tincion roja neutro
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“Utilización de la técnica de tinción de Rojo Neutro para la categorización de la
condición de vivo-moribundo-muerto de Caligus rogercresseyi (Boxshall & Bravo, 2000)
(Copépoda: Caligidae) en bioensayos de sensibilidad a los antiparasitarios.”
Tesis para optar al título de Ingeniero en Acuicultura.
Profesor Patrocinante: MSc. Sandra Marín.
Pedro Barría Recabarren.
PUERTO MONTT, ABRIL, 2012
2
Agradecimientos.
A mi profesor patrocinante MSc. Sandra Marín por todo su apoyo durante el
desarrollo de la tesis y el trabajo en conjunto desarrollado en el laboratorio de
Interacciones Ecológicas. A mis profesores informantes Dr. José Luis Iriarte y Dra.
Sandra Madariaga por su gran disposición y ayuda. A la colaboración de Nitza Vera en
muchas de las actividades relacionadas con este ensayo.
A las empresas que participan junto al laboratorio en investigaciones privadas, por
su constante búsqueda de soluciones a la industria y fomentar la realización de esta
tesis por tratar de entregar mejores respuestas a sus requerimientos.
A mi familia, en especial a mis Padres por darme la oportunidad y las fuerzas para
poder salir adelante con este desafío. A mi polola Roxana Muñoz, por su constante
apoyo y guía en las distintas etapas en la Universidad
Finalmente agradezco al Instituto de Acuicultura, a la Escuela de Ingeniería en
Acuicultura y a la Universidad Austral de Chile por su apoyo en distintas áreas del
desarrollo de esta tesis.
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Índice.
1 Resumen. ..............................................................................................................................................4
1.1 Resumen Español. ......................................................................................................................4
1.2 Resumen Ingles. ..........................................................................................................................7
2 Introducción. .........................................................................................................................................9
3 Hipótesis. ........................................................................................................................................... 17
4 Objetivos. ........................................................................................................................................... 18
4.1 Objetivo general. ....................................................................................................................... 18
4.2 Objetivos específicos. .............................................................................................................. 18
5 Materiales y Métodos. ...................................................................................................................... 19
5.1 Colección de hembras ovígeras. ............................................................................................ 19
5.2 Cultivo. ....................................................................................................................................... 20
5.3 Infestación Experimental. ........................................................................................................ 21
5.4 Bioensayos. ............................................................................................................................... 22
5.5 Lectura del bioensayo. ............................................................................................................. 22
5.5.1 Lectura usando el método de la tinción Rojo Neutro. ................................................. 23
5.6 Método del Rojo Neutro. .......................................................................................................... 24
5.6.1 Control muerto. ................................................................................................................. 25
5.6.2 Análisis estadístico. .......................................................................................................... 25
6 Resultados. ........................................................................................................................................ 27
6.1 Método de Tinción con Rojo Neutro. ..................................................................................... 27
6.2 Prueba de tinción: Rojo Neutro. ............................................................................................. 28
6.3 Comparación de la clasificación entre las distintas técnicas. ............................................ 29
7 Discusión. .......................................................................................................................................... 31
8 Conclusión. ........................................................................................................................................ 37
9 Referencias. ...................................................................................................................................... 38
10 Figuras. .......................................................................................................................................... 43
11 Tablas. ............................................................................................................................................ 56
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1 Resumen.
1.1 Resumen Español.
El monitoreo de la sensibilidad de Caligus rogercresseyi a los antiparasitarios
constituye una herramienta que permite detectar el posible desarrollo de resistencia a
los antiparasitarios. Los parámetros utilizados para monitorear sensibilidad son la
concentración que afecta y que mata al 50% de los individuos de la muestra (EC50 y
LC50, respectivamente). En el caso del EC50 se considera afectados a los individuos
muertos y moribundos, sin embargo la distinción de la condición de moribundo no es
sencilla y depende de la experiencia del observador. Esta condición puede influir
significativamente sobre los valores estimados de los parámetros de sensibilidad,
especialmente para el EC50. El objetivo de este estudio fue comparar la clasificación de
la condición de los parásitos (categoría vivo, moribundo y muerto) obtenida bajo
distintas técnicas en términos del porcentaje de individuos clasificado en cada
categoría. Las técnicas que se utilizaron fueron observación ojo desnudo, observación
bajo microscopio estereoscópico y aplicación de la tinción de rojo neutro. El rojo neutro
es un tinte vital que actúa tiñendo solamente los parásitos vivos y en menor intensidad
los moribundos, logrando diferenciarlos de los muertos. El primer experimento consistió
en comparar las lecturas del bioensayo realizadas por dos observadores sin ayuda de
un microscopio y la lectura obtenida después de la aplicación del rojo neutro. En el
segundo experimento se comparó las lecturas del bioensayo obtenidas por un
observador sin ayuda de un microscopio, un observador mirando bajo microscopio
estereoscópico y después de la aplicación del rojo neutro. Los resultados del primer
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experimento indican que no existen diferencias significativas en los porcentajes
asignados por los 2 observadores sin ayuda de un microscopio para ninguna de las
categorías de clasificación de los parásitos, pero si entre cada observador y la lectura
realizada bajo la tinción rojo neutro para las categorías de vivos y moribundos. El patrón
observado sugiere que los observadores clasifican un mayor porcentaje de individuos
como vivos y un menor porcentaje como moribundos que la técnica del rojo neutro. En
el segundo experimento no se detectó diferencias significativas en el porcentaje de
individuos asignados a la categoría de vivos entre el observador sin ayuda de un
microscopio, el observador que utiliza microscopio estereoscópico y el rojo neutro. Para
las categorías de moribundo y muerto los resultados indican que solo existen
diferencias significativas entre las asignaciones del observador sin ayuda de un
microscopio y la tinción. Las asignaciones del observador sin ayuda de un microscopio
y el que usa microscopio estereoscópico no difieren entre sí, ni tampoco las
asignaciones realizadas por el observador con microscopio estereoscópico y con la
tinción del rojo neutro. El patrón observado en este experimento sugiere que la
tendencia es que el observador sin ayuda de un microscopio clasifica un menor
porcentaje de individuos moribundos y uno mayor de muertos. Si se considera que la
tinción del rojo neutro produce la categorización más objetiva de la condición de los
parásitos, los resultados sugieren que las categorizaciones debieran realizarse
utilizando microscopio estereoscópico o rojo neutro. Sin embargo, la categorización de
los parásitos utilizando microscopio estereoscópico no difiere de la realizada por el
observador sin ayuda de un microscopio lo cual sugiere que la categorización de los
parásitos para la estimación de los parámetros de sensibilidad debiera realizarse
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utilizando la técnica del rojo neutro. No obstante, dada la mayor complejidad que
implica la aplicación de la técnica del rojo neutro es necesario validar con un mayor
número de experimentos la categorización de parásitos utilizando microscopio
estereoscópico y la tinción del rojo neutro.
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1.2 Resumen Ingles.
