KAN GRUPLAMADA KAN GRUPLAMADA

KARKARŞŞILAILAŞŞILAN SORUNLAR ILAN SORUNLAR

Dr. Meral SDr. Meral SÖÖNMEZONMEZOĞĞLULUYeditepe Yeditepe ÜÜniversitesi Hastanesi Transfniversitesi Hastanesi Transfüüzyon Merkezizyon Merkezi

IV. ULUSAL KAN MERKEZLERİ VE TRANSFÜZYON KONGRESİ

Page � 2

KAN GRUP TERMKAN GRUP TERMİİNOLOJNOLOJİİSSİİ

�Sistem (Tek gen loküsünde allel ile kodlanan antijen spesifisitesi-29)

�Koleksiyon (Serolojik, genetik, biyokimyasal temel)

�Seri (bilinen seri ve koleksiyonlara girmemiş en az iki antijen bildirimi-700 seri düşük insidans, 901 seri yüksek insidans)

Page � 3

Major kan grup sistemleriMajor kan grup sistemleri

Page � 4

DiDiğğer kan grup sistemlerier kan grup sistemleri

Page � 5

ABO Kan Grup SistemiABO Kan Grup Sistemi

�ABO sistemi transfüzyonla ilişkili olarak en önemli kan grup sistemidir.

�ABO tanımlamada güçlükler ve yanlış yorumlama hasta hayatına mal olabilir.

�ABO ve H iki ayrı sistem, biyokimyasal ve fenotipik düzeyde yakın ilişkili

�ABO geni kromozom 9 üzerinde lokalize

Page � 6

ABO ABO Kan Grup Kan Grup SSiistemstemii (2)(2)

�A ve B ABH genleri kan grup antijeni değil, transferaz isimli enzimleri kodlar.

�A antijeni: terminal KH; N-asetil-galaktozamin

�B antijeni: terminal KH; galaktoz

�O antijeni yok: O geni A ve B yokluğunda nonfonksiyone transferaz üretir.

Page � 7

TTipip 2 Pre2 Prekküürsrsöör Zincirr Zincir

Page � 8

H AntiH Antijjenen OluOluşşumuumu

Page � 9

A AntiA Antijjenen OluOluşşumuumu

Page � 10

B AntiB Antijjenen OluOluşşumuumu

Page � 11

ABO allellerABO alleller

Page � 12 12

ABO ABO KanKan Grup SGrup Siistemstemii

GenotGenotiip (Gen)p (Gen) FFenotenotiip (p (Kan Kan grubugrubu) )

Eritrositte Eritrositte antijenantijen

Plazmada antikorPlazmada antikor

AA1 1 AA1 1 , A, A1 1 AA22

AA22 AA22, A, A22 OO

AA1 1 (23(23--25%)25%)

AA2 2 (6(6--10%)10%)

AA11, (H), (H)

AA22, (H), (H)

antianti--B, antiB, anti--HH

AntiAnti--B, antiB, anti--AA11

BB, BOBB, BO B(8B(8--17%)17%) B,(H)B,(H) AntiAnti--A/AA/A11

AA11BB

AA22 BB

AA11B(3%)B(3%)

AA22B(1%)B(1%)

A,AA,A11,B,B

A,B,HA,B,H

AntiAnti--HH

AntiAnti--AA11

O,OO,O

H,hH,h

O(43O(43--50%)50%)

Oh BombayOh Bombay

HH

NoneNone

AntiAnti--A,A,--AA11,,--BB

AntiAnti--A,A,--AA11,,--B,B,--HH

Page � 13

ABO Kan GruplamaABO Kan Gruplama

�ABO kan gruplaması iki şekilde yapılır:

–Eritrositler A ve/veya B antijenlerinin varlığına göre tiplendirilir: forward (doğrudan) gruplama

–Serum/plazma anti-A ve/veya anti-B antikorlarının varlığı veya yokluğu için test edilir: revers (dolaylı) gruplama

Page � 14ABO & Rh(D) 14

ABO Kan Gruplama

�Forward Gruplama

– Yıkanmış hücrelerle Test:

– Monoklonal Anti-A

– Monoklonal Anti-B

– Inert kontrol

�Aglütination pozitif sonuç

�Reverse Gruplama

– Plazma/serum test:

