BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

INTRODUCCION

Las bacterias vistas al microscopio generalmente aparecen como esferas o como bastones rectos o curvos, estas pueden clasificarse dependiendo de su forma, en cocos (esféricas), bacilos (bastones rectos) y espirilos (bastones curvos). Otra forma de clasificar las bacterias es aerobia, las que necesitan aire para vivir, anaerobia, que no pueden vivir en presencia de aire y por último, aquella que indiferentemente pueden vivir con aire o sin éste.También las bacterias se pueden dividir en dos grupos: Gram Positivo (+) y Gram negativo (-). Esta división se basa en la capacidad de reacción de las bacterias frente al método de coloración, desarrollado por Christian Gram en 1884. Las que se tiñen con el colorante son Gram + y aquellas que no toman el colorante son Gram -.

Normalmente a los géneros de Gram negativos y positivos se les realiza pruebas bioquímicas como son: LIA, MIO, SIM, CITRATO, KLIGGER, TSI, UREA, FENILALANINA entre otras...que ayudan en su identificación, en el caso de las Gram negativas, existen otros tipos de medios de cultivo, así como pruebas, como es el caso de la cataraza y coagulasa.Uno de los géneros mas importantes del mundo microbiológico bacteriano son las enterobacterias las cuales son de tipo Gram negativo, que por definición son microorganismos entericos que producen enfermedad en el hombre y en todas las especies, como enteritis o la típica diarrea, su aislamiento y cultivo son en medios selectivos diferenciales y perfiles bioquímicos. Una de las especies más sobresalientes es la E.Coli.

La Escherichia Coli es una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos animales, incluido el humano y, por ende, en las aguas negras. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodor von Escherich, bacteriólogo alemán, quién la denominó Bacterium coli. Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.Ésta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso digestivo. Además produce vitaminas B y K. Es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram, es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa, en 48 horas con producción de gas y ácidos orgánicos (fermentación ácido mixta). Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado por la producción de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al color amarillo (ácido). Es decir las colonias que fermentan la   lactosa producirán suficiente ácido para causar el vire del indicador.

La supervivencia de estas bacterias en medios no entéricos es limitada por lo que su presencia indica una contaminación reciente. Por estas razones, E. coli es el microorganismo índice ideal para la detección de contaminaciones recientes.Los Proteus mirabilis son una bacteria Gram.-negativa, facultativo anaerobia que pertenece a la familia de las Enterobacteriaceae, este demuestra salida en enjambre, motilidad, y actividad del ureasa. Los cuales causan el 90% de todas las infecciones del “Proteus”. Es decir al igual que otras enterobacterias como E.coli, causa con más frecuencia infección urinaria y cutánea. Está también implicado en septicemia especialmente en pacientes inmuncomprometidos, y ocasionalmente produce infección pulmonar. Se cree que el germen alcanza la vía aérea por inhalación, implicándose el papel de la colonización intestinal como posible reservorio. Los mirabilis del Proteus, se pueden diagnosticar en el laboratorio debido al motilidad característico de la salida en enjambre, y la inhabilidad de metabolizar la lactosa (en una placa de agar de Mac Conkey, por ejemplo.) a causa de ello originan coloraciones incoloras. Es decir el agar de Mac Conkey es de gran apoyo ya que es un medio diferencial que permite distinguir entre enterobacterias que hidrolizan lactosa y las que no lo hacen, por decir si la bacteria es lactosa positiva la hidrólisis de la lactosa produce ácidos orgánicos y las colonias que la hidrolizan adquieren un color rojo o rosa, en el caso de que las colonias fueran lactosas negativas permanecen incoloras aunque el medio vira a amarillo por la subida de pH que origina la utilización de las proteínas (peptona) que se encuentran en el medio. Generalmente los proteus son susceptibles a la mayoría de los antibióticos aparte de la tetraciclina, no obstante 10%-20% de tensiones de los mirabilis del Proteus.

