrobenceno y NaOH. Se producen
coloraciones violetas que desaparecen rápidamente.
Sin embargo, estas pruebas no se pueden realizar sobre extractos coloreados (por ejemplo,
con clorofilas) y es conveniente realizarlos en combinación con la cromatografía en capa fina
para obtener buenos resultados.
Actividad biológica
Para las sesquiterpénlactonas se reportan varias actividades biológicas tales como: acción
citotóxica, antiinflamatoria, antitumoral, antibacterial, anti dermatitis en humanos,
venenosa, insecticida, antimicótica, inhibidores del crecimiento de las plantas, y otras.
332
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La actividad citotóxica de las sesquiterpenlactonas ha sido relacionada especialmente con el
anillo lactónico provisto del grupo exometileno. A continuación, se presentan algunos
ejemplos de estudios de actividad biológica de sesquiterpénlactonas naturales.
La artemisinina es una sesquiterpénlactona aislada inicialmente de Artemisia annua, pero
también ha sido aislada de otras plantas del género Artemisia, de la familia de las
compuestas. Esta sustancia es más activa contra el parásito de la malaria Plasmodium
falciparum, que la cloroquina, y sus derivados se usan actualmente combinada con otras
sustancias para el tratamiento de esta enfermedad.
O
O
H
OO
H
O
Artemisinina
Centipeda minima de la familia de las compuestas, es una hierba medicinal china, utilizada
comúnmente para prevenir infecciones respiratorias y cáncer nasofaríngeo. De esta planta
se aisló 6-O-angeloilenolina, que tiene potencial para el tratamiento del cáncer de pulmón.
O
H
O
O
O
6-O-Angeloilenolina
Saussurea lappa, es otra medicina herbaria china, a la que se le atribuyen actividades
biológicas múltiples como inhibir las respuestas inflamatorias, prevenir la proliferación de
células cancerosas e inducir apoptosis. Esta planta contiene la sesquiterpénlactona
dehidrocostus-lactona, que ha mostrado actividad in vitro contra células cancerosas.
333
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O
H
H
O
Dehidrocostus-lactona
La alantolactona es una sesquiterpénlactona aislada de Inula helenium, a la que se ha
reportado tener actividad propiedades antiinflamatoria y anti-cáncer. Se ha mostrado que
tiene potencial en el tratamiento de la inflamación asociada a desórdenes metabólicos, tales
como la resistencia a la insulina y diabetes tipo 2.
O
H
H
O
Alantolactona
La enfermedad del sueño es producida por el parásito Trypanosoma brucei, y Vernonia
lasiopus es una planta africana usada tradicionalmente para curar problemas de indigestión,
dolores de estómago, problemas gastrointestinales, gusanos, malaria, enfermedades
venéreas, como purgante, etc. De esta planta se aisló la vernolepina, la cual ha mostrado una
interesante actividad in vitro contra el parásito T. brucei. Una especie relacionada Vernonia
amygdalina es una planta con potencial antihelmíntico, a partir de ella se han obtenido varias
clases de compuestos, que incluyen varias sesquiterpénlactonas, flavonoides y saponinas
esteroides; y se ha sugerido su uso como agente terapéutico o preventivo para reducir la
toxicidad de los medicamentos normalmente utilizados contra esta clase de parásitos.
O
O
OH
HO
O
Vernolepina
334
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La damsina y la ambrosina, aisladas de la especie suramericana Ambrossia arborescens,
muestran potencial contra células tallo cancerosas.
O
O
O O
O
O
Damsina Ambrosina
Elephantopus scaber L. (Compuestas), es una planta ampliamente distribuida en la China. La
planta entera la denominan didancao, y es utilizada en la medicina china como antifebril,
diurética, antibacteriana y antiviral. También se usa para el tratamiento de hepatitis, tos,
neumonía, bronquitis y dolor en las articulaciones. De esta planta se han aislado diez
sesquiterpénlactonas tipo elemanólido, los cuales están asociados a una actividad
antitumoral potencial.
Diferentes especies de plantas de las familias asteráceas, lamiáceas y mirtáceas presentan
propiedades anti-tricomonas y dentro de los componentes bioactivos identificados se
encuentran varias sesquiterpénlactonas.
Es interesante anotar que algunos sesquiterpenos que no poseen el ciclo lactónico, sino otros
grupos éster, como los aislados de Artemisia pérsica, presentan potente actividad
antiplasmodial.
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337
Ir al índice
Capítulo 8
Otros derivados de AcetilCoenzima-A
338
Ir al índice
Si bien los terpenoides constituyen uno de los más grandes grupos de metabolitos
secundarios derivados biosintéticamente del acetil coenzima-A, esta sustancia también es el
precursor de otras sustancias de importancia biológica como los ácidos grasos, los cuales
cumplen papeles fundamentales como componentes de membranas en los fosfolípidos,
además de ser fuente de energía para diferentes procesos metabólicos. Además, los ácidos
grasos a su vez son precursores en diferentes organismos de sustancias de interés
farmacéutico como son los poli acetilenos, las prostaglandinas, las acetogeninas entre otros;
los cuales presentan diferentes actividades biológicas. Todos estos compuestos, de manera
general tienen la característica de no incluir en su estructura química los anillos aromáticos.
Sin embargo, por una ruta biosintética alterna, denominada la ruta de las cadenas
policetídicas; se originan sustancias como los antibióticos tipo tetraciclina, y sustancias con
anillos aromáticos de diferentes clases como son los flavonoides y las quinonas mencionadas
en el capítulo 2, y otros compuestos aromáticos que tienen como característica grupos
oxigenados en disposición meta en el anillo aromático.
A continuación, se presentan algunos aspectos relevantes sobre algunas de estas sustancias
naturales, especialmente sobre su biosíntesis y algunas técnicas de análisis.
Ácidos grasos
Los ácidos grasos naturales incluyen fundamentalmente compuestos con cadenas
hidrocarbonadas que oscilan generalmente entre los 4 y 30 átomos de carbono. La cadena
hidrocarbonada puede contener una o varias insaturaciones. Las tablas 8.1 y 8.2 muestran
listas de alcaloides con cadenas saturadas y con cadenas insaturadas, respectivamente.
Tabla 8.1. Ácidos grasos naturales de cadena par saturada.
CH3(CH2CH2)nCOOH
n Número total de carbonos Nombre sistemático Nombre común
1 4 n-Butanoico Butírico
2 6 n-Hexanoico Caproico
3 8 n-Octanoico Caprílico
4 10 n-Decanoico Cáprico
5 12 n-Dodecanoico Laúrico
6 14 n-Tetradecanoico Mirístico
7 16 n-Hexadecanoico Palmítico
8 18 n-Octadecanoico Esteárico
339
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n Número total de carbonos Nombre sistemático Nombre común
9 20 n-Eicosanoico Araquídico
10 22 n-Docosanoico Behénico
11 24 n-Tetracosanoico Lignocérico
12 26 n-Hexacosanoico Cerótico
13 28 n-Octacosanoico Montánico
14 30 n-Triacontanoico Melissico
Tabla 8.2. Algunos ácidos grasos monoinsaturados.
Número total de carbonos y enlaces dobles
Nombre sistemático Nombre común
16:1 9(Z)-Hexadecenoico Palmitoléico
18:1 9(Z)-Octadecenoico Oléico
18:1 11(Z)-Octadecenoico cis-Vaccénico
22:1 13(Z)-Docosenoico Erúcico
18:2 9(Z),12(Z)-Octadecadienóico Linoléico
18:3 9(Z),12(Z),15(Z)-Octadecatrienoico α-Linolénico
18:3 6(Z),9(Z),12(Z)-Octadecatrienoico γ-Linolénico
20:4 5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-Eicosatetraenoico Araquidónico
22:5 7(Z),10(Z),13(Z),16(Z),19(Z)-Docosapentaenoico Clupadónico
Los ácidos grasos poliinsaturados contienen entre 18 y 22 átomos de carbono, y se les
denomina comúnmente de acuerdo con la posición del enlace doble carbono-carbono
ubicado en el extremo apolar de la cadena, como omega-3, omega-6, etc., dependiendo si
están a 3 ó 6 carbonos de distancia de dicho extremo apolar. Para mencionarlos también se
les nombra como ácidos ω-3, ω-6; aunque también se les nombra como ácidos n-3 ó n-6.
Estos compuestos (sigla inglesa PUFA, PolyUnsaturated Fatty Acids), y en especial los omega-
3 y omega-6 pueden proporcionar beneficios para la salud, además de proporcionar energía.
Estos ácidos grasos son importantes para el mantenimiento de la salud y el bienestar
humano, porque minimizan los riesgos de enfermedades cardiovasculares y
neurodegenerativas como artritis, diabetes y ciertos tipos de cáncer. Debido a que el
340
Ir al índice
organismo humano no produce estos compuestos en suficiente cantidad, se les conoce como
ácidos grasos esenciales y tienen que ser suplidos a través de la dieta. Los PUFA son
abundantes en peces marinos, algas y algunas semillas vegetales. Los que se encuentran en
aceites vegetales son de cadena hidrocarbonada corta, como el ácido α-linolénico (ALA C18:3
ω – 3), y el ácido linoleico (LA, C18:2 ω – 6). Los aceites de peces y algas contienen PUFAs de
cadena larga como son ejemplos los ácidos eicosapentaenoico (EPA, C20:5 ω – 3),
docosapentaenoico (DPA, C22:5 ω – 3), docosahexaenoico (DHA, C22:6 ω – 3) y araquidónico
(AA, C20:4 ω – 6). Los PUFAs disponibles en el comercio provienen principalmente de aceites
de peces como el atún, las sardinas, la macarela, arenque y trucha.
