g.p.biologia molecular_1 2015-i.pdf

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

GUIA DE PRCTICA DE

BIOLOGIA MOLECULAR

I CICLO

PROFESOR COORDINADOR: Mg. EDITH RODRIGUEZ QUISPE

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CURSO DE BIOLOGIA MOLECULAR

PRCTICA N1

APLICACIN DEL MTODO CIENTFICO

I. OBJETIVOS:

Dar a conocer los lineamientos bsicos del mtodo cientfico y su aplicacin

Adiestrar al estudiante en el uso del mtodo cientfico para usarlos en el campo de la medicina.

II. MATERIALES:

Lectura (s )seleccionada (s) a partir de revista especializada.

III PROCEDIMIENTO.

- Hacer una descripcin de las diferentes etapas que comprende en mtodo cientfico.

- Leer el artculo seleccionado rpidamente para tener una idea general del mismo.

- Proceda a leer el artculo cuidadosamente y analizarlo con el propsito de establecer lo siguiente:

1. Reconocimiento del problema planteado

2. Formulacin de la hiptesis

3. Formulacin de objetivos y mtodos

4. Prueba de hiptesis mediante la experimentacin

5. Anlisis de resultados y conclusiones.

IV.RESULTADO

- Entregar el reporte del artculo evaluado considerando todos los pasos del mtodo cientfico.

- Artculo de la Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud

Pblica 2013 30(4):616-20.

- Artculo de la Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pblica 2008 25(2):250-52.

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PRACTICA N 2

RECONOCIMIENTO EN MATERIAL BIOLGICO DE LOS CARBOHIDRATOS

I. OBJETIVO

Reconocer las unidades monomricas y macromoleculares como componentes fundamentales de todos los seres

vivos.

II. MATERIALES POR MESA

Solucin de Glucosa al 1% (Monosacrido)

Solucin de fructuosa al 1%(Monosacrido)

Solucin de Sacarosa al 1% (Disacrido, azcar comn)

Solucin de Maltosa al 1% (Disacrido)

Solucin de Almidn al 1% (Polisacrido)

Solucin de Lugol

cido sulfrico concentrado

Reactivo de Molish

Reactivo de Benedict

Tubos de 13x100

Tubos de 16x150

Gradillas

Pipeta de vidrio de 5 ml. graduada

Pipetas Pasteur

Propipeta

Pinzas de madera

Mecheros, trpode, rejilla de asbesto

Guantes

Plumn marcador

III. PROCEDIMIENTO

3.1. Determinacin General de Glcidos (reaccin de Molish):

Los Glcidos o Hidratos de carbono por accin deshidratante del cido sulfrico originan compuestos derivados

del furfural, los que en presencia del alfa-naftol presente en el Reactivo de Molish, formarn un compuesto

coloreado.

Preparacin:

1. Colocar 1 ml. de cada solucin del glcido al 1% (Glucosa, Fructuosa, Sacarosa y Almidn) en un tubo de

13x100 y roturarlo.

2. Adicionar a cada tubo con glcido una (1) gota del Reactivo de Molish, agitar suavemente.

3. Agregar lentamente por la pared del tubo sin agitar 1 ml. de cido sulfrico concentrado.

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4. Observar la formacin de un anillo coloreado en la zona de interfase.

3.2. Determinacin de Azcares Reductores:

Un Azcar reductor al ser sometido a la accin del calor en el medio alcalino del Reactivo de Benedict, sufre

fenmenos de enolizacin y se fragmenta formando cuerpo fuertemente reductores para el cobre del Reactivo de

Benedict que se transforma en Ion cuproso (Cu+) el que reaccionar con los iones OH

- del medio para formar

Oxido cuproso (Cu2O) que es de color rojo ladrillo.

Preparacin:

1. Colocar 2 ml. de cada solucin de glcido al 1% (Glucosa, Fructuosa, Sacarosa, Maltosa y Almidn) en

un tubo de 16x150 mm y roturarlo.

2. Adicionar 1 ml. de Reactivo de Benedict a cada tubo.

3. Someter los tubos a ebullicin en agua hirviendo en un beaker por 5 minutos. Retirarlos con ayuda de una

pinza.

4. Observar la formacin del oxido cuproso que es color anaranjado hasta rojo ladrillo .

3.3. Determinacin de Almidn:

El yodo del Lugol es absorbido por el almidn a nivel de los enlaces glucosidicos y forma con l compuestos

complejos de color azul negruzco (yoduro de almidn).

Preparacin:

1. Colocar 2 ml. de solucin de Almidn al 1% en un tubo de 16x150 mm.

2. Adicionar 3 gotas de Lugol y agitar.

3. Observar la formacin de color (azul a negro si es positivo)

4. Calentar el tubo hasta perder el color y luego enfriar el tubo (interprete el proceso).

III. CUESTIONARIO:

1. Diga cules son las principales fuentes de carbohidratos en nuestra dieta y cul es el requerimiento diario?

2. Definir azcares reductor y no reductor, de 2 ejemplos.

1. Explique el significado de deficiencia de disacaridasa, de un ejemplo.

2. Establezca las diferencias estructurales y funcionales entre el almidn y el glucgeno.

IV. INFORME: Debe contener lo siguiente

Cartula; Introduccin,

Marco terico.

Resultados y fundamentos.

Conclusiones.

Cuestionario.

