INTRODUCCIÓN

Estructura tridimensional de la hemoglobina. La animación corresponde a la transición conformacional entre las formas oxigenada y desoxigenada.

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos. El nombre proteína proviene de la palabra griega πρώτα ("prota"), que significa "lo primero" o del dios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar.

Las proteínas desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan: estructural (colágeno y queratina), reguladora (insulina y hormona del crecimiento), transportadora (hemoglobina), defensiva (anticuerpos), enzimática, contráctil (actina y miosina).

Las proteínas de todo ser vivo están determinadas mayoritariamente por su genética (con excepción de algunos péptidos antimicrobianos de síntesis no ribosomal), es decir, la información genética determina en gran medida qué proteínas tiene una célula, un tejido y un organismo.

Las proteínas se sintetizan dependiendo de cómo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a señales o factores externos. El conjunto de las proteínas expresadas en una circunstancia determinada es denominado proteoma.

MARCO TEÓRICO

Proteína

Estructura tridimensional de la hemoglobina.

Características

Las proteínas son macromoléculas; son biopolímeros, es decir, están constituidas por gran número de unidades estructurales simples repetitivas (monómeros). Debido a su gran tamaño, cuando estas moléculas se dispersan en un disolvente adecuado, forman siempre dispersiones coloidales, con características que las diferencian de las disoluciones de moléculas más pequeñas.

Por hidrólisis, las moléculas de proteína se escinden en numerosos compuestos relativamente simples, de masa pequeña, que son las unidades fundamentales constituyentes de la macromolécula. Estas unidades son los aminoácidos, de los cuales existen veinte especies diferentes y que se unen entre sí mediante enlaces peptídicos. Cientos y miles de estos aminoácidos pueden participar en la formación de la gran molécula polimérica de una proteína.

Todas las proteínas tienen carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno y casi todas poseen también azufre. Si bien hay ligeras variaciones en diferentes proteínas, el contenido de nitrógeno representa, por término medio, 16% de la masa total de la molécula; es decir, cada 6,25 g de proteína contienen 1 g de N. El factor 6,25 se utiliza para estimar la cantidad de proteína existente en una muestra a partir de la medición de N de la misma.

La síntesis proteica es un proceso complejo cumplido por las células según las directrices de la información suministrada por los genes.

Las proteínas son largas cadenas de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos entre el grupo carboxilo (-COOH) y el grupo amino (-NH2) de residuos de aminoácido adyacentes. La secuencia de aminoácidos en una

proteína está codificada en su gen (una porción de ADN) mediante el código genético. Aunque este código genético especifica los 20 aminoácidos "estándar" más la selenocisteína y —en ciertos Archaea— la pirrolisina, los residuos en una proteína sufren a veces modificaciones químicas en la modificación postraduccional: antes de que la proteína sea funcional en la célula, o como parte de mecanismos de control. Las proteínas también pueden trabajar juntas para cumplir una función particular, a menudo asociándose para formar complejos proteicos estables.

Funciones

Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas. Bastan algunos ejemplos para dar idea de la variedad y trascendencia de las funciones que desempeñan. Son proteínas:

casi todas las enzimas, catalizadores de reacciones químicas en organismos vivientes;

muchas hormonas, reguladores de actividades celulares; la hemoglobina y otras moléculas con funciones de transporte en la

sangre; los anticuerpos, encargados de acciones de defensa natural contra

infecciones o agentes extraños; los receptores de las células, a los cuales se fijan moléculas capaces de

desencadenar una respuesta determinada; la actina y la miosina, responsables finales del acortamiento del músculo

durante la contracción; el colágeno, integrante de fibras altamente resistentes en tejidos de

sostén.

Estructura

Es la manera como se organiza una proteína para adquirir cierta forma. Presentan una disposición característica en condiciones fisiológicas, pero si se cambian estas condiciones como temperatura, pH, etc. pierde la conformación y su función, proceso denominado desnaturalización. La función depende de la conformación y ésta viene determinada por la secuencia de aminoácidos.

Para el estudio de la estructura es frecuente considerar una división en cuatro niveles de organización, aunque el cuarto no siempre está presente.

Conformaciones o niveles estructurales de la disposición tridimensional:

Estructura primaria. Estructura secundaria.

o Nivel de dominio. Estructura terciaria. Estructura cuaternaria.