Los ácidos grasos son biosintetizados a partir de la acetilcoenzima-A, por procesos mediados
enzimáticamente, que elongan la cadena hidrocarbonada con adiciones de dos unidades de
átomos de carbono. De esta manera se producen ácidos como el esteárico, que tiene 18
átomos de carbono y su cadena hidrocarbonada es recta y saturada. El ácido esteárico y en
general los ácidos grasos saturados son deshidrogenados enzimáticamente en posiciones
específicas de la cadena hidrocarbonada para dar origen a los monoinsaturados, por
ejemplo, el oleico. Una posterior des hidrogenación en otros sitios de la cadena
hidrocarbonada da origen al ácido linoleico.
Los ácidos grasos naturales se pueden encontrar en forma libre o enlazados a glicerol
(triglicéridos, por ejemplo), enlazados a esteroles (esteres de esteroles), en las estructuras
de fosfolípidos, entre otros. De acuerdo con esto se debe seleccionar el método de
extracción. Para muchos propósitos se ha utilizado la mezcla cloroformo-metanol 2:1, la cual
aseguran muchos autores, es ideal para la extracción de la fracción lipídica de muestras
naturales. Para esto se requiere partir preferiblemente de muestras secas y molidas, con el
fin de eliminar la interferencia del agua en el proceso de extracción. El proceso incluye la
agitación, preferiblemente con ultrasonido, seguido de partición con agua, para separar la
fase orgánica que contiene el material lipídico menos polar. Dada la toxicidad de estos
solventes, es recomendable ensayar en la extracción preferiblemente con una mezcla de
acetato de etilo y etanol 2:1. En algunos casos la extracción soxhlet con solventes orgánicos
de baja polaridad, es superada en rendimiento por la extracción con ultrasonido con metanol
a 60°C utilizando relaciones de 45:1 solvente-muestra vegetal, en peso.
Una vez obtenida la fase orgánica, esta se seca con sulfato de sodio anhidro, se concentra al
vacío, y el extracto lipídico se puede analizar por cromatografía en capa fina. Para esto se
pueden utilizar cromatoplacas de sílica gel, como eluente hexano-acetato de etilo 4:1, y
como revelador ácido fosfomolíbdico, seguido de calentamiento a 105°C. En estas
condiciones los ácidos grasos libres se observan como manchas ovoides de color azul de Rf
aprox. 0.4, y los ésteres de esteroles y triglicéridos se observan como manchas azules de Rf
aprox. 0.8-0.9. Los fosfolípidos por su polaridad no se mueven del punto de siembra.
341
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Si se desea se pueden aislar en estas condiciones, la fracción de ácidos grasos libres y la
mezcla de ésteres de esteroles y triglicéridos, pero si se desea obtener todo en forma de
ácidos grasos libres, se puede someter a hidrólisis alcalina bien sea el extracto total, o la
fracción aislada de triglicéridos y ésteres de esteroles. Para esto la fracción se somete a
reflujo con NaOH 2N etanólico. El tiempo de reflujo dependerá de la cantidad a hidrolizar.
Para menos de 50 mg de muestra, con una hora de reflujo es suficiente, pero se puede seguir
el proceso de hidrólisis por cromatografía en capa fina en el sistema ya descrito. Una vez
concluida la hidrólisis, la mezcla se deja enfriar, se neutraliza con HCl 2N acuoso, y se
recuperan los ácidos grasos libres por partición con acetato de etilo.
La fracción de ácidos grasos libres se puede analizar por la técnica combinada cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas de impacto electrónico, pero en forma de
derivados ésteres metílicos. Los espectros de masas de los ésteres metílicos de muchos
ácidos grasos naturales están disponibles en bases de datos comerciales. A manera de
ejemplo, el espectro de masas del éster metílico del ácido palmítico, presenta con mayor
intensidad los iones m/z 55, 74 (100%, pico base), 87, 101, 115, 129, 143, 157, 171, 185, 199,
213, 227, 239, 241 y 270. Estos iones tienen como fórmula general [CH3OCO(CH2)n]+. El ión
más intenso m/z 74 se origina a través de un rompimiento tipo McLafferty. La secuencia de
iones con diferencia de 14 unidades de masa como son m/z 87, 101, 115, etc., corresponde
a rompimientos de enlaces sencillos carbono-carbono, como se ilustra en la 8.1. El ión
molecular m/z 270 es consistente con el peso molecular correspondiente a la fórmula
molecular C17H34O2. El ión m/z 231, corresponde a la pérdida del grupo metoxilo.
87
101115
129
143
157
171
185
199
213
227
241
CH3O
O
CH3O
OH
m/z 74
R. McLafferty
O
m/z 239
- OCH3
Figura 8.1. Esquema de la fragmentación del éster metílico del ácido palmítico, en espectrometría de masas de impacto electrónico.
342
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En el caso de los ácidos grasos insaturados, el espectro de masas de impacto electrónico
permite determinar el peso molecular y observar algunos fragmentos característicos de la
cadena hidrocarbonada, pero no permite determinar la posición de la insaturación; para esto
es necesario preparar el derivado pirrolidida del ácido graso y determinar su espectro de
masas de impacto electrónico. A manera de ejemplo, el espectro de masas del derivado
pirrolidida del ácido oleico, presenta los iones intensos m/z 113 (pico base) y 126, así como
también el ión molecular m/z 335. Además, se observa una serie de iones m/z 140, 154, 168,
182 entre otros. El pico base m/z 113 se origina a través de un rompimiento McLafferty, para
dar el ión con la estructura mostrada en la figura 8.3. Los iones m/z 126, 140, 154, etc., son
originados por rompimientos simples carbono-carbono y tienen como fórmula general
[C4H8NCO(CH2) n]+. Pero adicionalmente se observan dos iones m/z 196 y 208,
correspondientes a una diferencia de 12 unidades de masa. Estos iones permiten determinar
la posición del enlace doble en el carbono 9.
R. McLafferty
O
N
N
OH
m/z 113
126 154 196
208
Figura 8.3. Esquema de la fragmentación del derivado pirrolidida del ácido oléico, en espectrometría de masas de impacto electrónico.
Para la interpretación de los espectros de masas y la identificación de los ácidos grasos,
obtenidos con columnas de cromatografía de gases de diferente polaridad, además de las
bases de datos, se cuenta con análisis multidimensionales que permiten inclusive asignar
posiciones y geometrías de los enlaces dobles, sin necesidad de derivatizaciones posteriores.
343
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A partir de los derivados ésteres metílicos es posible obtener también los derivados
pirrolidida, los cuales permiten asignar la posición de los enlaces dobles carbono-carbono en
la cadena hidrocarbonada. Actualmente se cuenta con herramientas en línea de acceso
abierto como LipidXplorer®, la cual permite el análisis de espectros de masas tándem de las
diferentes clases de lípidos.
Prostaglandinas y tromboxanos
Los eicosanoides son una gran clase de lípidos bioactivos naturales derivados de la oxidación
del ácido araquidónico (AA), e incluyen las prostaglandinas (PG), los tromboxanos (TX), los
leucotrienos (LT), las lipoxinas (LX), los ácidos hidroxieicosatetraenóicos (HETEs), y los ácidos
epoxieicosatrienoicos (EETs). Son sustancias de vida media corta que actúan en procesos
patológicos y fisiológicos que incluyen el cancer, las enfermedades inflamatorias, la sanación
de heridas, etc.
Las prostaglandinas son una clase de eicosanoides conocidos como prostanoides, que
contienen 20 átomos de carbono y un anillo ciclopentano. A su vez, se dividen en dos grupos:
prostaciclopentanos y tromboxanos. Los primeros se clasifican con base en las estructuras
de sus anillos ciclopentano (denotados utilizando una letra desde la A hasta la K), y el número
de enlaces dobles en sus cadenas hidrocarbonadas, que se denotan utilizando un numero
subíndice del 1 al 3. Mientras los tromboxanos consisten en TXA y TXB (figura 8.4). Por
ejemplo, la estructura:
COOH
O(O)H
O
OH
Corresponde a la Prostaglandina-E2 (PGE2), porque el anillo ciclopentano es del tipo E, y las
cadenas R1 y R2, contienen dos enlaces dobles.
Las prostaglandinas están involucradas en diferentes funciones biológicas del organismo
humano, que incluyen la regulación del sistema inmune, la fiebre y el dolor asociados a la
inflamación, la hemos tasis y la presión sanguínea. También se han encontrado en
organismos no mamíferos como aves, algunos peces, trematodos, moluscos, corales, algas
rojas y hongos. Entre los organismos diferentes a mamíferos en los que se han encontrado
prostaglandinas están los corales blandos Gersemia fruticosa y Plexaura homomalla, los
crustáceos Gammarus sp., Caprella sp.,Daphnia pulex, Homarus americanus, y Petrolisthes
cinctipes; en el alga roja Gracilaria vermiculophylla y en cordados primitivos Ciona savignyi y
Ciona intestinalis. El papel de las prostaglandinas en estos últimos organismos es aun motivo
344
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de investigación, pero algunos autores afirman que cumplen funciones importantes en
insectos y artrópodos, y como mecanismo de defensa contra los depredadores en diferentes
organismos marinos. Además, que presentan un interesante potencial farmacológico contra
procesos de inflamación, y como antitumorales y antivirales.
Poliacetilenos
Otros derivados de los ácidos grasos son los poliacetilenos, que como su nombre lo indica,
contienen en su estructura química uno o varios enlaces triples carbono-carbono. La figura
8.5 muestra ejemplos de varios de ellos aislados del ginseng.
Los poliacetilenos se han aislado de organismos como plantas, hongos, organismos marinos,
insectos y humanos. En general presentan diversas actividades biológicas, lo que los hace
sustancias de interés para la medicina, la farmacología, la química medicinal y la industria
farmacéutica. En alimentos como la zanahoria, el apio, la lechuga, el perejil, la alcachofa y el
tomate, se reportan poli acetilenos del tipo falcarinol. Las familias vegetales que más se
reportan como fuentes de estos compuestos incluyen las apiáceas, las araliáceas, las
asteráceas, las campanuláceas, las olacáceas, las pitosporáceas y las santaláceas.
