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HERRAMIENTAS DIAGNOSTICAS EN LA ASPERGILOSIS INVASIVA. La importancia de un diagnóstico precoz.

Coordinadora: Dra. Ana Laura Barloco

Diagnóstico convencional de Aspergilosis invasora.

Dra. Yerizada Rodriguez

Marcadores serológicos

Dra. Ana Laura Barloco

Nuevas herramientas diagnósticas

Dra. Paulette Legarraga

Importancia del diagnóstico precoz

Dra. Cecilia Guillermo

HERRAMIENTAS DIAGNOSTICAS EN LA

ASPERGILOSIS INVASIVA. DIAGNOSTICO MICOLOGICO

CONVENCIONAL

DRA. YERIZADA RODRIGUEZ

ASISTENTE DPTO. LABORATORIO PATOLOGÍA CLÍNICA

HOSPITAL DE CLÍNICAS

Enfermedad fúngica invasora por hongos filamentosos.

Infección sistémica causada por hongos filamentosos oportunistas.

Etiología: Aspergillus spp.

Fusarium spp.

Scedosporium spp.

Mucorales

Rev Iberoam Micol. 2014;31(4): 219-228.

Aspergilosis invasora

IMPORTANCIA

Elevada morbimortalidad en población inmunodeprimida.

Consumo de recursos en prevención, diagnóstico y tratamiento

Gasto sanitario mayor, estancia hospitalaria prolongada.



Dificultades en diagnóstico temprano.




Estudio micológico directo de baja sensibilidad y diagnóstico tardío.





Baja especificidad de las manifestaciones clínicas.





Baja especificidad de las manifestaciones clínicas.

Inexistencia de hallazgos imagenológicos patognomónicos.

Principales factores de riesgo para Aspergilosis invasora

Ruiz-Camps, Jarque. Rev Iberoam Micol 2014; 31(4): 249-254

Diagnóstico de Aspergilosis invasiva

clínico histológico

micológico

paciente

Imagenológico

• Grupo de Consenso EORTC (Grupo Colaborativo de Infecciónes Fúngicas Invasoras de la Organización Europea para la Investigación y tratamiento del Cancer )

• y NIAID MSG (Instituto Nacional de Alergias y

Enfermedades Infecciosas de E.U.A/Grupo de Estudio de Micosis)

• Pacientes inmunodeprimidos con cáncer y receptores de trasplantes de progenitores hematopoyéticos:

Factores predisponentes en el hospedero.

Elementos clínicos y radiológicos.

Hallazgos de laboratorio.

• Estos factores permitirán clasificar estas infecciones como: probadas, probables o posibles.

Criterios de la EORTC/MSG para diagnóstico de enfermedad fúngica invasora DEMOSTRADA, excepto micosis endémicas.

Criterios de la EORTC/MSG para diagnóstico de enfermedad fúngica invasora PROBABLE Y POSIBLE, excepto micosis endémicas.

Probable: requiere la presencia de un factor del huésped, un criterio clínico y uno micológico. Posible : aquellos pacientes con criterio micológico ausente.

Diagnóstico de Aspergilosis invasiva

clínico histológico

micológico

paciente

Imagenológico

Diagnóstico convencional de la infección fúngica invasiva.

Se basa en el aislamiento e identificación de hongos responsables empleando medios de cultivos idóneos y estudiar si es pertinente su sensibilidad a antifúngicos.

Muestras: representatividad recolección y transporte

Examen microscópico

Cultivo .

Identificación de especies


MUESTRAS : preanalítica.

• Representativas del foco de infección

• Correcta identificación

• Toma en momento adecuado en condiciones asépticas

• Contenedor estéril

• Volumen adecuado


• Lavado broncoalveolar (LBA)

De elección en micosis invasoras por hongos filamentosos del tracto respiratorio inferior.

En ID tiene un valor predictivo positivo >80%.





Alternativas: Esputo, Aspirado traqueal.

Valor diagnóstico en caso de patógenos primarios.

Valor diagnóstico presuntivo en caso de hongos oportunistas.







Valor diagnóstico presuntivo en caso de hongos oportunistas.

• Biopsia del tejido afectado.

Obtención por técnicas quirúrgicas.

Agregar cantidad de solución salina adecuada.


¿Hemocultivos?


Hemocultivos

Aspergilemias son excepcionales. Más frecuente en endocarditis por Aspergillus spp

Diagnóstico convencional de la infección fúngica invasiva. • Lavado broncoalveolar (LBA)




• Biopsia del tejido afectado.