Sensitivity of parasite to chemotherapeutants is measured throough the
concentration that affects and kills the 50% of the exposed individuals (EC50 and LC50,
respectively). Estimates of EC50 include moribund and dead individuals, but
differentiation of moribunds is not simple. This condition may affect significantly the
estimates of EC50 and LC50 parameters. The objectives of this study were to compare
the percentage of live, moribund and dead parasites C. rogercresseyi, classified using 3
techniques, and to discuss the usefulness of a more objective technique on parasite
classification. Two experiments were carried out. The first experiment compared
parasite classification (after being exposed to chemotherapeutants) made by 2 normal
vision observers and that by the neutral red technique. The second experiment
compared classification made by normal vision observer, observer using stereoscopic
microscopic and that made by the neutral red. Results from first experiment showed no
significant differences between normal vision observers, and that normal vision
observers assign a larger percentage of live individuals and a less percentage of
moribund than neutral red technique. Results from second experiments showed no
significant differences among percentage of individual classified as live by the three
techniques. Natural vision observer classified a smaller percentage of moribund and a
larger one of dead individuals than the neutral red. Parasite classification should be
made using neutral red or stereoscopic microscopic techniques. However, since
stereoscopic microscopic technique is no different from the normal vision observer it
would be more precise if sensitivity parameters are estimated using neutral red. This
technique adds complexity to bioassays therefore further validation of parasite
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classification between the stereoscopic microscopic and neutral red technique is
needed.
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2 Introducción.
Desde los inicios de la salmonicultura a principios de los años ’70, una de las
principales preocupaciones ha sido la infestación por el piojo de mar. Así en Noruega,
Chile, Canadá, Escocia e Irlanda, donde el salmón cultivado ha contribuido
crecientemente al desarrollo de las respectivas economías, la enfermedad ha sido una
significativa limitación de la eficiencia productiva (Rozas & Asencio, 2007). Caligus
rogercresseyi (Boxshall & Bravo,2000) es un copépodo ectoparásito que afecta
principalmente a trucha arcoíris y salmón del Atlántico, y en menor intensidad al salmón
coho (González et al., 2000).También se ha reportado en peces nativos no salmónidos
como el róbalo Eleginops maclovinus, el pejerrey Odonthestes regia y el lenguado de
ojo chico Paralichthys microps, siendo así reservorios de esta especie de
parásito(Carvajal et al., 1998). La fijación del estadío infestivo al pez, así como su
alimentación desde mucus, tejido y sangre del pez hospedador, son las responsables
de cualquier enfermedad secundaria que se desarrolle. Es por esto que las pérdidas en
la industria asociadas a este parásito son el resultado de mortalidades directas,
mortalidades debido a infecciones secundarias, fallas omsorregulatorias, crecimiento
reducido, pérdida del valor del pez y costos relacionados a tratamientos (Johnson et al.,
2004).
El ciclo de vida de este parásito fue descrito por González & Carvajal (2003)
quienes reconocieron ocho estados de desarrollo: tres estados planctónicos y cinco
parasíticos. Las etapas planctónicas comprenden dos estados naupliares y un
copepodito, este último correspondiente al estado infestivo. El copepodito se asienta en
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el hospedador sosteniéndose con su par de antenas, y durante la muda se desarrolla el
filamento frontal que le permite fijarse permanentemente al pez. Una vez en el pez el
parásito se desarrolla a través de los estadíos Chalimus I a IV con una muda entre cada
estadío, permaneciendo siempre unido al pez por el filamento frontal. Luego del estadío
Chalimus IV alcanzan el estadío adulto, hembras y machos.
Esta taxa de parásito fue registrado por primera vez en el año 1997 infestando al
salmón del Atlántico (Salmo salar) (Bravo, 2003) y desde ese momento una gran
variedad de medicamentos han sido usados para controlar este parásito. Sin embargo,
el Benzoato de Emamectina (BE) es el que ha sido utilizado por el periodo más largo,
comenzando en el año 1999 y siendo hasta el año 2007 el único medicamento
autorizado en el país (Bravo et al., 2010). Para este parásito, se tiene registro desde el
año 2005 al 2010 respecto a la cantidad (en kg) del principio activo que se ha usado en
la industria salmonicultora, donde los más altos niveles se encuentran para los períodos
2006-2007 con 443 y 595 kg., respectivamente (Figura 1). El BE es un derivado semi-
sintético de un producto químico producido por la bacteria Streptomyces avermitilis, con
propiedades neurotóxicas teniendo gran efectividad en artrópodos previa ingestión de
este producto (Burrige et al., 2010).En el año 2005 los productores observaron una
evidente pérdida de eficacia de C. rogercresseyi a este producto (Bravo et al., 2008),
basado en un incremento en la intensidad de parásitos por pez, de 10 a 34 parásitos
totales/pez para salmón del Atlántico, 5 a 20 parásitos totales/pez para trucha arcoíris y
el más imprevisto de 3 a 29 parásitos totales/pez en salmón coho (Figura 2). Esta
situación estuvo probablemente asociada a la pérdida gradual de eficacia del benzoato
de emamectina, incremento de los volúmenes de producción en zonas con bajas
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velocidades de corrientes y tasas de recambio que favorece la reproducción del
Caligus, y el hecho de que la industria no perseveró lo suficiente para un trabajo
asociativo y coordinado para su control (Rozas & Asencio, 2007). La pérdida de
efectividad del BE fue entonces atribuida al desarrollo de resistencia del parásito debido
a que había sido usado como único medicamento por al menos 7 años. Sin embargo,
de acuerdo a Denholm (2002), la pérdida de efectividad no sólo es el resultado del
desarrollo de resistencia, sino que puede deberse a condiciones adversas en la
aplicación de tratamientos, dosis inapropiadas o al método de aplicación del
medicamento. Sin embargo estas fallas no deben ser descartadas sin realizar una
experimentación rigurosa para interpretar la causa de estas dificultades.
Lamentablemente en Chile no se hicieron pruebas de sensibilidad del parásito previo su
uso masivo, por lo cual no es posible atribuir las fallas en los tratamientos a resistencia
genética de manera directa.
