Unidad Educativa Hontanar

Año Lectivo 2015 - 2016

Laboratorio de Biología N # 3

Nombre: Ana Paula Flores, María Paz Aguinaga, Andrea Germán, Antonio Robalino y Daniela Mancheno.

Curso: Segundo Bachillerato “A”Fecha de práctica: 29/10/15 Fecha de entrega: 12/11/15Grupo # 4

TEMA: Tinción de Gram

OBJETIVOS:1. Utilizar adecuadamente las técnicas básicas de identificación de microorganismos.2. Determinar los pasos para realizar la tinción de Gram3. Usar adecuadamente los colorantes 

FUNDAMENTO TEÓRICO: Investiga y explica1. ¿Qué es una tinción diferenciada? Dos ejemplos.

O coloración Diferencial son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera más explícita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales (combinación de colorantes, mordentes y decolorantes), que se componen de más de una sustancia tintórea. Las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de Gram y la tinción ácido-resistente, también está la Tinción de Ziehl-Neelsen. Estas se utilizan para obtener información acerca de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas. De este modo, se pueden distinguir microorganismos que aun cuando tengan igual morfología, presenten diferencias en su composición química. Pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre partes de una misma célula.

2. ¿En qué consiste el proceso de fijación de una placa? ¿Cómo se fija una muestra utilizando metanol?

Fijación es toda manipulación sobre un ser vivo, o bien sobre parte de él, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible, de tal forma que sus componentes celulares mantengan las mismas características que cuando dicho ser o tejido estaban vivos. Por otra parte, un fijador prepara también de alguna forma el tejido o la célula para la posterior manipulación, bien en el proceso de inclusión, actuando como mordiente o como fijador del colorante dependiendo de su naturaleza. Mecanismo que consiste en matar a la célula lo más rápidamente posible para permitir que se mantengan las propiedades fisiológicas y morfológicas del organismo vivo. Los fijadores solidifican el coloide protoplasmático mediante coagulación o precipitación, convirtiéndolo en un gel insoluble. La fijación evita que el tejido se pudra u se desintegre, produciendo puentes entre proteínas y diferentes materiales de los tejidos.

Una forma de fijar la muestra es con calor, el cual fijará las bacterias al portaobjetos de forma que no se enjuaguen tan fácilmente durante la tinción, se debe pasar por el portaobjetos dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen.

Alternativamente, la muestra puede fijarse con metanol, agregando 1 o 2 gotas sobre la mancha seca, drenando el exceso de metanol y dejando que se seque con el aire. Este método minimiza el daño a las células huésped, dándoles un fondo más limpio.

La muestra que va a ser fijada no debe tener menos de tres milímetros de espesor, porque, de lo contrario, el fijador, que penetra por difusión, no actuaria por igual en todas las células de la muestra. Además, el líquido fijador debe exceder en 50:1 al de la muestra. Hay que tener en cuenta que los líquidos fijadores son

volátiles. Existe un tiempo adecuado de fijación, que no debe excederse, una vez concluido, se lava la muestra para quitar el exceso de fijador. Además de mantener las propiedades del objeto de estudio, los fijadores, dependiendo de los casos, pueden servir para endurecerlos o ablandarlos, o aumentar su afinidad tintorial.

Los fijadores se pueden clasificar en dos grupos: fijadores físicos y fijadores químicos.

Fijadores físicos.-

El calor: Es el más antiguo y más utilizado de estos fijadores. Tanto en microbiología, como en el frotis de células animales, la fijación se hace a la llama, con lo que se obtiene una coagulación rápida de las proteínas y por tanto su estabilización.

El frío: congelación, fija pero sobre todo es un agente conservador.

La criodesecación (liofilización): Se trata de congelar a una temperatura inferior a -50ºC y eliminar el agua a una presión baja.

Fijadores químicos.-

La fijación se hace en recipientes con la muestra y el fijador poniendo cantidades muy superiores de fijador frente al volumen de la muestra y se deja un tiempo de infiltración. Este proceso debe realizarse lo más pronto que se pueda después de la recolección de material.

Metanol: La fijación con solventes orgánicos permeabiliza las membranas por lo que en este caso no será necesario un paso de permeabilización posterior.

