lipossomas fármacos
TRANSCRIPT
Nereide Stela Santos Magalhães
Recife, 2004
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO-ASAMI
EVOLUEVOLUÇÃÇÃO DA NANOTECNOLOGIA FARMACO DA NANOTECNOLOGIA FARMACÊÊUTICAUTICALIPOSSOMAS
NANOPARTÍCULASSÍTIO-ESPECÍFICOS
Lipossomas-PEG-Lectina
NanocápsulasNanoesferas
Dex- PLA
Dex- PCL
Dextrana-PCL-Lectina
Groupo SLC/UFPE
ConvencionalNanocápsulas
Lipossomas19701970
19801980
19901990
20002000
CONVENCIONAL
LIPOSSOMAS, NANOPARTÍCULAS
- Metacrilatos- Alquilcianoacrilatos- BiodegradáveisPolímeros pré-formados
•PLA•PLGA•PCL
NanocápsulasNanoesferas
LIPOSSOMASNANOPARTÍCULAS
STEALTH®
PLA-PEGPLGA-PEGPCL-PEG
NanocápsulasNanoesferasLipossomas
Polimerização in situ
�Nanopartículas?
Descritos inicialmente em 1965
Alec D. Bangham
Vesículas esféricas formadas por bicamadas lipídicas com capacidade de incorporar compostos hidrofílicos e hidrofóbicos.
Lipossomas
Estrutura das Membranas Biológicas
Leningher, 2000
Figura 1. Arquitetura supramolecular das membranas
Estruturas Lipídicas• Monocamadas e micelasEm meio aquoso, os lipídeos formam espontaneamenteestruturas.– Monocamadas (baixas concentrações)– Micelas (altas concentrações)
• CMC = concentração crítica micelar)
– Bicamadas lipídicas– Vesículas
• Lipossomas
www.cm.utexas.edu/.../overheads-2/ ch12_lipid-bilayer.jpg
Lipossomas
Micela Bicamada Lipossoma
Compartimentointerno aquoso
Interações não covalentes nasbicamadas lipídicas
• As bicamadas lipídicas possuem tendênciainerente a serem extensas
• As bicamadas lipídicas podem fecharem-se sobre si mesmas e formar vesículas.
• As bicamadas lipídicas são auto-selantes, pois um “orifício” na bicamada é energeticamente desfavorável.
Interações não covalentes nasbicamadas lipídicas
• Hidrofóbicas
• Forças atrativas de van der Waals– Caudas hidrocarbonadas
• Atrações eletrostáticas
• Pontes de hidrogênio– Cabeças polares – água
Moléculas de água são liberadas das caudashidrocarbonadas dos lipídeos quando essas caudasficam sequestradas no interior apolar da bicamada.
Transição de Fases em Bicamadas
• As transições de fases são sempresendotérmicas; o calor é absorvido enquanto a temperatura aumenta durante a transição.
• Fosfolipídeos apresentam temperaturas de transição de fase específicas Tm: aumenta com o comprimento da cadeia alifática, diminui com a insaturação e depende da natureza do grupo polar da cabeça.
Transição de Fases em Membranas
• T<Tm– Bicamada organizada com cadeias alifáticas
relativamente imobilizadas (conformação extendidamáxima),
– Área superficial / lipídeo é mínima– Espessura da bicamada é máxima
• T>Tm– Fase cristalina líquida (mobilidade das cadeias
alifáticas é intermediária entre os estados sólido e líquido de alcanos).
– Área superficial / lipídeo aumenta.– Espessura da bicamada diminui de 10 a 15%.
Transição de Fases em Bicamadas
• Em bicamadas de fosfolipídeos puros, a transição ocorre em faixa estreita de temperatura. Ex:– Tm dimiristoilfosfatidilcolina = 0,2oC.
• Membranas biológicas apresentam faixa larga de transição de fase e dependem fortemente da composição dos lipídeos e proteínas.
Transição de Fases em Bicamadas
• Para certas bicamadas de lipídeos, uma modificação no estado físico, chamada de pré-transição, ocorre de 5 a 15oC abaixo da Tm. Estas pré-transições envolvem inclinação das cadeias hidrocarbonadas.
• Geralmente a fase de transição está relacionada com uma modificação de volume.
• A transição de fase da bicamada é muito sensível à presença de solutos que interagem com os lipídeos, tais como cátions divalentes, substâncias lipossolúveis, peptídeos e proteínas.
LipossomaLipossomaLipossomaLipossoma
InternalizaçãoInternalizaçãoInternalizaçãoInternalização de de de de lipossomaslipossomaslipossomaslipossomas por por por por célulascélulascélulascélulas
LIPOSSOMAS
• DEFINIÇÃO
São vesículas aquosas, de diâmetro entre 0,1 e 0,5 µm, contituídas de uma ou mais membranas fosfolipídicas de origem natural. O princípio ativo pode estar encapsulado na fase aquosa (hidrofílico) ou ser retido pela membrana (lipofílico).
