mobilità di proteine via nmr

Mobilità di Proteine Mobilità di Proteine via NMRvia NMR

Strutturata/Destrutturata

Moti Catene Laterali

NHH NDD

Velocità di Scambio

Moti Veloci

NOE eteronuclear NOE eteronuclear Rilassamento TRilassamento T1 1 e Te T22..

Simulazioni DMSimulazioni DM

Moti Molecolarir

c

Fenomeni Proteine e Scale Fenomeni Proteine e Scale di Tempodi Tempo

-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)

Cambiamenti Conformazionali

Esperimenti CPMG e Esperimenti CPMG e TT11

Scambio di H2O

Misure NMRDMisure NMRD

RilassamentoRilassamento

Il rilassamentorilassamento è il processo con cui, un sistema che è stato eccitatoeccitato

(oppure ha subito una perturbazione) va di nuovo ad equilibrioequilibrio...

Rilassamento Rilassamento 1515NN

Il rilassamentorilassamento è causato dai campicampi magnetici oscillantioscillanti percepiti dal

nucleo.

Le interazioni, dovute a mobilità, che possono creare campi magnetici oscillanti sul nucleo 15N sono:

Interazione Dipolare Dipolare 11H-H-1515NN. 1515N CSA N CSA ((Chemical Shift AnisotropyChemical Shift Anisotropy)). Altri:: Quadrupolare, scalare Quadrupolare, scalare......

In una proteina isotopicamente arricchita in 15N, ogni spin 15N è vicino sia a spin 1H che 15N.

Poiché l’interazione si esercita attraverso r-3, e poiché per ogni 15N lo spin di gran lunga piu’ vicino è il suo HN ammidico, l’interazione diopolare H, HN è preponderante rispetto a tutte le altre interazioni dipolari, che possono essere in prima approssimazione trascurate.

Quando una proteina in soluzione ruota, ciascun spin sente tutti gli altri come un campo fluttuante, che per effetto della rotazione della molecola si ri-orienta in continuazione rispetto allo spin studiato, creando quindi un campo magnetico oscillante

Campi Magnetici OscillantiCampi Magnetici Oscillanti

Interazione Dipolare Interazione Dipolare 11H-H-1515NNLa rotazionerotazione della molecola in della molecola in

soluzionesoluzione genera dei campi magnetici oscillanti intorno al

nucleo. Questi campi forniscono un

meccanismo di rilassamentomeccanismo di rilassamento al núcleo.

BB

00

NNSSHH

II

Anisotropia dello Anisotropia dello Spostamento Chimico Spostamento Chimico ((CSACSA))

Interazione Interazione 1515N-CSAN-CSA

xx y y

zz

BBoo

XX

BBeffeff == (1- (1-) ) BBoo == schermatura schermatura ee- -

Se la distribuzionedistribuzione della carica elettronica è anisotropaanisotropa, la schermaturaschermatura sarà anisotropaanisotropa. In soluzione si ottiene un valore valore promediopromedio dovuto alla barillatura molecolare veloce:

== ( (xx xx + + yyyy + + zzzz))//33

CSACSA:: La rotazione molecolare genera campi magnetici oscillanti che rapressentano un meccanismo di rilassamento per il nucleo osservato.

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Proteinein Proteine

Se il rilassamento di ogni rilassamento di ogni 1515N amidicoN amidico è determinato essenzialmente dall’accoppiamentoaccoppiamento dipolare H-NH-N e dalla

anisotropia dello Spostamento Chimicoanisotropia dello Spostamento Chimico di 1515NN, ALLORA, le velocità di rilassamento di 15N dovrebbero essere ugualiuguali per tutti

gli n 15N amidici di una catena polipeptidica di n aminoacidi.

Distanza di legame

HH NN

CC

CC

OO

HH

1.021.02 ÅÅUguale per tutti

Struttura elettronica intorno a N

Uguale per tutti

Funzione di CorrelazioneFunzione di Correlazione

La Funzione di Correlazione, Funzione di Correlazione, C(t)C(t),, definisce il tempo che impiega un sistema per

reorientarsireorientarsi.Per una sfera rigida, C(t)C(t) si caratterizza per il

Tempo di CorrelazioneTempo di Correlazione.

Tempo di CorrelazioneTempo di Correlazione

Il Tempo di CorrelazioneTempo di Correlazione, cc, è la costante di tempo per il decadimento esponenziale della

Funzione di CorrelazioneFunzione di Correlazione.

