PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS, TINCIONES Y MORFOLOGIA MICROSCOPICA DE COLONIAS

BIOCHEMICAL TESTS FOR IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS, MICROSCOPIC STAINS AND COLONY MORPHOLOGY

Alejandro Patarroyo1

Jennifer Aroca2, Jeison Cuitiva2, Natalia Diaz2, Lizeth Gutierrez2, Sergio Valencia2.

Ficha: 662078

Química Aplicada a la Industria

RESUMEN

En la práctica de laboratorio pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismo, tinción y morfología microscópica de colonias, se realizo en primer lugar una tinción Gram con cristal violeta para reconocer entre la Escherichia coli y Staphylococcus aureus, la cual se encontró Gram negativa escherichia coli y Gram positiva Staphylococcus aureus.

Después de esto se realizaron unas pruebas bioquímicas en diferentes tipos de medios de cultivo, TSI (agar de hierro triple azucarado), LIA (agar de hierro y lisina), prueba de citrato, y Prueba de Voges Proskauer; en los cuales las pruebas TSI, LIA, y citrato, dieron positivo; en e l caldo al realizarle la prueba con rojo de metileno dio positiva ya que se torno de color rojo

PALABRAS CLAVES

Pruebas Bioquímicas Identificación Microorganismos Tinción Morfología Colonias Tinción Gram Cristal violeta Escherichia coli Staphylococcus aureus Gram positiva Gram negativa TSI LIA Citrato Caldo (Prueba Voges Proskauer) Rojo de metilo Peróxido

ABSTRACT

In biochemical lab for identification of microorganism, staining and morphology microscopic colony, I was done in first spot Gram staining with crystal violet to recognize between Escherichia coli and Staphylococcus aureus, which was found Gram negative Escherichia coli and Gram positive Staphylococcus aureus.

After this were performed a biochemical tests on different types of culture media, TSI (triple sugar iron Agar), LIA (lysine iron agar), citrate test and Voges Proskauer test; in which the tests TSI, LIA, and citrate were positive; in the broth performed to this test with methyl red gave positive since red is around.

KEY WORDS

Testing Biochemical Identification Microorganisms Staining Morphology Colonies Gram stain Crystal Violet Escherichia coli Staphylococcus aureus Gram Positive Gram negative Citrate Broth ( Voges Proskauer test ) Methyl red Peroxide

INTRODUCCION

La tinción Gram fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884, a pesar del tiempo transcurrido la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana (Acevedo Barrios, R.L.; Severiche Sierra, C.A. Castillo Bertel, M.E. 2013). Desde entonces las tinciones Gram son muy utilizadas en el laboratorio para la identificación temprana y definitiva del microorganismo, además de que nos da la forma que tiene, su agrupación y el grupo taxonómico al que pertenece.

Desde el siglo XIX se comenzó a direccionar una buena parte de la biología y la química a la creación de una nueva disciplina integradora: la química fisiológica o la bioquímica. Pero la aplicación de la bioquímica y su conocimiento, probablemente comenzó hace 5000 años con la producción de pan usando levaduras en un proceso conocido como fermentación. A partir de esta nueva rama se investigaron y sacaron nuevas pruebas para la identificación de las bacterias como lo son las pruebas bioquímica, tales como el Citrato, TSI, LIA, y Caldo (Voges Proskauer).

METODOLOGIA

PARA LA TINCIÓN DIFERENCIAL (TINCIÓN GRAM).

1. Preparación del frotis

En un portaobjetos previamente desengrasado y limpio se colocaron unas gotas de agua esterilizada, después con el asa esterilizada se tomo una pequeña muestra del crecimiento bacteriano (para esta lamina se utilizo la bacteria Escherichia coli proveniente del agar de los tubos inclinados, se coloco sobre la gota de agua y con ayuda del asa se distribuyo en la superficie tratando de que la muestra estuvieran bien dispersa y no acumulada para lograr una mejor visualización en el microscopio. Se procedió a dejar secar en el aire y luego pasando la lamina rápidamente por la flama del mechero se fijo la muestra a la lamina (se llevo a cabo este procedimiento 5 veces).