– Bilinen A1 hücreleri

– Bilinen B hücreleri

– Bilinen O hücreleri

– ? Bilinen A2 hücreler

�Reaksiyonlar forward dan daha zayıf

Page � 15

YYööntemlerntemler

1. Hemaglütinasyon a. Lam (Slide) Yöntemib. Tüp Yöntemic. Jel Santrifügasyon Yöntemid. Mikroplak Yöntemi2. RİA (Radio immun assay)3. EİA (Enzim immun assay)4. PCR, (polimerase chain reaction)

Page � 16

�Testler iki kişi tarafından ayrı ayrı çalışılır ve ayrıkayıt yapılır.

�Sonuçlar uyumlu çıkarsa hasta kaydına girilir.

�Varsa eski kayıtlarla karşılaştırılır

�RhD negatif sonuçlar mutlaka tekrar çalışılır.

Kan GruplamaKan Gruplama

Page � 17

Page � 18

PatientPatient AntiAnti--AA AntiAnti--BB AA11 CellsCells B CellsB Cells

11 4+4+ 1+1+ 00 4+4+

22 00 4+4+ 1+1+ 00

33 4+4+ 4+4+ 1+1+ 00

44 00 3+3+ 00 00

Forward ve Reverse gruplamaForward ve Reverse gruplama

Page � 19

Page � 20

Page � 21

Rh Kan grubuRh Kan grubu

�ABO dan sonra 2. önemli kan grup sistemi

�İki Rh geni RHD ve RHCE

�RHDM..D antijeni

�RHCEM4 antijen kombinasyonu

– ce, Ce, cE, CE

– Allel genler

– D+MMRHD + RHCE

– D-MM.silinmiş RHCE

Page � 22

RRh h kan grup sistemikan grup sistemi

• 1940da by Landsteiner & Wienertarafından bulundu.

• En komplex eritrosit antijen sistemi; kromozom 1 üzerinde lokalize

• Eritrosit yüzeyinde bulunur-membrana entegre

• primer antijen � bulunursa Rh (+)

• Serumda doğal antikoru bulunmaz

• Immün antikor (IgG) oluşur

Page � 23

Rh Rh Kan Kan GrupGruplamalama

Farklı teknikler –

Tüp, Mikroplak, Jel teknolojisi, Otomasyon

� İki anti-D kullanılır

� Negatif sonuçlar doğrulanır

�Hücreler DAT pozitif bulunursa yorumlanır

Page � 24

Page � 25

Page � 26

Eritrosit Tiplendirmede Sorunlar Eritrosit Tiplendirmede Sorunlar

� Zayıf reaktan veya eksik antijenler

1. A ve B Subgrupları

2. Bazı hastalıklara bağlı antihen ekspresyonunda değişiklikler

3. Kimerizm

� Beklenmedik antijen reaksiyonları

1. Rulo formasyonu (globulin düzeyi yüksekliği)

2. Antikor kaplı eritrositler (+ DAT)

3. Poliaglütinasyon

4. Kazanılmış B antijeni

Page � 27

GGÜÇÜÇLLÜÜKLERKLER

�Forward gruplama sonucu revers testle “uyumsuz”çıktığında

�İki ayrı kişinin yaptığı test sonuçları aynıolmadığında

�Test sonucu hastanın daha önceki sonuçlarıyla uyuşmadığında

�Kanı stoğa koyma!

�Kesin sonuç çıkana kadar kullanma!

HatalarHatalar

Page � 29

TeTeknik Hatalarknik Hatalar� Kayıt hataları

– Tüpler yanlış etiketli

– Hasta yanlış tanımlı

– Kayıtların yanlış yorumlanması

– Kayıt transferinde hata

– Bilgisayara aktarırken hata

� Reajan veya ekipman hataları– SKT geçmiş reajan kullanımı

– Kalibre olmayan santrifüj kullanma

– Kontamine veya hemolizli reajan kullanma

– Saklama ısılarına uymama (yanlış ısı?)

