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Manual bIR

VOLUMEN V: MANUAL DE INMUNOLOGÍA

Autor: Dr. Tomás E. Verdura González

Editora: Dra. Iliana Perdomo López

Manual BIR. VOLUMEN V: MANUAL DE

INMUNOLOGÍA

Autor: Dr. Tomás E. Verdura González

© Iliana Perdomo López (editora). Depósito legal: DLC 615-2012

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ÍNDICE DE MANUAL DE INMUNOLOGÍA

Tema 1. Introducción. Generalidades. Células y tejidos del sistema

inmune .................................................................................................................. 1

Tema 2. Inmunoglobulinas. Estructura funcional. ..................................................... 21

Tema 3. Genética de las inmunoglobulinas .................................................................. 35

Tema 4. El sistema del complemento. ............................................................................. 43

Tema 5. Complejo principal de histocompatibilidad (MHC). .................................. 57

Tema 6. Citocinas. ..................................................................................................................... 65

Tema 7. Desarrollo de linfocitos B.. .................................................................................. 83

Tema 8. Receptor de Ag del linfocito T.. ......................................................................... 89

Tema 9. Desarrollo de linfocitos T .................................................................................... 95

Tema 10. Transducción de señales mediante los receptores de Ag de linfocitos B y T. ............................................................................................. 99

Tema 11. Inmunidad mediada por linfocitos T.. ........................................................ 107

Tema 12. Activación de linfocitos B y producción de anticuerpos.. ................ 125

Tema 13. Regulación de la respuesta inmune ........................................................... 135

Tema 14. Inmunidad frente a microorganismos. ...................................................... 145

Tema 15. Inmunodeficiencias ............................................................................................ 159

Tema 16. Reacciones de hipersensibilidad. ............................................................... 171

Tema 17. Autoinmunidad ..................................................................................................... 181

Tema 18. Trasplantes y aloinmunidad ........................................................................... 187

Tema 19. Respuesta inmune frente a tumores .......................................................... 193

Tema 20. Técnicas Inmunológicas y manipulación de la

respuesta inmune tumores ............................................................................ 201

Bibliografía ................................................................................................................................. 237

Inmunología InspiracleBIR/2015

1

Tema 1. Generalidades. Células y tejidos del sistema inmune.

(2014: 133, 134, 143, 160), (2013: 53, 207, 214) (2012: 122, 136, 137, 139) (2011: 128, 138, 255) (2010: 122,

126,128, 139, 140, 141) (2009: 122, 126, 138) (2008: 129, 138, 143, 144) (2007: 73, 131, 134) (2006: 144,

164, 254) (2005: 53, 54, 55, 60, 62, 64, 69) (2004: 184, 186, 195, 196) (2003: 147)

El sistema inmune es, por excelencia, el encargado de mantener la homeostasia del

organismo. Originado a partir de adaptar moléculas, células y tejidos a las tareas de

preservar el equilibrio interno, fue complejizándose bajo la presión evolutiva hasta alcanzar

la diversidad de estructuras, mecanismos y funciones que caracterizan a dicho sistema en

los organismos superiores. Los seres vivos tienen que preservar constantemente su

integridad biológica frente a los cambios internos y externos (tumores, infecciones, etc.) que

amenazan su supervivencia. Esta es la tarea del sistema inmune y la realiza mediante la

identificación de las moléculas propias y extrañas y la destrucción de aquellas consideradas

“peligrosas”. El estudio de las estructuras y mecanismos que conforman dicho sistema y de

sus alteraciones patológicas es el campo de interés de la inmunología.

Los llamados mecanismos de defensa (en realidad adaptaciones del medio interno ante

cambios probablemente peligrosos) son muy diversos y de origen filogenético diferente, pero

en un organismo funcionan todos, concatenados y coordinados, al unísono. Dichos

mecanismos de defensa se suelen clasificar en innatos (inmunidad natural o inespecífica) y

adaptativos (inmunidad adquirida o específica).

Rep. De . Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.

InspiracleBIR/2015 Inmunología

2

La respuesta inespecífica o innata constituye la primera barrera defensiva del organismo y

no requiere, para su funcionamiento óptimo, de contacto previo con el agente agresor. Por lo

general a igual estimulo siempre se desarrolla con igual intensidad (no se amplifica) y su

sistema de discriminación de las características fisicoquímicas del agente agresor es menos

sofisticado (solo reconoce estructuras muy primitivas y conservadas filogenéticamente y

estímulos físicos o químicos).

Consta de estructuras y mecanismos físico-químicos como la existencia de las barreras

naturales (la piel y las mucosas impiden la fácil penetración de agentes externos), el flujo

constantes de secreciones (flujo de orina que arrastra bacterias) y las secreciones de

sustancias con actividad antibacteriana (como la lisosima de la saliva y lágrimas que rompe

la unión de azúcares en las paredes bacterianas, el PH extremo del estómago, los ácidos

grasos de la piel, etc).

También entre estos mecanismos inespecíficos se encuentran células y moléculas que

participan fundamentalmente en los procesos de inflamación, fagocitosis e histolisis como

los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos, los macrófagos y las células NK. A esto se le

suma la participación de otras células que tienen una acción con carácter más particular

como basófilos, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, etc.

En ella participan también moléculas como las citoquinas (interleuquinas, quimioquinas,

interferones, etc.), las enzimas citoliticas intracelulares, sistemas moleculares integrados

como el complemento y otro gran número de estructuras de membrana, mecanismos

bioquímicos (ej. proteinas de fase aguda como el fibrinógeno y la proteina C reactiva, etc.) y

metabólicos cuya actividad integrada y coordinada tiene como finalidad el aislamiento y la

destrucción de los agentes “agresores” sean de naturaleza física, química o biológica.

La respuesta específica o adquirida se desarrolla solo (especificidad) frente a las

moléculas extrañas (antígenos) que indujeron su iniciación y está mediada

fundamentalmente por los linfocitos y las sustancias liberadas por los mismos (anticuerpos,

citoquinas, etc.) Requiere del reconocimiento antigénico (discriminación, especificidad,

clonalidad), lo cual le caracteriza, además de otras propiedades como memoria,

amplificación y autorregulación. Mejora cuantitativa y cualitativamente con los subsiguientes

encuentros con el antígeno que le dio origen (cambios en la respuesta secundaria con

respecto a la primaria).


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constituyen regiones de contenido variable en aminoácidos, es decir son las zonas donde

radica la variabilidad de la molécula. Por el contrario el dominio alfa-3 es bastante constante.

Rep.de Peña. J. Inmunologíaonline. http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/ 2003.

Los dominios 1 y 2 constan cada uno de ellos de una zona formada por cuatro

fragmentos en estructura de hoja plegada seguido de otro segmento organizado en forma

de -hélice. Esta organización delimita una hendidura denominada sitio de unión al

péptido en el que los residuos más polimórficos se encuentran en el suelo y las paredes de

la hendidura. En esa hendidura se sitúa un péptido que va ser presentado a los linfocitos T

CD8. Este péptido procede de proteínas endógenas y tiene un tamaño de aproximadamente

8-10 aminoácidos. Un determinado antígeno de histocompatibilidad puede unirse a péptidos

diferentes siempre que éstos posean uno o varios motivos que interaccionen con las zonas

adecuadas complementarias de la molécula MHC (promiscuidad o degeneración).

http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/


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hepatocitos y actúa sobre el SNC induciendo sueño y anorexia, típicamente asociados con

los procesos infecciosos. Posee notable redundancia con IL-6 y también con TNF.

IL-6: Producida por monocitos y macrófagos, células endoteliales vasculares, fibroblastos y

otras células, en respuesta a IL-1 y TNF. Induce a la síntesis hepática de proteínas de fase

aguda, como el fíbrinógeno, la PCR y factores del complemento, que contribuyen a la

respuesta de fase aguda. Actúa como factor de crecimiento de células B activadas en sus

últimas etapas de diferenciación. Regula la hematopoyesis y estimula la producción de

inmunoglobulinas.