C (t)C (t)

tempo (ns)tempo (ns)

cc corti fanno diminuire rapidamente C(t)C(t).

Funzione di Densità Funzione di Densità SpettraleSpettrale

FTFT

Frequenze (MHz)Frequenze (MHz)

J(J()/10)/10-9-9

La Funzione di Densità SpettraleFunzione di Densità Spettrale, JJ(()), rappresenta la distribuzione di frequenze generata per le

oscillazioni del sistema. Spiega il moto aleatoriomoto aleatorio.cc lunghi corrispondono ad alte densità spettrali in un intervallo stretto di frequenze.

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N e Meccanismie Meccanismi

Le velocitàvelocità di rilassamento derivano dalla sommesomme di tutte le densità spettralidensità spettrali. Nel caso di 15N esse

dipendono da 3 frequenze tipiche del sistema (0, N, H).

J(0), J(N), J(H)

Intervengono su R1 ed R2 ma anche sul NOE eteronucleare tra 1H e 15N.

MisurandoMisurando RR11, RR22 ed NOENOE, io ho 3 equazioni dalla cui analisi posso ricavare il valore esatto

del cc

Equazione Stokes-EinsteinEquazione Stokes-Einstein

kT

rr 3

4 3

Il Tempo di Correlazione, Tempo di Correlazione, ,, corrisponde al Tempo Rotazionale Browniano, Tempo Rotazionale Browniano, rr,, de

molecule in soluzione seccondo l’equazione di Stokes-EinsteinStokes-Einstein.

• TT:: Temperatura.• rr:: Radio della Proteina.• :: Viscosità del Solvente.

cc non è lo stesso per Tutti non è lo stesso per Tutti

C-terminalN-terminal

Sito I

Sito II

cc==4.5 ns4.5 ns cc==10.4 10.4 nsns

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N e Meccanismie Meccanismi

Le velocitàvelocità di rilassamento derivano dalla sommesomme di tutte le densità spettralidensità spettrali. Nel caso di 15N esse

dipendono da 3 frequenze tipiche del sistema (0, N, H).

J(0), J(N), J(H)

Intervengono su R1 ed R2 ma anche sul NOE eteronucleare tra 1H e 15N.

MisurandoMisurando RR11, RR22 ed NOENOE, io ho 3 equazioni dalla cui analisi posso ricavare il valore esatto

del cc

Interazione Dipolare Interazione Dipolare 11H-H-1515NNLa rotazionerotazione della molecola in della molecola in

soluzionesoluzione genera dei campi magnetici oscillanti intorno al

nucleo. Questi campi forniscono un

meccanismo di rilassamentomeccanismo di rilassamento al núcleo.

BB

00

NNSSHH

II

Interazione Interazione 1515N-CSAN-CSA

xx y y

zz

BBoo

XX

BBeffeff == (1- (1-) ) BBoo == schermatura schermatura ee- -

Se la distribuzionedistribuzione della carica elettronica è anisotropaanisotropa, la schermaturaschermatura sarà anisotropaanisotropa. In soluzione si ottiene un valore valore promediopromedio dovuto alla barillatura molecolare veloce:

== ( (xx xx + + yyyy + + zzzz))//33

CSACSA:: La rotazione molecolare genera campi magnetici oscillanti che rapressentano un meccanismo di rilassamento per il nucleo osservato.

Misura della Velocità di Misura della Velocità di Rilassamento Rilassamento 1515NN

100

110

120

130

12 11 10 9 8 7 6 5

15N (p

pm

)

1H (ppm)

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Calbindin Din Calbindin D9K9K

0 10 20 30 40 50 60 700.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

R1

(s-1)

Residue Number

0 10 20 30 40 50 60 700

2

4

6

8

10

12

14

16

18

R2(

s-1)

Residue Number

0 10 20 30 40 50 60 700

1

2

3

4

5

6

R2/

R1

Residue Number

A

C

B

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Rusticianinain Rusticianina

A

C

BR

1(s

)-1

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 20 40 60 80 100 120 140

R 2(s

)- 1

0

10

20

30

40

50

0 20 40 60 80 100 120 140

Número de Residuo

115

H-

N N

OE

-0.4

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 20 40 60 80 100 120 140

Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Citocromo bin Citocromo b55 Ossidato Ossidato

R2

R1

NOE

Moti in Scala ns-ps del Moti in Scala ns-ps del Citocromo bCitocromo b55 (Fe (Fe3+3+))