Referencias Bibliogrficas (estilo Vancouver)

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PRCTICA N 3

RECONOCIMIENTO EN MATERIAL BIOLGICO DE LPIDOS y PROTENAS

I. OBJETIVO

Reconocer que compuestos orgnicos como los lpidos y protenas son constituyentes importantes en todos los

seres vivos.


Aceite comestible

Albmina al 2%

Alcohol

Cloroformo

ter etlico

Solucin alcohlica de Sudam III

Hidrxido de sodio al 40%

Hidrxido de sodio al 20%

Sulfato de cobre al 1%

cido ntrico concentrado

Tinta roja

Tubos de 16 x 150 mm.

Tubos 13x100mm.

Beakers de 50ml

Mechero

Pipetas Pasteur de plstico de 2.5ml.

Guantes

Pinza de madera

Gradilla para tubos

V. PROCEDIMIENTO

1.DETERMINACIN DE LPIDOS

A. Solubilidad de los Lpidos

Los lpidos son insolubles en agua y solubles en solventes orgnicos como el ter y cloroformo.

Preparacin:

1. Colocar 1 ml. de Aceite en cada tubo de 13x100mm. y agitar.

2. Agregar:

En el tubo N 1: 1 ml de agua destilada

En el tubo N 2: 1 ml. de Alcohol

En el tubo N 3: 1 ml. de cloroformo

En el tubo N 4: 1 ml. de ter etlico

3. Agitar (con la misma intensidad a c/u) los tubos..

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4. Observarlos y determinar el grado de solubilidad de mayor a menor.

B. Solubilidad y Tincin en Sudam III

El Sudam III es un tinte diazo del tipo lisocromo altamente soluble en lpidos tindolos en la gama del

rojo cereza al anaranjado.

Preparacin:

1. Colocar 1 ml. de aceite comestible en dos tubos de 13x100 mm.

2. Adicionar 1 ml. de Sudam III a uno de ellos y al otro agregar 1ml de tinta roja, agitar dejar reposar .

3. Observar la coloracin producida en en la zona del aceite en uno de los tubos.

C. Saponificacin.

Las grasas reaccionan en caliente con hidrxido sdico o potsico descomponindose en glicerina y cidos

grasos. stos se combinan con iones sodio o potasio del hidrxido para dar jabones, que son por ende las sales

sdicas o potsicas de los cidos grasos.

1. Colocar en un tubo 16x150mm 2ml de aceite y 2ml de NaOH 20%.

2. Agitar enrgicamente y colocar el tubo en bao mara de 20 a 25 minutos.

3. Observe en el tubo las 3 fases: inferior que contiene la solucin de soda sobrante junto con glicerina

formada, Otra intermedia semislida que es el jabn formado y la superior lipdica de aceite inalterado.

II. DETERMINACIN DE PROTENAS

A. REACCIN DE BIURET Los compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos forman un complejo con las sales de cobre en un medio

fuertemente alcalino, dando un color prpura o violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los

iones del Cu+2 y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.

Preparacin:

1. Disponer de dos tubos 16x150mm y colocar 2ml. de la solucin de Albmina al 1% solucin Clara de huevo al

10% y una muestra de leche respectivamente.

2. Agregar 2ml. de la solucin de Hidrxido de sodio al 40% en cada tubo y mezclar.

3. Aadir 6 gotas de Sulfato de cobre al 1%.

4. Incubar a 37 C por 10 minutos.

5. Observar la coloracin producida e intrprete .

B. REACCIN XANTOPROTECA Se emplea para determinar la presencia de protenas solubles en una solucin, empleando cido ntrico

concentrado (HNO3). Las protenas que presentan aminocidos con anillos bencnicos, dan derivados

nitrogenados que se colorean de amarillo.

Preparacin:

1. Colocar 2 ml. de la solucin de Albmina al 1% o Clara de huevo al 10% en un tubo de 16x150

2. Adicionar 2 ml. de cido ntrico concentrado.

3. Observar la formacin de un precipitado blanco y hervir por 3 minutos.

4. Observar la coloracin producida.

VI. CUESTIONARIO:

1. Qu son los disolventes orgnicos?

2. Qu es la obesidad y la proteinuria

3. Qu supone la desnaturalizacin de una protena?

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V. INFORME: Cartula; Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.

Referencias Bibliogrficas (estilo Vancouver).

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PRCTICA N4

EXTRACCIN DE CIDO DESOXIRRIBONUCLEICO

I. OBJETIVOS:

Utilizar mtodo sencillo de extraccin de ADN a partir de clulas eucariotas poniendo de manifiesto su

estructura fibrilar.

Reconocer algunos componentes estructurales del ADN

II. MATERIALES:

- Muestras de origen vegetal y animal.

- NaCl 0,9% mantener a 4C

- Solucin de Lisis ( EDTA, SDS, NACl) mantenerla en frio.

- Acetato Na 3M

- Etanol 96 frio (mantener a C)

- Solucin salino citratada.

- ADN

- Reactivo de Bial

- Azul de metileno

- Tubos de ensayo 16x150mm.

- Beakers 20ml

- Beaker de 500ml

- Baguetas

- Mortero y piln

- Embudos

- Mechero.

- Pinzas de madera

- Pipetas 5ml

- Propipetas

- Gasas 10x15cm (3)

- Gradilla para tubos

- Tijera

- Pinza de madera.

III PROCEDIMIENTO.

A. Extraccin de ADN:

El ADN en las clulas eucariotas se encuentra en el ncleo disperso y muy replegado unido a protenas para formar

la cromatina. Para extraerlo se requiere homogenizar la muestra para proceder al lisado de membranas , la liberacin

de ADN el retiro de protenas asociadas a dicha macromolcula y su posterior obtencin bajo la forma de fibras .