Rep.de Peña. J. Inmunologíaonline. http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/ 2003.

Quimiocinas: Las quimiocinas son un grupo de pequeñas moléculas proteicas (8-14 kDa)

con características bioquímicas comunes producidas por muchos tipos celulares en

respuesta a estímulos exógenos o endógenos. Son moléculas que estimulan el

movimiento de leucocitos en sentido del gradiente de concentración

(quimioatrayentes de leucocitos) y actúan sobre las células endoteliales favoreciendo su

separación y expresión de moléculas de adhesión para facilitar la migración leucocitaria.

Además participan en la angiogénesis, otras organogénesis y la regulación del tráfico

linfocitario. Se han dividido en tres familias: Familia o C-X-C, siendo las más

representativas la IL-8 y el factor activador de plaquetas 4 (PAF-4), Familia o C-C, dentro

de la cual se encuentran RANTES, proteínas inhibidoras de macrófagos (MIP) y proteínas

quimioatrayentes de monocitos (MCP) y Familia o C, representada por la linfotactina.



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Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.

Dentro de esta familia hay dos grupos de receptores: Tipo I o receptores de hematopoyetinas: presentan el motivo WSXWS que les

caracteriza. Pertenecen a este grupo los receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-

9, IL-11, IL-12. Pueden presentar varias vías de transducción.

Tipo II, carecen del motivo WSXWS y presentan una sola vía de transducción.

Pertenecen a este grupo los receptores de IFN e IL-10.

Familia de los receptores de quimiocinas: Se caracterizan por presentar siete

dominios transmembrana típicos de la transducción mediada por proteínas G

(asociadas a su extremo carboxiterminal intracitoplasmático y que catalizan la

conversión de GDP en GTP).


109

integrados en tejidos sólidos; allí reciben distintos nombres y, aunque mantienen sus

propiedades principales, adquieren características específicas al diferenciarse en los

diferentes tejidos. Los macrófagos activados en el lugar de la infección inician un proceso de

fagocitosis muy activo mediante receptores específicos, receptores tipo toll (TLR) y

receptores scavenger, capaces de reconocer patrones moleculares (PAMPS) expresados en

los patógenos. Los macrófagos también pueden endocitar antígenos opsonizados con

moléculas del complemento o anticuerpos, vía receptores del complemento o receptores Fc.

También aumentan la expresión de moléculas de clase II y las moléculas accesorias en su

superficie, por lo que aumentan su capacidad de presentación de antígeno. A consecuencia

de la activación, los macrófagos secretan quimiocinas que reclutan células inflamatorias y

citocinas implicadas en la activación de las células T como IL-12.

Linfocitos B: Los linfocitos B pueden actuar como células presentadoras de antígeno ya

que expresan MHC-II constitutivamente, expresión que aumenta cuando se activan, aunque

su capacidad de captación de antígeno es muy baja. Sin embargo, los linfocitos B son

células presentadoras muy eficientes si expresan una inmunoglobulina de superficie (BCR)

específica del antígeno. La presentación de antígeno a linfocitos T específicos es parte

esencial de la completa activación y diferenciación de la célula B en célula plasmática

productora de anticuerpos, ya que para este proceso, los linfocitos B requieren de la

colaboración de los linfocitos T. La presentación de antígeno es su forma de obtener esta

colaboración.

APCs no profesionales: En condiciones de inflamación y presencia de citocinas,

especialmente IFN-, otras células como las endoteliales, las epiteliales o los fibroblastos,

expresan MHC-II y como consecuencia podrían presentar antígeno en determinadas

situaciones. Por otra parte, todas las células nucleadas que expresan MHC-I pueden

presentar antígeno a células T CD8+ aunque no son capaces de iniciar una respuesta

inmune.

Captacion de antigenos exógenos.

Las células captan antígenos exógenos por endocitosis, mediada o no por receptores. Se

distinguen dos tipos de endocitosis: pinocitosis y fagocitosis. La pinocitosis es la captación

de líquido extracelular en el que se hallan los antígenos en forma soluble, llamada

macropinocitosis cuando la célula es capaz de captar grandes volúmenes de fluido,

mecanismo clásico de las células dendríticas. La fagocitosis es un proceso utilizado por

fagocitos mononucleares, neutrófilos y otras células para ingerir y eliminar partículas de gran

tamaño (bacterias, restos celulares). La internalización de la partícula se inicia por la


110

interacción de receptores en la superficie de la célula con ligandos de la superficie de la

partícula o por simple invaginación mecánica de la membrana. Después de la

internalización, la vesícula formada (endosoma o fagosoma) madura por fusión con

compartimentos de la vía endocítica en varios pasos, que culminan en la formación de

lisosomas. La vía endocítica está constituida por distintos tipos de vesículas cuyo contenido

se va modificando a medida que van madurando en el interior de la célula. El pH del interior

de estas vesículas es bajo y va acidificándose a medida que éstas van evolucionando hacía

lisosomas. Los diferentes compartimentos contienen distintas proteasas que los

caracterizan. El procesamiento de antígeno consiste en la desnaturalización y proteolisis de

las proteínas captadas en las vesículas acídicas.

Biosintesis de las moléculas del MHC.

Las moléculas del MHC (clase I y clase II) son proteínas de membrana, cuyas vías

biosintéticas y de exocitosis son distintas e influyen en el tipo y origen de los péptidos que

presentan.



153


Los virus inducen la síntesis de varios IFNs que juegan un papel muy importante en la

resistencia a ciertas infecciones virales. Los IFNs son capaces de ejercer la acción antiviral

de varias maneras sinérgicas: bloqueo de la replicación viral, aumento en la expresión de

MHC, activación de las células NK y de los macrófagos.

Otro mecanismo, a nivel de respuesta innata, es mediado por células NK, un grupo de

linfocitos grandes granulares cpaces de destruir células infectadas por virus y parásitos

intracelulares mediante citotoxicidad directa no restringida por el MHC o por mecanismos de

citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC), otro ejemplo de cooperación entre

respuesta innata y específica.


154


En el caso de los parásitos extracelulares es importante la actividad de los fagocitos.

La destrucción del parásito por células fagocíticas se lleva a cabo por dos tipos de

mecanismos:

Oxígeno-dependientes: Actuan mediante la formación de productos metabolitos del

oxígeno debido a la acción de enzimas como la mieloperoxidasa y a la formación

espontánea de radicales. Otro mecanismo importante es mediado por la acción del

óxido nítrico.

Oxígeno-independientes: variaciones del pH, la acción de enzimas como la

lisozima, la lactoferrina y las proteínas catiónicas.

Receptores del sistema inmune innato.

El sistema inmune innato carece de la especificidad del adaptativo, pero es capaz de reconocer

las estructuras no propias consideradas como “peligrosas” y activar mecanismos para

destruirlas. Al contrario que los receptores de la respuesta adaptativa, los del sistema

innato no se distribuyen de forma clonal, sino que existen en todas las células del mismo

tipo o linaje. La unión de patógenos a estos receptores dispara rápidamente la respuesta,

sin el retraso impuesto por los mecanismos de expansión clonal de la respuesta adaptativa.


175

Las reacciones de tipo II son reacciones mediadas por la interacción de antígenos

presentes en la superficie de diferentes células con anticuerpos de tipo IgG e IgM

preformados y que reconocen el tejido en cuestión. El daño celular resulta de la posterior

activación de la cascada del sistema complemento o su interacción con células

efectoras a través de su fracción Fc. Los receptores para la fracción Fc de la IgG se

encuentran presentes en células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos), células NK y

plaquetas. La activación de estos receptores causa la liberación de proteasas y radicales

libres de las células fagocíticas y el proceso de citotoxicidad dependiente de anticuerpo

(ADCC) mediado por los linfocitos NK. Además, la activación del sistema del complemento

origina el depósito de las fracciones C3b y C3bi en la membrana celular. Tanto las células

fagocíticas como las NK poseen receptores para estos fragmentos (CR1 y CR3) lo que

favorecerá su unión a la célula diana y su subsecuente destrucción.

