PRUEBA DE FENILALANINA DESAMINASA

Fundamento: Se basa en determinar la capacidad de un organismo de desaminar la fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su

actividad enzimática, con la producción de acidez.

Reacción química: Se lleva a cabo un proceso de dos pasos: en un inicio se elimina el hidrógeno, lo que produce un iminoácido y el

hidrógeno se combina con el oxígeno para formar agua; luego el iminoácido es hidrolizado a un cetoácido.

La fenilalanina es desanimada a ácido fenilpirúvico y con posterioridad puede ser reducida a ácido fenil-láctico con una incubación adicional. El ácido fenil- láctico es reconvertido a fenilalanina y el ciclo de desaminación ocurre de nuevo. Una

pequeña cantidad de ácido fenilpirúvico puede ser descarboxilado a ácido fenilacético, el que también puede ser reconvertido a

fenilalanina.

MEDIO DE CULTIVO EMPLEADO:

Medio fenilalanina (PA)

A.)Ingredientes. PH 7.3

El extracto de levadura proporciona tanto una fuente de Carbono como de nitrógeno.

B) Existen productos comerciales

C) Método de preparación

1. Pesar la cantidad exacta que indica el rótulo.

2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.

3. Calentar con suavidad la solución.

4. Fraccionar alrededor de 4 mL por tubo, pico de flauta largo (16X120 mm).

D) Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15 lb, 15 minutos.

E) Dejar solidificar el medio en posición inclinada.

F) Enfriar antes de usar y conservar refrigerado (4-10°C)

G. Inoculación

1. Inóculo denso.

2. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h (agar con hierro de Kligler, KIA).

H) Incubación: 35°C. 4 horas o 18 a 24 horas.

I) Agregar directamente el reactivo al tubo incubado antes de intentar la interpretación y hacer que el reactivo se deslice

suavemente sobre el pico de flauta.

Si no se obtiene el medio de fenilalanina comercial, y se utiliza L-fenilalanina en lugar de la mezcla del isómero DL, solo se necesita

1g. La forma L (+) de fenilalanina es degradada más rápidamente por Proteus y Providencia que la mezcla DL.

PRUEBAS ALTERNATIVAS

A. Medio líquido de fenilalanina-malonato1. Fórmula de Shaw y Clark es la combinación del medio de

fenilalanina de Buttiaux, Osteux, Fresnoy y Moriamex, más tarde modificado por Ewing, y el medio de malonato de Leifson más tarde modificado por Ewing, Davis y Reaves.

2. Diferencia por la capacidad de utilizar el malonato de sodio y la fuente de carbono y/o de desaminar la fenlilalanina a

ácido fenilpirúvico.3. Ingredientes: PH 6.3

4. Indicador de PH: azul de bromotimola. Ácido: PH 6: amarillo.

b. Alcalino: PH 7.6: azul de Prusia oscuro5. Fraccionar: tubos con rosca: 6-8 mL/tubo (16 X 125 mm).

6. Esterilización: autoclave, 121°C, 15 lb, 10 min.7. Inoculación: crecimiento proveniente de un cultivo puro de

18 a 24 h: inóculo denso.8. Inoculación: en aerobios, 35°C, 18-24 h.

9. Interpretacióna. Malonato

(1)Positivo (+): color azul oscuro: reacción alcalina.

(2)Negativo(-): sin cambios: el medio permanece verde claro.

b. Fenilalanina

(1) Agregar reactivo cloruro férrico antes de la interpretación, 0.8 g/ml de agua destilada estéril: agregar al

pico de flauta.

(a)Solución de FeCl3 al 8%: 3-5 gotas.

(b) HCl, 0.1 N: 3-5 gotas.

(2) Positivo (+)

(a) Color inmediato verde oscuro intenso.

(b) Fenilalanina desaminada a ácido fenilpirúvico.

(3) Negativo (-); color amarillo.

B) Discos o comprimidos comerciales (Nota: seguir las instrucciones del fabricante)

REACTIVOS EMPLEADOS

A) Dos elecciones

1. Solución acuosa de cloruro férrico (FeCl3) al 10%

Dos tipos

1) Acidificado, recomendado.a) Cloruro férrico (FeCl3) 12 gr

b) Ácido clorhidrico concentrado (HCl) 2.5 mlc) Agua destilada c.s.p 100 ml

2) No acidificadoa) Cloruro férrico (FeCl3) 10 mgb) Agua destilada 100 ml

2. Sulfato de hierro y amonio [FeSO4(NH4)2SO4.6H20 semisaturado

B) Métodos de utilización.

1. Cloruro férrico, cualquier tipo

a) Agregar 4 a 5 gotas de FeCl3 directamente a un tubo incubado de 18 a 24 h. Si el tubo es inoculado densamente, serán

suficientes 4 h de incubación.

b) Hacer rotar suavemente el tubo para que el crecimiento se separe.

c) En el término de 1 a 5 min se produce una reacción positiva de color verde en el pico de la flauta, y en el líquido de sinérsis.

2. Sulfado de amonio férrico

a) acidificar con ácido sulfúrico (H2SO4) al 10% utilizando como indicador rojo de fenol.

1. alcalino: rojo

2. acido: amarillo

b) Agregar de 4 a 5 gotas de sulfato férrico de amonio semisaturado.

c) Agitar suavemente el tubo.

d) Una reacción positiva de color verde se produce dentro del termino de 1 min.

3. Cualquier reactivo: interpretar la reacción inmediatamente, dado que el color producido es inestable y se desvanece rápidamente.

RESULTADOS

Interpretación

A. Resultado positivo (+): color verde pálido a intenso en el pico de flauta y en el líquido de condensación.

B. Resultado negativo (-): sin cambios de color: permanece amarillo debido al color del reactivo FeCl3.

PRECAUCIONES

A. Un resultado positivo debe ser interpretado de inmediato después del agregado del reactivo FeCl4;

debido a que el color verde se aclara con rapidez. La interpretación positiva o negativa debe realizarse dentro de los primeros 5 min. El hecho de permitir

rodar el FeCl3 sobre el pico de flauta ayuda a obtener una reacción más rápida con un color más

pronunciado.B. Los laboratorios a menudo utilizan las letras PA para

denominar el medio de fenilalanina. Sin embargo, PA también puede utilizarse para el agar con peptona y los agares con peptona y fenilalanina parecen idénticos. Si existen dudas acerca de lo que representa la sigla PA, realizar un control de calidad con un microrganismo

fenilalanina positivo conocido antes de poner el medio en uso general.

C. Los extractos de carne o los hidrolizados de proteína no pueden ser utilizados en la preparación del medio debido a que presentan variaciones naturales en el

contenido de fenilalanina.

PRUEBA DE OXIDASA

Fundamento: Esta prueba se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular.

Reacción química: Esta reacción de la oxidasa se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un

aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía a partir de la respiración. La cadena respiratoria es una secuencia de

enzimas y transportadores responsables del transporte de equivalentes reductores desde los sustratos al oxígeno

molecular. El oxígeno molecular oxida un sustrato por medio de la intervención del sistema de transporte de electrones.

El sistema citocromo, por lo común presente sólo en los microrganismos aerobios permite a éstos utilizar el oxígeno

como aceptor final de hidrógeno para reducir el oxígeno molecular a peróxido de hidrógeno, el último eslabón en la

cadena de la respiración aerobia.

Los anaerobios obligados carecen de la actividad de oxidasa, no pueden vivir en presencia del oxígeno atmosférico y no

poseen un sistema de citocromo oxidasa.

El sistema citocromo oxidasa varía entre las especies bacterianas y existen cuatro pigmentos bacterianos que actúan como enzimas respiratorias citocromo oxidasa

terminales: citocromo a1, citocromo a2, citocromo a3 y un pigmento que se une al monóxido de carbono designado

citocromo O. Una mezcla de citocromo a y el citocromo a3 se denomina citocromo c oxidasa. Los citocromos son pigmentos

respiratorios que contienen compuestos ferroporfirina. El citocromo aa3 contiene dos moléculas de hemo A y cada una

contiene un átomo de Fe que varia en sus valencias entre Fe3+

y Fe2+ durante la oxidación y la reducción, y dos átomos de Cu2+

asociados con la actividad de citocromo oxidasa y la reacción de electrones con el oxígeno molecular.

Los electrones provenientes del citocromo c son captados por la citocromo oxidasa oxidada, que los transfiere a una

molécula de oxígeno. El oxígeno libre es necesario para la regeneración indirecta del citocromo c oxidado. La prueba en realidad determina presencia del citocromo c y los resultados son positivos sólo en las bacterias que contienen citocromo c

como una enzima respiratoria

REACTIVOS EMPLEADOS

Reactivos para la oxidasa, varias opciones:

1) Reactivo de Kovacs: Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%.

2) Reactivo de Gordont y McLeod: Diclorhidrato de dimetil- p-fenilendiamina (denominado también N-dimetil- p-fenilendiamina).

3) Reactivo de Nadi: Una mezcla por partes iguales de α-naftol al 1% en alcohol etílico (etanol) de 95° y aminodimetilanilina al 1%.

4) Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison: Oxalato de aminodimetilanilina al 1%.

5) Discos impregnados con oxidasa:

a) Difco: Discos Bacto-Differentiation, de oxidasa.

b) BBL: Discos Taxo N.

Método de preparación de los reactivos

1.Disolver 1 g del reactivo deseado en menos de 100 ml de agua destilada (con excepción del α-naftol).

a) α-naftol (1-naftol) |g

b)Alcohol etílico absolute 100 ml

2. Calentar suavemente hasta su disolución.

3. Pasar a un frasco volumétrico y agregar un diluyente adecuado (agua o alcohol etílico) c.p.s 100 ml

4. Dejar descansar 15 min antes de su empleo.

5. Guardar en frasco de vidrio de color caramelo, tapado.

Método de utilización

1. Solución del reactivo.

a) Método en placa directa

1. Agregar directamente 2 o 3 godas de reactivo a algunas colonias sospechosas que se desarrollan en un medio en placa (agar sangre o

agar chocolatado).

2. Observar los cambios de color

a)Reactivo de Kovacs: reacción de color dentro de los 10 a 15 seg.

b) Reactivo de Gordon y McLeod: reacción de color dentro de los 10 a 30 min.

v) Método indirecto de Kovacs sobre papel.

1. Colocar un trozo de 6 cm2 de papel filtro de Whatman N°1 en una capsula de Petri.

2. Agregar de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovacs en el centro.

3. Hacer un extendido con el asa de inoculación de una colonia sospechosa, en el papel impregnado con reactivo siguiendo una

línea de 3 a 6 cm de longitud.

4. La reacción de color positiva se produce a los 5 a 10 seg.

2. Discos de oxidasa

2. Discos de Oxidasa

a) Método directo en placa.

1. Humedecer los discos impregnados con agua destilada estéril

2. Colocar el disco sobre algunas colonias sospechosas de un medio en placa(por ejemplo; agar chocolatado y agar sangre).

3. Reponer la placa en una incubadora a 35°C durante 20 a 30 min. La prueba puede ser incubada a la temperatura del ambiente (25°C)

o en refrigerador (4-10°C), pero la reacción es más lenta.

4. Observar los cambios de color que se produzca.

b) Método indirecto

a)Humedecer el disco con agua destilada estéril, colocar en una capsulada de Petri y agregar después la cantidad recogida con una

asa de una colonia sospechosa cultivada en un medio solido.

b)Humedecer el disco con un cultivo de caldo del organismo sospechoso.