GLICEROFOSFOLIPÍDEOS• FOSFOLIPÍDEOS
Principais constituintes das membranas biológicas
– Ácido fosfatídico
– Fosfatidilcolina (lecitina)
– Fosfatidiletanolamina
– Fosfatidilglicerol
– Difosfatidilglicerol (cardiolipina)
– Fosfatidilserina
– Fosfatidilinositol
COMPOSIÇÃO DOS LIPOSSOMAS• Lipídeos Características
Fosfatidilcolina de ovo constituinte principal e o mais utilizadoDiestearilfosfatidilcolina menos permeável à fase aquosaDipalmitoilfosfatidilcolina fosfolipídeo sintético totalmente
saturadoFosfatidiletanolamina utilizado em imunolipossomasLisofosfatidilcolina aumenta a permeabilidade lipossomal
pode aumentar a fusão lipossoma-célulaColesterol reduz a permeabilidade dos lipossomas
Incorporação máxima: 50 mol% com relaçãoaos fosfolipídeos totais
Estearilamina confere carga positiva aos lipossomasDicetilfosfato confere carga negativa aos lipossomasÁcido fosfatídico confere carga negativa aos lipossomasEsfinomielina utilizado em imunolipossomasCardiolipídeos lipídeos antigênicos utilizados em
imunolipossomos
VANTAGENS
• São biodegradáveis
• Não possuem antigenicidade
• Protegem as drogas contra a ação enzimática
• Reduz a toxicidade das drogas
• Podem ser direcionados ao local de ação pela
adição de sinais moleculares, anticorpos
monoclonais, hormônios ou glicolipídeos
Classificação�
SUV LUV MLV20-100 nm > 100 nm > 0,5µm0,5 a 1,0 5 a 15 35 a 65
Vesículas multilamelares: MLV (Multilamellar Vesicles)Vesículas pequenas unilamelares: SUV (Small Unilamellar Vesicles)Vesículas grandes unilamelares: LUV (Large Unilamellar Vesicles)
MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Métodos mecânicos de Dispersão de fosfolipídeos
– Hidratação de filme lipídico
– Homogeneização por ultra-som
– Homogeneização por extrusão
– Microfluidificação
– Dispersão de lipossomas liofilizados
– Dispersão de lipossomas congelados
MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Métodos mecãnicos de Dispersão de solução
orgânica de fosfolipídeos
– Evaporação em fase reversa
– Injeção em solução etanólica
– Infusão em éter
• Dispersão de micelas mistas
– Eliminação de detergente
Metodologia
Filme lipídico
MLV’s SUV’s
Preparação de Lipossomas
LipidsSolvent
evaporation
Aqueous phase + α-glu-SO4
Ultrasound
Liposomes
LipidsSolvent
evaporation
Aqueous phase + α-glu-SO4
Ultrasound
Liposomes
Metodologia
Fosfatidilcolina de soja - Epikuron 200ColesterolEstearilamina(Acido Úsnico)
Hidratação com Tampão Fosfato pH 7,4Filme lipídico
Sonicação
MLV’s SUV’sLipossomas
BrancoLipossomasÁc.Usnico
CHCl3 : MeOH
Preparação de Lipossomas
www.avantilipids.com/ PreparationOfLiposomes2B
CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Métodos de Conservação
–Atmosfera de nitrogênio ou argônio
–Temperatura 4°C
–Abrigo da luz
–Liofilização
CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Alterações morfológicas e físico-
químicas
–Oxidação e hidrólise de fosfolipídeos
– Interações do tipo Van der Waals
• Agregação
• Presença de cargas negativas ou positivas
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Obtenção de uma preparação homogênea
• Determinação do tamanho das vesículas
• Taxa de encapsulação
• Estabilidade físico-química
• Cinética de liberação in vitro
• Estabilidade em fluidos biológicos
• Interação com células
• Biodisponibilidade
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Estabilidade Físico-química
– Aspecto macroscópico
– Aspecto microscópico
– Diâmetro das partículas
– Viscosidade
– Condutividade
– pH
– Potencial de superfície (zeta)
– Temperatura de conservação
– Doseamento do fármaco
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Estabilidade Físico-química
– Aspecto macroscópico
• Observação visual
– Cor
– Cremagem
– Exsudato
– Precipitado
– Separação de fase
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Estabilidade Físico-química
– Aspecto microscópico
• Microscopia ótica (LUV, MLV)
• Microscopia Eletrônica
– Varredura (observação tridimensional da vesícula)
– Transmissão (observação de MLV)
– Força atômica (caracterização da superfície)
Lipossomas
LipossomasÁcido Usnico
Aspecto microscópico de lipossomas contendo ácido úsnico: Partículas uniformes bem distribuídas com tamanho de aproximadamente 130 nm.
