Pruebas Bioquímicas

1 - Prueba de la Catalasa:

Fundamento: Investigar la presencia en el microorganismo de la

enzima catalasa capaz de descomponer el peroxido de hidrógeno o

agua oxigenada (H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma

de burbujas en el medio.

Técnica: Con un palillo de madera estéril recoger el centro de una

colonia pura de Agar y colocarla sobre un portaobjeto limpio, luego

agregarles 2 a 3 gotas de peroxido de hidrógeno.

Es util para la identificación de los genéros.

Staphylococcus (+)‏

Srreptococcus (-)

Negativo Positivo

Streptococcus Staphylococcus

Prueba de la catalasa

2 – Prueba de la Coagulasa:

Fundamento: Comprobar la facultad de un microorganismo de

coagular enl plasma por acción de la enzima coagulasa, con

actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el

fibrinogeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo

visible.

Tecnica: Tomar una colonia del agar, pasar al caldo soya y

dejarla en la estufa.

Reacción Positiva: SE considera positiva ante cualquier grado

de coagulación dentro del tubo.

Reacción Negativa: Ausencia del coagulo tras 24 – 48 hrs de

incubación.

Es útil para diferenciación de:

S. aureus (+)‏

S. epidermidis (-)‏

S. saprophyticus (-)‏

Coagulasa Positiva Coagulasa negativa

Prueba de la Coagulasa

3 - Prueba DNAsa

Fundamento: Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que

es capaz de clivar los enlaces fosfodiester internos de la molécula de DNA. Se

utiliza un medio sólido que contiene verde de metilo el cual se combina con

DNA altamente polimerizado. Cuando la combinación no ocurre, por acción de

la enzima DNAsa, se produce una decoloración del medio.

Interpretación de resultados: La formación de un halo transparente alrededor

de la siembra indica presencia de DNAsa.

Permite diferenciar S.aureus que es la única especie dentro del Género

Staphylococcus que posee DNAsa de las otras especies.

4 – Prueba D- Manitol Salado Agar

Fundamento

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta

concentración salina. Los Staphylococcus coagulasa positiva

hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen

rodeadas de una zona amarilla brillante. Los Staphylococcus

coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona

roja o púrpura.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y

se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona

del mismo color.

Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan

como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o

púrpura

Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el

manitol

Prueba de Manitol sal

5 – Prueba de Trehalosa

6 – Prueba de Sacarosa

Para ambas pruebas su fundamento es muy parecido al de la

Prueba de Manitol; ya que se mide la capacidad de la bacteria

de fermentar un carbohidrato generando compuestos acidos que

torrnan el medio amarillo

7 – Prueba de la Urea:

Fundamento: Mide la capacidad que tienen algunas bacterias para producir

ureasa la cual es una enzima que hidroliza la urea originando amonio lo que

producirá un incremento del pH que puede detectarse con un indicador; como

indicador de pH utiliza Rojo Fenol.

La positividad se evidencia por un color Fucsia

8 – Prueba de Arginina, lisina

Fundamento: Mide la presencia en las bacterias de las enzimas descarboxilasas

que remueven una molécula de dióxido de carbono de un aminoácido para formar

aminas reactivas alcalinas.

Interpretación:

Inicialmente la bacteria metaboliza una pequeña cantidad de glucosa del medio

para producir ácidos mixtos, esto genera un cambio a color amarillo en el indicador

púrpura de bromocresol, posteriormente estos ácidos son desaminados,

alcalinizándose el medio y tomándose de nuevo el color original: morado.

9 – Prueba de MIO: Medio Semisólido Morado

(Motilidad, Indol, Ornitina)‏

Motilidad: Permite distinguir la movilidda de algunas bacterias la cual es

consecuencia de la presencia de Flagelos.

Interpretación de Resultados:

Turbidez Positivo

Sin Turbidez Negativo

Producción de Indol: Determina la capacidad de una bacteria para

hidrolizar el triptófano mediante la triptofanasa, liberando indol, ácido pirúvico

y amonio.

Interpretación de resultados:

El medio contiene triptófano y la liberación de indol por acción de la enzima

se detecta por la aprición de un anillo de color rojo después de agregar una

solución del Revalador Kovac.

Indol

Kovacks

o de

Erlich

Se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa en bacterias,

que degradan el aminoácido triptófano a indol

Descarboxilación de Ornitina: Si la bacteria es capaz de

producir la enzima descarboxilasa, va a transformar la ornitina en

putrescina.

Interpretación de los resultados:

Morado Positivo

Amarillo Negativo

10-Sensibilidad a la Novobiocina

Fundamento: Varias especies del género Staphylococcus son

resistentes a la novobiocina (disco de 5 μg).

Procedimiento: Se siembra una placa de agar MH con un hisopo

embebido en una suspensión de la cepa a estudiar. Luego se

aplica el disco de novobiocina y se incuba a 35º por 18 horas.

Permite diferenciar S. saprophyticus (resistente a la

novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa

negativos

Interpretación de resultados: nos permite distinguir en el

laboratorio entre las siguientes dos especies de estafilococos

Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus epidermidis. S.

saprophyticus es resistente a la novobiocina y mientras que S.

epidermidis es sensible

Prueba de la catalasa

Negativo

Streptococcus

hemolítico Gamma-hemolítico

Alfa-hemolítico

11 - Sensibilidad a al Optoquina

Fundamento: Se basa en la sensibilidad de

S.pneumoniae a una concentración menor o igual a

5μg/ml de hidroxicuprina (optoquina).

Procedimiento: Estriar un cuadrante de una placa de

agar sangre en varias direcciones con una suspensión Mc

Farland 0,5. Colocar luego un disco de optoquina en el

centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC.