2. Observar si se producen cambios de color: la reacción positiva debe ocurrir a los pocos segundos.

QUIMÍCA DE LA ACCIÓN REACTIVA

Los colorantes p-fenilendiaminas son aminas aromáticas primarias, diaminoderivados del benceno.

La citocromooxidasa, en presencia del oxígeno atmosférico, oxida el reactivo fenilendiamina oxidasa para formar un compuesto

coloreado, el indofenol. El indofenol es un colorante, un N-análogo de la quinona en la cual =N remplaza a uno o ambos grupos =O.

El reactivo clorhidrato de fenilendiamina forma un grupo diclorimida (CIN=C6H4=NCl); el =NCl es reducido a –NH2, o hidrolizado en =O.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

A) colonias oxidasa positivas: las colonias toman un color rosado, después del marrón y finalmente negro.

1) colonias rosadas.

A) bacterias viables.

B) periodo para el subcultivo.

2) colonias negras: bacterias no viables.

Cuando se emplea un mezcla de reactivo dimetil-p-fenilendiamina-α-naftol, la reacción oxidasa positiva esta indicada por un color azul.

B) colonias oxidasa negativas.

1- no se produce cambio de color en las colonias o solo adquieren un color rosado pálido por el reactivo.

2- puede producirse una coloración negra del medio circundante.

Si se emplea el reactivo de Kovacs, la reacción oxidasa positiva esta indicada por un color negro purpureo que se desarrolla en el

término de 10 segundos; y la reacción positiva dentro de los 10 a 60 seg. Se considera un resultado retardado. Steel asegura que el

desarrollo tardío del color, pasado un periodo de 60 seg, indica una prueba oxidasa negativa.

PRECAUCIONES

a) la prueba de la oxidasa se usa como rutina para la identificación del genero Neisseria. No obstante, otros géneros pueden mostrar

también una reacción oxidasa positiva.

b) no debe intentarse realizar una prueba de oxidasa de las colonias cultivadas en un medio que contenga glucosa ya que su

fermentación inhibirá la actividad de la enzima oxidasa , y dará posible resultados falsamente negativos .

c) se recomienda el empleo de asa o aguja de inoculación de platino para retirar las colonias para la prueba de la oxidasa.

d)Pueden ocurrir resultados falsos negativos, si un cultivo mixto contiene los géneros Pseudomonas y Neisseria, Las especies de

Pseudomonas producen una sustancia inhibitoria que interfiere con la producción de oxidasa por las especies de Neisseria.

e) Un resultado de oxidasa negativo puede exhibir un cambio de color al negro en el medio que rodea a las colonias pero no sobre las

colonias.

f)No rotular el reactivo de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina simplemente como reactivo de Kovacs, sino como reactivo de Kovacs para oxidasa porque hay otro de Kovacs para

indol.

G)Los reactivos de oxidasa se autooxidan con rapidez y pierden sensibilidad. Evitar cualquier exposición indebida de los reactivos a la luz. El reactivo tetrametil de Kovacs debe descartarse si muestra

un color azul oscuro, debe ser incoloro.

H)El reactivo tetrametil de Kovacs es confiable siempre que se respete el tiempo límite para considerar positivo un resultado (60

seg).

I)Cuando se usan los reactivos de prueba A y B indofenol, hacer caso omiso a cualquier reacción débil o dudosa después de 2 minutos

PRUEBA DE MOVILIDAD

Fundamento: Se basa en determinar si un organismo es móvil o inmóvil.

MEDIOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE MOVILIDAD (SEMISÓLIDO)

A) Dos variantes:

1. Ingredientes, pH 7,3; formula de Edwards y Ewing

Extracto de carne 3gPeptona 10gCloruro de sodio (NaCl) 5gAgar 4g

Agua destilada 1000mL

2. Ingredientes, pH 7,2

Tiptosa 10g

Cloruro de sodio (NaCl) 5g

Agar 5gAgua destilada 1000mL

B) Método de preparación1. Pesar la cantidad exacta como indica el rotulo. Los

productos de las diferentes compañías pueden presentar leves variaciones}

2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada

3. Calentar con suavidad la solución

4. Fraccionar alrededor de 5mL por tubo (13x100 mm)

C) Método de esterilización: autoclave, 121°C, 15 lb, 15 min

D) Dejar que el medio se enfrié en posición vertical y refrigerar para la conservación (4-10°C)

E) Inoculación

1. Crecimiento proviene de un cultivo puro de 18-24 h en agar con hierro de Kligler (KIA) u otro medio apropiado

2. Punzar el centro del medio con una aguja de inoculación a una profundidad de 1,25 cm

F) Incubación

1. 35°C

2. 24-48 h; si es negativo, incubar a 21-25°C durante 5 días

G) Si se desea, utilizar sales de tetrazolio en el medio para la movilidad; sin embargo, este reactivo inhibe ciertos

microorganismos.

1. Preparar una solución acuosa al 1,0% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)

2.Dos métodos de esterilización

a) Filtrado

1) Filtro Seitz

2) Filtro de membrana Millipore, 0,45 µm de diámetro de poro

3) Asépticamente agregar 5 ml de CTT al 1% estéril, por litro de medio para la prueba de movilidad, estéril.

b) Antes de someter al autoclave, agregar 0.05 g de CTT/litro de medio de movilidad o 5 ml de una solución al 1%.

Kelly & Fulton recomiendan el agregado de sal de tetrazolium al 0,005% para ayudar a detectar la movilidad, en particular cuando es

difícil la interpretación

QUÍMICA DEL REACTIVO

Las sales de Tetrazolium son incoloras, pero a medida que el organismo crece el colorante es incorporado a las células

bacterianas, donde es reducido a un pigmento rojo insoluble, formazán. El color rojo sólo se forma en el área del medio, donde se

están desarrollando las bacterias.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

A) Medio de movilidad.

1) Prueba positiva (movilidad): los organismos móviles migran de la línea de la siembra y se difunden en el medio, provocando

turbiedad. Pueden mostrar un crecimiento en estrías vellosas.

2) Prueba negativa (sin movilidad): crecimiento bacteriano acentuados siguiendo la línea de siembra, el medio circundante se

mantiene claro.

3)Medio de control (no inoculado): no hay crecimiento, el medio se mantiene incoloro y claro.

B)Medio de movilidad con sal de Tetrazolium (CTT).

1)Prueba positiva (movilidad): los organismos móviles muestran una nubosidad turbia rosada que se difunde por todo el medio.

2) Prueba negativa (sin movilidad): el crecimiento bacteriano produce una línea rojo brillante limitada a seguir la línea de siembra;

el medio que la rodea se mantiene claro.

3) Medio de control (no inoculado); no hay crecimiento, el medio se mantiene incoloro y claro.

PRECAUCIONES

1. El órgano de locomoción, el flagelo, es una proteína y es pasible de desnaturalización por el calor excesivo. Un cultivo calentado con anterioridad a la comprobación de la movilidad brinda un resultado

falso negativo.

2. Los resultados de la movilidad son difíciles de determinar en las bacterias anaerobias. Solo un resultado positivo (móvil) tiene algún

significado.

3. Los flagelos pueden destruirse o romperse por la agitación violenta de un tubo de cultivo bacteriano, lo cual puede producir

una movilidad positiva débil o un resultado falso negativo.

4. Los microorganismos móviles que se conservan como cultivos stock en un medio artificial durante periodos prolongados de tiempo

tienden a perder su movilidad

5. Muchas bacterias son móviles a una temperatura e inmóviles cuando se cultivan a otra. Un microorganismo es negativo después

de 48 h de incubación a 35°C debe ser incubado a 22-25°C durante 5 días para confirmar la falta de movilidad. La mayoría de las bacterias móviles pueden ser probadas a 35°C; sin embargo, Y.enterocolitica

desarrolla las proteínas de los flagelos a temperatura ambiente (22-25°C), pero no a 35°C. L.monocytogenes también requiere una

temperatura de 22-25°C

6. Si una prueba de movilidad es difícil de interpretar, comprar un tubo para movilidad no inoculado. El uso de sal de tetrazolio en el

medio puede ayudar a la interpretación. Si aún existen dudas, realizar una preparación de gota pendiente con una asada densa de

un cultivo de 18-24h.

7. En ocasiones, un cultivo móvil puede ser temporalmente inmóvil, con solo unas pocas bacterias móviles presentes. En este caso, un

cultivo positivo puede exhibir solo unos pocos ramilletes que a menudo son pasados por alto como indicadores de movilidad.

PRUEBA DE OXIDACIÓN-FERMENTACIÓN

Fundamento: Se basa en determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización.

Reacción química: La utilización que una bacteria hace de los hidratos de carbono tiene lugar por alguno de dos procesos, de

fermentación o de oxidación.

La fermentación es un proceso anaeróbico y los fermentadores bacterianos de un hidrato de carbono son por lo general anaerobios facultativos. Por medio del proceso de fermentación un hidrato de carbono es metabolizado y desdoblado en dos moléculas triosa de

carbono que a su vez son convertidas en cierto número de compuestos con 1,2,3 o 4 carbonos; el intermediario clave es el

ácido pirúvico. Los productos finales de la fermentación varían en cada especia bacteriana, lo que depende de su sistema enzimático y de las condiciones ambientales. El criterio importante es que antes de esta ruptura, el azúcar glucosa es fosforilado a glucosa 6-fosfato.

La principal vía metabólica fermentativa de la glucosa es la vía Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), aunque puede ocurrir por la vía de

la derivación (shunt) de las pentosas o por la de Enter-Doudoroff (ED). Sin

embargo, las tres vías metabólicas requieren la fosforilación de la glucosa como el paso inicial antes de que pueda ocurrir la

degradación. La vía metabólica de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) también se denomina glucoltica o anaerobia o fermentativa. La vía

metabólica de Entner-Doudoroff también se denomina aerobia.

La oxidación de la glucosa por una de las vías metabólicas de derivación (shunt) es un proceso anaerobio y las bacterias que

oxidan los hidratos de carbono por lo común son aerobias obligadas (estrictas). En el proceso de la oxidación el grupo aldehído es

directamente oxidado a un grupo carboxilo, para formar el acido glucónico, que con posterioridad es oxidado a un acido 2-

cetoglucónico. El 2-cetoglucónico luego puede acumularse o ser degradado en dos moléculas de ácido pirúvico.