A partir del nivel de dominio sólo las hay globulares.

Propiedades de las proteínas

Solubilidad: Se mantiene siempre y cuando los enlaces fuertes y débiles estén presentes. Si se aumenta la temperatura y el pH, se pierde la solubilidad.

Capacidad electrolítica: Se determina a través de la electroforesis, técnica analítica en la cual si las proteínas se trasladan al polo positivo es porque su molécula tiene carga negativa y viceversa.

Especificidad: Cada proteína tiene una función específica que está determinada por su estructura primaria.

Amortiguador de pH (conocido como efecto tampón): Actúan como amortiguadores de pH debido a su carácter anfótero, es decir, pueden comportarse como ácidos (aceptando electrones) o como bases (donando electrones).

Desnaturalización

Si en una disolución de proteínas se producen cambios de pH, alteraciones en la concentración, agitación molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de las proteínas puede verse reducida hasta el

punto de producirse su precipitación. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformación globular se rompen y la proteína adopta la conformación filamentosa. De este modo, la capa de moléculas de agua no recubre completamente a las moléculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre sí dando lugar a grandes partículas que precipitan. Además, sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el centro activo. Las proteínas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseñadas, en resumen, no son funcionales.

Esta variación de la conformación se denomina desnaturalización. La desnaturalización no afecta a los enlaces peptídicos: al volver a las condiciones normales, puede darse el caso de que la proteína recupere la conformación primitiva, lo que se denomina renaturalización.

Ejemplos de desnaturalización son la leche cortada como consecuencia de la desnaturalización de la caseína, la precipitación de la clara de huevo al desnaturalizarse la ovoalbúmina por efecto del calor o la fijación de un peinado del cabello por efecto de calor sobre las queratinas del pelo.1

Clasificación

Según su forma

Fibrosas: presentan cadenas polipeptídicas largas y una estructura secundaria atípica. Son insolubles en agua y en disoluciones acuosas. Algunos ejemplos de estas son queratina, colágeno y fibrina. Globulares: se caracterizan por doblar sus cadenas en una forma esférica apretada o compacta dejando grupos hidrófobos hacia adentro de la proteína y grupos hidrófilos hacia afuera, lo que hace que sean solubles en disolventes polares como el agua. La mayoría de las enzimas, anticuerpos, algunas hormonas y proteínas de transporte, son ejemplos de proteínas globulares. Mixtas: posee una parte fibrilar (comúnmente en el centro de la proteína) y otra parte globular (en los extremos).

Según su composición química

Simples: su hidrólisis sólo produce aminoácidos. Ejemplos de estas son la insulina y el colágeno (globulares y fibrosas). Conjugadas o heteroproteínas: su hidrólisis produce aminoácidos y otras sustancias no proteicas llamadas grupo prostético.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

PREPARACION DE SOLUCIONES PROTEICAS PARA LA EJECUCION DE REACCIONES CUALITATIVAS

Proteína no diluida del huevo de gallina

Separar la clara de la yema de tres huevos frescos de gallina. Considerando que la masa de la clara de huevo, en promedio, es igual a 33g, se obtiene cerca de 100mL de solución no diluida de clara de huevo. Esta solución contiene 87% de agua, 1% de carbohidratos y 0.5% de sustancias minerales, el resto corresponde a proteínas. De esta manera la clara de huevo representa aproximadamente una solución al 10% de proteína.

Solución diluida de albúmina de huevo

La clara de un huevo de gallina, después de separarla de la yema, se bate bien y luego se mezcla (con agitación) en un matraz con un volumen de agua destilada 10 veces mayor. Filtrar la solución de albúmina a través de una gasa doble, un pedazo de algodón o un pedazo de tela previamente remojado en agua y colocarlas sobre el embudo. En el precipitado queda la globulina del huevo. Considerando que la concentración de albúmina en la clara de huevo constituye cerca del 6%, la solución diluida obtenida de albúmina de huevo será aproximadamente de 0.5%.