Dada la situación de descontrol de Caligidosis en el año 2007 el Servicio Nacional
de Pesca (SERNAPESCA) propone incluir la Caligidosis como Enfermedad de Alto
Riesgo de la Lista 2 (EAR), al considerarla una enfermedad de importancia presente en
el país que puede ser objeto de programas de vigilancia y control. Con el objetivo de
obtener un diagnóstico acabado de la situación, SERNAPESCA desarrolló el Programa
Sanitario Específico de Vigilancia de Caligidosis (PSEVC), el que consideró el primer
Diagnóstico General por Jaula Anual (DGJA), obteniendo resultados de prevalencia a
nivel de centro de cultivo de 76,7% y una carga media de 13.9, 13.8, y 1.4 parásitos por
pez correspondientes a trucha arcoíris, salmón del Atlántico y salmón coho,
respectivamente. El informe técnico DGJA2010 muestra diferencias significativas en la
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abundancia del parásito en las 3 especies de mayor importancia comercial al comparar
los años 2007 y 2010,siendo en el año 2010 menores las abundancias. Sin embargo, al
comparar las abundancias del parásito entre los años 2009 y 2010 para las dos
especies más susceptibles (salmón del Atlántico y trucha arcoíris) no se detectaron
diferencias significativas. Esto podría estar indicando una estabilización de las cargas
de parásitos en el último período en un nivel más bajo al año 2007. Los valores de
abundancia (parásitos por pez) para este periodo se estimaron entre 2.7 – 4.7 para
trucha arcoíris, 2.3 – 2.8 para salmón del Atlántico y 0.2 – 0.5 para salmón coho,
respectivamente (SERNAPESCA, 2010). El último informe técnico DGJA 2011 reportó
un aumento significativo respecto del año 2010 sobre las cargas parasitarias para
trucha arcoíris y salmón del Atlántico, con 3.7 y 3.1 parásitos totales promedio por pez
respectivamente, valores todavía más bajos a los reportados el año 2007
(SERNAPESCA, 2011). Estas reducciones se han explicado como el resultado de
varias acciones impulsadas por el Estado en el ámbito regulatorio (SERNAPESCA) y
desde el ámbito privado. Particularmente el Estado implementó varias acciones , entre
ellas, autorizó el uso de varios medicamentos en el periodo 2007-2010 (Deltametrina,
Diflubenzurón y Cipermetrina), estableció límites para la biomasa de cultivo por centro,
se definieron las Áreas de Manejo Sanitario (AMS), actualmente llamadas Áreas de
Concesiones de Salmónidos (ACS), en las cuales se estableció la obligatoriedad de
tratar coordinadamente los centros de un área cuando las cargas promedio por pez
superaban los límites establecidos por la autoridad.
A través de iniciativas de proyectos financiados por el Estado, así como iniciativas
privadas desde el 2006 ya se tienen registros sobre la sensibilidad de C. rogercresseyi
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al BE. Según Bravo et al. (2008) los resultados obtenidos de 18 centros cultivos
distintos en la Región de los Lagos para el periodo Noviembre 2006-Julio 2007, indican
una fuerte pérdida de sensibilidad de C. rogercresseyi dado por el EC50 (concentración
que inmoviliza al 50% de los individuos (moribundos + muertos)). Posteriormente para
el periodo Noviembre 2007-Enero 2010 Marín et al. (2010) no detecta diferencias
significativas entre regiones o especies de salmónidos (salmón del Atlántico y trucha
arcoíris) y reporta valores más bajos que Bravo et al. (2008) para las zonas de Puerto
Montt y Ancud-Castro respecto al EC50. Sin embargo, si detectan diferencias
significativas para LC50 (Concentración letal, que mata al 50% de los individuos) entre
regiones, siendo mayor la sensibilidad en los parásitos colectados desde peces de la
región de Aysén. Se sugiere de acuerdo a estos resultados que es necesario que los
bioensayos estimen ambos indicadores, ya que la significancia respecto de las
diferencias para LC50 pueden estar mostrando que los parásitos colectados desde
Aysén se encuentran en una transición en la cual su respuesta ya es evidente en el
EC50 pero no en el LC50.
Dada la importancia de ambos indicadores (LC50 y EC50) en el monitoreo de la
sensibilidad del parásito a los distintos antiparasitarios, cabe destacar lo relevante que
es la precisión con la que se estiman. Dicha precisión tiene su base en la clasificación
del estado de muerto del parásito por parte del observador. Una clasificación errónea
pone en riesgo el monitoreo de la sensibilidad a los productos antiparasitarios, debido a
que podría sub o sobre estimarse los indicadores (LC50 y EC50) y llevar a decisiones
erróneas respecto del uso de los antiparasitarios. Dada esta situación es que se hace
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necesario un mejoramiento de la metodología que actualmente se utiliza para clasificar
los copépodos en vivos, moribundos y muertos y su posterior validación.
Existen métodos que permiten establecer la condición de vivo o muerto del
parásito que permitirían validar la metodología. Específicamente rojo neutro, un tinte
básico, que ha sido empleado como colorante vital para determinar la sobrevivencia de
distintas especies de copépodos, además no es tóxico y solo tiñe las células que se
encuentran vivas (Crippen & Perrier, 1974). El rojo neutro es captado por las células
(específicamente por los lisosomas y endosomas) y en la medida que la célula pierda
viabilidad por la acción del compuesto que se evalúa se libera al medio el colorante,
pues solo las células viables son capaces de retener el colorante en su interior
(Arencibia et al., 2009).Uno de las propiedades bioquímicas fundamentales de los
lisosomas es su capacidad de mantener enzimas hidrolíticas en una forma latente. La
estabilidad de la membrana del lisosoma puede ser alterada cuando ciertas condiciones
fisiológicas o patológicas ocurren. Por lo tanto, puede resultar en una activación, y en
algunos casos, en la liberación de estas enzimas al citosol (Martínez-Goméz et al.,
2008). El rojo neutro es un tinte catiónico anfifílico que ingresa a la célula en una forma
no iónica por difusión pasiva y se acumula en los lisosomas donde se une por medio de
enlaces hidrofóbicos electroestáticos a grupos aniónicos o fosfatos de la matriz
lisosomal (Repetto et al., 2008). Esta protonización del tinte es causada por el bajo pH
en los lisosomas, por lo que el grado o capacidad de atrapar de este biomarcador
depende de la capacidad de la célula de mantener gradientes de pH a través de la
producción de ATP (Repetto et al., 2008), como también de la eficiencia de la
membrana asociada a bombas de protones (Martínez-Goméz et al., 2008). A un pH
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fisiológico, el tinte presenta una carga cercana a cero, permitiéndole penetrar la
membrana de la célula (Repetto et al., 2008). Los ensayos de retención de Rojo Neutro
reflejan la potencial filtración del contenido lisosomal hacia el citosol seguido de un
daño en la membrana y posiblemente una pérdida de la capacidad de la bomba de
protones (Martínez-Goméz et al., 2008). Cuando la célula muere o el gradiente de pH
disminuye, el tinte no puede ser retenido. Consecuentemente, la concentración del tinte
es proporcional al número de células viables. Además, utilizando el tinte rojo neutro es
posible distinguir entre células viables, dañadas o muertas (Repetto et al., 2008).
Dressel et al. (1972) desarrolló una metodología con Rojo Neutro para diferenciar
copépodos vivos y muertos haciendo posible el estudio de la muerte natural de los
copépodos en el ambiente marino. Esta metodología también ha sido utilizada por Elliot
et al. (2009) en terreno para análisis de zooplancton, de manera de simplificar el trabajo
en esta determinación y evitando así distinguir visualmente signos de daño o
descomposición de estos copépodos para una correcta estimación de la sobrevivencia,
disminuyendo los tiempos de análisis y además la subjetividad producida por la
variabilidad del observador debido a la dificultad de distinguir parásitos vivos de los
muertos. Dressel (1972) y Crippen & Perrier (1974) han desarrollado la metodología,
pero no han reportado una evaluación de la precisión de la tinción. Tang et al. (2006)
fue el primero en examinar los efectos de diferentes variables ambientales en los
resultados de tinción, como descomposición del cuerpo, duración de la tinción, método
de matanza y la posibilidad de mortalidad debido al manejo de las muestras, sin
encontrar diferencias significativas en estos factores en la precisión de la determinación
de copepoditos vivos o muertos de Acartia tonsa. Aun así es necesario estandarizar los
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procesos de manera de poder interpretar los patrones de tinción y las intensidades de
color, debido a que existe una variación entre especies de copépodos (Elliot, 2009).Esta
metodología no se ha descrito para discriminar individuos muertos y vivos en
bioensayos eco-toxicológicos y podría ser relevante si es posible usarla para además
distinguir a los individuos moribundos de los muertos y vivos.