MEDIOS UTILIZADOS: dos opciones de acuerdo con la morfología de los microorganismos de prueba

1) Medio basal OF de Hugh y Leifson (OFBM): bacilos gramnegativos (entéricos OF)

A) Ingredientes del medio basal semisólido. pH 7.1

Peptona de caseína (triptona) 2 gCloruro de sodio, NaCl 5 g

Fosfato dipotasico (K2HPO4) 0.3 gAgar 2.3 g

Azul de bromotimol (BTB) 0.03-0.08 g

Agua desionizada 1,000 ml

B) Indicados de pH: azul de bromotimol (BTB)

1. Acido: color amarillo pH 6

2. Alcalino: color azul de Prusia oscuro pH 7.6

3. Medio no inoculado: pH 7.1; color verde

2) Staph OF: medio de fermentación para la diferenciación de Staphylococcus y Micrococcus grampositivos

A) Ingredientes del medio basal semisólido, pH 7

Digerido pancreático de caseína (triptona), 1% 10 g

Digerido pancreático de caseína (triptona), 1% 10gExtracto de levadura 1 gAgar 2 g

Purpura de bromocresol (BCP) 0.001gAgua desionizada 1,000 ml

B) Indicador de pH: púrpura de bromocresol (BCP)i. Acido: amarillo pH 5.2

ii. Alcalino: purpura pH 6.8

iii. Medio no inoculado: pH 7; purpura

Pueden utilizarse indicadores alternativos de pH como la fucsina de Andrades y el rojo de fenol

Método de preparación, medio basal; cualquier medio

1. Pesar la cantidad exacta que indica el rotulo. Los productos diferentes de las diferentes compañías pueden presentar

leves diferencias

2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada

3. Calentar con suavidad la solución

Método de esterilización, medio basal; cualquier medio1. Autoclave

2. 121 °C, 15 lb, 15 min

Enfriar el medio estéril a 40-45 °C en un baño de agua. Agregado de hidratos de carbono, 2 opciones

1) Soluciones acuosas, 10% (10g/100ml)

a)Hidratos de carbono

i) Enteric OF: glucosa, maltosa, lactosa, manitol, sacarosa, xilosa

ii) Staph OF: solo glucosa y manitol

a) Método de esterilización

i) Filtración, recomendado

(1)Método con filtros de membrana Millipore

(2)Membranas: diámetro de poro 0.45 µm.

i) Procedimiento alternativo

(1)Concentración al 1% del hidrato de carbono deseado agregado al medio basal antes de la esterilización (10 g/L)

(2)Autoclave: 118 °C

a) A alícuotas de 10 ml del medio basal estéril fundido, agregar 10 ml de una concentración al 10% del hidrato de carbono deseado estéril (filtrado); concentración final del hidrato de carbono, 1%

b)De manera aséptica fraccionar alrededor de 5 ml por tubo estéril con tapa de rosca

2) Discos comerciales estériles con hidrato de carbono

a) Medio basal

i)El mismo que se emplea para las soluciones acuosas de hidratos de carbono

ii) Agregar los discos de hidrato de carbono a un medio en un tubo estéril

1. De manera aséptica

2. Seguir las indicaciones del fabricante

Enfriar antes del uso y refrigerar para la conservación (4-10°C)

Inoculación, prueba estándar de dos tubos

1) Inóculo: crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h

a) Enteric OF agar con hierro de Kliger (KIA) u otro agar apropiado para el pido de flauta

b) Staph OF: placa de agar con sangre (BA, SBA) u otro medio conveniente de aislamiento en placa; no inocular a partir del medio agar manitol salado

2) Para cada hidrato de carbono, inocular un par de tubos OF por cada microorganismo a probar. Marcar uno

como “abierto” y el otro como “cubierto” (o “sellado”). También realizar un grupo de controles: un grupo

inoculado sin el agregado de hidrato de carbono y un grupo no inoculado con hidrato de carbono.

3) Inoculo liviano

a) Aguja de inoculación

b) Sembrar por punción ambos tubos alrededor de 0.5 cm desde el fondo del tubo.

4) Recubrir todos los tubos marcados como “cubiertos” (o “sellados”) con alrededor de 1-2 ml de vaselina liquida estéril o

Vaspar estéril para excluir todo el oxigeno

a) Selladores

i) Parafina

(1) En una botella de 200 ml, agregar 1 ml de agua a 100 ml de parafina liquida

(2) Esterilización: dos opciones

(a) Autoclave: 121°C, 15 lb, 15 min

(b) Estufa de esterilización: 160-170°C, 1h

i) Vaspar: mas eficaz; no se retrae del vidiro como lo hace la parafina y es un solido con menos posibilidad de permitir la difusión del aire

(1) Mezclar partes iguales de vaselina solida y parafina

(2) A una botella de 100 ml, agregar 50 ml de la mezcla

(3) Esterilización: en alícuotas de 50 ml, esterilizar en la autoclave a 121°C, 15 lb, 1 h

(4) Después de la esterilización, colocar en estufa para el secado a 110°C para eliminar el agua atrapada

b) Se recomienda no utilizar vaselina liquida espesa: aumenta la difusión del aire

Incubación: 35°C, 48 h o mas tiempo. Los microorganismos de desarrollo lento pueden requerir 3-4 dias o incluso hasta

14 días de incubación prolongada. Tapas flojas. Una baja relación hidrato carbono: proteína reduce la formación de

aminas alcalinas que pueden neutralizar pequeñas cantidades de ácidos débiles provenientes del metabolismo

oxidativo. Las grandes cantidades de hidratos de carbono aumentan la cantidad de acido encontrada

El medio OF entérico Hugh y Leifson contiene una concentración alta de hidrato de carbono con una concentración baja de peptona para superar la posibilidad de que un microorganismo aerobio utilice la peptona y, en consecuencia, pueda producir una condición alcalina

que neutralice cualquier acidez leve producida por un microorganismo oxidativo. Estos autores establecieron que ciertas peptonas pueden no ser satisfactorias; recomiendan un digerido

pancreático de caseína. El fosfato dipotasico en el medio estimula la fermentación y actua como un buffer para controlar el pH. El cloruro

de sodio incrementa el crecimiento de las especies Brucella

La concentración de agar semisólido utilizada también permite la determinación de la movilidad además de la capacidad oxidativa o

fermentativa de un microorganismo. El agar también ayuda a distribuir el acido producido en la superficie a todo el tubo, lo cual

facilita la interpretación del pH. La glucosa se utiliza de manera sistémica en el medio basal OOF; sin embargo, algunos

microorganismos a ser probados son incapaces de metabolizar la

glucosa pero pueden atacar a otros hidratos de carbono. Debe utilizarse una batería de glucosa, lactosa y sacarosa y, a veces de

maltosa, manitol y xilosa

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

PRECAUCIONES

1.Deben utilizarse las abreviaturas correctas para registrar las reacciones OF. No utilizar positivo (+) o negativo (-) para denotar

oxidación (O, Oxi) o fermentación (F, Ferm).

2. las reacciones OF de muchos microorganismos se indican como +/-.

3. Algunas veces se agrega al medio una solución acuosa del indicador de pH, 3 ml, de una concentración por litro al 1%.

4. Un microorganismo que no es oxidativo ni fermentativo (-) podrá producir una leve alcalinidad en el tubo abierto (color azul-verde), pero el tubo cubierto podrá no exhibir un cambio de color (verde).

5. Algunos microorganismos pueden crecer en ambos tubos OF sin nunguna producción de acido, si esto ocurre, Cowan y Steel

recomiendan la confirmación de la reacción negativa mediante el uso de otro medio basal que contenga glucosa

6. Para especies con producción de ácido tardío realizar la prueba de galactosidasa para determinar la capacidad fermentativa potencial.

7. Las bacterias paracolonicas pueden oxidar y fermentar los hidratos de carbono, y en este caso la oxidación no se evidencia a

menos que la fermentación sea débil o lenta.

8. Los microorganismos fermentativos exhiben una reacción acida en todo el medio en ambos tubos. Sin embargo, la producción de

acido por un microorganismo oxidativo se evidencia primero solo en la superficie del medio del tubo abierto y de manera gradual se

disemina al resto del tubo.

PRUEBA DE ROJO DE METILO

Fundamento: Se basa en comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos

terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la producción de ácido, algunos organismos producen más ácidos

que otros.

Reacción química; La prueba del RM se basa en el empleo de un indicador del pH, RM, para determinar la concentración de iones

hidrógeno presente cuando un organismo fermenta la glucosa.

Las diferentes formas de fermentación se deben a variaciones en las enzimas vinculadas con el metabolismo del ácido pirúvico que se

encuentran en el organismo.

Los organismos rojo de metilo positivos producen ácidos estables, manteniendo una alta concentración de iones hidrogeno hasta alcanzar cierta concentración y entonces cesa toda actividad.

Los organismos RM negativos continúan metabolizando los productos iniciales de la fermentación por decarboxilación,

produciendo acetilmetilcarbino neutro, lo que da un elevado pH terminal que disminuye la acidez del medio, elevando el pH hacia la

neutralidad.

MEDIO EMPLEADO:

Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP), pH

Ingredientes1. Polipeptona o peptona 7g

2. Dextrosa 5g

3. Fosfato de potasio 5g

4. Agua destilada 1000ml

Método de preparación1. Pesar exactamente las cantidades.

2. Rehidratar con agua destilada.

3. Calentar suavemente hasta disolución.

4. Distribuir en tubos, aprox. 5ml por tubo.

Método de esterilización1. Autoclave

2. 121ºC, 15 libras, 15 min.

Enfriar antes de su empleo y refrigerar para su conservación (4-10ºC).

Inoculación

1. Crecimiento en un cultivo puro en AHK, de 18 a 24 h.

2. Inóculo poco espeso.

Incubación

1. Mínimo absoluto

a) 35ºC 48 h

2. Recomendada

a) 30ºC de 3 a 5 días

Agregar indicador del pH rojo de metilo directamente a una alícuota incubada antes de intentar la interpretación.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

A) Prueba RM positiva: el cultivo es lo suficientemente ácido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga

un definido color rojo (pH: 4.4) en la superficie del medio.

B) Prueba RM negativa: color amarillo (pH:6) en la superficie del medio.

Reacción retardada: color anaranjado. Continuar la incubación hasta 4 días y repetir la prueba.

PRECAUCIONES

A) La peptona que se encuentra en el medio puede afectar los resultados del rojo de metilo. Antes de su empleo, debe hacerse un

control de calidad con cada lote utilizando organismos rojo de metilo positivos y negativos conocidos.

B) La reacción del rojo de metilo no puede acelerarse aumentando la concentración de glucosa en el medio.

c) No debe intentarse interpretar un resultado con el rojo de metilo después de menos de 48 h de incubación.

D) Evitar la prueba con una mezcla caldo inóculo demasiado turbia; el crecimiento bacteriano es inhibido si el inóculo excede la

concentración celular máxima de alrededor de 109 células viables por ml.

PRUEBAS DE DECARBOXILASAS (LISINA-ARGININA-ORNITINA) Y

PRUEBA DE DIHIDROLASA (ARGININA)

Fundamento: Se basa en medir la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido para formar una

amina, con la consiguiente alcalinidad.

Reacción química: La descarboxilación es el procesos por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) y forman

una amina o una diamina y dióxido de carbono. Las tres decarboxilasas importantes utilizadas para la identificación de

bacterias son la lisina, la ornitina y la arginina. Solo se forman cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente acido en presencia

de un sustrato especifico, y los productos de descarboxilación cambian a un pH a limites alcalinos.

El aminoácido L- lisina es descarboxilado para formar cadaverina (una diamina ) y dióxido de carbono por la enzima lisina

descarboxilasa

El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para formar la diamina putrescina y dióxido de

carbono

En el Sistema de descarboxilasa, la L-arginina sufre una descarboxilación para producir agmatina,una molécula mas grande que la putrescina. La acción catalizadora de la enzima agmatinasa

rompe la agmatina en dos compuestos, putrescina y urea. Si la Enzima ureasa esta presente, la urea es catabolizada aun mas para dar dos moléculas de amoniaco (NH3 ) y dióxido de carbono( CO2 ).

En el Sistema dihidrolasa,Knivett , slade y Slamp y Oginsky y Gehrig demostraron que la degradación de la L-arginina ocurre en un

proceso de dos pasos,primero una degradación d L-arginina a L-citrulina, seguida por un sistema que fracciona la citrulina.