Aumenta Aumenta MobilitàMobilità

Moti in Scala ns-ps del Moti in Scala ns-ps del Citocromo bCitocromo b55 (Fe (Fe2+2+))

Aumenta Aumenta MobilitàMobilità

Model FreeModel Free

• SS:: Parametro di Ordine • ’’ee:: Tempo di Correlazione Effetivo

• mm:: Tempo di Correlazione Rotazionale

• ee:: Tempo di Correlazione per Moti Interni

Se SSe S2 2 < 1 c’è mobilità locale< 1 c’è mobilità localeSe SSe S2 2 = 1 è rigido rispetto al sistema = 1 è rigido rispetto al sistema molecolaremolecolare

Lipari and Szabo, Lipari and Szabo, JACS JACS 19821982

log(log())

J(J())

t’t’ee

ttmmx S2

x (1-S2)

Oscillazioni in un ConoOscillazioni in un Cono

Rex

D||

D

e

1-S2

r

Il Parametro di Ordine SS22 viene dato da:

S2 = [cos(1+cos) / 2]2

Oscillazioni in un ConoOscillazioni in un Cono

Le Velocità di Rilassamento RR11 e RR22 si analizzano via el metodo Model FreeModel Free per

ottenere informazione sui moti internimoti interni che avvengono a scale di tempi inferiori a nsinferiori a ns e

pure sulla rotazione molecolarerotazione molecolare.

Parametro di Ordine in Parametro di Ordine in Calbindin DCalbindin D9K9K

10 20 30 40 50 60 700.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0S

2

Residue Number

Parametro di Ordine in Parametro di Ordine in RusticianinaRusticianina

S2

Numero di Residuo0 20 40 60 80 100 120 140

Moti Interni a Diverse Scale Moti Interni a Diverse Scale di Tempodi Tempo

t e(s)

R (s)ex -1

Número de Residuo

0

40

80

120

160

0 20 40 60 80 100 120 140

0

10

20

30

Numero di Residuo

e (

s)

Rex (s

-1)



NHH NDD


Moti Veloci



Moti Molecolarir

c


-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)



Scambio di H2O


Misura di RMisura di R22 CPMGCPMG

n

90°x180°y

180°y

M()=M0[e- /T2]

=2, 4, 6….

0

0,25

0,5

0,75

1

0 200 400 600 800 1000

T2=80ms

Se variando si ottiene un valore diverso per R2, significa che c’è un fenomeno di scambiofenomeno di scambio che agisce su una scala di tempo

dell’ordine di ordine di

è tipicamente tra 0,5 e 2ms.

Misura di RMisura di R22 CPMGCPMG

n

90°x180°y

180°y

M()=M0[e- /T2]

=2, 4, 6….

0

0,25

0,5

0,75

1

0 200 400 600 800 1000

T2=80ms

Se ci sono dei valori di R2 che nonnon sono interpretabili semplicemente ricorrendo alla analisi del model free, allora siamo in presenza di

uno scambio più lento rispetto alla scalapiù lento rispetto alla scala del r

RR22== R R22 ++ R Rexcexc

RR22 ((1/1/cpcp)) in Ca in Ca22CbCb

GdmHCl 0 MGdmHCl 0 M GdmHCl 2 MGdmHCl 2 M

• Mobilità ms-s.

• Andamento Simile.

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

0 10 20 30 40 50 60 70

R2 (

s-1)

R2 (

s-1)

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

0 10 20 30 40 50 60 70

Residue Number

• Nessun Cambiamento nel Cuore.



NHH NDD


Moti Veloci



Moti Molecolarir

c


-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)



Scambio di H2O


100

110

120

130

12 11 10 9 8 7 6 5

15N

(p

pm

)

0 M0 M100

110

120

130

12 11 10 9 8 7 6 5

2 M2 M100

110

120

130

12 11 10 9 8 7 6 5

1H (ppm)

3.5 M3.5 M

1H (ppm) 1H (ppm)

Destrutturazione di Apo-Destrutturazione di Apo-CbCb



NHH NDD


Moti Veloci



Moti Molecolarir

c


-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)



Scambio di H2O


Scambio HN-Scambio HN-SolventeSolvente



NHH NDD


Moti Veloci



Moti Molecolarir

c


-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)



Scambio di H2O


100

110

120

130

12 11 10 9 8 7 6 5

15N

( ppm

)

1H (ppm)

cleanexcleanex100

110

120

130

12 11 10 9 8 7 6 5

1H (ppm)

phogsyphogsy

HH22O StrutturaleO Strutturale

mobilità di proteine via nmr

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