1. Colocar en el mortero la muestra ( 3 fresas sin hojas y/o pltano 3 cm/ ) e incorporar 2 ml de NaCl

0.9% triturar por 1 minuto.

2. Aadir 10ml de la solucin de lisis y seguir triturando hasta obtener una masa homognea y semilquida

(aprox. 5minutos).

3. Incluir a la preparacin 2ml de acetato de sodio, mezclar, para luego dejar reposar por 5

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minutos.

4..Filtrar la preparacin en untubo de 16x150 con la ayuda de un embudo cubierto con gasa.

5. Transvasar 5-8ml d el filtrado a un beaker pequeo e incorporar 2 volmenes de etanol frio

por las paredes e introducir rpidamente una bagueta delgada y girar sobre su mismo eje a fin

para recuperar el ADN bajo la forma de fibras y colocarla en un tubo 16x150mm

conteniendo 1 ml de solucin salido citratada para su resuspencin y uso en la parte

experimental B.

6. Obtener ms fibra de ADN para reconocer el carcter cido, para ello dejar caer en las hebras

el colorante bsico como el azul de metileno,

B. Identificacin de Pentosas (reaccin de Bial) Las pentosas en solucin cida se deshidratan dando furfural que al reaccionar con el orcinol en presencia de FeCl3,

dan un producto de condensacin de color verde-azulado

1. Colocar 1 ml de ADN en un tubo 16x150 y en otro tubo de 16x150 colocar 1 ml agua destilada.

2. Agregar 3 ml de Reactivo de Bial a cada tubo; calentar cuidadosamente cada tubo en la llama de un mechero hasta

que la solucin comience a hervir.

3. Obsrvese y antese el color que aparece en cada tubo de ensayo.

IV.CUESTIONARIO

1. Cul es la composicin bsica del ADN?

2. Qu protena est asociada al ADN, cules son sus caractersticas?

3. Por qu el ADN absorbe luz UV a 260nm?

V. INFORME: Cartula; Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


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PRCTICA N5

MICROSCOPA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I. OBJETIVO

1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio compuesto.

2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.

II. MATERIALES

Microscopios

Lminas o portaobjetos

Laminillas cubreobjetos

Lminas artrpodo (Pulex irritans pulga Pediculus humanus piojo )

Suero fisiolgico

Pipeta Pasteur

1 Plumn indeleble

Papel lente

Hebra de algodn

Letra e

.

III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:

PARTE MECNICA

Tubo portalentes y cremallera

Tornillos macro y micromtrico

Revolver

Platina

Condensador

Brazo y Pie

PARTE PTICA

Ocular

Objetivos

Espejo

Lentes de condensador

Diafragma

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IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

2. Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma.

3. Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera

4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x y los objetivos de 5x, 10, 40, y

100x.

VII. PROCEDIMIENTO.

1. Preparar lminas hmedas (gota de suero fisiolgico mas la muestra) con hebra de algodn y letra e en

posicin de lectura .

2. Realizar las observaciones de dichas muestras con los objetivos 4x, 10x y 40x

3. Verificar con la lmina de la letra e, que los movimientos en estos sistemas son invertidos.

4. Observar con los objetivos de 4x y 10x la lmina de artrpodo fijadas.

VIII. CUESTIONARIO 1. Definir que es una imagen real y que una imagen virtual

2. Cules son las unidades de medida de longitud empleadas en microscopia?

3. Defina aumento y, resolucin del microscopio.

4. Cmo se define un microscopio electrnico y cules son sus aplicaciones mdicas.

IX. INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.

Observaciones (esquemas) con su descripcin.

Conclusiones.

Cuestionario.


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PRCTICA N 6

OBSERVACIONES CELULARES: PROCARIOTAS (BACTERIAS)

I. OBJETIVO

Existen dos tipos de clulas, las procariotas y las eucariotas, que difieren principalmente, en la organizacin de su

material gentico.

Las procariotas no poseen envoltura nuclear, su DNA circular ocupa dentro de la clula un lugar llamado nucleoide

y se halla en contacto directo con el protoplasma. , por ello nuestro objetivo es identificar distintos tipos de

bacterias .


Laminas con tincin de Gram de Escherichia coli (bacilos) y Streptococcus (cocos)

Lminas con Tincin de Ziehl Neesel de Mycobacterium

Yogurt natural

Palitos mondadientes

Solucin fisiolgica al 0.85%

Solucin Mercurio cromo

Solucin de Violeta de genciana

Colorante azul de metileno

Alcohol yodado

Lamina portaobjetos

Lamina cubreobjeto

Varilla de coloracin

Aceite de inmersin

Alcohol isoproplico

Papel lente

Depsito para eliminar lminas y laminillas.

Microscopios

Guantes

III.PROCEDIMIENTO

A.Observacin de Microflora bacteriana en cavidad bucal (Tincin de Vag)

1. Colocar una gota de solucin fisiolgica sobre una lmina.

2. Con el mondadientes obtener una muestra de sarro dental y esparcir con movimientos circulares

en la gota de solucin fisiolgica.

3. Secar a temperatura ambiente y luego cubrir con colorante Mercurio de cromo por 5 minutos.

4. Enjuagar y aplicar inmediatamente el colorante Violeta de genciana, dejar por 3 minutos, para

luego lavar con agua de cao.