La degradación de la L-arginina a L-citrulina es una reacción productora de energía que proporciona una fuente importante de

ATP para los microorganismos. Este catabolismo es utilizado sobretodo por los anaerobios para la síntesis de ATP en la reacción

de carbamatocinasa.

Un cambio rápido e intenso del indicador de pH a alcalinidad indica que el catabolismo de la L-arginina se debió al sistema arginina dihidrolasa .Un cambio débil y lento del pH sin la formación de amoniaco ocurre cuando la L-arginina solo es degradada por el

sistema de arginina descarboxilasa. Sin embargo , el factor tiempo no es una manera confiable de determinar cual fue la vía utilizada.

MEDIOS DE CULTIVOA) Base de decarboxilasa de Moller,: pH 6 +/- .2

Ingredientes :Peptona 5gExtracto de carne 5g

Purpura de bromocresol (BCP) 0.1gRojo cresol 0.005gFosfato de pirodoxal 0.005g

Glucosa 0.5gAgua desionizada 1lt

Indicadores de pha) Púrpura de bromocresol

1) Ácido: color amarillo, PH: 5.2

2) Alcalino: color púrpura, PH: 6.8

b)Rojo de cresol (alcalino)

1. Alcalino: color amarillo, PH: 7.2

2. Alcalino: color rojo, PH: 8.3

c)Medio no inoculado

1. PH:6

2. Color púrpura intenso brillante.

Método de preparación:

a)Pesar la cantidad con exactitud, tal como se indica en el prospecto

b) Rehidratar con H20 destilada o desmineralizada.

c) Calentar suavemente hasta la disolución

d) Agregar 10 g (concentración al 1%)] del aminoácido deseado.

Método de esterilización

Autoclave,121°C, 15 libras, 15 minutos.

Enfriar, ajustar las tapas de la rosca y refrigerar (4-10°C) Inoculación.

a) Crecimiento de un culturo puro de 18 a 24 horas.

b) Inóculo liviano

c)Con cada bacteria de aminoácidos en proceso de investigar, se inoculará un tubo de control sin aminoácido.

d)Cubrir todos los tubos incluyendo el de control, con 2 o 3 mlde parafina o vaselina estéril. En estas condiciones el oxígeno del

medio es consumido por el microrganismo y esto controla el PH.

Incubación

35°C, 24 horas a 4 días.

B)Caldo de lisina-decarboxilasa de Falkow, PH: 6.8

Ingredientes

Peptona o digerido pancreático de gelatina Gelysate(BBT) 5gExtracto de levadura 3gDextrosa 1gL-lisina 5gPurpura de bromocresol (BCP) 0.02gAgua desionizada 1lt

Indicador de PH; púrpura de bromocresol

a)Ácido: color amarillo, PH: 5.2

b)Alcalino: color púrpura, PH:6.8

c)Medio no inoculado: PH: 6.8, color púrpura intenso brillante.

Método de preparación

a)Pesar exactamente la cantidad siguiendo las instrucciones.

b)Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.

c)Calentar suavemente hasta su disolución.

d)Distribuir en tubos aprox. 4 a 5 ml por cada tubo con tapa a rosca.

Método de esterilizaciónAutoclave,121°C, 15 libras, 15 minutos.

Enfriar, ajustar las tapas y refrigerar (4-10°C) Inoculación

a)Crecimiento de un culturo puro de 18 a 24 horas.

b)Inóculo liviano

c)Con cada bacteria de aminoácidos en proceso de investigar, se inoculará un tubo de control sin aminoácido.

Incubación: 35°C, 24 horas a 4 días. Reactivos utilizados

A)Hidróxido de sodio 10 N (40%):Método de utilización; para ajustar el PH del medio de decarboxilasa que contiene L-ornitina.

B)Reactivo de Nessler: Método de utilización, para detectar la producción de NH3 en la descomposición de la L-arginina.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

A. Positivo(+) Color Purpura turbio a amarillo-purpura apagado (El microorganismo poduce cadaverina)

B. Negativo (-)Color Amarillo brillante , claro (el microorganismo solo fermento la glucosa)

C. Tubo Control no inoculado (sin sustrato de aminoácido): Permanece Amarillo (el microorganismo fermento glucosa )

PRECAUCIONES1) Después de la incubación, las pruebas de descarboxilasa pueden

mostrar dos capas de colores diferentes amarillo y purpura. Agitar el tubo con suavidad antes de intentar una interpretación.

2) A menudo el resultado positivo de una prueba descarboxilasa es difícil de leer , debido a un color purpura amarillento no

diferenciado.si esto ocurre siempre se debe comparar con un tubo no inoculado. Cualquier rastro de purpura denota resultado positivo

si el tubo se ha inoculado por lo menos 24 h.3) El tubo control no inoculado que no contiene ningún aminoácido debe permanecer amarillo después de 18 a 24 h de incubación, lo

que denota que se produjo fermentación de la glucosa. Un resultado positivo (purpura) del tubo control no inoculado invalida todas las pruebas de descarboxilasa de aminoácidos y no puede realizarse

ninguna interpretación.4) Cuando se utilizan las pruebas de descarboxilasa de falkow o de moller deben intentar interpretar los resultados hasta que hayan

pasado por lo menos 18 a 24 horas de incubación.5) Dado que los medios de cultivo para descarboxilasa contienen peptona, es necesario eliminar el aire mediante el sellado para

prevenir una reacción falsa positiva causada por la oxidación y la desaminacion de las peptonas que comienzan en la superficie de los

medios6) La actividad de descarboxilasa especifica se incrementa en gran

dmedida en presencia de un pH de 5 o menor y disminuye mucho o se deprime por completo a un pH de 8 o superior

PRUEBA DE INDOLFundamento; Se basa en determinar la capacidad de un

microrganismo para separar Indol a partir del triptófano.

Reacción química: El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar 4 metabolitos

indólicos principales: indol, escatol (metil indol) y acido indolácetico. Las diversas enzimas intracelulares involucradas se denominan colectivamente “triptofanasa”, un termino general usado para

designar el sistema completo de enzimas que median la producción de indol por actividad hidrolítica sobre el sustrato triptófano. El

principal intermediario en la degradación del triptófano es el acido indolpirúvico, a partir del cual puede formarse indol por

desaminación y escatol por descarboxilación del IAA.

La triptofanasa cataliza la reaccion de desaminación atacando la molecula del tritofano solo en su cadena lateral

y dejando el anillo aromatico intacto como indol.

La desaminación y la hidrólisis tienen lugar con el agregado de una molécula de agua en presencia de la triptofanasa y

de la coenzima fosfato de piridoxal. Existen 2 tipos de desaminación: oxidativa y reductiva. La desaminación

oxidativa separa el grupo amina de un aminoácido y agrega un enlace doble al producto desaminado y de amoniaco y

energía.

La degradación del triptófano es reductiva. La degradación del triptófano libera indol, acido pirúvico, amoniaco y

energía.

El indol liberado de la molécula de triptófano puede detectarse por medio de un reactivo que involucra una combinación química que produce un color definido.

La presencia o la ausencia de formación de indol se usan para la identificación bacteriana.

MEDIOS UTILIZADOS

A) Caldo triptófano de peptona Ingredientes

Peptona de caseína (un fragmento proteico) 10 gCloruro de sodio, NaCl 5 g

Agua desionizada 1.000 ml Método de preparación

a) Pesar con precisión la cantidad que se indica en la etiqueta. Los productos de diferentes compañías pueden variar ligeramente.

B) Rehidratar con agua destilada o desionizadac) Calentar suavemente la disolución.

d) Distribuir alrededor de 4 ml por tubo. Método de esterilización: autoclave; 121ºC, 15 lb, 15 min.

Enfriar antes del uso y refrigerar para la conservación (4-10ºC). Inoculación

a) Inoculo liviano.b)Desarrollo proveniente de un cultivo puro de 18 a 24 h: con agar

hierro de Klieger. Incubacion: 35ºC; 24 a 48 h.

Agregar el reactivo de Kovacs o de Ehrlich directamente al tubo incubado antes de intentar una interpretación.

B) Medio de caseina Ingredientes

Digerido pancreático de caseína 2 gCloruro de sodio, NaCl 0.5 g

Agua desionizada 100 ml Método de Preparación

a)Disolver por calor moderadob)Distribuir 4 ml en cada tubo

Método de esterilización: autoclave; 121ºC, 15lb, 15 min

REACTIVOS UTILIZADOS

A)Reacción del Indol de Ehrlich

Método de utilización

a) Agregar 1ml de éter a un tubo de caldo incubado de 24 a 48 hrs.

b)Esperar a que el éter suba hasta la superficie del medio.

c)Agregar suavemente 0.5 ml de reactivo de Ehrlich al tubo.

B)Reacción del Indol de Kovacs

Método de utilización

a)Agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs directamente al tubo incubado 24 a 48 horas.

b)Agitar suavemente el tubo.

Química de la reacción: Cuando existe Indol, éste se combina con el aldehído que se encuentra tanto en el reactivo de Kovacs como en el de Ehrlich para dar un color rojo en la capa de alcohol. Esta reacción

se produce por un proceso de condensación formado por un desdoblamiento ácido de la proteína.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

1) Positivo (+): en segundos, aparece un anillo rojo (fucsia brillante) en la interfase del medio con la porción inferior de la fase alcohólica,

sobre el medio.2) Negativo (-): no hay ningún desarrollo de color en la capa de alcohol o aparece un anillo turbio toma el color del reactivo de

Kovacs o de Ehrlich (amarillo)3) Variable (+.-): un color anaranjado en la superficie del medio,

debido al escato, un compuesto metilado que puede ser un precurso de la formación de indol.

PRECAUCIONES

1. Cuando se usa caldo peptona en lugar de caldo con triptófano para la prueba de indol, el medio debe probarse con un

microorganismo producto de indol conocido. Esto determina si la peptona es adecuada para la producción de indol y también

establece el periodo de incubación optimo requerido.

2.No debe emplearse para la detección de Indol un medio de peptona que contenga glucosa.

3. La disminución de PH por debajo de 7.4 provoca una reducción en la producción de indol, y un posible falso negativo.

4. Los cultivos que se van a someter a las pruebas de producción de indol deben ser incubados aeróbicamente. El descenso en la tensión

del oxígeno disminuye la producción de indol.

5.El reactivo de Kovacs debe ser fresco pero puede conservarse en refrigeración (4-10°C).

6. Si el inóculo es de un cultivo mixto de organismos indol positivos y negativos cuando se realiza la prueba de mancha pueden producirse

reacciones falmente positivas.

7- Pueden requerirse modificaciones menores al hacer la prueba de producción de indol por ciertos no fermentadores positivos debiles; se necesita un medio enriquecido, como caldo infusión de corazon.

8. Debido a que el indol es soluble en compuestos organicos, debe agregarse xileno o cloroformo al medio de prueba antes de agregar

el reactivo de Ehrlich o de Kovac.

PRUEBA DE CITRATOFundamento: Se basa en determinar si un organismo es capaz

de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo, provocando alcalinidad.

Reacción química: El metabolismo del citrato por la mayoría de las bacterias es rápido a través del ciclo de acido tricarboxílico o el

ciclo de fermentación del citrato.

En las bacterias no se utiliza la coenzima A que es denominada citritasa.

Se considera que el oxalacetato y el acetato son intermediarios en el metabolismo del citrato.

Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio.