� İşlem hataları– Reajan eklenmemesi

– Üretici talimatlarına uymama

– RBC süspansiyonlarının uygunsuz konsantrasyonları

– Hücre kümelerinin aglütinasyon değerlendirmesi öncesi resüspanse edilmemesi

Page � 30

PPııhthtıılalaşşma yetersizlikleri ma yetersizlikleri

�Pıhtılaşmayan Serum :

– Düşük platelet sayısı

– Antikoagulan tedavisi (Heparin, Aspirin, etc)

– Faktör yetersizlikleri

�Test öncesi tam olarak puhtılaşmayan serum aglüinasyonu taklit eden fibrin kümeleri oluşturmaya eğilimlidir

�Pıhtı oluşturmak için seruma Trombin eklenebilir veya, EDTA lı tüpler kullanılabilir

Page � 31

KonKontamintamine e öörnek veya reajanlar rnek veya reajanlar

�Örnek kontaminasyonu

– Tüpte mikrobiyal üreme

�Reajan kontaminasyonu

– Bakteriyel üreme bulutlu, renk değişikliği yapan görünüme neden olur.. Bu reajan kullanılmaz!

– Diğer reajanlarla kontamine reajanlar (dağıtımda tüp kenarlarına dokunulmaz)

– Tuzlu su düzenli değiştirilir

Page � 32

EEkipman sorunlarkipman sorunlarıı

�Rutin bakım yapılmalıdır (günlük, haftalık, aylık, vs)

�Cihaz kalibrasyonları yapılmalıdır (santrifüj, termometre, zaman ayarlayıcı)

– Kalibre olmayan santrifüjler hatalı sonuçlara yol açabilir

Page � 33

HemolHemoliziz

� Santrifüjden sonra serumda tespit edilir (kırmızı)

� Dökümente edilmelidir

� Neden olabilecekleri:

– Kompleman bağlama

• Anti-A, anti-B, anti-H, ve anti-Lea

– Bakteriyel kontaminasyon

Kırmızısüpernatan

ABO ABO uyumsuzluklaruyumsuzluklarıı

Page � 35

ABO ABO UyumsuzluUyumsuzluğğuu

�RBC lerle ilgili sorunlar

– Zayıf reaktan/Eksik antijenler

– Extra antijenler

– Karışık alan reaksiyonları

�Serum la ilgili sorunlar

– Zayıf reaktan/Eksik antikorlar

– Extra antikorlar

Page � 36

Grouping

Forward Reverse

Missing/Weak Extra Mixed Field Missing/Weak Extra

A/B Subgroup

Disease (cancer)

Acquired B

B(A) Phenotype

O Transfusion

Bone Marrow Transplant

YoungElderly

Immunocompromised

Cold Autoantibody

Anti-A1

Rouleaux

Cold Alloantibody

RouleauxMay cause all + reactions

FORWARD (DOFORWARD (DOĞĞRUDAN) RUDAN) GRUPLAMADA GGRUPLAMADA GÜÇÜÇLLÜÜKLER KLER

Page � 38

Eritrositle Eritrositle İİlgili lgili ProblemProblemlerler

�ABO forward gruplamada beklenmedik reaksiyonlar iki grupta görülebilir;

–zayıf veya eksik reaktivite

–ekstra reaktivite

– Karışık alan reaksiyonları

Page � 39

Forward GrupForward Gruplama:lama:Eksik veya ZayEksik veya Zayııff antiantijenlerjenler

�ABO Subgrupları

�Hastalık (lösemi, Hodgkin hastalığı)

AntiAnti--AA AntiAnti--BB A1 A1 hhüücrecre B B hhüücrecre

00 00 00 4+4+

• Forward ve reverse uyuşmuyor, (eksik antijen..)

O grubu A Grubu

Page � 40

A A SubgrupSubgruplarlarıı ((veyaveya B)B)

�A subgrupları tüm popülasyonda az oranda (B subgrupları daha nadir)