5. Dejar secar la muestra preparada por accin del calor o al medio ambiente.

6. Observar la lmina con el objetivo de 100x con un gota de aceite de inmersin, e identifique

las diferentes formas bacterianas.

B. Observacin de Lactobacillus en una muestra de yogurt.

1. Colocar una gota de yogurt en el extremo de un portaobjetos y con otro extender el material .

2. Dejar secar, colocar una gota de azul de metileno, cubrir con laminilla.

Observar 40x y 100x.

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C . Observacin de Bacterias con Coloracines diferenciales como Gram y Ziehl Neelsen

1. Colocar sobre la lmina (E. coli) ya procesada con tincin de Gram , una gota de aceite de

inmersin. Observar con objetivo de 100x.

2. Colocar sobre la lmina (Streptococus sp.) ya procesada con tincin de Gram , una gota de aceite de

inmersin. Observar con objetivo de 100x.

3. Observacin de Mycobacterium turbeculosu s (tincin Ziehl Neelsen con el objetivo de 100x

V. CUESTIONARIO

1. Como es la estructura de una clula bacteriana.

2. Qu es la tincin o coloracin de Gram, como se realiza?

3. Describa a la bacteria que infectan el epitelio gstrico: Helicobacter pylori as como tambin a la

Pseudomona aeruginosa que se relaciona con la fibrosis qustica..

V.INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


BACTERIAS (Procarionte)

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PRCTICA N 7

OBSERVACIONES CELULAS EUCARIOTAS : animal, vegetal y fungi

II. OBJETIVO

Existen dos tipos de clulas, las procariotas y las eucariotas, que difieren principalmente, en la organizacin de su

material gentico.

En las eucariotas el DNA se asocia a protenas formando unas estructuras complejas denominadas cromosomas, los

cuales se encuentran dentro de un ncleo verdadero rodeado por una complicada envoltura nuclear, a travs de la

cual tiene lugar los procesos de intercambios ncleo-citoplasmticos,

- Poder visualizar clulas eucariotas unicelulares y pluricelulares.

- Poder diferenciar al microscopio las caractersticas que presentan la membrana celular de la clula animal y la pared

celular de la clula vegetal.


Muestra de clula epitelial de la mucosa bucal

Muestra de catfila de cebolla (Allium cepa)

Muestra de levadura (Saccharomyces)

Lmina de hongos: Penicillium y Aspergillus

Microscopios

Lminas portaobjetos


Bistur

Pinza de punta recta

Mechero de alcohol

Colorante Azul de metileno

Colorante Lugol

Alcohol yodado

Solucin fisiolgica (NaCl 0,9%)

Papel lente

III. PROCEDIMIENTO

A) OBSERVACION DE CELULA ANIMAL (RASPADO DE MUCOSA BUCAL)

1. Con la ayuda de un hisopo hacer un raspado de la mucosa bucal y colocar la muestra obtenida sobre

dos lminas .

2. Agregar a una lmina una gota de suero fisiolgico y a la otra aplicar una gota del colorante azul de

metileno.

3. Cubrir las preparaciones con una laminilla cubreobjeto.

4. Observar las preparaciones con objetivo de 10x y 40x.

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1- Membrana plasmtica, 2- Mitocondria,

3- Retculo endoplsmico rugoso, 4- Ribosomas,

5- Nucleolo, 6- Cromatina,

7- Citosol (=hialoplasma), 8- Diplosoma (=centriolos),

9- Retculo endoplsmico liso, 10- Aparato de Golgi

B) OBSERVACION DE CELULA VEGETAL (CATAFILA DE CEBOLLA)

1. Con ayuda de la pinza separe una de las catfila de la cebolla y extindalo sobre la lmina portaobjeto.

2. Con el bistur corte cuadritos de medio centmetro de catfila.

3. Disponga de dos lminas y coloque en ella un cuadradito de catfila.

4. Agregar a una lmina una gota de suero fisiolgico y en l otra una gota del colorante lugol

5. Cubrir las preparacines con una laminilla cubreobjeto.

6. Observar con objetivos de 10x y 40x precisar su membrana , pared y ncleo.

C) OBSERVACION DE UNA CELULA FUNGICA UNICELULAR Y PLURICELULAR C.1 En una lmina colocar dos gotas de cultivo de levadura (unicelulares) cubrir con laminilla y

observar a 40x .

C.2 Observar laminas fijadas de Penicillium y Aspergillus con el objetivo de 40x y 100x.

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Reconocer sus partes y precisar su pared celular. .

HONGOS PLURICELULARES

Aspergillius

Penicillium : 1. Conidiforo 2. Mtula 3. Filide 4. Esporas

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CUESTIONARIO.

1. Cmo se define a una clula epitelial, qu funcin tienen y cuantos tipos tejido epiteliales se reconocen.

2. Cules son los componentes y como est estructurado las paredes celulares de las bacterias, hongos y vegetales

3. Defina tincin vital y supravital

4. Qu es el lugol, cual es formula y cules son sus aplicaciones..

V.INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


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PRCTICA N 8

FENMENOS FISICOS DE LA CLULA: DIFUSION, OSMOSIS

I.OBJETIVO

Observar los fenmenos de difusin y smosis y su importancia para la clula.