345
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R1
R2
O
R1
R2
O
R1
R2
OH
O
R1
R2
O
PGA PGB PGC PGD
R1
R2
O
HO
PGE
R1
R2
O
O
PGG/H
R2
OR1
HO
PGI
R1
R2
O
PGJ
R1
R2
O
O O
R1
R2
O
O
R1
R2
OH
HO
PGK TXA TXB
COOH
O(O)H
COOH
O(O)H
COOH
O(O)H
PGX1 PGX2 PGX3
Figura 8.4. Nomenclatura de prostaglandinas. Arriba los núcleos probables tipo ciclopentano o pirano para tromboxanos, y abajo las tres cadenas R1 y R2.
346
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OH OH
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Cl
Panaxinol Ginsenoina-A
PanaxidolPanaxidiol
Cl
Ginsenoina-B Panaxidol clorohidrina
Figura 8.5. Estructuras químicas de varios compuestos poli acetilénicos aislados de las raíces de Panax ginseng.
En el caso de los organismos marinos, se han reportado poli acetilenos de cadena corta (C15-
C20) con anillos oxigenados de 6, 7, 8 y 9 átomos, especialmente en algas, mientras que
organismos como las esponjas marinas contienen poli acetilenos de cadenas hasta de más
de 40 átomos de carbono, generalmente sin ciclaciones. En estos organismos también es
común la presencia de sustituyentes como el bromo y el cloro, lo cual es una característica
de muchos metabolitos marinos. En este caso se han reportado actividades biológicas que
incluyen antihongos, antimicrobiana, inhibición de la transcriptasa reversa del VIH,
citotóxica. Además de inducir la metamorfosis de larvas de ascidias, prevenir la invasión de
larvas de percebe e inhibir la fertilización de gametos de estrellas de mar.
Los poliacetilenos son derivados biogenéticamente de ácidos grasos como el esteárico, el
oleico y el linoleico. La figura 8.6, muestra el esquema propuesto para la biogénesis de
compuestos acetilénicos a partir de ácidos grasos insaturados, puede observarse que los
enlaces dobles C=C y los enlaces triples C≡C, se originan mediante procesos que se resumen
en des hidrogenaciones mediadas por enzimas.
347
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Los métodos para la extracción incluyen el uso de microondas y el uso de ultrasonido, con
solventes como metanol y etanol. Sin embargo, se reporta que la extracción por reflujo con
metanol es más eficiente que el uso de ultrasonido a temperatura ambiente. Una vez
extraídos se pueden fraccionar por cromatografía en columna con mezclas de diferentes
proporciones de hexano-acetato de etilo.
Los poliacetilenos muestran en sus espectros UV bandas características entre 200 y 410 nm.
Los que tienen el sistema diino (-C≡C-C≡C-) muestran bandas en 230, 240 y 255 nm. Los que
contienen el sistema diino-eno (-C≡C-C≡C-C=C-) muestran bandas en 210, 238, 251, 265 y
280 nm.
Para la separación se utiliza HPLC en fase reversa con mezclas como acetonitrilo-agua en
diferentes proporciones, y la cromatografía en contracorriente de alta velocidad, de la cual
se afirma es un método simple, eficiente y económico.
Cuando se analizan por HPLC acoplado a espectrometría de masas con detector APCI, se
pueden obtener sus iones cuasimoleculares M-H-. También se reportan análisis con HPCL
acoplado a espectrometría de masas de tiempo de vuelo (Time of flight).
En RMN-13C, las señales de los carbonos acetilénicos se observan generalmente entre 60 y
85 unidades de desplazamiento químico. Por ejemplo, en el capileno, aislado de Artemisia
ordosica, los desplazamientos de los carbonos acetilénicos se presentan en la estructura
mostrada a continuación. Los valores en negro corresponden a los desplazamientos químicos
reportados, y los mostrados en azul, a los calculados con la herramienta en línea nmrDB.org.
348
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SCoA
O
COOH
Acido esteárico (C18)
COOH
Acido oléico
COOH
Acido petroselínico
COOH
Acido linoléico
COOH
Acido crepenínico
COOH
Acido tarírico
Figura 8.6. Esquema biogenético simplificado de compuestos acetilénicos a partir de ácidos grasos saturados e insaturados.
349
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74.2
67.5
64.4
73.8
87.4
66.3
64.9
78.2
Tetraciclinas y anfotericinas
La ruta de la acetilcoenzima-A no solo lleva a una gran cantidad de compuestos como los
terpenoides, los ácidos grasos, los poliacetilenos, las prostaglandinas, entre otros, sino que
también mediante una ruta conocida como la de las cadenas policetídicas o del malonato,
da origen a una gran cantidad de sustancias con anillos aromáticos -como se describe a
manera de ejemplo con las antraquinonas en el capítulo 2- y a compuestos tan importantes
como las anfotericinas, las nistatinas y las tetraciclinas producidas por diferentes
microrganismos.
Las tetraciclinas fueron descubiertas en los 1940s, y son antibióticos con un amplio espectro
de actividad contra microorganismos Gram+ y Gram-. Su uso se ha limitado a personas
adultas por su capacidad quelante con el calcio y sus efectos gastrointestinales. Sin embargo,
se han venido desarrollando nuevos derivados con mejores propiedades como la
omadaciclina, un derivado semisintético que además de presentar actividad potente contra
bacterias Gram+, Gram-, anaerobias, aerobias y típicas.
NH H
OHO OH OH
NH
N
OH
H2N
O
O
Omadaciclina
Otro ejemplo de la importancia farmacéutica de las tetraciclinas es el compuesto SP2575,
aislado de Streptomyces sp. Que además presenta actividad antitumoral contra varias líneas
celulares.
350
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OH H
OO OH
H2N
O OHO
HO
O
HO
OMeO
O
O
OH
Tetraciclina SP2575
La figura 8.7, esquematiza la biogénesis de clorotetraciclina, a partir de malonamilamida y
ocho unidades de malonilcoenzima-A, que originan la cadena policetídica, que luego es
deshidratada para formar el tetraciclo. Luego de varios procesos se origina la sustancia como
tal.
La figura 8.8 muestra un esquema biogenético propuesto para la anfotericina-B.
Aquí es importante mencionar que se están desarrollando trabajos con ingeniería genética
para producir diferentes compuestos de interés farmacéutico, gracias al conocimiento que
se tiene de la ruta de las cadenas policetídicas.
NH2
OO
CoAS
MalonamilCoA
8 malonilCoA
SEnz
NH2
O O O O
O O O O O
Cadena policetídica intermedia
- 3 H2O
O O O O
NH2
O
OH
Cl
OH O
HOH H
NMe2
NH2
O
OH
OOH
OH
Clorotetraciclina
Figura 8.7. Esquema biogenético resumido para las tetraciclinas, por la vía de la malonilcoenzima-
A.
351
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O OH OH OH OH O
OHOH
OH
HO
O O O O O O
O
O
O O
O
OOOOOOO
O
HO
O OH OH OH OH O
OHOH
COOH
O
HO
OH
OOH
NH2
HO
Figura 8.8. Esquema biogenético para la anfotericina-B, a partir de una cadena policetídica.
Compuestos aromáticos derivados de cadenas policetídicas
Como se mencionó, además de la gran cantidad de metabolitos secundarios, que
generalmente no contienen anillos aromáticos, como los terpenoides; la ruta de la
acetilcoenzima-A también da origen a compuestos aromáticos, que también de manera
352
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general contienen sustituciones meta-dioxigenadas en su estructura molecular. Esto se
explica a través de la formación de las cadenas policetídicas, que tienen la formula general:
CH3-(CO-CH2)n-COOH
CH3
O O
OHn
Para la formación de estas cadenas policetídicas, la acetilcoenzima-A es “carbonatada”
enzimáticamente, lo que origina la malonilcoenzima-A:
CH3
O
SCoA
CO2
Enz.
CH2
O
SCoA
O
HO
AcetilCoA MalonilCoA
La formación de la malonilcoenzima-A puede unirse a la de acetilcoenzima-A mediante el
mecanismo:
CH3
O
SCoA CH2
O
SCoA
O
-O+
CH3
O
CH2 SCoA
O
CO2
La molécula formada a su vez, se une a una nueva molécula de malonilcoenzima-A, para
generar un tricétido:
CH2
O
SCoACH3
O
CH2
O
SCoA
O
-O+
CH3
O
CH2 CH2
O
SCoA
O
CO2
Tricétido
Este proceso se repite mecanísticamente, para dar origen a un tetracétido:
CH2
O
SCoACH2
O
CH3
O
CH2
O
SCoA
O
-O+
CH2
O
CH2 CH2
O
SCoA
O
CH3
O
CO2
TetracétidoTricétido
353
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Si se siguen adicionando moléculas de malonilcoenzima-A, se generan sucesivamente un
hexacétido, un octacétido, un decacétido, etc. Esto se puede resumir en la expresión general:
CH3
O
SCoACH2
O
SCoA
O
HO
+CH2
O
SCoACH3
O
n
Enz.
n
+ n CO2 + n AcetilCoA
Cadena policetídica
Las cadenas policetídicas (o policétidos) así formadas se pueden plegar de diferentes
maneras, para dar origen a diferentes compuestos aromáticos, tal como se ilustra en la figura
9.6. El proceso de formación de enlaces dobles C=C, entre los grupos carbonilos y los
metilenos, ocurre mediante reacciones de condensación (eliminación de moléculas de agua).
En la figura se puede observar también como a partir de un mismo pentacétido, se puede
dar origen a dos compuestos aromáticos distintos, dependiendo de la forma en que se
pliegue la cadena policetídica antes de la condensación.
CH3
COOH
OO
O
O O
H H H H
CH3O
O O
COOH
2H2O
aromat.CH3HO
OH OH
COOH
O
O
O
CH3
COOH
OH H
H2O
COOH
O
O CH3
Oaromat.
COOH
OH
HO CH3
O
Figura 9.6. Esquema biogenético que explica como a partir de un pentacétido, se puede dar origen a dos compuestos aromáticos distintos, pero que tienen como característica el patrón de oxigenación meta.