Los ejemplos más claros de hipersensibilidad de tipo II lo constituyen las reacciones

hemolíticas. En determinadas circunstancias existen anticuerpos preformados que pueden

reaccionar con antígenos de membrana del eritrocito y ocasionar su destrucción. Tal es el

caso de las reacciones contra antígenos de grupos sanguíneos. A veces no se reconocen

Ag propios sino Ag adsorbidos a la membrana como puede ocurrir con los medicamentos.

El ejemplo clásico es la eritroblastosis fetal por conflicto Rh entre madre y feto.

Hipersensibilidad tipo III

Las reacciones de hipersensibilidad tipo III se producen por la existencia de

inmunocomplejos circulantes que al depositarse en los tejidos causan la activación

de los fagocitos y el subsecuente daño tisular.



183

Además del MHC (HLA) otros muchos genes han sido asociados con una frecuencia

significativamente más elevada de enfermedades autoinmunes en comparación con la

población general, pero esta asociación siempre es débil e incompleta y en la mayor parte

de los casos se desconoce gran parte o totalmente los mecanismos que subyacen en esta

aparente asociación.

Factores ambientales

La concordancia de gemelos monocigotos para una enfermedad autoinmune no supera en

ningún caso el 60%. En consecuencia debe haber factores no controlados genéticamente

que intervienen en la expresión de las enfermedades autoinmunes. A dichos factores en

general les denominamos factores ambientales. Entre ellos destacan los agentes

infecciosos (mimetismo molecular, desrepresión de genes) las sustancias químicas

(modificación del DNA, neoantígenos) y las hormonas (por lo general más frecuentes en el

sexo femenino).



190


Tipos de rechazo.

En dependencia del tiempo mediado entre el transplante y el rechazo y los mecanismos

implicados, desde el punto de vista clínico el rechazo se clasifica en hiperagudo, agudo y

crónico.

Rechazo hiperagudo: Ocurre en los minutos u horas inmediatas a la revascularización del

órgano transplantado (existe una variante un poco más lenta que ocurre en los primeros

días tras el transplante que se le llama rechazo acelerado). Se debe a anticuerpos

preformados en el receptor contra antígenos presentes en el órgano transplantado.

Habitualmente antígenos de grupos sanguíneos presentes en hematíes adheridos y

fundamentalmente los expresados en las células del endotelio vascular del órgano

transplantado. Tras esta unión se activa complemento y a través de él la cascada de la

coagulación produciéndose trombosis e isquemia. Además, mecanismos inflamatorios que

atraen células fagocíticas y citotóxicas.

Rechazo agudo: es aquel que se produce en el primer mes postransplante. No se conoce

el mecanismo exacto por el que se produce un rechazo agudo, pero los hallazgos

histológicos y la respuesta a la terapia inmunosupresora indican que en él intervienen tanto

la inmunidad específica (humoral y celular) como otros mecanismos no específicos

(respuesta inflamatoria con estimulación de polimorfonucleares, plaquetas y macrófagos,


203

Inmunoelectroforesis:

Consiste en la separación electroforética de los antígenos en el gel de agarosa y posterior

identificación mediante reacción de precipitación con anticuerpos. Útil en mezclas problema

de Ag muy complejas (muchos Ag que se quieren identificar en la misma muestra como

bandas mono u oligoclonales de Ig en el suero para dignosticar mielomas o en LCR para

diagnosticar esclerosis múltiple -bandas monoclonales, a veces de paraproteínas-.

En los agujeros se depositarán las mezclas antigénicas y se aplica un dipolo por el que se

hace fluir corriente eléctrica. Los Ag se separan al migrar en función de su carga eléctrica y

a una velocidad dependiente de su peso molecular (a veces expresado en KDa y a veces

referido a su coeficiente de sedimentación en unidades Svedberg). A continuación hacemos

una ranura a lo largo del gel donde colocamos los anticuerpos (suero, mezcla de

monoclonales, policlonales, etc.) y se dejan difundir como en la inmunodifusión doble. Se

formarán bandas de precipitación donde cada anticuerpo reconozca a su antígeno

específico complementario en equivalencia de concentraciones. En el diagnóstico de

tumores

Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.

La mayoría de los antígenos, a pH alcalino, migran hacia el polo positivo porque la

resultante de cargas entre los aminoácidos será negativa. Pero algunas proteínas con

muchos aminoácidos básicos compensan los OH- del medio y migran hacia el polo negativo.

Excepto la IgA de ratón, que a pesar de ser una Ig migra hacia el polo positivo, el resto de

las inmunoglobulinas (anticuerpos) migra hacia el polo negativo. Estas características en su

migración se aprovechan también en la contrainmunoleectroforesis.


204

Contrainmunoelectroforesis:

Como en la inmunodifusión doble, se plantan el Ag y el Ac en pozos enfrentados, pero en

este caso no se dejan difundir espontáneamente, sino que para aumentar la sensibilidad y la

velocidad de la reacción se aplica un campo eléctrico para que migren uno hacia el otro.


Electroinmunodifusión cuantitativa:

Semejante a la inmunodifusión radial de Mancini, pero inmersa en un campo eléctrico, es un

método cuantitativo y se conoce como Rocket electroforesis o electroinmunodifusión

cuantitativa. En esta técnica se añade el Ac al agar y luego cuando fragua se hacen los

pocillos en los que se añaden los Ag problema. Es necesario buscar un pH en el que los Ac

se carguen isoeléctricamente y no migren en el campo. Al aplicar el campo eléctrico los Ag

migrarán y precipitarán formando una banda según encuentren la equivalencia con el Ac. A

mayor concentración necesitarán más Ac por lo que la banda será mucho más larga. La

altura del cohete (forma de la banda) será entonces directamente proporcional a la

concentración del Ag.


208

Rep. De Germ-Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.

En la reacción indirecta (dos pasos), el caso de querer conocer si la madre está

sensibilizada (si tiene Ac anti-D en su suero), se toman hematíes Rh positivos y se hacen

reaccionar con el suero de la madre, que si tiene Ac anti-D se unirán a estos hematíes. En el

segundo paso se añade el suero de Coombs y si hay Ac maternos adheridos a los hematíes,

los Ac anti-IgG del suero de Coombs se fijarían a ellos y aglutinarían los hematíes.

Rep. De Germ-Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.


209

Reacciones de hemólisis:

Se basan en el principio de que si se forma un inmunocomplejo sobre la superficie de un

hematíe (un Ac que reconoce un Ag en la membrana del eritrocito y se une a él) y el Ac es

capaz de fijar complemento, al añadirle el complemento éste lisará al hematíe. Hay varios

tipos de reacciones de diagnóstico que descansan sobre este principio: Reacción de fijación

del complemento, técnica de formación de placas, etc.

Reacción de fijación del complemento.

El objetivo es detectar la presencia de determinados Ac en un suero problema.

Se realizarán secuencialmente 2 reacciones en un mismo tubo.

1) Ag + suero (puede contener los Ac) + complemento (C´) en cantidad limitada. Si en

el suero hay los Ac se consumirá el C´.

2) Hematíes + Ac anti-hematíe + el C´ de la reacción anterior si no se consumió).

Si había anticuerpos en el suero, el C´ se consumirá en la primera reacción y no habrá

hemólisis. En cambio, si en el suero problema no hay los Ac, el C´ permanecerá activo y se

unirá a los hematíes con los Ac de la segunda reacción fijados y los lisará.

Se suele montar en paralelo un tubo control sin el suero para controlar la reacción; en este

tubo siempre ocurrirá hemólisis.


El resultado se da como titulación (1/ dilución máxima que produce inhibición total de la

hemólisis).

Técnica de células formadoras de placas (CFP).

El objetivo de la técnica es detectar si en una suspensión celular hay células productoras de

anticuerpos para determinados Ag.