II. MATERIALES

Lminas portaobjeto


Tubos de prueba

Microscopios

Lancetas hematolgicas

Solucin de NaCl al 0.4% (medio HIPOTONICO)

Solucin de NaCl al 0.9% (medio ISOTONICO)

Solucin de NaCl al 2.0% (medio HIPERTONICO)

Agua destilada

Alcohol 96C

Algodn estril

Pipetas Pasteur para cada solucin

Gradillas

Microscopios

Papel lente

Conteiner de descarte

III. PROCEDIMIENTO

A) Experimento con eritrocitos (clula animal):

1. Recepcionar tubos de prueba perfectamente rotulados conteniendo:

En el 1er. tubo: 3 ml. de Sol. NaCl al 0.4 %

En el 2do. tubo: 3ml. de Sol. NaCl al 0.9 %

En el 3er. tubo: 3ml. de Sol. NaCl al 2.0 %

1. Colocar 1 gota de cada concentracin de la sol.NaCl en lminas portaobjetos., previamente rotuladas.

2. Desinfectar el dedo cordial (tercero) con algodn humedecido en alcohol y realizar una puncin con

ayuda de la lanceta descartable, en el pulpejo del dedo.

3. Dejar caer 1 gotas de sangre a cada lmina y con la ayuda de la laminillas mezclar

suavemente, dejar en reposo por 2 minutos.

Colocar el cubreobjeto o laminilla y observar en el microscopio 40x..

B) Experimento con catfila de cebolla (clula vegetal):

1. Colocar 1 gota de cada concentracin de NaCl en lminas portaobjeto previamente rotulados.

2. Agregar a cada lmina trocitos de catafila de cebolla.

3. Dejar en reposo dos minutos, para luego cubrirla con una laminilla.

4. Observar al microscopio 10x y 40x

IV. RESULTADO:

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MUESTRA MEDIO FENMENO

VI. CUESTIONARIO

1. Qu tipo de difusin es la osmosis y qu es presin osmtica?.

2. Defina que es: Dilisis, Turgencia y Plasmlisis.

3. Qu significa homeostasis?

4. En qu consiste los fenmenos de crenacin y citlisis

V.INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


1

Sol. NaCl 0.4% + sangre

Hipotnica

2

Sol.NaCl 0.9 % + sangre

Isotnica

3

Sol. NaCl 2 % + sangre

Hipertnica

4

Sol, NaCl 0.4% + vegetal

Hipotnica

5

Sol. NaCl 0.9% + vegetal

Isotnica

6

Sol. NaCl 2% + vegetal

Hipertnica

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PRCTICA N 9

ESTUDIO DE ORGANELAS CELULARES: MITOCONDRIAS, LISOSOMAS, CLOROPLASTOS Y

PLASTIDOS.

I. OBJETIVO:

Mediante el empleo de la tcnica de coloracin vital se observarn las mitocondrias presentes slo en el

citoplasma de las clulas Eucariotas, que vienen a constituir las centrales de energa porque producen

y almacenan energa bajo la forma de ATP.

Las clulas tienen vesculas membranosas que contienen enzimas hidrolticas que permiten la digestin

intracelular y que corresponden a los lisosomas los cuales pueden pueden ser identificados en

protozoarios con una tincin vital.

Con el uso de suero fisiolgico observar plastidos en las clulas vegetales eucariticas, los que

contienen pigmentos y pueden sintetizar y acumular diversas sustancias, como los Leucoplastos que son

plastidos incoloros, los Amiloplastos que acumulan almidn, los Proteinoplastos que acumulan

protenas, los Elaioplastos que acumulan grasas y aceites esenciales. Los Cromoplastos son plastidos

coloreados como el Caroteno que presenta un pigmento de color naranja, el Licopeno de color rojo, la

Xantofila de color amarillo y los Cloroplastos que presentan un pigmento de color verde y cuya

funcin principal es realizar la fotosntesis.

II. MATERIALES POR MESA:

Muestra de:

Clulas de epitelio bucal

Hoja de Elodea (Cloroplastos)

Aj amarillo (Xantofila)

Zanahoria (caroteno)

Papa (Amiloplastos)

Betarraga (Antocianina)

Cultivo de protozoarios (observacin de lisosomas)

Microscopios.

Bistur

Pinza en punta

Laminas y laminillas

Colorante Rojo neutro

Solucin Verde Janus 1/10,000

Colorante Lugol

Hisopos

Mecheros de alcohol

Guantes

III. PROCEDIMIENTO:

A) OBSERVACION DE MITOCONDRIA EN EPITELIO BUCAL:

1. Con una lmina limpia y mediante un raspado suave obtener una muestra de la mucosa bucal,

2. Realizar un frotis extendiendo la muestra sobre otra lmina,

3. Dejar secar la lmina con la muestra al medio ambiente,

4. Cubrir la muestra con Verde Janus durante 5 minutos,

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5. Eliminar el exceso de colorante y dejar secar al medio ambiente,

6. Observar al microscopio con objetivos de 10x y 40x.

B) OBSERVACION DE LISOSOMAS en PROTOZOARIOS 1. Colocar en una lmina dos gotas cultivo de protozoarios y una gota del colorante rojo neutro, mezclar

dejar reposar 2 minutos..

2. Cubrir con una laminilla y observar el preparado a 10x y 40x . Visualizar en el interior de los

Paramecium a los lisosomas .

C.OBSERVACION DE PLASTIDOS EN VEGETALES:

CLOROPLASTOS: Se localizan en las hojas debajo de la epidermis superior.

1. Seleccionar una hoja joven de Elodea, colocarla sobre una gota de agua en una lamina portaobjeto.

2. Cubrir la muestra con una laminilla.

3. Observar al microscopio con objetivo de menor y mayor aumento.

CROMOPLASTOS: Son organelas coloreados y presentan formas variadas (redondas, elpticas, o

aciculares).