En este estudio se implementará un protocolo de recomendaciones para la técnica
del bioensayo para evaluar la sensibilidad en los estadíos adultos de Caligus
rogercresseyi ante distintos antiparasitarios a través del uso del tinte rojo neutro que
debiera permitir la correcta clasificación de las distintas categorías en las que se puede
encontrar el parásito luego de ser sometido al bioensayo. Para esto en este estudio se
evaluará la hipótesis y los objetivos que se presentan en las siguientes secciones.
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3 Hipótesis.
Para implementar un protocolo de recomendaciones en la actual metodología de
lectura del bioensayo es necesario evaluar que los procedimientos actuales de lectura
para la clasificación de la condición del parásito (vivo, moribundo, muerto) entregan una
lectura que difiere significativamente de la lectura realizada al implementar la nueva
metodología en el bioensayo. Para probar esto se plantea la siguiente hipótesis de
trabajo:
H: La técnica de tinción rojo neutro logra una correcta clasificación de los individuos
adultos de Caligus rogercresseyi en vivo, moribundo y muerto durante la lectura de un
bioensayo.
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4 Objetivos.
Para llegar a probar la hipótesis se plantea los siguientes objetivos
4.1 Objetivo general.
Comparar la clasificación de la condición de los parásitos (vivo, moribundo y
muerto) durante la lectura de un bioensayo obtenida bajo distintas técnicas de
observación en términos del porcentaje de individuos clasificado en cada categoría en
condiciones experimentales.
4.2 Objetivos específicos.
Estandarizar la técnica de Rojo neutro sobre los bioensayos aplicados sobre
Caligus rogercresseyi.
Validar la metodología para la correcta diferenciación entre un individuo vivo de
uno moribundo y uno muerto en el copépodo Caligus rogercresseyi.
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5 Materiales y Métodos.
El estudio fue realizado en el laboratorio de Interacciones Ecológicas de la
Universidad Austral de Chile, Sede Puerto Montt, en el periodo comprendido entre
mayo y diciembre del 2011. El procedimiento incluyó las etapas de colección de
hembras ovígeras, cultivo de parásitos, infestación experimental de los peces,
bioensayos, lectura del bioensayo usando el método de tinción de rojo neutro y análisis
estadístico. A continuación se explican en detalle cada una de las etapas.
5.1 Colección de hembras ovígeras.
Se colectaron parásitos adultos desde distintos centros de cultivo ya sea para 1)
iniciar un cultivo huevos del parásito, o 2) realizar el bioensayo directamente. Esta
segunda opción se realizó sólo si el número de parásitos adultos era suficiente para
cumplir con el número que requería el diseño del bioensayo y si se encontraban en una
buena condición: comportamiento normal, capacidad de nadar en línea recta y la
capacidad de adherirse a la superficie del envase del bioensayo. Los parásitos fueron
extraídos con pinzas punta curva desde peces vivos anestesiados con benzocaína. La
extracción se realizó apretando levemente la zona del cefalotórax del parásito para
minimizar cualquier daño por manipulación, y se introdujeron en el contenedor de
traslado con agua de mar. El traslado de los parásitos se realizó en contenedores
plásticos con agua de mar, con aireación continua y a temperatura aproximada entre
9°C a 12°C con la ayuda de gel packs puestos en las hieleras. Cada envase fue
rotulado con la fecha y zona de muestreo, además se registró antecedentes tales como,
especie del hospedador y su peso promedio. Una vez que los parásitos se
20
recepcionaron en el laboratorio se midió temperatura, oxígeno disuelto y salinidad del
agua en que fueron trasladados, se verificó actividad natatoria inmediata, la habilidad
de adherirse y mantenerse adherido al recipiente. Los contenedores se mantuvieron
con aireación en la incubadora a 12°C hasta la realización del cultivo o el bioensayo.
5.2 Cultivo.
A las hembras colectadas se le extrajeron los sacos ovígeros del cuerpo y se
clasificaron en maduros (oscuros) e inmaduros (blanco-verdoso), para así realizar el
cultivo por separado según estado de madurez de los huevos. Se realizó un recuento
total de los sacos y se muestreo el 10% del total para estimar el número promedio de
huevos por saco. Este valor se utilizó para proyectar la cantidad de huevos totales que
se obtendrán en el cultivo.
El cultivo se realizó con agua de mar filtrada a 1 µm, esterilizada con UV, a 12° C con
aireación constante y fotoperiodo 12:12. Se realizó un recambio de agua diario y parcial
a través de una manguera y un tamiz de105 µm, para evitar la pérdida de larvas por
este proceso.
Cada 5 y 7 días de iniciado el cultivo para sacos inmaduros y maduros respectivamente,
se realizó un muestreo para registrar la cantidad aproximada de copepoditos en los
cultivos. Se redujo el volumen de cada cultivo, se homogenizó el contenido y se
tomaron 10 muestras aleatorias de 1 ml con una pipeta. Bajo un microscopio
estereoscópico se contabilizó el número de parásitos y el estadío del ciclo de vida en
que se encontraba. Se promedió el número de parásitos encontrado y se extrapoló
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hacia el volumen total del cual se realizó el muestreo para obtener el número total de
parásitos de vida libre en los cultivos.
5.3 Infestación Experimental.
La infestación se realizó al quinto día para el cultivo de sacos maduros y al
séptimo día de iniciado el cultivo para los sacos inmaduros. La cosecha de cada cultivo
se restringió a las unidades térmicas acumuladas (UTA) por estado de desarrollo, por lo
tanto en el cultivo de sacos maduros se cosechó a las 60 UTA y el cultivo de los sacos
inmaduros a las 86 UTA. Para realizar el conteo del número de estados infectivos que
se agregaron por pez, se redujo el volumen del cultivo a 500 ml de agua, se
homogenizó el contenido y se tomó una alícuota de 1 ml con una pipeta. El contenido
se distribuyó en cantidades similares en placas de conteo para obtener el número de
larvas y extrapolar a 1 L. A medida que se cuantificaron las larvas se depositaron en
contenedores distintos para ir acumulando el número necesario para cada estanque
según el número de peces que hubiese. Cuando se obtuvo la cantidad suficiente de
parásitos para infestar los peces y lograr una presión de infección de 100 cop/pez
(Araya.et al, 2011) se procedió a disminuir el volumen de agua de los estanques de
cultivo de peces y se agregó la cantidad estimada de estados infectivos. Los peces se
mantuvieron con volumen reducido de agua, oxigenación constante y en oscuridad por
6 horas para favorecer el encuentro hospedador-parásito y la infestación.