Si el pH es alcalino se produce más acetato y formato pero menos lactato y CO2.

Por encima de pH 7 no hay producción de lactato y los productos:

Si el pH es acido la acetoina y el lactato son los principales productos de utilización del citrato.

Independientemente de los productos, el 1º paso de la fermentación del citrato da por resultado la producción de piruvato.

Su degradación depende del pH del medio.

Los organismos que usan el citrato como su única fuente de carbono, utilizan también las sales de amonio como su única fuente

de nitrógeno.

La utilización de ácidos orgánicos y sus sales como fuente de carbono produce carbonatos y bicarbonatos alcalinos en la nueva

degradación.

Medios de cultivo

A) Medio de citrato de Simmons, pH: 6.9

Ingredientes

Indicador de PH: azul de bromotimol.a)Ácido: color amarillo. PH:6

b)Alcalino: color azul de Prusia intenso PH:7.6c)Medio no inoculado: Color verde, PH:6.9

Método de preparacióna)Pesar exactamente la cantidad de acuerdo con las indicaciones del

prospecto.b) Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.

c)Calentar suavemente hasta su disolución.d)Colocar aproximadamente 4 a 5 ml en cada tubo.

Método de esterilización: Autoclave, 121°C, 15 lb/15 min Dejar que el medio solidifique en posición inclinada.

Enfriar antes de su empleo y refrigerar (4-10°C). Inoculación

A )Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 horas.B )Inóculo liviano.

c) Únicamente en cola de pescado sobre un medio en pico de flauta

Incubación; 35°C, 24 a 48 horas.

B)Medio de citrato sulfuro de Christensen PH 6.7

Ingredientes

Indicador de PH: rojo de fenola)Ácido: color amarillo, PH: 6.8

b)Alcalino: color rojo rosado, PH:8.4c)Medio no inoculado: color crema a cobrizo, PH:6.7

Proceder de la misma manera que cuando se emplea medio de citrato de Simmons en cuanto a preparación,

esterilización, almacenamiento, inoculación e incubación.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓNA) Medio de citrato de Simmons

1)Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico de flauta.

2) Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (verde).

B) Medio de citrato de Christensen1) Prueba positiva: color rojo rosado en el pico de flauta.

2) Prueba negativa: no se observa cambio de color

PRECAUCIONES1. Puede haber variaciones en la intensidad del color producido en una prueba de citrato positiva, debido a las diferencias en los lotes

de indicadores del pH que se encuentran en el comercio.2.Si se usa un inoculo grande para estriar el cultivo en pico de flauta,

puede obtenerse en éste un color amarillo claro a cobrizo, sin afectar el medio de mas abajo. También un inoculo demasiado

espeso puede dar un falso resultado positivo.3. Inoculación de una batería de sustancias bioquímicas con el

mismo cultivo, pasar por la llama la aguja o el asa de inoculación antes de estriar el medio citratado o inocularlo primero.

4. Después de 24 h de incubación, un organismo citrato positivo puede mostrar una ligera alcalinidad, apenas visible en el pico de

flauta5.Se recomienda que cuando se utiliza la tira de citrato impregnada con reactivo, para dar validez a los resultados se tiene

que tener en cuenta lo siguiente:1) Usar un inoculo espeso

2)Tomarlo de un cultivo en pico de flauta de agar hierro triple azucarado (AHTA) en vez de agar con tripticasa de soja (ATS), que muestra tendencia a dar resultados débilmente positivos o falsos

negativos.3) Aumentar el tiempo de incubación de 4 a 6 h si las reacciones son

dudosas.

PRUEBAS DE LICUEFACCIÓN DE GELATINA

Fundamento: Se basa en determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolítico

(gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina o muestran cambios característicos debido a los productos de degradación.

Reacción química: La gelatina, una proteína derivada del colágeno animal, se incorpora a diferentes medio de cultivo para

determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolíticas, detectadas por digestión o licuefacción de la gelatina.

Las enzimas capaces de producir gelatinolisis se denominan gelatinazas.

Estas enzimas proteolíticas a menudo son importantes factores de virulencia de algunos microorganismos.

Las proteínas naturales son demasiado grandes para entrar en una célula bacteriana; por ende para que una célula pueda usar las

proteínas, estas primero deben ser catabolizadas a componentes más pequeños.

Ciertas bacterias segregan gelatinazas exocelulares para degradar las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana.

El catabolismo de las proteínas por parte de la gelatinazas es un proceso de dos pasos; el resultado final es una mezcla de

aminoácidos aislados.

La gelatina es hidrolizada por la gelatinasa en sus aminoácidos constitutivos, con perdida de sus caacterísticas gelificantes.

Básicamente hay cinco medio/métodos para detectar la degradación de la gelatina por microorganismos:

Medios utilizados

A) Medio de gelatina de Kohn, muy recomendado Ingredientes

Método de preparacióna)Espolvorear la gelatina nutritiva sobre la superficie del agua.

Esperar unos minutos hasta que la misma se humedezca y se forme una suspensión homógenea.

b)Hacer hervir la mezcla de gelatina.c)Agregar carbón en polvo.

d)Agitar bien y dejar enfriar hasta 48°C en un baño de agua.e) Volcar la mezcla bastante fría como para que coagule

rápidamente, de manera de evitar que se forme un sedimento de carbón.

f)Dejar que la mezcla se endurezca.g)Suavemente retirar la lámina de gelatina y carbón intacta y

colocarla en formol al 10% durante 24 horas.h)Cortar discos de gelatina con carbón, de 1 cm de diámetro.

i)Envolver en gasa los discos de gelatina y dejarlos durante 24 horas debajo de un chorro de agua corriente.

j)Colocar los discos en tubos con tapa a rosca y cubrir con una pequeña cantidad de agua. Método de esterilizaciónI)Vapor fluente, 30 min.

II) Calentamiento repetido, 3 veces.a)Baño de agua 90-100ºC. 20 min cada vez.

Después de la esterilizacióna)Decantar el agua asépticamente.

b)Agregar de 3 a 4 ml por tubo de caldo de tripticasa de soja (CTS) estéril u otro medio de crecimiento liquído adecuado.

c) Incubar durante 24 horas antes de su empleo. Inoculación

a)Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 horas, suspensión densa Preparar un tubo de control (no inoculado)junto con la

bacteria de estudio y rotularlo. Incubación

a)Simultáneamente los tubos con caldo de prueba y el de controlb)35-37°C, 18 a 24 horas, o más.

B)Método de gelatina nutritiva para punción, PH:6.8

Ingredientes

Método de preparacióna)Ingredientes individuales

1)Primero agregar solamente gelatina al agua destilada o desmineralizada y dejar descansar de 15 a 30 minutos.

2)Calentar hasta que hierva (50°C) para que se diliuya la gelatina.3)Agregar el extracto de carne y la peptona, y volver a calentar

4)No calentar en exceso y ajustar el PH de 6.8 a 7.1

b)Medio deshidratado comercial1)Pesar exactamente la cantidad siguiendo las indicaciones del

prospecto2)Rehidratar con agua destilada o desmineralizada

3)Calentar suavemente hasta su disolución4)Distribuir en tubos aprox. de 4 a 5 ml por cada tubo con tapa a

rosca. Método de esterilización: Autoclave, 121°C, 15 lb/15 min

Inoculacióna)Mantener los tubos de gelatina en el refrigerador hasta el

momento de su inoculación. El medio debe de estar solidificado.b)Aguja de inoculación

1)Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 horas, inóculo espeso.2)Hacer una punción en el medio hasta una profundidad de 1.25 a

2.50 cm. Incubación: Simúltaneamente los tubos de prueba y de

control 22-25°Co a 35°C, 24 horas a 14 días

C) Medio de gelatina con tioglicolato, PH: 7.2

Método de preparacióna)Pesar exactamente la cantidad según las indicaciones.b)Rehidratar con agua destilada o desmineralizada fría.

c) Colocar en un baño de agua a 50°C para que se mojen los ingredientes.

d)Calentar suavemente hasta su disolución.e)Distribuir en tubos, aprox. de 4 a 5 ml por cada tubo con tapa a

rosca. Método de esterilización:Autoclave 121°C, 15 lb/15 min.

Enfriar en posición vertical, ajustar las tapas y refrigerar para su conservación (4-10°C)

Inoculacióna)Mantener los tubos de gelatina con tioglicolato en un refrigerador

hasta el momento de la inoculación.b)Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 horas, suspensión

densa. Preparar un tubo de control (no inoculado)junto con la

bacteria en estudio. Incubación

a)Ambos tubos, el de prueba y el de control, simultáneamente.22-25°C o a 15°C/24 hras a 14 días.

INTERPRETACIÓNA. Medio de Kohn de gelatina-carbón

1. Licuefacción (L); microorganismos de pruebaa) Partículas libres de carbón sedimentan en

el fondo del tubo.a. Agitar el tubo suavemente para resuspender las partículas, que se ven como una “nube negra visiblemente

turbia”2. Sin licuefacción (SL); microorganismo de prueba

a. Mezcla de gelatina-carbón intactab. No hay ninguna partícula de carbón libre

en el medio.c. Reincubar un tiempo adicional.

3. Tubo controla. Mezcla de gelatina-carbón intacta

b. No hay ninguna partícula de carbón libre en el medio.

B)Medio de gelatina nutriente para punción o medio tioglicolato. Precaución: enfriar el medio incubado a 35ºC antes de leer los

resultados.1 )Licuefacción (L); microorganismo de prueba, medio licuado. La

licuefacción de la gelatina comienza en la superficie del medio y se extiende: la magnitud depende del grado de licuefacción.

2)Sin licuefacción (SL); microorganismo de pruebaa)El medio permanece sólido.

b)Reincubar un tiempo adicional3)Tubo control: el medio permanece sólido; forma un gel firme

debido a la resolidifiación de licuefacción.C)Medio de gelatina nutriente en placa

1)Licuefacción (L): turbidez en la zona alrededor del desarrollo.a)El resto del medio permanece límpido.

b)El resultado positivo fuerte muestra una precipitación de color blanco lechoso; el halo es de 3-6 mm de ancho.

2)Sin licuefacción (SL): ningún cambio zonal; el medio permanece límpido.

Tiene varias ventajas la hidrólisis de gelatina en placa:

Detecta proteínas extracelulares El medio permanece sólido tanto a 30ºC como a 35ºC

También puede dar resultados positivos más temprano.

PRECAUCIONES1|.Procesar siempre un tubo control en paralelo con el

microorganismo a probar; un solo control es suficiente si se prueban varios microorganismos.

2.Si los tubos de gelatina se incuban a 35ºC o mas, deben colocarse en un refrigerador o baño de hielo y deben enfriarse antes de

determinar si hay licuefacción.3. No sacudir la gelatina mientras esta caliente, si se agita y se mezcla con el líquido caliente del medio, se puede dar un falso

reporte.

4. Se recomienda agregar 0.01 M en el medio en que se hace la suspensión porque algunas bacterias producen una gelatinasa que

necesitan calcio.5. La mayoría de las bacterias con requerimientos especiales crecen en caldo infusión, pero algunas no crecerán en caldo nutriente o de

peptona.6. La gelatina debe estar libre de hidratos de carbono fermentables.7. Después de la preparación de los discos de gelatina, es esencial lavarlos bien con agua corriente durante 24 horas para eliminar

todos los rastros de formalina.8.Es mejor usar el caldo peptona que el caldo nutriente.