Las características más comunes del genero proteus es que pueden utilizar la urea y el citrato, al igual que producir el gas del sulfuro del hidrógeno, y formar las películas claras en medios del crecimiento. Comúnmente las bacterias pueden ser encontradas a través de las piedras, y estas bacterias que están al acecho en las piedras pueden dar una infección después del tratamiento antibiótico.

En el caso de los entericos positivos como los estafilococos, estreptococos, Corinebacterias, Clostridios entre otros, crecen en medios enriquecidos como el agar sangre o normalmente los medios suelen ser combinados, por ejemplo: Un medio de “eosina azul de metileno” es un medio selectivo diferencial. Este medio se utiliza para diferenciar las bacterias Gram positivas, a las que inhibe el crecimiento, de las Gram negativas como las enterobacterias (E. coli). Este medio contiene lactosa como nutriente, y al ser tomado por las enterobacterias se produce ácido, que hace que el pH del medio baje, por lo que el color del medio pasará a ser violeta oscuro. Si por el contrario las bacterias existentes en el medio no utilizan lactosa, no se produce ácido, por lo que dan lugar a colonias incoloras.

Las infecciones bacterianas son las más frecuentes, representando entre el 50 y 80% de todas las complicaciones infecciosas generalmente representadas por bacterias Gram positivas que negativas, prevaleciendo el Staphylococcus aureus, pero ninguna bacteria esta exenta de causar enfermedad, por que en casos son indispensables ciertos factores.

MATERIALES Y METODOS

A partir de una cepa microbiana, etiquetada como cepa numero 12 y 13 se tomo una muestra, la cual se sembró en agar Mac Conkey, en forma de estriado, para después incubar a 37 C, durante 24 horas.

Pasado el tiempo, se realizaron las observaciones en cada placa, a partir de ello se procedió a la identificación de microorganismos con la ayuda de una tinción Gram, la cual fue necesaria para la obtención de datos mas cercanos al microorganismo presente.

Debido a la obtención de una colonia lactosa negativa y positiva, se realizaron pruebas bioquímicas, es decir se tomo una pequeña muestra del cultivo y se inoculo de forma recta y estriado en cada una de las pruebas, según halla sido el caso, después del sembrado del microorganismo se incubaron a 37 C, durante 24 horas, para después discutir las observaciones.

RESULTADOS

Basándonos en la actividad realizada, se discutió lo siguiente:

En la siembra de la cepa 12, en medio Mac Conkey se observo que la colonia era de forma redonda y de tamaño pequeña, con un color rosa pálido, en base a sus características físicas se dedujo que era lactosa negativa.

Para la cepa 13 se observaron colonias en forma redondas, de tamaños grandes y chicos, con un color rosa fuerte, en base a sus características físicas se dedujo que era lactosa positiva.

Tinción de Gram:

Cepa 12: se encontraron bacilos en color morado, sin presencia de otro microorganismo.

Cepa 13: se observaron microorganismos cocobasilares.

En el caso de las pruebas bioquímicas, mediante cambios de coloración, motilidad y presencia de H2S, según haya sido el caso, se dedujo la presencia de E.coli en la cepa número 13 y proteus mirabilis en cepa 12.

Crecimiento de E. coli en agar Mac Conkey.

Crecimiento de Proteus Mirabilis en agar Mac Conkey

PRUEBA DE CATALASA

Introducción

Estafilococo, del griego Staphylé, que significa racimo de uvas, es una variedad bacteriana de la familia de los cocos. Poseen forma esférica y se agrupan formando grandes masas bacterianas en forma de racimo. Son del tipo conocido como Gram Positivo. Los estafilococos son la variedad más virulenta de la familia de los cocos, y son responsables de un gran espectro de enfermedades, desde infecciones cutáneas hasta neumonía, sepsis, etc.Estos microorganismos están presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamíferos y aves. El género comprende en la actualidad a 32 especies y 15 subespecies, muchas de las cuales se encuentran en los humanos. Las especies que se asocian con más frecuencia a las enfermedades en humanos son Staphylococcus aureus (el miembro más virulento y conocido del género), Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophticus, Staphylococcus capitis y Staphylococcus haemolyticus.Los estafilococos crecen fácilmente sobre casi todos los medios bacteriológicos, en condiciones aeróbicas se da el mejor crecimiento. Su mayor velocidad de crecimiento es a 5-25ºC. Pero también se puede ver en activa fisión binaria entre 30 y 27 ºCLos Estafilococos producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos.