Posteriormente se restauró las condiciones de cultivo de peces y monitoreó de los
parásitos de acuerdo a la temperatura del agua para llegar a determinar en qué
momento la mayoría de los parásitos han alcanzado el estado de adulto. Para esto se
22
usó el modelo de grados-días descrito por González y Carvajal (2003). En ese momento
se realizó la extracción de los parásitos para la realización de los bioensayos.
5.4 Bioensayos.
Los bioensayos se realizaron de acuerdo a la metodología propuesta por “Sea lice
Resistance to Chemotherapeutants: A Handbook in Resistance Management” (Search
Project, 2006). Se utilizaron 10 parásitos adultos con una proporción 1:1 de hembras y
machos, para cada concentración por triplicado. Los parásitos se depositaron en una
placa Petri o envases plásticos con malla tamiz de 1 mm, previamente rotulada con la
información de la concentración del producto. Los parásitos fueron expuestos a la
concentración de cada réplica en el mismo orden en los cuales fueron dispuestos por
tratamiento y réplica, anotando el tiempo en el cual se inició la exposición. Los parásitos
se mantuvieron en la cámara de incubación, con fotoperiodo y temperatura controlada
por 24 horas durante el bioensayo.
5.5 Lectura del bioensayo.
Una vez finalizado los bioensayos los parásitos de cada réplica y concentración se
clasificó en vivo, moribundo y muerto, directamente en las placas Petri y/o envases con
malla tamiz. Las características que definen cada una de las categorías se obtuvieron
desde Search Project, 2006:
Vivo: Comportamiento normal, natación en línea recta o el parásito es capaz de
succionar en la pared de la placa y mantenerse adherido.
Moribundo: Actividad natatoria errática, nada en círculos, problemas para adherirse a la
pared, no es capaz de adherirse o se caen inmediatamente. Todos los parásitos con
23
algún tipo de movimiento, pero que no sea clasificado como normal, pertenece a este
grupo.
Muerto: Sin movimiento en extremidades después de tocar el parásito, en intestinos u
otros órganos.
Las lecturas de los bioensayos variaron dependiendo del bioensayo. El primer
grupo de bioensayos se utilizaron 2 observadores sin ayuda de un microscopio y un
observador usando microscopio estereoscópico después de aplicado el rojo neutro.
Para el segundo grupo de bioensayos las lecturas fueron realizadas por un observador
sin ayuda de un microscopio, un observador bajo microscopio estereoscópico y un
observador bajo microscopio estereoscópico después de haber aplicado rojo neutro.
Las observaciones fueron realizadas en el mismo orden para cada tipo de observador y
se registraron en una planilla de datos para su posterior análisis, clasificándolos en
términos de porcentaje de individuos en cada categoría vivo, moribundo y muerto.
5.5.1 Lectura usando el método de la tinción Rojo Neutro.
Una vez clasificados los parásitos en las categorías de muerto, moribundo y vivo
por parte de los observadores natural y bajo microscopio estereoscópico, los
copépodos se sometieron al reactivo Rojo Neutro, para posteriormente realizar una
nueva clasificación en base a la tinción que se observara en los parásitos a través de
un registro fotográfico realizado con un microscopio estereoscópico marca Leica modelo
EZ4, para su posterior lectura (La Figura 3 describe los pasos involucrados en la
aplicación del Rojo Neutro previo a la lectura).
24
5.6 Método del Rojo Neutro.
Se utilizó la metodología mejorada descrita por Tang et al. (2006) que consiste en
preparar la solución stock disolviendo el químico rojo neutro (0,01 g/ml) en agua
destilada. En este caso se disolvió 0.1 g de rojo neutro en 20 ml de agua destilada por
medio de un agitador magnético durante 10 minutos (Figura 4). Además se preparó una
solución alcalina que ayuda a estabilizar por mayor tiempo el tinte dentro de los tejidos
del zooplancton, disolviendo Hidróxido de Sodio 0.1 M en agua de mar hasta ajustar el
pH a 9 (Figura 5) después de aplicado el rojo neutro. El procedimiento básico de tinción
con rojo neutro es añadir 1.5 ml de la solución stock de Rojo Neutro cada 1000 ml del
volumen de la muestra de zooplancton (Concentración final de 1:67000 aprox.) Se
utilizó una micro pipeta (HandyStep, Brand), en posición 3 con una punta de 1.25 ml
para completar una dosis de 75 µl (Figura 6) para el volumen de la placa de 50 ml
homogenizando la solución completamente (Figura 7). La muestra se mantuvo en baño
por 15 minutos, se filtró con un colador tamiz de 0.8 mm y se enjuagó repetidamente
con agua de mar para eliminar el exceso de tinte (Figura 8). Esta muestra se transfirió a
otro recipiente con la solución alcalina (pH > 9) preparada anteriormente y se preservó
con formalina al 5% (Figura 9). Las muestras fueron mantenidas en frío y a oscuras,
para procesarlas en un máximo de 4 días. Para el procesamiento las muestras
preservadas fueron acidificadas con ácido clorhídrico 0.1 M, hasta lograr un pH < 7.
Esta acidificación ayuda a desarrollar el color del tinte de manera que el zooplancton
que estaba vivo al momento del bioensayo aparece de color rojo, mientras que los
muertos van a aparecer sin la tinción. Se registró fotográficamente cada tratamiento y
réplica a través de la cámara integrada del microscopio estereoscópico (EZ4D, Leica)
25
para su posterior análisis y clasificación según la intensidad de la tinción registrada en
vivos, moribundos y muertos, clasificándolos en términos de porcentaje de individuos en
cada categoría. Para una mejor determinación de las diferencias en la intensidad de la
coloración y su asociación con el estado del parásito (vivo, moribundo y muerto) se
realizó una prueba de control para los individuos muertos.
5.6.1 Control muerto.
Para poder determinar el nivel de tinción que posee un individuo muerto y así
diferenciarlo de uno moribundo, se distribuyeron 10 individuos adultos entre machos y
hembras, por triplicado en placas Petri (Figura 10). Se preparó una solución de
formalina al 5% con agua de mar con la cual se realizó un baño a los parásitos durante
1 hora. Se observaron bajo microscopio estereoscópico para comprobar que se
encontraban muertos, que no posea movimientos en extremidades después de tocar el
parásito, en intestinos u otros órganos. Se procedió a aplicar la metodología de rojo
neutro, finalizando con el registro fotográfico y análisis posterior de las intensidades de
la coloración.
5.6.2 Análisis estadístico.
Para comparar las lecturas de los diferentes métodos de observaciones respecto
de cada una de las categorías de clasificación de los parásitos se realizaron 3 análisis
de ANOVA no paramétrico de una vía de Kruskal Wallis (Zar, 1996) (uno por cada
categoría de clasificación de los parásitos). Si se detectó diferencias significativas se
aplicó la prueba de comparación múltiple a posteriori de Conovan (Zar, 1996) por medio
del software InfoStat 2011. Debido a que los bioensayos se ejecutaron en dos grupos y
26
que los métodos de lectura fueron diferentes entre estos dos grupos de bioensayos, el
análisis estadístico indicado previamente se aplicó para ambos grupos de bioensayos.