9. Si se agrega 0.1 ml de tolueno por tubo de medio de Kohn para acelerar las cepas bacterianas que licuan la gelatina despacio, pero

también puede inhibir de acuerdo con la temperatura de incubación. Por lo tanto si se usa tolueno, deben incubarse

simultáneamente 2 tubos por microorganismos de prueba, uno sin tolueno.

10. El tipo de licuefacción de la gelatina no tiene gran importancia en el trabajo de diagnostico de rutina. Registrar simplemente como

(+) o (-) en licuefacción.11. Para bacterias mesófilas, incubar tubos a 35ºC y enfriar antes de

leer resultados.13. [Gelatina] de 12 a 15% puede inhibir el desarrollo.

14. Una reacción (+) empieza en la superficie del medio y la expansión depende del grado de licuefacción.

PRUEBA DE ÁCIDO SULFHÍDRICO

Fundamento: Se basa en determinar si se ha liberado ácido sulfhídrico (H2s) por acción enzimática, de los aminoácidos que

contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.

Reacción química: Algunas especies bacterianas heterotróficas son capaces de liberar azufre enzimáticamente de los diferentes

aminoácidos que los contienen, produciendo el gas ácido sulfhídrico. La peptona, la cisteína, la cistina y el tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o

aminoácidos que contienen azufre para producir H2S.1ra etapa: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio

de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. Para que tenga lugar la reducción del tiosulfato es necesario que exista

un medio ácido. Este es el proceso de respiración anaeróbica por el cual el átomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la

oxidación de los sustratos orgánicos. El tiosulfato (S203) remplaza el sulfato como aceptor de electrones y es fuente de azufre para el

organismo. El ácido sulfhídrico es un gas incoloro por eso es necesario un segundo indicador para detectar visiblemente su

producción.2da etapa: El gas incoloro H2S reacciona con una sal pesada, citrato

férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso.

MEDIOS EMPLEADOSA)Detección del H2S de las Enterobacteriaceae.

a)Agar hierro de Kligler (AHK)b) Agar hierro triple azucarado (AHTA)

Ingredientes BBL, PH: 7.3Polipeptona 20gCloruro de sodio 5g

Lactosa 10gSacarosa 10gDextrosa (glucosa) 1g

Sulfato ferroso de amonio 0.2gTiosulfato de sodio 0.2g

Rojo de fenol 0.025gAgar 13g

Agua destilada 1000ml Ingredientes, Difco, PH: 7.4

Extracto de carne 3gExtracto de levadura 3g

Peptona 20 gLactosa 10g

Sacarosa 10gDextrosa (glucosa) 1g

Sulfato ferroso 0.2gTiosulfato de sodio 0.3g

Cloruro de sodio 5gAgar 12g

Rojo de fenol 0.024gAgua destilada 1000ml

C)Agar sulfuro-indol-motilidad (SIM): medio semilsólido

Ingredientes, BBL, PH:7.3Peptona 26.1g

Sulfato ferroso de amonio 0.2gTiosulfato de sodio 0.2gAgar 3.5g

Agua destilada 1000ml

Difco, PH: 7.3Extracto de carne 3g

Peptona 30gHierro peptonizado 0.2g

Tiosulfato de sodio 0.025gAgar 3g

Agua destilada 1000ml

D) Agar con hierro y peptona (AHP) Ingredientes, Difco, PH:6.7Peptona 20g

Citrato férrico 0.25gCitrato de amonio 0.25gTiosulfato de sodio 0.08g

Fosfato de potasio 1gAgar 15g

Agua destilada 1000ml

E)Agar con sulfito de bismuto (ASB) Ingredientes BBL, Difco, PH: 7.5, PH:7.7

Peptona 10gExtracto de carne 5gDextrosa (glucosa) 5gFosfato de sodio 4g

Sulfato ferroso 0.3g

Sulfito de bismuto 8gVerde brillante 0.025g

Agar 20gAgua destilada 1000ml

Método de preparacióna)Pesar exactamente las cantidades, tal como se indica en el

prospecto.b)Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.

c)Calentar suvamente hasta su disolución.d)Distribuir en tubos, aprox. 5 ml por cada uno; excepción agar ASB

1) Medio en placa.2)Esterilizar el frasco con el medio antes de volcar en la placa.

Método de esterilización: Autoclave, 121°C, 15 lb/15 min Dejar enfriar

a)En posición inclinada con capa superior profunda.1.AHK

2. AHTAb)En posición vertical

1. APH2.SIM

c)Baño de agua a 37°C: medio de agar con sulfito de bismuto1)Dejar enfriar el frasco con el medio hasta 45-50°C

2)Asépticamente volcar de 15 a 20 ml por cada capsula de Petri esterilizada.

3)Dejar enfriar en posición vertical (sin tapa)4)Colocar la tapa sobre la superficie seca.

5) Usar el mismo día que se preparó la capsula. Método de inoculación

a)Cultivo puro, colonia aisladab)Con una aguja de inoculación recoger el centro de la colonia.

c)Medios en tubo

1) En pico de flauta (inclinado)(AHK, AHTA)a)Punción de la capa profunda. Hasta 0.6cm del fondo. Retirar la

aguja siguiendo el mismo camino de entrada.2)Vertical (APH, SIM) punción en la capa profunda hasta 0.6 a 1 cm

del fondo. Retirar la aguja siguiendo la línea inicial.+d)Medio en placa ASB: estriar para el aislamiento(método de los 4

cuadrantes). Incubación: 35°C, todos los medios en tubo:18 a 24 horas.

Placas ASB:1)Invertir, hasta 48 horas antes de dar un informe negativo.

Tiras de reactivo:a)Reactivo: solución acuosa de acetato de plomo saturada, caliente.

Medios utilizados: 1)Caldo nutritivo, PH: 6.9 Ingredientes

Peptona o proteosa peptona 5gExtracto de carne 3g

Agua destilada 1000ml

2)Caldo de tiopeptona, PH:6.8 Ingredientes

Peptona tiotona 5gExtracto de carne 3g

Agua destilada 1000ml

3)Caldo de tripticasa de soja (CTS). PH: 7.3 Ingredientes

Peptona tripticasa 17gPeptona (poroto de soja) 3gCloruro de sodio 5g

Fosfato de Potasio 2.5gDextrosa (glucosa} 2.5g

Agua destilada 1000mlMétodo de esterilización igual que los medios anteriores.

3. Métodosa)Macrométodo

1.Método de Zobell y Feltham

2. Medios: CTS, Caldo nutritivo, Picos de flauta de agar con suero y glucosa, para las especies de Brucella solamente.

3. inoculación: crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 hrs: AHK, inóculo espeso.

4. Asépticamente, suspender una tira de acetato de plomo estéril por sobre el nivel del caldo.

5. Incubación: Especies de Brucella, 35°C. Todos los demás organismos 30°C . Leer al cabo de 12 a 24 horas.

b)Micrométodo

1. Método de Morse y Weaver .

2. Medio: caldo de tiopeptona.

3. Inoculación: Calentar los tubos en un baño de agua a 37°C , Crecimiento de una fase logarítmica de 6h, de cultivo puro en un

medio enriquecido. Transferir el inóculo con un hisopo, sin necesidad de esterilizarlo. Hacer girar suavemente el hisopo en el

medio.

4. Asépticamente, suspender una tira de acetato de plomo estéril, hasta unos 10,mm por encima del nivel del caldo.

5. Incubación: 35°C, leer los resultados con intervalos de 15 min, hasta un periodo final de 45 min.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

1.Medios en tubo:AHK, AHTA,SIM y APH

a)Positivo: se observa ennegrecimiento en el medio.

b)Negativo: no se observa ennegrecimiento

2. Medio en placa, ASB

a)Positivo: colonias negras rodeadas por una zona negro-pardusca en el medio.Puede mostar un reflejo metálico.

b)Negativo:no hay ennegrecimiento ni reflejo metálico

B)Tira de acetato de plomo

a)Positiva: coloración negro-pardusca de la tira de papel; puede tener cierto brillo.

b)Negativo no hay alteraciones ni coloración de la tira.

PRECAUCIONES

1. La producción de H2S puede manifestarse en agar hierro de Kligler pero ser negativa en agar hierro triple azucarado.

2.Un organismo que produce H2S puede mostrar ennegrecimiento en el medio SIM (positivo) pero no en el AHTA (negativo).

3. Si la peptona es deficiente para la rápida detección del H2S puede agregarse cisteína para enriquecer la concentración de enlaces –SH.

4. Según Tittsler se produce cierta inhibición del SH cuando la prueba es incubada a 34°C.

5. Algunos tratan las tiras de acetato de plomo con glicerina para aumentar las condiciones higroscópicas.

6. Los métodos de la tira de acetato de plomo son diez veces más sensibles que los que incorporan el metal en el medio.

7.El acetato de plomo es tóxico para el crecimiento bacteriano, por lo tanto, no permitir que las tiras de acetato de plomo toquen el

caldo.

PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Fundamento: Se basa en determinar la capacidad de un microrganismo de hidrolizar el almidón por medios enzimáticos. Y en probar la desaparición del amidón por el uso de un reactivo con

yodo

Reacción química: El almidón es un homopolisacárido, producto de condensación de muchos monómeros de α-D-glucosa,

que forma un polímero por puentes α-glucosídicos (acetal). La hidrólisis enzimática ocurre en las uniones α-1,4-acetal y α-

1,6.acetal que mantienen junto el polímero de almidón. Algunos azucares reductores y sustancias fermentables son producidos a través de la reacción; sin embargo, el principal mecanismo de la

reacción es la ruptura de polisacáridos primero a dextrinas, seguida por una fase mas lenta de formación de maltosa.

Sólo las bacterias del género Bacillus (B. thuringiensis y B. subtilis) producen amilasa.

La hidrólisis de almidón es analizada en medios conteniendo el almidón en placa. Después de incubar se inundan las placas con

lugol que al unirse con el almidón intacto forma un complejo púrpura.

La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacáridos de la

dieta se metabolizan mediante hidrólisis a monosacáridos. El almidón es un homopolisacárido, producto de condensación de muchos monómeros de α-D-glucosa, que forma un polímero por

puentes α-glucosídicos (acetal). La hidrólisis enzimática ocurre en las uniones α-1,4-acetal y α-1,6.acetal que mantienen junto el polímero de almidón. Algunos azucares reductores y sustancias fermentables

son producidos a través de la reacción; sin embargo, el principal mecanismo de la reacción es la ruptura de polisacáridos primero a

dextrinas, seguida por una fase más lenta de formación de maltosa.

MEDIO DE CULTIVO: Agar-almidón:

Ingredientes

Peptona 10g

Cloruro de sodio 5g

Extracto de carne 5g

Almidón soluble 2g

Agar 20g

Agua destilada 1000ml

Método de preparación

a) Disolver en el agua todos los componentes y ajustar el pH a 7.2.

b) Esterilizar en la olla a presión durante una hora y posteriormente repartir en placas de Petri estériles

Inoculación

a)Inocular en tres puntos equidistantes de la superficie de las placas (tocando suavemente con el asa un punto de dicha superficie) con

las bacterias de prueba.

Incubación: 35 °C durante 24-48 horas

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

Positivo: Se observa la presencia de un halo transparente alrededor de la indica que la prueba es positiva, es decir que la bacteria ha

hidrolizado el almidón mediante la amilasa.

Negativo; No se produce un halo transparente alrededor de la colonia.