Staphylococcus Streptococcus

Fundamento

La enzima descompone el peróxido de hidrógeno H2O2

Método:Añadir una gota de H2O2 a un cultivo denso y buscar burbujas (O2)

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

2H2O2 ---Catalasa---> 2H2O + O2

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)

MATERIALES Y METODOS

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos técnicas:1-. Método del portaobjetos (recomendado): Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

RESULTADOS

Al realizar la prueba de la Catalasa arrojo un resultado positivo indicando que el microorganismo encontrado se trata de un Staphylococcus y no un Streptococcus. La función de esta prueba es diferenciar los géneros de Staphylococcus de los géneros de Streptococcus.

PRUEBA DE COAGULASA

Introducción

Los estafilococos coagulasa negativos son un grupo de microorganismos frecuentes en la piel, causa de infecciones nosocomiales sobre todo en recién nacidos de bajo peso y en pacientes inmunocomprometidos (con SIDA, con cáncer, etc.). Una alta proporción de los estafilococos coagulasa negativos aislados son portadores del gen mcA que le confiere resistencia a las betalactamasas (meticilina). Se han identificado hasta el presente 37 especies de estafilococos coagulasa negativos, de ellas 13 pueden originar infecciones en humanos. La sensibilidad a la novoviocina se utiliza para clasificar el estafilococo coagulasa negativo en dos grupos. La cepas con susceptibilidad a la novoviocina incluyen entre otras Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis, y Staphylococcus schlefieri; por el contrario entre las cepas resistentes a la novoviocina se incluyen Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus xylosus que originan infecciones urinarias en huéspedes inmunocompetentes. Al ser el estafilococo coagulasa negativo un comensal habitual de la piel, la distinción entre infección y contaminación puede resultar en ocasiones difícil. Por ello, habitualmente se considera como criterio necesario de infección además de un hemocultivo positivo, la existencia de manifestaciones clínicas de infección o una elevación de algún parámetro inflamatorio. Algunos son más estrictos en los criterios diagnósticos de infección por estafilococo coagulasa negativo y consideran necesario al menos 2 hemocultivos positivos.

Staphylococcus coagulasa negativa staphylococcus aureus

fundamento

Esta prueba se utiliza  para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otras especies del género Staphylococcus. La coagulasa es una enzima que estimula la conversión del fibrinógeno en fibrina, por lo que comprueba la facultad de un microorganismo de coagular el plasma por acción de esta enzima. Si es coagulasa positivo, se produce una turbidez alrededor de la colonia, debida a la coagulación del plasma. Por otro lado, realizamos esta prueba cultivando a las bacterias en un medio rico en manitol (además de plasma). El manitol es un azúcar y gracias a este medio podremos distinguir si el microorganismo lo utiliza como fuente de carbono. Si es capaz de usarlo, se produce una acidificación del medio, lo que da lugar a un viraje del indicador de pH de rojo a amarillo.

MATERIALES Y METODOS

Para esta prueba se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma. Y se incuba a 37 oC.Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.Si aparece un coagulo en la suspensión el resultado será positivo.De no observarse nada en la solución, el resultado se tomara como negativo.

RESULTADOS

El resultado arrojado después de haber realizado la prueba de la coagulasa fue negativo por lo que se compraba que el microorganismo encontrado es un Staphylococcus coagulasa negativo. Con este resultado se puede asegurar de que la especie estudiada no se trata de un Staphylococcus aureus.

SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

Introducción Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Fundamento

El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Reacciones

Produccion de indol

Triptofano ( C11H12N2O2 ) indol ( C8H7N )

Produccion de H2S

+ H+ H2S

Cisteina Íon hidrogeno Acido sulfhidrico

MATERIALES Y METODOS

Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta.Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie.