210

Se prepara una suspensión celular mixta con las células a testar (linfocitos obtenidos

mediante separación en gradiente de ficoll de sangre periférica) y eritrocitos de carnero

sensibilizados con el antígeno (con el Ag adherido a su membrana). Se incuban a 37 grados

y se añade complemento. Durante la incubación las células secretoras de Ac producen

inmunoglobulinas que secretan a su alrededor y se unen a los Ag fijados a la membrana de

los hematíes que se encontraban en este radio de acción. Al añadirse el complemento será

fijado por los inmunocomplejos (Ig que reconocieron los Ag de la membrana del eritrocito) y

lisará dichos eritrocitos. Entonces se vé que alrededor de la célula productora de Ac se

forma una zona vacía o placa de hemólisis. El número de placas de hemólisis equivale al

número de células que producen anticuerpos específicos.

Separación en gradiente de Ficoll



211

Técnicas con ligandos marcados.

Se basa en la conjugación de moléculas trazadoras (emisoras de una señal identificable) a

antígenos y más frecuentemente a anticuerpos. La presencia o no de la señal implica la

existencia o ausencia del ligando (ensayos cualitativos) y en muchos casos se puede medir

la cantidad o intensidad de la señal e inferir la cantidad de ligando (ensayos cuantitativos).

Se han utilizado, como moléculas trazadoras acoplables a los ligandos, diversidad de ellas

con cualidades diferentes:

-Moléculas fluorescentes

-Moléculas cromogénicas (con activación enzimática o no)

-Moléculas radiactivas

-Moléculas luminiscentes

Los ensayos con ligandos marcados pueden clasificarse de diversas maneras atendiendo a

las características del Ag (Ag fijos a tejidos o antígenos solubles), las características del

marcador o trazador (fluorescente, enzimático, radiactivo), la características del diseño de la

técnica (cualitativos, semicuantitativos, cuantitativos, competitivos, no competitivos,

homogéneos, heterogéneos), etc.

Inmunofluorescencia.

En esta técnica se conjuga el ligando (casi siempre el anticuerpo) con una molécula

trazadora fluorescente. Por lo general se aprecia la emisión de fluorescencia en un

microscopio específico llamado de fluorescencia que emite luz UV.

Inmunofluorescencia directa.

Se usa para detectar antígenos en tejidos o células e identificarlos. Es directa porque el Ac

marcado es el que reconoce directamente, en un solo paso, al Ag que se desea identificar.

Inmunofluorescencia indirecta.

Puede usarse igualmente para detectar o identificar antígenos en tejidos o muestras o para

detectar la existencia de Ac en suero o fase soluble para lo cual suele fijarse Ag específico a

fase sólida. En cualquier caso al ser indirecta se realizan dos pasos y se suelen usar dos Ac

de los cuales sólo uno se marca con la molécula fluorescente. Esta técnica además de ser

más versátil es más sensible que la directa.

Tinción del complemento.

Es una variante de la técnica indirecta aplicada para amplificar la señal fluorescente y

aumentar la sensibilidad del ensayo. Para ello es necesario que el Ac que reconoce el Ag (el


212

Ac del primer paso) sea capaz de fijar complemento. Como segundo anticuerpo o anticuerpo

conjugado (el Ac marcado que se añade en el segundo paso) reconozca específicamente un

componente del complemento. De este modo se marcará el C´ unido al primer Ac y el que

esté insertado a la membrana en la cercanía del Ag que al formar el inmunocomplejo activó

y fijó el C’.


Inmunohistoquímica.

Es una técnica semejante a la anterior pero la molécula trazadora no es fluorescente sino un

colorante químico, una molécula electrodensa metálica si se quiere aplicar microscopía

electrónica (ej. Oro coloidal), una enzima que hace colorear un sustrato, etc. Este marcaje

se utiliza de modo directo o indirecto para detectar Ag en tejidos o utilizándolos como fase

sólida para detectar Ac en suero u otro fluido.

Los marcadores o trazadores utilizados, sean enzimas u otro tipo de molécula, deben poder

ser acoplados al Ac sin que esto afecte sus propiedades. En el caso de enzima, en

presencia de un determinado sustrato producirá color, pero este debe tener la particularidad

de ser soluble cuando lo añadimos, pero al unirse al enzima debe hacerse insoluble y formar

un precipitado insoluble en el sitio de reacción.


213

Para la localización de estructuras subcelulares o simultáneas puede hacerse un doble o

triple marcaje. También estas técnicas pueden hacerse de modo directo (un Ac marcado) o

indirecto (dos anticuerpos, uno de ellos marcado) según lo requiera la determinación del

ligando que se pretenda evidenciar.

Inmunohistoquímica directa.

Inmunohistoquímica indirecta.

Rep.de. www.usc.es

Inmunocromatografia (dip-stick).

Son métodos que se basan en la migración de un ligando marcado con partículas

coloreadas apreciables a simple vista. Se utilizan en kits de diagnóstico rápido (Ej. test de

embrazo). Existen adaptaciones de esta metodología para diagnosticar un gran número de

enfermedades infecciosas, determinar Ag en alimentos, etc.

El soporte suele ser papel de acetato de celulosa embebido en un buffer apropiado y

envuelto en un chasis o cartucho de plástico en el cual hay practicadas ventanas

transparentes para permitir ver el color en ellas. En un extremo se pone la muestra problema

(que puede contener Ag o Ac a determinar) y cerca, pero un poco más adelantado se ha

preparado un sitio donde se ha colocado previamente el ligando conjugado con la partícula

trazadora (oro coloidal, partículas de látex coloreadas, etc). En otro sitio más adelantado

aún, y también preparado de antemano se coloca un reactivo capaz de unirse al ligando

problema. Sobre este sitio hay practicada una ventana (llamada positiva) para poder

visualizar el color. Más adelante hay practicada otra ventana (llamada negativa) que permite

apreciar color a este nivel.

Los reactivos migran por capilaridad en el papel de acetato de celulosa (de la zona más

húmeda a la más seca). Al migrar el ligando problema interactúa con el ligando marcado

(reaccionan y se unen formando un inmunocoplejo) y siguen migrando juntos. También

migran el ligando marcado y el ligando problema que no se unieron (excesos). El


214

inmunocomplejo migrará hasta llegar a la ventana positiva, donde hay fijado otro ligando del

componente de la muestra problema, diferente al conjugado. Este ligando fijo retendrá los IC

coloreados en este sitio que es la ventana positiva (color en esa ventana significa que hubo

reacción Ag-Ac y formación de IC o sea que se detectó el ligando buscado). El resto de los

ligandos que no se unieron (excesos) continuará migrando hasta la otra ventana y al contar

entre ellos con ligando marcado se coloreará entonces también esta ventana llamada

negativa. Esto sirve como control y como señal de fin de ensayo. En un caso positivo se

colorearán ambas ventanas y en uno negativo sólo la ventana negativa.

Rep.de. www.usc.es

Inmunoblot o inmunotransferencia (westernblot marcado con Ac).

Es un ensayo de alta sensibilidad y especificidad. Es altamente resolutivo y se usa tanto en

investigación como en diagnóstico. Se utiliza para identificar Ag inmersos en una muestra

compleja (muestra con muchos Ag diferentes). Permite además determinar el peso

molecular de los antígenos.

Se realiza en tres etapas:

Separación de los Ag (SDS-PAGE). Se prepara previamente un gel de poliacrilamida1 en el

que se incluye un molde antes de que polimerice, para crear los pocillos, en el extremo

donde se pondrá la muestra. Este gel, al polimerizar, forma un entramado microscópico a

través del cual podrá difundir la muestra. El gel, ya polimerizado, se coloca en una cámara

de electroforesis inmerso en un buffer apropiado. Antes de poner las muestras en los

pocillos se someten a tratamiento térmico para desnaturalizarlas (romper enlaces que

conforman la estructura tridimensional) y linearizarlas. Si se desea conocer el peso

molecular hay que poner en un pocillo un marcador especial que al separarse durante la

migración se divide en bandas de peso molecular conocido con las cuales se compararán

las obtenidas de la muestra problema. Al gel inmerso en el buffer se le somete a un campo

1 El Gel de poliacrimamida ofrece una mejor resolución de las bandas en la electroforesis con respecto a

otros soportes como papel, acetato de celulosa, gel de agarosa.