1. Realizar cortes finos de zanahoria, aj amarillo, betarraga sobre una lmina portaobjetos

2. Colocar una gota de agua sobre el corte.

3. Cubrir con una laminilla.

4. Observar al microscopio con objetivos de menor y mayor aumento.

AMILOPLASTO: Son organelas que contienen almidn como sustancia de reserva.

1. Sobre una lmina portaobjetos colocar una gota de Lugol.

2. Agregar un corte transversal fino de papa .

3. Cubrir con una laminilla.

4. Observar al microscopio con objetivo de menor y mayor aumento.

IV. PROTOCOLO:

MUESTRAS

OBSERVACIN DE MITOCONDRIA, CLOROPLASTOS Y PLASTIDIOS

20 X

40 X

TIPO DE ORGANELA

PLASTIDIO

EPITELIO BUCAL

CULTIVO

PROTOZOARIO

HOJA DE ELODEA

AJI AMARILLO

ZANAHORIA

BETARRAGA

PAPA

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V. CUESTIONARIO

1. Qu son las patologas mitocondriales?.

2. Qu relacin tiene los lisosomas y la autofagia?

3. Porqu las mitocondrias fijan el colorante verde de Janus?.

4. Qu funcin cumplen los plastidios en las clula?.

VI.INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


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PRCTICA N 10

ACCIN ENZIMTICA

I. OBJETIVO:

Conocer el mecanismo de accin de las enzimas durante una reaccin qumica.

Conocer cmo acta un catalizador.

II. MATERIALES:

Gradilla Mechero de alcohol

Mortero con piln Hgado de pollo

Tubos de prueba de 16 x150 /13x100 Hisopos

Agua oxigenada Fsforos

Dixido de Manganeso Pipetas pasteurss

Azul de metileno Pipetas1ml

Aceite Cloruro de sodio

Succinato sodio 0,1M Gradilla

Buffer Fosfato pH7.4 Placas Petri

NaCl 0,9%

Bistur

III. FUNDAMENTACION:

Las Enzimas tienen como funcin acelerar la velocidad de una reaccin qumica. El mecanismo de accin se

realiza de la siguiente manera:

Unin de un Sustrato a la Enzima para formar un Complejo Enzima- Sustrato y desdoblamiento del complejo

formado para liberar los Productos.

E + S E - S E + P

IV. PROCEDIMIENTO:

a. Actividad de la Enzima Catalasa

MnO2 + 2 H2O2 2 H2O + O2 + MnO2

Catalasa + 2 H2O2 2 H2O + O2 + Catalasa

1) Numerar los tubos del 1 al 3

2) Colocar en cada tubo 2 ml. de Perxido de hidrgeno (Agua oxigenada).

3) Agregar al:

Tubo 1: cucharita de Hgado de pollo entero

Tubo 2: cucharadita de Hgado de pollo triturado

Tubo 3: 2 g. Dixido de Manganeso

4) Colocar a cada tubo el palito de Ignicin encendido en la boca del tubo

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5) Si el palito de Ignicin aumenta la intensidad del fuego, la reaccin es positiva.

b. Actividad de la Enzima Succinato Deshidrogenasa

1) Preparar homogenizado de hgado con cloruro de sodio.

2) Disponer de 2 tubos de 13x100 y roturarlos (tubo N 1 y tuboN 2)

3) Colocar en cada tubo 1 ml de Succinato y luego 1 ml de buffer .

4) Aadir 2 gotas de azul de metileno, agitar, anotar el color.

5) Incorporar al tuboN 1 0,5ml de aceite por las paredes y dejar en la gradilla NO MOVER

6) Agregar al tubo N 2 1ml de homogenizado de hgado e inmediatamente aadir 0,5ml de aceite por las

paredes, No MOVER, dejar en la gradilla.

7) Hacer el seguimiento de la decoloracin de los tubos por 20minutos,

8) Analice lo ocurrido .

.

V. CUESTIONARIO:

1) Defina que es un catalizador

2) Qu se entiende por sitio activo.?

3) Qu tipo de enzima es la catalasa, y cul es su importancia en el metabolismo ?

4) Cul es el rol de la deshidrogenasa succnica y porque se relaciona con el sndrome de Kearns Sayre?

VI.INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


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ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

CURSO DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

PRACTICA N 11

OBSERVACIN DE ELEMENTOS FORMES DE LA SANGRE

I. OBJETIVOS

Determinar la presencia de elementos figurados presentes en una muestra de sangre perifrica humana,

mediante el uso de una coloracin diferencial.

Observar la presencia de ncleos en su interior.

II. MATERIALES

Microscopios

Colorante Wright o Giemsa

Alcohol yodado

Agua destilada

Lminas portaobjetos limpias y desengrasadas


Algodn estril

Varillas de coloracin

Lminas coloreadas de sangre con Wright

Papel lente.

Aceite de cedro

Guantes


III. PROCEDIMIENTO

A. Obtencin de sangre capilar

1. Desinfectar el dedo anular con alcohol yodado y algodn y con una lanceta estril punzar el dedo y

dejar caer una gota de sangre sobre un extremo de la lmina portaobjetos.

2. Con ayuda de otra lmina portaobjeto formar un ngulo de 45 y realizar un frotis, tratando de

esparcir homogneamente la gota de sangre sobre la superficie de la lmina.

