manual inmuno 2a version

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FACULTAD DE QUÍMICA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

SECCIÓN DE BIOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS LABORATORIO DE

INMUNOLOGÍA GENERAL

Saturnino de León Chapa Magdalena Acosta Segura Patricia Elvira Berrón Ruíz Rodolfo Pastelín Palacios Rosana Pelayo Camacho Fernando García Tamayo

Junio de 2003

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PRÓLOGO

Inmunología General representa una de las asignaturas teórico-prácticas que resultan trascendentales para los estudiantes de la carrera de Química Farmacéutico-Biológica, por cuanto que sienta las bases de una formación sólida que permite el adecuado desempeño en el campo de la salud, a través del uso y/o el diseño de metodologías diagnósticas, preventivas y terapéuticas que incluyen elevados índices de confiabilidad, sensibilidad y especificidad. Si bien se trata de una disciplina en la que los avances científicos progresan a ritmos especialmente acelerados, el curso práctico de esta materia cubre con evidente eficacia su objetivo general de enseñar las técnicas y fundamentos “claves”. Esto último se refleja claramente en el hecho de que los alumnos mantienen un creciente interés por conocer y profundizar en relación con los nuevos hallazgos, aspecto esencial para lograr su permanente actualización. El presente manual contiene los principales fundamentos y técnicas asociados a los ejercicios que se realizan hoy en día en el laboratorio de Inmunología General, lo que sin duda representará un gran apoyo para los estudiantes. Lógicamente, como cualquier texto sobre Inmunología, éste es perfectible y deberá ser modificado y ajustado continuamente, tal como lo han afirmado en forma reiterada los docentes del curso. Expreso mi mayor reconocimiento a los autores de esta gran obra, los profesores Saturnino de León Chapa, Patricia E. Barrón Ruiz, Rosana Pelayo Camacho, Magdalena Acosta Segura, Fernando García Tamayo y Rodolfo Pastelín Palacios, y dicha manifestación de respeto académico también la hago extensiva a los profesores Ma. Guadalupe Reyes García, Luisa Constanza del R. Cervantes Barragán, Marco Velasco Velázquez y Constantino III R. López Macías quienes, mostrando un ejemplar espíritu de equipo, contribuyeron con los autores realizando diversas y muy valiosas aportaciones. Raúl Garza Velasco

Jefe del Departamento de Biología

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Í N D I C E

UNIDAD 1. INMUNÓGENOS, ANTÍGENOS E INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE

1. Preparación de inmunógenos y antígenos. 4 I. Extracto de tejido muscular o proteínas plasmáticas de origen 6 humano, equino, bovino, porcino, de pollo, de perro, etc. II. Proteínas purificadas. 9 Albúmina y γ-globulina humana III. Preparación de antígenos e inmunógenos celulares. 11 Glóbulos rojos de carnero. IV. Preparación de antígenos e inmunógenos bacterianos. 13 Antígenos OK-L de Escherichia coli. Antígenos de Shigella dysenteriae. Antígenos totales de B. abortus. Antígeno somático (O) de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). Antígeno flagelar (H) de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). 2. Inmunización de animales de laboratorio. 21 Sueros antiespecie. Sueros anti-proteínas purificadas. Suero anti-eritrocitos de carnero (Amboceptor hemolítico anti-carnero). Sueros antibacterianos. UNIDAD 2. INTERACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO (Ag-Ac) INMUNOPRECIPITACION 28 3. Curva de precipitación cuantitativa en capilar. 33 4. Mezcla de antígeno y anticuerpo. 36 Prueba de Identidad a sueros de uso terapéutico. Determinación del origen de manchas de sangre. 5. Doble difusión en placa (Ouchterlony) 38 Identificación de fracciones antigénicas presentes en suero humano. 6. Inmunodifusión radial simple (RID). (Mancini, Carbonara y Hermans) 41 Cuantificación de albúmina sérica humana (ASH). 7. Inmunoelectroforesis (IEF). (Grabar y Williams) 44 Análisis de proteínas en Suero Humano. UNIDAD 3. REACCIONES DE AGLUTINACIÓN AGLUTINACIÓN DIRECTA E INDIRECTA 47

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8. Aglutinación en placa. 49 Titulación de sueros anti-bacterianos 9. Aglutinación en tubo. 52 Tipificación de grupo sanguíneo ABO y Rh. 10. Hemaglutinación Indirecta. 55 Titulación de anticuerpos frente a tiroglobulina. UNIDAD 4. CITÓLISIS INMUNE REACCIONES DE CITÓLISIS 60 11. Titulación de Amboceptor Hemolítico Anticarnero. 62 UNIDAD 5. TÉCNICAS CON ANTICUERPOS MARCADOS INMUNOFLUORESCENCIA, RADIOINMUNOANÁLISIS, 65 INMUNOENZIMÁTICOS 12. Ensayo inmunoenzimático 67 UNIDAD 6. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS MÉTODOS DE PURIFICACION DE ANTICUERPOS 70 13. Purificación fraccionada con sales neutras. 73 Purificación de γ-globulinas a partir de plasma humano. ANEXO I. TÉCNICAS DE APOYO 76 A. Coagulación de plasma B. Determinación de proteínas. Método de Biuret C. Curva de Mc Farland D. Preparación de suspensiones de eritrocitos de carnero E. Manejo y desecho de material biológico potencialmente infeccioso ANEXO II. PREPARACIÓN DE REACTIVOS 82 BIBLIOGRAFÍA 86

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UNIDAD 1

PRÁCTICA No. 1 PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS Y ANTÍGENOS.

GENERALIDADES Anteriormente el término antígeno era utilizado para denominar a todos aquellos agentes capaces de estimular una respuesta inmune y además de interaccionar con los productos de ésta (anticuerpos y linfocitos T sensibilizados). Actualmente, se ha establecido que una sustancia puede o no tener dos propiedades diferentes, una la inmunogenicidad y otra la antigenicidad. Por tanto, se considera inmunógeno a toda sustancia capaz de inducir respuesta inmune al ser introducido a un individuo inmunocompetente. Estas sustancias deben reunir ciertos requisitos para actuar como tales, entre estas características se pueden mencionar: - Ser reconocidas como extrañas por el animal inmunizado, - Su peso molecular, que generalmente es mayor a 10 kDa, - De naturaleza química proteica o polisacárida, - La rigidez estructural, - La complejidad molecular, - El volumen molecular, - El contenido de grupos cargados y configuración - Su difusibilidad El concepto antígeno designa únicamente a aquella sustancia que reacciona con sus anticuerpos específicos. Existen ciertas sustancias llamadas haptenos, que no reúnen todas las condiciones de inmunogenicidad, que por sí solas no inducen la respuesta inmune, pero si lo hacen cuando son conjugadas a una proteína acarreadora (complejo hapténico). La respuesta inmune de un animal a un inmunógeno puede ser un fenómeno totalmente natural, como sucede en el caso de infecciones causadas por microorganismos, en estados de hipersensibilidad a distintos elementos del medio ambiente, en las enfermedades autoinmunes o en aquellas ocasiones en que son generadas para rechazar a una neoplasia. Pero también la respuesta inmune puede ser inducida artificialmente en un individuo mediante la aplicación del inmunógeno, como sucede en las vacunaciones, en la hipersensibilidad a fármacos, en transplantes o a nivel laboratorio en animales de experimentación con diferentes fines tanto de investigación como de producción de sueros inmunes.

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En muchos de estos casos se requiere contar con los inmunógenos preparados adecuadamente y un esquema de inmunización ideal para lograr inducir la respuesta inmune. Entre los inmunógenos y antígenos de mayor interés están: • Bacterias • Virus • Hongos • Parásitos • Proteínas u otros componentes purificados a partir de estos organismos como

las toxinas (toxoides). • Sueros heterólogos • Proteínas animales heterólogas purificadas • Extractos vegetales • Proteínas vegetales purificadas. • Células animales o vegetales • Componentes de células animales o vegetales purificadas • Complejos hapténicos Las aplicaciones que tiene el conocimiento de la preparación de estos productos biológicos es muy variada, de las cuales podemos mencionar: Como antígenos: ⇒ Antígenos de bacterias, hongos, parásitos y virus para la determinación de

anticuerpos en suero, líquido cefalorraquídeo, etc.; para el diagnóstico de enfermedades causadas por estos organismos.

⇒ Para el estudio de la composición antigénica de microorganismos. ⇒ En la investigación de reacciones cruzadas entre individuos de diferente

especie. ⇒ En la determinación de estructura, localización de determinantes antigénicos

(epítopos), etc. Como inmunógenos: ⇒ Producción de vacunas, ya sea constituidas por microorganismos completos o

por fracciones de estos, tanto para uso humano o veterinario. ⇒ Obtención de sueros inmunes para uso diagnóstico. ⇒ Preparación de sueros inmunes para uso terapéutico. ⇒ Producción de sueros inmunes utilizados en control de alimentos y bebidas. ⇒ Obtención de sueros inmunes de uso en Química Legal. ⇒ En investigación para el estudio de la respuesta inmune El objetivo de esta unidad es que el alumno vea ejemplificada la preparación de antígenos e inmunógenos de diferente naturaleza.

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I. EXTRACTO DE TEJIDO MUSCULAR O PROTEINAS PLASMÁTICAS DE ORIGEN HUMANO, EQUINO, BOVINO, PORCINO, DE POLLO, DE PERRO, ETC.

MARCO TEÓRICO Los extractos de tejidos o las proteínas plasmáticas de animales son excelentes inmunógenos cuando son inyectados en otro individuo taxonómicamente alejado, por lo que son utilizados en la inmunización de animales de laboratorio para obtener sueros inmunes denominados antiespecie que pueden ser aplicados en el campo del control de alimentos para determinar de que especie proceden las carnes y sus derivados, en Química Forense para establecer el origen de una mancha de sangre, en diagnóstico para el análisis de proteínas o bien en las pruebas de identidad de sueros de uso terapéutico. En el presente ejercicio se van a preparar extractos de tejido muscular o bien suero, estériles que posteriormente serán utilizados en la inmunización de conejos para obtener el correspondiente suero antiespecie. I.1.1 PREPARACIÓN DE UN EXTRACTO DE TEJIDO MATERIAL 1 Embudo de 6 cm de diámetro con tres capas de gasa. 2 Pipetas de 10 mL (1/10) 1 Disco de papel filtro de poro grueso (10 cm diám.) 1 Tijeras de punta recta. 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL. 1 Bisturí. 1 Balanza granataria. 1 Licuadora con vaso de 250-500 mL. 40 g Tejido muscular de equino, pollo, perro, bovino, etc. 60 mL Solución salina isotónica (SSI). TÉCNICA 1. Eliminar toda la grasa y aponeurosis del trozo de tejido muscular y cortarlo

en fragmentos de 0.5 a 1.0 cm. 2. Pesar el tejido y pasarlo al vaso de la licuadora. Agregar SSI a tener una

proporción de 1:2 (p/v) y triturar hasta que el tejido esté perfectamente homogeneizado.

3. Pasar el tejido triturado al matraz Erlenmeyer y dejarlo en refrigeración durante toda la noche para extraer la mayor cantidad de proteínas.

4. Filtrar a través de tres capas de gasa para eliminar las partículas gruesas y en seguida por papel de poro grueso.

5. Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret. 6. Esterilizar por filtración. (Ver I.2, pag. 4).

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I.1.2 PREPARACIÓN DE UN SUERO HETERÓLOGO MATERIAL 1 Jeringa de 20 mL estéril. 1 Aguja hipodérmica del No. 17 de 3” estéril. 1 Aplicador de madera 2 Tubos de centrífuga de 50 mL de plástico. 1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL. 1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo (propipeta). 40 mL Sangre de humano, equino, bovino, porcino, etc. 60 mL Solución salina isotónica (SSI). TÉCNICA 1. Tomar por punción venosa 40 mL de sangre ya sea de perro, caballo,

burro, cerdo, etc. y colocar 20 mL en cada uno de los tubos de centrífuga. 2. Dejar coagular la sangre y con un aplicador de madera separar el coágulo

de las paredes del tubo. Centrifugar 30 minutos a 3000 r.p.m. 3. Mediante la pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el sobrenadante y

pasarlo al matraz Erlenmeyer. 4. Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret. 5. Esterilizar por filtración. (Ver I.2, pag. 7). NOTA: Si en lugar de suero se utiliza plasma, es necesario coagularlo con

CaCl2 como se describe en el anexo I.A, para evitar la formación de redes de fibrina que interfieran durante la filtración.

I.2 ESTERILIZACIÓN DEL EXTRACTO DE TEJIDO O DEL SUERO MATERIAL 1 Equipo para filtración estéril. Constituido por: Filtro Seitz, matraz Kitasato

de 500 mL, manguera para vacío de 50 cm, material filtrante EKS-1 y manguera de látex de 10 cm.

2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido. 2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados. 2 Pipetas de 10 mL (1/10) estériles. 2 Pipetas de 1.0 mL (1/10) estériles. 2 Frascos tipo “vial” de 10 mL con tapón estériles. 2 Mecheros 9 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril. TÉCNICA 1. Esterilizar el extracto de tejido o el suero por filtración en filtro Seitz,

aplicando vacío ligero para que no se forme espuma. 2. En condiciones de esterilidad, pasar 1.0 mL del filtrado a uno de los

frascos “vial” y el resto en el segundo frasco. 3. Adicionar al primer frasco 9.0 mL de SSI estéril y mezclar (dilución 1:10).

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4. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana a cada producto sembrando 0.1 mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana.

5. Etiquetar y guardar el extracto o suero diluido y el concentrado en refrigeración hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.

NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E.

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II. PREPARACIÓN DE PROTEINAS PURIFICADAS ALBÚMINA SÉRICA HUMANA Ó γ GLOBULINA HUMANA MARCO TEÓRICO La mayoría de las proteínas animales y vegetales cumplen con los requisitos de inmunogenicidad y por tanto se pueden utilizar como inmunógenos en su forma nativa, pero si se desea tener mayor especificidad en la respuesta inmunológica, es necesario purificarlas. Los métodos de purificación dependen de las propiedades fisicoquímicas de cada una de las proteínas tales como su solubilidad, peso molecular, tamaño, carga eléctrica, pI, etc., en la siguiente tabla se ejemplifican algunos de ellos:

BASADOS EN: MÉTODO Diferencias de solubilidad:

• Precipitación con sales neutras • Precipitación con metales pesados • Precipitación con solventes orgánicos • Precipitación con ácidos o bases (pI)

Diferencias en carga eléctrica:

• Electroforesis • Cromatografía de intercambio iónico

Diferencias en PM y tamaño:

• Permeación molecular • Ultracentrifugación en gradiente

Estas prácticas se llevarán a cabo a partir de proteínas purificadas comerciales y el ejercicio consistirá en la preparación de soluciones estériles de éstas con la concentración necesaria para la inmunización de conejos, para obtener los correspondientes anticuerpos. MATERIAL 2 Tubos de 16 X 150 estériles 2 Pipetas de 10 mL (1/10) estériles 4 Pipetas de 1 mL (1/10) estériles 2 Frascos tipo “vial” de 12 mL c/tapón estériles 2 Tubos de 16 x 150 mm con tioglicolato fluido. 2 Tubos de 16 x 150 mm con agar Sabouraud inclinados. 0.3 mL Albúmina sérica humana (ASH) comercial de 25% ó γ globulina humana

al 1% estériles. 25 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril TÉCNICA TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD 1. A partir de una solución comercial estéril de albúmina sérica humana

(ASH) ó de γ globulina humana purificadas cuya concentración es de 25 g/100 mL ó 1 g/100 mL preparar dos diluciones con solución salina isotónica estéril:

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Para ASH: 1:50 para tener una concentración de 5 mg/mL

1:250 para tener una concentración de 1 mg/mL Para γ globulina humana: 1:2 para tener una concentración de 5 mg/mL 1:10 para tener una concentración de 1 mg/mL 2. Determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret. 3. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana sembrando 0.1

mL en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana.

4. Etiquetar y guardar en refrigeración hasta su empleo. Desechar cuando se observe turbidez, ya que esto indica que hay desarrollo de contaminantes bacterianos.



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III. PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INMUNÓGENOS CELULARES GLÓBULOS ROJOS DE CARNERO MARCO TEÓRICO Las células de origen animal o vegetal constituyen verdaderos mosaicos antigénicos debido a la compleja composición de sus organelos. La preparación de antígenos e inmunógenos celulares tiene varias aplicaciones, entre las que se puede mencionar la producción de anticuerpos específicos usados como reactivos para la identificación de alguna población específica de células como en el caso de la tipificación sanguínea y la determinación de moléculas de histocompatibilidad HLA (antígenos de los leucocitos humanos), pero también se han utilizado para la investigación de marcadores y receptores celulares. Para estas aplicaciones, la elaboración de anticuerpos monoclonales ha cobrado mayor importancia. En esta sección se ejemplifica la preparación de antígenos celulares con la obtención de eritrocitos de carnero lavados para su utilización inmediata en la inmunización de conejos para así obtener el correspondiente suero inmune. MATERIAL 1 Jeringa de 10 mL con aguja No. 20 estéril 2 Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL c/tapón estériles 1 Pipeta de 1 mL (1/10) estéril 1 Pipeta de 5 mL (1/10) estéril 2 Pipeta de 10 mL (1/10) estéril 1 Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado

con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm.

1 Bulbo para pipeta 1 Frasco tipo “vial” de 10 mL con tapón estériles 2 Mecheros Centrífuga con cabezal para tubos de 15 mL 3 mL Solución de Alsever estéril 100 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril TÉCNICA TODO EL PROCESO SE REALIZA EN CONDICIONES DE ESTERILIDAD 1. Llenar la jeringa con 3 mL de la solución de Alsever estéril y puncionar la

vena yugular de un carnero y tomar 3 mL de sangre. 2. Quitar la aguja de la jeringa y vaciar la mezcla sangre-Alsever a un tubo

de centrífuga cónico de 15 mL estéril dejándola resbalar por las paredes. Tapar el tubo.

3. Centrifugar durante 15 min a 2500 rpm. 4. Eliminar el sobrenadante utilizando el equipo de succión y la pipeta de 10

mL estéril.

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5. Lavar el paquete de eritrocitos 5 veces de la siguiente manera: Agregar 10 mL de SSI estéril, resuspender los glóbulos rojos perfectamente con una pipeta estéril adaptada con un bulbo. Tapar y centrifugar 10 min a 2500 rpm. Eliminar completamente el sobrenadante mediante el equipo de succión.

6. Al término de los lavados, tomar 1.5 mL de paquete de eritrocitos con una pipeta estéril y pasarlos al frasco “vial” estéril.

7. Agregar 13.5 mL de SSI estéril para tener una suspensión al 10%, que es como se va a utilizar para la inmunización del conejo. Tapar el frasco.