PRECAUCIONES

1. Enzima α-amilasa no es estable a un pH menor de 4.5

2. Evitar el sobrecalentamiento del almidón cuando se disuelve en un medio basal; puede ionizarse y dar resultados falsos positivos.

3. El medio de almidón debe tener una reacción neutra o acida (24); el pH optimo debe ser 7.2.

4. El agar almidón brinda mejores resultados si se utiliza antes de las 2 semanas: después de este periodo el almidón cambia y puede

desarrollar unas manchas color purpura rojizo con el agregado de la solución de yodo .

PRUEBAS DE REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS

Fundamento; Se basa en determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre.

Reacción química: La reducción de nitrato (NO3-) a nitrito (NO2

-) y a nitrógeno gaseoso (N2) por lo común se produce en condiciones

de anaerobiosis, en las cuales en un microorganismo produce su oxígeno del nitrato. El oxígeno actúa como un aceptor de hidrógeno; es decir el protón y el aceptor final de electrones. La mayoría de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y solo pueden reducir los nitratos en ausencia de oxígeno. Esta respiración anaerobiasis un proceso de oxidación en el que las sustancias inorgánicas producen

oxígeno para actuar como un aceptor de electrones a fin de proporcionar energía. En la reducción de nitratos, los citocromos

bacterianos transportan electrones a moléculas aceptoras específicas.

Reducción de nitratos a nitritos

Las posibilidades del producto final en la reducción del nitrato son muchas: nitrito (NO2

-), amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N2), óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N2O) o hidroxilamina (R·NH·OH). El

producto formado depende de la especie bacteriana. De acuerdo con las condiciones ambientales, estos productos por lo común no

son oxidados con posterioridad ni asimilados en el metabolismo celular, pero son excretados en el medio circundante. la reducción

de nitrato a nitrógeno gaseoso u óxido nitroso, se denomina desnitrificación.

MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS: Medio nitrato de potasio, dos variantes.A. Caldo nitrato: pH 7B. Agar nitrato: pH 6.8

Ingredientes:

Métodos de preparación1. Pesar la cantidad exacta como indica el rotulo.

2. Rehidratar con agua destilada o desmineralizada.3. Calentar la solución con suavidad.

4. Fraccionar alrededor de:a) Agar nitrato: 5 ml por tubo (13 × 100 mm.).

b) Caldo nitrato: 1 ml por tubo (13 × 100 mm.). agregar tubos de Durham invertidos para detectar la producción de gas.

esterilización: autoclave, 121˚C, 15 lb, 15 min. Dejar que el medio de agar nitrato solidifique en una

posición inclinada. Enfriar en cualquiera de los medios antes del uso y

conservar en refrigerador (4-10˚C). el vencimiento es aproximadamente a los 6 meses.

Inoculación1. Crecimiento proveniente de un cultivo puro de 18-24 h en agar

con hierro de Kligler o (KIA) u otro cultivo apropiado.2. Medio líquido: inoculo denso.

3. Medio de agar inclinado: estría en el pico de flauta y punción en el fondo del tubo.

4. Deben comprobarse de manera simultánea dos controles.

a) Tubo control 1: inoculado con un microorganismo conocido nitrato positivo.

b) Tubo control 2: no inoculado, pero incubado en las mismas condiciones que los tubos inoculados. Control para determinar si

hay presencia de nitrito en el medio. Incubación: 35˚C, 12-24 h; raras veces puede ser necesaria

una incubación prolongada de hasta 5 días. Agregar reactivos de nitrato antes de intentar una

interpretación. La mayor parte de los microorganismos capaces de reducir el nitrato lo hace dentro de las 24 h. el medio de nitrato utilizado puede ser liquido o un agar en

pico de flauta.

REACTIVOS EMPLEADOS

A. Acido acético, 5 N, 30%Acido acético glacial, CH3COOH 30 ml

Agua desionizada llevar a 1000 mlB. Reactivo A: dos opciones

1. α- Naftilamina, 0.5%: se determino que la α-naftilamina era carcinógena; como precaucion se prefiere el empleo de

N,N-dimetil-α-naftilamina.2. N,N-dimetil-α-naftilamina 0.6%

IngredientesN,N-dimetil-α-naftilamina, C10H7N(CH3)2 6 gÁcido acético glacial, 5 N, 30 % 1000 ml

Método de preparación1. Disolver cada sustancia química en menos de 1000 ml de acido

acético 5 N por calentamiento suave.2. Transferir la solución a un frasco graduado de 1 L y llevar a 1000

ml con acido acético 5 N.

3. Filtrar la solución a través de algodón absorbente lavado.C. Reactivo B: acido sulfanilico, 0.8%

IngredientesÁcido sulfanilico 8 g

Ácido glacial acético, 5 N, 30% 1000 ml Método de preparación

a) Disolver el acido sulfanilico en menos de 1000 ml de acido acético 5 N.

b) Transferir la solución a un frasco graduado de 1 L y llevar a 1000 ml con acido acético 5 N.

D. Reactivo de Nessler1.Disolver 5 g de yoduro de potasio (KI) en 5 ml de agua desionizada;

el agua no debe contener amoniaco.2.Agregar una solución saturada de cloruro de mercurio (HgCl2) fría

hasta que aparezca un precipitado después de la agitación.3.Agregar 40 ml de NaOH 9 N.

4.Diluir con agua desionizada a 100 ml.5.Permitir que la solución repose 24 h antes del uso. Puede formarse

un leve precipitado en el fondo; no agitar el sedimento cuando se utiliza el reactivo. Método de uso

1.Primero, controlar la formacion de gas en el tubo de Durham o en fondo del agar.

a)Si el gas esta presente el microorganismo es un no fermentador, el resultado es positivo para la desnitrificacion.

b)Si el gas esta presente y el microorganismo es un fermentador, continuar con la fase 1.

c)Si no hay gas, continuar con la fase 1.1. Fase 1

a)A un cultivo incubado de nitrato, agregar directamente reactivos, dos procedimientos.

(1)Preferido

(a)Inmediatamente antes de la prueba, mezclar partes iguales los reactivos A y B.

(b)Agregar cerca de 10 gotas de la mezcla al cultivo.(2)Alternativo

(a)Reactivo A: 5 gotas.(b)Reactivo B: 5 gotas.

(c)Agitar el cultivo con suavidad para mezclar los dos reactivos.a. Un resultado positivo (color rojo) dentro de 1-2 min denota una

prueba terminada; descartar los tubos.b. Si el resultado es negativo, continuar con la fase 2.

2. Fase 2: metodo del reducción del cinca)Al tubo que contiene los reactivos A y B, agregar directamente una

pizca (20 mg) de polvo de cinc.b)El polvo de cinc no debe contener nitrato-nitrito.

c)Observar para la interpretación final. El color aparece dentro de 5-10 min.

RESULTADOS

INTERPRETACIÓN

A. Primero controlar la producción de gasa. Burbujas de gas en el tubo Durham, en la superficie o en

todo el medio semisólido.b. Una única burbuja es significativa; registrar como

producción de gas.c. Si el microorganismo de prueba es un no fermentador

(1) Prueba terminada; descartar los tubos.(2) Informar como desnitrificacion.

(3) Producción de N2, N2O o productos de degradación no gaseosa distintos de NO2.

d. Si el microorganismo de prueba es un fermentador(1) El gas es hidrogeno de modo que debe probarse con

reactivos para nitrato.(2) Continuar con la fase 1.

B. Fase 11. Resultado positivo (+)

a. Color rosa a rojo oscuro en 1-2 min.b. Nitrato reducido (NO3

-) a nitrito (NO2-) por el

microorganismo.c. Prueba terminada.

2. Resultado negativo (-)a. Falta de desarrollo de color.

b. El nitrito (NO2-) no esta presente.

c. Continuar con la fase 2 para probar la presencia de nirato no reducido.

C. Fase 2: prueba de reducción del cinc1. Resultado positivo

a. Ausencia de desarrollo de color.b. Ausencia de nitrito en el medio.

c. El microorganismo redujo nitrato a nitrito y con posterioridad redujo el nitrito a productos no

gaseosos; desnitrificacion; probar la producción de amoniaco por el agregado de una pocas gotas de reactivo Nessler; resultado positivo, color naranja

oscuro.2. Resultado negativo

a. Color rosa a rojo oscuro en 5-10 min.b. Confirma resultado negativo de fase 1.

c. Nitrato presente; no reducido por el microorganismo.d. El cinc redujo el nitrato a nitriro.

PRECAUCIONES

1. Cuando se realiza la prueba de reducción de nitrato utilizando α-naftilamina, el color producido en una reacción positiva puede

desvanecerse rápidamente. Interpretar los resultados inmediatamente,sobre todo cuando se efectúan varias

determinaciones.

2. Eliminar la decoloración o destrucción del desarrollo del color por los organismos que producen ácido sulfhídrico utilizando un medio

de peptona que no contenga azufre.

3. Un organismo reductor del nitrato fuertemente positivo puede mostrar un precipitado castaño inmediatamente después del

agregado de los reactivos.

4. Se hará la prueba de un tubo de nitrato no inoculado, con los reactivos, para determinar si el medio está exento de nitritos.

5. Algunos organismos son capaces de reducir el nitrato en nitrito, aunque destruyen el nitrito con la misma rapidez con que se formó,

dando un resultado falsamente negativo.

6. Una prueba positiva de reducción del cinc indica que el nitrato fue reducido en nitrito y vuelto a reducir.

7.Zobell asegura que algunos organismos pueden causar la destrucción del KNO3 al 0.01% que se encuentra en el medio

después de un periodo de incubación de 2 días.

8. Conn afirma que en algunos casos el nitrato puede estar sólo parcialmente reducido, o que un organismo puede perder

temporalmente su capacidad de reducir el nitrato.

9. En todos los cultivos que no contienen nitritos, cuando se utilizan los reactivos α-naftilamina y ácido sulfanílico, agregar polvo de cinc

directamente al tubo antes de hacer la interpretación final.

PRUEBA DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Fundamento: Se basa en determinar la capacidad de un organismo de fermentar (degradar) un hidrato de carbono

específico incorporado a un medio básico, produciendo ácido, o ácido con gas visible.

Reacción química: Los hidratos de carbono se clasifican como: 1)monosacáridos, aldehídos polihidroxílicos o cetonas; 2)

polisacáridos u oligosacáridos, productos de condensación de dos o más monosacáridos o 3)alcoholes polihídricos y ciclitoles, productos

de la reducción de los monosacáridos.

La fermentación es un proceso metabólico anaerobio de oxidación-reducción en el cual un sustrato orgánico sirve como el aceptor de

hidrógeno final (aceptor de electrones) en lugar del oxígeno.

Los productos finales provenientes de la fermentación de hidratos de carbono dependen de varios factores: 1) El microorganismo que lleva a cabo la fermentación; 2) El sustrato a ser fermentado y 3) a

veces factores como: temperatura y acidez.

En conjunto los hidratos de carbono y alcoholes en conjunto

denominado azucares dan: H y unos pocos ácidos; unos pocos alcoholes y una cetona.

El proceso de fermentación mas común produce como producto final acido láctico.

Se pueden utilizar pruebas de hidratos de carbono para revelar los patrones de fermentación de una especie bacteriana particular por

la observación de:

a. Ausencia de glucósidosb. Ausencia de monosacáridos en disacáridos, trisacáridos y

polisacáridos mas complejos estos demuestran que la glucosa fue metabolizada.

Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono por lo común son anaerobias facultativas.

El criterio importantes es que antes de su degradación la glucosa es fosforilada a un compuesto glucosa 6-fosfato.

La principal vía fermentativa de degradación de la glucosa es la vía de Embden-Meyerhof-Parnas aunque también puede ocurrir por vía

o en combinación con el Shunt de la pentosa o vía de Entner-Doudoroff.

Sin embargo, las 3 vías requieren la fosforilación inicial de la glucosa antes de que pueda ocurrir la degradación.

El acido pirúvico es el intermediario principal en la degradación de la glucosa y el catabolismo del ácido pirúvico involucra muchos

mecanismo deferentes que forman una variedad de productos finales característicos de las fermentaciones bacterianas.

Los productos finales característicos de la fermentación bacteriana son:

a. Ácido lácticob. Ácidos acéticos y fórmico

c. Acido láctico y alcohol etílicod. Etanol

e. Acetilmetilcarbinol (acetoína) y

f. Acido succínico a acido propiónico y

g. y acetona a alcohol isopropílicoh. Acido butírico a alcohol butílico

Fermentación alcohólica

Las bacterias alcohólicas degrada la glucosa a ácido pirúvico por la vía metabólica de Embden-Meyerhof-Parnas.

Fermentación del acido láctico

Las bacterias que producen ácido láctico pueden ser divididas en 2 subgrupos:

Fermentadoras homolácticas (degradan la glucosa por vía EMP casi exclusivamente a ácido láctico).

Fermentadoras heterolácticas (pueden catabolizar la glucosa por una de las 3 vías de degradación, para dar los productos

característicos: ácido láctico y ácidos fórmicos, etanol y

).

Los factores de control son el pH y el sustrato presente para la actividad bacteriana.

Fermentación del ácido propiónico

Los productos finales principales del ácido pirúvico son el ácido

propiónico y por la vía del acido succínico, aunque puede producirse acido acético. Los microorganismos anaerobios llevan a

cabo la fermentación propiónica.

Fermentaciones del grupo coliforme (fermentadores mixtos de ácidos o grupo CDT).

Esta fermentación es característica de los miembros e la familia Enterobacteriaceae y estos microorganismos degradan la glucosa en

una diversidad de productos finales.

El grupo coliforme puede subdividirse en 2 categorías:

a. Microorganismos que rinden diversos productos mixtos de ácidos

El alcohol se forma por la fermentación alcohólica; el acido láctico,

el acido acético y el se forman por la fermentación láctica a través de la dismutación del acido pirúvico.

b)Los que elaboran butilenglicol (butanodiol) como principal producto final.

Compuesto por microorganismos cuyo principal producto final es el butilenglicol. Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae

los grupos Klebsiella-Enterobacter muestran este tipo de fermentación.

Fermentación del butanol

Es llevada a cabo por las bacterias anaerobias como Clostridium.

Los diversos productos finales son acido acético, acido fórmico, etanol, acido butírico, butanol, acetona, isopropanol y una gran

cantidad de y . La combinación y las cantidades de los productos finales formados dependen del género y de las especies

bacterianas.

Medios EmpleadosA) Caldo básico rojo de fenol, PH: 7.4

Ingredientes

Indicador de PH: Rojo fenol como indicador de pHa)Acido: color amarillo, pH 6.8

b)Alcalino: color rosado, pH 8.4c)Medio sin inocular: color naranja rojizo; pH 7.4

Método de preparación: 1)Pesar con precisión la cantidad indicada en el rotulo del envase;2)Rehidratar con agua

destilada o desionizada;3)Calentar suavemente la solución. Método de esterilización: Autoclave, 121°C, 15 lb/15 min

Enfriar a 45-50°C en baño de agua. Método de preparación de hidratos de carbono: Por lo

general usar de 8 a 10 azúcares. Los que se emplean con más frecuencia son: 1)glucosa; 2)lactosa; 3)sacarosa; 4)manitol; 5)dulcitol; 6)salicina; 7)adonitol; 8)inositol;

9)sorbitol; 10)arabinosa; 11)rafinosa; 12)ramnosa; 13)xilosa; 14)trehalosa; 15)celobiosa; 16) galactosa; 17)inulina;

18(fructuosa; 19)melibiosa. Preparación de las concentraciones de azúcar: a)Agregar

directamente el azúcar a la base de la concentración deseada.b)Preparar una concentración de 5 o 10% del

azúcar deseado en agua destilada. Métodos de esterilización

a)Filtración (recomendada como el método de elección)

b)Autoclave 116-118°C, 10 a 12 libras /15 minutos. No se aconseja meter autoclave a los siguientes hidratos de

carbono; 1)lactosa; 2)sacarosa; 3)salicina; 4)xilosa; 5)arabinosa; 6)trehalosa; 7)maltosa.

Inoculación:a)Crecimiento de un cultivo puro de 18 a 24 h. Inóculo

espeso Incubación: Incubadora a 35°C 18 a 24 horas.

B) Indicador de PH alternativo: indicador de Andrade modificado, PH: 7.1,7.2

Método de preparación: 1)Disolver la fucsina ácida en agua destilada; 2)Agregar 15 ml de NaOH 1N; Mezclar y dejar descansar. El color rojo deberá transformarse en un color

castaño. Si no se produce está decoloración agregar 1 ml de NaOH (4%); Mezclar y dejar reposar otras 24 horas.

C)Medio básico semisólido con rojo de fenol, PH: 7.5

Ingredientes;

a)Medio de caldo de hidrato de carbono con rojo de fenol.

b)Agregar 0.4% de agar.

El medio básico semisólido con hidratos de carbono elimina el empleo de los tubos de Durham para la detección de

gases. Manipular de la misma manera que se utilizara un caldo, con

las siguientes excepciones:

a)Enfriar en posición vertical antes de su uso.

b)Inoculación: Unicamente con aguja de inoculación.

Peptona 10 g

Extracto de carne (optativo) 1 g

NaCl 5 g

Rojo fenol 0.018 g

Agua desionizada 1.0

RESULTADOS

INTERPRETACIONES

A)Medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol.

(1)Positivo: Ácido, PH: 6.8, color amarillo. Producción de gas variable

a)Positivo para gas: Se observan burbujas de gas en el tubo de Durham o el medio se halla completamente desplazado por el gas

que deja una parte sin colorear en el tubo incluido.

b)Negativa para gas: No se observan burbujas de gas en el tubo.

(2) Negativa:Alcalina: Rosa-rojizo.

B)Medios semisólidos de hidratos de carbono con rojo de fenol.

Igual que en medio de caldo con hidratos de carbono y rojo de fenol

C)Medio de calco con hidratos de carbono como indicador del PH de Andrade.

(1)Positiva: Ácido, PH: 5.0, Rojo-rosado, Producción de gas variable

(2)Negativa: Alcalina, Amarillo a incoloro

PRECAUCIONES

1. La concentración de hidratos de carbono incorporados en el medio base con rojo fenol es por lo común de 1%, con excepción de

la salicina (0.5%). Se puede utilizar concentraciones de 0.5% para todos los hidratos de carbono; sin embargo, se recomiendan las

concentraciones de 1% ya que reducen la posibilidad de reversión.2.Algunos tipos de peptonas no son apropiados, la caseína

(constituyente básico de la peptona) debe estar exenta de cualquier hidrato de carbono que puede fermentarse.

3.Se recomienda que el medio con hidratos de carbono no contenga nitrato, el que puede interferir con l a producción de gas.

4.Se recomienda evitar el agregado de extracto de levadura, suero o líquido ascítico al medio de hidratos de carbono. Sin embargo, el

agregado líquido ascítico se recomienda para determinar el perfil de determinación de especies de Neisseria. El agregado extracto de

levadura es optativo (se suelen obtener resultados idénticos con o sin el extracto).

5.El medio con hidratos de carbono, cuando se calienta o se retira de la autoclave, posee un color anaranjado suave. Esto cambia al

naranja-rojo cuando se enfría.6.Se debe tener cuidado cuando se interpretan la pruebas de

hidratos de carbono, ya que el color que denota la fermentación

varia de acuerdo con el indicador de pH utilizado en el medio.

7.Evitar el exceso de agregado de NaOH y obtener un color rojo oscuro; estos medios pueden ser demasiado alcalinos para que

ocurra la verdadera fermentación dentro del periodo de incubación habitual.

8.Flamear la aguja o el ansa antes de reentrar en el cultivo de crecimiento. Si se utiliza un hisopo, se necesita uno nuevo para cada

reentrada al cultivo de crecimiento.9.Todos los hidratos de carbono deben rotularse de manera

apropiada inmediatamente después de la preparación y colocarlos en cierto orden en la gradilla.

10. Por fines prácticos en la realización del catalogo A se uso en vez de que significa que hay tanto, acidez como producción de gas.

11. Se recomienda utilizar un medio con un contenido reducido de fosfatos (0.08%) y con rojo de fenol como indicador de pH a una

concentración de 0.0072%, el que da un pH de 7.5-7.6. Estas concentraciones para los miembro de la familia Enterobacteriaceae.

12. La acidez viable se alcanza a diferentes lecturas de pH, dependiendo del indicador utilizado, consultar referencias de

indicadores.13.Muchos anaerobios decoloran los indicadores; para evitar esta

posibilidad, puede agregarse el indicador después de la incubación.14.La producción de gas puede provenir de la degradación de

proteínas y no por la utilización de hidratos de carbonos.

15.Los ácidos producidos por bacterias no fermentadoras son considerablemente más débiles que los producidos por las

fermentadoras.16.Se recomienda evaluar todos los aislamientos desconocidos de

bacilos gramnegativos de oxidación/fermentación por la inoculación de KIA o TSI.

Universidad de Guadalajara

Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías

Departamento de Farmacobiología

Licenciatura en Químico Farmacobiólogo

Microbiología I

Profesora: NancI Edid Martínez Gonzales

Alumno: Luis Enrique Lomelí Santillán

Tarea: Catalogo Pruebas Bioquímicas para la

Identificación de bacterias

BIBLIOGRAFÍA

Libro: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica 3ra Edición

Autor:  Jean F. Mac FaddinEditorial: panamericana

Año: 2003 págs.: 92-96, 160-172, 206-217, 223-236, 301-306

http://books.google.com.mx/books?id=FYWSzy7EjR0C&pg=PA301&lpg=PA301&dq=pruebas+bioquimicas+rojo+de+metilo&source=bl&ots=RMMJVfMcSt&sig=mrudbjBaUHB2jHVDHkToaV3GfFI&hl=es&sa=X&ei=L2WCT5jlAqnW2wX66M3_Bg&sqi=2&ved=

0CEIQ6AEwBA#v=onepage&q=pruebas%20bioquimicas%20rojo%20de%20metilo&f=false El

21/04/12

ÍNDICE

Prueba fermentación de carbohidratos 3

Prueba de Citrato 15

Pruebas de decarboxilasas 21(lisina-arginina-ornitina) y

prueba de dihidrolasa (arginina)

Prueba de licuefacción de gelatina 29

Prueba de ácido sulfhídrico 37

Prueba de indol 45

Prueba de rojo de metilo 51

Prueba de movilidad 55

Pruebas de reducción de nitratos a nitritos} 61

Prueba de oxidasa 69

Prueba de oxidación-fermentación 77

Prueba de fenilalanina desaminasa 87

Prueba de hidrólisis del almidón 94