�Bu subgrupların eritrosit yüzeyinde daha az antijen bölgesi vardır

�Sonuçta daha zayıf (eksik) reaksiyon verirler

�Çözüm: A subgrupları için Anti-A1, Anti-H, ve anti-A,B ile test edilir

Page � 41

A1 ve A2 Eritrositler ve AntijenlerA1 ve A2 Eritrositler ve Antijenler

A1

Eritrosit

A2 EritrositKan grup A determinant sayısı

A1 810.000-1.170.000

A2 160.000-440.000

A3 40.600-118.000

Ax 7.500-10.500

Aend 2.100-2.700

Am 100-1.900

Ael 100-1.400

Ay 100-1.900

Page � 42

A subgruplarA subgruplarıı

Page � 43

Forward GrupForward Gruplamalama::Extra AntiExtra Antijjenenlerler

�Kazanılmış B

�B(A) fenotip

�Rulo

�Poliaglutinasyon

�Wharton’s Jelly

AntiAnti--AA AntiAnti--BB A1A1 BB

4+4+ 1+1+ 00 4+4+

ÖRNEK

Page � 44

KazanKazanıılmlmışış B B FFenotenotiippii

�A1 grubu kişilerde görülür:

– Alt GI yol hastalığı

– Kolon/rektum kanseri

– Intestinal obstrüksiyonu

– Gram negatif septisemi(örn. E. coli)

Page � 45

KazanKazanıılmlmışış BB

� Bakteriler (E. coli) deasetile eden enzim ile A KH etkiler M.

A GrubuKişi

N-acetyl

galactosamine

Kazan.B Fenotipi

Bakteriyel enzim asetil grubunu koparır

Galactozamin D-

galactose (Grup B)

a benzer

Page � 46

KazanKazanıılmlmışış BB ‘‘de de ÇöÇözzüümm

�Hastanın tanılarını gözden geçir: İnfeksiyon?

�Bazı üreticilerin anti-B reajanları kazanılmış B ile reaksiyon vermez

�Hasta serumunu kendi RBC leri ile test edilir.

– Hastanın kendi anti-B si eritrositler üzerindeki kazanılmış B antijeni ile reaksiyon vermez (otologtest

Page � 47

B(A) B(A) ffenotenotiippii

�Kazanılmış B ye benzer

�Hasta B Grubu ve belirgin extra A antijeni var

�B geni, H antijenine az miktarda A KH ı transfer eder

�Bazan belirli anti-A reajanları bu az miktardaki A antijenini tespit eder

�Çözüm: Başka üretici anti-A reajanı ile test tekrar edilir

Page � 48

““extraextra”” antiantijjenenlerin dilerin diğğer nedenlerier nedenleri

�Poliagglütinasyon – Kan grubu ne olursa olsun eritrositler human antiserumla agglütinasyon verir

– Bakteriyel enfeksiyona bağlı..

– Saklı T antijen ekspresyonu antiserumla reaksiyon verir

�Rulo– extra serum proteinleri

�Wharton Jeli – Kordon kanında bulunan bağdokusu kaynaklı jelatinöz substans yalancıaglütinasyon verebilir. (Hatırlatma: kordon kanında sadece forward gruplama yapılır)

– RBC yıka veya yeni kan örneği

Page � 49

Forward GrupForward Gruplamalama::KarKarışıışık Alank Alan AglutinaAglutinasyonusyonu

� İki farklı hücre popülasyonundan kaynaklanır

� Aglütine olmamış hücre zemininde aglütinatlar vardır

– O grubu transfüze edilmiş tüm gruplarda

– Kemik iliği/kök hücre alıcılarında

– A3 fenotipinde

AntiAnti--AA AntiAnti--BB A1 CellsA1 Cells B CellsB Cells

00 2+ mf2+ mf 4+4+ 00

Page � 50

Mixed Field Agglutination (Post transfusion)

~ (ABO Testing) Can be seen in A, B and AB individuals who have received O units. The antisera reacts with the patient’s RBCs, but not with the transfused O cells.

~ (Antibody screen) Can also be seen post transfusion if a person makes an antibody to antigen on donor cells; antibody agglutinates with donor cell, but not their on cells.