3. Dejar secar la preparacin y proceder luego a la coloracin con Wright o Giemsa.

B. Coloracin

1. Cubrir el frotis con colorante Wright o Leishman por 1 minuto.

2. Sin eliminar el colorante agregar agua destilada y dejar actuar por 10 minutos.

3. Eliminar luego el colorante y lavar suavemente con agua de cao.

4. Dejar secar la lmina coloreada.

5. Una vez que la lmina coloreada a secado, observar al microscopio con el objetivo de 100 X y aceite

de inmersin.

IV. PROTOCOLO

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(Esquematice los siguientes elementos que abajo se indican y que sern observados con ayuda del

microscopio).

1. LEUCOCITOS GRANULARES:

a) Neutrfilos segmentados: presenta un ncleo con varios lbulos (2-5) unidas por bandas de

cromatinas.

b) Neutrfilos en banda o abastonado: presenta un ncleo no dividido en forma de S o en cayado O.

c) Eosinfilos: redondos, voluminosos, con granulaciones acidfilas de color anaranjado, ncleo con dos

lbulos.

d) Basfilos: son escasos de 0-1, presenta un ncleo difcil de observar, pues se halla cubierto por una

granulacin de color violeta o morado oscuro .

2. LEUCOCITOS AGRANULARES:

a) Linfocitos: De forma redonda o irregular, su ncleo es morado, voluminoso y ocupa la mayor parte

de la clula, el citoplasma es azul y sin granulaciones. Su nmero aumenta con las infecciones.

b) Monocitos: De forma redonda u ovalada, ncleo variable generalmente en forma de rin, citoplasma

sin grnulos. Presenta una gran actividad fagocitaria.

3. PLAQUETAS:

Las ms pequeas de las clulas de la sangre, de forma redonda y no contienen hemoglobina. Son

esenciales en la coagulacin de la sangre.

4. HEMATIES O ERITROCITOS:

De forma generalmente redonda, sin ncleo, de color rosa intenso, contiene hemoglobina. La protena que

se encarga del transporte de oxgeno y anhdrido carbnico.

Neutrofilos

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Eosinfilos

Basfilo

Monocitos

Linfocitos

X. CUESTIONARIO

1. Cul es la diferencia entre plasma y suero?.

2. Diga que es la frmula leucocitaria, cules son los valores normales en el adulto y qu significado tiene los

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valores anormales.

3. Qu es la histamina y cul es su importancia?.

4. Qu es la anemia, y cul es su origen?

V.INFORME

Cartula;

Introduccin,

Marco terico.


Conclusiones.

Cuestionario.


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PRCTICA N 12

CICLO CELULAR: Divisin Celular : LA MITOSIS

I. OBJETIVO:

Se estudiar la mitosis y el ciclo de divisin celular en las clulas meristemticas de la raz de Allium cepa

(cebolla).

En este sistema la poblacin celular esta en equilibrio dinmico y los cromosomas son relativamente grandes, con

un nmero diploide ( 2n =16 ).

II. MATERIALES:

Races de cebolla

Lminas fijadas de mitosis

Placas Petri

Estiletes y pinzas

Papel de Filtro

Portaobjetos

Cubreobjetos

Aceite de inmersin

Mechero de Alcohol

Orcena actica- clorhdrica

Aceite de inmersin

Papel lente

Microscopios

III. PROCEDIMIENTO:

1. Cultivar los bulbos de cebolla en vasos pequeos conteniendo agua corriente, la que deber cambiarse cada 24

horas, mantener los bulbos en oscuridad a 25C y sometidos a aireacin constante.

2. Despus de 48 a 72 horas, arrancar con ayuda de una pinza 2 a 3 races del bulbo, cortar 2 cm. de la parte

apical y colocarla sobre una placa Petri que contenga Orcena.

3. Calentar la placa en la llama de un mechero de alcohol hasta aproximadamente 60C y se observe la emisin

de vapores blancos, evitar la ebullicin del colorante.

4. Dejar enfriar y repetir esta operacin cuatro veces.

5. Enfriar y dejar reposar durante 15 minutos.

6. Colocar la raicilla en la lmina portaobjeto, cortar 2 mm de la punta, aadir una agota de Orcena fra, cubrir la

preparacin con laminilla.

7. Con la punta de un lpiz golpear suavemente la preparacin describiendo crculos concntricos para permitir la

extensin del tejido meristemtico.

8. Eliminar el exceso de colorante usando una tira de papel filtro.

9. Observar la preparacin a mayor aumento y lente de inmersin.

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IV. PROTOCOLO:

Esquematizar las diferentes fases que se observan:

Interfase: Los cromosomas no se observan al microscopio debido a que son demasiados delgados y no puede

absorber suficiente colorante para ser visible.

Profase: Fase en la cual los cromosomas se observan con sus dos cromtidas.

Metafase: Se observa el huso acromtico, los cromosomas estn mas condensados y cortos.

Anafase: Los cromosomas se dirigen a los polos

Telofase: Los cromosomas estn en los polos, empieza la formacin de la membrana nuclear

V. CUESTIONARIO:

1. Qu hay de comn entre mitosis y meiosis.

2. Que es Indic mittico e ndice interfsico

3. Defina cariocinesis y citocinesis

REALIZAR ESQUEMAS:

FASE DE LA MITOSIS

ESQUEMAS

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PRACTICA N 13

GRUPO SANGUINEO Y FACTOR Rh

I. OBJETIVO:

Al finalizar la prctica el alumno debe saber qu es el grupo sanguneo, sus aplicaciones en el campo de la

medicina y el grupo sanguneo al que pertenece.