Obtención por técnicas quirúrgicas.

Agregar cantidad de solución salina adecuada.

• Hemocultivos

Aspergilemias son excepcionales.


*BIOPSIAS

*LAVADO BRONCOALVEOLAR

*EXPECTORACIÓN

*ASPIRADO TRAQUEAL.

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IDENTIFICACIÓN !!!!


TRANSPORTE

En contenedor estéril a prueba de vertidos.

En menos de dos horas.

De no ser posible conservar a 4° C (heladera).


EXÁMEN MICROSCÓPICO DIRECTO

• Busca observar estructuras fúngicas características.

• Técnico dependiente.

• Baja sensibilidad.

• Su negatividad no excluye infección.

• No llega al diagnóstico de especie.


EXÁMEN MICROSCÓPICO DIRECTO

Se realiza: Ex. directo en fresco

Coloraciones: Gram

Giemsa

Gomori-Grocott

(tinciones argénticas)


Examen directo en fresco.

Filamentos de moho. 400x


Coloraciones

Tinción de Gram. 1000x


Coloraciones

Tinción de Giemsa. 1000x


Coloraciones

Tinción de Gomori-Grocott. 1000x


CULTIVOS

• En medio selectivo agar glucosado Sabouraud, suplementados con antibióticos o con antifúngicos (cicloheximida).

• Siembra por duplicado.

• Se incuban a 28° por 20 días.

• Indispensable para identificación a nivel de especie y eventual sensibilidad antifúngica.

Valor predictivo del cultivo según factor de riesgo del paciente. Perfect et al.


Identificación de hongos filamentosos a nivel de género y especie:

• Aspecto macroscópico de las colonias

• Examen microscópico de las colonias evidenciando estructuras de reproducción asexuada.

Cabeza Aspergilar

Aspergillus fumigatus.

Aspergillus niger.

Aspergillus flavus.

HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS EN LA ASPERGILOSIS INVASIVA

Marcadores serológicos

DRA. ANA LAURA BARLOCO

PROF. ADJ. DPTO. LABORATORIO DE PATOLOGÍA CLÍNICA

HOSPITAL DE CLINICAS

Aspergilosis Invasiva (AI)

◦ Aumento incidencia en los últimos años

◦ Aspergillus sp. es la principal causa de infecciones fúngicas en pacientes neutropénicos

◦ Presentan elevada morbimortalidad (S/T hemato-oncológicos, mortalidad 80% niños)

◦ Diagnóstico tardío (síntomas inespecíficos y de aparición tardía)

DIAGNÓSTICO PRECOZ/ANTICIPADO

TRATAMIENTO ADECUADO

Aspergilosis Invasiva (AI) FACTORES DE RIESGO PARA DESARROLLAR ASPERGILOSIS

◦ Neutropenia prolongada (más de 3 semanas) o disfunción neutrófila (enfermedad

granulomatosa crónica) ◦ Trasplante (mayor riesgo en médula ósea y pulmón) ◦ Enfermedades hematológicas malignas (sobre todo leucemias) ◦ Tratamiento con glucocorticoides (especialmente a dosis altas y prolongado) ◦ Tratamiento citotóxico ◦ Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

Perfect JR, Cox GM, Lee JY, Kauffman CA, de Repentigny L, Chapman SW, et al. The impact of culture isolation of Aspergillus species: a hospital-based survey of aspergillosis. Clin Infect Dis. 2001;33:1824-33

Aspergilosis Invasiva (AI) HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS

◦ DETERMINACION DE ANICUERPOS

Baja sensibilidad

◦ DETERMINACION DE ANTÍGENOS

Antígeno Galactomanano (GMN)

1,3-β-D Glucano

◦ BIOLOGÍA MOLECULAR PCR para Aspergillus sp.

