POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH

NFNFB I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH B I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW

GENOTOKSYCZNYCH – GENOTOKSYCZNYCH – wpływ promieniowania na przebieg szlaku NFwpływ promieniowania na przebieg szlaku NFB B

Katarzyna SzołtysekCentrum Badań Translacyjnych i Biologii

Molekularnej Nowotworów

Mechanizm regulacji NFB, współzależności z p53

Cel pracy

Identyfikacja funkcjonalnych współzależności między szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFB i p53, poprzez m.in. scharakteryzowanie wpływu każdego z tych białek na ekspresję genów regulowanych przez drugi czynnik

Analiza kinetyki aktywacji i przebiegu ścieżki sygnałowej zależnej od NFB w komórkach stymulowanych promieniowaniem i /lub cytokiną TNF (analiza Western-blot i EMSA)

Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFB (analiza QRT-PCR)

Analiza wpływu czasu napromieniowania na ekspresję wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFB (analiza QRT-PCR)

Cel szczegółowy: wpływ promieniowania na przebieg ścieżki NFwpływ promieniowania na przebieg ścieżki NFBB

HCT116 (human colon carcinoma) p53+/+ (wt) p53-/- (knock-out)

Model doświadczalny

RYC.1. Komórki linii HCT116 (wt).

TNF= 10ng/ml

RYC.4. Kinetyka degradacji białka IB (Western-blot) w komórkach linii HCT116 stymulowanych cytokiną TNF (15-min).

Indukcja ścieżki NFB - degradacja inhibitora IB

Charakterystyka modelu doświadczalnego:

RYC.2. Transkrypcja genu TP53 (RT-PCR) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C.

RYC.3. Akumulacja białka p53 (Western-blot) w komórkach linii HCT116 pod wpływem napromienienia UV-C lub IR.

Indukcja/akumulacja białka p53

UV = 20J/m2

IR = 4 Gy

K

lub

Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na aktywację szlaku NFB i ekspresję wybranych genów zależnych od NFB

Układ doświadczalny:

Wykonane analizy:

identyfikacja genów indukowanych przez TNFidentyfikacja genów indukowanych przez TNF (profil ekspresji – macierz QRT-PCR) ilościowa analiza zmian poziomu wybranychilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów genów (QRT-PCR) analiza kinetyki degradacji inhibitora analiza kinetyki degradacji inhibitora I IBB(Western-blot) analiza obecności aktywnego NFanaliza obecności aktywnego NFB w jądrzeB w jądrze komórkowym komórkowym (EMSA)

Wybrane geny: Podjednostki czynnika NFB: geny NFKB1 i REL Białka regulujące ścieżkę NFB: geny NFKBIA, BCL3, TNFAIP3 Geny odpowiedzi komórkowej prozapalnej (TNFA, IL1A, IL8, LTA ) i proprzeżyciowej (JUN)

TNF= 10ng/ml

UV = 20J/m2

IR = 4Gy

RYC.1. Kinetyka zmian poziomu białka IB (Western-blot) w komórkach poddanych kombinacji stymulacji cytokiną TNF i promieniowania UV.

RYC.2. Detekcja aktywnych form NFB (test EMSA) w ekstraktach jądrowych z komórek napromieniowanych UV i stymulowanych cytokiną TNF (wynik testu przeprowadzonego przez dr Natalię Kashchak).

Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie hamuje aktywację NFB i obniża poziom ekspresji genów zależnych od NFB w komórkach stymulowanych przez TNFefektniezależny od statusu białka p53

Przykładowa analiza przeprowadzona 1h i 6h po stymulacji cytokiną TNF

Analiza wpływu czasu napromieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję wybranych genów zależnych od NFB

Układ doświadczalny: TNF= 10ng/ml

UV = 20J/m2

Wykonane analizy: ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NFilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NFB B (QRT-PCR)

Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych od NFB, indukowanych TNF w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efektniezależny od statusu białka p53

p<0,01

(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)

RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych od NFB, indukowanych TNF w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji; efektniezależny od statusu białka p53

p<0,01

(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)

RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji genów zależnych od NFB, indukowanych TNF; efektzależny od statusu białka p53

p<0,01

(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)

RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji genów zależnych od NFB, indukowanych TNF; efektzależny od statusu białka p53

p<0,01

(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)

RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 (QRT-PCR) w punkcie czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNF w komórkach linii HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych (wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego 18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach eksperymentalnych).

Komórkowa odpowiedź na promieniowanie jest modulowana przez sekwencję czasową aktywacji ścieżek sygnałowych zależnych od czynników NFB i p53

Napromienienie komórek poprzedzające stymulację cytokiną TNF

Podsumowanie

hamowanie aktywacji ścieżki NFB i osłabienie ekspresji genów zależnych od NFB – niezależnie od p53

oscylacje poziomu genów zależnych od NFB – zależnie od p53