8. Esta suspensión deberá conservarse en refrigeración, entre 4 y 6 °C hasta el momento de emplearse y solo puede usarse durante 4 días, ya que el envejecimiento desnaturaliza a los antígenos presentes en los eritrocitos.



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IV. PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS E INMUNÓGENOS BACTERIANOS Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Brucella abortus, Salmonella

9,12,d,Vi (serotipo Typhi). MARCO TEÓRICO Las bacterias están constituidas por un gran número de fracciones antigénicas diferentes, de aquí que se pueda utilizar como antígenos o inmunógenos tanto las células íntegras o sus fracciones aisladas; ya sea componentes somáticos, flagelares o capsulares, dependiendo del tipo de bacterias. Otras veces se utilizan los productos del metabolismo de estos microorganismos como son las toxinas. No todas las bacterias tienen una estructura antigénica similar. En algunas hay predominio de componentes proteicos, en otras los carbohidratos constituyen los Ag que permiten su diferenciación; y en algunos casos particulares son fosfoglucolípidos complejos. Para ejemplificar la complejidad del mosaico antigénico de las bacterias se mencionarán las características de los principales antígenos de las enterobacterias: Antígenos somáticos u “O”: Son lipopolisacáridos que se encuentran formando parte de la pared celular bacteriana, resisten temperaturas de 100°C por tiempos prolongados y no se destruyen con alcohol, ni con ácidos diluidos. Corresponden a la endotoxina de muchas enterobacterias entre ellas Salmonella y su especificidad antigénica reside en la parte oligosacárida. Antígenos flagelares o “H”: Son componentes de naturaleza proteica localizados en los flagelos de las bacterias, lábiles a temperaturas mayores de 60°C y al tratamiento con alcohol o ácido. Antígeno de virulencia o “Vi”: Es también superficial, de naturaleza glucolipídica y difiere químicamente del antígeno somático “O”, se encuentra en algunas especies del género Salmonella y en otras enterobacterias, es termolábil. Antígenos capsulares o “K”: Se encuentran en las envolturas o cápsulas de algunas bacterias, generalmente de naturaleza polisacárida que tienen secuencias repetidas de dos o tres azúcares, son termorresistentes. Dentro de las aplicaciones más importantes de los antígenos bacterianos está la determinación cuali y semicuantitativa de anticuerpos en muestras de suero humano en el diagnóstico de infecciones bacterianas y la titulación de sueros hiperinmunes de animales inmunizados, mediante reacciones antígeno-anticuerpo. Como inmunógenos, estas preparaciones son utilizadas en la formulación de vacunas tanto de uso humano como veterinario, así como en la inoculación de animales de laboratorio para la obtención de sueros inmunes cuya aplicación es

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amplia en la identificación de bacterias, tanto en muestras biológicas de origen humano para diagnóstico, como en el control microbiológico de alimentos y productos farmacéuticos. Durante la preparación de antígenos bacterianos es importante conocer el fenómeno llamado variación antigénica el cual implica la pérdida de antígenos o cambios en la especificidad debido a envejecimiento del cultivo, infección por bacteriófagos o a otros factores que son lesivos para las bacterias. Además, cuando se trabaja con bacterias y en general con microorganismos se debe tener en cuenta que existe antigenicidad cruzada entre especies diferentes, hecho que cobra importancia cuando se hace tipificación bacteriana o cuando se obtienen sueros antibacterianos que obliga a someterlos a procesos de purificación para aumentar su especificidad. Brevemente, los procedimientos más relevantes para la obtención de estos preparados bacterianos involucran: Contar con una cepa pura de la bacteria, propagarla en medios de cultivo adecuados, que permitan la expresión de los componentes antigénicos de interés, atenuarla (disminución de la virulencia) o inactivarla (perdida de viabilidad) según sea el caso, mediante métodos que eviten la desnaturalización de los componentes antigénicos y, finalmente ajustar a una concentración determinada, que está en relación a su uso. La atenuación de las bacterias puede llevarse a cabo mediante resiembras sucesivas en condiciones poco favorables, aislamiento de los microorganismos de casos de infecciones leves, etc.; mientras que para la inactivación se cuenta con métodos físicos (exposición al calor), químicos (tratamiento con formol o timerosal) o combinaciones de estos; en el caso de las toxinas, son convertidas a toxoides (pierden toxicidad pero no su composición antigénica tratándolas con formaldehído). Durante la producción de un antígeno o inmunógeno bacteriano se deben llevar a cabo una serie de controles que son más o menos rigurosos según sea el destino del biológico preparado, así una vacuna (principalmente de uso humano) requiere de un mayor número y más estrictas pruebas de control, muchas de ellas reglamentadas o bien definidas en las farmacopeas. Estas pruebas de control pueden ser biológicas en donde se incluye: identidad, pureza, inactivación, toxicidad, atoxicidad, esterilidad bacteriana y micótica, inocuidad, potencia, etc.; o bien químicas como: pH, determinación de adyuvantes y conservadores, proteínas totales, cloruros, sólidos totales, humedad residual, solubilidad, etc. En los siguientes ejercicios se describe la preparación de inmunógenos a partir de cepas de, E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y S. typhi que serán utilizados en la inoculación de conejos para la obtención de sueros inmunes antibacterianos.

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E. coli: Tiene Ag “O” que han servido para identificar más de 150 serotipos, además presenta Ag “K” que de acuerdo con su termorresistencia han sido clasificados en: Ag “A” (estables a más de 120°C), Ag “B” (a 100°C pierden su inmunogenicidad pero no su antigenicidad) y Ag “L” (son destruidos a 100 °C). Sh. dysenteriae: No presenta flagelos, por lo tanto no tiene antígenos “H”, sin embargo sus antígenos somáticos “O” tienen un alto poder antigénico y en base a ellos se han descrito varios serotipos de los 4 grupos de Shigella. Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inicialmente el género Salmonella fue clasificado por Kauffman-White en 5 grupos en base a sus antígenos somáticos “O”, que difieren químicamente en cuanto a su composición de azúcares, presencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosídicos alfa y beta. Actualmente esta clasificación se ha completado y se describen 9 grupos denominados A, B, C, D, E, F ,G, H e I en donde se encuentran incluidos más de 1020 serotipos diferentes. Además, algunas cepas de Salmonella son móviles y presentan flagelos y en base a sus antígenos flagelares o “H” se puede hacer una clasificación más precisa de estos microorganismos. B. abortus: Las seis especies del género Brucella son antigénicamente similares, siendo su lipopolisacárido y sus proteínas de membrana externa (PME) los antígenos más importantes. Las PME están clasificadas en tres grupos, considerándose a las del grupo II como porinas.

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IV.1 PROPAGACIÓN DE LAS CEPAS CEPAS: B. abortus E. coli Sh. dysenteriae Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) de gran movilidad para obtención de Ag “H” MEDIOS DE CULTIVO: 1 Medio para el desarrollo de la cepa: Tubo de 16 x 150 mm con 7 mL de

medio. 1 Medio de propagación: matraz Erlenmeyer de 1000 mL conteniendo 350

mL de medio.

CEPA MEDIO PARA EL DESARROLLO DE LA

CEPA

MEDIO DE PROPAGACION

B. abortus Caldo triptosa Agar triptosa E. coli Agar BHI inclinado Agar BHI Sh. dysenteriae Agar BHI inclinado Agar BHI Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag “O”

Veal-infusion Agar Veal-infusion

Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag “H”

Veal-infusion Veal-infusion

MATERIAL 1 Asa bacteriológica 2 Mecheros 1 Juego de colorantes para Gram. 2 Portaobjetos. Microscopio. 15 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril (Exclusivo para E. coli y Sh.

dysenteriae). 500 mL Solución salina isotónica (SSI) formolada al 0.6% estéril. (Exclusivo para

Ag “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)). TÉCNICA IV.1.1 ANTIGENOS OK-L DE Escherichia coli. IV.1.2 ANTIGENOS DE Shigella dysenteriae. 1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un cultivo puro

de E. coli o de Sh. dysenteriae e incubar 24-48 h a 37°C.

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2. Con la pipeta adaptada con un bulbo de hule agregar 8 mL de SSI estéril al cultivo anterior y levantar el desarrollo, expeliendo y absorbiendo varias veces.

3. Verificar la pureza del cultivo mediante tinción de Gram. Debe observarse sólo bacilos Gram negativos. Si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No.4, de lo contrario desechar el cultivo.

4. Pasar la suspensión bacteriana al matraz que contiene el medio de propagación, extender el inóculo por toda la superficie e incubar el matraz 18-24 horas a 37°C.

5. Adicionar 15 mL de SSI estéril y desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de rotación suaves.

6. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram. 7. Si hay algún tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es

satisfactoria continuar con el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMÚN PARA LA PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag. 18).

IV.1.3 ANTÍGENOS TOTALES DE B. abortus. IV.1.4 ANTÍGENO SOMATICO (O) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). IV.1.5 ANTIGENO FLAGELAR (H) DE Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi). 1. Sembrar el tubo del medio para desarrollo de la cepa con un inóculo

abundante de la cepa de B. abortus o Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) e incubar 24-48 h ó 18-24 h, respectivamente a 37°C.

2. Verificar la pureza del cultivo mediante una tinción de Gram. Deberán observarse únicamente cocos Gram negativos en el caso de Brucella y bacilos Gram negativos en el caso de Salmonella. Si hay algún tipo de contaminante desechar la cepa y si la prueba es satisfactoria continuar con el paso No. 3.

3. Pasar 8-10 mL del cultivo al matraz del medio de propagación, extender el inóculo en toda la superficie en el caso de tratarse de medio sólido, o agitar el matraz para incorporar perfectamente si el medio es líquido. Incubar el matraz 18-24 h a 37°C.

4. Comprobar la pureza del cultivo realizando una tinción de Gram. Para los cultivos en medio sólido primero adicionar 15 mL de SSI estéril y desprender todo el desarrollo bacteriano dando al matraz movimientos de rotación suaves.

5. Si hay algún tipo de contaminante desechar el cultivo y si la prueba es satisfactoria continuar en el caso de B. abortus y Ag “O” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) desde el paso No. 1a. del PROCEDIMIENTO COMÚN PARA LA PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS BACTERIANOS, (IV.2, pag. 18) y para el Ag “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) a partir del paso 1b.

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IV.2 PROCEDIMIENTO COMUN PARA TODOS LOS ANTIGENOS BACTERIANOS.

MEDIOS DE CULTIVO: 1 Medios para prueba de esterilidad bacteriana: Tubos de 16 x 150 mm

con 12 mL de tioglicolato fluido. 1 Medios para prueba de esterilidad micótica: Tubos de 16 x 150 mm con

7 mL de agar Sabouraud inclinados. 1 Medios para prueba de viabilidad: Tubos de 16 x 150 mm con 7 mL de

medio.

ANTIGENO MEDIO PARA PRUEBA DE VIABILIDAD

B. abortus Agar triptosa inclinado E. coli Agar BHI inclinado Sh. dysenteriae Agar BHI inclinado Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag “O”

Agar Veal-infusion inclinado

Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) Ag “H”

Agar Veal-infusion inclinado

MATERIAL 1 Equipo de succión estéril. Constituido por: Frasco de centrífuga de 250

mL, tapón del No. 6 bihoradado, tubo de vidrio de 10 cm con filtro de gasa, tubo de vidrio de 12 cm en ángulo de 90° con trampa de aire, tubo de vidrio de 35 cm con un extremo angosto, tres perlas de vidrio y tramo de manguera para vacío de 50 cm.

2 Frascos tipo “vial” de 50 mL con tapón estériles. 2 Pipetas de 1 mL (1/10) estériles. 3 Pipetas de 10 mL (1/10) estériles. 1 Bulbo de hule para pipetas de 10 mL (propipeta). 1 Tapón de hule del No. 6 estéril. 1 Asa bacteriológica. 2 Mecheros. 1 Juego de colorantes para Gram. 1 Termómetro de 0 a 100°C. 1 Charola de peltre para desechar material contaminado. 4 Portaobjetos. Microscopio. Centrífuga con cabezal para frascos de 250 mL. Nefelómetro Klett Summerson con filtro verde y celdas. Incubadora a 37 °C. Baño de agua de temperatura controlada. 25 mL Solución salina isotónica (SSI) estéril.

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100 mL SSI fenolada o SSI formolada: Es SSI estéril, adicionada de fenol al 0.5% ó de formol al 0.3%.

TÉCNICA 1a. Antígenos de E. coli, Sh. dysenteriae, B. abortus y Ag “O” de

Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Cosecha: Por medio del equipo de succión y empleando un vacío leve

extraer la suspensión bacteriana. Sustituir el sistema de succión por un tapón de hule sin horadar y proceder

a llevar a cabo la inactivación. Inactivación: Colocar el frasco de centrífuga en el baño de agua a: 55-

56°C, 2 h para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae y baño de agua hirviente, 2.5 h para el antígeno “O” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi); agitando de vez en cuando.

Prueba de viabilidad: Sembrar 0.2 mL de la suspensión calentada en el

medio de cultivo indicado para cada bacteria, extendiendo el inóculo perfectamente en toda la superficie e incubar a 37°C, 48-72 h. Al cabo de este tiempo no debe haber desarrollo de colonias, en caso contrario deberá hacerse un tinción de Gram y observar si no se trata de contaminación y si no es así , calentar por 1 hora más ya que los microorganismos están todavía vivos. Después del segundo calentamiento repetir la prueba de viabilidad.

Continuar con el paso No. 2. 1b. Antígeno “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi): Inactivación: Adicionar un volumen igual al que ocupa el cultivo de SSI

formolada al 0.6% y dejar a temperatura ambiente durante varios días. Prueba de viabilidad: Para el 4° ó 5° día probar si ya se destruyó la

viabilidad de los microorganismos, sembrando 0.2 mL de la suspensión perfectamente agitada en un tubo con agar Veal-infusion inclinado, extendiendo el inóculo perfectamente en toda la superficie del medio e incubar a 37°C, 24-48 h. Si todavía hay crecimiento deberá hacerse un tinción de Gram y observar si no se trata de contaminación, y si no es así, se dejar transcurrir 3 a 4 días más y se repite la prueba de viabilidad. La prueba es satisfactoria cuando ya no se obtiene desarrollo.

Cosecha: dejar reposar la mezcla de un día para otro y evitando que se

resuspenda, eliminar la mayor cantidad posible de sobrenadante utilizando un sifón estéril y decantar el sedimento a 1 ó 2 frascos de centrífuga de 250 mL, estériles.

2. Centrifugar la suspensión 30 min a 3000 r.p.m., eliminar el sobrenadante y

resuspender el paquete celular en aproximadamente. 20-25 mL de SSI fenolada al 0.5% estéril (para B. abortus, E. coli y Sh. dysenteriae) ó SSI

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formolada al 0.3% estéril (para los antígenos “O” y “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi)).

3. Preparar una dilución 1:10 de la suspensión directamente en la celda del nefelómetro y determinar las unidades Klett en el aparato, leyendo contra SSI fenolada o formolada como blanco. Tomando en cuenta el factor de dilución e interpolando en la curva de Mc Farland (ver anexo I.C) determinar la concentración de bacterias/mL. La lectura también se puede realizar en un colorímetro, leyendo a 540 nm, en donde 0.3 unidades de absorbancia equivalen a 1 X 109 microorganismos/mL.

4. Ajustar la concentración de una alícuota de la suspensión a 109 microorganismos/mL adicionando la cantidad necesaria de SSI fenolada o formolada, para obtener el volumen suficiente para realizar el esquema de inmunización (15 mL aprox.). Aplicar la siguiente fórmula:

Concentración que se tiene - 1 = Volumen de diluyente que se debe agregar Concentración que se desea por cada mL de la suspensión concentrada 5. Envasar en frascos “vial” tanto la suspensión concentrada como la diluida

y rotular adecuadamente. 6. Realizar la prueba de esterilidad micótica y bacteriana a cada producto

sembrando 0.1 mL de las suspensiones en los tubos de tioglicolato y Sabouraud, incubando los primeros a 32-35°C, 48 h y los segundos a temperatura ambiente por lo menos una semana. Si el resultado de la prueba es satisfactorio, las suspensiones se conservan en refrigeración hasta su uso.



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PRÁCTICA No. 2 INMUNIZACIÓN DE ANIMALES DE LABORATORIO

GENERALIDADES Se entiende por inmunización al mecanismo por el cual se estimula a un individuo inmunocompetente para que genere la respuesta inmune, la cual se caracteriza por la formación de anticuerpos (respuesta humoral) y linfocitos T sensibilizados (respuesta celular) específicos para el agente inductor. La respuesta inmune celular es mediada por la actividad de los linfocitos T sensibilizados, que mediante la producción de muchos factores llamados citocinas concertan las actividades de otros tipos celulares como los macrófagos y los polimorfonucleares. La respuesta inmune humoral es mediada por los anticuerpos (Ac) o inmunoglobulinas (Igs), los cuales son glucoproteínas presentes principalmente en el plasma y en menor cantidad en los demás líquidos corporales tales como saliva, lágrimas, sudor, líquido seminal, leche, líquido cefalorraquídeo, jugo intestinal, secreciones respiratorias y genitourinarias. Los anticuerpos son producidos y secretados por las células plasmáticas, las cuales son el resultado de la maduración y diferenciación de los linfocitos B que han sido estimulados por el antígeno. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, las cuales tienen diferentes funciones efectoras durante la respuesta inmune. Su estructura básica está constituida por cuatro cadenas polipeptídicas unidas por puentes disulfuro (Fig. 1). Dos de las cadenas se denominan ligeras o L y las otras dos pesadas o H. Las inmunoglobulinas se unen específicamente al Ag que estimuló su formación. Una unidad básica de inmunoglobulina tiene 2 sitios de unión al Ag o paratopo, que son conformados por ambas cadenas (H y L). Sitios de unión al Ag (Paratopo)

Figura No. 1.1 Estructura de la Unidad Básica de las Inmunoglobulinas Los inmunoglobulinas existen como monómeros (IgG, IgA, IgD e IgE) o como polímeros (IgA secretoria e IgM) de la unidad básica.