MARCADORES SEROLÓGICOS - ANTÍGENOS

Diagnóstico de AI continua siendo dificultoso dada la baja SENSIBILIDAD de los métodos de diagnóstico MICOLOGICOS convencionales (cultivos)

European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) Mycoses Study Group (MSG)

INCLUYERON Antígeno Galactomanano (GMN)

1,3-β-D Glucano

Fueron incluidos como criterios micológicos indirectos en la definición de Infección Fúngica Invasiva

De Pauw, B.; Walsh, T.J.; Donnelly, J.P.; Stevens, D.A.; Edwards, J.E.; Calandra, T.; Pappas, P.G.; Maertens, J.; Lortholary, O.; Kauffman, C.A.; et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group. Clin. Infect. Dis. 2008, 46, 1813–1821

MARCADORES SEROLÓGICOS - ANTÍGENOS

Rabagliati B. y col. Enfermedad fúngica invasora en pacientes hemato-oncológicos y receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos bajo la perspectiva de los criterios diagnósticos EORTC/MSG. Rev Chil Infect 2009; 26 (3): 212-219Ricardo

ANTÍGENO GALACTOMANANO (GMN)

Ag. GMN

Es el mayor componente de la pared celular del género Aspergillus

Marcador específico

El principal exoantígeno liberado durante la invasión tisular

Es indicativo de la carga fúngica

Fibrosis Quística colonizados Aspergillus sp. GMN: Negativos

ANTÍGENO GALACTOMANANO (GMN) EN QUIÉN TIENE MAYOR VALOR DIAGNÓSTICO? PACIENTES NEUTROPÉNICOS ADULTOS DE ALTO RIESGO ◦ < 100 neutrófilos / mm3 > 3 semanas ◦ Trasplante de médula ósea no relacionado ◦ Enfermedad injerto contra huésped ◦ Corticosteroides > 2 mg/kg > 2 semanas ◦ Corticosteroides > 1mg/kg con neutropenia

Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284 Prentice y col.


UTILIDAD DIAGNÓSTICA RELATIVA EN

◦ Receptores de trasplante de órganos sólidos

◦ VIH/SIDA

◦ Enfermedad granulomatosa crónica

◦ Neoplasias de órgano sólido

◦ Grandes quemados

Br. J. Haematol. 2000; 110: 273-284 Prentice y col.


Pacientes con alto riesgo de desarrollar AI (Neoplasias hematológicas y Trasplante de precursores hematopoyeticos TPH)

SENSIBILDAD : 70%

Trasplante de Órganos Sólidos: SENSIBILIDAD 20%

Herbrecht R, Letscher-Bru V, Oprea C, et al. Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of invasive aspergillosis in cancer patients. J Clin Oncol 2002; 7:1898–906. Marr KA, Balajee SA, McLaughlin L, Tabouret M, Bentsen C, Walsh TJ. Detection of galactomannan antigenemia by enzyme immunoassay for the diagnosis of invasive aspergillosis: variables that affect performance. J Infect Dis 2004; 190:641–9. Maertens J, Glasmacher A, Selleslag D, et al. Evaluation of serum sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for circulating galactomannan during caspofungin therapy: results from the caspofungin invasive aspergillosis study. Clin Infect Dis 2005; 41:e9–14. Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J, Verbeken E, Verschakelen J, Boogaerts M. Use of circulating galactomannan screening for early diagnosis of invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients. J Infect Dis 2002; 186:1297–306. JA, Klont R, Masson C, et al. Optimization of the cutoff value for the Aspergillus double-sandwich enzyme immunoassay. Clin Infect Dis 2007; 44:1329–36. Pfeiffer CD, Fine JP, Safdar N. Diagnosis of invasive aspergillosis using a galactomannan assay: a meta-analysis. Clin Infect Dis 2006; 42:1417–27.


TECNICA DE LABORATORIO:

◦ Enzimo inmuno ensayo: Platelia®Aspergillus, Bio-Rad, Francia.

◦ Utiliza Anticuerpos monoclonales EBA- 2

◦ Diseñado para: Suero, LBA (LCR)

◦ La sensibilidad del método depende de la cinética de la antigenemia y de los niveles de corte elegidos.

◦ Se recomienda la determinación seriada de muestras (generalmente 2 semanales)


RESULTADO DE LABORATORIO:

◦ Se expresa como un índice

◦ I = Densidad Óptica (DO) de la muestra/DO cut off

◦ Punto de corte ha variado


PUNTOS DE CORTE ◦ Propuestos por el fabricante (Bio Rad): < 0.5 : NEGATIVO

≥ 0.5: POSITIVO

◦ La mayoría de autores coinciden GMN ≥ 0,5 en dos sueros consecutivos (aumenta la E y VPP)

◦ Si se realiza una única determinación serológica un índice de GMN ≥ 0,7 puede ser considerado como positivo

◦ Si la muestra es LBA el punto de corte de positividad del índice varía según autores de 0,5 a 1