Un ejemplo de este proceso es la biogénesis del heterocornol-B, aislado de Pestalotiopsis
heterocornis (Figura 8.9).
354
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OH
O O
O
O O O O
CH3
O
O CH3
O
O O
OH
O
Red. ydeshidratación
Reducción
Red. ydeshidratación Reducción
Aromatización
CHOOH
OH
OH
Heterocornol-B
Figura 9.7. Esquema biogenético del heterocornol-B (19).
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356
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Capítulo 9
Metabolitos de hongos
357
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Además de los metabolitos secundarios que se encuentran en los organismos vegetales y
animales, el reino de los hongos incluye muchos macro- y microorganismos, que son fuentes
de metabolitos secundarios de interés farmacéutico. Los hongos han sido utilizados a través
de la historia para fines mágico-religiosos y en la alimentación, también han sido un problema
para la agricultura, especialmente debido a las micotoxinas que producen algunos hongos
filamentosos. En el primer caso están los denominados hongos sagrados, que incluyen
Amanita muscaria, varias especies de Psilocybe y Claviceps purpurea. Entre los más
conocidos están los denominados alcaloides del ergot que se obtienen del hongo Claviceps
purpurea, que es un parásito del centeno o cornezuelo, y que han servido para el desarrollo
de medicamentos utilizados para el tratamiento de migrañas, inhibidores de prolactina, anti
Parkinson, entre otros usos. También es el caso de los hongos del género Penicillium, gracias
a los cuales se obtuvo inicialmente el antibiótico tan importante como es la penicilina.
También son conocidos por ser la fuente de ergosterol, una sustancia precursora de las
vitaminas D, que son importantes en diferentes procesos fisiológicos humanos. Estos y otros
ejemplos se han logrado gracias a la investigación de los hongos encontrados en diferentes
hábitats terrestres, pero recientemente se han iniciado estudios con hongos del mar, los
cuales se constituyen en una despensa hasta ahora poco conocida y explorada, de
metabolitos secundarios de interés para desarrollar productos útiles para el mantenimiento
de la salud, como las penicilinas, las cefalosporinas, las ciclosporinas, las estatinas, entre
otros.
Se calcula que existen en la naturaleza unas 1.5 millones de especies de hongos, de los cuales
solo un 10% ha sido clasificado taxonómicamente. Se clasifican en un reino diferente, porque
a diferencia de los vegetales no poseen pared celular, sino quitina; y no realizan la
fotosíntesis. Una clasificación breve los subdivide en basidiomicetos, ascomicetos,
zigomicetos, oomicetos, deuteromicetos (hongos imperfectos), y microsporidiomicetos. Los
deuteromicetos incluyen géneros como Alternaria, Aspergillus y Penicillium.
Los hongos producen diversidad de compuestos que incluyen desde antibióticos hasta
micotoxinas. Todos estos compuestos son producidos básicamente por tres rutas: la del
ácido mevalónico que da origen a compuestos tales como terpenoides y esteroides; la del
ácido shikímico que da origen a muchos compuestos aromáticos y a alcaloides aromáticos; y
la de las cadenas policetídicas, que da origen a ácidos grasos, otros compuestos aromáticos,
etc.
Aunque los antibióticos han sido la gran contribución de los hongos para la salud humana, se
vienen encontrando nuevas sustancias, y más importante con un mayor potencial uso
farmacéutico gracias a las diferentes actividades biológicas que presentan. La tabla 9.1
presenta una lista de metabolitos, sus fuentes y sus actividades biológicas reportadas.
358
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Tabla 9.1. Ejemplos de metabolitos bioactivos de hongos y sus actividades biológicas.
Metabolitos Fuente Actividad Biológica
Ascomicona-B y 6-desoxifusarubina
Biatriospora sp. Citotóxica
Asperterpenoide-A, Asperlonas A y B, mitorubrina
Aspergillus sp. Inhibidor de la protein tirosina fosfatasa B, de Mycobacterium tuberculosis
Aspecetolactonol, aspironol, epiaspinonadiol
Aspergillus sp. Citotóxica a líneas de cáncer humano
Apicidina-F Fusarium fujikuroi Antimalárica
Beauvericina Fusarium sp. Contra Trypanosoma sp.
Citrinina Penicillium sp, asociado a esponja
Antibacteriana y citotóxica
Cladosina-C Cladosporium sphaerospermum
Antiviral, Contra influenza A H1N1
Cercosporenos-F Cercospora sp. Citotóxica a líneas celulares de cáncer, induce autofagia en células HCT116
1-(2,6-dihidroxifenil)pentan-1-ona
Crystoporiopsis sp. Antibacteriana
6,8-di-O-metilaverufina Aspergillus versicolor Antibacteriana
Dihidronaftalenona-2 Nodulisporium sp. Antimicobacteriana
Dinapinona AB2 Talaromyces pinophulos Inhibición síntesis de triglicéridos en células de mamífero
Fumiquinazolina Q y Protuboxepina-E
Penicillium expansum Efecto mitigatorio de bradicardia y actividad vasculogenética
Gliotoxina Aspergillus sp. Citotóxica células HeLa
Ganoleucoinas A y C Ganoderma leucocontextum Inhibición HMG-CoA reductasa
4-hidroximelleina Phoma sp. Inhibición células leucemia murina P-388
359
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Metabolitos Fuente Actividad Biológica
Herquedicetal Penicillium sp. Contra S. aureus sortasa A
Hispidina Phaeolus schweinitzii Antioxidante
Isosclerona Aspergillus fumigatus Antiproliferativa, células MCF-7 cáncer de seno
Nodulosporividirina-G Nodulisporium sp. Inhibición de agregación de amiloides β42
Neoquinulina-A Eurotium sp. Anti inflamatoria
Pestalotiopsona-A Pestalotiopsis sp. Antibacteriana
Poliporusterona-B Polyporus umbellatus Antitumoral, células HepG2
Fenilpiropenos E y F Penicillium concentricum Citotóxica, células MGC-803
Pinazafilona-B y penifupirona Penicillium sp. Inhibición de α-glucosidasa
Gliotoxina reducida, 6-acetilbis(metiltio)gliotoxina
Neosartorya pseudofischeri Citotóxica y anti bacteriana
Solaninaftoquinona Fusarium solani Citotóxica, células MCF-7 cáncer de seno
Sorbicatecoles A y B Penicillium chrysogenum Antiviral, virus influenza A (H1N1)
Estemfiperilenol Botryosphaeria dothidea Antifúngica y citotóxica, células HCT116
Verrucosidina Penicillium sp. Antimicobacteriana
Ciclosporinas
Las ciclosporinas son un grupo de oligopéptidos cíclicos apolares, siendo la ciclosporina-A, el
más conocido, y que posee actividad inmuno supresora. Es utilizada ampliamente en los
procesos de trasplante de corazón, hígado y riñón.
360
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O
NH
O
NHN
NH
O
O O
N
O
N
O
NN
O
NNH
O
O
HO
O
Ciclosporina-A
La ciclosporina-A (CyA), se utiliza en numerosas enfermedades como la enfermedad de
Graves, uveítis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, lupus eritematoso
sistémico, dermatomiositis, psoriasis, artritis reumatoide, y ciertas nefropatías donde se
involucren factores inmunológicos. Por estas propiedades, la ciclosporina-A se prepara por
métodos biotecnológicos, como la fermentación sumergida.
Metabolitos con potencial anti-cáncer
Algunos metabolitos obtenidos de hongos presentan propiedades antitumorales
importantes, por lo cual varios se encuentran en fases de ensayos preclínicos y clínicos.
La fenilahistina, aislada de Aspergillus ustus, es un derivado de fenilalanina con un anillo
imidazol. Esta sustancia ha mostrado actividad potente contra diferentes líneas de células de
cáncer tanto in vitro como in vivo en ratones. Un derivado sintético denominado pinabulina
presenta también actividad antitumoral potente.
HN
NH NNH
O
O
Fenilahistina
361
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La palmarumicina CP-1, se aisló del hongo endofítico Coniothyrium palmarum. Es una
sustancia que contiene una rara estructura de espirobisnaftaleno. Esta sustancia tiene
propiedades antimicóticas, antibacteriana y antiproliferativa. Un compuesto relacionado con
un grupo acetato en posición para respecto al hidroxilo, denominado rithidenona-H, ha sido
aislado del endófito Rhytidysteron rufulum, muestra actividad contra dos líneas de células
cancerosas.
O
O
O
HO
Palmarrumicina-CP1
O
O
O
HO
O
O
Rithidenona-H
La rhizoxina es un policétido macrocíclico aislado del hongo Rhizopus chinensis. Se origina
por la bacteria Burkholderia que vive en sus hifas. Además de ser un problema para los
cultivos de arroz, esta sustancia es muy citotóxica contra células tumorales humanas y
murinas. Esta sustancia se liga la β-tubulina e inhibe la mitosis, por lo que se la clasifica como
un antimitótico.
O
OH
O
H
O
O
OHO
O
N
OMe
Rhizoxina
El epoxiquinol-B es un compuesto pentacíclico altamente funcionalizado, aislado de un
hongo no identificado. Su estructura novedosa es la de un dímero de pentacétido, Esta
sustancia presenta una fuerte actividad anti angiogénica. La angiogénesis está relacionada
362
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con diferentes enfermedades como el cáncer, la artritis reumatoide, la retinopatía diabética,
y otras enfermedades crónicas.
OO
O
H
O
O
O OHHO
Epoxiquinol-B
La fumagilina es un meroterpenoide antibiótico que fue aislado inicialmente en 1949 del
hongo Aspergillus fumigates. Es muy usado para el tratamiento de enfermedades causadas
por micrósporas, por ejemplo, en pacientes con sida, los cuales tienen disminuido su sistema
autoinmune. También para pacientes recién trasplantados y para pacientes con micrósporas
en los ojos. Además, esta sustancia inhibe la angiogénesis, lo cual es indispensable para el
crecimiento de tumores y la metástasis. Otros estudios han mostrado que la sustancia inhibe
el desarrollo de varias líneas células de cáncer. Sin embargo, debido a los efectos laterales
que presenta, se vienen estudiando análogos químicos para mejorar sus propiedades. Esta
sustancia se ha identificado también en aguas superficiales mediante técnicas como
extracción en fase sólida SPE, y HPLC-ESIMS.