Forward GrupForward Gruplamalama::KarKarışıışık Alank Alan AglutinaAglutinasyonusyonu

Reverse GrupReverse Gruplamada lamada SorunlarSorunlar

Page � 52

Reverse GrupReverse Gruplamalama

�Reverse gruplamayı etkileyen

– Eksik veya zayıf antikorlar

– Extra antikorlar

Page � 53

Reverse GrupReverse Gruplamalama::Eksik veya ZayEksik veya Zayııf f antiantikorlarkorlar

�Yenidoğanlar

– Antikor oluşturmazlar (birkaç ay sonra 5 yaş pik)

�Yaşlılar

– Antikor aktivitesi zayıflar

�Hipogammaglobulinemi

– Az yada hiç antikor üretimi yok (örn. immunokompromize)

� Reverse gruplamada hiç aglütinasyon yoktur

Page � 54

ZayZayııf veya eksik antikorda f veya eksik antikorda çöçözzüümm

�Hastanın yaşı, tanısı

�Antikor reaksiyonunu artırmak için serum testini 15 dk inkübe et (Oda ısısı)

�Negatif ise otokontrol ile beraber

�“mini-cold” panel yap ve antikor reaktivitesini artır

Page � 55

Reverse GrupReverse Gruplamalama:Extra Anti:Extra Antikorlarkorlar

�Soğuk antikorlar (allo- veya auto-)

– Soğuk antikorlar anti-I, H, M, N, P, Lewis içerebilir

�Rulo

�A2 veya A2B kişilerde Anti-A1

Page � 56

SoSoğğuk antikorlar uk antikorlar

�Reverse gruplamada “extra” antikorlar gibi görünür

�Alloantikorlar yabancı eritositlere karşı gelişir

�

�Otoantikorlar kendi eritrositlerine karşı gelişir. Soğuk reaktif antikorlar oda ısısında ve daha düşük ısıda RBC lerle reaksiyon verir. Otokontrol pozitiftir.

– Çözüm: Tüp 37° ye ısıtılır ve yıkanır, agglütinasyon dağılır IgM bağları 2-ME ile de dağılır.

Page � 57

RulRuloo

�Hem extra antijen hem de extra antikorlarla oluşabilir

�“para dizisi” görünümü

�Artmış serum proteinine bağlı olarak (globulinler) agglütinasyon görünümü verir.

�SF ile güçlü reaksiyon, 37°C de zayıf reaksiyon, AHG fazında hiç aglütinasyon yok

�Görüldüğü hastalıklar:– Multiple meloma

– Waldenstrom’s macroglobulinemia (WM)

– Hydroxyethyl starch (HES), dextran, vs

Page � 58

RRulo ulo çöçözzüümmüü

�Proteinler uzaklaştırılır!

�forward gruplamada sorun varsa, hücreler yıkanır ve test tekrarlanır

�reverse gruplamada sorun varsa, serum fizyolojik tekniği uygula– Hücreler (reajan) and serum (hasta) santrifüj edilir antijen

ve antikor reaksiyonu aranır (varsa)

– Serum ayrılır eş volümde SF eklenir (hücreleri ayırır)

– Tüp karıştırılır, santrifüj edilir ve tekrar incelenir (makro ve mikro)

Page � 59

AntiAnti--AA11

�Bazan A2 (veya A2B) kişiler anti-A1 antikor üretir

�A2 (veya A2B) kişiler A1 kişilerden daha az antijenik bölgeye sahip

�Antikor genellikle doğal oluşan IgM

�A1 hücrelerle reaksiyon, A2 hücrelerle yok

Anti-A1

hastada

+ A1 hücre

+ A2 hücre

AGLÜTİNASYON

AGLÜTİNASYON YOK

Page � 60

antianti--AA11 uyumsuzluk uyumsuzluk çöçözzüümmüü

�2 basamak:

– Hasta RBC lerini Anti-A1 lektin ile tiplendir

– Reverse gruplamayı A1 yerine A2 hücrelerle tekrar et

– Her iki sonuçta aglütinasyon olmamalı

AntiAnti--AA AntiAnti--BB A1 A1 CellsCells

B B CellsCells

4+4+ 00 2+2+ 4+4+

Page � 61

DiDiğğererOO

�Bombay fenotipi (çok NADİR) hh geçişi ile

�Bu kişilerde hiç ABO antijeni yok, doğal oluşan anti-A, anti-B, anti-A,B, ve anti-H oluşturmazlar

�Temel olarak forward reaksiyon yok,

�Çözüm: anti-H lektin ile test (Bombay’da H yok ve reaksiyon vermez)

Page � 62

ABO rutABO rutiin testn testii

NE YAPILIR?