S S

S S

S S

S S

H

H

L

L

22

Como se mencionó anteriormente, la respuesta inmune de un animal puede ser totalmente un fenómeno natural o puede ser inducida artificialmente mediante la inoculación del inmunógeno. Los factores que hay que tomar en cuenta para lograr con éxito una inmunización son: • Dosis • Frecuencia de dosis • Vía de inoculación • Condiciones generales del animal inmunizado: edad, sexo, alimentación, estado

de salud, etc. • Uso de adyuvantes Estos factores se conjugan e interrelacionan, y en conjunto determinan un esquema de inmunización. La dosis y la frecuencia de dosis son factores que hay que tomar en cuenta para evitar caer en el fenómeno de tolerancia inmunológica. Este se refiere al hecho de que a dosis subóptimas y supraóptimas del inmunógeno, el animal puede ya no responder a la estimulación por el inmunógeno aplicado. La vía de inoculación es determinante para el tipo de respuesta que se obtiene. Aunque la mayoría de las veces ambos tipos de respuesta (humoral y celular) se presentan, nosotros podemos favorecer una u otra de las respuestas según la vía de administración que utilicemos. Así, la vía endovenosa es excelente para obtener respuesta humoral y pésima para obtener respuesta celular. Y por el contrario, la vía intradérmica es excelente para obtener respuesta celular y mala para obtener respuesta de anticuerpos. Dentro de estos extremos, las otras vías pueden favorecer a una u otra de las respuestas en menor o mayor grado. También la vía de inmunización utilizada puede influir en la velocidad con la que se de la respuesta. Existen diferentes vía de administración de inmunógenos, entre ellas se pueden mencionar: endovenosa o intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, que son de las más frecuentes en la inmunización de animales de laboratorio, aunque en estudios especiales también se han usado otras como la intranasal, intraganglionar, intracerebral, etc. En el caso de inmunización a humanos solo se utilizan las vías: intramuscular, intradérmica, subcutánea y oral. En cuanto a la especie que se inmuniza es importante debido a que un esquema de inmunización se diseña para una especie dada, no existe un esquema universal para todas las especies, debido principalmente a que cada una responde de diferente forma e intensidad, por tanto los factores dosis, frecuencia de dosis, vía de administración y uso o no de adyuvantes dependerán del animal que se inmuniza.

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La edad, sexo, alimentación y estado de salud del animal inmunizado, también son factores determinantes para lograr la inmunización, debido a que estos influyen ya sea en la madurez, interrelaciones hormonales, capacidad y competencia del sistema inmune. Los adyuvantes se consideran potenciadores de la respuesta inmune, existen los de uso veterinario como el adyuvante completo e incompleto de Freund, los liposomas, los lipopolisacáridos bacterianos (LPS), el alumbre, el alginato de calcio, la tapioca, entre otros. También los hay que se utilizan en la inmunización de humanos (en las vacunas) como el AlPO4, Al(OH)3, Mg(OH)2. La inducción artificial de la respuesta inmune tiene muchas aplicaciones, entre ellas se pueden mencionar: • Las vacunaciones, que se practican tanto en el ser humano como en animales. • Preparación de sueros hiperinmunes de uso terapéutico. • Preparación de sueros inmunes utilizados como reactivos biológicos para uso

diagnóstico. • Preparación de sueros inmunes utilizados como reactivos en Química Legal. • Preparación de sueros inmunes utilizados como reactivos en análisis de

alimentos. • Preparación de sueros inmunes utilizados en diferentes campos de la

investigación. En esta unidad se describen los esquemas de inmunización para obtener los sueros inmunes en conejos:

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ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN MATERIAL COMUN PARA TODOS LOS ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN 1 Jeringa hipodérmica de 3 mL con aguja No. 22 estéril 1 Jeringa hipodérmica de 5 mL con aguja No. 20 estéril 1 Jeringa hipodérmica de 20 mL con aguja No. 18 estéril 1 Tubo de ensayo de 12 X 100 mm 2 Tubos de centrífuga de 50 mL de plástico 1 Pipeta de 1 mL (1/10) 1 Pipeta de 10 mL (1/10) con bulbo 1 Probeta graduada de 100 mL 1 Frasco tipo “vial” de 30 mL 1 Bulbo de hule 1 Aplicador de madera Centrífuga con cabezal para tubos de 50 mL Tabla para sujetar conejos 1 Conejo de por lo menos 2.5 Kg de peso 0.3 mL Solución al 10% de etilmercuritiosalicilato de sodio (timerosal) o azida al

10%. 2.1 SUEROS ANTIESPECIE Antihumano, anticaballo, antibovino, antiperro, antipollo, etc. MATERIAL ESPECÍFICO Extracto de tejido muscular o suero estéril 2 mL Adyuvante completo de Freund

DÍA INÓCULO VÍA DE ADMINISTRACIÓN

1 0.5 mL de suero o extracto 0.5 mL de adyuvante completo de Freund

intramuscular

8 1.0 mL de suero o extracto 1.0 mL de adyuvante completo de Freund

intramuscular

15 0.2 mL de suero o extracto diluido 1:10 endovenoso 16 0.5 mL de suero o extracto diluido 1:10 endovenoso 17 1.0 mL de suero o extracto diluido 1:10 endovenoso 18 0.2 mL de suero o extracto concentrado endovenoso 19 0.5 mL de suero o extracto concentrado endovenoso 20 1.0 mL de suero o extracto concentrado endovenoso

25 a 27 SANGRIA DE PRUEBA

25

2.2 SUEROS ANTI-PROTEINAS PURIFICADAS Anti-albúmina sérica humana y anti-γ globulina humana. MATERIAL ESPECÍFICO Soluciones de proteínas purificadas estériles 1 mL Adyuvante completo de Freund 1 mL Adyuvante incompleto de Freund


1 1.0 mL de proteína de 5 mg/mL 1.0 mL de adyuvante completo de Freund

Intradérmica o subcutánea en sitios múltiples.

15 1.0 mL de proteína de 5 mg/mL 1.0 mL de adyuvante incompleto de Freund

Intradérmica o subcutánea en sitios múltiples.

30 0.25 mL de proteína (1 mg/mL) endovenoso 31 0.50 mL de proteína (1 mg/mL) endovenoso 32 1.0 mL de proteína (1 mg/mL) endovenoso 37 SANGRIA DE PRUEBA

2.3 SUERO ANTI-ERITROCITOS DE CARNERO (Amboceptor hemolítico anti-carnero): MATERIAL ESPECÍFICO 10 mL Suspensiones de eritrocitos de carnero al 10%.


1 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 2 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 3 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 4 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 6 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 8 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso

10 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 13 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 15 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 17 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso endovenoso 20 SANGRIA DE PRUEBA

2.4 SUEROS ANTIBACTERIANOS:

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Anti-B. abortus, anti-E. coli, anti-Sh. dysenteriae y anti-Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) (O y H).

MATERIAL ESPECÍFICO 6.5 mL Antígenos bacterianos de concentración 1 X 109 µos/mL


1 0.5 mL de suspensión bacteriana 1 X 109 µos/mL

endovenoso


endovenoso


endovenoso


endovenoso

20 SANGRIA DE PRUEBA Las inyecciones intramusculares se hacen en el cojincillo plantar o en el músculo y las endovenosas en las venas marginales de las orejas, comenzando a inyectar por la punta de las orejas y avanzando hacia la base. SANGRÍA DE PRUEBA 1. Al término del esquema de inmunización, dejar descansar al animal

durante 5 a 7 días y proceder a realizar la sangría de prueba. 2. Tomar unos 2 mL de sangre por punción de una de las venas marginales

de la oreja. 3. Colocar la sangre en un tubo de ensayo de 12 X 100 mm y dejar coagular. 4. Separar el suero y en él se investiga la presencia de anticuerpos. Sueros anti-especie y anti-proteínas purificadas: Por el método de la

doble difusión de Ouchterlony. Título deseado ≥ 1:8. Sueros antibacterianos: Por el método de aglutinación en placa. Título

deseado: ≥ 1:3200. Sueros anti-eritrocitos de carnero (hemolisina): Por el método de

citólisis. Título deseado: ≥ 5 000 Unidades hemolíticas /mL.

SANGRÍA DE COSECHA 1. Si el resultado de la prueba es satisfactorio, proceder a la sangría de

cosecha, para ello se extraer de 50 a 60 mL de sangre por punción cardiaca.

2. Colocar la sangre en tubos de centrífuga de 50 mL y dejar coagular. 3. Separar el coagulo de las paredes del tubo mediante un aplicador de

madera y centrifugara 300 rpm durante 30 min. 4. Mediante una pipeta con bulbo, separar cuidadosamente el suero y

colocar en una probeta para determinar el volumen obtenido. NOTA: Si es necesario, volver a centrifugar para clarificar completamente el suero.

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5. Adicionar el conservador: Para sueros antiespecie, anti-proteínas purificadas y antibacterianos:

Solución de timerosal al 10%, a tener una concentración final de 1:10,000 (0.1 mL por cada 100 mL de suero) o azida de sodio al 10% (1.0 mL por cada 100 mL de suero).

Para sueros anti-eritrocitos de carnero: Glicerina Q.P. vol/vol. (Considerar que el título final queda diluido 1:2).

6. Envasar en frasco tipo vial y rotular con: Nombre del producto Fecha de obtención Título de Ac obtenido Volumen Conservador utilizado REFUERZOS 1. Si los resultados de la titulación de Ac son negativos o no satisfactorios, es

necesario aplicar refuerzos. Para sueros anti-especie: Administrar 2 dosis más de suero o extracto

concentrado, de 3 mL cada uno, por vía intraperitoneal a intervalos de 1 semana entre la primera y la segunda.

Para sueros anti-proteínas purificadas: Inocular 2 dosis de 1.0 mL de la solución de proteína de 1 mg/mL vía intraperitoneal a intervalos de 1 semana entre la primera y la segunda.

Para sueros antibacterianos: Aplicar 1 dosis de 3.0 mL de antígeno por vía endovenosa.

Para sueros anti-eritrocitos de carnero: Aplicar 2 dosis más de 1.0 mL de eritrocitos al 10% por Kg de peso con intervalo de 3 días, o bien dos dosis de 1.0 mL de una suspensión de Pasteurella cuniculicida de 1 X 109 microorganismos/mL inactivados por calentamiento a 56º C durante 60 min o mejor aún en autoclave a vapor fluyente ya que se trata de una antígeno termoresistente.

2. Dejar transcurrir de 4 a 5 días y se repite la sangría de prueba. 3. Si el título de anticuerpos ya es satisfactorio se procede a la sangría de

cosecha, pero si no se observa ningún aumento en el título el animal se desecha.



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UNIDAD 2 INTERACCIONES ANTÍGENO - ANTICUERPO (Ag-Ac).

INMUNOPRECIPITACIÓN GENERALIDADES Los antígenos (Ag) pueden reaccionar tanto in vivo como in vitro con los anticuerpos (Ac) específicos. No toda la molécula de antígeno reacciona con toda la molécula de anticuerpo, sino que estas interacciones se dan entre los sitios activos de ambas moléculas. Para el antígeno, estos sitios activos se denominan determinantes antigénicos o epítopos y para el anticuerpo se llaman sitios activos de anticuerpo o paratopos. Por tanto, una reacción Ag-Ac implica la interacción epítopos-paratopos. El número de epítopos presentes en los antígenos es variable, y éste determina la valencia del Ag. Generalmente una molécula de Ag tiene varios epítopos por lo que es multivalente. En el caso de los anticuerpos, los de clase IgG, IgA, IgD e IgE tienen solo 2 paratopos (bivalentes) y la IgM e IgAs (IgA secretoria) tienen 10 y 4 paratopos respectivamente (deca y tetravalentes). Debido a la multivalencia del Ag y a la por lo menos bivalencia del Ac, cuando se da la reacción Ag-Ac se forman agregados moleculares. El tipo de enlaces o fuerzas que participan en la unión de los epítopos y paratopos son débiles no covalentes y entre ellas están: Puentes de hidrógeno, electrostáticas débiles (no iónicas), de van der Waals e hidrofóbicas. Por tanto la reacción es reversible y por tanto es fácil disociar un complejo ya formado. En la interacción “in vitro” de un antígeno con un anticuerpo se distinguen dos etapas: la reacción primaria, no observable, y la reacción secundaria, caracterizada por la aparición de un fenómeno visible. “In vivo” la reacción Ag-Ac puede generar reacciones terciarias, como es el caso de la necrosis en la reacción de Arthus, los fenómenos vasógenos de la anafilaxia por la liberación de histamina, etc, los cuales son fenómenos biológicos colaterales. En la reacción primaria se unen el Ag y el Ac dando lugar a la formación de complejos iniciales que posteriormente, en la reacción secundaria, se agregan para dar lugar a fenómenos visibles cuyas características dependen en gran parte de las características físicas del antígeno, pero también de la clase de inmunoglobulina que participa en la reacción y de la concentración de Ag y Ac. De acuerdo a la naturaleza de los diferentes fenómenos que se pueden presentar como consecuencia de la reacción permite clasificar a las interacciones Ag-Ac en:

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• Reacciones de precipitación. • Reacciones de aglutinación. • Reacciones de floculación. • Reacciones de neutralización. • Reacciones de opsonización. • Reacciones de citólisis. • Reacciones de fijación de complemento. • Reacciones con reactivos marcados. En este bloque de prácticas nos referiremos a las reacciones de precipitación y a las metodologías que se han diseñado para llevarlas a cabo. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN Cuando se utiliza un antígeno en solución, como lisados bacterianos, toxinas, extractos de tejidos heterólogos, extractos vegetales, etc, al estar en presencia de sus Ac específicos forman complejos Ag-Ac que posteriormente se insolubilizan, dando como resultado una reacción de PRECIPITACIÓN. Esta propiedad tiene muchas aplicaciones para la investigación y valoración de Ag y Ac.

Ag + Ac Ag - Ac (PRECIPITADO)

Figura 2.1 Formación del inmunoprecipitado.

DEFINICIÓN: Cuando se mezclan en cantidades adecuadas un Ag soluble con su Ac correspondiente (principalmente de clase IgG) se forma un inmunoprecipitado. MECANISMO: La formación del inmunoprecipitado se lleva a cabo en dos etapas: 1ª. ETAPA: Reconocimiento y recombinación de Ag y Ac.- en ella los Ag y Ac se unen rápidamente (casi instantáneamente) formando complejos primarios, que aún siguen siendo solubles. Dentro de ciertos límites, esta 1ª. etapa casi no se ve influenciada por factores tales como la temperatura, pH, fuerza iónica y la concentración de los reactantes. +

30

COMPLEJOS PRIMARIOS

Figura 2.2 1ª. Etapa: Reconocimiento y recombinación 2ª. Etapa: AGREGACIÓN: Los complejos primarios se van agregando, aumenta el peso molecular y entonces precipitan, formándose un enrejado tipo cristal en donde cada molécula de Ag y Ac ocupa un lugar determinado. Esta 2ª etapa es mas tardada puede durar de minutos a horas y es muy dependiente de la temperatura, pH, fuerza iónica y concentración de Ag y Ac. COMPLEJOS PRIMARIOS PRECIPITADO

Figura 2.3 2ª. Etapa: Agregación Puede ocurrir solo la fase 1ª y no la 2ª, debido a variaciones cuantitativas. La fase 2ª solo se presenta cuando la concentración de Ag y Ac son equivalentes. FACTORES QUE AFECTAN LA REACCIÓN: • TEMPERATURA: Acelera la reacción debido a un incremento de la difusión y el

movimiento de las moléculas. Se considera que esto es válido hasta los 56°C, ya que a mayor temperatura comienza a haber desnaturalización. La mayoría de las reacciones Ag-Ac se trabajan a temperatura ambiente, pero también se tienen algunas técnicas que usan 37°C para igualar condiciones fisiológicas y otras a 45°C o 56°C como es el caso de la titulación de toxinas. Las temperaturas frías (4-6°C) se han utilizado en investigación en estudios inmunoquímicos, cuando se requiere minimizar lo más posible la desnaturalización y que los resultados sean más estequiométricos y cuantitativos.

• pH: De este factor depende el estado iónico de grupos importantes que

participan en la interacción, como son los radicales amino (-NH3) y carboxilo (-COO). Aunque la reacción Ag-Ac la podemos observar en un intervalo amplio de pH, se considera que el óptimo está entre 6.8 a 8.6.

• Fuerza iónica (µ): Corresponde a la concentración de iones presentes en el

medio de reacción (electrolitos) los cuales son necesarios para disminuir las cargas de repulsión que impiden que se formen los agregados. Se requieren µ bajas (intervalo óptimo 0.01 – 0.1) para que el máximo número de grupos

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iónicos se aprovechen para el enlace del Ag y el Ac, a altas µ los grupos iónicos son neutralizados y por tanto se reduce la afinidad.