OMe
OOH
O
O
O
O
Fumagilina
La destruxina-B es un ciclodepsipéptido aislado del hongo entomopatogénico Metarhizium
anisopliae en 1961. Posteriormente se ha aislado de otros hongos del género Althernaria y
Ophiosphaerella. Esta sustancia ha mostrado un amplio espectro de actividades que
incluyen: fito toxica, antiviral, insecticida, antitumoral, citotóxico y citostática. Esta sustancia
está siendo investigada por sus propiedades potenciales contra cánceres como el colo-rectal
y del hígado.
363
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O
O
NH
N
NN
NH
O O
O
O
O
H
H
Destruxina-B
La cotylenina-A aislada en 1970 desde un caldo de cultivo de Cladosporium sp., es un
glicósido diterpenoide con potencial utilidad para el desarrollo de alternativas terapéuticas
contra el cáncer de pulmón, de seno y leucemia.
OMeHO
H
HO O
O
OMe
O
O O
OHO
Cotylenina-A
La myriocina, es un ácido graso aminado, aislado inicialmente en 1972 del ascomiceto
termofílico Myriococcum albomyces. Esta sustancia es un inhibidor potente de la serina-
palmitoil transferasa. Uno de sus derivados el Fingolimod®, fue aprobado por la FDA en 2010
para el tratamiento de la esclerosis múltiple. Estudios posteriores han mostrado que tiene
potencial contra diferentes tipos de cáncer como el de mama, glioblastoma, de próstata, de
pulmón, colangiocarcinoma, gástrico, pancreático, colon, de ovario, de vejiga, y contra
problemas hematopoyéticos. La myriocina puede analizarse mediante técnicas como HPLC
acoplada a espectrometría de masas y HPLC con detector de fluorescencia.
364
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HO
OOH
OH
OH
NH2
O
Myriocina
La cytocalasina-E, es una micotoxina del hongo Aspergillus clavatus, que crece en alimentos
almacenados. Es una sustancia inhibidora de la angiogénesis y del crecimiento tumoral. En
el caso del cáncer de ovario, esta sustancia es menos citotóxica que sustancias aprobadas
como doxorubicina, paclitaxel y vinblastina. Es una sustancia que ha ayudado en el avance
del conocimiento sobre los procesos de metástasis.
OO
NH
O
H
H
OH
HOO
O
Cytocalasina-E
La apicidina es un tetrapéptido cíclico, aislado del hongo endofítico Fusarium pallidoroseum.
Esta sustancia inhibe las enzimas histona desacetilasas tanto en los parásitos como en los
mamíferos. Presenta potencial para el desarrollo de agentes terapéuticos contra cánceres
como leucemia promielocítica, cervical, de seno, de páncreas, renal, de pulmón, de colon,
de hígado, entre otros. Esta sustancia muestra potencial en terapia de infarto de miocardio
y como antiparasitario.
365
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N
HN
NH
NH
N
O
OO
O
(CH2)4COC2H5
OMe
H
Apicidina
La chaetocina es una epiditiocetopiperazina aislada inicialmente de un medio de cultivo
líquido fermentado de Chaetomium minutum. Esta sustancia se menciona como un agente
antitumoral potencial. Diferentes estudios muestran que este metabolito ejerce una
actividad antiproliferativa importante contra diferentes tipos de cáncer como el de hígado,
leucemia, de seno, de pulmón, de colon y de próstata. Esta sustancia induce apoptosis de
células de cáncer hepático.
NH
NH
N
N
N
N
O
O
O
O
OH
OH
SS
S S
Chaetocina
La galiellalactona es un hexacétido aislado de Galiella rufa. Esta sustancia presenta potencial
anti angiogénico y anti metastásico. Se estudia su potencial contra el cáncer de próstata.
Además, presenta actividad antiinflamatoria.
366
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O
HOH
H
O
(-)-Galiellalactona
En general los hongos filamentosos, y especialmente los endófitos (o endofíticos, porque
conviven con plantas), se utilizan biotecnológicamente para producir sustancias para la
terapia del cáncer como el taxol. Son ejemplos de estos Fusarium oxysporum, cultivado en
caldo de papa-dextrosa, y Aspergillus niger aislado de Taxus cuspidate.
Es importante destacar que no solo se investigan los metabolitos contra cáncer sino también
con otros potenciales usos farmacéuticos, por ejemplo, el hongo endofítico Aspergillus sp.,
produce compuestos tipo fenalenona, que muestran actividad contra el VIH.
HO
OH
OH
O
OHO
HO
Asperfenalenona-A
La dehidrocurvularina aislada de Alternaria cinerariae, junto con la galiellalactona, aislada de
Galiella rufa; han mostrado un potencial uso para el tratamiento de inflamaciones
intestinales.
O
OH
O
Galiellalactona
OO
O
HO
OH
CH3
Dehidrocurvularina
367
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Pigmentos
A partir de hongos se han obtenido pigmentos tipo quinona de colores que van del amarillo
al rojo, como los reportados en especies Fusarium sp., Talaromyces verruculosus, y
Stemphylium lycopersici. Varios de estos compuestos además de tener uso potencial como
colorantes para textiles, presentan propiedades antioxidantes, antibacterianas y anti cáncer.
Del género Aspergillus, se obtuvo la Asperversina-A, que es un metabolito raro que se
asemeja a un híbrido entre xantona y esteroide. Para esta sustancia se reporta actividad
antimicótica.
Otros pigmentos incluyen sesquiterpenos tipo azuleno, como el caso del 7-acetil-4-
metilazuleno-1-carbaldehído, aislado de los cuerpos fructíferos del hongo comestible
Lactarius deliciosus. Esta sustancia muestra una actividad moderada contra Staphylococcus
aureus.
O
OH
7-acetil-4-metilazuleno-1-carbaldehído
Los hongos del género Monascus, son conocidos como fuente de pigmentos. Estos son
metabolitos secundarios que son ampliamente utilizados como colorantes de alimentos en
el mundo, muy especialmente en países del oriente como China, Japón y otros. Se han
reportado unas 57, y a estas sustancias se les atribuyen propiedades anti cáncer,
antimicrobianas, anti mutagénicas, antidiabéticas, entre otras. Estos pigmentos son mezclas
de azafilonas, y se conocen tres pigmentos: el pigmento Monascus naranja (sigla inglesa
MOP), el pigmento Monascus rojo (MRP), y el pigmento Monascus amarillo (MYP). Los
compuestos presentes en estas mezclas incluyen la rubropunctamina (amarillo), la
monascorubramine (amarillo), rubropunctatina (naranja), monascorubrin (naranja),
monascina (amarillo), y ankaflavina (amarillo).
368
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NO R1
O
RO
O
Estructura general de pigmentos rojos de MonascusR1 = H / aminoácido / glucosamina
R1 = H, R = C5H11, rubropunctamina
R1 = aminoácido, R = C7H15, monascorubramina
Las melaninas son metabolitos secundarios compuestos a su vez de unidades monoméricas
fenólicas y de indol. Estos pigmentos de estructura compleja tienen enlaces covalentes entre
anillos aromáticos, N-acetil glucosaminas derivadas de quitina, y glicéridos de membrana.
Estas sustancias se consideran como un mecanismo de protección o adaptación de los
hongos que las producen contra la excesiva humedad, la radiación ultravioleta, contra otros
organismos, entre otros.
Hongos marinos
Aunque comparativamente con los hongos terrestres, los hongos de origen marino han sido
muy poco investigados, las perspectivas de encontrar nuevos y novedosos metabolitos de
interés farmacéutico en los marinos es muy grande. Los estudios realizados muestran que
hongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, también abundan en el mar, debido
posiblemente a que tienen la posibilidad de soportar niveles de salinidad altos. La mayoría
de las especies analizadas conviven con organismos como algas y esponjas, y en sitios poco
estudiados como manglares y sedimentos marinos. Los metabolitos más abundantes en los
hongos marinos son los alcaloides y derivados de policétidos, seguidos de péptidos,
terpenos, lactonas y esteroides. Otro grupo de metabolitos interesantes son las quinonas.
En cuanto a las actividades biológicas, las más reportadas son citotóxica y antimicrobiana,
seguidas de otras como antioxidante, antiinflamatoria, anti-invasión (palabra inglesa
antifouling), actividad para disminuir niveles de lípidos, letalidad contra camarones, entre
otras. Entre los miles de metabolitos aislados la halimida, un péptido llevó a la síntesis de la
plinabulina, la cual está en fase II para su potencial uso contra el cáncer de pulmón. Sin
embargo, en la medida que se evalúen más metabolitos, y se desarrollen condiciones
biotecnológicas adecuadas es de esperar que se encuentren nuevas sustancias de uso
farmacéutico en el futuro.
369
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Técnicas de separación e identificación
La técnica combinada HPLC-MS, ha mostrado ser muy útil para procesos como la
identificación de los mismos hongos. Por ejemplo, el hongo Aspergillus flavus, un hongo
filamentoso que es muy común en diferentes alimentos ricos en almidón como el maíz, y
produce micotoxinas, por lo cual es un problema económico y de salud. El análisis por la
técnica combinada HPLC-ESIMS, permite reconocer 14 compuestos marcadores como son la
aflatoxina B1, la aflatoxina G1, el ácido aspergílico, la aspirona, la betaina, la chrisogina, el
desacetil parasiticólido-A, el flufurano, la gregatina-B, el ácido hidroxisidónico, el ácido
nictotínico, la fomaligina-A, y la espinulosina. Estos compuestos se reconocen en sus
espectros de masas por sus iones cuasimoleculares [M+H]+ . En el caso de compuestos como
las circumdatinas aisladas del hongo Aspergillus ocraceus, se han optimizado métodos
combinados que permiten la separación y análisis de micotoxinas. Por ejemplo, la
combinación UPLC − MS − IT – TOF (sigla inglesa correspondiente a ultraHPLC – Mass
Spectrometry – Ion Trap – Time of Flight), permite la identificación de estas sustancias. Los
espectros de masas muestran los iones cuasimoleculares [M+H]+, [M + Na]+, y [M + K]+;
además de fragmentos característicos.