Proteínas de la carne

Colocar en un vaso 40 – 50g de carne molida desgrasada; añadir 80 a 100mL de solución de NaCl al 10% y dejar reposar la mezcla por 15 a 20 minutos agitando frecuentemente. Filtrar el liquido rojo a través de un papel filtro o de una gasa doble. Esta solución contiene fundamentalmente albúmina muscular y globulina.

Proteínas de la leche

A 50mL de leche fresca de establo, añadir un volumen igual de solución saturada de sulfato de amonio. Se forma un precipitado de globulina y caseína. Filtrar la solución de albúmina a través de un papel filtro.

Albúmina vegetal

Mezclar 25g de harina de trigo con 100mL de agua destilada. Agitar la mezcla durante una hora con la ayuda de un agitador magnético. Centrifugar la suspensión y luego filtrar el líquido sobrenadante a través de un papel filtro. La solución transparente filtrada contiene básicamente albúmina de los granos de trigo.

REACCIONES DE PRECIPITACION DE PROTEINAS

REACTIVOS

Sulfato de Amonio

Ácido Acético (1%, 10% y concentrado)

Cloruro de Sodio (saturado)

Hidróxido de Sodio (10%)

Ácido Nítrico (concentrado)

Ácido Sulfúrico (concentrado)

Ácido Tricloroacético (5%)

Ácido Sulfosalicílico (20%)

Sulfato de Cobre (5%)

Acetato de Plomo (5%)

Ácido Clorhídrico (5%)

MATERIALES

Tubos de ensayo.

Vasos de Precipitado.

Probetas.

Algodón

Bagueta.

Cocinilla Eléctrica.

Papel filtro.

Agitador magnético.

SEDIMENTACION DE PROTEINAS CON SULFATO DE AMONIO

En tubos de ensayo colocar 2mL de las soluciones proteicas preparadas y agregarle un volumen igual de sulfato de amonio (solución saturada) y agitar, aparecerá un precipitado, este se filtra y el filtrado se separa en dos. Una parte del filtrado se lleva a ebullición, a la otra parte se le agrega un exceso de sulfato de amonio sólido hasta que no se produzca precipitación.

COAGULACION DE PROTEINAS POR CALENTAMIENTO

Se colocan 2mL de las soluciones proteicas en 5 tubos, al primero se le somete a calentamiento, se observa la formación de un precipitado antes de que el liquido hierva. Al segundo se le agrega una gota de acido acético al 1% y se calienta produciendo también un precipitado. El tercer tubo se le agrega 0.5mL

de acido acético al 10% y se calienta, en este caso no se observara precipitado. Al cuarto tubo se le agrega 0.5mL de acido acético al 10% y algunas gotas de solución saturada de NaCl y se calienta observándose un precipitado. Al quinto tubo se le agrega 0.5mL de NaOH y se calienta no formándose ningún precipitado.

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON ACIDOS CONCENTRADOS

En tres tubos de ensayo secos se colocan 2mL de acido nítrico, sulfúrico y clorhídrico concentrados. Luego, después de inclinar los tubos con los ácidos concentrados, se agregan cuidadosamente 0.5mL de la solución proteica, de tal manera no se mezcle con el acido concentrado, en la zona de contacto se forma un precipitado de proteína blanco amorfo.

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON ACIDOS ORGANICOS

En dos tubos se colocan 2mL de solución proteica, al primero se le agrega unas gotas de acido tricloroacetico al 5% y al otro varias gotas de acido sulfosalicilico al 20% observándose la formación de precipitados.

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON METALES PESADOS

En dos tubos de ensayo se colocan 2mL de las soluciones proteicas, se les agrega lentamente y con agitación a uno de los tubos una solución de sulfato de cobre y al otro una solución de acetato de plomo. En ambos se produce una precipitación.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

SEDIMENTACION DE PROTEINAS CON SULFATO DE AMONIO

Cuando se le agrega una solución saturada de sulfato de amonio las globulinas presentes precipitan.El precipitado es la sedimentación de las “globulina” las cuales precipitan con una semi-saturación de la sal de sulfato de amonio. Se observo la precipitación de las proteínas por efecto de una sal neutra (sulfato de amonio), con esta sal precipitan todas las soluciones proteicas. La cantidad del precipitado depende de la cantidad y del tipo de proteína globular que presenta así como de la concentración de la sal usada. Así pues con sales semi-saturadas o saturadas, las primeras proteínas en precipitar son las globulinas

Para las proteínas filtradas después de la precipitación se observó la reversibilidad de la desnaturalización usando sales neutras y comparándola con la desnaturalización por calentamiento el cual es un proceso irreversible. También se vio el efecto de la concentración de la sal sobre la precipitación de las proteínas, llegando a la conclusión que las albúminas necesitan una concentración mayor de sal (sulfato de amonio) para precipitar en comparación con las globulinas. Se observó en función a la cantidad de proteínas globulares en el huevo, la leche y la harina, observando, que le huevo tiene mayor cantidad de proteínas globulares en comparación con la leche y la harina, siendo esta ultima la que tiene menor cantidad de este tipo de proteínas.

Precipitación por calentamiento

Precipitación con exceso de sulfato de amonio

Comparación en harina de trigo albúmina vs. globulina

Comparación en el huevo albúmina vs. globulina

Comparación en la leche albúmina vs. globulina

COAGULACION DE PROTEINAS POR CALENTAMIENTO

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrófobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.

En general las proteínas precipitan por calentamiento, esta precipitación es mas completa y fácil en medio débilmente acido, cercano al punto isoeléctrico, en un medio neutro y fuertemente acido la precipitación es mas abundante, por el contrario en medio alcalino la precipitación no se produce. Para la harina de trigo

La figura muestra los tres primeros ensayos

En la figura se muestran los 2 últimos ensayos

Para la muestra de leche

La figura muestra los tres primeros ensayos

En la figura se muestran los 2 últimos ensayos

Para la proteína del huevo

La figura muestra los tres primeros ensayos

En la figura se muestran los 2 últimos ensayos

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON ACIDOS CONCENTRADOS

Para el caso de la harina de trigo

Para el caso del huevo

Para el caso de la leche

Podemos observar de las imágenes la formación de un precipitado blanco en la interfase entre la solución del ácido y la solución de la proteína, esto evidencia la desnaturalización de la proteína la cual se ve precipitada por acción del acido al alterar el pH de su estado nativo, esta desnaturalización es irreversible debido a que los ácidos minerales son agentes fuertemente deshidratantes, lo que produce una alteración en la estructura tridimensional de la proteína e incluso su destrucción. Al usar el ácido sulfúrico se debe de tener mucho cuidado ya que este ácido deshidrata fuerte y rápidamente a la proteína no pudiendo observarse la formación del precipitado blanco. En el caso de la adición de ácido nítrico los grupos amino libres de las proteínas reaccionan con el ácido nítrico liberando nitrógeno, sustituyéndolo con grupos hidroxilo y dando como resultado proteínas desaminadas. Con esto se destruye la estructura de la proteína permitiendo que ésta precipite. El ácido sulfúrico es un ácido fuerte y al disminuir el pH de la solución se forman grupos protonados y por lo tanto con cargas que ocasionan repulsión entre varias partes de la proteína de manera que ésta pierde su estructura.

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON ÁCIDOS ORGÁNICOS

La precipitación con ácidos orgánicos débiles se da por la capacidad de estos ácidos de neutralizar la carga de la proteína además hay diferente solubilidad de las proteínas en solución acuosa a solventes orgánicos como ácido tricloroacético y el ácido sulfosalicílico estos disminuyen constante dieléctrica del medio aumentando la atracción entre moléculas cargadas y disminuyendo su interacción con el agua haciendo que la solubilidad de la proteína disminuya: los grupos hidrofóbicos son “protegidos” por solvente y grupos iónicos son dominantes provocando la desnaturalización la perdida de actividad de la proteína y la precipitación de la misma.

Proteína del huevo al lado izquierdo y proteína de la harina de trigo al lado derecho.

Proteina de la leche

PRECIPITACION DE PROTEINAS CON METALES PESADOS

Este método de desnaturalización se basa en la unión de la molécula proteica de los cationes de metales pesados (Pb, Zn, Cu, Hg) con los grupos funcionales de los radicales laterales de los restos de los aminoácidos. Estos cationes por efecto de la fuerza iónica destruyen la estructura espacial de la proteína y la precipitan. Al añadir un exceso de metales pesados se produce la disolución del precipitado formado inicialmente debido a la absorción del ión metálico y la adquisición de una carga positiva de la molécula proteica.