• Concentración de Ag y Ac: La concentración de Ag y Ac deben ser

equivalentes para que la precipitación pueda llevarse a cabo. Si hay exceso de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA:

Exceso de Ac: En ambos casos solo se forman complejos primarios No hay precipitación Exceso de Ag: Concentración Formación de precipitado equivalente de Ag y Ac

Figura 2.4 Fenómeno de Zona: Inhibición de la formación del precipitado

por efecto de la concentración de Ag y Ac. El efecto de la concentración puede ser observado si se hacen reaccionar cantidades variables del Ag con una concentración constante de Ac y graficando: Exceso de Ac Zona de Exceso de Ag PREZONA EQUIVALENCIA POSTZONA

pp

[Ag]

[Ac = cte]

32

Figura 2.5 Curva de precipitación cuantitativa Debe considerarse que la formación de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los Ac y de la multivalencia de los Ag, por lo tanto, los Ag o haptenos simples que sólo tengan un determinante antigénico NO dan reacciones de precipitación; así mismo, el Ag y el Ac deben estar en proporciones adecuadas, ya que el exceso de cualquiera de ellos lleva a la solubilidad del agregado y la no formación del precipitado. El efecto de “no precipitación” producido por falta de concentraciones equivalentes de antígeno o anticuerpo (fenómeno de zona) puede ser disminuido o evitado haciendo diluciones seriadas del reactivo desconocido (generalmente el Ag), o realizando la reacción en el seno de un gel de agar por difusión del Ag y/o el Ac. Las reacciones de precipitación pueden ser cualitativas, semicuantitativas o cuantitativas y se pueden realizar en medio líquido y semisólido. Hay varias técnicas para realizar este tipo de reacciones: • La simple mezcla del Ag y del Ac en tubo de ensayo o capilar • La formación de capas estratificadas (técnica del anillo de interfase o Ascoli) • La difusión simple unidimensional en gel de agar (técnica de Oudin) • La doble difusión unidimensional en agar (modificación a la técnica de Oudin) • La difusión radial simple en agar (RID) (técnica de Mancini, Carbonara y

Hermans) • La doble difusión radial en gel de agar (DDR) (técnica de Ouchterlony) Y las técnicas que combinan difusión en geles de agar con procedimientos electroforéticos como: • La inmunoelectroforesis (IEF) (técnica de Grabar y Williams) • La electroinmunodifusión (EID) (técnica de Laurell). • La electroforesis bidimensional

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PRÁCTICA No. 3 CURVA DE PRECIPITACIÓN CUANTITATIVA EN CAPILAR

MARCO TEÓRICO La precipitación en medio líquido se puede realizar en tubos de ensayo o capilares, mezclando el Ag soluble con su Ac específico y la cantidad de precipitado formado varía según la proporción de los reactivos. Si se dispone una serie de tubos conteniendo una cantidad constante de anticuerpo y cantidades crecientes del Ag soluble, se puede observarse que al ir aumentando la cantidad de éste el precipitado formado alcanza un máximo y posteriormente comienza a disminuir aunque la cantidad de Ag aumente. De manera semicuantitativa se puede estimar la cantidad de precipitado formado expresándolo en milímetros lineales. Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de Ag agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado (en mm), se obtiene una curva, generalmente en forma de campana, que se puede dividir en tres zonas: A. Zona de exceso de anticuerpo: Las moléculas de Ag están saturadas y no

hay agregación, en esta zona el sobrenadante contiene Ac libre. B. Zona de equivalencia: el precipitado es máximo, el sobrenadante no

contiene ni Ag ni Ac libres. C. Zona de exceso de antígeno: Solo hay formación de complejos primarios

pero no agregados por falta de Ac; el sobrenadante contiene Ag libre. A. PREZONA (Exceso de Ac) B. ZONA DE EQUIVALENCIA C. POSTZONA (Exceso de Ag) Un análisis cuantitativo se puede realizar determinando el N proteico en el precipitado cuando el Ag es un polisacárido. Si el antígeno es proteico pero tiene un grupo químico que sirve como marca, como el DNP-ASB (dinitrofenol-albúmina sérica bovina) se puede determinar la cantidad de Ac en el precipitado por lectura espectrofotométrica a 360 nm para el Ag y a 280 nm para la cantidad total de proteína. La cantidad de Ac se obtiene mediante la siguiente operación: Cant. de proteína – Cant. de Ag = Cant. de Ac. Sí el Ag es proteico y no tiene alguna marca, por ejemplo ovoalbúmina, la cantidad de Ac en el precipitado se puede determinar haciendo los cálculos con valores obtenidos en la zona de equivalencia: Proteína en pp – Ag añadido = Ac en pp. MATERIAL 12 Tubos capilares de 100 x 1.6 mm

A

B

C

pp

[Ag]

[Ac] = cte

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10 Tubos de ensayo de 12 x 75 mm 2 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 3 Pipetas de 1 mL (1/10) 1 Gradilla par tubos de ensaye 1 Gradilla de plastilina para capilares Papel absorbente Lápiz graso o marcador indeleble 1 mL Solución de Ag de concentración conocida: Albúmina sérica humana

(ASH) 1 000 mg/dl 0.6 mL Ac específico: Suero anti-ASH 5 mL Solución salina isotónica (SSI) TÉCNICA 1. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador. 2. En los tubos de ensayo debidamente rotulados (2 a 10), realizar diluciones

seriadas (2X) de la solución de antígeno (ASH) con SSI: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 y 1:512. Para ello: • Colocar 0.5 mL de SSI en cada uno de los tubos • Al tubo 2 agregar 0.5 mL de la solución de ASH, mezclar con la misma

pipeta (dilución 1:2). • Pasar 0.5 mL del tubo al tubo 3. Mezclar. (dilución 1:4). • Repetir el procedimiento hasta el tubo 10 (diluciones 1:8 a 1:512)

3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de antisuero (anti-ASH) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y manteniendo el dedo índice en el extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente.

4. Quitando el dedo índice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad la solución de antígeno sin diluir (1:1) de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente.

5. Tapando con el dedo índice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las soluciones por inversiones repetidas o moviendo el líquido de un lado al otro y rotando el capilar simultáneamente varias veces.

6. Con el dedo índice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el líquido dentro del capilar, colocando el dedo índice en un extremo.

7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalización de los reactivos por contacto con ésta.

8. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para cada uno de los capilares correspondientes a las otras diluciones de Ag (de 1:2 a 1:512).

9. Incluir los siguientes testigos: a) Un capilar llenado hasta la segunda marca con solución de Ag sin diluir. b) Un capilar llenado hasta la segunda marca con antisuero.

10. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente ó 48 h en refrigeración. 11. Medir la cantidad de precipitado en milímetros en cada capilar. Si el

precipitado es difuso o está fraccionado, centrifugar los capilares 1 min a

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1000 rpm colocándolos dentro de los tubos de ensayo de 13 X 100 mm o en una centrífuga para hematocrito.

NOTA: Cuidar que al sacar cada uno de los capilares de la plastilina queden tapados con la misma en su parte inferior.

RESULTADOS Con los datos obtenidos complementar la siguiente tabla y construir la curva de precipitación, graficando concentración de Ag (abscisas) contra la cantidad de precipitado formado, expresado en mm (ordenadas).

CAPILAR DILUCION DEL Ag [Ag] mg/dl PRECIPITACIÓN (mm)

1 1:1 2 1:2 3 1:4 4 1:8 5 1:16 6 1:32 7 1:64 8 1:128 9 1:256

10 1:512 11 Control de Ag 1.1 12 Control de Ac 0

[ASH] = 1000 mg/dl NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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PRÁCTICA No. 4 MEZCLA DE ANTÍGENO Y ANTICUERPO

Prueba de Identidad a Sueros de Uso Terapéutico Determinación del Origen de Manchas de Sangre

MARCO TEÓRICO La precipitación por simple mezcla de Ag y Ac puede llevarse a cabo en capilar o en tubos de ensayo, cuando se utilizan estos últimos suele acelerarse la reacción con temperatura (50 – 55° C). Las ventajas que ofrece la metodología es la economía, la facilidad de interpretación y el poco equipo requerido, y la desventaja principal es el riesgo de caer fácilmente en fenómeno de zona cuando no se prueban diluciones. Entre las aplicaciones de esta técnica se pueden mencionar las pruebas de peritaje para la identificación de manchas de sangre y de semen, así como en alimentos en la determinación de la especie de que proceden las carnes y derivados, así como en la investigación del origen de sueros inmunes y para estudiar las relaciones filogenéticas de las especies y la zoofilia y antropofilia de vectores. Esta técnica será ejemplificada con la investigación del origen de muestras de antitoxinas, determinación que se realiza como prueba de identidad a sueros inmunes, o con la identificación del origen de manchas de sangre. MATERIAL: 2 ó 4 Tubos capilares 1 x 9 mm 1 Gradilla de plastilina Papel absorbente 100 µl Muestras de antitoxina tetánica o papel filtro con manchas de sangre. 50 µl De cada suero antiespecie: anti-equino, anti-humano, anti-bovino, etc. TÉCNICA: Para la prueba de identidad de sueros de uso terapéutico llevar a cabo todos los pasos incluyendo los incisos (a) del paso 1 y 8. Para la identificación de manchas de sangre también realizar todos los pasos pero ahora incluir los incisos (b) del paso 1 y 8. 1a. Si es necesario, eliminar partículas en suspensión de los sueros y las

muestras por centrifugación a 2000 rpm, 2 min. 1b. Colocar pequeños fragmentos de la mancha de sangre en un tubo de

ensayo y extraer con 2 mL de solución salina isotónica. 2. Marcar los capilares a 3 y 6 cm a partir de un extremo, con un marcador. 3. Tomar un tubo capilar y absorber por capilaridad un volumen de suero

(anti-humano) hasta llegar a la primera marca del tubo capilar (3 cm), y manteniendo el dedo índice en el extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente para no contaminar la muestra problema.

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4. Quitando el dedo índice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad un volumen igual de la muestra de antitoxina problema o del extracto de la mancha de sangre, de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar. Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente.

5. Tapando con el dedo índice y pulgar los extremos del capilar, mezclar las soluciones por inversiones repetidas o moviendo el líquido de un lado al otro y rotando el capilar simultáneamente varias veces.

6. Con el dedo índice tapar uno de los extremos del capilar y centrar el líquido dentro del capilar y, colocando el dedo índice en un extremo.

7. Insertar el capilar verticalmente en la gradilla de plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalización de los reactivos por contacto con ésta.

8a. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para el otro capilar pero ahora utilizar como Ac el suero anti-equino.

8b. Repetir el procedimiento de los incisos 3 al 7, para los otros capilares pero ahora utilizando los otros sueros antiespecie.

9. Incubar los capilares 24 h a temperatura ambiente ó 48 h en refrigeración. RESULTADOS Leer los resultados observando en cual de los capilares se observa precipitación. Determinar el origen de la muestra de antitoxina utilizada o la especie de donde procede la mancha de sangre. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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PRÁCTICA No. 5 DOBLE DIFUSIÓN EN PLACA (OUCHTERLONY)

Identificación de fracciones antigénicas presentes en suero humano MARCO TEÓRICO Las macromoléculas pueden difundir libremente a través de geles. Esta difusión está limitada por la concentración del gel, así como por el peso molecular y tamaño de las moléculas de Ag y Ac. Empleando soportes que tienen como base agar disuelto en una solución amortiguadora, los antígenos y/o anticuerpos pueden migrar y al encontrarse en concentraciones equivalentes, formar el inmunoprecipitado, evitando así el efecto indeseable del fenómeno de zona. La velocidad de la difusión de ambas moléculas es directamente proporcional a la concentración e inversamente proporcional al peso molecular (Ley de Fick). Otros soportes que pueden ser utilizados son: pectinas, alginatos, poliacrilamida y tiras de acetato de celulosa gelatinizado. En la técnica de Ouchterlony, el Ag y el Ac se colocan en pozos hechos en una placa de gel de agar, a partir de ellos ambos reactivos difunden radialmente y al encontrase en concentraciones equivalentes forman una o varias bandas de precipitación dependiendo del número de sistemas Ag-Ac presentes. Cuando se prueba un Ag constituido por una mezcla de fracciones antigénicas frente a una mezcla de Ac, se forman varias bandas y cada una corresponde a una fracción antigénica diferente. Aumentando el número de perforaciones se pueden probar varios sistemas simultáneamente y según las formas de las bandas obtenidas se puede determinar si los antígenos analizados son idénticos (cuando las líneas de precipitación confluyen), diferentes (cuando las líneas se cruzan) ó relacionados (cuando las líneas se unen parcialmente) (ver esquema). IDENTIDAD IDENTIDAD NO IDENTIDAD PARCIAL

Figura 2.6 Patrones de bandas obtenidos en el Ouchterlony Esta técnica es muy útil para determinar la homogeneidad de antígenos y anticuerpos purificados, así como para buscar impurezas en un sistema. MATERIAL 1 Portaobjetos

Ag Ag

Ac

Ag

Ag

Ac

Ag

Ag

Ac

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1 Hisopo 1 Nivelador de gota 1 Placa de vidrio 1 Cámara húmeda (caja Petri con papel filtro húmedo) 1 Vaso de precipitado de 250 mL 1 Tripié con tela de alambre 1 Mechero 1 Horadador de 2 mm de diámetro 1 Plantilla de una horadación central y seis periféricas. 5 Capilares Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado

con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm.

3.5 mL Solución de agar noble al 1.5% en PBS 0.075 M, pH 7.2 2 mL Solución de agar noble al 0.3% en PBS 0.075 M, pH 7.2, para sellar 5 µL Antígenos: Suero humano (SH), Albúmina sérica humana (ASH), IgG

humana purificada, suero bovino (SB), suero murino. 5 µL Anticuerpo: Suero antihumano, TÉCNICA 1. Barnizar los portaobjetos lavados y desengrasados con agar al 0.3%

fundido con ayuda del hisopo. 2. Colocar los portaobjetos barnizados sobre una superficie perfectamente

nivelada y verter sobre cada uno el contenido del tubo con agar al 1.5% fundido (3 mL).

3. Permitir que solidifique el agar a temperatura ambiente. 4. Con el horadador practicar 7 cortes en forma de roseta: uno central y 6

periféricos, usando la plantilla o un papel con el esquema de las perforaciones debajo del portaobjetos. (ver Fig. 2.7)

Figura 2.7 Disposición de pozos para el Ouchterlony 5. Extraer el gel de agar de los cortes mediante el equipo de succión

haciendo un ligero vacío o con la aguja de una jeringa. 6. Colocar con un capilar en la horadación central suero antihumano hasta

llenar el pocito, sin derramar su contenido. 7. Con capilares individuales tomar cada reactivo biológico, colocar en los

pozos de la periferia ordenados en el sentido de las manecillas del reloj: en los pozos 1 y 6 suero humano; en el 2 ASH, en el 3 suero bovino, en el 4 suero murino, en el 5 IgG humana purificada.

3

2 1

4 5

6

40

8. Introducir el portaobjetos en la cámara húmeda, cerrarla e incubar de 18 a

24 h a temperatura ambiente ó 48 h a 4° C. RESULTADOS Leer los resultados, identificando bandas de identidad, no identidad e identidad parcial. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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PRÁCTICA No. 6 INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (RID)

(Mancini, Carbonara y Hermans) Cuantificación de Albúmina Sérica Humana

MARCO TEÓRICO Este método se aplica rutinariamente en Inmunología Clínica para la cuantificación de antígenos, fundamentalmente de las fracciones plasmáticas humanas, como son la albúmina sérica humana (ASH), las inmunoglobulinas G, A y M, los componentes C3 Y C4 del complemento, factores de coagulación, etc. Para llevarlo a cabo se emplea una placa de gel de agar purificado al que se incorpora el suero específico monovalente para la fracción que se desea cuantificar. En esta placa se practican horadaciones y en ellas se coloca un volumen medido con exactitud tanto de un estándar en tres diluciones de concentración conocida, como de los sueros problema. Al difundirse de manera radial el Ag en el seno del agar que contiene el anticuerpo se va formando un halo de precipitación alrededor del pozo donde se colocó el Ag. El diámetro de la zona de precipitación es directamente proporcional a la concentración del Ag y por lo tanto los datos obtenidos en las reacciones de precipitación de los estándares sirven para trazar la curva de calibración de la placa de donde se obtiene la concentración del Ag presente en los sueros problema. El anticuerpo incorporado determina la sensibilidad de la placa. Esta técnica ofrece las ventajas de utilizar poca cantidad de reactivos, sencillez de manipulación e interpretación, alta sensibilidad y la opción de usar placas disponibles comercialmente; aunque tiene como desventaja que el tiempo para dar por terminada la prueba es largo. MATERIAL 1 Gradilla 1 Matraz Erlenmeyer de 100 mL 1 Tubo de 16 x 100 mm con tapón de hule 1 Pipeta graduada de 1 mL 1 Nivelador de gota 1 Placa de vidrio de 20 x 20 cm 1 Placa de plástico con tapa para RID 1 Horadador de 2 mm de diámetro 1 Micropipeta de 20 µl o capilares calibrados de 5 µl 1 Plantilla de 12 horadaciones para RID 1 Regleta para medición de halos para RID Puntas para micropipeta Platina calentadora con agitación Baño de agua a 56° C. Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado

con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm

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5.0 mL Solución de agar noble al 2.0 % en PBS 0.075 M, pH 7.2 1.0 mL Suero anti-ASH 0.2 mL Suero problema diluido 1:10 10 µl Soluciones estándares de ASH TÉCNICA 1. Preparar una solución de agar noble al 2% en amortiguador PBS pH 7.2,

fuerza iónica 0.075. Fundir a ebullición en la platina de calentamiento. 2. Pipetear 5 mL de la solución anterior en un tubo de ensayo previamente

calentado en baño de agua a 56° C y mantener el tubo con gel a esa temperatura un tiempo, hasta que se estabilice.

3. Manteniendo el tubo dentro del baño de agua a 56º C, incorporar al gel de agar 1.0 mL de suero anti-ASH.

4. Tapar el tubo, sacarlo del baño y mezclar por inversión rápida, pero suavemente para evitar que se forme espuma.

5. Secar el tubo y verter el agar sobre la placa de plástico para RID, la cual ha sido previamente calentada “al vapor” sobre la platina caliente cubierta con un trapo húmedo (para no dañar la placa).

6. Homogeneizar con movimientos de rotación suave y en seguida dejar solidificar sobre la placa de vidrio perfectamente nivelada.

7. Haciendo uso de una plantilla, practicar 12 horadaciones en el gel con un perforador de 2 mm de diámetro interno.

8. Depositar en cada pozo 5 µl de las soluciones estándares y problemas. Es conveniente que los 3 primeros pozos se ocupen con estándares y los demás con problemas (ver fig. 2.8).

Figura 2.8 Disposición de pozos en la placa de RID

9. Permitir que difunda el antígeno 48 h. 10. Medir con la regleta para RID el diámetro del halo formado, esta regleta

tiene marcadas líneas convergentes-divergentes, las cuales deben quedar dispuestas en forma tangente al halo y las marcas en líneas en cruz al centro. La línea vertical del centro del pozo da la medida del diámetro elevado al cuadrado (ver figura 2.9).

12

10

11 1 2

3

4 5 6

7

8

9

49 Lectura: 54.75 mm2

64

43

Figura 2.9 Medición de los diámetros de los halos de precipitación.

RESULTADOS Construir una curva de calibración con los resultados de los estándares de concentración conocida, graficando concentración (abscisas) vs diámetro al cuadrado (ordenadas), e interpolar los valores de diámetro al cuadrado de las muestras problemas. La recta formada no tiene origen en cero. Y el punto en que corta al eje de las ordenadas es una constante para la placa y depende de tres factores: el diámetro del pozo en que se colocaron los reactivos, la concentración del Ac incorporado y la altura del gel. Obtener la concentración de albúmina de las muestras problema. Es importante considerar el factor de dilución de los sueros problema al momento de calcular la concentración de éstos. Comparar los cantidades obtenidos con los valores de referencia para albúmina en suero y determinar si se encuentran alterados. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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Práctica No. 7 INMUNOELECTROFORESIS

Análisis de Proteínas en Suero Humano. MARCO TEÓRICO Este método combina la precipitación antígeno-anticuerpo por difusión en gel con la electroforesis o separación de los antígenos de acuerdo a su carga. En un primer paso se hace la electroforesis del antígeno en un gel de agarosa purificada sometiéndolo al paso de una corriente eléctrica, en un pH en el que las proteínas cargadas positivamente migran hacia el polo negativo y las negativas hacia el electrodo positivo. Una vez hecha la separación, se corta un canal a lo largo del gel y se llena con el anticuerpo, dejándolo difundir. En la zona de equivalencia de cada antígeno se forman líneas de precipitación que aparecen como un patrón de bandas que permiten analizar cualitativamente las proteínas presentes. En la clínica, este procedimiento es de gran valor diagnóstico en la identificación de paraproteinemias, de inmunoglobulinas monoclonales que aparecen en el mieloma y algunos linfomas, de complejos Ag-Ac, etc. La IEF se usa básicamente como un método cualitativo, pero puede ser cuantitativo si se corre paralelamente un suero estándar, o cuantitativo si en estas mismas condiciones se lee en un integrador. Para tener un grado de resolución mayor de las líneas de precipitación es muy recomendable teñirlas con cualquier colorante para proteínas. Es trascendente conocer que el efecto electroendosmótico influye de manera importante en un corrimiento inmunoelectroforético: como el agar no es una sustancia absolutamente neutra, el fenómeno secundario de electroendósmosis acompaña a la electroforesis, y consiste en un movimiento regular de cargas del líquido que embebe el gel en el sentido opuesto a la corriente eléctrica. Si estas dos migraciones son iguales la impresión dada es que la sustancia no se ha movido, en cambio su movilidad será en sentido de la corriente, aunque más reducida, si sus moléculas están fuertemente cargadas. Las sustancias poco cargadas son desplazadas por electroendósmosis en sentido contrario al de sus migración electroforética real. Este efecto es minimizado en un corrimiento electroforético si se iguala la fuerza iónica del amortiguador del gel y de la cámara electroforética. MATERIAL 4 Portaobjetos 2 Caja Petri 1 Hisopo 8 Tiras de papel filtro 1 Horadador de 3 mm 1 Bisturí Equipo de succión constituido por: Matraz Kitasato de 500 mL adaptado

con tapón de hule No. 6 monohoradado, tubo de vidrio de 12 cm y 2 tramos de manguera para vacío de 30 cm

Cámara de electroforesis Fuente de poder

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10 µl Suero humano 10 µl ASH 10 µl IgG purificada 100 µl Suero anti-humano polivalente 100 µl Suero anti-ASH 100 µl Suero anti-IgG humana 3.5 mL Solución de agarosa al 1.5% en amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 2.0 mL Solución de agar noble al 0.3% en amortiguador de Veronal-acetato pH

8.2 para sellar 500 mL Amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 2 µl Solución de azul de bromofenol TÉCNICA 1. Barnizar los portaobjetos limpios y libres de grasa con la solución de agar

al 0.3% caliente y dejar secar. 2. Colocar los portaobjetos en una superficie completamente horizontal y

vaciar sobre ella con un movimiento rápido aproximadamente 3.5 mL de agar al 1.5% fundido y caliente, a quedar una capa de agar homogénea de 3 mm de espesor.