En el caso de muestras respiratorias la especificidad de esta prueba se incrementaría al aumentar este índice


DETERMINACION GMN LBA (Punto de corte 0.5 – 1,5, 2, 3.. aún en revisión)

• Resultado BAJO ALTO VPN descarta API

• Valor ≥ 3 VPP cercano 100%

• Utilizando el punto de corte 0.5 tiene alta sensibilidad cercana 100% , disminuyendo Especificidad (aumento falsos positivos)

ANTÍGENO GALACTOMANANO (GMN) RECOMENDACIÓN • Determinaciones seriadas en suero • Semanalmente o 2 veces por semana • Curva para valorar la cinética GMN • No recomendado su uso con tratamiento o profilaxis antifúngica • Determinación el LBA • Cuando el médico clínico lo considere/depende de cada caso

clínico


DETERMINACIÓN DE GMN EN “LCR” De utilidad para el diagnóstico de Asprgilosis cerebral (88% Sensibilidad y un 96% de Especificidad) Chong,G.M.;Maertens,J.A.;Lagrou,K.;Driessen,G.J.;Cornelissen,J.J.;Rijnders,B.J.diagnosticperformance of galactomannan antigen testing in cerebrospinal fluid .

J. Clin. Microbiol. 2016, 54, 428–431

Punto de corte LCR: 0.8


La determinación de GMN debe ser realizado:

• por profesionales capacitados

• extremando los cuidados de asepsia (trabajo bajo campana, con guantes, etc.) para evitar que probables esporas de Aspergillus en las partículas de polvo del aire ambiental produzcan falsos positivos debido a la alta sensibilidad de la metodología ELISA.

• Teniendo en cuenta las condiciones pre analíticas :

Suero: Tubo primario, conservación adecuada

LBA: Tubo primario o mínima manipulación, conservación adecuada

ANTÍGENO GALACTOMANANO (GMN) FALSOS POSITIVOS La tasa de falsos positivos con Platelia®Aspergillus oscila entre el 8% y el 14%

• Reacción cruzada con antígenos de otros géneros: Penicillium, Paecilomyces, Alternaria, Geotrichum, Histoplasma y Candida

• Recién nacidos y población pediátrica

• reacción cruzada por bacteriemias (GP y GN)

• Colonización masiva intestinal por Aspergillus sp.

• Mucositis intensa

• Pacientes que están en tratamiento con piperacilina-tazobactam/amoxicilina-clavulánico

• Transfusiones sanguíneas y hemoderivados

• LBA uso de Plasmalyte como solución de lavado

Maertens J, Verhaegen J, Demuynck H, et al. Autopsy – controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunoabsorbent assay for hematological patients at risk for invasive aspergillosis. J Clin Microb 1999; 37: 3223-3228. Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, et al. Screening for circulating galactomannan as a non-invasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001; 97; 1604-1610. Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J, et al. Use of circulating galactomannan screening for early diagnosis of invasive aspergillosis in allogenic stem cell transplant recipients. J nfect Dis 2002; 186: 1297-1306.


La tasa de FALSOS NEGATIVOS con Platelia®Aspergillus oscila entre el 8% y el 10% de los enfermos con aspergilosis invasora documentada

MULTIFACTORIAL:

• Encapsulación del proceso infeccioso impediría la liberación de GMN

• El grado de angio invasión podría ser menor en pacientes no neutropénicos

• Formación de inmunocomplejos que impidan la detección de GMN en enfermos con anticuerpos frente a Aspergillus sp. (Comienzo dela infección/Baja inmunodepresión)

• El tratamiento previo antifúngico suprimiría la producción de galactomanano por el hongo

Maertens J, Verhaegen J, Demuynck H, et al. Autopsy – controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunoabsorbent assay for hematological patients at risk for invasive aspergillosis. J Clin Microb 1999; 37: 3223-3228.

Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, et al. Screening for circulating galactomannan as a non-invasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001; 97; 1604-1610.

Maertens J, Van Eldere J, Verhaegen J, et al. Use of circulating galactomannan screening for early diagnosis of invasive aspergillosis in allogenic stem cell transplant recipients. J nfect Dis 2002; 186: 1297-1306.