Previamente se procedió a hacer lo mismo con otra lamina porta objetos con la diferencia que se manejo la bacteria Staphylococcus aureus.

2. Tinción:

Se tomo las laminas portaobjetos fijadas con las dos diferentes bacterias y se colocaron en un puente de coloración (fig. 1), se le echo el cristal violeta y se dejo actuar por un minuto; después se escurrió la muestra y se lavo con agua del grifo, se cubrió con solución de lugol y se dejo quieto por un minutos, después de este se escurrió el exceso e inclinando el portaobjetos se le agrego alcohol acetona (fig. 2) y se dejo escurrir hasta que no se vio se gregación del cristal violeta. Al termino de lo anterior se lavo con agua de la llave y se coloco safranina y se dejo actuar por 15 segundos; se volvió a lavar con del grifo, previamente bien escurrido y dejándolo secar al aire se procedió a la observación en el microscopio.

Fig.1

Cuando se llevo a cabo la observación en el microscopio se observo primero con un objetivo de 10x y otro de 40x y luego se observo con objetivo de inmersión (objetivo 100x).

fig 2

PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACION

Se distribuyeron las diferentes pruebas en la gradilla del siguiente orden (fig. 3): Citrato (Simmons Citrato Agar), TSI (agar de hierro triple azucarado), LIA (agar de hierro y lisina) y el caldo (Prueba de Voges Proskauer).

Fig. 3

Esterilizando el asa circular y la boquilla del tuno inclinado que tenía el crecimiento bacteriano de la escherichia coli, se procedió (con el asa) a tomar una muestra de este, luego se volvió a esterilizar la boquilla del tubo inclinado y se cerro, se abrió el tubo de la prueba de citrato se esterilizo la boquilla y se estrió el pico de flauta con el asa, se volvió a esterilizar la boquilla y el asa y se cerró el tubo.

En las pruebas TSI y LIA se procedió de la misma forma: Se esterilizo el asa recta, se abrió el tubo con el crecimiento bacteriano con la que anteriormente se había procedido, se esterilizo la boquilla y se punciono desde la mitad hacia el fondo del tubo.

Se esterilizo la boquilla del tuno del crecimiento y se cerro, se abrió el tubo con las pruebas TSI/LIA se esterilizo la boquilla y se punciono con el asa recta de la misma manera con la cepa; se esterilizo la boquilla y se cerró.

Y finalmente con el caldo; tomamos el asa circula la esterilizamos, con esta sacamos una muestra del crecimiento procediendo de la misma manera como en los casos anteriores (se estrió), y con el tubo que tenía el caldo se abrió, se esterilizo la oquilla se introdujo el asa y se inoculo el caldo; para cerrar el tubo se procedo primero a esterilizar la boquilla.

RESULTADOS

TINCION GRAM

PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBA BIOQUIMICA ECHERICHIA COLI STAPHILOCOCUS AUREUS

CITRATO POSITIVO NEGATIVOTSI POSITIVA POSITIVALIA POSITIVA POSITIVA

VOGES PROSKAUER POSITIVO NEGATIVOROJO DE METILO POSITIVA POSITIVA

PEROXIDO NEGATIVO NEGATIVO

Esquema:

.

Gram PositivaStaphylococcus AureusSu agrupacion es diplobacilos.

.