Es interesante anotar, que para la diferenciación de especies de hongos como los del género
Ganoderma, reconocidos como hongos alimenticios y con diferentes propiedades
medicinales, se utilizan técnicas de espectrometría de masas, a partir del tejido del hongo
directamente. Este género comprende más de 300 especies y es de amplio consumo en
países orientales. Por las propiedades nutricionales de algunas de estas especies, es
necesario contar con herramientas para su identificación rápida. Es un ejemplo el estudio
realizado con espectrometría de masas de ionización directa (sigla inglesa DI – MS), el cual
permite reconocer las especies de hongos de este género por sus componentes
característicos como son los ácidos ganodéricos. Los espectros de masas obtenidos muestran
iones pseudomoleculares [M + K]+. Este método ofrece posibilidades interesantes para otros
estudios similares que ayuden a identificar entre especies cultivadas y silvestres.
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373
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Capítulo 10
Glicósidos cianogénicos
374
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Muchas plantas sintetizan compuestos que, por hidrólisis ácida, liberan cianuro de
hidrógeno. Esta capacidad, conocida como ciano génesis, se ha observado durante siglos en
plantas tales como albaricoques, duraznos, almendras y otras plantas alimenticias
importantes.
Estas sustancias producen muchas víctimas cada año. La mayoría de los casos de
envenenamiento con cianuro son resultado del consumo de plantas de las familias Rosáceas,
Fabáceas (Leguminosa), Euforbiáceas, o miembros de los géneros Sorghum (Poaceas o
Gramíneas). Aunque muchos de los casos de envenenamiento son accidentales (Como por
ejemplo las reses que comen semillas frescas de sorgo), una cantidad de personas está
expuesta diariamente a su consumo. Aunque el organismo humano puede eliminar
cantidades relativamente grandes de HCN rápida y eficientemente, existe un consenso
creciente en el sentido de que ciertas condiciones neurológicas provienen de
envenenamiento crónico con cianuro. Un caso especialmente crítico es el del casabe, el cual
es una harina para alimentación humana, obtenido de la denominada yuca brava, que
corresponde a Manihot esculenta, familia euforbiáceas. El tubérculo de esta planta es la base
de alimentación en más de medio billón de seres humanos en el mundo, especialmente de
países sub desarrollados; pero contiene glicósidos cianogénicos como la amigdalina y la
lotaustralina, que son neurotóxicos y pueden generar parálisis y muerte. También se
hipotetiza que el consumo de dietas altas en estas sustancias puede llevar a la carbamilación
de proteínas, en personas con enfermedades inflamatorias crónicas tales como la
enfermedad renal crónica y el reumatismo.
Dos clases de sustancias naturales son los responsables de esta capacidad cianofórica: Los
glicósidos cianogénicos y los cianolípidos. Ambos son derivados de α-hidroxinitrilos
(cianohidrinas) y ambos liberan un componente carbonílico y HCN cuando se remueve la
porción de carbohidrato o de ácido graso. La presencia de HCN se detecta fácilmente
mediante varios ensayos de coloración. La 10.1 muestra la estructura general de los
glicósidos cianogénicos y los procesos enzimáticos implicados en la liberación de HCN a partir
de ellos, pasando por un intermedio cianohidrina.
375
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R'
R
O
C N
Gli
Hidrólisis
R'
R
O
C N
H
Gli-OH
R'
R
OHCN
Glicósido cianogénico Cianohidrina Carbohidrato(s)
Enz.
Enz.
Figura 10.1. Esquema que explica cómo se libera el HCN a partir de los glicósidos cianogénicos.
A pesar de que se ha sabido que muchas plantas son cianogénicas, son muy pocas las
sustancias aisladas e identificadas. Esto se debe al hecho de que estas sustancias son difíciles
de aislar y purificar, así como también son inestables a la hidrólisis. Al romperse los tejidos
vegetales que contienen estas sustancias, las enzimas presentes las hidrolizan. Además, los
carbohidratos y otros glicósidos que se encuentren presentes dificultan su purificación. Hay
tres glicósidos cianogénicos que se consiguen comercialmente: amigdalina, prunasina y
linamarina. La Figura 10.2 muestra las estructuras de los glicósidos cianogénicos más
comunes.
376
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OGentiobiosa
CN
Amigdalina (Amygdalus sp.)
OGlucosa
CN
Prunasina (Prunus sp.)
OGlucosa
CN
HO
Dhurrina (Sorghum sp.)
OGlucosa
CN
CH3
CH3
Linamarina (Linum sp.)
OGlucosa
CN
CH3
CH3CH2
Lotaustralina (Lotus sp.)
Figura 10.2. Estructuras químicas de los glicósidos cianogénicos naturales más comúnmente reportados.
Biogénesis
Todos los glicósidos cianogénicos conocidos se originan a partir de los aminoácidos: L-
fnilalanina, L-tirosina, L-leucina, L-valina, y L-isoleucina, con excepción de los que contienen
funciones ciclopenteno, los cuales provienen de 2- ciclopentenil-l-glicina; y aquellos de
hongos y bacterias, los cuales provienen de L-glicina. La figura 10.3 muestra las estructuras
de estos aminoácidos.
377
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NH2
COOHR
R = H, Fenilalanina
R = OH, Tirosina
H2N
COOHNH2
COOH
H2N
COOHH2N COOH
NH2
COOH
Leucina Valina
Isoleucina Glicina 2-Ciclopentenil-1-glicina
Figura 10.3. Estructuras químicas de los aminoácidos precursores de glicósidos cianogénicos.
La figura 10.4 muestra la trayectoria general de biogénesis de los glicósidos cianogénicos a
partir del respectivo aminoácido. El aminoácido es inicialmente oxidado sobre el nitrógeno.
La des carboxilación y des hidrogenación da origen a la aldoxima. Esta es deshidratada para
originar el nitrilo intermedio. Este a su vez es oxidado, para finalmente introducir una o varias
moléculas de carbohidratos, mediante procesos de glicosilación enzimática.
378
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C
R
R'
H
CH
NH2
COOHC
R
R'
H
CH
NH
COOH
OH
C
R
R'
H
CH
N
OH
Oxid.-CO2
- 2H
Aldoxima
- H2O
C
R
R'
H
N
Nitrilo
Oxid.C
R
R'
OGlicosil
N
Glicosil. C
R
R'
OH
N
Figura 10.4. Esquema biogenético general que explica el origen de los glicósidos cianogénicos a partir de aminoácidos.
Función biológica
Existen algunos estudios para tratar de comprender el papel biológico de los glicósidos
cianogénicos y estos estudios han generado varias hipótesis al respecto, una de las cuales es
que las plantas los producen como mecanismo de defensa contra depredadores. Esto lo
sustentan la misma actividad tóxica de estos compuestos, además de otras actividades que
han presentado contra microorganismos. De esta toxicidad sacan ventaja algunos insectos,
que acumulan estas sustancias para defenderse de depredadores, al consumir plantas que
contienen estas sustancias, aunque también se ha reportado que algunos insectos son
capaces de producirlos por biosíntesis de novo.
Hidrólisis enzimática
Los glicósidos cianogénicos se hidrolizan para generar un compuesto carbonílico (aldehído o
cetona), uno o varios carbohidratos y HCN. La hidrólisis enzimática ocurre cuando los tejidos
frescos que contienen glicósidos cianógenos son alterados (P.ej. rotos), de ahí que su
aislamiento sea difícil. Precisamente este proceso de hidrólisis enzimática es el que hace que
se libere HCN, y es la base del denominado Ensayo de Guignard, el cual permite determinar
la existencia de estas sustancias en muestras vegetales.
379
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Ensayo de reconocimiento (Ensayo de Guignard)
En el fondo de un tubo de ensayo se colocan unos gramos de tejido vegetal fresco triturado
o desmenuzado. En la boca del tubo se suspende un papel de filtro impregnado con picrato
de sodio (Papel picrosódico) y se sella herméticamente. Después de un tiempo si el tejido
contiene sustancias cianogénicas, el papel toma coloración rojiza. Algunos autores adicionan
2 ó 3 gotas de benceno, cloroformo o tolueno antes de tapar, y otros someten a
calentamiento el tubo cerrado para acelerar la hidrólisis.
Más recientemente se vienen diseñando nuevos dispositivos con el fin de detectar pequeñas
cantidades de HCN, dada su toxicidad, lo que seguramente ayudará también en la detección
de los compuestos cianogénicos naturales.
Distribución natural
Los glicósidos cianogénicos se han encontrado en alrededor de 2500 especies de plantas de
unas 110 familias. Se les encuentran en helechos, gimnospermas (tanto en mono- y
dicotiledóneas), angiospermas y varios insectos. En forma general, las concentraciones más
altas se encuentran en las hojas, pero algunos se encuentran en raíces, semillas u otros
tejidos vegetales.
Muchos glicósidos cianogénicos tales como prunasina, sambunigrina, linamarina y
lotaustralina, se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza. Algunos otros, tales
como los que contienen funciones ciclopenteno (p. ej. ginocardina) se han encontrado en
pasifloráceas, flacourtiáceas y turneráceas.
La cardiospermina se conoce únicamente en sapindáceas, mientras que su éster p-
hidroxibenzoato, solamente se conoce en rosáceas. La heterodendrina solamente se conoce
en leguminosas (gén. Acacia) y sapindáceas (gén. Heterodendron).