II. GENERALIDADES:

El serlogo Karl Landsteiner, en 1900-1901 fue el primero en demostrar la existencia de grupos sanguneos y en

1938 el Comit de Higiene de la Liga de la ONU, el Congreso de Microbiologa de 1930 en Londres y la

Internacional de Transfusin Sangunea de Pars, se adopt definitivamente la clasificacin de los grupos

sanguneos humanos heredables, designados como A, B, AB, O.

GRUPOS SANGUINEOS RESULTANTES

GRUPO SANGUINEO

ANTIGENO EN GLOBULOS

ROJOS

(AGLUTINOGENOS)

ANTICUERPOS EN PLASMA O

SUERO SANGUINEO

(AGLUTININAS)

A

A

Anti-B

B

B

Anti-A

AB

AB

Ninguno

(Receptor universal)

O

Ninguno

Anti-A + Anti-B

(Dador universal)

III. MATERIAL Y METODOS:

Lmina preparadas de frotis sanguneo

Placas excavadas de porcelana


Sueros Anti-A, Anti-B, Anti-D o Rh.

Mondadientes

Algodn

Alcohol yodado

Guantes


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RECONOCIMIENTO DE GRUPOS SANGUINEOS:

La tcnica de reconocimiento de grupos sanguneos se basa en la aglutinacin o no de los hemates cuando se

mezclan con la aglutinina Anti-A o Anti-B.

IV. PROCEDIMIENTO :

1. Limpie con algodn embebido en alcohol la yema del dedo anular.

2. Realizar la puncin utilizando una lanceta hematologa estril.

3. Coloque dos gotas de sangre por separado sobre la lmina portaobjetos, de la persona a la cual se va a realizar

la prueba y en otra lmina otra gota de sangre.

4. Agregar a cada gota de sangre una gota de suero Anti-A y Anti-B y Anti-D o Anti-Rh por separado.

5. Observar la reaccin e identificar a que grupo pertenece y que factor Eh, si es positivo o negativo

METODO DE RECONOCIMIENTO PRACTICO:

GRUPO A GRUPO B

Anti-A Anti-B Anti-A Anti-B

GRUPO AB GRUPO O

Rh: Anti D o Rh (+) Anti- D o Rh (-)

V: CUESTIONARIO :

1. A quienes se les llama receptores y donadores universales, por qu?

2. Explique la Eritroblastosis fetal.

3. En que se basa el reconocimiento de los grupos sanguneos?

4. Indique que tipo de sangre pueden recibir y donar las personas de los grupos sanguneo A,B,AB y O con

Rh + y Rh -

VI . INFORME ; Cartula, Introduccin, Marco terico. Observaciones (esquemas) con su descripcin.

Conclusiones.

Cuestionario.


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PRACTICA N14

CDIGO GENTICO

III. OBJETIVOS:

Comprender las bases moleculares del dogma de la biologa molecular.

Usar el cdigo gentico y comprender el efecto de mutaciones y sus posibles causas.

IV. MATERIALES:

Secuencias problemas entregadas por el docente.

Lapiz, borrador.

Tabla de cdigo gentico.

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III PROCEDIMIENTO.

Analice y complete las siguientes secuencias (en clase)

Ejemplo:

Pro

Reconocer:

Sitio de N glicosilacin: Asparragina-X-Serina o Asparragina-X-Serina-Treonina. Sitio de O Glicosilaicon: Serina o treonina

SECUENCIA I

Segmento A:

ADN 5 a t g c g c t c a c g t g a C a c a a t g

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ADN3

Mensajero

Aminocido

Segmento B

ADN 5 c c c g g t a c g t g t g c A c a a a t g

ADN3

Mensajero

Aminocido

Segmento C

ADN 5 g g t a t a c t a t c a t c T t a g a t a

ADN3

Mensajero

Aminocido

Analice y responda:

1. Numero de codones:

2. Numero de aminocidos empleados:

3. Secuencia usada por la ARN polimerasa:

4. Sitios de Glicosilacion.

SECUENCIA II

Segmento A:

ADN 5

ADN3 t a c g g c a t g g g g c a C c c a t t T

Mensajero

Aminocido

Segmento B

ADN 5

ADN3 g c c c c g t a g a t a c a T c a t g t t

Mensajero

Aminocido

Segmento C

ADN 5

ADN3 c g a c t t g g a a a a a t C c c g g a T

Mensajero

Aminocido

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Analice y responda:

1. Numero de codones: 2. Numero de aminocidos empleados: 3. Secuencia usada por la ARN polimerasa: 4. Sitios de glicosilacin:

Secuencia C (para el informe: preste atencin a las indicaciones que dar el profesor)

*A continuacin se le entrega una secuencia de aminocidos, halle la posible secuencia nucleotdica y responda lo

siguiente:

FVNQHLCGSH LVEALYLVCG ERGFFYTPKS

1. Numero de aminocidos: 2. Nmero de Codones: 3. Por qu el primer aminocido no es Metionina? 4. Cmo podramos averiguar a qu protena pertenece esta secuencia?

IV.CUESTIONARIO

1. Por qu el cdigo gentico es degenerado?

2. Qu mutaciones son cruciales en el gen de hemoglobina y como atae esto la salud?

3. Explique, por qu en el cdigo gentico se utilizan tres nucletidos por codn?

4. Por qu son importantes las mutaciones?

g.p.biologia molecular_1 2015-i.pdf

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