Gram NegativaEscherichia ColiSu agrupacion es micrococo

BACTERIA GRAM POSITIVA (MORADO)

GRAM NEGATIVA (ROJO)

Escherichia Coli xStaphylococcus Aureus x

ANALISIS Y DISCUSIÓN

En el laboratorio microbiología la identificación de bacterias es muy importante, sobre todo en el sector de la salud. Hay muchas pruebas que sirven para la identificación de las bacterias como lo son las tinciones diferenciales y las pruebas bioquímicas

La tinción Gram es una gran forma de identificar a los microorganismos y determinar su grupo taxonómico. Cuando una bacteria retiene el colorante –cristal violeta- después de haberlolavado con agua y tratado con lugol y safrina son llamadas Gram positivas, pero, por lo contrario la bacteria no retiene el colorante después del debido proceso como se realiza la tinción y se identifica un color rojo, son llamadas

Gram negativas. Esto sucede ya que las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano (además del acido teicoico), la cual retiene el colorante apezar dehaberlas tratado con el lugol y la safrina.. Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior por medio de lipoproteínas (Fig. 8). ES por ello que las bacterias Gram negativa se tiñen de manera diferente ya que estas no retienen el color morado del cristal violeta sino que se les observa un color rojo gracias a la safrina que se le aplico (Garcia, V. 2004). El peptidoglucano, ya que es el material que da la rigidez a la pared celular de las bacterias, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas se observan diferentes tinciones en cada una.

Fig. 8 Paredes celulares de bacterias Gram positiva y Gram negativas

Por ello encontramos que las bacterias Escherichia coli contienen el peptidoglucano contiene una rigidez menor que a las bacterias Staphylococcus Aureus; en copnsecuencia de esto enconteramos Gram

negativas a las bacterias Escherichia Coli y Gram negativas a las bacteria Staphylococcus Aureus.

Las pruebas bioquímicas son otros métodos para la identificación de bacterias con los procesos metabólicos que utilizan; en

general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva específica o sustrato y después de la incubación del cultivo se examina para ver los cambios químicos que hayan ocurrido.

En nuestra practica de laboratorio utilizamos 4 pruebas diferentes, las cuales fueron: citrato, TSI (agar de hierro triple azucarado), LIA (agar de hierro y lisina), Caldo (Voges Proskauer). Las cuales, con la bacteria Escherichia Coli; las pruebas citrato, TSI, LIA nos dieron positivo al examinarlas ya que nos demostraban crecimiento a lo largo del lugar donde se estrio o punso la muestra de cultivo (fig 4, fig 5, fig 6). El resultado del caldo nos dio positivo con rojo de metilo (fig. 7)

Fig. 4 Prueba de Citrato

Fig. 5 Prueba TSI

Fig. 6 Prueba LIA

Fig. 7 Prueba Voges Proskauer

Con la bacteria Staphylococcus Aureus se notaron diferentes resultados ya que con el citrato la prueba V.-P. a diferencia de la bacteria Escherichia Coli. Esto se debe a las diferentes enzimas que posee cada bacteria y como estas ayudan a sus diferentes procesos de metabolización, en consecuencia de esto se noto que la bacteria Staphylococcus Aureus no pudo tomar como única fuente de energía el carbono de la prueba de citrato (MacFaddin, J. 2003).

CONCLUSIONES

Se logro determinar las taxonomia de las bacterias Escheeichia Coli (Gram negativa) y Staphylococcus Aureus (Gram positivo) las cuales se determino con la tincion Gram (tincion diferencial).

En las Pruebas bioquimicas se identificaron los diferentes enzimas y procesos metabólicos de las bacterias Escheeichia Coli y Staphylococcus Aureus las cuales se diferenciaron en la prueba dle caldo (Voges Proskauer) y citrato.

BIBLIOGRAFIA

Garcia, V. (2004). Introducción a la microbiologi. Costa Rica: EUNEDPaís. Pag 47

Acevedo Barrios, R.L.; Severiche Sierra, C.A. Castillo Bertel, M.E. (2013). Biología y Microbiología Ambiental. Prácticas de Laboratorio. EUMED.NED, España 2013. Pag. 23

MacFaddin, J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínic. Ed. Médica Panamericana