3. Dejar solidificar perfectamente el gel de agar sobre la superficie nivelada. Colocar en el refrigerador 15 min para facilitar la ejecución de los cortes.

4. Perforar el agar de las placas (cortes circulares y canales) utilizando las plantillas adecuadas al sistema que se va aprobar (ver esquema).

5. Extraer ÚNICAMENTE el agar de las perforaciones circulares mediante un aplicador con punta rota o una aguja. NO RETIRAR EL AGAR DE LOS CANALES.

6. Llenar con una micropipeta los pozos circulares de los portaobjetos con 5 µl de los reactivos biológicos correspondientes, según el sistema de estudio (ver fig. 2.10), evitando derramamientos. Colocar en los pozos en donde se coloco suero humano 1 a 2 µl de solución de azul de bromofenol para que sirva como indicador del desplazamiento.

7. Vaciar a los reservorios de la cámara de electroforesis una cantidad de amortiguador de Veronal-acetato pH 8.2 que no llegue a tocar el soporte en donde se colocarán los portaobjetos.

8. Colocar la placa en la cámara de electroforesis con los pozos hacia le polo negativo. El contacto con el amortiguador se establece mediante tiras de papel filtro colocadas de manera que quede aproximadamente 1 cm sobre el gel de agar y 1 cm dentro del amortiguador, evitando las burbujas entre el papel y el gel, ya que afectaría al paso de la corriente.

9. Conectar la cámara de electroforesis a la fuente de poder y ajustar la corriente a 90 volts. Cuando la muestra teñida haya avanzado 3 cm aproximadamente se desconecta la cámara.

10. Retirar los portaobjetos, remover cuidadosamente el agar de los canales y colocar ahí 80 µl del Ac correspondiente, según el sistema trabajado (ver fig. 2.10).

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SISTEMA 1 Pozo 1: Suero humano Canal: Suero anti-humano polivalente Pozo 2: ASH SISTEMA 2 Pozo 1: Suero humano. Canal: Suero anti-humano polivalente Pozo 2: IgG purificada SISTEMA 3 Canal A: Suero anti-humano polivalente Pozo: Suero humano Canal B: Suero anti-ASH SISTEMA 4 Canal A: Suero anti-humano polivalente Pozo: Suero humano Canal B: Suero anti-IgG

Figura 2.10 Sistemas utilizados para la IEF

11. Colocar el portaobjetos dentro de una cámara húmeda (caja de Petri con

algodón mojado), taparla e incubar a temperatura ambiente de 18 a 24 h para que se lleve a cabo la difusión e inmunoprecipitación.

RESULTADOS Interpretar y reportar los resultados obtenidos, basándose en los patrones de precipitación reportados en la literatura. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


1

2

1

2

A

B

A

B

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UNIDAD 3 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN.

GENERALIDADES Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno especifico y este se encuentra en estado particulado o forme (p.ej. bacterias, eritrocitos, levaduras, células) reaccionan formando grumos o aglutinados. Los principios que regulan esta reacción son los mismos de la reacción de precipitación. Por lo tanto la aglutinación ocurre en dos fases: La primera fase es conocida como sensibilización. Proceso mediante el cual el anticuerpo se une al antígeno de la superficie de la partícula. En esta fase puede haber activación del complemento, donde se observa lisis. Esta unión del anticuerpo y el antígeno se logra por la formación de múltiples uniones no covalentes, como puentes de hidrogeno, electrostáticas, van der Waals e hidrofóbicas. La segunda fase es el resultado de la unión de las partículas mediante puentes de anticuerpo, formando grumos o aglutinados que pueden ser visibles a simple vista o en microscopio. Para que tenga lugar este fenómeno visible, se deben vencer las fuerzas de repulsión que mantienen normalmente separadas a las partículas, lo que se denomina potencial zeta. Por lo tanto se requieren un numero razonable de enlaces con el anticuerpo entre las células antes de superar la repulsión mutua. La IgM es superior a la IgG como aglutinante, debido a su enlace multivalente, superando la distancia entre partículas, en un medio salino. Mientras que la IgG requiere de medios proteicos como albúmina, o la utilización de enzimas proteolíticas como la bromelina para disminuir el potencial zeta y llegar a la segunda fase de la reacción. Otro medio para que la IgG pueda aglutinar es la utilización de una antigammaglobulina humana denominada suero de Coombs, la cual se une a la IgG unida al Ag formando puentes para poder vencer la distancia entre dos partículas y aglutinarlas. Esta reacción se ha utilizado ampliamente debido a la facilidad con que se lleva a cabo y su alta sensibilidad, comparada con las reacciones de precipitación. Sin embargo no permite la cuantificación exacta de anticuerpos y los resultados solo pueden expresarse en función de la dilución mayor del suero donde se observa el aglutinado, que corresponde al título de anticuerpos en el suero. Las reacciones de aglutinación pueden ser: Aglutinación directa o activa, donde los antígenos que intervienen son componentes naturales de la partícula.

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Y la aglutinación indirecta o pasiva, en donde los antígenos solubles se adsorben en forma artificial a partículas que funcionan como soporte, por ejemplo eritrocitos de carnero, eritrocitos humanos tipo “O”, bacterias como M. tuberculosis, levaduras como S. cervicieae, S. marcenses o partículas inertes como látex. , Esto les da la característica de ser particulados y poder aglutinar. Las reacciones de aglutinación en el laboratorio se pueden realizar de tres formas: en placa, tubo y en placa de microtitulación. En la reacción en placa se utiliza un portaobjetos o vidrio plano donde una gota del anticuerpo y otra del antígeno se mezclan y se observa aglutinación en los 3 minutos siguientes. En la técnica en tubo también se ponen una gota de anticuerpo y una de antígeno, se mezclan y centrifugan alrededor de 15-20 segundos y se lee aglutinación. En la de placa de microtitulación se utiliza una placa con pozas en las que se depositan de 25 a 50 µl de Ag y Ac, se mezclan y se requiere hasta de dos horas para leer los resultados.

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PRÁCTICA No. 8 AGLUTINACIÓN EN PLACA

Titulación de sueros anti-bacterianos MARCO TEÓRICO La aglutinación de una bacteria por un suero inmune específico resulta de la presencia de anticuerpos dirigidos contra los antígenos de la superficie bacteriana, presentes en la cápsula, flagelos o pared . Estas reacciones son usadas para estudios de composición de antígenos bacterianos, para diagnosticar enfermedades infecciosas buscando al agente causal, y para taxonomía en la clasificación de microorganismos aislados de diversas fuentes, como exudados, heridas, alimentos, aguas negras, etc. También el diagnóstico de cuadros infecciosos se puede realizar mediante el hallazgo de anticuerpos específicos en el suero de los pacientes contra una determinada bacteria, así como seguir la evolución del proceso en casos en que tenga correlación el título de anticuerpos con el cuadro clínico; las mejores aplicaciones de este caso son las reacciones febriles, utilizadas para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades causadas por bacterias de diversas especies en donde el proceso infeccioso cursa con una elevación marcada en la temperatura, entre otros síntomas inespecíficos. Estos gérmenes inducen una respuesta humoral con la producción de anticuerpos que fácilmente se identifican en el laboratorio utilizando los antígenos específicos, como sucede en la fiebre tifoidea causada por Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) “O” y “H” (reacción de Widal), la fiebre paratifoidea causada por S. paratyphi A y B, la fiebre de malta causada por B. melitensis (reacción de Huddlesson) y la fiebre de tifo causada por Rickettsia prowaseki (reacción de Weil-Félix), en esta última se utiliza como Ag a Proteus OX-19, OX-2 u OX-K ya que poseen determinantes antigénicos glucolípidos comunes con Rickettsia. Otra aplicación es la titulación de anticuerpos en el suero de animales inmunizados con antígenos de bacterias (sueros antibacterianos). Al finalizar la práctica el alumno será capaz de titular sueros inmunes obtenidos de conejos inmunizados contra antígenos bacterianos como “O” y “H” de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi), antígenos totales de E. coli, B. abortus o Sh. dysenteriae. MATERIAL 4 Tubos de 12 por 100 mm 1 Pipeta de 0.2 mL 1 Pipeta de 1 mL 1 Placa de vidrio de 25 por 20 cm 1 Lámpara de iluminación indirecta Aplicadores de madera o plástico Solución salina isotónica

50

1 mL Suero de conejos inmunizados 0.3 mL Suspensiones bacterianas de Salmonella 9,12,d,Vi (serotipo Typhi) “O” y

“H”, E. coli, B. abortus o Sh. dysenteriae, ajustadas a 15 x 109 /mL TÉCNICA 1. Dividir la placa de vidrio en cuadros de 4 columnas por 5 filas, con un lápiz

de cera para evitar que las reacciones se mezclen (ver fig. 31). 2. Utilizando la pipeta de 0.2 mL en la primera columna de 5 cuadros

adicionar 0.08 mL en el primer cuadro, en el segundo 0.04 mL, en el tercero 0.02 mL, en el cuarto 0.01 mL y en el quinto 0.005 mL del suero problema.

3. Agregar inmediatamente para evitar desecación, una gota de la suspensión bacteriana previamente homogeneizada a cada cuadro donde se puso antisuero y mezclar utilizando un aplicador de madera o plástico perfectamente formando un círculo.

4. Dar a las reacciones movimientos de rotación suave durante 2 minutos y leer el resultado con iluminación indirecta y sobre fondo obscuro. Las reacciones positivas dan acúmulos gruesos de bacterias sobre un fondo claro, mientras que las negativas quedan homogéneas.

Trabajando con los volúmenes anteriores se tienen las siguientes títulos: 0.08 mL de 1:20, 0.04 mL de 1:40, 0.02 mL de 1:80, 0.01 mL de 1:160 y de 0.005 mL de 1:320.

5. Si con las diluciones anteriores se obtuvieron reacciones positivas significa que el título de anticuerpos es igual o mayor de 1:320, por lo que se procede a diluir el suero 1:10 con SSI (0.1 mL de antisuero y 0.9 de SSI) y en la segunda columna se agregan los volúmenes 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 mL en los cuadros correspondientes, y se repiten los pasos 3 y 4.

Los títulos correspondientes serían: 0.04 de 1:400, 0.02 de 1:800, 0.01 de 1:1600 y 0.005 de 1:3200. Si todas las reacciones son positivas tendremos que el título es igual o mayor a1:3200.

7. Se procede a realizar una dilución 1:50 del suero (0.1 mL de antisuero diluído 1:10 y 0.4 mL de SSI) y se agregan a los cuadros de la tercera columna 0.02 mL, 0.01 mL y 0.005 mL; dando títulos de 1:4000, 1:8000 y 1:16000 respectivamente, si dan reacciones positivas con la suspensión bacteriana repitiendo los pasos 3 y 4.

8. Si todas las reacciones anteriores fueron positivas significa que el título de anticuerpos es igual o mayor de 1:16000 y por tanto procedemos a realizar la última dilución del suero 1:100 (haciendo una dilución 1:2 de la dilución 1:50 o si se prefiere hacer una dilución 1:10 de la de 1:10 para obtener en cualquier caso 1:100). Agregando de esta solamente en un cuadro de la cuarta columna la cantidad de 0.005 que corresponde a un título ≥ 1:32,0000, si después de repetir los pasas 3 y 4 da positiva.

9. El título del antisuero será la máxima dilución del suero en donde se observe aglutinación franca (ver fig. 3.1)

SUERO CONC. SUERO 1:10 SUERO 1:50 SUERO 1:100

51

0.08 1:20

0.04 1:40

0.04 1:400

0.02 1:80

0.02 1:800

0.02 1:4000

0.01 1:160

0.01 1:1600

0.01 1:8000

0.005 1:320

0.005 1:3200

0.005 1:16000

0.005 1:32000

Figura 3.1 Interpretación de la reacción de aglutinación en placa. Título: Máxima dilución del suero que presenta reacción

de aglutinación visible. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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Práctica No. 9 AGLUTINACIÓN EN TUBO

Tipificación de Grupo Sanguíneo ABO Y Rh. MARCO TEÓRICO Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antigénicas determinadas genéticamente las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos específicos. SISTEMA ABO: El primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, que se conoce como sistema ABO, el cual consta de tres antígenos denominados A, B y H que dan los cuatro diferentes grupos de este sistema : A , B, AB y O. Estos antígenos son glucoproteínas que se forman por acción de diferentes enzimas codificadas por los genes A, B y H y modifican una sustancia precursora. La sustancia precursora es una cadena de N-acetilglucosamina, D-galactosa, N-acetilglucosamina y D-galactosa, que es modificada por la enzima 1,2 fucosil-transferasa codificada por el gen H y que adiciona una fucosa en la parte terminal de la sustancia precursora que es la D-galactosa terminal con lo que se convierte en la sustancia H. La sustancia H es modificada por las enzimas codificadas por el gen A y/o el gen B que son una 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa y 1-3 galactosidil-transferasa respectivamente. Si la sustancia H es modificada por 1-3 N-acetilgalactosaminil-transferasa esta le adiciona una N-acetilgalatosamina en su parte terminal donde esta la D-galactosa dando lugar a la sustancia A. Si lo que modifica la sustancia H es la 1-3 galacosidiltransferasa esta le adiciona una galactosa en la parte terminal donde esta la D-galactosa dando lugar a la sustancia B. El denominado grupo O, no es otra cosa que la sustancia H, por lo tanto no heredo los genes A y B , y su sustancia H no es modificada. Si se heredan los dos genes A y B estos son codominantes por lo tanto tendrán sustancia A y sustancia B en sus eritrocitos y se les denomina grupos AB. Como las sustancias del sistema ABO son químicamente similares a antígenos bacterianos y de alimentos, los que estimulan al sistema inmune a producir anticuerpos a partir del nacimiento y siendo detectables a los 6 meses de vida, a estos anticuerpos así formados se les denomina naturales. Por tanto, la tipificación del sistema ABO se realiza de dos maneras:

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Tipificación directa: Se pone de manifiesto los antígenos presentes en la membrana del eritrocito, cuando se les hace reaccionar con anticuerpos específicos. Tipificación inversa: Se ponen de manifiesto los anticuerpos presentes en el suero del individuo cuando se les hace reaccionar con eritrocitos tipificados para el sistema ABO. SISTEMA Rh: Por otro lado el sistema Rh esta constituido por mas de 40 antígenos proteicos distintos, cinco de los cuales son importantes por su inmunogenicidad y frecuencia. Los genes que codifican a este sistema se designan con símbolos: D y d, C y c , E y e, cada gen (con excepción de d) codifica para un antígeno específico, que puede ser detectado en la membrana del hematie. La presencia o ausencia del antígeno D es lo que determina que un individuo sea Rh positivo o negativo. Los anticuerpos del sistema Rh son de clase IgG, siendo estimulados por transfusión o por embarazo, ya que el individuo Rh negativo esta recibiendo hematíes Rh positivos, no son naturales. Los anticuerpos que se forman después de recibir sangre o sus derivados se denominas aloanticuerpos inmunes o adquiridos. En esta práctica se llevará a cabo la tipificación directa e inversa del sistema ABO, así como la determinación del Rh, logrando la identificación de estos grupos sanguíneos y se analizará la importancia de esta técnica en la práctica transfusional y médico-legal. MATERIAL 2 Pipetas Pasteur con bulbo 1 Gradilla 8 Tubos de 12 x 75 mm 3 mL Sangre total 3 mL Solución salina isotónica (SSI) 2 gotas Suero anti-A 2 gotas Suero anti-B 2 gotas Suero anti-AB 2 gotas Suero anti-D 1 gota Suspensión de GR A al 5% 1 gota Suspensión de GR B al 5%

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TÉCNICA 1. Centrifugar la muestra sanguínea 5 min a 2000 rpm y separar el plasma

(para la prueba inversa) y el paquete celular (para la prueba directa) en diferentes tubos, previamente marcados.

2. Preparar una suspensión al 5% del paquete celular de la muestra, adicionando a un tubo una gota de pipeta Pasteur del paquete celular y adicionando 19 gotas de SSI.

3. Rotular cuatro tubos con A, B, AB y D respectivamente, a los cuales se les agrega una gota de suspensión al 5% del paquete celular a cada tubo.

4. Adicionar al tubo A dos gotas de suero anti-A, al tubo B dos gotas de suero anti-B, al tubo AB dos gotas de suero anti-AB y por último al tubo rotulado D agregar dos gotas de suero anti-D.

5. Mezclar el contenido de los tubos y centrifugar 30 seg a 2000 rpm. 6. Realizar la lectura agitando suavemente el tubo para resuspender el botón

formado. La presencia de cúmulos celulares indica la presencia del antígeno en la superficie del eritrocito.

7. Para la prueba inversa se toma el plasma de la muestra y se agregan dos gotas a cada tubo rotulado previamente con anti-A y anti-B, mas una gota de suspensión de G.R. A al 5% al tubo rotulado anti-A y una gota de suspensión de G.R. B al 5% al tubo marcado anti-B.