215

eléctrico (dipolo) creado en la cámara de electroforesis que hará migrar los antígenos que

componen la muestra e irse separando en función de su peso molecular (por lo general las

proteínas migran del polo negativo al positivo en función de su carga neta). Los de menor

peso molecular migrarán más rápido (mayor facilidad para difundir a través de los poros del

entramado microscópico del gel) y los de mayor peso molecular lo harán más lentamente. Al

cabo de un tiempo los Ag de la muestra compleja quedan separados en el gel.

Transferencia a papel de nitrocelulosa: En una cámara de transferencia se hacen

coincidir el gel y una lámina de papel de nitrocelulosa de igual dimensión que este y

mediante capilaridad (utilizando papel de filtro) o más habitualmente con la aplicación de un

nuevo campo eléctrico se hacen migrar los Ag (proteínas), ya separados previamente en el

gel de poliacrilamida, desde el gel hacia el papel de NC donde quedan retenidos. Es

necesario hacer la transferencia de las proteínas a un papel de nitrocelulosa porque los

anticuerpos, debido a su estructura no pueden penetrar en el gel.

Revelado o marcaje: Una vez que tenemos las proteínas en el papel de nitrocelulosa se

añaden sobre este los Ac específicos que reconocerán los Ag presentes en él. Para poder

verlo (revelado) se utilizan Ac marcados con enzimas a los que se les añade el sustrato

correspondiente para obtener una señal de color semejante al inmunodot.

Las aplicaciones de esta técnica son prácticamente universales, en la clínica y en

investigación, en muchas ramas de las ciencias biológicas.


216

Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica

Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.

ELISPOT:

Es una técnica muy sensible que se aplica para determinar la frecuencia de células

específicas en una suspensión celular (fracción mononuclear). Se pueden detectar células

de estirpe B secretoras de Ac (incluso de un isotipo determinado) o células T totales,

subpoblaciones o específicas. Aunque es un ensayo con alta disponibilidad y sensibilidad

actualmente ha sido relegado por las técnicas de citometría de flujo.

Si se quiere determinar la frecuencia de células de estirpe B productoras de Ac de una

especificidad determinada (productor de determinado idiotipo de Ig), se fija previamente a la

fase sólida (pocillo de placa) el Ag específico complementario. Sobre este se añade la

suspensión celular dentro de la cual estarán las células cuya frecuencia queremos

determinar. Si hay células productoras de Ac específicos para el Ag fijado, dichas células

secretarán dichos Ac que se adherirán los Ag que encuentren en su vecindad y entonces no

se eliminarán con los lavados. Seguidamente se añade un Ac anti-Ig conjugado con una

enzima. Se añade el sustrato que cambia de color por la acción de la enzima y si es

insoluble formará en cada sitio un punto de color correspondiente a cada célula específica

detectada. Si se utiliza un cromógeno que permanece soluble tras su interacción con la


217

enzima se puede cuantificar, por la intensidad de color del medio, la cantidad de Ig

producida.

Puede también aplicarse el método para detectar células T, pero en este caso lo que se

detecta es alguna citoquina que produzcan dichas células. Es necesario activarlas

previamente enfrentándolas al Ag en presencia de células presentadoras (de otro modo no

producen las citoquinas). En esta variante en lugar de Ag fijado a la fase sólida se fija Ac

anticitoquina. El resto de la técnica es igual.

ELISPOT. Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica


Radioinmunoensayos (RIAs) y Enzimoinmunoensayos (EIAs).

Se define como inmunoensayo a todos aquellos métodos, empleados para la detección de

cualquier sustancia o compuesto, que están basados en las reacciones inmunológicas. Es

decir, que se fundamentan en el extraordinario poder discriminatorio que presentan los

anticuerpos y su gran afinidad por agentes externos extraños. Con estos métodos pueden

ser detectadas en muestras biológicas sustancias en el orden de picogramos. En ellos

alguno de los componentes de la reacción (antígeno o anticuerpo) está marcado con una


218

enzima (EIA) o con un elemento radioactivo (RIA). Existen muchas variantes con multitud de

aplicaciones.

Radioinmunoensayos (RIA).

Es un método para detectar algunas sustancias que pueden ser marcadas con radioisótopos

y constituir antígenos para determinados anticuerpos. Los RIAs originalmente utilizaban a

las sustancias que se querían determinar marcadas isotópicamente, o sea que lo que

presentaban marcado era el antígeno (Ag). Posteriormente aparecieron métodos en los que

lo que se marcaba era los anticuerpos (Ac) y a los que se les denominó ensayos

inmunoradiométricos (IRMAs) para diferenciarlos de los RIA. Los IRMA son más fáciles de

desarrollar, más precisos y más sensibles que los RIA originales. Es oportuno señalar que

actualmente, de manera general, se les llama “radioinmunoensayos” indistintamente si lo

que se marca es el Ag o el Ac. Estos métodos tienen alta sensibilidad y especificidad así

como mínimas interferencias, pero dado lo engorroso de los métodos de separación que

requieren, el elevado precio de los equipos lectores de radiactividad y el peligro que

representa la radiactividad para la salud de los operadores como para el medio ambiente

han sido sustituidos casi totalmente en la actualidad por los métodos inmunoenzimáticos. No

obstante se siguen usando en la determinación cuantitativa de hormonas, drogas y algunos

marcadores tumorales; todos ellos compuestos de muy bajo peso molecular y a bajas

concentraciones en la muestra. Debido a las características de dichos analitos, y a la

necesidad de cuantificarlos, se diseña el ensayo tipo competitivo, ya sea en una sola fase

líquida pero con sistemas de separación, o en dos fases (una líquida y una sólida).

Ej. RIA en medio líquido.

Si queremos determinar la concentración de un hapteno (H) en un fluido corporal;

habitualmente una hormona en orina o en suero, diseñaremos un ensayo competitivo para el

cual será necesario realizar primeramente una curva patrón donde interpolar posteriormente

la reacción específica con el analito (H) a concentración desconocida.

Es necesario disponer de:

a) un anticuerpo que se una específicamente a H (Ac anti-H).

b) el analito (hapteno H) a concentración conocida.

c) el mismo hapteno pero marcado con el isótopo radiactivo (hapteno radioactivo H*)

también a concentración conocida.

.


219

Procedimiento:

1. Hacemos diluciones seriadas de H en tubos o pocillos de microtitulación

2. Añadir a todos los tubos una concentración conocida de H*

3. Añadimos a todos los tubos una cantidad fija de anticuerpos. Debe ponerse en

cantidad limitada, no en exceso. Idealmente aquella que captura aproximadamente el

70% de la hormona marcada.

4. El Ac se unirá a los analitos marcados y sin marcar indiscriminadamente (misma

estructura). En los primeros tubos se unirá más a los analitos sin marcar y en los

finales en mayor medida a los marcados, dadas las concentraciones relativas a que

estarán estos (competencia).

5. Posteriormente se aplica un método de separación para separar de la mezcla la

radiactividad libre de la radiactividad ligada al anticuerpo y se mide una de las dos.

La radiactividad que se una al Ac será menor a medida que es mayor la

concentración del analito sin marcar, dado que las afinidades son iguales y la

probabilidad de unión dependerá entonces de la concentración.

6. Con los datos obtenidos de la serie se realiza una curva patrón.

Posteriormente se hace un ensayo semejante con las muestras con el analito a

concentración desconocida y concentraciones conocidas del analito marcado y del Ac, para

determinar el rango de la curva en la que se trabajará y donde se podrán interpolar los

resultados. En este rango la cantidad de marcador unido a los Ac dependerá de la

concentración del analito sin marcar y será inversamente proporcional a la concentración de

este.

El RIA competitivo también se puede hacer sobre fase sólida.

Enzimoinmunoensayos (EIA).

Inmunoensayos en los cuales la detección del compuesto a determinar es realizada al

evaluar los cambios de concentración en el producto de una reacción enzimática. La enzima

va unida a uno de los componentes de la reacción Ag-Ac y su actividad va a depender de la

cantidad de ligando que se una a este componente.