Incubación

Durante 24 horas, a 35-37°C, en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.

RESULTADOS

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más allá de la línea de siembra.

Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.

Triptofanasa

Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.

Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Sulfuro indol motilidad

Se observa la producción de sulfuros, que se precipitan con iones férricos, a partir del tiosulfato de sodio presente en el medio. La prueba positiva se muestra un precipitado negro en el medio de cultivo donde creció la bacteria así también una turbidez en el medio debido ala motilidad de la bacteria

Sulfuros indol motilidad

Se observa una coloración café oscuro alrededor de la punción lo que indica el crecimiento, así también la motilidad de la bacteria y la falta de producción de sulfuro en el medio.

Sulfuro indol motilidad

Se

observa la capacidad de la bacteria para desdoblar el triptófano por medio de la enzima triptofanasa y producir INDOL. Al adicionar Kovacs sobre el medio cuando hay producción de Indol se forma un anillo rojo (tubo de la derecha). De lo contrario se forma un anillo amarillo (tubo del centro y la izquierda).

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

MO. Encontrado Prueba bioquímica Movilidad Indol H2SE. coli SIM Positivo Positivo NegativoP.mirabilis SIM Negativo Positivo Positivo

PRUEBA DEL CITRATO

Introducción

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Independientemente de los productos terminales producidos, el primer paso de la fermentación del citrato da por resultado la producción de piruvato. La degradación del piruvato depende entonces, del pH del medio.

Reacciones del citrato

Citrato oxalacetato + acetato

Piruvato + CO2 Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del medio. Si el pH aumenta (alcalino), se produce más acetato y formato con una disminución de la producción del lactato y CO2, por encima de pH 7 no hay producción de lactato y los productos son:

Citrato CO2 + acido formico + 2 acido acético

Con el pH acido el acetilmetilcarbinol (acetoina) y el lactato son los principales productos de utilización del citrato. Independientemente de los productos terminales producidos, el primer paso de la fermentación del citrato da como resultado la producción de piruvato. La degradación del piruvato depende entonces del pH del medio

MATERIALES Y METODOS

Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta y estriado en la superficie.

Incubación

Durante 24 horas, a 35-37°C, en aerobiosis.

RESULTADOS

Prueba de citrato Simmons positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta

Prueba negativa: No se observa crecimiento ni cambio de color (verde)POSITIVA NEGATIVO

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

MO. Encontrado Prueba bioquímica Resultado

E. coli Citrato Negativo

P.mirabilis Citrato Negativo

KLIGLER (AGAR CON HIERRO)

Introducción

El agar con hierro de Kligler (KIA) y el agar con azúcar triple y hierro (TSI) son medios de cultivo diferenciales en tubo que cumplen un doble propósito: a) la determinación de fermentaciones de hidratos de carbono y b) la determinación de la producción de H2S.El KIA contiene dos hidratos de carbono: 1% de lactosa y 0.1% de glucosa. El TSI puede sustituir el KIA: la diferencia primaria es el agregado de un tercer hidrato de carbono, la sacarosa, a una concentración del 1%.En el KIA, algunos microorganismos pueden fermentar ambos hidratos de carbono, otros fermentan solo la glucosa: incluso otros no pueden fermentar ni la lactosa ni la glucosa. La fermentación de los hidratos de carbono puede ocurrir con producción de gas o sin ella (CO2 + H2).La fermentación tiene lugar tanto en aerobiosis (en el pico de flauta) como en anaerobiosis (en el fondo). En el pico de flauta, el monosacárido glucosa es catabolizado inicialmente por la vía metabólica anaerobia de Embden-Meyerhof-Parnas, usadas por aerobios y anaerobios para producir el intermediario clave ácido pirúvico. El ácido pirúvico es degradado luego a través del ciclo de Krebs por aerobios o anaerobios facultativos para rendir CO2, H2O y energía.

Fundamento

Determinar la capacidad de un microorganismo para atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de desarrollo basal, con producción de gas o sin ella, junto con la determinación de la posible producción de ácido sulfhídrico (H2S).La producción de H2S y/o los patrones de fermentación por lo general son característicos de grupos bacterianos específicos, géneros o especies, sobre todo entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Las reacciones del KIA se usan principalmente para identificar a los miembros de la familia Enterobacteriaceae (entéricos), que por definición son bacilos Gram negativos catalasa positivos, todos los cuales fermentan la glucosa con producción de ácido. Así mismo, existen muchos bacilos intestinales Gram negativos no entéricos cuya identificación o separación de la familia Enterobacteriaceae es facilitada por sus reacciones en el KIA. Se observan tres patrones de fermentación básicos en el medio KIA: a) fermentación solo de la glucosa, b) fermentación de glucosa y de lactosa y c) ausencia de fermentación de glucosa o de lactosa.

MATERIALES Y METODOS

Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta y estría en la superficie.Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie.

Incubación

Durante 24 horas, a 35-37°C, en aerobiosis

Reacción

RESULTADOS

Fermentación solo de la glucosa (alcalino/ácido)

El primer patrón del KIA después de las 18-24 horas de incubación es un pico de flauta alcalino de un fondo ácido. Esta reacción se observa con los microorganismos capaces de fermentar solo la glucosa: son los no fermentadores de la lactosa.El pico de la flauta es alcalino (rojo), lo cual indica la degradación aerobia de la glucosa. Después de 18-24 horas de incubación, la concentración baja de la glucosa (0.1%) se agota y el microorganismo empieza a usar las peptonas del medio como nutrientes de desarrollo. El catabolismo de la peptona libera amoniaco (NH3) que alcaliza el pH con el rojo fenol, el indicador de pH incorporado en el medio.Sin embargo, el fondo del KIA tiene un color amarillo debido ala degradación anaerobia de la glucosa. La glucosa aquí también es degradada después de 18-24 horas de incubación: sin embargo, se forman productos finales ácidos lo que produce un pH ácido (color amarillo); la reacción ácida se mantiene en el fondo debido a la tensión de oxigeno mas baja.Fermentación de lactosa y de glucosa (ácido/ácido)

Algunos microorganismos pueden fermentar la lactosa y la glucosa para obtener sus nutrientes y producen una reacción en el KIA con un pico de flauta ácido y un fondo ácido (ácido/ácido) después de 18-24 horas de incubación. La concentración de lactosa (1%) es 10 veces la de la glucosa. En 18-24 horas, la lactosa (presente en mayor cantidad) no se ha agotado y todavía existe un medio ácido, si el mismo tubo de KIA se leyera después de 48 horas o más, el pico de flauta se pondría finalmente alcalino debido al agotamiento de la lactosa y al uso de las peptonas.

Ausencia de fermentación de lactosa y de glucosa (Alcalino/alcalino; alcalino/sin cambios)

PeptonasAeróbicamente

Anaeróbicamente Amoniaco (NH3)

Ciertas bacterias, principalmente los bacilos Gram negativos no entéricos, no pueden fermentar ni la glucosa ni la lactosa. Estas bacterias están presentes en el tracto intestinal junto con los miembros de la familia Enterobacteriaceae y es necesario identificarlas definitivamente como no entéricas. Dado que estas bacterias no pueden obtener sus nutrientes a partir de los hidratos de carbono, dependen de la peptona del medio. Estos microorganismos no entéricos pueden usar la peptona de manera aeróbica o anaeróbica y producen dos reacciones posibles en el KIA. Un microorganismo que produce un KIA con un pico de flauta alcalino y el fondo alcalino degrada la peptona aeróbica y anaeróbicamente. Una reacción con un pico de flauta alcalino y ningún cambio en el fondo es el resultado de un microorganismo que puede catabolizar la peptona sólo aeróbicamente: por ende, sólo el pico de flauta muestra un cambio de color (rojo). Cuando las peptonas son degradadas y producen un pH alcalino debido a la liberación de amoniaco (NH3), el medio adquiere un color rojo profundo.