Este proceso se justifica en un fenómeno de absorción del metal de transición a la superficie de la molécula proteica formando durante la solvatación de esta una doble capa eléctrica y transfiriendo de esta manera la carga eléctrica desde el metal a la molécula proteica.

Precipitado de color celeste con sulfato de cobre.

Precipitado blanco con acetato de plomo

CONCLUSIONES

Las globulinas son proteínas insolubles a bajas concentraciones de sales las albúminas son solubles a estas condiciones pero al aumentar la concentración de la sal se vuelven insolubles.

La solubilidad depende del pH. La distribución de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos en la superficie de la proteína determina solubilidad, un solvente acuoso puede manipularse para alterar solubilidad de las proteínas de interés: fuerza iónica, pH, solventes orgánicos miscibles, otros solutos.

Existe una diferente sensibilidad de las proteínas al calor. Seria bueno determinar a que temperatura se desnaturalizan las proteínas (pérdida de actividad).

Sal más comúnmente usada: sulfato de amonio esta es altamente soluble en agua, muy pura, barata, no tiene efecto sobre la estructura de las proteínas. Después de la adición de sal, proteínas precipitadas pueden regresar a su estado nativo por redisolución. Ademas las proteínas solubles pueden precipitarse con una concentración mayor de la misma sal. La Proteína precipitada es “salted out”. La sal retira la capa de moléculas de agua que rodea a la superficie de la proteína, los grupos hidrofóbicos permiten que la proteína se agregue y precipite.

Diferente solubilidad de las proteínas en ácidos minerales y en ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos disminuye constante dieléctrica del medio y aumentan la atracción entre moléculas cargadas disminuyendo su interacción con el agua. La solubilidad de la proteína disminuye los grupos hidrofóbicos son “protegidos” por el solvente y grupos iónicos son dominantes.

BIBLIOGRAFIA

http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://www.monografias.com/trabajos15/proteinas/proteinas.shtml

http://www.ehu.es/biomoleculas/proteinas/desnaturalizacion.htm

http://www.aula21.net/Nutriweb/proteinas.htm

CUESTIONARIO

Explicar desde el punto de vista quimico los fenomenos de desnaturalizacion y renaturalizacion.

La desnaturalización consiste en descenso de la solubilidad y de la actividad biológica de la molécula protéica debido a una fluctuación muy limitada de la temperatura, el pH y la fuerza iónica. La desnaturalización consiste en el cambio de la conformación espacial (Estereoquímica) de la estructura nativa plegada característica de las cadenas polipetídicas originando una conformación de cadena libremente ondulada. La renaturalización es el proceso en el que estructura proteica desnaturalizada regresa a su forma nativa , sin perder sus propiedades caracterísiticas y sin desarrollar una actividad biólogica que no se hallase ya presente en la molécula original, indicando, que la secuencia de los aminoácidos en la cadena polipétidica contiene la información requerida para especificar su conformación plegada nativa.

¿Cómo influyen las sales diluidas y concentradas sobre la solubilidad de las proteinas?

La concentración de una sal esta estrechamente relacionada con la fuerza iónica de este, la cual constituye una medida de la actividad asi como del número de cargas positivas y negativas aportados por la sal (cationes y aniones), el efecto de la prescipitación por sales o precipitación por salado esta dado por el cambio de tendencia a la ionización de los grupos R disociables de la proteína. Por tanto a medida que aumenta la fuerza iónica (aumento de la concentración de la sal) la solubilidad de la proteina comienza a disminuir llegando a un punto incluso en el que la proteina pueda estar casi completamente precipitada.

¿Por qué precipitan las proteinas por acción de los metales pesados?

Este proceso se justifica en un fenómeno particular de la adsorción del metal (La quimisorción) sucede cuando un enlace químico entre los restos de la proteína desnaturalizada y el metal, ocurre un intercambio de electrones formando un enlace definido esto es producto de formación durante la solvatación de una doble capa eléctrica y transfiriendo de esta manera la densidad eléctrica desde el metal a la molécula proteica. El grado de intercambio y lo simétrico que sea dependen de los materiales involucrados. A menudo hay un paralelismo con las situaciones encontradas en química de coordinación.