Las enzimas, como marcadores, presentan muchas ventajas ya que pueden diseñarse

ensayos con tanta detectabilidad, sensibilidad, especificidad y precisión como las que

presentan los RIA sin muchos de sus inconvenientes.


220

Tipos de enzimoinmunoensayos.

Homogéneos: se caracterizan por realizarse en una sola fase líquida sin pasos intermedios

de lavado. Son diseños de tipo competitivo y en ellos la actividad enzimática se modifica con

la unión de los ligandos (inhibición o activación catalítica durante la reacción Ag-Ac). Son

muy empleados para la determinación de fármacos y hormonas en fluidos biológicos

(compuestos de pequeño tamaño molecular que se comportan como haptenos).

Heterogéneos: El ensayo transcurre en dos fases, una líquida y una sólida y no se modifica

la actividad enzimática Se realizan pasos de lavado intermedios en los que se eliminan los

elementos de la fase líquida que no se han unido a la fase sólida. Según su diseño pueden

ser competitivos y no competitivos, directos e indirectos, de captura, etc. Son los que se

denominan ELISA.

Ambos tipos de ensayos pueden ser cualitativos o cuantitativos.

Ej. EIA homogéneos: CEDIA (Combined Enzyme Donor Inmunoassay): La enzima

conjugada es la -D-galactosidasa que está compuesta por dos subunidades que cuando se

juntan adquieren actividad enzimática. Se conjuga una subunidad a una cantidad conocida

de analito y la otra se añade sin conjugar. De unirse el analito conjugado al Ac esto impide

que se una a la otra subunidad y no habrá actividad enzimática. Como el sistema es

competitivo la actividad enzimática dependerá de cuánto Ac se utilice en reaccionar con el

analito de la muestra. A mayor concentración del analito más Ac secuestrará y entonces

más analito conjugado quedará en disposición de unirse a las otras subunidades y más

transformación de sustrato y señal habrá. La señal será directamente proporcional a la

concentración de analito en la muestra.


221

Rep.de. www.usc.es

EIA heterogéneos.

Estos ensayos se realizan sobre una fase sólida que habitualmente es de poliestireno o

cloruro de polivinilo. Dada la adaptabilidad a equipos automáticos y la posibilidad de analizar

muchas muestras se suelen usar placas de microtitulación aunque también se pueden se

pueden utilizar otros soportes como tubos, microesferas, membranas, etc.

El primer paso siempre es adherir a este soporte sólido uno de los ligandos, que puede ser

un Ag o un Ac según el diseño. Tras cada paso se realiza lavado para eliminar los

elementos no adheridos a la reacción, excepto en el último paso para no perder el sustrato

modificado. La evidencia de este cambio de color, ya sea presencia o ausencia en el caso

de los cualitativos o grados de intensidad en el de los cualitativos, se lee en un equipo

automático cuyas características depende de las cualidades de la señal del sustrato utilizado

(cromógenos en un espectrofotómetro, sustratos fluorescentes en un fluorímetro, sustratos

luminescentes en un luminómetro). Como los equipos leen el total de señal en una sección

estrecha de la columna líquida es preferible que los sustratos al modificarse se mantengan

solubles y no precipiten, así se mantienen homogéneamente distribuíos en el pocillo y la

lectura de esta señal es representativa de toda la reacción.


222


A partir de estas características básicas pueden diseñarse diferentes tipos de ensayos

heterogéneos con diversas aplicaciones que pueden clasificarse en dos grandes grupos:

EIA heterogéneos competitivos y no competitivos.


En los competitivos se establece una competencia entre el analito y uno idéntico marcado

por el sitio de unión en el ligando y esta unión dependerá de sus cantidades relativas en la

reacción. La evidencia (cantidad de señal) es indirecta. Al haber más cantidad de analito,

menos analito marcado se fijará y quedará en la fase sólida, por lo tanto al revelar habrá

menos señal. Estos ensayos se usan generalmente para detectar antígenos a bajas

concentraciones.


223

Rep.de. www.usc.es

En los ensayos no competitivos no hay competencia por el ligando y la evidencia procede

directamente de la cantidad de analito. Pueden diseñarse EIA no competitivos directos,

indirectos y de captura o tipo “sándwich” para detectar Ag o Ac. En las aplicaciones clínicas

se utilizan con mayor frecuenta los indirectos para detectar o cuantificar Ac en suero.

Rep.de. www.usc.es

Técnicas inmunológicas con aplicación de biología molecular.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Se aprovecha la termoestabilidad de la DNA polimerasa de bacterias extremófilas para

poder realizar en el laboratorio múltiples ciclos de reacciones de polimerización

encadenadas. De esta manera se puede obtener un alto número de copias de un segmento

de DNA determinado.


224

Se desnaturaliza el DNA en bandas sencillas mediante un tratamiento breve con calor y a

continuación se enfría en presencia de exceso de oligonucleótidos cebadores (primers)

complementarios de las secuencias de DNA que flanquean el segmento que se desea

amplificar. Se emplea una polimerasa de DNA termoresistente para copiar el DNA a partir de

los extremos 3´ de los cebadores. Como todos los elementos de la reacción son

termoestables se puede repetir el ciclo de calentamiento y enfriamiento muchas veces, lo

que tiene como resultado fusión y síntesis de DNA complementario y amplificación rápida de

una secuencia determinada. En pocos ciclos se puede amplificar alrededor de un millón de

veces la secuencia de DNA seleccionada.

Rep.de Kindt. T, goldsby. R, Osborne. B. Inmunología de Kuby. Mc Graw Hill, Ed. 6. 2007.

La posibilidad de amplificar muchas veces un segmento de DNA lo convierte en un elemento

inmejorable para diseñar sistemas de amplificación de señales. Se adhiere un ligando de la

reacción Ag-Ac con una cadena de ácido nucleico que luego podrá amplificarse mediante

PCR y servir de elemento de evidencia ya sea solo o marcado con otras moléculas.


225

Inmuno-PCR.

Técnica de amplificación de señal que utiliza la especificidad de la detección de la reacción

Ag-Ac y la capacidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de obtener miles de

copias idénticas de una cadena corta de DNA. Aumenta considerablemente la sensibilidad

del ensayo sin perder especificidad. De particular utilidad cuando se pretende cuantificar Ag

que se encuentran en muy pequeña cantidad en la muestra.

Ej. Inmunoensayo con amplificación por PCR cuantitativa: Se diseña un sistema de

captura con el Ac de captura unido al soporte sólido; se añade la muestra y posteriormente

se añade un Ac de reconocimiento o detección que lleva unido (marcado) un

oligonucleótido. Este último se amplifica mediante PCR. La existencia de copias de DNA es

la evidencia de la existencia del Ag en la muestra, que puede ser a u vez cuantificada de

esta manera. Pueden utilizarse oligonucleótidos marcados con fluoresceína o enzimas. La

fluorescencia emitida que depende del número de copias obtenidas tras un número de

ciclos de amplificación predefinido será proporcional al número de cadenas iniciales, que a

su vez se corresponderá con la cantidad de Ag presente en la muestra. Es un método de

alta sensibilidad y especificidad e incrementa enormemente la detectabilidad del ensayo.

Rep.de. www.usc.es

Citometría de flujo.

La citometría de flujo permite el análisis morfológico y fenotípico de leucocitos y otras células

en suspensión. Se puede cuantificar y clasificar distintas poblaciones de leucocitos,

linfocitos, células de cultivo, etc (Ej. clasificar leucemias según los marcadores de la

superficie celular). Si el citómetro es un citofluorímetro está equipado con detectores de

fluorescencia y con él se puede determinar la expresión de moléculas en las células

(moléculas de membrana o intracitoplasmáticas) mediante el marcaje con anticuerpos


226

monoclonales conjugados con moléculas fluorescentes. Cada molécula tiene un espectro de

excitación y emisión diferente que permite su identificación mediante filtros selectivos.

Algunos aparatos están equipados para separar las células identificadas (FACS; separador

de células activado por fluoresecencia).