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Determinação do tamanho das vesículas
–Contador de partículas Nanosizer
• Espectroscopia de auto-correlação de fótons
• Espalhamento da luz (light scattering)
• Determinação do potencial de superfície
Potencial zeta ξξξξ (carga)
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Taxa de encapsulação• Doseamento do fármaco
• Porcentagem de encapsulação
• Massa de substância encapsulada por
unidade de massa de lipídeo
Metodologia
Taxa de encapsulação de fármacos em lipossomas
• Determinação indireta
A percentagem de incorporação de fármacos em lipossomas pode ser quantificada por HPLC, após separação do fármaco encapsulado do não encapsulado, através de uma ultrafiltração-centrifugação utilizando unidades filtrantesultrafree® (Millipore).
CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Influência de diferentes fatores sobre a
taxa de encapsulação
– Características do fármaco
– Métodos deficientes de separação e marcação
• Substâncias hidrossolúveis
• Substâncias lipossolúveis e anfifílicas
• Caso particular de proteínas
• DNA
ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS
• Estabilidade Físico-química
–Acelerada
• Centrifugação
• Ciclos de congelamento-descongelamento (8
h a -18°C e 16 h a 25°C)
• Agitação mecânica (150 evoluções/min)
– Movimento horizontal
ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS
• Estabilidade Físico-química
– A longo prazo
Medida de parâmetros físico-químicos em intervalos
de tempo regulares (1, 15, 30, 60, 180, 360, etc dias)
• Tamanho das vesículas
• Doseamento do fármaco
• Viscosidade
• Condutividade
• pH
• Avaliação dos aspectos macroscópico e microscópico
Metodologia
Avaliação da cinética de liberação in vitro
DiretaIndireta
DiáliseDiálise inversa
Meio doadorLipossomas
Meio receptorTampão
LipossomasAvaliação da atividade em células
Teste de citotoxicidadeem células NCIH-292
Teste de citotoxicidadeem células HEp-2
0
20
40
60
80
100
2.5 5 10 20
Concentration µg/ml
% c
ell
via
bili
ty
UA Free Lip Cont Lipos AU
0
20
40
60
80
100
2.5 5 10 20
Concentration µg/ml
% c
ell
via
bili
ty
UA Free Lip Cont Lipos AU
Citotoxicidade de lipossomas contendo ácido úsnico
VIAS de ADMINISTRAÇÃO DE LIPOSSOMAS
• Parenteral (i.v.; i.m.; s.c.;i.c.)
• Cutânea
• Oftálmica
• Nasal
• Pulmonar
NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA
• Lipossomas (Injetáveis)
– Terapia do Câncer• resistência multi-droga• Cardiotoxicidade
– Doenças Infecciosas
– Terapia Gênica
• Lipossomas (Tópicos)– Farmacêuticos– Cosméticos
APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DE LIPOSSOMAS
• Antibioticoterapia• Insuficiência respiratória neonatal (surfactante pulmonar)
• Enzimas
• Hormônioterapia
• Produtos de contraste
• Produtos radiofarmacêuticos
• DNA
• Vacinas
PRODUTOS LIPOSSOMAIS
Produto Fármaco Companhia Status
Câncer
DaunoXome® Daunorubicina NeXstar Aprovado Europa, US
Doxil® Doxorubicina Sequus (Alza) Aprovado Europo, US
Evacet® Doxorubicina Liposome Co. Fase III
Annamycin Anamicin Aronex Fase I/II
Cisplatin Cisplatin Aronex Fase II
Atragen® Tretinoina Aronex Fase I/II
Edelfosine Edelfosina Liposome Co. Fase I
Infecções
AmBisome® Amphotericin B NeXstar Aprovado Europa, US
Nyotran® Nistatina Aronex Fase III
MiKasome® Amikacina NeXstar Fase II/III
APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS
• Cosmetologia
–Vitaminas hidro e lipossolúveis
– Agentes hidratantes
– Elastina
–Colágeno
– Ácido hialurônico
APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS
• Cosmetologia
– Anti-radicais livres
– Antioxidantes
– Agentes rejuvenecedores
(remoção de colesterol)
APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS
• Farmácia de Manipulação
– Incorporação de lipossomas pré-fabricados em
• Cremes
• Protetores solares
• Gel
• Gel creme
• Xampu
CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS CONTENDO
LIPOSSOMAS
• Observação macroscópica
– observar a preservação das características iniciais do
produto e detectar sinais de instabilidade
• Observação microscópica
– detectar a presença dos lipossomas na preparação
• Determinação do ativo