1. Eritrositler serum fizyolojikle 3-4x yıkanır ve tüm testler tekrar edilir, antikorlar için test edilir

2. Anti-A1 ve anti-A kullanılarak A subgruplarıiçin test yapılır

3. Anormal antikorları tespit için hücre panelleri kullanılır

Page � 63

Problemi bulmakO

�Forward gruplama (RBC)

�Reverse gruplama (serum)

�Her iki gruplamayıkarşılaştır (Forward & Reverse )

�Reversde <+2, forwardda <+3 reaksiyonlarda

�+4°C, 37°C de tekrar

�Normalden zayıf reaksiyon?

�Eksik veya ekstra reaksiyon?

Page � 64

ABO ABO UyumsuzluUyumsuzluğğunda unda çöçözzüüm m

�Hastanın öyküsü :

– Yaş

– Yakın zamanda transplantasyon

– Yakın zamanda transfüzyon

– Hastanın aldığı tedaviler

– DiğerM.

Page � 65

Rh D ekspresyonunda farklRh D ekspresyonunda farklııllııklar klar � D-Pozitif - çoğunluk “konvansiyonel”

� D-Negatif - 15%-17% European Ancestry

• 3%-7% Afrikalı, 0.5%-1% Asyalı

� Zayıf D - önceden “Du” ( 0.2%-1%)

• DAT testi ile tespit edilir

• Genel bilgi - anti-D oluşturmaz

� DEL - D negatif olarak gruplanır, anti-D adsorb ve elüsyonu

– Çoğu Asyalıda C+

� Parsiyel D – Önceden “mosaic”

– D-pozitif olarak gruplanır(bazıları AHG/IAT test gerektirir)

– anti-D - yapar “missing” RhD protein ile

� D epitopları Rhce proteinleri üzerinde

Page � 66

Rh D ekspresyonunda farklRh D ekspresyonunda farklııllııklar klar �Zayıf D

– D+ kişilerde yaklaşık 10.000-33.000 antijenik bölge

– Zayıf D de 200-10.000 (kantitatif varyasyon)

�Parsiyel D

– Kalitatif varyasyon

– Farklı epitoplarda mozaik, 1 veya birkaç epitop eksik

– Monoklonal antikorlarla tespit edilebilir

Page � 67

Rh D ekspresyonunda farklRh D ekspresyonunda farklııllııklar klar

• Hem zayıf, hem parsiyel moleküler düzeyde tanımlanabilir

• Rh proteinlerinde aminoasit değişikliklerini kodlayan nükleotid mutasyonları D varyantların sık nedenidir.

• Substitüsyon transmembranöz veya intrasellüler zayıf D?

• Substitüsyon ekstrasellüler parsiyel D?

Page � 68

Rh gruplamaRh gruplama

Page � 69

Ulusal Kan ve Kan Ulusal Kan ve Kan üürrüünleri Rehberinleri Rehberi

� F2.1.6 Grup Uyumsuzluklarına yaklaşım

� g.Tek bir anti-D miyarı kullanılarak zayıf reaktivite saptandığında hastabuna dayanılarak RhD (+) kabul edilmemelidir.

� İki ayrı monoklonal anti-D miyarı kullanılarak (IgG ve IgM) belirgin D + sonuç almadıkça hastanın D (-) olarak kabul edilmesi daha güvenlidir

� D gruplaması yapılan hastalarda kategori D-VI saptayan miyarlar kullanılmamalıdır. Bu gruplar anti-D üretir

� Bağışçıda kategori D-VI saptayan miyarlar kullanılmalıdır

� Parsiyel D hastalar RhD negatif

� Parsiyel D bağışçı RhD pozitif

Page � 70

Ulusal Kan ve Kan Ulusal Kan ve Kan üürrüünleri Rehberinleri Rehberi

� F2.1.6 Grup Uyumsuzluklarına yaklaşım

b) A ve B grup varyantların saptanmasında anti-AB, lektin A1, lektin-H, A2 hücresi, ve anti-A ve anti-B ile absorbsiyon, elüsyon çalışmalarının faydası vardır.

Zayıf A, B antijenlerin saptanması zordur ve bu yüzden bu hastaların transfüzyonunda O grubu eritrositlerin kullanılması daha uygundur.

Page � 71

DDİİKKATKKATİİNNİİZ Z İİÇÇİİN N TETEŞŞEKKEKKÜÜR EDERR EDERİİMM