GMN es una herramienta útil en la monitorización de la terapéutica antifúngica

Los cambios radiológicos no son evidentes antes de las 2 semanas o mas • Un descenso GMN es buen indicador de éxito terapéutico • Un aumento GMN es buen indicador de fracaso terapéutico Determinación GMN es un marcador terapéutico: permite establecer el pronóstico de tratamiento de la AI puede servir para modificar el mismo o añadir una segunda droga antifúngica


Herramienta diagnóstica no invasiva, precoz:

• se adelanta a los síntomas

• a las imágenes radiológicas

• al tratamiento empírico antifúngico cuando aún no hay evidencia clínica de enfermedad

Maertens J, Verhaegen J, Demuynck H, et al. Autopsy – controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunoabsorbent assay for hematological patients at risk for invasive aspergillosis. J Clin Microb 1999; 37: 3223-3228. 34.

Maertens J, Verhaegen J, Lagrou K, et al. Screening for circulating galactomannan as a non-invasive diagnostic tool for invasive aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 2001; 97; 1604-1610. 35.

Sulahian A, Boutboul, Ribaud P, et al. Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of invasive aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4 year prospective study. Cancer 2001; 91: 311-318.


EN SUMA:

La detección de GMN en suero es un criterio muy útil para establecer el diagnóstico temprano de AI

Población adulta y pediátrica Población adecuada

Siempre que se respalde con datos clínicos, micológicos y radiológicos estudiando a los pacientes de alto riesgo de padecer AI

Extrayendo sueros bisemanalmente y continuando incluso durante el tratamiento antifúngico

No recomendado en pacientes con tratamiento o profilaxis con antifúngicos


EN SUMA

Monitoreo seriado con GMN (con valor de base elevado)

es una herramienta útil para la monitorización del tratamiento antifúngico y

tiene valor pronóstico


La instauración de un tratamiento anticipado permite reducir el número de pacientes que requieren tratamiento antifúngico

Disminuyendo los costos Posibles efectos secundarios por tratamiento antifúngico generalizado

Impacto beneficioso del diagnóstico temprano de AI

Disminuir la mortalidad (del 60% al 12%)

Utilizando conjuntamente la detección prospectiva de GMN , TAC , broncoscopia, cirugía y tratamiento antifúngico con azoles.

Caillot D, Casanovas O, Bernard A, et al. Improved management of invasive aspergillosis in neutropenic patients using early thoracic computed tomographic scan and surgery. J Clin Oncol 1997; 15: 139 – 147.

1,3-β-D Glucano (BDG)

Es un polisacárido constituyente de la pared celular de la mayoría

de los hongos de importancia médica

(MARCADOR PANFÚNGICO)


Los géneros que presentan mayor cantidad de 1,3-β-D Glucano en su pared son :

Candida, Fusarium, Pneumocystis jirovecii, Saccharomyces , Trichosporon , Sporothrix , Penicillium , y Aspergillus.

Excepción: Cryptococcus sp., Zygomycetes y Malassezia sp.

◦ Tienen cantidades menores de BDG, indetectables por los test utilizados.


Existen diferentes equipos colorimétricos:

• Fungitell (Glucatell) (Limulus polyhemus)

• FungiTec-G (Tachypleus tridentatus)

Muestra: suero o plasma

Frecuencia: 2-3 veces por semana


Resultados POSITIVOS de BDG indican “infección fúngica activa”

Estos valores no se ven afectados por colonización fúngica

Son de utilidad para el diagnóstico de AI

Candidiasis invasivas

Otras IFI

Alto VVN, valores por debajo de los puntos de corte destacarían una IFI

1,3-β-D Glucano (BDG) FALSOS POSITIVOS

Pacientes en hemodiálisis con celulosa

Tratamiento con inmunoglobulinas

Uso de β lactámicos

Infecciones por Streptococcus pneumoniae

FALSOS NEGATIVOS

Infecciones por Cryptococcus sp.

Mucormicosis


• Parece ser mas sensible que GM en la detección de AI

• Carece de especificidad micológica

• Requiere interpretación en conjunto con datos clínicos, radiológicos y microbiológicos

• No hay estudios que recomienden su uso como predictor de respuesta al tratamiento


(1 3)-β-D-glucano

Herramienta de screening para vigilancia de AI y otras infecciones fúngicas diseminadas, en poblaciones con factores de riesgo

Realización mas compleja que GM con un mayor costo

NUESTRO PAÍS

Determinación de GMN (suero y LBA)

INDICACIÓN

1,3-β-D Glucano (Paciente)

Estudio micológico convencional (Ex. directo y cultivo)

herramientas diagnosticas en la … · de elección en micosis invasoras por hongos filamentosos...

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