27
6 Resultados.
6.1 Método de Tinción con Rojo Neutro.
La aplicación de la técnica de rojo neutro en los bioensayos no estuvo exenta de
dificultades durante el proceso de estandarización. En el primer grupo de bioensayo los
parásitos fueron contenidos en envases plásticos con malla tamiz (Figura 11). En si este
diseño facilita la aplicación de la metodología de rojo neutro y disminuye la
manipulación de los individuos, debido a que al sumergir los envases en las distintas
soluciones permite además mayor rapidez en el transcurso de la lectura del bioensayo
por parte de los observadores y la posterior aplicación de la tinción. Para el segundo
grupo de bioensayos se utilizaron placas Petri (Figura 7) para contener a los parásitos
en los distintos baños con producto antiparasitario y además, para la aplicación de rojo
neutro. El vidrio es una superficie que favorece que los parásitos puedan adherirse y
moverse a través de ella, por lo que fue necesario constantemente monitorear que se
mantuvieran sumergidos en la solución de rojo neutro, especialmente en las
concentraciones más bajas en los cuales se encontraban con una alta actividad
natatoria. Los envases plásticos tienen el mismo problema de adherencia de los
parásitos que las placas Petri, por lo que también hay que estar constantemente
monitoreando que se encuentren sumergidos en la solución. Al ser muchas
concentraciones y réplicas, se hace difícil poder monitorearlas todas, por lo que puede
inducir a cierto tipo de error principalmente en las concentraciones más bajas en la
clasificación de los individuos debido a que al no estar sumergidos completamente se
tiñen parcialmente o no se tiñen.
28
6.2 Prueba de tinción: Rojo Neutro.
La lectura de los bioensayos consiste en diferenciar las distintas categorías a los
parásitos: vivos, moribundos y muertos. Como se ha mencionado previamente, esta
clasificación depende en gran parte de la experiencia del observador sin ayuda para
lograr una correcta determinación.
En las primeras pruebas de tinción con rojo neutro se observó distintos niveles de
coloración en los distintos tratamientos y réplicas. Al comparar preliminarmente la
clasificación de la lectura existió una clara diferencia dentro de los individuos
clasificados como vivo, ya que al ser sometidos a la técnica de tinción adquirió una
coloración intensa, pero al comparar visualmente las réplicas se apreció una
variabilidad en esta intensidad pero manteniendo la coloración en todo el cuerpo (Figura
12). Para los individuos clasificados como moribundos la coloración fue menos intensa
que la de los vivos, parcial en el cuerpo y/o apéndices (Figura 13).Al someter a los
individuos clasificados como muertos a la técnica de tinción, se observó que algunos
no presentaban coloración en el cuerpo, en machos fue observable en apéndices y
extremidades y en hembras la coloración generalmente se presenta en el segmento
genital y sacos ovígeros (Figura 14).
Ejemplos como el citado previamente indicaron que existe una alta variabilidad en
los niveles de coloración, reflejado en la intensidad de la coloración. Esto dificultó la
diferenciación de un individuo moribundo y uno muerto en el análisis de las imágenes,
pero si fue posible detectar un patrón de coloración que se mantenía en individuos vivos
y parcialmente en individuos clasificados como moribundos. Para definir mejor los
29
rasgos de coloración que diferencian al individuo muerto y moribundo fue necesario
determinar cómo se presenta la tinción en un individuo muerto, pero cuya condición de
muerto pueda ser verificada previo a la aplicación de la metodología de rojo neutro. La
formalina al 5% fue el método más efectivo para matar los individuos, ya que al
momento de sumergirlos en la solución inmediatamente se podía apreciar que los
estaba afectando. Durante los 30 minutos que se mantuvieron en baño, se procedió a
observar bajo microscopio estereoscópico para asegurar que se encontraban muertos y
se aplicó la metodología de rojo neutro. Este procedimiento se aplicó en machos,
hembras y hembras ovígeras. En los machos adultos muertos es común encontrar las
antenas ventrales teñidas de un color rosáceo u anaranjado, como también en la
anténula del cefalotórax (Figura 15). En las hembras ovígeras, generalmente se puede
apreciar una coloración rosácea en el segmento genital y sacos ovígeros, como
también aunque casi imperceptible en anténulas y cefalotórax (Figura 16), por lo que
parásitos que presentaron esta tinción durante la lectura del bioensayo, se consideraron
individuos muertos.
6.3 Comparación de la clasificación entre las distintas técnicas.
En el primer grupo de experimentos se comparó las lecturas del bioensayo
realizadas por dos observadores sin ayuda y la lectura obtenida después de la
aplicación del rojo neutro. No se detectaron diferencias significativas en los porcentajes
asignados por los observadores sin ayuda de un microscopio para ninguna de las
categorías de clasificación de los parásitos. Si existieron diferencias significativas entre
cada observador y la lectura realizada bajo la tinción rojo neutro para las categorías de
vivos y moribundos. Para la categoría de parásitos muertos los observadores y la
30
tinción rojo neutro muestran porcentajes de asignación que no difieren
significativamente (Figura 17 y Tabla 1). El patrón observado sugiere que los
observadores clasifican un mayor porcentaje de individuos como vivos y un menor
porcentaje como moribundos que la técnica del rojo neutro.
En el segundo grupo de experimentos se comparó las lecturas del bioensayo
obtenidas por un observador sin ayuda de un microscopio, un observador mirando bajo
microscopio estereoscópico y después de la aplicación del rojo neutro. No se detectó
diferencias significativas en el porcentaje de individuos asignados a la categoría de
vivos entre el observador sin ayuda, el observador que utiliza microscopio
estereoscópico y el rojo neutro. Para las categorías de moribundo y muerto los
resultados indican que solo existen diferencias significativas entre las asignaciones del
observador sin ayuda de un microscopio y la tinción. Las asignaciones del observador
sin ayuda de un microscopio y el que usa microscopio estereoscópico no difieren entre
sí, ni tampoco las asignaciones realizadas por el observador con microscopio
estereoscópico y con la tinción del rojo neutro (Figura 18 y Tabla 2). El patrón
observado en este experimento sugiere que la tendencia es que el observador sin
ayuda de un microscopio clasifica un menor porcentaje de individuos moribundos y uno
mayor de muertos.
.
31
7 Discusión.
Los bioensayos son una herramienta importante para determinar la sensibilidad de
Caligus rogercresseyi a los fármacos que se utilizan actualmente para su control. Se
recomienda realizar estos bioensayos durante la fase de engorda en la producción de
salmones para monitorear y detectar cambios en la sensibilidad dentro de una
población de parásitos. Este monitoreo constituye un elemento esencial de una
estrategia exitosa para prevenir y manejar la resistencia del parásito a los
antiparasitarios (Wescott et al., 2008). Sin embargo, la certeza de los resultados de los
bioensayos puede ser cuestionada debido a que la lectura está sujeta a la experiencia
del analista/observador en la clasificación de los parásitos en las distintas categorías,
afectando así los valores de los indicadores EC50 y LC50.