Otros glicósidos cianogénicos se encuentran en sapotáceas (gén. Lucuma), leguminosas (gén.
Vicia, Holocalyx), (gén. Davallia), rutáceas (gén. Zieria), caprifoliáceas (gén. Sambucus),
liliáceas (gén. Chlorophytum), platanáceas, campanuláceas, magnoliáceas, calicantáceas,
papaveráceas, gramíneas, juncáceas, scheuzeriáceas, juncagináceas, etc.
Técnicas de aislamiento e identificación
Debido al gran número de carbohidratos enlazados y otros compuestos glicosídicos
presentes en los tejidos en los cuales se les encuentra, no existe un método simple para el
aislamiento y purificación de glicósidos cianogénicos. No obstante, lo anterior se han hecho
algunos avances.
Los glicósidos cianogénicos se pueden extraer con mezclas alcohol-agua. Los métodos de
aislamiento y purificación de los glicósidos cianogénicos no han sufrido cambios sustanciales,
380
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aunque se les han hecho algunas innovaciones, especialmente para compuestos tales como
la triglochinina.
Para el análisis y separación por cromatografía en capa fina se utiliza sílica gel con indicador
de fluorescencia y como eluentes diferentes mezclas cloroformo:metanol (especialmente
para aquellos glicósidos relacionados con el mandelonitrilo).
Para el revelado, se utilizan entre otros los siguientes reactivos y procedimientos:
a) Rociado con solución al 2% de cloruro de 2,3,5- trifeniltetrazolio. Luego las placas se secan
y se calientan a 60°C. Finalmente se colocan en una cámara con amoníaco concentrado
durante 10 minutos. Este método es razonablemente selectivo para glicósidos cianogénicos
aromáticos.
b) Rociado con una solución de hidroxilamina (4.5%) y cloruro de hidroxilamina (4.5%) en
alcohol, seguido de rociado con una solución de cloruro férrico al 1.25% en Metanol,
observándose manchas rojas o pardas.
A veces se ha observado que algunos glicósidos cianogénicos sufren isomerización durante
el proceso de aislamiento. Por ejemplo, la plularasina, una mezcla de prunasina y
sambunigrina, se reportó en varias plantas, pero más tarde se demostró que la mezcla se
originaba por epimerización durante el trabajo experimental.
Se han investigado los efectos de la temperatura, el pH y los diferentes solventes, sobre la
isomerización del centro quiral de la amigdalina, y se ha observado que en solventes
orgánicos (tales como etanol y metanol) se produce poca isomerización, mientras que esta
es mucho mayor en agua hirviendo durante cierto tiempo y en ciertos tipos de vidrio.
El Sephadex G-10 se ha utilizado en la purificación preliminar de extractos que contienen
glicósidos cianogénicos. Los extractos siruposos se particionan sobre este soporte en medio
acuoso. El Sephadex es mucho menos reactivo que la sílica gel y causa poca descomposición
de las sustancias de interés.
El método más utilizado para la separación y el aislamiento de los glicósidos cianogénicos es
HPLC en fase reversa, con detector de índice de refracción. También la técnica combinada
de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas permite el análisis de los
derivados trimetilsilil de glicósidos cianogénicos como la amigdalina con m/z 961 como ión
molecular.
Los espectros de masas ESI de los glicósidos cianogénicos muestran los iones
pseudomoleculares [M+Na]+, característicos como m/z 480 para la amigdalina y m/z 318 para
la prunasina. En modo negativo para la amigdalina se reporta el ión pseudomolecular m/z
502 [M + CHO2]-, además de los iones m/z 323, 221, 179, 161, 131, 119, 113, 101, 89, 71 y
59.
381
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También se reportan los iones m/z 292 [M + CHO2]- y 161 para linamarina, y m/z 306 [M +
CHO2]- y 161 para lotaustralina.
La resonancia magnética nuclear ha sido la técnica más útil para la caracterización de los
glicósidos cianogénicos conocidos. Se utilizan tanto las técnicas 1D como 2D. A manera de
ejemplo, para el compuesto prupersina-E aislado de las semillas de Prunus davidiana, se
pueden observar señales muy características como el protón bencílico que se observa como
un singlete en 5.98 ppm. La señal del carbono bencílico se reporta en 66.7, y la del carbono
nitrílico en 118.8 ppm. Al utilizar la herramienta de predicción en línea NMRdb.org, se
observan estas tres señales en 6.22, 68.5 y 119.2 ppm respectivamente, demostrando la
utilidad de esta herramienta para este glicósido cianogénico.
Síntesis
Aunque los glicósidos cianogénicos son producidos por diferentes plantas, debido a su
capacidad de generar ácido cianhídrico, también existen reportes de procesos para su
síntesis química.
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383
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Capítulo 11
Compuestos azufrados
384
Ir al índice
Históricamente, los metabolitos secundarios de interés farmacéutico más conocidos e
investigados han sido principalmente compuestos con carbono, hidrógeno, oxígeno y
nitrógeno; como los vistos en los capítulos anteriores. En cambio, los metabolitos
secundarios azufrados son menos conocidos muy probablemente debido a la inestabilidad
química de algunos grupos funcionales azufrados, sin embargo, los estudios recientes han
mostrado el gran potencial biomédico de estas sustancias naturales, y en particular su papel
destacado en los complejos mecanismos de defensa del organismo humano.
El azufre es esencial para la vida y se encuentra en varias biomoléculas fundamentales como
los aminoácidos metionina y cisteína, el regulador redox glutatión, el agente metilante S-
adenosilmetionina y en los cofactores biotina, coenzima-A, ácido lipoico y tiamina (Figura
11.1.).
HS
NH2
OH
O
L-cisteína
NH2
OH
O
HS
L-metionina
HO
NH2
NH
O
NHOH
O OSH
O
Glutatión
S
NHHN
O
H H
COOH
Biotina
S S
OH
O
Acido lipoico
N
N
NS
OH
NH2
Tiamina (Vitamina B1)
N
N
N
N
NH2
O
SHOOC
NH2
OHOH
S-adenosilmetionina (SAM)
NHNH
O
SO
PO
PO
O OH
OHO
N
N
N
N
NH2
O
OHOP
HO
O OH
OH
OO
Acetilcoenzima-A
Figura 11.1. Estructuras químicas de varios compuestos azufrados de interés bioquímico.
385
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En las plantas los metabolitos azufrados, desempeñan un papel muy importante como es la
defensa contra enfermedades y depredadores. En los seres humanos el azufre también está
presente en las sustancias involucradas en procesos bioquímicos importantes como la
biosíntesis de una gran cantidad de sustancias por la vía de la acetilcoenzima-A, y en
procesos metabólicos como los que originan diferentes proteínas, como es el caso de las
proteínas con hierro y azufre que desempeñan un papel importante en la reparación y
replicación del ADN y contra enfermedades como la tuberculosis. Además, se encuentra
presente en los aminoácidos involucrados en procesos como el metabolismo de los lípidos
y en enfermedades como la arterioesclerosis y otras enfermedades cardiovasculares.
Los metabolitos azufrados conocidos hasta ahora incluyen sustancias que contienen grupos
funcionales como sulfato, tiol, tioéster, sulfuro, disulfuro, sulfona, sulfóxido, sulfoxonio,
tiofeno, tiazol, tiosulfinatos, glucosinolato, isotioacianato, nitrilo, tiooxazolidina, etc.
Los metabolitos sulfatados son los más abundantes, y el grupo sulfato se encuentra ligado
a sustancias tales como terpenoides, esteroides, polisacáridos, flavonoides, etc. Muchos de
estos compuestos presentan diferentes actividades biológicas que incluyen las actividades
anticoagulante, antimicrobiana y citotóxica, y ello está llevando al interés en la obtención
de derivados sulfatados de sustancias naturales, con potencial farmacoterapeútico. En el
caso de los organismos marinos, estos han sido fuente de unos 150 esteroides sulfatados,
los cuales han mostrado entre otras actividades antimicrobiana, antitumoral y
cardiovascular. La abundancia de estas sustancias en el medio marino está relacionada con
la abundancia del azufre ya que después del cloro, el sodio y el magnesio, el azufre es el
cuarto elemento más abundante en el mar. Los corales en particular contienen compuestos
azufrados tanto en su esqueleto como en los demás tejidos.
Aunque en general los polisacáridos abundan en los organismos vivos, son conocidos
principalmente como constituyentes estructurales y como fuente energética, pero algunos
de ellos presentan propiedades interesantes e inesperadas como un polisacárido aislado de
la ahuyama Cucurbita pepo, el cual muestra propiedades antidiabéticas potenciales. En el
caso de los polisacáridos sulfatados, estos muestran actividades biológicas interesantes
como antitumoral, antioxidante, anticoagulante, antidiabética, como radioprotectores,
antiviral, hipolipidémica y no se conocen efectos tóxicos o colaterales, por lo cual son
consideradas sustancias promisorias para la prevención y el tratamiento de diferentes
enfermedades. A manera de ejemplo se reportan estudios de polisacáridos sulfatados de
algas marinas, que muestran su capacidad protectora del endotelio, y también con
propiedades cosméticas anti envejecimiento de la piel. También en el tamarindo
Tamarindus indica, se reporta un polisacárido sulfatado con acción hepatoprotectora.
Los compuestos con grupos sulfuro, disulfuro, sulfóxido y tiosulfinatos, se pueden encontrar
en una misma fuente vegetal como los bulbos de ajo y en otras plantas de la familia de las
386
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aliáceas. La figura 11.2 presenta algunos ejemplos de estructuras de compuestos con estos
grupos funcionales. En el caso particular del ajo, este es conocido por sus efectos benéficos
en la salud humana, los cuales incluyen la prevención del cáncer, especialmente el cáncer
gastrointestinal, la disminución de riesgos cardiovasculares y de la diabetes tipo 2. El
compuesto psammaplin-A, aislado de una esponja marina Psammaplysina sp., además de
contener grupos disulfuro posee grupos oxima, los cuales son raros en los organismos
marinos, sin embargo, esta sustancia tiene un rango amplio de actividades biológicas que
incluyen antimicrobiana, anticáncer, antiviral, promotora del desarrollo embrionario,
insecticida y como mecanismo de defensa químico.