Las células en suspensión se hacen pasar con gran rapidez (50000 células por segundo)

por un colector en forma de flujo laminar de células individuales (en “fila india”). El paso de

cada célula atravesando una fuente de rayos láser dispersa la luz y da señales que son

analizadas por un ordenador mediante detectores específicos. Hay detectores para luz

dispersada que informa del tamaño de la célula (forward light scatter o luz refractada) y de

su morfología o rugosidad (side Light scatter o complejidad estimada por la luz reflejada a

90º). Para fluorescencia hay detectores precedidos de filtros que seleccionan las longitudes

de onda de los fluorocromos correspondiente cada una a un color diferente. Estos

receptores sólo son activados cuando pasa una célula recubierta por el anticuerpo

monoclonal marcado con el color correspondiente.




227

Técnicas de histocompatibilidad y prevención de rechazos.

Pruebas cruzadas:

Se realiza siempre y permite descartar que no haya anticuerpos preformados en el receptor

contra Ag del donante. En este ensayo se enfrenta in vitro el suero del receptor con las células

(linfocitos, monocitos, eritrocitos) del donante. Si existe reconocimiento ocurrirá aglutinación o

lisis celular (si se añade complemento a la reacción). De esta forma se previene el rechazo

hiperagudo.

Ensayo de microlinfocitotoxicidad:

Se utiliza para identificar las moléculas de HLA que expresan las células (linfocitos y moncitos)

del receptor y los posibles donantes. Es una técnica serológica en la que se hacen reaccionar, en

una placa de Terasaki, las células a tipar con una batería de anticuerpos con especificidades

para los diferentes antígenos HLA en presencia de una fuente de complemento. Si existe

reconocimiento específico se formará un inmunocomplejo sobre la membrana de la célula que

activará el complemento por la vía clásica y culminará con la lisis celular por la acción del MAC.

Actualmente también se aplican técnicas de marcaje con Ac fluoresecentes y detección mediante

citometría de flujo. También se aplican con este propósito técnicas de biología molecular que

identifican las secuencias génicas de los diferentes alelos.




228

Cultivo mixto de linfocitos: Es una prueba in vitro en la que se cultivan en conjunto células del

anillo mononuclear (Linfocitos y APC) del donante y receptor. Si los antígenos de

histocompatibilidad son diferentes, una gran proporción de estas células proliferarán en pocos

días y es indicativo del reconocimiento de antígenos extraños e inmunogénicos y permite predecir

que va a ocurrir una reacción de rechazo (o enfermedad de injerto contra huésped en el caso del

transplante de médula ósea). La proliferación puede medirse cuantificando la incorporación de

timidina tritiada en el ADN de las células que replican o, más recientemente, mediante marcaje

(CFSE) aplicando citometría de flujo.

Anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos pueden unirse y reconocer una variedad prácticamente ilimitada de moléculas

(antígenos). El suero de animales de laboratorio hiperinmunizados con un determinado antígeno

contiene una gran cantidad de anticuerpos específicos para ese antígeno. Estos anticuerpos son

heterogéneos, pues son producidos por numerosos clones de linfocitos B y reconocen epítopes

diferentes, por ello se denominan anticuerpos policlonales. Aunque pueden emplearse en

numerosos ensayos inmunológicos tienen como limitantes su heterogeneidad y su cantidad

limitada. Por ello se han creado técnicas que permiten la obtención de anticuerpos de una

especificidad única y definida (reconocern un epítope concreto) en cantidad ilimitada

denominados anticuerpos monoclonales. Se trata de anticuerpos sintetizados por un único clon

de linfocitos B.

Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.


229

En teoría bastaría aislar un clon de los activados por la inmunización para obtener in vitro un

anticuerpo monoclonal (AcMo) pero los linfocitos B y células plasmáticas sólo sobreviven de

modo limitado en cultivo. La solución es fusionarlos con células de un tumor (mieloma) creando

células híbridas o hibridomas. Las células B no fusionadas morirían al cabo de un número

limitado de divisiones en cultivo pero para separar mielomas de hibridomas es necesario

seleccionar mielomas mutados incapaces de crecer en un medio selectivo con aminopterina. La

minopterina bloquea la síntesis de novo de nucleótidos y la mutación afecta la enzima

hipoxantina-guaninafosforribosil transferasa (HPRT) que permite una ruta alternativa de de

obtención de nucleótidos. De este modo los linfocitos B aportan al hibridoma la facultad de

producir Ac de una especificidad determinada y la posibilidad de producir la HPRT que salva al

hibridoma de morir en el medio selectivo y el mieloma le aporta la capacidad de dividirse sin

límites y vivir eternamente en cultivo.

Debido a las diferencias xenogénicas el uso terapéutico de los Ac monoclonales murinos es muy

limitado por su inmunogenicidad. Por esta razón, y por lo poco estables de las células

maliginizadas con virus para producir AcMo humanos, se ha aplicado la ingeniería genética para

obtener AcMo mixtos (quiméricos, humanizados y “reshaped”) donde casi toda la molécula es

humana, excepto los sitios de unión al Ag). Tambien se han obtenido AcMo humanos mediante

tecnicas de “inmortalización” de linfocitos B utilizando virus (Saimiri, virus de Epstein-Baar).

Los AcMo además de resultar un reactivo de múltiples aplicaciones en técnicas inmunológicas in

vitro también son utilizados actualmente como parte del arsenal terapéutico para tratar

enfermedades. (Ej: anti-TNF (infliximab) en el tratamiento de la artiritis reumatoide y la psoriasis,


230

anti-CD20 en el tratamiento del linfoma de Hodgkin, anti-IgE (omalizumab) en enfermedades

alérgicas).

Pruebas in vivo.

Permiten evaluar la respuesta inmunológica de diversa índole en un individuo concreto.

-Tests cutáneos de hipersensibilidad inmediata IgE mediada (Prick-test, intradermoreacción

con lectura inmediata). Detectan y miden de un modo semicuantitativo la sensibilización de un

individuo a alergenos específicos. Consiste en la administración de alergenos en capas diferentes

de la piel (prick test en la epidermis e ID en el interior de la dermis) y la medición, 15-20 minutos

después, de la reacción local (habón y eritema) causada por los mediadores de la inflamación

que liberan los mastocitos que se hayan activado mediante el reconocimiento del alergeno por

las IgEs específicas fijadas a la membrana por receptores de Fc de alta afinidad.

-Tests cutáneos de hipersensibilidad retardada (patch tests, intradermoreacción con lectura

tardía). Miden la respuesta inmune celular, ya sea para evaluar su capacidad o para detectar

hipesensibilidades tipo IV. Los llamados patch tests o pruebas epicutáneas consisten en la

aplicación sobre la piel de parches con el antígeno que se quiere testar y un vehículo apropiado y

se aplica en el diagnóstico de las dermatitis de contacto. En la ID se procede igual que en el caso

de la inmediata pero varía el intervalo hasta la lectura. Se aplica para el estudio de los exantemas

medicamentosos y la evaluación de la capacidad de la rama celular de la inmunidad (utilizando

antígenos ubicuos). En ambos casos las lecturas de las reacciones se hacen como mínimo a las

48 horas.


231

Manipulación de la respuesta inmune

La inmunidad dadas sus propiedades de ser específica y generar memoria puede ser utilizada

con diversos fines médicos (ej. profilaxis, terapéutica).

Pude adquirirse de diversas maneras; de modo natural o artificial y de forma activa o pasiva.

La inmunidad natural es la que se adquiere sin intervención de la mano del hombre, o sea

durante la vida del individuo biológico a través de su interacción con el medio; y la inmunidad

artificial es aquella que se induce intencionadamente para modificar el curso de procesos

patológicos mediante la acción del hombre en el proceso.

La inmunidad activa es aquella en la cual se crean en el individuo los efectores de la respuesta

inmune como consecuencia de la interacción con el antígeno. La inmunidad pasiva es la que se

adquiere por la transferencia de dichos efectores a un individuo que no los ha creado.