La clasificación de los parásitos entre moribundo y muerto no es sencilla debido a
que individuos que han sido clasificados como muertos por un observador sin ayuda de
un microscopio, poseen una alta probabilidad de tener movimientos del sistema
digestivo y apéndices, que son solo detectables bajo microscopio estereoscópico por lo
que realmente se debieran clasificar como moribundos. Por esta razón la incorporación
de la aplicación del tinte rojo neutro a la actual metodología de lectura de los
bioensayos significaría un mejoramiento significativo respecto de la objetividad en la
lectura del bioensayo, independizando los resultados de la experiencia del observador.
La tinción rojo neutro desarrollada por Dressel et al. (1972) les permitió separar
copépodos vivos y muertos, haciendo posible el estudio de la muerte natural de los
32
copépodos en el ambiente marino. No se ha descrito el uso de la metodología de rojo
neutro en bioensayos eco-toxicológicos
En este contexto, la definición de las características de los individuos muertos
sometidos al tinte rojo neutro fue relevante para realizar la correcta lectura de los
bioensayos para todas las comparaciones realizadas. Crippen & Perrier (1974)
describen los métodos aplicados para lograr la muerte de los individuos y así utilizarlos
como control muerto. Entre ellos citan la aplicación de un golpe de calor desde los 40 a
60 °C e inmediatamente someten a los individuos a la tinción. Tang et al. (2006) no
detectó diferencias significativas entre distintos métodos para matar los copépodos de
la especie Acartia tonsa (etanol, formaldehido 4% y dióxido de carbono). En este
estudio se seleccionó la formalina al 5% del producto comercial verificando su
efectividad observando los parásitos con un microscopio estereoscópico. Después de
30 min en formalina, los parásitos no mostraban signos de movimiento. Especialmente
no había movimientos ni en los apéndices ni en el tracto digestivo, zonas en las cuales
después de usar otros métodos para matar los parásitos aún persistían movimientos.
Entre los factores a considerar como parte de la metodología de aplicación del
tinte rojo neutro se pueden indicar el tiempo de exposición de los parásitos a este tinte
una vez que se haya finalizado el bioensayo y el método de preservación de las
muestras una vez aplicado el rojo neutro para su posterior lectura. En este estudio se
mantuvo a los parásitos sumergidos en el tinte por 15 minutos. Sin embargo, el tiempo
de exposición al tinte no parece ser relevante ya que Tang et al. (2006) no encontró
diferencias significativas respecto al tiempo de tinción, entre un rango de 5 y 20 minutos
33
de exposición en muestras de copépodos, en comparación a sus resultados en la
clasificación de vivos y muertos en el copépodo Acartia tonsa. En cuanto al método de
preservación, en este estudio se usó la formalina al 5%. Elliot & Tang (2009) no
encontraron diferencias significativas entre el método de preservación de las muestras.
Sin embargo, estos autores describen que la preservación con formaldehido resultó en
un menor porcentaje de copépodos coloreados y una mayor variabilidad que los
porcentajes de copépodos coloreados cuando las muestras fueron leídas
inmediatamente después de aplicado el tinte, o cuando fueron congeladas a -20 °C. De
acuerdo a la experiencia obtenida desde este estudio, la lectura inmediata de la
coloración de los individuos requeriría demasiado tiempo, añadiendo un elemento
adicional de variabilidad, es decir el tiempo que transcurre entre la lectura del primer
tratamiento y el último.
Una dificultad que se puede presentar en la lectura de los bioensayos en los que
se aplica el rojo neutro está relacionada con los individuos muertos. En este estudio se
observó que en los parásitos clasificados como muertos (según el patrón de coloración
definido para los muertos a través del análisis del control muerto) persiste un patrón de
coloración casi imperceptible en hembras y en machos, generalmente en el par de
antenas. Elliot & Tang (2009) presumen que este resultado se debe a residuos de
actividades celulares y enzimáticas. A su vez, los individuos clasificados como
moribundos, presentaban una coloración parcial del cuerpo, probablemente debido a
que se encontraban afectados por la concentración del antiparasitario aplicada en el
bioensayo, y muchas de las células no eran viables. No obstante a través de las
fotografías se ha podido identificar más claramente el patrón de coloración que
34
presentarían los individuos muertos y moribundos. Los individuos vivos fueron
fácilmente identificables bajo la técnica de rojo neutro ya que presentaban una
coloración intensa.
Los resultados del primer grupo de bioensayos permiten sustentar la consistencia
de los observadores que participaron en el experimento en la clasificación de la
condición de los parásitos sin ayuda de microscopio estereoscópico. Esto podría sugerir
que ambos observaron tenían la misma experiencia en clasificar. Si se considera que el
rojo neutro permite clasificar correctamente la condición de los parásitos entonces este
grupo de bioensayos sugiere que los observadores cometen errores durante la
clasificación, especialmente entre la categoría vivo y moribundo. Es posible que este
resultado esté afectado por la exposición de los parásitos al tinte, ya que en este primer
grupo de bioensayos hubo dificultades en mantener los parásitos sumergidos en el rojo
neutro debido a la adherencia de éste al plástico. Esto pudo haber ocasionado una
menor intensidad en la coloración de los individuos vivos facilitando su confusión con
los moribundos y disminuyendo el porcentaje de asignación de parásitos a la categoría
de vivos.
El reemplazo de los envases plásticos por cápsulas Petri como unidades
experimentales para aplicar los baños con rojo neutro durante el segundo grupo de
bioensayos constituyó efectivamente un mejoramiento de la técnica. Aunque el vidrio
también provee una superficie de alta adherencia para los parásitos, se disminuyó la
posibilidad de error debido a que el volumen de rojo neutro fue suficiente para
completar el nivel superior de la placa Petri (50 ml).
35
La inclusión del observador que utiliza microscopio estereoscópico (observador 2)
en reemplazo del segundo observador sin ayuda de un microscopio del primer grupo de
bioensayos permitió confirmar que una gran parte de los individuos clasificados como
muertos poseían algún tipo de movimiento de apéndices y del tracto digestivo
únicamente detectable bajo este método. Esto sugiere que sin ayuda, un observador
puede clasificar un parásito como muerto cuando aún no lo está. A diferencia de los
resultados del primer grupo de bioensayos estos resultados indican que no existen
diferencias significativas para los individuos clasificados como vivos entre los distintos
observadores (observador sin ayuda, con ayuda de un microscopio estereoscópico y
con rojo neutro). Sin embargo, estos resultados también sugieren que un observador
sin ayuda de un microscopio clasifica un menor porcentaje de individuos moribundos y
uno mayor de muertos. Esto es consistente con los resultados explicados previamente
que indican que usando el microscopio estereoscópico es posible observar en
individuos clasificados como muertos por el observador sin ayuda de un microscopio
movimiento en las extremidades y sistema digestivo.