8. Centrifugar 30 seg a 2000 rpm. 9. Resuspender el botón agitando suavemente, la reacción de aglutinación

positiva indicara la presencia de los anticuerpos contra los antígenos de los G.R. utilizados como reactivo.

RESULTADOS Con las observaciones realizadas complete el siguiente cuadro y determine el grupo sanguíneo de la muestra problema

TIPIFICACION DIRECTA TIPIFICACION INVERSA

GRUPO SANGUINEO

A B AB D ANTI-A ANTI-B ABO D



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PRÁCTICA No. 10 HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA

Titulación de Anticuerpos frente a Tiroglobulina MARCO TEÓRICO En la hemaglutinación indirecta o pasiva, los eritrocitos de carnero o humano tipo “O”, se utilizan como soporte de antígenos debido a que son fáciles de obtener y de conservar en el laboratorio bajo ciertas condiciones durante 15 a 30 días. Fijan espontáneamente a su superficie casi todos los polisacáridos y ciertas proteínas, cualidad que se incrementa cuando los eritrocitos son tratados con sustancias tales como el ácido tánico que favorece la unión por atracción electrostática. También se les puede unir covalentemente el antígeno proteico, usando reactivos como el glutaraldehído. Una vez que los eritrocitos han sido “sensibilizados” (recubiertos) con el antígeno producen aglutinación cuando se ponen en contacto con anticuerpos específicos. La técnica de Boyden es altamente sensible y fácil de realizar, por lo que se emplea para la cuantificación de anticuerpos presentes aún en cantidades pequeñas en el diagnóstico de un gran número de enfermedades. Para conocer la cantidad de Ac presentes, se hacen reaccionar dilaciones seriadas del suero, con cantidades constantes de una suspensión de eritrocitos sensibilizados con un Ag específico, la dilución más alta del suero que determina una clara hemaglutinación, se considera como punto final de la reacción y representa el título de anticuerpos. La prueba puede realizarse mediante una macrotécnica (en tubo) o una microtécnica (placa). Así, por ejemplo proteínas tales como la tiroglobulina son adsorbidas rápidamente a la superficie de glóbulos rojos tratados previamente con ácido tánico. La tiroglobulina, extraída de glándula tiroides humana por las técnicas de precipitación con sales neutras y adsorbida a eritrocitos de carnero tanados, proveen una prueba de hemaglutinación indirecta para la detección de anticuerpos frente a tiroglobulina. La estabilidad durante el almacenamiento de las células tanadas y recubiertas con el antígeno (sensibilizadas), se logra por tratamiento de la suspensión final con formalina. Como algunos sueros humanos contienen anticuerpos heterófilos capaces de aglutinar eritrocitos de carnero, se debe incluir un control de eritrocitos tanados sin sensibilizar (testigo negativo). Si en éste existe aglutinación, la prueba se repite con el suero previamente adsorbido con eritrocitos de carnero tanados. La prueba de hemaglutinación fue inicialmente usada por Witebsky y Rose para la cuantificación de autoanticuerpos frente a tiroglobulina.

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La glándula tiroides tiene ciertas propiedades funcionales y estructurales exclusivas que la predisponen para el desarrollo de respuestas autoinmunes. El constituyente principal de los folículos tiroideos es la tiroglobulina (glucoproteína de PM 660 Kd), que representa la forma de almacenamiento de las hormonas tiroideas, tiroxina y triyodotironina, que afectan la velocidad del metabolismo en todas las células del cuerpo. El diagnóstico de patología autoinmune de la glándula tiroides, consiste principalmente en la demostración de autoanticuerpos contra la tiroglobulina, y en menor grado frente al antígeno microsomal. Se pueden encontrar autoanticuerpos frente a estos constituyentes en: tiroiditis aguda, subaguda, fibrótica, crónica (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo primario (mixedema en el adulto), hipertiroidismo (tirotoxicosis o enfermedad de Graves), y en carcinoma de tiroides; la diferencia de estos padecimientos se hace de acuerdo a su manifestación clínica, el estudio histológico y algunas otras pruebas de laboratorio. Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina también pueden presentarse en otros padecimientos como: anemia perniciosa, gastroenteritis atrófica, insuficiencia suprarrenal idiopática, insuficiencia paratiroidea y en el síndrome de Sjogren. Además de la hemaglutinación pasiva, se han utilizado otras pruebas para la detección de estos autoanticuerpos como la fijación de complemento, la inmunofluorescencia y el radioinmunoensayo.

PRIMERA PARTE TANADO Y SENSIBILIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS

MATERIAL 2 Tubos de ensayo de 13 x 100 mm 3 Pipetas de 5 mL (1/10) 2 Pipetas de 1 mL (1/100) 1 Gradilla 2 Pipetas capilares con bulbo Baño de agua a 370c Baño de agua a 560c Centrifuga clínica Papel Parafilm 4 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, µ = 0.15 6 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH= 6.4 µ = 0.15 15 mL Amortiguador salino de fosfatos (PBS) pH = 7.2, µ = 0.15, adicionado de

suero normal de conejo al 1%. 4 mL Acido tánico diluido 1:20 000 0.4 mL Formaldehído al 40% 2 mL Antígeno: Solución de tiroglobulina humana purificada (HTG) (dil. óptima) 4 mL Suspensión de G.R. de carnero al 2.5% en PBS 7.2 0.15 M, pH 7.2. TÉCNICA TANADO DE LOS GLÓBULOS ROJOS:

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1. Rotular 2 tubos de ensayo, uno “S” (sensibilizados) y otro “NS” (no sensibilizados).

2. En cada tubo, pipetear 2 mL de la suspensión de eritrocitos de carnero al 2.5% (procurando que la suspensión este perfectamente homogeneizada).

3. Agregar un volumen igual de ácido tánico 1:20 000 a cada tubo. Inmediatamente tapar con papel parafilm y mezclar por inversión.

4. Incubar ambos tubos en baño María a 37 °C durante 15 min. Agitar eventualmente.

5. Centrifugar los dos tubos a 2 000 rpm durante 5 min, retirarles el sobrenadante con pipeta Pasteur o por decantación cuidadosa y resuspender los paquetes de G.R. en 2 mL de PBS pH = 7.2 y volver a centrifugar 5 min.

6. Retirar el sobrenadante y resuspender el paquete de G.R. de cada tubo en 2 mL de PBS pH= 6.4 para tener nuevamente la suspensión al 2.5%.

SENSIBILIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS CON ANTÍGENO: 1. Los G.R. tanados se sensibilizan agregando un volumen igual de la

dilución óptima de antígeno en PBS pH= 6.4. Para ello al tubo rotulado “S” agregarle 2 mL de la dilución óptima de antígeno (tiroglobulina humana).

2. Tapar con papel parafilm e incubar la mezcla en baño de agua a 37 °C durante 15 min. Agitar eventualmente.

4. Retirar las células del baño de agua y centrifugar 5 min a 2000 rpm. 5. Decantar el sobrenadante y lavar las células dos veces por centrifugación

a 2000 rpm por 5 min con PBS pH = 7.2, adicionado de suero normal de conejo al 1%.

6. Ajustar el paquete de células al 1.5% resuspendiendo en 3.3 mL de PBS pH= 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.

7. Al tubo rotulado “NS” que contiene los 2 mL de eritrocitos tanados sin sensibilizar, ajustarlos al 1.5% en el mismo amortiguador. Para ello centrifugar, retirar el sobrenadante y agregar 3.3 mL de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.

FORMALINIZACIÓN DE LOS GLÓBULOS ROJOS: Este procedimiento se realiza para preservar los GR cuando se preparan grandes cantidades, para utilizarse durante mucho tiempo (duran hasta 6 meses sin disminuir su actividad antigénica). 1. A los G.R. sensibilizados y sin sensibilizar se les adiciona lentamente 1 mL

gota a gota de formaldehído al 40% por cada 10 mL de suspensión (a cada tubo agregar 0.2 mL de formaldehído al 40%).

2. Dejar reposar 18 h a 4 ºC. 3. Agregar otros 0.2 mL de formaldehído al 40% a cada uno de los tubos. 4. Cuando las células han sedimentado (después de 2 ó 3 días) se retira el

sobrenadante y se resuspenden las células en su volumen original de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1%.

5. Se agitan nuevamente las células y se añade 1 gota (0.05 mL) de formaldehído al 4%.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DE ANTÍGENO:

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1. Preparar 4 diluciones del antígeno HTG en PBS pH= 6.4: por ejemplo 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160.

2. Sensibilizar los G.R. con cada dilución de antígeno como se indicó anteriormente.

3. Probar con un suero positivo y otro negativo, cada una de las diluciones. La mas baja dilución de antígeno, que de el título más elevado con el suero inmune y no reaccione con el suero negativo se considerará el óptimo.

SEGUNDA PARTE: DESARROLLO DE LA PRUEBA

MATERIAL 1 Micropipeta de 25 µl 1 Placa de microtitulación fondo en “U” 1 Microdilutor Baño de agua a 56oc. Rotor 3.3 mL Suspensión de G.R. al 1.5% sensibilizados con el Ag 3.3 mL Suspensión de G.R. al 1.5% no sensibilizados 25 µL Suero control positivo 25 µL Suero control negativo 50 µL Suero problema diluído 1:8 3 mL Amortiguador de fosfatos PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de

conejo al 1%. TÉCNICA 1. Inactivar los sueros problema a 56 ºC durante 30 min o a 63 ºC por 3 min. 2. A todas los pozos de las filas A, B, C, D y E de la placa de microtitulación

agregar con una micropipeta 25 µl de suero normal de conejo al 1% diluido en PBS pH= 7.2.

3. Cargar el microdilutor con 25 µl de suero problema y colocarlos en la primera poza de la fila A; mezclar completamente y transferir 25 µl a la poza siguiente, repitiendo este proceso hasta la ultima poza de la hilera de donde se descartan 25 µl.

4. A cada dilación del suero, agregar con una micropipeta 25 µl de la suspensión de glóbulos rojos al 1.5% sensibilizados.

5. Colocar la placa en el rotor y agitar de 1 min. 6. Dejar reposar la placa a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas

cubriéndola; hacer la lectura. Al mismo tiempo se corren los siguientes controles: Control para Ac heterófilos: Probar las mismas diluciones del suero problema con eritrocitos sin sensibilizar (fila B).

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Control positivo: Hacer las mismas diluciones del suero control positivo y agregar 25 µl de eritrocitos sensibilizados a cada una de las pozas (fila C). Control negativo: Realizar la misma operación con un suero negativo conocido (fila D). Control del diluyente: Depositar 25 µl de PBS pH = 7.2 adicionado de suero normal de conejo al 1% en una hilera de pozas (fila E) y agregar 25 µl de la suspensión de células sensibilizadas al 1.5%. Esta reacción deberá ser negativa. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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UNIDAD 4 REACCIONES DE CITÓLISIS

GENERALIDADES Una de las funciones efectoras de los anticuerpos producidos en la respuesta inmune humoral, es la activación del sistema complemento. El complemento es un complejo multienzimático presente en el suero de todos los vertebrados, cuyos componentes que en su mayoría son glucoproteínas se encuentran como precursores inactivos (zimógenos), y por tanto requieren de ser activados. También participan de forma importante iónes Ca++ y Mg++ durante la activación. La activación del sistema complemento se lleva a cabo en forma de cascada, es decir, los componentes se van activando secuencialmente uno a uno y derivado de su activación se generan varías actividades, entre ellas: quimiotaxis, opsonización, degranulación de basófilos y células cebadas (con la consecuente vasodilatación y contracción de músculo liso) y la lísis celular. La activación del complemento se puede llevar a cabo por dos vías principales, la clásica y la alterna. La vía clásica es activada por una reacción Ag-Ac, en la cual el Ac participante es de clase IgG o IgM, mientras que la vía alterna se activa por factores no inmunológicos como son los lipopolisacáridos bacterianos (LPS), el zimosan, la inulina y algunos policationes y polianiones. Recientemente se ha descrito una tercera vía de activación denominada vía de la lectina que involucra a la proteína que une manosa (MBL) que se une a residuos de manosa, y otros azúcares (N-acetilgalactosamina, manosamina, fucosa, galactosa y galactosamina), presentes en proteínas y polisacáridos microbianos. Cuando la activación del complemento se lleva a cabo sobre una superficie celular por cualquiera de estas vías, en las últimas etapas se forma el complejo de ataque a la membrana (MAC), que causa la lisis de dicha célula. En la figura 4.1 se describe la vía clásica de activación del complemento. Debido a que las actividades que se generan durante la activación del complemento pueden causar daño a los propias células y tejidos del huésped, existen factores que actúa en la regulación del sistema. En las reacciones de citólisis, en donde se utiliza el Complemento como reactivo (titulación de hemolisinas, y reacción de fijación de complemento) en donde se utiliza el suero de algún animal como fuente de complemento (cobayo), o cuando se cuantifica el complemento en el suero de un paciente, debe tomarse en cuenta que algunos de los componentes son termolábiles, y pierden rápidamente su actividad, por lo que se debe utilizar el suero recientemente obtenido y conservado en refrigeración o en su caso usar productos comerciales liofilizados.

VIA CLASICA

C3

C3 CONVERTASA Ag-Ac-C1; C4b2b Ag-Ac-C1; C4b

C4

C2a

C2

Mg 2+

C4a Ag-Ac-C1 Ag - Ac

Ca 2+

C1q,r,s

2 IgG ó

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Fig. 41 Activación del Complemento por la Vía Clásica.

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PRÁCTICA No. 11 TITULACIÓN DE AMBOCEPTOR HEMOLÍTICO ANTICARNERO

MARCO TEÓRICO Las hemolisinas son anticuerpos producidos frente a los antígenos que se encuentran en la superficie de los eritrocitos. Estos anticuerpos, también llamados amboceptores hemolíticos, al estar en presencia del antígeno que estimuló su formación y del complemento desencadenan una reacción que causa la lisis de los eritrocitos. Este fenómeno es el resultado de la acción enzimática del complemento, el cual es activado por la vía clásica, formándose el complejo de ataque a la membrana (MAC) el cual causa daño a la membrana del eritrocito que a su vez va a producir cambios en su permeabilidad y al cambiar las propiedades osmóticas de ésta, penetran líquidos y se produce el estallamiento de los eritrocitos. Para medir la actividad del amboceptor hemolítico se prueban diferentes diluciones del suero de conejo inmunizado con G.R. de carnero, frente a una cantidad constante de complemento (suero de cobayo) y de G.R. de carnero lavados y ajustados a una suspensión del 2%. La máxima dilución del suero de conejo que produce hemólisis total indica el título del amboceptor hemolítico anticarnero. Para algunas técnicas no se toma como punto final la hemólisis total, sino el 50% de hemólisis y para esto se hace la medición colorimétrica de la hemoglobina liberada. MATERIAL 21 Tubos de ensayo de 12 x 75 mm 3 Pipeta de 1 mL (1/10) 1 Pipetas de 2 mL (1/10) 1 Pipeta de 10 mL (1/100) 1 Gradilla Baño de agua a 370c Centrifuga clínica Papel Parafilm 0.2 mL Amboceptor hemolítico anticarnero obtenido en la práctica No. 1.V 2.0 mL Suspensión de G.R. de carnero lavados y ajustados al 2%. 4.0 mL Suero de cobayo diluído 1:30 (fuente de complemento). Nota: El suero debe ser de cobayo macho, de más de 500 g de peso,

recientemente obtenido o liofilizado TÉCNICA 1. Preparar en 10 tubos de 12 X 75 mm las diluciones del amboceptor

hemolítico anticarnero en amortiguador de de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo Amortiguador Amboceptor Hemolítico anticarnero Dilución

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No. Veronal (mL) (o sus diluciones) (mL) Final 1 0.9 0.1 Mezclar 1:10 2 0.9 0.1 (del tubo 1) Mezclar 1:100 3 2.7 0.3 (del tubo 2) Mezclar 1:1 000 4 0.5 0.5 (del tubo 3) Mezclar 1:2 000 5 1.0 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 8 1:3 000 6 1.5 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 9 1:4 000 7 2.0 0.5 (del tubo 3) Mezclar y pasar 0.5 al No. 10 1:5 000 8 0.5 Mezclar 1:6 000 9 0.5 Mezclar 1:8 000

10 0.5 Mezclar 1:10 000 2. En otros 9 tubos de ensayo transferir 0.2 mL de cada una de las diluciones

a partir de la de 1:1 000, en el último tubo no se coloca hemolisina. 3. Adicionar a los tubos del 1 al 8 un volumen de 0.4 mL de complemento

diluído 1:30 y mezclar perfectamente. 4. Agregar a todos los tubos, incluyendo el No. 9, 0.2 mL de la suspensión de

glóbulos rojos al 2% y mezclar perfectamente. 5. Agregar a los tubos del 1 al 8 un volumen de 0.4 mL de amortiguador de

veronal y al No. 9 un volumen de 1.0 mL. Mezclar perfectamente. (Ver esquema de la reacción)

ESQUEMA DE LA REACCIÓN: Tubo No.

mL de dilución de amboceptor

Complemento diluído 1:30

Suspensión de G.R. carnero

Amortiguador Veronal

1 0.2 (1:1 000) 0.4 0.2 0.4 2 0.2 (1:2 000) 0.4 0.2 0.4 3 0.2 (1:3 000) 0.4 0.2 0.4 4 0.2 (1:4 000) 0.4 0.2 0.4 5 0.2 (1:5 000) 0.4 0.2 0.4 6 0.2 (1:6 000) 0.4 0.2 0.4 7 0.2 (1:8 000) 0.4 0.2 0.4 8 0.2 (1:10 000) 0.4 0.2 0.4 9

(Control) ------- ------- 0.2 1.0

6. Colocar la gradilla con los tubos en un baño de agua a 37°C y observar

después de transcurrida una hora. 7. Al término del periodo de incubación, centrifugar los tubos a 3 000 rpm

durante 5 minutos para facilitar la lectura, ya que los eritrocitos que no fuero lisados se acumulan en el fondo y se puede apreciar perfectamente en que tubos no hay hemólisis o en su caso hemólisis parcial o total.

RESULTADOS La unidad de amboceptor hemolítico está dada por la máxima dilución del suero que es capaz de causar hemólisis total.