3. ¿Qué es un mordiente en una tinción?

Los Mordientes, como el Lugol, son sustancias que aumentan la afinidad de la célula por el colorante. Suelen añadirse después del colorante en determinadas tinciones diferenciales. Aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas técnicas de tinción. También se pueden utilizar para producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no podrían ser visualizados de otra forma. Son los reactivos o sustancias que preparan al tejido para la coloración, comunicándole las apetencias colorantes.

4. ¿Por qué la edad de cultivo puede influir en la tinción Gram?

La tinción de Gram influye en los cultivos viejos, que estén muertos o tengan problemas en la pared celular. Cuando está más compleja se vuelve más permeable a lo que entran tintes y reacciona el Gram negativo, pero uno falso. Cultivos de más de 24 horas de teñidos pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo.

La reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias grampositivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas). Al hacerte está más vieja se vuelve más permeable a la entrada de tintes y reacciona como Gram negativo. Es decir obtienes un falso Gram negativo.

5. Explica que hace (función desempeñada) cada reactivo en la tinción Gram I. Cristal violeta: colorante básico catiónico que penetra en todas las células bacterianas, tanto Gram

positivas como Gram negativas, a través de la pared bacteriana. En una solución acuosa, el cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro (Cl-). Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de ambas células. El ion CV+ interactúa con los componentes con carga negativa de las células bacterianas para mancharlas de violeta. Tiñe a células de morado.

II. Lugol: es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta. El yodo, en la forma de iones con carga negativa, interactúa con los iones CV+ para formar grandes compuestos de cristal violeta y yodo dentro de las capas interiores y exteriores de la célula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la célula, en el lugar en el que la haya teñido. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del colorante primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.

Alcohol-acetona: sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen. Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble función:vdeshidratante de proteínas y solvente de lípidos.

III. Safranina: Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Se usa un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un contraste adicional entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiñendo las bacterias decoloradas (Gram negativas) de rosado o rojo.

Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina). MATERIALES Y REACTIVOS

1. Palillos2. Portaobjetos3. Goteros4. Frasco lavador.5. Microscopio6. Lámpara de alcohol.

PROCEDIMIENTO:1. Primero realizamos un raspado de nuestra mejilla con un palillo, colocamos el portaobjetos haciendo

un círculo central con la nuestra.2. Después proseguimos a fijar la muestra al calor utilizando la lámpara de alcohol, pasamos por la

flama 3 veces y el portaobjetos. 3. Agregamos gotas de cristal violeta hasta cubrir la muestra y dejar que actué el colorante por 1 min. 4. Lavamos nuestra muestra con el frasco lavador. 5. Agregamos gotas de Lugol hasta cubrir la muestra y dejamos que actué por 1 min. 6. Lavamos la muestra de nuevo. 7. Agregamos gotas de alcohol acetona y dejamos que actué por 20 segundos. 8. Agregamos gotas de Safranina por 1 min.9. Volvemos a lavar nuestro portaobjetos. 10.Secamos con cuidado y procedemos a observar con el microscopio poniendo previamente el aceite

de inmersión 11.Podemos observar la diferencia de bacilos, cocos, racimos.

RESULTADOS:

Paso del procesoReacción y coloración de las bacterias

GRAM positivas GRAM negativas

Solución de cristal VioletaSe deja actuar 1 minuto

Células color violeta Células color violeta

7. Cristal violeta.8. Lugol9. Alcohol acetona.10. Safranina11. Aceite de inmersión.

Solución LugolSe deja actuar 1 a 2 minutos

Formación del complejo yodo- cristal violeta en el interior de las células. Las células permanecen violetas.

Formación del complejo yodo- cristal violeta en el interior de las células. Las células permanecen violetas.

Solución de alcohol acetonaSe deja actuar 20 segundos

El complejo yodo – cristal violeta no sale de las células, las que conservan el color violeta.

El complejo yodo – cristal violeta no sale de las células, las que pierden el color y no pueden observarse.

Solución de safraninaSe deja actuar 1 a 2 minutos

Las células conservan el color violeta.