Por consiguiente, una reacción en KIA puede interpretarse de cuatro maneras, según las bacterias a probar:

Alcalino/ácido: sólo la glucosa es degradada.Ácido/ácido: glucosa y lactosa degradadas.Alcalino/alcalino: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas, uso de las peptonas.Alcalino/sin cambios: ni la glucosa ni la lactosa son degradadas: uso de las peptonas.

REACCION KIAAlc/A (rojo/amarillo) Sólo la glucosa sola fermentada Peptonas usadasA/A (amarillo/amarillo) Glucosa fermentada, Lactosa fermentadaAlc/Alc (rojo/rojo) Ausencia de fermentación de la glucosa y la lactosa;

peptonas usadas

Formación de h2s

Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de H2S presentes en el medio: una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes, ya que el resultado final es un procedimiento en dos pasos.Paso 1

El H2S es un gas incoloro: por ello, es necesario un segundo indicador para visualizar la producción de H2S.

Paso 2

El precipitado negro del sulfuro ferroso que indica la producción de H2S puede enmascarar la condición ácida producida en el fondo del KIA: por consiguiente, si se produce H2S, existe una condición ácida aun cuando no sea evidente.

Bacteria (en ambiente ácido) + tiosulfato de sodio H2S gaseoso

H2S + iones férricos Sulfuro ferroso (Precipitado negro insoluble)

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

MIO (MOTILIDAD, INDOL, ORNITINA DESCARBOXILASA)

Introducción

Medio usado para la identificación de Enterobacterias basándose en su movilidad, actividad de ornitina descarboxilasa y producción de indol.

Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteina. Además, la tripteina aporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina descarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo.

Fundamento

Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina descarboxilasa e indol.La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación.La reacción positiva a la ornitina esta dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones optimas para la actividad de la enzima ornitina descarboxilasa,

MO. Encontrado Prueba bioquímica ResultadoE. coli Kigler NegativoP.mirabilis Kigler Negativo

la cual descarboxila la ornitina presente. Por descarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.El indol producido a partir del triptófano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac’s o de Erlich, indica un resultado positivo.

MATERIALES Y METODOS

Siembra

A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta.Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie.

Incubación

De 18 a 24 horas, a 35°C, en aerobiosis

Para la prueba de indol se añaden de 3 a 4 gotas de reactivo de Kovac’s, y se agita suavemente el tubo.

RESULTADOS

Observaciones

La movilidad es indicada por turbidez del medio o por crecimiento extendido a partir de la línea de inoculación.

La ornitina descarboxilasa es indicada por el color púrpura del medio. La ornitina negativa es indicada por un color amarillo, en el fondo puede ser púrpura al final.

La aparición de color rosa o rojo en el reactivo se interpreta como prueba positiva de indol.

Interpretación de resultados

1.- MOVILIDAD

Positivo: presencia de turbidez o crecimiento más a allá de la línea de siembra

Negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra

2.- ORNITINA DESCARBOXILASA

Positivo: color púrpura

Negativo: color amarillo, a veces se puede observar color púrpura en el fondo

3.- PRUEBA DEL INDOL:

Positivo: color rojo al agregar el reactivo de Kovac’s

Negativo: el color del reactivo de Kovac’s permanece incoloro-amarillento

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

MO. Encontrado Prueba bioquímica Movilidad Indol OrnitinaE. coli MIO Positivo Negativo PositivoP.mirabilis MIO Positivo Positivo Positivo

TRIPLE AZUCAR (TSI)

Introducción

E TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de la glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. También permite la identificación de la producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae. Con objetivo de diferenciar entre: Bacterias fermentadoras de la glucosaBacterias fermentadoras de la lactosa.Bacterias fermentadoras de sacarosa.Bacterias aerogenicas.Bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Fundamento

El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno es aerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia.

Al crecer un microorganismo en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la producción de aminas, debido a la utilización aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxígeno- la degradación de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la producción de pequeñas cantidades de ácido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan microorganismo no fermentadores no se formarán ácidos, pero por la producción de aminas en el pico, todo el medio quedará rojo.