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Título obtenido: _____________________ NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso


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Unidad 5 TÉCNICAS CON ANTICUERPOS O ANTÍGENOS MARCADOS

GENERALIDADES Las reacciones Ag-Ac, pueden ser utilizadas para revelar la presencia de uno u otro de estos reactantes. Es decir, se pueden utilizar Ac para demostrar la presencia de Ag en una muestra problema y, viceversa, se pueden utilizar Ag para revelar la presencia de Ac. La especificidad de la reacción Ag-Ac le da a estas reacciones in vitro una elevada confiabilidad. La sensibilidad de estas pruebas ha sido aumentada significativamente al utilizar “marcas” que al estar unidas a los Ag o a los Ac, según sea el caso, permiten demostrar la presencia de cantidades sumamente pequeñas de los reactantes. Las principales sustancias utilizadas como marcas son: isótopos, enzimas y fluorocromos. Los isótopos se comenzaron a usar en 1966 por la Dra. Yallow , cuando realizó el primer Radioinmunoanálisis (RIA), que se trataba de un ensayo competitivo en donde se permitía la competencia entre moléculas de Ag no-marcadas y marcadas con radiosótopo por los sitios de unión con anticuerpos específicos. La marca en este caso se denomina trazador y tiene el objeto de permitir la identificación y la cuantificación del analito en la fracción libre y unida de la reacción. Al término de la reacción se separan las moléculas de Ag que quedan unidas al Ac de las que no lo están, mediante métodos de separación que pueden ser fisicoquímicos como adsorción, intercambio iónico, filtración molecular, o bien, inmunológicos utilizando un segundo Ac anti-gammaglobulina para precipitar al complejo Ag-Ac previamente formado, a este método se la conoce como método del segundo anticuerpo. Actualmente este segundo Ac anti-gammaglobulina se adsorbe a una fase sólida para capturar a los complejos Ag-Ac, que después de un periodo de incubación y procesos de lavado se separa el sobrenadante. Finalmente mediante un contador de centelleo se determina la radioactividad presente. Generalmente basta con contar solo una de las fracciones (unida o libre), pero preferentemente se determina la fracción unida, que estará en relación a la cantidad de Ag marcado, con lo cual: “La cantidad de radioactividad es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno no marcado”. Para 1971 Engall y Perlman, desarrollan el RIST (radio immunosorbent assay), en donde las moléculas de Ag marcado radioactivamente interaccionan con Ac inmovilizados en celulosa o sephadex. Posteriormente estos autores describen la aplicabilidad de conjugar a los Ac a enzimas en lugar de radioisótopos, con lo que nacen los inmunoensayos enzimáticos (EIA); de estos existen dos variedades, los homogéneos y los heterogéneos. En un EIA homogéneo la reacción se lleva a cabo en fase líquida y no se requieren de etapas o medios para separar los complejos Ag-Ac formados de los Ac o Ag (según sea el caso) que permanecen libres en el sistema y que no han

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intervenido en la reacción. Estos EIA se basan en la inhibición o activación de la función de la enzima por la interacción Ag-Ac. Generalmente las enzimas que se utilizan son de bajo peso molecular que puedan ser conjugadas a un hapteno, como ejemplo esta la lisozima. En los sistemas heterogéneos se utiliza una fase líquida en donde se encuentran inicialmente disueltos algunos de los reactivos y una fase sólida en donde se lleva a cabo la reacción. A diferencia de los homogéneos, la actividad enzimática del conjugado no se ve influida por la reacción inmunológica y además requieren medios físicos para separar las fracciones libres de las unidas, ya que después de que se lleva a cabo la reacción Ag-Ac, los complejos se retienen en la fase sólida, y mediante lavados se eliminan los Ac o Ag que no intervienen en la reacción. El EIA heterogéneo por excelencia es el ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay). En ambos casos, el paso final es la adición del sustrato específico para demostrar cualitativa o cuantitativamente la actividad enzimática, que estará en relación a la presencia o ausencia del Ag o Ac buscado. La lectura del resultado puede ser visual (cualitativa) o mediante un colorímetro o fluorómetro (cuantitativa). La tercera marca utilizada son los fluorocromos como el isotiocianato de fluoreceína y la rodamina que se conjugan a los Ac, para identificar o localizar Ag en la superficie y dentro de la célula lo que da origen a los métodos de inmunofluorescencia, de los cuales existen dos principales modalidades la directa y la indirecta. En la inmunofluoresencia directa, los Ac marcados con el fluorocromo están dirigidos al Ag buscado y la demostración se hace en un solo paso, mientras que en la indirecta se lleva a cabo en dos pasos, en el primero se utiliza un Ac no marcado que se une al Ag celular el cual es demostrado en el segundo paso mediante una antiglobulina marcada con el fluorocromo. La fluorescencia se hará visible amarilla verde o roja según sea el caso, cuando se examina en un microscopio de fluorescencia. Cabe mencionar que adicional a estos tres principales marcadores (radioisótopos, enzimas y fluorocromos) se han utilizado otros como la ferritina, compuestos quimioluminiscentes y existen diferentes modalidades que utilizan amplificadores como en el sistema avidina-biotina que también es utilizado ampliamente.

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Práctica No.12 ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA)

MARCO TEÓRICO Se trata de un EIA heretogéneo que utiliza como marca enzimas, es una prueba cuantitativa o cualitativa.. En el primer caso sirve para medir la concentración (nanogramos o picogramos/mL) de antígenos o anticuerpos presentes en una muestra. En el segundo caso solo revela la presencia de ellos en una muestra problema y la reacción resulta simplemente positiva o negativa. Los reactivos de ELISA cuentan con una vida media larga, pueden automatizarse y no hay contaminación radiactiva, dándole con esto ventajas sobre el RIA. Para realizar una técnica de ELISA se requiere contar con: Fase sólida: Es donde el Ag o Ac pueden estar adsorbidos en su superficie mediante interacciones hidrofóbicas. Los materiales más usados son: poliestireno, cloruro de polivinilo (PVC), nylon, polipropileno, nitrocelulosa, goma de silicona y vidrio; que pueden encontrarse comercialmente como microplacas de fondo plano, tubos o perlas. Cuando a una fase sólida se le adsorben los Ac, se esta buscando al Ag en la muestra problema, por ejemplo en la detección del Ag de superficie de hepatitis B (HBsAg), en cambio cuando se han adherido los Ag a la fase sólida se va ha detectar la presencia de Ac en la muestra problema, por ejemplo en la búsqueda de Ac contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Bloqueador: Se utiliza para bloquear los sitios libres de la fase sólida para evitar que durante la reacción algunas moléculas de reactivo se unan inespecíficamente a la fase sólida, en lugar de hacerlo por medio de la reacción Ag-Ac, dando lugar a resultados falsos y se observe un exceso de actividad enzimática que no es real. Para ello, se puede usar un exceso (0.1 al 1%) de una proteína inerte. Entre los bloqueadores más usados esta la caseína, seroalbúmina bovina, gelatina, suero entero y leche entera (sveltex). Conjugado: Es la unión de una enzima a un Ac o Ag en forma covalente, dando como resultado complejos Ag-enzima o Ac-enzima sin que se pierda la actividad inmunológica o enzimática. La técnica más usada para conjugar es la de Avrameas o del gluteraldehído. Enzima y sustrato: Son los indicadores de que la reacción Ag-Ac ha ocurrido, de ellos depende la sensibilidad total del ensayo, logrando esta cuando se conocen todos los requerimientos de la enzima. La enzima debe conservar toda su actividad enzimática al ser conjugada y tener un alto número de recambio (las moles de sustrato convertido en producto por unidad de tiempo). Las enzimas más usadas son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina. El sustrato generalmente es incoloro y el producto de la reacción enzimática debe ser fácil y sensiblemente detectable., debido a que desarrolle color, sea fluorescente o que emita luz.

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La presencia del producto indica la prueba positiva desde el punto de vista cualitativo. Para hacer el ensayo cuantitativo, se determina la cantidad de enzima adsorbida (por su actividad sobre el sustrato para dar un producto colorido, fluorescente o luminoso) la cual es proporcional a la cantidad de Ag o Ac en la muestra, entonces su concentración se puede medir mediante una curva de calibración utilizando estándares de concentración conocida. Las técnicas de ELISA se pueden realizar de 4 maneras diferentes: (1) directo, (2) indirecto, (3) sandwich y (4) por competencia. ELISA directo consiste en la adsorción pasiva de un Ag (o un Ac) sobre la superficie de la placa y luego la adición de un Ac (o Ag) que lleva conjugada la enzima. ELISA indirecto (para detección de Ac) consiste en adsorber pasivamente el Ag sobre la placa, adicionar el suero donde se buscan los Ac específicos contra el Ag y posteriormente añadir un segundo anticuerpo anti-gamma globulina que lleva conjugada la enzima. ELISA tipo sandwich (para detección de Ag) puede ser directo o indirecto. El primero consiste en adsorber los Ac específicos a la placa, después añadir la muestra que contiene el Ag y finalmente un segundo Ac (dirigido contra el mismo Ag) que tiene la enzima conjugada. El indirecto, utiliza un segundo Ac (contra el mismo Ag) no conjugado y en un paso siguiente un tercer Ac anti-gamma globulina conjugado a la enzima. ELISA por competencia puede ser directo o indirecto. La prueba se basa en que se tratan de unir dos reactivos a un tercero. La competencia apropiada exige la adición simultánea de los dos reactivos que van ha competir, uno de ellos marcado y el otro sin marca. En esta práctica se utilizará un juego de reactivos comercial, y el sistema utilizado y su aplicación variará de acuerdo a su disponibilidad, pero de cualquier forma a continuación se describen los pasos generales para la realización de un ELISA. PROCEDIMIENTO GENERAL DE UN ELISA: 1. Adsorber los Ag o Ac, según sea el caso a una fase sólida. 2. Bloquear la fase sólida. 3. Proceder a la “captura”, del Ag o Ac presente en la muestra problema a la

fase sólida (al reaccionar con el Ac o Ag) e incubar. 4. Lavar la placa para separar lo que reacciono de lo que NO reacciono. 5. Adicionar el conjugado e incubar. 6. Lavar la placa para separar lo que reacciono de lo que NO reacciono. 7. Adicionar el sustrato específico de la enzima usada. Para revelar la

reacción. 8. Detener la reacción enzimática por un cambio drástico de pH.

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9. Interpretar los resultados visualmente si es un estudio cualitativo o en caso de ser cuantitativo leer el desarrollo de color en un colorímetro.



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UNIDAD 6 PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS

GENERALIDADES Los anticuerpos (Ac) son glicoproteínas que pertenecen a la parte efectora de la respuesta inmune humoral. Se sintetizan por las células plasmáticas y se localizan en la mayoría de los fluidos biológicos. La purificación de los Ac ha sido una práctica muy importante, debido a que los productos purificados son utilizados como herramientas de uso terapéutico, preventivo, diagnóstico y de investigación. Como uso terapéutico o preventivo en humanos, se utilizan sueros homólogos (de la misma especie) y heterólogos (de especie diferente) cuyo grado de pureza y efectividad deben de ser factores importantes que considerar. En el caso de su uso como reactivos para diagnóstico e investigación se requieren anticuerpos purificados que presenten gran especificidad. Existe una gran variedad de métodos usados para purificar anticuerpos. La elección correcta del método de purificación depende de una serie de variables, como son el uso que se les dará a los anticuerpos, las especies filogenéticas en las cuales se generaron, la clase o subclase si es un anticuerpo monoclonal, etc. A menudo es necesario combinar varias técnicas para llevar a cabo la purificación con éxito. Los métodos de separación y purificación de anticuerpos pueden ser “inespecíficos”, cuando se desea separar la fracción de las γ-globulinas del resto de las proteínas que constituyen el plasma, o “específicos” cuando se desea separar del suero o plasma anticuerpos con una especificidad determinada. Purificación Inespecífica Los métodos de purificación inespecífica de los anticuerpos se basan en aprovechar algunas de las propiedades fisicoquímicas de proteínas como son: diferencias en solubilidad, carga eléctrica neta, tamaño y peso molecular (PM); pero también aquí se incluye un método basado en una propiedad biológica de las bacterias Staphylococcus aureus y Streptococcus sp. que unen a través de su proteína A y G respectivamente, la región Fc de los anticuerpos de clase IgG. Algunas consideraciones sobre estas propiedades son: Solubilidad: la solubilidad de las proteínas depende no solo de la variedad de grupos residuales de aminoácidos y de la manera en que se pliega la cadena peptídica, sino también de las propiedades del sistema en el cuál se encuentra la proteína. Los cuatro factores que afectan la solubilidad son: fuerza iónica, pH, temperatura y la constante dieléctrica del disolvente. Así, los siguientes métodos se basan en diferencias de la solubilidad de los anticuerpos con respecto a las demás proteínas: • Precipitación fraccionada con sales neutras.

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• Precipitación fraccionada con sales neutras combinada con hidrólisis enzimática con pepsina.

• Método de Cohn o precipitación fraccionada con disolventes orgánicos miscibles con el agua (etanol, rivanol, acetona).

Carga: la carga neta de las proteínas la determina en general los grupos de aminoácidos presentes y el pH del medio en que se encuentre. Los métodos basados en esta propiedad son: • Electroforesis • Cromatografía de Intercambio iónico PM-Tamaño: bajo el principio de que una molécula de mayor peso molecular tiende a ocupar mayor espacio y por lo tanto la resistencia que le ponga el medio va a ser fundamental para determinar sí fluye o sedimenta con mayor o menor rapidez. Esto sucede en métodos como: • Exclusión molecular. • Ultracentrifugación en gradiente de densidad. • Electroforesis-SDS-Poliacrilamida. Afinidad por proteínas A y G: la región Fc de los anticuerpos IgG tiene una gran afinidad por la proteína A de Staphylococcus aureus y la proteína G de Streptococcus sp., siendo esto de utilidad para separar a los anticuerpos de esta clase. El método basado en esta propiedad es: • Purificación de Ac de clase IgG por cromatografía de afinidad. Purificación específica Como se mencionó anteriormente la purificación específica tiene como finalidad separar del suero o plasma Ac con una especificidad determinada y para ello es necesario utilizar reacciones Ag-Ac, es decir se basa en las propiedades inmunológicas de estas moléculas. Básicamente pueden ser llevados a cabo por: Adsorción: consiste en hacer interaccionar a los Ac indeseables con sus correspondientes antígenos y separar de la mezcla los complejos Ag-Ac. • Eliminar los Ac indeseables. Adsorción-Elución: se basa en utilizar antígenos puros que al interaccionar con el suero inmune se combinan específicamente con sus anticuerpos específicos, se separa el complejo Ag-Ac de la mezcla, y bajo el principio de que la reacción es reversible modificando el pH, la fuerza iónica, la temperatura o la concentración del Ag, se disocia el complejo para obtener el Ac deseado. • Obtener los anticuerpos que se desean. Cromatografía de Afinidad: es una técnica que conjunta el principio de adsorción-elución y la cromatografía. Se basa en hacer pasar la mezcla de Ac a través de una columna cromatográfica empacada con un soporte (Sepharosa), el cual tiene unido covalentemente (utilizando bromuro de cianógeno) un Ag puro. Los Ac específicos se unirán al Ag. Posteriormente, se lava la columna para

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separar las proteínas no enlazadas y el Ac deseado es separado de la columna por elución, disociando la reacción Ag-Ac modificando el pH y/o la fuerza iónica. También esta disociación se puede lograr agregando una concentración elevada de antígeno en forma soluble. Además de la reacción Ag-Ac, este método aplica a otros sistemas en donde se encuentre un ligando bioespecífico como enzima-sustrato, carbohidratos-lectinas, etc.

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PRÁCTICA No. 13 PURIFICACIÓN FRACCIONADA CON SALES NEUTRAS

Purificación de γ-globulinas a partir de plasma humano MARCO TEÓRICO La precipitación con sulfato de amonio es uno de los métodos más comúnmente usados para extraer proteínas de una solución. Las proteínas en solución forman uniones de hidrógeno con el agua a través de sus grupos polares y iónicos expuestos. Cuando se adicionan altas concentraciones de pequeños iones muy cargados, estos hacen que disminuya la solubilidad de las proteínas y precipiten. Los factores que pueden afectar la concentración a la cual una proteína particular precipite incluyen el número y posición de los grupos polares, el peso molecular de la proteína, el pH de la solución y la temperatura a la cual se lleva a cabo el proceso. En este método se precipita a la γ-globulina mediante la adición de solución saturada a temperatura ambiente de sulfato de amonio a tener una concentración en la mezcla de 1/3 de saturación. Esta precipitación se realiza varias veces. El sulfato de amonio que queda “atrapado” en el precipitado se elimina mediante diálisis contra solución salina amortiguada con boratos. El producto resultante de este método no se encuentra totalmente puro, estará contaminado con otras proteínas de alto peso molecular y con proteínas que quedan atrapadas en el precipitado. Por esta razón, la técnica se usa para concentrar y purificar parcialmente Acs de todas las fuentes y especies y se recomienda combinarla con otra como cromatografía de intercambio iónico o exclusión molecular, para mayor eficiencia en la purificación; es barata, fácil y conveniente para grandes volúmenes. MATERIAL 1 Vaso de precipitado de 100 mL 1 Agitador magnético 1 Magneto 1 Pipeta de 10 mL 2 Tubos para centrífuga de plástico de 50 mL 1 Pipeta Pasteur 1 Bulbo. 1 Propipeta. 1 Centrífuga con cabezal para tubos de 50 mL 1 Frasco de 500 mL. 1 Probeta de 100 mL 10 cm Bolsa de diálisis. Hilo cáñamo. Papel tornasol, papel pH o potenciómetro. 30 mL Plasma o suero humano 45 mL Sulfato de amonio saturado 90 mL Solución salina isotónica (SSI) 0.85%

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0.5 mL NaOH al 2N 0.2 mL BaCl2 al 10% 750 mL Solución salina isotónica amortiguada con boratos pH 7.8 TÉCNICA 1. En un vaso de precipitado de 100 mL con un magneto, colocar un volumen

medido de plasma o suero humano. Poner en agitación constante a baja velocidad, evitando la formación de espuma.

2. Adicionar gota a gota la cantidad adecuada de solución saturada de sulfato de amonio al plasma para tener 1/3 de saturación de la sal neutra (para 30 mL de plasma, adicionar 15 mL de solución saturada de sulfato de amonio). La adición debe de ser lenta para evitar que precipiten proteínas indeseables. Al principio el precipitado se redisuelve inmediatamente y no se debe agregar otra gota hasta que esto haya sucedido, de lo contrario quedan englobadas en el precipitado otras proteínas.

3. Una vez que se ha adicionado todo el sulfato de amonio, ajustar el pH a 7.8 con NaOH 2N. Si se trabaja con volúmenes menores de suero, usar NaOH 0.5 –1 N, y si se trabaja con un volumen mayor usar NaOH 4–5 N.

4. Continuar con la agitación durante 2 a 3 h a temperatura ambiente para eliminar mecánicamente las proteínas que hayan quedado englobadas en el precipitado de γ-globulina.

5. Adicionar toda la solución y precipitado obtenido en una tubo para centrífuga.

6. Centrifugar durante 30 min a 3000 rpm. Este precipitado contiene toda la γ-globulina, pero impurificada con trazas de albúmina.

7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido con SSI hasta tener el volumen inicial de plasma (si se inició con 50 mL de plasma, aforar el precipitado a 50 mL con SSI).