Una sobre-estimación de los individuos muertos y una consecuente subestimación
de los moribundos cuando los parásitos se someten a un bioensayo para evaluar
sensibilidad a antiparasitarios pueden conducir a estimaciones de EC50 y LC50
erradas. Al hacer el ejercicio de estimar estos indicadores, para el caso de EC50, se
estaría estimando valores relativamente similares por el observador sin ayuda de un
microscopio y el observador con ayuda de la técnica de rojo neutro. Sin embargo para
el caso de la estimación del LC50, las diferencias ocasionadas por el reducido número
de parásitos muertos que se detecta utilizando la técnica del rojo neutro hacen
36
imposible la estimación del parámetro por desviarse significativamente los resultados de
los supuestos del modelo Probit. En este escenario, los resultados del observador sin
ayuda de un microscopio al clasificar una mayor cantidad de individuos muertos nos
sugiere que los individuos están siendo más sensibles al antiparasitario aplicado, de lo
que sugiere la técnica de rojo neutro.
Los resultados también sugieren que podría ser equivalente utilizar la tinción rojo
neutro y el microscopio estereoscópico. En este contexto, la aplicación del bioensayo
requiere un tiempo de desarrollo y lectura de 24 horas, y agregar la tinción del rojo
neutro puede ser una desventaja en términos de tiempos debido que agrega 12 horas la
lectura del bioensayo. En este sentido la lectura utilizando microscopio estereoscópico
disminuye considerablemente los tiempos manteniendo los porcentajes del rojo neutro
en la clasificación de los parásitos en cada categoría.
La tendencia de la implementación de los monitoreos de sensibilidad es hacia la
aplicación en terreno, más que en laboratorio, sin embargo, es difícil realizar una lectura
objetiva en terreno. Es por esto que mientras las técnicas de aplicación en terreno se
perfeccionan y masifican podría ser útil someter en terreno a los parásitos al rojo neutro
y preservarlos para así observar en laboratorio la condición de los parásitos.
37
8 Conclusión.
La técnica de rojo neutro aplicada en bioensayos en Caligus rogercresseyi provee
un herramienta efectiva de verificación de la clasificación en cada categoría (vivo,
moribundo y muerto), entregando una mayor precisión a la estimación de los
indicadores EC50 y LC50. Es un método que además puede ser utilizado para la
validación de los observadores en la respectiva clasificación que realizan y para
determinar el porcentaje de error que pueden tener los observadores cuando clasifican
la condición de los parásitos.
La metodología para aplicar la técnica del rojo neutro a la lectura de los
bioensayos realizados con C. rogercresseyi a los antiparasitarios ha sido descrita en la
Figura 3 y la interpretación de las coloraciones para clasificar la condición de los
parásitos se muestran en las Figuras 12, 13, 14 y 15.
Dado estos resultados y la discusión realizada se rechaza la hipótesis nula y se
acepta la hipótesis alternativa de este trabajo. Es decir existen diferencias significativas
entre las distintas técnicas de observación respecto de la clasificación de los individuos
adultos de Caligus rogercresseyien vivo, moribundo y muerto durante la lectura del
bioensayo.
La metodología de rojo neutro puede seguir siendo mejorada, de manera de poder
facilitar la lectura y proyectarla en un futuro para la aplicación de bioensayos en terreno,
como también la posibilidad de uso en estudios de evaluación de eficacia de
tratamientos antiparasitarios en estadíos fijos en el pez de Caligus rogercresseyi.
38
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43
10 Figuras.
Figura 1. Registro del uso de benzoato de emamectina (en kg de principio activo) desde
el año 2005 al 2010 (Fuente SERNAPESCA, 2011).
Figura 2. Abundancia de parásitos totales para salmónidos para los años 2004 y 2007
en Chile (Fuente: Rozas & Asencio, 2007).
44
Figura 3. Diagrama de flujo que describe los pasos en la aplicación de la metodología
rojo neutro para la tinción de los parásitos C. rogercresseyi.
45
Figura 4. Solución stock de rojo neutro.
Figura 5. Solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) 0.1 M.
46
Figura 6. HandyStep (Brand) con punta 1.25 ml.
Figura 7. Entrega de la dosis de rojo neutro en las placas Petri, antes y después del
homogenizado
47
Figura 8. Filtrado y enjuague de los parásitos teñidos con rojo neutro
Figura 9. Muestra preservadas en formalina al 5%.
48
Figura 10. Distribución de parásitos en placas Petri para ensayo control muertos con
formalina al 5%.
Figura 11. Envases utilizados para un tipo de bioensayo por medio de baños y posterior
aplicación de rojo neutro.
49
a)
Figura 12. Coloración tinción rojo neutro individuos vivos. Imagen superior machos e
inferior, hembras ovígeras.
50
Figura 13. Individuos clasificados como moribundos por la técnica rojo neutro. La
coloración fue menos intensa que la observada en los vivos y además parcial en el
cuerpo y/o apéndices. Fotografía superior machos e inferior hembras ovígeras.
51
Figura 14. Individuos clasificados como muertos por la técnica rojo neutro, en algunos
no se apreció la coloración del tinte en el cuerpo. En machos se observó coloración en
apéndices y extremidades y en hembras fue persistente en el segmento genital y sacos
ovígeros.
52
a)
b)
Figura 15. Control Muerto. a) Vista ventral de un macho adulto. Se puede apreciar par
de antenas de un color rosáceo. b) Vista dorsal de machos adultos. Todos con el par de
antenas teñidas de un color anaranjado.
53
Figura 16. Control Muerto. Vista superior hembras sin y con saco ovígeros. Se puede
observar levemente coloración parcial en segmento genital y sacos ovígeros.
54
Tipo Obs
MuertoMoribundoVivo
321321321
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Da
tos
Grupo 1
a a
b
c
c
d
e
e
e
Figura 17. Medianas con intervalos de confianza por tipo de observador y categoría
(Vivo, moribundo, muerto) para el grupo 1. Leyenda: 1) observador 1, ojo desnudo, 2)
observador 2 ojo desnudo y 3) Rojo Neutro.
55
Figura 18. Medianas con intervalos de confianza por tipo de observador y categoría
(Vivo, moribundo, muerto) para el Grupo 2. Leyenda: 1) observador 1, ojo desnudo, 2)
observador 2, microscopio estereoscópico y 3) Rojo Neutro.
Tipo Obs
MuertoMoribundoVivo
321321321
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Da
tos
Grupo 2
a
a
a
b
b-c
c
dd-e e
56
11 Tablas.
Tabla 1. Resumen del análisis pos-hoc a Kruskal Wallis con comparación múltiple de
Conover entre observadores por categoría para el grupo 1 de bioensayos. Medias con
letras distintas por categoría indican diferencias significativas (p<0.05).
Observador ojo desnudo 1
Observador ojo desnudo 2
Rojo Neutro
p
Vivo A A B <0.0001
Moribundo C C D <0.0001
Muerto E E E 0.1483
Tabla 2. Resumen del análisis pos-hoc a Kruskal Wallis (1952) con comparación
múltiple de Conover (1999) entre observadores por categoría para el grupo 2. Medias
con letras distintas por categoría indican diferencias significativas (p<0.05)
Observador ojo desnudo
Observador bajo lupa
Rojo Neutro
p
Vivo A A A 0.82
Moribundo B B-C C 0.0361
Muerto D D-E E 0.0117