La glucosa en el TSI está en una proporción 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de ácido producida por fermentación será baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hrs.) de incubación se producirá viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubación, el pico del tubo retornará al rojo por la producción de aminas debida a la degradación aerobia de las peptonas antes descrita. Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azúcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producirá gran cantidad de ácido (que no puede ser neutralizado por la producción de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virará al color amarillo (ácido).

La producción de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitación del sulfuro ferroso (negro). Como esta reacción se da preferencialmente en medio ácido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentación de algunos de los azúcares del medio. Además puede observarse la producción de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie.

MATERIALES Y METODOSSiembra

Con un asa recta de micromel tomar una colonia del microorganismo a investigar.Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 37 °C durante 18-24 hrs., pero no más de 24 hrs.

Incubación

De 18 a 24 horas, a 35°C, en aerobiosis

Para la prueba de indol se añaden de 3 a 4 gotas de reactivo de Kovac’s, y se agita suavemente el tubo.

DISCUSION Y RESULTADOS

Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada.Bisel ácido (amarillo): Lactosa y/o sacarosa fermentada.Taco ácido (amarillo): Glucosa fermentada.Bisel alcalino (rojo): Lactosa y/o sacarosa no fermentada.Taco alcalino (rojo) y Bisel alcalino (rojo): Ninguno de los tres glúcidos es fermentado.La aparición de burbujas en el taco indica que la fermentación se ha efectuado con producción de gas.Un ennegrecimiento en el medio indica la producción de ácido sulfhídrico.

A B C D

A Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentadaB Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídrico y gasC Glucosa fermentada con producción de ácido sulfhídricoD Ninguno de los tres azúcares es fermentado

En el experimento que realizamos en el laboratorio de microbiología inoculamos dos microorganismos desconocidos en tubos diferentes de agar TSI. Y por medio de esta prueba bioquímica acompañada de otras mas determínanos que los microorganismos encontrados eran los siguientes.

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

Moo. Encontrado Prueba bioquímica H2S MOTILIDAD FERMENTACION DE AZUCARES

E. coli TSI Negativo Positivo PositivoP.mirabilis TSI Positivo Negativo Negativo

LIA (AGAR HIERRO LISINA)

Introducción

Esta prueba permite diferenciar el microorganismo. Que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se puede detectar además la producción de H2S. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.

La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El púrpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato-especificas, capaces de actuar sobre la porción carboxilo (COOH) de los aminoácidos, con formas de aminas de reacciona alcalina. Esta reacción conocida como descarboxilación, produce dióxido de carbono con producto secundario. Cada una de las descarboxilasas es específica para un aminoácido. Lisina, ornitina y arginina son los tres aminoácidos ensayados habitualmente en la identificación de las enterobacterias y producen las siguientes aminas específicas.

La cadaverina (o 1,5-diaminopentano o pentametilenodiamina pentano-1,5-diamina; o C5H14N2) es una amina biogénica que se obtiene por la descomposición del aminoácido lisina. Se encuentra principalmente en la materia orgánica muerta, y es responsable en parte del fuerte olor a descompuesto.

La formación de la cadaverina se esquematiza de la siguiente manera:

(NH2) - (CH2)4-CH (COOH)-NH2 (Lisina) NH2-(CH2)5-NH2 (Cadaverina)

La Putrescina es un compuesto químico orgánico NH2(CH2)4NH2 (1,4-diaminobutano o butanodiamina) que se crea al pudrirse la carne, dándole además su olor característico.Está relacionada con la cadaverina; ambos se forman por la descomposición de los aminoácidos en organismos vivos y muertos.La putrescina es producida en pequeñas cantidades por las células vivas gracias a la acción de la ornitina-descarboxilasa.Las poliaminas, de las que la putrescina es uno de los ejemplos más simples, parecen ser factores de crecimiento necesarios para la división celular.Otros compuestos químicos que se caracterizan por su mal olor son el metanotiol y el ácido butírico.