8. Después de haber resuspendido la proteína, repetir la precipitación dos veces más: para la segunda repetir los pasos 1-7 y para la tercera del 1-6. En total se debe precipitar la proteína 3 veces.

9. Después de la 3ª precipitación y una vez centrifugado, resuspender el precipitado con amortiguador salino de boratos en cantidad igual a la mitad del volumen inicial de plasma (si se inició con 30 mL, se aforar a 15 mL).

10. Eliminar el sulfato de amonio mediante diálisis contra amortiguador salino de boratos, cambiando esta solución cada 12 a 24 h y manteniendo a 4 ºC durante este proceso.

11. Continuar con el proceso de diálisis hasta que el dializado de negativa la reacción para sulfatos, la cual consiste en agregar unas gotas de BaCl2 ó Ba(OH)2 al 10% a una muestra del dializado, si se forma un precipitado blanco de BaSO4 la diálisis aún no ha terminado.

12. Recuperar la solución de γ-globulinas purificadas de la bolsa de diálisis cuando ya no contenga sulfato de amonio, y pasarla a un tubo de centrífuga de 50 mL.

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13. Centrifugar en frío (colocar hielo en la camisa de la centrífuga) durante 30 min a 3000 rpm para eliminar partículas insolubles que se forman durante la diálisis. La solución final debe presentar sólo una ligera opalescencia.

14. Envasar la γ-globulina purificada en un frasco vial. Para su conservación puede filtrarse por Seitz, liofilizarse o adicionarle un conservador como timerosal a concentración final de 1:10 000, glicerina a concentración final de 50% ó azida de sodio 1 mg/mL.

15. Etiquetar con los siguientes datos: Nombre del producto, fecha de obtención, volumen, conservador empleado y nombre de quien(es) elaboraron.



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ANEXO I TÉCNICAS DE APOYO

A. COAGULACION DE PLASMA Se utiliza para eliminar los factores de la coagulación del plasma y así evitar que interfieran en algunas técnicas, por ejemplo durante los pasos de esterilización por filtración. MATERIAL 1 Matraz Erlenmeyer de 500 mL 1 Pipeta de 1 mL (1/10) 1 Pipeta de 5 mL (1/10) Congelador de –20°C Baño de temperatura controlada a 37 °C 50 mL Plasma humano 1.0 mL CaCl2 1M 0.1 mL Trombina bovina TÉCNICA 1. Congelar el plasma a –20°C durante 3 días. 2. Descongelar en baño María a 37°C. 3. Agregar 2 mL de CaCl2 1M por cada 100 mL de plasma y se deja en el

baño María por 1 hora con agitación. 4. Si no coagula agregar 1 gota de trombina bovina. Se continúa agregando

gotas de trombina hasta lograr la coagulación. 5. Una vez ocurrida la coagulación, mantener el plasma coagulado 24 horas

a 4°C. 6. Se separa el coagulo y se exprime para obtener la mayor cantidad de

suero. 7. Si el suero se va a guardar, se conserva en congelación. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E. B. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS. MÉTODO DE BIURET Se utiliza para la cuantificación de proteínas en preparados biológicos que van a ser empleados como inmunógenos, para poder ajustar a la concentración deseada para la inmunización. La técnica descrita es útil en un intervalo de 0.1 a 2.5 mg de proteína. MATERIAL 10 Tubos de 13 X 100 mm

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1 Gradilla 2 Pipeta de 1.0 mL (1/10) 1 Pipeta de 5.0 mL (1/10) Colorímetro 3.5 mL Estándar de proteínas de 2.5 mg/mL 10 mL Solución salina isotónica 0.85% 15 mL Reactivo de Biuret Muestra Problema TÉCNICA 1. En una serie de tubos preparar la curva estándar de acuerdo al siguiente

cuadro:

Tubo Estándar de proteína (2.5mg/ml)

Muestra SSI (ml)

Reactivo de Biuret (ml)

Concentración (mg/dl)

1 ----- ----- 1.0 1.5 0.00 2 0.05 ----- 0.95 1.5 0.125 3 0.10 ----- 0.90 1.5 0.25 4 0.20 ----- 0.80 1.5 0.50 5 0.40 ----- 0.60 1.5 1.00 6 0.60 ----- 0.40 1.5 1.50 7 0.80 ----- 0.20 1.5 2.00 8 1.00 ----- 0.00 1.5 2.50 9 ----- 0.10 0.90 1.5

10 ----- 1.00 0.00 1.5 2. Agitar los tubos. 3. Reposar 30 min a temperatura ambiente. 4. Leer la D.O. a 555 nm contra blanco de agua destilada. 5. Restar la D.O. del blanco de reactivo (tubo 1). 6. Graficar D.O. contra Concentración de proteínas. NOTA: Para el manejo y desecho del material biológico potencialmente infeccioso

seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E. C. CURVA DE Mc FARLAND Se utiliza para determinar la concentración de suspensiones de bacterias. Para ello se compara la turbidez de la suspensión problema con la de suspensiones estándar de sulfato de bario (resultado de la mezcla de BaCl2 al 1% y H2SO4 al 1%), que equivalen a cierto número de microorganismos. La construcción de la escala de Mc Farland y su equivalencia se dá en la siguiente tabla:

Escala de BaCl2 al 1% H2SO4 al 1% Bacterias X 106

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Mc Farland mL ML 1 0.1 9.9 300 2 0.2 9.8 600 3 0.3 9.7 900 4 0.4 9.6 1200 5 0.5 9.5 1500 6 0.6 9.4 1800 7 0.7 9.3 2100 8 0.8 9.2 2400 9 0.9 9.1 2700

10 1.0 9.0 3000 La suspensiones se pueden guardar de manera permanente en tubos con cierre hermético, para utilizarse cada vez que se desee previa agitación. La escala se puede utilizar de manera visual por simple comparación de la suspensión de bacterias problema y obtener así un estimado de su concentración. Pero también se puede hacer la lectura de la turbidez en un nefelómetro Klett Summerson y determinar la concentración exacta, interpolando el valor en una curva estándar construida a partir de los siguientes datos:

Unidades Klett Micoorganismos X 106/mL 53 300 97 600

150 900 195 1200 228 1500 262 1800


seguir las indicaciones mencionadas en el anexo I.E. D. PREPARACION DE SUSPENSIONES DE ERITROCITOS DE CARNERO Se describe la preparación de las suspensiones de eritrocitos de carnero que son utilizadas en las técnicas de hemaglutinación indirecta y en la titulación de amboceptor hemolítico anticarnero. MATERIAL 1 Jeringa hipodérmica de 20 mL con aguja No. 18 estéril 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL con tapón de rosca. 2 Tubos de centrífuga de plástico de 50 mL. 1 Probeta graduada de 100 mL. 1 Pipeta de 5.0 mL (1/10).

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1 Pipeta de 10.0 mL (1/10). 1 Bulbo o propipeta. 1 Frasco tipo Vial de 100 mL Refrigerador 23 mL Sangre de carnero. 27 mL Solución de Alsever estéril. 100 mL Solución salina isotónica 0.85% 150 mL Amortiguador: Fosfatos 0.15 M pH = 7.2, para hemaglutinación indirecta Veronal pH = 7.3-7.4, para titulación de amboceptor hemolítico

anticarnero 1. Tomar 23 mL de la sangre del carnero por punción de la yugular. 2. Recibir la sangre en un matraz Erlenmeyer conteniendo 27 mL de solución

de Alsever estéril y agitar suavemente. 3a. Para preparar una suspensión de eritrocitos de carnero para

hemaglutinación indirecta dejar que la sangre se estabilice en el Alsever durante 3 ó 4 días, conservando el matraz en refrigeración a 4°C.

3b. Para preparar una suspensión de eritrocitos de carnero para titulación de hemolisina (amboceptor hemolítico anticarnero), la sangre debe ser fresca, cuando mucho de un día de tomados, de lo contrario las reacciones pueden verse falseadas por la desnaturalización de los Ag de los G.R.

4. Pasar la mezcla sangre-Alsever a tubos de centrífuga de 50 mL y centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.

5. Quitar el plasma sobrenadante por succión, evitando que el paquete de G.R. se resuspenda.

6. Lavar los G.R. agregando 2 ó 3 veces su volumen de SSI, resuspender el paquete perfectamente pero gentilmente con una pipeta con bulbo y centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Eliminar el sobrenadante por succión.

7. Repetir el paso 6 dos veces más, pero en el último lavado utilizar el amortiguador indicado para cada técnica, fosfatos 0.15 M pH = 7.2 para hemaglutinación indirecta o veronal pH = 7.3-7.4 para titulación de amboceptor hemolítico.

8a. Para hemaglutinación indirecta, preparar la suspensión de G.R. al 2.5%, para ello, tomar 2.5 mL del paquete de G.R. lavados y llevar a un volumen final de 100 mL con amortiguador de fosfatos 0.15 M pH = 7.2.

8b. Para titulación de amboceptor hemolítico , preparar la suspensión de G.R. al 2%, para ello, tomar 2.0 mL del paquete de G.R. lavados y llevar a un volumen final de 100 mL con amortiguador de veronal pH = 7.3-7.4.



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E. MANEJO Y DESECHO DE MATERIAL BIOLÓGICO POTENCIALMENTE INFECCIOSO

Se consideran materiales biológicos potencialmente infecciosos a aquellos que puedan contener microorganismos o sus productos que sean capaces de causar efectos nocivos a la salud y al ambiente. Entre ellos tenemos: • Sangre y sus fracciones (plasma, suero y paquete globular) • Cepas y cultivos de agentes infecciosos (bacterias, virus, parásitos, hongos) • Productos biológicos: vacunas, sueros, reactivos biológicos de diagnóstico. • Cadáveres, tejidos, órganos y fluidos corporales de origen animal. • Equipo, material y objetos contaminados durante las prácticas. • Equipos y dispositivos desechables utilizados en las prácticas: vendas,

gasas, algodones, guantes, cubre-bocas, hisopos, abate-lenguas, etc. • Objetos punzo cortantes y materiales con sangre, así como recipientes de

muestras biológicas para análisis. Aquí se incluye: agujas hipodérmicas, navajas, jeringas, bisturís, pipetas Pasteur, cubreobjetos y portaobjetos, cajas Petri, tubos de ensaye y otro tipo de cristalería.

Para evitar que este tipo de materiales constituyan un riesgo para la salud y el ambiente, se deberán tener las siguientes precauciones durante el desarrollo de las prácticas. 1. Al iniciar la práctica limpiar la mesa de trabajo con una solución de hipoclorito

de sodio al 0.1%. 2. Utilizar bata, guantes y cubre-boca siempre que se maneje material

potencialmente infeccioso. 3. No comer, beber o fumar en el laboratorio. 4. No colocar mochilas, ropa, útiles escolares y otros artículos personales sobre

las mesas de trabajo cuando se esté utilizando material potencialmente infeccioso.

5. No pipetear con la boca. 6. Esterilizar en autoclave a 121º C durante 15 min todo material no desechable

y equipo que haya estado en contacto con material potencialmente infeccioso.

7. Cuando se trate de material o equipo que no sea esterilizable, aplicar hipoclorito de sodio al 2% por lo menos durante 10 min.

8. Cuando sucedan derrames de material infeccioso sobre mesas de trabajo u otras superficies aplicar hipoclorito de sodio al 2% durante 10 min.

9. Cuando se trate de material desechable contaminado desechar en los recipientes destinados para tal efecto (ver tabla).

10. En el caso de desechos biológicos como tejidos, sangre, sueros, orina y cualquier otro líquido corporal de origen animal, desechar en los contenedores destinados para dicho fin (ver tabla). No tirar en las tarjas.

11. No almacenar por mucho tiempo en la gaveta material biológico potencialmente infeccioso como cepas, cultivos, sangre, suero, etc.

12. Al finalizar la práctica limpiar la mesa de trabajo con la solución de hipoclorito de sodio al 0.1%.

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13. Lavarse las manos perfectamente con jabón y desinfectárselas al término del ejercicio de laboratorio.

TIPO DE RESIDUO

EJEMPLOS ESTADO FÍSICO

ENVASADO COLOR

Sangre y sus derivados

Líquido Recipientes Herméticos

Rojo

Cultivos y cepas de agentes

infecciosos

Sólido Bolsas de Polietileno

Rojo

Patológicos Tejidos, órganos, muestras biológicas, cadáveres y partes animales

Sólido

Líquido

Bolsas de polietileno

Recipientes Herméticos

Amarillo

Rojo

Residuos no anatómicos

Recipientes con sangre, materiales de curación materiales deshechables, materiales absorbentes utilizados en jaulas

Sólido

Bolsas de Polietileno

Recipientes Herméticos

Rojo

Rojo

Objetos punzocortantes

Tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringa deshechable e hipodérmica, de sutura, acupuntura, tatuaje, bisturís, estiletes de catéter

Sólido Recipientes rígidos de

polipropileno

Rojo

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ANEXO II PREPARACION DE REACTIVOS

1. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA (SSI) 0.85%: NaCl 8.5 g Agua destilada 1 000 mL 2. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA FORMOLADA AL 0.3% ESTÉRIL: Solución salina isotónica 0.85% 992.5 mL Formaldehído al 40% 7.5 mL Esterilizar la SSI a 121°C durante 15 min. En condiciones de esterilidad

agregar el formaldehído. 3. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA FORMOLADA AL 0.6% ESTÉRIL: Solución salina isotónica 0.85% estéril 985 mL Formaldehído al 40% 15 mL Esterilizar la SSI a 121°C durante 15 min. En condiciones de esterilidad

agregar el formaldehído. 4. SOLUCION SALINA ISOTÓNICA FENOLDA AL 0.5 % ESTÉRIL: Solución salina isotónica 0.85% estéril 995 mL Fenol fundido 5 mL Esterilizar la SSI a 121°C durante 15 min. En condiciones de esterilidad

agregar el fenol fundido. 5. ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND: Aceite mineral (Nujol) 8.5 mL Arlacel A 1.5 mL Esterilizar la mezcla en autoclave 15 min a 15 lb de presión. 6. ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND: Aceite mineral (Nujol) 8.5 mL Arlacel A 1.5 mL M. smegmatis 5.0 mg Esterilizar la mezcla de aceite mineral y Arlacel A en autoclave 15 min a

15 lb de presión. Agregar la micobacteria en condiciones de esterilidad.

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7. SOLUCIÓN DE ALSEVER: Glucosa 20.5 g Citrato de sodio 8.0 g Ácido cítrico 0.55 g Cloruro de sodio 4.2 g Agua destilada 1000 mL Esterilizar a 10 lb de presión a temperatura de 121 °C por 10 min o por

filtración. Se utiliza como anticoagulante y estabilizador de sangre de carnero. 8. SOLUCIÓN DE TIMEROSAL AL 10%: Etilmercuritiosalicilato de sodio 10 g Agua destilada 100 mL Se usa como conservador en proporción de 0.1 mL por cada 100 mL de

suero. 9. SOLUCIÓN DE AZIDA DE SODIO AL 10%: Azida de sodio 10 g Agua destilada 100 mL Se usa como conservador en proporción de 1.0 mL por cada 100 mL de

suero. 10. AMORTIGUADORES DE FOSFATOS (PBS): SOLUCIONES STOCK: Solución I: Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4) 0.15 M: Na2HPO4 21.3 g Agua destilada c.b.p. 1000 mL Solución II: Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) 0.15 M: KH2PO4 20.4 g Agua destilada c.b.p. 1000 mL Solución III: Cloruro de sodio (NaCl) 0.15 M: NaCl 8.8 g Agua destilada c.b.p. 1000 mL 10.1 AMORTIGUADOR DE FOSFATOS SALINO (PBS) pH = 7.2, 0.15 M: Solución I 76.0 mL Solución II 24.0 mL Solución III 100.0 mL

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Se utiliza para la técnica de hemaglutinación indirecta, pero también puede ser utilizado en las técnicas de inmunoprecipitación como el Ouchterlony y el RID diluído 1:2 con agua destilada.

10.2 AMORTIGUADOR DE FOSFATOS SALINO (PBS) pH = 6.4, 0.15 M: Solución I 32.3 mL Solución II 67.7 mL Solución III 100.0 mL Se utiliza en la técnica de hemaglutinación indirecta. 11. AMORTIGUADOR DE VERONAL-ACETATO pH = 8.2 (MICHAELIS): SOLUCIÓN CONCENTRADA µ = 0.15 pH = 8.2: Barbital sódico 88.26 g Acetato de sodio.3H2O 58.26 g (ó Acetato de sodio anhidro 35.21 g) Solución de timerosal al 10% 3.0 mL Agua desionizada c.b.p 3 000 mL Mezclar 800 mL de la solución de barbital-acetato con 960 mL de agua

destilada y ajustar el pH a 8.2 con solución 0.1N de HCl. La µ final es 0.15. Solución de trabajo: Para tener una fuerza iónica de 0.05 y pH = 8.2 diluir

una parte de la solución concentrada con 2 partes de agua desionizada. Se utiliza en la técnica de inmunoelectroforesis. 12. AMORTIGUADOR PARA COMPLEMENTO (VERONAL pH = 7.3-7.4): SOLUCIÓN CONCENTRADA 5X: NaCl 41.5 g Barbiturato de sodio 5.095 g Agua destilada 250 mL HCl 17.29 mL * Solución de Mg2+ y Ca2+ 2.5 mL Agua destilada c.b.p. 1000 mL * Solución de MgCl2 y CaCl2: MgCl2.6H20 1.0 M 20.3 g CaCl2.2H20 0.3 M 4.4 g Agua destilada 100 mL Para preparar la solución de trabajo diluir 1:5 y el pH debe ser 7.3-7.4 13. SOLUCIÓN SALINA ISOTÓNICA AMORTIGUADA CON BORATOS: Amortiguador de boratos pH 8.4-8.5 Ácido bórico 6.184 g Bárax (Na2B407

.10H2O) 9.536 g NaCl 4.384 g Agua destilada c.b.p 1000 mL

85

Para preparar la solución salina isotónica amortiguada, mezclar 400 mL de este amortiguador de boratos con 8,000 mL de solución salina isotónica.

14. REACTIVO DE BIURET: Tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6

.4H2O) 9.0 g Sulfato de cobre (CuSO4

.5H2O) 3.0 g Yoduro de potasio (KI) 5.0 g Hidróxido de sodio (NaOH) 0.2 N libre de carbonato c.b.p. 1000 mL Colocar el tartrato en un matraz volumétrico de 1000 mL y disolver en

aproximadamente 400 mL de NaOH 0.2 N. Posteriormente disolver sucesivamente el sulfato de cobre y el yoduro de potasio. Aforar con NaOH 0.2 N y almacenar en una botella de polipropileno. El reactivo es estable por un periodo indefinido de tiempo.

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acid and subsequent hemagglutination by antiprotein sera. J. Exp. Med. 93:107-120 (1951).

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