SS
O
S
S
SS
S
Allicina Dialildisulfuro Dialiltrisulfuro
SS O
S-Metiltiometanosulfinato
S SS
O
Ajoeno
S
O NH2
OH
O
Alliina
O
NHS
N
OH
Br
HO
SNH
N
O
OH
OH
Br
Psammaplyn-A
Figura 11. 2. Estructuras químicas de algunos metabolitos azufrados naturales con diferentes grupos funcionales.
Diferentes estudios han mostrado que las sustancias azufradas del ajo, las cuales se
encuentran también en otras plantas como la cebolla (Allium cepa); participan en procesos
de señalización de células y tejidos de mamíferos, los cuales están asociados con la salud y
los procesos de envejecimiento. Desde el punto de vista dietario, es ampliamente aceptado
que el consumo de ajo y otros vegetales aliáceos, está asociado con diferentes beneficios
387
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en la salud humana, los cuales incluyen el reducir el riesgo de varios tipos de cáncer, en
especial del tracto gastrointestinal, el reducir el riesgo de enfermedades cardiovasculares,
y la diabetes tipo 2. Uno de estos compuestos es el dialiltrisulfuro DATS. Esta sustancia
participa en diferentes procesos enzimáticos en los cuales además de liberarse H2S, genera
otros compuestos reactivos como dihidropersulfuros (H2S2), dihidropolisulfuros (H2Sn),
hidropersulfuros (RS2H) e hidropolisulfuros (RSnH). Algunos de estos compuestos participan
en procesos de señalización en cerebros de animales, además de presentar acción
antiinflamatoria y citoprotectora contra el stress oxidativo. Sin embargo, muchos de estos
procesos no son todavía comprendidos del todo.
Glucosinolatos
Los glucosinolatos (conocidos con la sigla GS) son metabolitos secundarios azufrados, que
desempeñan papeles importantes en los vegetales, por ejemplo, como anti herbívoros, y
que además presentan actividades como la prevención contra el cáncer y actividad
antibiótica.
Los glucosinolatos son compuestos con el grupo funcional β-tioglucósido-N-hidroxisulfato.
Son además precursores de los isotiocianatos, están presentes en al menos 16 familias de
plantas angiospermas dicotiledóneas e incluyen un número grande de especies
comestibles. Se han identificado más de 132 glucosinolatos diferentes. La figura 11.3
muestra ejemplos estructurales de varios glucosinolatos naturales. La sinalbina y la sinigrina
están presentes en el aceite de mostaza negra Brassica nigra y mostaza blanca Sinapis alba.
La glucorafanina fue aislada inicialmente del rábano Raphanus sp., y está presente en el
broccoli Brassica oleracea, y la glucomoringina de Moringa sp.
OS
N
R
HO
OHOHHO
OSO3H
OS
Glucorafanina
R =
(Precursor del sulforafano)
HO
R =
Sinalbina
OH
Progoitrina y epiprogoitrina
Glucobenzsisaustricina
R =
O
O
NH
Glucobrassicina
R =
GluO
Glucomoringina
R = R =
Sinigrina
Figura 11.3. Estructuras químicas de algunos glucosinolatos naturales.
388
Ir al índice
Para su estudio sistemático los glucosinolatos actualmente se clasifican en tres grupos,
dependiendo de la naturaleza química de la cadena R, y estos son: alifáticos, aromáticos e
indólicos. Son ejemplos de glucosinolatos alifáticos la glucorafanina (precursor a su vez del
isotioacianato sulforafano) y la progoitrina. Ejemplos de glucosinolatos aromáticos son la
sinalbina, la glucobenzsisaustricina, y la glucomoringina; y de glucosinolatos indólicos la
glucobrassicina.
Se ha tratado de establecer una nomenclatura sistemática para estos compuestos, y se
sugiere nombrarlos con el nombre de la cadena R en forma de radical, terminando en las
letras GSL. De acuerdo con esto para la sinalbina, corresponde a 4-hidroxibencilGSL, que es
la forma abreviada de 4-hidroxibencilglucosinolato. Aunque no hay actualmente unas reglas
definidas para la nomenclatura sistemática, esta forma se usa también para los
isotiocianatos (ITC) que se originan a partir de los correspondientes glucosinolatos, así
siguiendo con el ejemplo de la sinalbina, el isotioacianato que se forma a partir de ella se le
nombra 4-hidroxibencilITC.
La biogénesis de los glucosinolatos se lleva a cabo a partir de los aminoácidos precursores
leucina, isoleucina, valina, metionina, triptófano, cisteína, y con la participación de sistemas
enzimáticos que incluyen las transaminasas.
En cuanto a su estabilidad química, y de una manera muy similar a lo que ocurre con los
glicósidos cianogénicos cuando liberan HCN; los glucosinolatos se hidrolizan fácilmente a
pH ácido y liberan la molécula de glucosa, dando lugar a la aglucona inestable. Este proceso
es realizado por la enzima myrosinasa. A su vez, la aglucona inestable puede dar lugar a
varios productos como los epitionitrilos, los nitrilos, los isotiocianatos, los tiocianatos y las
oxazolidintionas. La figura 11.3, esquematiza estos procesos. De todos estos compuestos
los isotiocianatos son a los que se les atribuyen las propiedades para prevenir el cáncer y
enfermedades neurodegenerativas. En el organismo humano, la conversión de los
glucosinolatos en isotiocianatos se lleva a cabo gracias a la flora intestinal. El calentamiento
a temperaturas superiores a 60°C conduce a la formación de los otros productos como
nitrilos, epitionitrilos y tiocianatos, los cuales no presentan las propiedades anticáncer de
los isotiocianatos. Existen evidencias reportadas de que el isotiacianato obtenido a partir
de la glucomoringina es más potente que el sulforafano, en la quimioprevención del cáncer,
y esto se ha demostrado en diferentes bioensayos.
Técnicas de análisis e identificación
Para el estudio de los compuestos azufrados naturales se vienen desarrollando métodos
analíticos para su estudio y determinación que incluyen la cromatografía de gases para los
más volátiles, la cromatografía líquida HPLC y la espectrometría de masas.
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NOSO3H
GluSR
Myrosinasa
H2O Glucosa
NOSO3H
SHR
R =n
NS n Epitionitrilo
R C N
Nitrilo
R N C S
Isotiocianato
R S C N
Tiocianato
ONH
S
OHR =
Oxazolidin-2-tiona
Aglucona
NOSO3
-
S-R
Figura 11.3. Esquema de los procesos de hidrólisis y conversión en diferentes metabolitos a partir de los glucosinolatos.
Con la excepción de los compuestos sulfatados naturales, muchos metabolitos azufrados
son inestables a los procesos de extracción y aislamiento que normalmente se utilizan para
otras sustancias naturales. Esta inestabilidad ha sido una barrera limitante para el estudio
sistemático de estas sustancias, y al revisar la literatura científica se encuentran algunos
trabajos que reportan procesos de extracción y análisis complejos utilizando métodos de
derivatización para utilizar técnicas analíticas como la cromatografía de gases. Sin embargo,
y gracias a que actualmente se está haciendo muy extendido el uso de solventes extractores
amigables con el medio ambiente, como los solventes eutécticos DES y NADES; se están
facilitando los procesos de extracción de los metabolitos azufrados y de otros metabolitos
vegetales como los compuestos fenólicos. Un ejemplo de esto es la extracción de
metabolitos de Moringa oleifera, utilizando una mezcla de agua caliente presurizada,
sulfato de amonio 20%, etanol y el solvente eutéctico NADES obtenido de la mezcla cloruro
de colina y ácido cítrico. El uso de estos materiales en la extracción además de ser útil para
los procesos de investigación, es de gran potencial para la obtención a nivel industrial de
diferentes sustancias como por ejemplo los compuestos azufrados bioactivos, pues se
disminuye notoriamente el uso de solventes orgánicos costosos y tóxicos.
Para la extracción y el análisis por cromatografía en capa fina en el caso de las semillas de
mostaza blanca y negra, los glucosinolatos se pueden extraer con alcohol caliente, y se
utiliza como eluente la mezcla n-butanol-n-propanol-ácido acético glacial-agua (3:1:1:1),
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revelando con una solución de hexacianoferrato-cloruro férrico y ácido tricloroacético. La
sinigrina y la sinalbina revelan de color azul.
En cuanto se refiere a los procesos de separación e identificación, se utilizan los métodos
combinados de cromatografía líquida y espectrometría de masas con muy buenos
resultados, inclusive para realizar otros estudios sobre el papel de estas sustancias en el
metabolismo vegetal y en metabolómica. Entre los compuestos que se pueden analizar con
esta técnica se incluyen S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocisteína (SAH),
metionina (Met), glutatión (GSH), y disulfuro de glutatión (GSSG). En el caso de SAM, su
espectro de masas ESI muestra los iones m/z 298.2 y 250.1, correspondientes a las pérdidas
de la cadena del aminoácido y del grupo metilsulfuro, como se aprecia en la figura 11.4.
N
N
N
N O
HO OH
S+
CH3
NH3+
COO-
NH2
m/z 298.2
m/z 250.1
Figura 11.4. Esquema que explica el origen de los fragmentos observados en el espectro de masas ESI de la S-adenosilmetionina SAM.
Síntesis de glucosinolatos
Dado el gran interés en conocer aún más sobre sus propiedades químicas y su potencial
bioactivo, se vienen desarrollando métodos para la síntesis de los glucosinolatos. Un
ejemplo es la síntesis de los glucosinolatos ω-metilsulfanilalquilados partiendo de cloruros
de hidroximoilo funcionalizados en el azufre, vía nitronatos, y acoplamiento final con
tioglucosa.
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