Interpretación de resultados: Halos de inhibición

mayores de 14mm son característicos de S.pneumoniae

12- Sensibilidad a optoquina y sensibilidad a bacitracina se realizan

igual

Streptococcus pneumoniae (sensible) , Soluble en bilis,

Prueba de la Optoquina

5μg/ml de hidroxicuprina (optoquina).

Halos de inhibición mayores de 14mm

13 – Prueba de la Bilis Esculina:

Fundamento:

Está basada en la capacidad de ciertas bacterias,

partucularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la

esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es,

químicamente, un derivado de la cumarina.

Interpretación de los resultados:

La positividad se debe a un precipitado Negro

13 – Prueba de la Bilis Esculina:

14 – NaCl al 6,5%

Fundamento: Se basa en la capacidad de los

enterococos de crecer en una concentración de 6,5% de

NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que

contiene además de NaCl, glucosa y un indicador de pH:

púrpura de bromocresol.

Interpretación de Resultados:

Positivo

turbidez con o sin acidificación

del medio, que se observa como un viraje de color del

púrpura al amarillo

.15- Susceptibilidad a la Bacitracina:

Fundamento:

Los estreptococos del grupo A pyogenes son inhibidos por una baja

concentración de bacitracina (0,02 a 0,04 unidades) en discos de papel

colocados en agar sangre, pero la mayoría de los otros estreptococos no lo

son. 5-15% de estreptococos susceptibles a la bacitracina no

pertenecientes al grupo A Mac Faddin habla que se reporta sensible

cualquier zona alrededor del disco

Susceptibilidad a la Bacitracina 0,02 a 0,04 unidades

Bacilos Gram negativo no

Fermentadores

Colonias lactosa negativas

Prueba de la Oxidasa

Positivo

Bacilos Gram negativo no

Fermentadores

1- Prueba de Oxidasa:

Fundamento:

Presencia del citocromo C oxidasa en ,la cadena de trasporte de e –

puede detectarse utilizando un aceptor de e – artifisial p- fenilendiamina.

Este test para deferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias

(negativo)

Prueba de la Oxidasa

Positivo

2 – Prueba O-F (oxidación-fermentación)Of – glucosa,Of –

Xilosa, Of – Maltosa

Fundamento:

En condiciones anaerobias las bacterias pueden oxidar la glucosa hasta CO2

gas. El oxígeno es el aceptor final de e – en el metabolismo respiratorio. En

condiciones anaerobicas en ausencia de un aceptor de e- como nitrato, las

bacterias sólo pueden utilizar la glucosa por vía fermentativa. En este test se

evalúa la capacidad de las bacterias para oxidar y/o fermentar produciendo ácido

que se detecta gracias al azul de bromotinol (indicador de pH) es util en lña

distinción de Pseudomonas y Enterobacterias.

Técnica

Se inoculan tubos de medio con asas de punta recta. Uno de los tubos se

recubre con aceite de parafina para aislarlo del oxígeno (tubo de fermentación) y

otro no (tubo de oxidación)

Se usan dos tubos con un medio semisólido con un indicador de pH y un hidrato

de carbono (se pueden investigar varios, aunque si no se especifica, se entiende

que es glucosa).

Positvidad Color Amarillo

OF-Glucosa

Fermentativo control Oxidante

azul de bromotinol (indicador de pH)

Bacilos Gram negativo Fermentadores

1 – Prueba de Kliger

Fundamento:

Permite detectar producción de ácido y gas a partir de la fermentación

de la glucosa y la lactosa.

Técnica:

Punción y estrías

Reacciones:

Bisel alcalino (rojo)/ taco acido (amarillo): la bacteria fermenta

glucosa, no fermenta lactosa.

Bisel acido (amarillo/ taco acido (amarillo): la bacteria fermenta la

glucosa y la lactosa.

Bisel alcalino (rojo) taco alcalino (rojo): las bacterias no fermentan la

glucosa ni lactosa, es característico de los no fermentadores.

K: alcalino (color rojo) A: Acido (color amarillo)‏

Kliger

Kliger

A

B

tiosulfato sódio

Rojo Fenol

2 – Prueba de Citrato:

Fundamento

Este medio indica la capacidad de las bacterias de

metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente

de carbono, fosfato de amonio como única fuente de

fosfato y azul de bromotimol como indicador de pH

Interpretación de los resultados:

Azul Positivo

Verde Negativo

Citrato

Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de amonio

como única fuente de fosfato

azul de

bromotimol

3 – Prueba de Fenilalanina:

Fundamento:

La formación de la enzima desaminasa está condicionada por la alcalinidad

del medio. La fenilalanina es desaminada a ácido fenilpirúvico,

produciéndose una coloración verdosa al agregarse el reactivo.

Revelador CLORURO FERRICO

Interpretación de resultados:

Positivo Verde Oscuro

fenilalanina

negativo

positivo

cloruro férrico

4 – Prueba de Rojo de Metilo y Voges Proskauer:

Fundamento:

Las bacterias pueden metabolizar el piruvato formado a partir de la

fermentación de glucosa por dos vías: la vía ácido mixta y la vía del

butilenglicol.

Revelador Rojo de metilo

Revelador KOH al 40%

Rojo de Metilo

fermentación ácido-mixta: productos finales son ácidos orgánicos

(fórmico, acético, láctico y succínico) y etanol

Voges Proskauer

fermentación butilén glicólica: productos finales son compuestos neutros

como el butanodiol y el etanol, produciéndose acetoína como intermediario.

KOH y alfa-naftol