La inmunidad creada a través del proceso natural de la infección por un agente biológico es el

ejemplo típico de inmunidad natural activa (se crean los efectores de la respuesta inmune

específica contra ese patógeno, ya sean anticuerpos o linfocitos T efectores, como

consecuencias de la interacción del sistema inmune del individuo con los antígenos del

microorganismo con el que se puso en contacto).

La transferencia transplacentaria materno-fatal, de los anticuerpos específicos creados por la

madre a través su vida, es el ejemplo que ilustra la inmunidad natural pasiva. En este caso el feto

recibe los efectores de la respuesta inmune (anticuerpos maternos) sin haberse enfrentado al

antígeno ni haberlos creado por sí mismo.

La vacunación con microorganismos modificados o antígenos de los mismos es el modo de

adquirir inmunidad activa de modo artificial (se crean los efectores propios pero el antígeno que

desencadena el proceso es administrado de forma artificial).

Cuando se administran anticuerpos preformados inducidos por la inmunización de un animal de

laboratorio o tomados de individuos que los han creado al enfrentarse a los antígenos, para

proteger a un individuo de ciertos procesos patológicos, estamos hablando de inmunidad pasiva

artificial (Ej. suero antirrábico, “vacunación” anti-D).

Vacunas.

El objetivo de la inmunización es proteger al individuo vacunado de la enfermedad causada

naturalmente por el agente del que proceden los antígenos utilizados. Idealmente esto debería

realizarse con la mayor seguridad posible (mínimos riesgos) y generar una respuesta protectora

que durara el mayor tiempo posible (a veces toda la vida). Intentando conseguir estos objetivos y

dadas las dificultades propias de cada caso particular, se han creado diversos tipos de vacunas.


232

Vacunas de microorganismos vivos: implica mayor riesgos que otras pero suelen ser

excelentes inmunogénicamente. Se aplican solo cuando otros tipos de vacunas más seguras no

generan un grado de protección aceptable. Se utilizan cepas atenuadas, por selección o

genéticamente modificadas (ej. Vacuna antipolio de Sabin y BCG).

Vacunas de microorganismos inactivados: se utiliza el agente biológico entero pero muerto,

sin capacidad infectiva ni de replicación (ej. Vacuna contra el cólera).

Vacunas de antígenos, subunidades y toxoides: en ellas sólo se utilizan partes antigénicas, a

veces modificadas como los toxoides, de microorganismos para inducir la respuesta inmune

protectora en el individuo vacunado (ej. vacunas contra la difteria y tétanos).

Más recientemente se han aplicado otros tipos de vacunas con diversos propósitos (vacunas de

péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, DNA purificado, etc.).

A veces la administración de Ag de modo no natural no es capáz de inducir una respuesta

inmune adecuada por lo que se acompaña de otras sustancias, denominadas adyuvantes. Estos

compuestos tienen la función de estimular de manera inespecífica la activación de linfocitos por

diversos mecanismos (estimulación de células presentadoras, incremento de la emisión de

señales co-activadoras, particulación del Ag, activación inespecífica de linfocitos, etc.) El más

usado en investigación es el adyuvante copmpleto de Freund (una emulsión oleosa con

micobacterias muertas) pero no está autorizado su uso invivo en humanos por lo que en vacunas

el más utilizado es el hidróxido d e aluminio.

Terapia adoptiva.

El termino terapia adoptiva se refiere a la administración de elementos celulares o moleculares

generados en otro individuo o del propio individuo pero modificados fuera del organismo, para el

tratamiento de enfermedades de diversa naturaleza. El ejemplo más antiguo de todos es la

transfusión sanguínea. Posteriormente otros procederes y técnicas han permitido utilizar

moléculas y células de la respuesta inmune. Las inmunoglobulinas (preparados purificados

generados a partir de plasma de donantes) se utilizan por vía endovenosa para tratar las

inmunodeficiencias de células B y en ocasiones como tratamiento inmunosupresor (dependiente

de dosis). Otras inmunodeficiencias como las severas combinadas debidas a déficit enzimáticos

(ADA y PNP) se pueden tratar con las propias células del individuo afectado tras ser modificadas

genéticamente (terapia génica). En el tratamiento de las enfermedades tumorales se han

ensayado aplicaciones terapéuticas de linfocitos circulantes o intratumorales procedentes del

propio individuo a los cuales se les somete a procesos in vitro de estimulación con citocinas y Ag

tumorales antes de ser reintroducidos (terapia LAK y TIL).

A veces para inducir la proliferación de subpoblaciones celulares seleccionadas in vitro se utilizan

los mitógenos. Son moléculas, generalmente de origen vegetal, capaces de interactuar con


233

receptores en las membranas de los linfocitos y producir la transducción de señales necesaria

para lograr dicho efecto (ej. LPS para linfocitos B, fitohemaglutinina y concanavalina A para

linfocitos T y pokeweed para ambos tipos celulares.

Otras moléculas “transplantadas” que se utilizan para tratar enfermedades son las citocinas como

el interferón beta (generalmente en complejo con polietileno glicol) para las hepatitis o la

esclerosis múltiple y el GM-CSF en las leucopenias.

Inmunosupresión.

Tanto la respuesta inflamatoria como la respuesta inmune específica pueden estar implicadas en

la producción de daño hístico y enfermedad por esta causa (enfermedades inflamatorias, por

hipersensibilidad y autoinmunes). En estos casos es necesario inhibir la respuesta inadecuada o

lesiva. Existen fármacos que permiten actuar en este sentido sobre la respuesta inmunológica a

través de diferentes mecanismos de acción.

Fármacos inmunosupresores: Se pueden dividir en tres categorías:

Drogas antiinfiamatorias de la familia de los corticosteroides como la prednisona.

Drogas citotóxicas, como la azatioprina y la ciclofosfamida.

Derivados fúngicos y bacterianos como la ciclosporina A.

Glucocorticoides: Efectos dosis dependientes de predominio antiinflamatorio mediante su

acción sobre diferentes sitios de las células. Tras su unión a receptores intracitoplasmáticos son

capaces de inducir cambios en la transcripción de proteínas (entre ellas citocinas) que conllevan

a cambios en la distribución de leucocitos, inhibir su migración, modular la función de las células

efectoras y disminuir la producción de mediadores de la inflamación.


235

La ciclofosfamida es una de las drogas más potentes como inmunosupresoras. Uno de

sus metabolitos se comporta como agente alquilante de diversos componentes

celulares incluyendo bases de DNA y RNA creando uniones cruzadas en la molécula

de ácido nucleico que conllevan a la muerte celular.

Rep.de Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.

La ciclosporina A, el tacrolimus (FK506) y el rapamicin inhiben la síntesis de citocinas,

especialmente la IL-2 por mecanismos semejantes.

Rep.de Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.

Anticuerpos


236

Mediante inmunoglobulinas se puede interferir la respuesta inmune de una forma no

tóxica y mucho más específica que los fármacos. Actualmente los más usados en este

sentido son anticuerpos monoclonales de origen humano, transgénicos o murinos

humanizados anti-CD3, anti-CD4, anti-TNF, anti-IgE, etc. También se utilizan

inmunoglobulinas a dosis altas (>400 mg/kg) como inmunosupresores. Hace unos años se

conjugaron Ac específicos (casi siempre monoclonales) contra dianas celulares con

diversas sustancias antitumorales (toxinas, fármacos, etc.), a lo cual que se llamó inmuno

toxinas, “magic bullets”, etc., con muy poco exíto en general.


237

Bibiliografía:

1. Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic.

2008.

2. Kindt. T, goldsby. R, Osborne. B. Inmunología de Kuby. Mc Graw Hill, Ed. 6. 2007.

3. Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología

del Sistema Inmune. Editorial médica Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp.

2006.

4. Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.

5. Peña. J. Inmunologíaonline. http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/

2003.

Las ilustraciones del manual han sido tomadas de bibliografías 1, 2 y 5.


manual bir - inspiracle€¦ · receptor de ag del linfocito t.. .....89 tema 9. desarrollo de...

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