La arginina se sintetiza de citrulina por acción secuencial de las enzimas citosólicas argininosuccinato sintetasa (ASS) y de la argininosuccinato liasa (ASL). Esto es energéticamente costoso, ya que la síntesis de cada molécula de argininosuccinato requiere la hidrólisis de adenosin trifosfato (ATP) a adenosin monofosfato (AMP); i.e., dos ATP equivalentes.

La citrulina es un compuesto que interviniente en el ciclo de la urea. Se forma por transferencia del grupo carbamoilo proveniente del anhídrido del ácido fosfórico al grupo d-amino de la ornitina. El enzima ornitina transcarbamoilasa es también mitocondrial. La citrulina difunde desde la mitocondria al citosol, donde continúa el resto del ciclo de la urea.El NO se produce mediante la acción de la enzima llamada óxido nítrico sintasa (NOS, siglas que provienen del inglés nitric oxide synthase), la cual contiene diferentes moléculas accesorias que trabajan en conjunto para formar el NO a partir del aminoácido arginina y O2. Durante esta reacción la arginina se convierte en una molécula de citrulina al liberar NO y consumir O2 (el cual dará lugar a una molécula de agua)

La citrulina puede proveerse de múltiples fuentes:

De la arginina vía óxido nítrico sintetasa (NOS); De la ornitina vía catabolismo de la prolilla o de la glutamina / glutamato; De la dimetilarginina asimétrica (ADMA) vía DDAH.

La actividad de la enzima NOS se regula mediante la disponibilidad de diversas materias primas (o substratos), como son la arginina, el O2 y otras moléculas que son necesarias para la síntesis del NO.

En la conversión de arginina a citrulina interviene una dihidrolosa más bien que una descarboxilasa, ya que en primer término un grupo NH2 es eliminado de la arginina. La citrulina es transformada en ornitina, que luego sufre descarboxilación para formar putrescina. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs. de incubación se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Siembra

Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.

Incubación

De 18 a 24 horas, a 37°C, en aerobiosis

RESULTADOS

Pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilación de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis.

Pico rojo/fondo ácido/H2S-, desaminación de lisina positiva, descarboxilación de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis.

Pico alcalino/fondo ácido/H2S- descarboxilación de lisina negativa. Ej. E. coli

Pico alcalino/fondo ácido/H2S+ descarboxilación de lisina negativa, producción de H2S. Ej. Citrobacter freundiiColoraciones de las reacciones de la prueba bioquímica LIA.

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

Microorganismo Prueba bioquímica ResultadoEscherichia coli LIA NegativaProteus mirabilis LIA Positiva

PRODUCCIÓN DE UREASA

Introducción

Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado. Los microorganismos que poseen la enzima ureasa tienen la capacidad de hidrolizar urea con la liberación de amoniaco.El caldo urea de stuart está fuertemente estabilizado con sales de fosfato a un ph de 6.8. El organismo en estudio debe producir cantidades relativamente grandes de amoniaco a fin de superar el sistema estabilizador y elevar el ph del medio lo suficiente como parar provocar el viaje del indicador (por encima de 8.0).El caldo urea de stuart es, por lo tanto, virtualmente selectiva para especies del genero Proteus.

Fundamento

Determina la capacidad de un organismo para desdoblar la urea, en amoniaco y C02, por acción de la enzima ureasa. La visualización del proceso se fundamenta en que la alcalinización producida en el medio de cultivo se detecta mediante un indicador de pH (rojo de fenol).

MATERIALES Y METODOS

Siembra

Inocular los tubos (asa recta). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado.

Incubación

Incubar a 35-37° C durante veinticuatro-cuarenta y ocho horas.

DISCUSION DE RESULTADOS

Se considera la prueba positiva si el medio adquiere una tonalidad rosada, y negativa si mantiene su coloración inicial.

Reacción negativa

Reacción positiva

Resultados obtenidos en la realización de la prueba

Bacteria Prueba bioquímica Resultado Escherichia coli Urea NegativoProteus mirabilis Urea Negativo