Las células decoloradas se tiñen de rojo

Lavar, secar y observar al microscopio.

Al realizar la prueba se pudo ver que existe en la saliva de Andrea German células Gram positivas ya que se observó que la muestra se tiño de morado, la saliva tiene bacterias.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Por esto las células se tiñen con safranina y las observamos rojas. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violeta.

Las gram positivas retienen la tinción azul y conservan el complejo yodocolorante. Las gram negativas quedan decoloradas y pierden el complejo yodocolorante y pueden ser anaeróbicos y aerobicos.

Las bacterias Gram negativas pierden el colorante básico cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipídico de la pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la pérdida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razón por la cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio.

El alcohol disuelve los lípidos de la parte externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta manera, el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina más fina de las bacterias Gramnegativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.

Safranina. Se utiliza para teñir de rojo las células previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas. La tinción bacteriana tiene dos propósitos fundamentales:

a) Identificar la bacteria (Gram positiva o Gran negativa).b) Con base en la identificación, indicar el tratamiento correcto (los antibióticos no funcionan por igual

para bacterias Gram positivas que Gram negativas). La tinción de GRAM aporta: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células

bacterianas. Realizar esta práctica nos permitió ver las formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana

en una tinción GRAM:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamaño

forma esférica: se llama Coco

División a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas División a lo

largo de 2 planos diferentes: Tétradas

División a lo largo de 3 planos

2 cocos juntos: Diplococos

4 - 20 en cadenas: Estreptococos

regularmente: Sarcinas

irregularmente: Estafilococos

Bacilos: Grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos: observados en el microscopio:

Racimos

Tetradas:

Bacilos Gram-positivos

Gruesos:

Cadenas: forma típica de Streptococcus

Ramificados:

Finos

Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células en el paso de decoloración, está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son incoloras.

CONCLUSIONES: Se recomienda seguir el procedimiento minuciosamente, pues si no se realiza con cuidado se corre el

riesgo de no obtener ningún resultado. En conclusión en este laboratorio se pudo observar la función de diferentes reactivos utilizados en

laboratorio, ampliando nuestro conocimiento. Cada reactivo tiene un papel fundamental: el cristal violeta (colorante básico), lugol (mordiente), alcohol cetona (decolorante) y safranina (colorante de contraste) los cuales nos permitirán ver si las células son Gram positivas o negativas.

Los resultados sobre un estudio de Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnóstico y buen tratamiento de la patología relacionada microorganismos es necesario saber cómo influyen en las manifestaciones clínicas las diferencias existentes entre la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en su detección y en el tratamiento.

En conclusión pudimos notar la importancia de la tinción para la microbiología debido a que: 1) Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos. 2) Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana. Ambas son fundamentales para el desarrollo de la microbiología y en si del ser humano.

La tinción de Gram se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. Se utiliza principalmente en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas.

Realizando esta prueba se logró ver estructuras de las células como son bacilos, cocos y racimos, se pudo comparar y contrastar estas.

Es fundamental para la realización de todo esto el dominio del microscopio para enfocar en 100x, además ser cuidadosos con el proceso de aplicación de reactivos ya que si no se cumple con los tiempos no lograremos una buena fijación, adicionalmente se debe tener un previo conocimiento de bacilos, cocos y racimos para lograr identificar en la muestra.

GRÁFICOS:

Bibliografía Karp G (2011). Biología Celular y Molecular, Conceptos y Experimentos. 6a. Edición. Editorial

McGraw-Hill interamericana Editores, S.A de C.V., México D.F., México. Lodish, H., Damell, J., Baltimore, D., Lawrence, Z.S., Berk, A., Matsudaria, P. (2006). Biología Celular

y Molecular. Editorial Médica Panamericana Donnersberge, A. Lesack, Laboratorio de Anatomía y Fisiología. Editorial Paidotribu http://inter-micro-uvm.over-blog.es/article-33657401.html http://tlaboratorio.blogspot.com/2009/10/coloracion-diferencial-o-tincion.html http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practico4.pdf http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm http://www.ecured.cu/index.php/Reactivos_mordientes http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-BIO-231-P-071/BIO-

231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm