fim predavanja i dio bez adresa animacija

FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMAtemeljni modul diplomskih studija Bioprocesno inenjerstvo i Molekularna biotehnologija

doktorskog studija Biotehnologija i bioprocesno inenjerstvo 6 ECTS bodova

1. dio

izv. prof. dr. sc. Anita Slavica i prof. dr. sc. Sran Novak

1

sadraj

2

1. Fiziologija industrijskih mikroorganizama - uvod.............................................................3

2. Metode u fiziologiji industrijskih mikroorganizama.........................................................36

3. Biomembrane - graa i funkcija....................................................................................107

4. Biomembrane i bioenergetika.......................................................................................127

5. Transport otopljenih molekula kroz membranu stanice................................................151

6. Metabolizam - katabolizam...........................................................................................188

7. Metabolizam - anabolizam............................................................................................235

8. Struktura stanice mikroorganizma................................................................................264

3FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA - UVOD

fiziologija industrijskih mikroorganizama (1)

4

FIZIOLOGIJA

...znanost o procesima u ivim organizmima; objanjava mehanizam, uzrone veze i odnose izmeu

ivotnih pojava, istrauje ope zakone ivota, rad i funkciju pojedinih organa, tkiva i stanica; slui

se eksperimentalnim metodama fizike, kemije i biologije, pa je povezana s biokemijom i

biofizikom... (Hrvatski opi leksikon, Leksikografski zavod MK, Zagreb, 1996.)

MIKROBNA FIZIOLOGIJA

- prouava procese u mikrobnim stanicama

- interakcija i preklapanja s mikrobiologijom, genetikom, biokemijom, molekularnom biologijom

- holistiki pristup: prouava stanicu kao cjelinu

5fiziologija industrijskih mikroorganizama (2)

FIZIOLOGIJA INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA

- prouava procese u stanicama mikroorganizama koji se koriste u biotehnologiji

(bakterije, kvasci, alge, plijesni, stanice biljnih i ivotinjskih tkiva)

- dvije suprotne tendencije:

uvoenje sve veeg broja novih vrsta u industrijsku proizvodnju,

ubacivanje gena iz novih, slabo poznatih vrsta, u stare, dobro poznate vrste

(ugroavanje bioloke raznolikosti)

6fiziologija industrijskih mikroorganizama: neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (1)

- (pre-)biblijski industrijski bioprocesi- vino, pivo, ocat, mlijeni proizvodii...

-20. stoljee - zlatno doba industrijske mikrobiologije: proizvodnja otapala, antibiotika, enzima,vitamina, aminokiselina, nukleotida(pojaivai okusa), polimeri, steroidi i dr.

- u ovom predavanju osvrt na industrijski primijenjene stanice:bakterija kvasacafilamentoznih fungabiljnih i ivotinjskih tkiva

7podsjetimo se: karakteristike stanica mikroorganizama - stanica prokariota

8podsjetimo se: karakteristike stanica mikroorganizama - stanica eukariota

animacija: Eukaryotic organelles

9usporedba karakteristika prokariotske i eukariotske stanice

karakteristika prokariot eukariot

jezgra bez membrane, nema mitoze prava jezgra, jezgrina membrana, mitoza

DNA raspored jedna molekula, bez histona vie ili mnogo kromosoma, veinom s histonima

sastav membrana nema sterola sadri sterole

respiratorni sustav dio plazmine membrane ili u membranskim organelama, mitohondrijima

mezosoma, nema mitohondrija

fotosintetske strukture na unutranjim membranama, u membranskim organelama, kloroplastima

nema kloroplasta

veliina ribosoma 70S (50S + 30S) 80S (60S + 40S), osim ribosoma u organelama(mitohondriji i kloroplasti sa 70S)

citoplazmino gibanje rijetko ili ga nema esto

stanina stijenka kemijski sloeni polimeri jednostavni polimeri i drugi organski i anorganski

(peptidoglikan) materijal

bi submikroskopske veliine, mikroskopske veliine, svaki flagelum sadri 20

svaki flagelum jedan fibril fibrila karakteristinog rasporeda (2x9)+2

seksualna reprodukcija fragmentarni proces, nema kompletan proces, mejoza, preraspodjela potpunog

mejoze, dio genskog materijala broja kromosoma

vakuole rijetko prisutne esto prisutne

10

podsjetimo se: primarni metaboliti

11

neki industrijski vani mikroorganizmi i njihov potencijal (2)

bakterije mogu se postii visoke koncentracije bakterijske biomaseAcetobacter sp. (octena kiselina)Bacillus sp. (vitamini, industrijski enzimi: amilaze, proteaze, lipaze)

Bacillus subtilis (transport proteina iz stanice - ind. primjena)Clostridium sp. (aceton, butanol)Corynebacterium sp. (aminokiseline) ( 4.5 - 109 USD; 2004)

Corynebacterium glutamicum

- proizvodnja aminokiselina: ekstrakcija iz hidrolizata proteinasinteza

biotehnoloki bioproces (cjelovita stanica biokatalizatora)enzimska kataliza (Japan)

12


bakterije mogu se postii visoke koncentracije bakterijske biomaseAcetobacter sp. (octena kiselina)Bacillus sp. (vitamini, amilaze, proteaze, lipaze)

Bacillus subtilisClostridium sp. (aceton, butanol)Corynebacterium sp. (aminokiseline) ( 4.5 - 109 USD; 2004)

Corynebacterium glutamicum

Escherichia coli (dominantni prokariotski biokemijski i genetiki model, domain tvornicama proteina, aceton, etanol, ...)

Lactobacillus sp. i Streptococcus sp. (mlijena kiselina)

Streptomyces sp. (vitamin B12, enzimi, antibiotici)Streptomyces coelicolor (20-tak sekundarnih metabolita)

13


kvasci mogu se postii visoke koncentracije kvaeve biomase etanol, mlijena kis.Saccharomyces cerevisiae (transportira heterologne proteine u podlogu,

posttranslacijske modifikacije overglikozilacija) Hansenula polymorpha (Pichia angusta; koristi metanol - metilotrof, glikozilacija)Pichia pastoris (metilotrof, glikozilacija; heterologni proteini)Pichia stipitis (obnovljive sirovine, celuloza ksiloza etanol)

filamentozni fungi - obligatni aerobitransport proteina iz stanice; organske kiseline, enzimi, polisaharidi, antibioticiAshbya gossypii (istraivanje fiziologije mikroorganizma)Aspergillus nidulans (istraivanje fiziologije mikroorganizma)Aspergillus niger (limunska kiselina)Aspergillus oryzae (-amilaza)Aspergillus terreus (biofarmaceutska ind.)Neurospora crassa (istraivanje fiziologije mikroorganizma)Penicillium chrysogenum (-laktamski antibiotici)

14


trite razliitih proizvoda biotehnoloke industrijske proizvodnje: 48 109 (2010)porast u 2012. godini za > 180 % (86.4 109 )

vrijednost proizvoda vs volumen

volumen proizvoda

v

r

i

j

e

d

n

o

s

t

p

r

o

i

z

v

o

d

a

farmaceutski proizvodi

fine kemikalije

dodaci preh. proizvodima

bulk kemikalije

antibiotici kiralni spojevi enzimi

vitamini antioksidansi pojaivai okusa

etanol druga otapala dodaci stonoj hrani (aminokis.) polimerni spojevi

rekombinanti proteini statini i drugi proizvodi

Biotechnology uses substances,materials or extracts derived from living cells, employing 22 million Europeans in a 1.5T endeavour, being the premier global economic growth opportunity this century....

Biotechnology will deliver solutions to unimagined problems,providing food security, health and well-being to mankind forcenturies to come.

KMA Gartland et al., Current Opinion in Biotechnology, 24S, S6-S13, 2013.

15


neki biotehnoloki proizvodi i ekonomska vrijednost njihove proizvodnje na poetku 21. stoljeasekundarni metaboliti

penicilinski antibiotici P. chrysogenum 4 . 109 USDcefalosporinski a. Acremonium chrysogenum 11 . 109 USD

Streptomyces clavuligerusstatini Aspergillus terreus 9 . 109 USDtaksol biljne stanice 1 . 109 USD

rekombinantni proteiniinzulin S. cerevisiae 3 . 109 USD

E. colieritropoetin chinese hamster ovary (CHO) cell 3.6 . 109 USD humani hormon rasta E. coli 1 . 109 USDinterferoni E. coli 2 . 109 USDvakcine bakterije i kvascimonoklonska antitijela hibridoma stanice 7 . 108 USD

16


neki biotehnoloki proizvodi i ekonomska vrijednost njihove proizvodnje na poetku 21. stoljeaenzimi

enzimi / detergenti Bacillus sp., Aspergillus sp. 6 . 108 USDenzimi / krob Bacillus sp., Aspergillus sp. 2 . 108 USDkimozin Aspergillus sp.

polimeriksantan Xanthom. campestris 4 . 108 USDpolihidroksialkanoati Alcaligenes erytrophus

DNAvakcine E. coligenska terapija E. coli

17

drugi industrijski vani organizmi, proizvodi i njihov potencijal (8)

- alge, stanice viih biljaka i ivotinja

- hormoni, steroidi, citokini (vanstanini proteini koji se izluuju zbog promjene funkcija stanice, npr. upala, tzv. imuno-odgovor), vanstanini polisaharidi, ergot alkaloidi, pigmenti, insekticidi, ...

- proizvodnja kiralnih (meu)spojeva i finih kemikalija npr. sinteza S-6-hidroksinorleucina(antihipertenzijski lijek Omapatrilat) visoke uinkovitostis pomou razliitih m.o. i/ili enzima mikrobnog porijekla

- proizvodnja rekombinantnih proteina transgene biljke (uljana repica - citokin enkefalin)stanice sisavaca (CHO)sustav za proizvodnju mlijeka (svinje, ovce)uro-trakt

- proizvodnja tkiva (kono, hrskavino, kotano tkivo, tkivo jetre)- proizvodnja biljaka za ishranu rastue populacije (zlatna ria s provitaminom A, -karotenske rajice, ...)

18

E. colipreivljava u vrlo irokom rasponu razliitih parametara bioprocesabrzo i precizno modificira svoj genom uz vrlo visoku ponovljivostrelativno se lako uzgaja, brzo raste, postie visoka koncentracija biomase u jeftinim podlogama

postiu relativno visoki prinosi odreenih proizvodareducira aktivnost proteazekod sinteze proteina izbjegava ugradnja analoga aminokiselinakontrolira promotorformiraju disulfidne vezesintetizira heterologni protein uz udio do 50% suhe tvari bakterijske biomasedobra sekrecija proteina

ne provodi posttranslacijske modifikacije proteinarelativno visok udio endotoksinaagregacija proteina (inkluzijska tijela)

neke prednosti i nedostaci domaina za proizvodnju rekombinantnih proteina (1)

animacija: Translation-Linked Protein Secretion

19

S. cerevisiaeGRAS (eng. Generally Regarded As Safe) nije patogen za ovjekaproizvodnja s tradicijom u industrijskom mjerilumogue neke posttranslacijske modifikacije proteina (kovalentne preinake) npr. glikozilacija

dostupan ogranien broj vektora za kloniranjeglikozilacija nije identina glikozilaciji kod sisavacagenetiki neto manje poznat od E. coli

filamentozni fungiiskustvo u proizvodnji u industrijskom mjerilumikroorganizmi pogodni za proizvodnju brojnih industrijski primijenjenih enzimaizvrstan transport proteina

relativno niska ekspresija heterolognih proteinagenetiki manje poznati


20

stanice sisavacaistovjetna bioloka aktivnost kao kod prirodnog proteinadostupan relativno velik broj vektora

problemi pri rastu stanica u bioreaktorustanice sporo rastuniska produktivnost bioprocesarelativno skup bioproces

stanice insekatamogu relativno visoka ekspresija ciljanog genamogue posttranslacijske modifikacije proteina (fosforilacija, glikozilacija, signalno cijepanje peptida, proteoliza)

proteini rijetko pokazuju (oekivanu) relativno visoku aktivnostrazliiti mehanizmi regulacije odreenih procesa i prijenosa informacija jo uvijek nepoznati


21


Time

White Biotechnology

Bio-feedstocks Replacement of fossil fuel by sugars and starch

Bio-processes Production of chemicalsusing bioprocesses, e.g. vitamins

Bio-products polymers enzymes food ingredients

Today

Marked

Thepotentialpotencijal

industrijska biotehnologija

danas vrijeme

Obnovljive sirovinezamjena fosilnih sirovina razliitimizvorima C (npr. celuloza, krob, obnovljive i dr. sirovine)

Bioprocesiproizvodnja razliitih proizvoda (npr. biokemikalija) optimiranim bioprocesima (npr. proizvodnja vitamina)

Bioproizvodi polimeri enzimi sastojci preh. proizvoda

22

podsjetimo se: biotehnologija podjela (the biotechnological rainbow*)

crvena biotehnologija* - zdravlje, medicina, dijagnostikaYellow Biotechnology - Food Biotechnology, Nutrition Scienceplava biotehnologija* - akvakultura, biotehnologija obale i morazelena biotehnologija* - poljoprivreda, biotehnologija okolia, biogoriva, biognojivo,

bioremedijacija i geomikrobiologijasmea biotehnologija* - biotehnologija sunih podruja i pustinjacrna biotehnologija - bioterorizam, bioloki rat, biokriminal, ratovanjepurpurna biotehnologija* - patenti, publikacije, izumi, intelektualno vlasnitvoWhite BiotechnologyGold Biotechnology - Bioinformatics, Nanobiotechnology

siva biotehnologija - biokemijsko inenjerstvo i bioprocesna tehnologija

bijela biotehnologija* - gene-based bioindustrija

uta biotehnologija* - prehrambena biotehnologija, nutricionizam

zlatna biotehnologija - bioinformatika, nanobiotehnologija

predobrada bioproces izdvajanje i proiavanje

priprava konanog proizvoda

sirovinabiokemikalije

ibiogoriva

istraivaki najintenzivniji dio

lanac vrijednosti u industrijskoj biotehnologiji


23

FIM

24

9 MORA BITI ISTA KULTURA9 MORA BITI GENETIKI STABILAN9 MORA BRZO RASTI I LAKO SE UMNAATI9 NE SMIJE BITI PATOGEN, TOKSIAN9 NE SMIJE STVARATI INFLAMATORNE TVARI9 MORA PROIZVODITI ELJENI PROIZVOD TO BRE9 POELJNA SAMOZATITA OD KONTAMINACIJE9 MORA SE LAKO ODRAVATI9 MORA BITI PRILAGOEN TEHNOLOKIM UVJETIMA

karakteristike industrijskog mikroorganizma

25

- dio je prirodnih stanita- u mikrobiolokoj zbirci (ATCC, DSMZ, NRRL, ...)- mutant dobiven mutagenezom- rekombinant je (rekombinacija in vivo)- r-DNA mikroorganizam (rekombinacija in vitro)

Definicija vrsteMikroorganizmi istorodni po svojim morfolokim, fiziolokim i genetikim odlikama, ali meu kojima postoji odreeni stupanj raznolikosti (varijabilnosti) dajui podvrste (subspecies), varijetete i klonove. Vie kategorije od vrste su rod, porodica, red, razred i carstvo.

Definicija sojaNajee podrazumijeva klon oznaen na temelju nekoliko tipinih, dovoljno stabilnih karakteristika po kojima se razlikuje od ostalih sojeva iste vrste.

gdje se nalazi (potencijalni) industrijski mikroorganizam

eng. the Agricultural Research Service Culture Collection, ranije poznat pod nazivomNorthern Regional Research Laboratory

26

izolacija iste kulture mikroorganizma

Metode:iscrpljivanjauzastopnog razrijeivanjakoritenja selektivnih podloga i razliitih uvjeta uzgoja visee kapimikromanipulacije

Prvi odabir (eng. screening): npr. razliiti indikatori, dodatak CaCO3, replika ploa, testmikroorganizam.

Drugi odabir: vrste i tekue podloge, auksonografska analiza.(auksotrof - divlji tip ili genetski modificirani divlji tip koji ne moesintetizirati odreeni organski spoj koji mu je potreban za rast; takav jespoj potrebno dodati u hranjivu podlogu u kojoj se eli uzgojiti ovajmikroorganizam)

animacija: Streak Plate Procedure

27

za prouavanje fiziologije odreenog mikroorganizma potrebno je:1. izolirati ga iz prirode,2. uzgojiti ga kao istu kulturu,3. prirediti ga i uvati kao trajnu kulturu (zbirka),4. moi ga uzgojiti po elji u odgovarajuem volumenu i koncentraciji s ponovljivim uspjehom.

PREMA NOVIJIM ISTRAIVANJIMA 90% BAKTERIJA JO NIJE IZOLIRANO I OKARAKTERIZIRANO JER SE NE MOGU UZGOJITI POZNATIM METODAMA!

metode mikrobne fiziologije (1)

28

Optimiranje uvjeta uzgoja mikroorganizma:

1. sastav podloge (izvori C, N, P, S; minerali; faktori rasta; prekursori)

2. optimalna temperatura uzgojaPSIHROFILI < 20CMEZOFILI 20 - 42CTERMOFILI 42 - 80CEKSTREMNI TERMOFILI > 80C (npr. 80 - 113C)

Termorezistentni mikroorganizmi podnose visoke temperature, ali pri njima ne rastu.


29

Optimiranje uvjeta uzgoja mikroorganizma (nastavak):

3. pH optimum (za bakterije uglavnom pH 6 - 8, a za kvasce i plijesni pH 4 - 6)

4. kisik (obligatni aerobi, obligatni anaerobi, fakultativni anaerobi, mikroaerofili)

5. aktivnost vodea) halofili - trebaju povienu koncentraciju soli.

slabi (1 - 6% NaCl)srednji (6 - 15% NaCl)ekstremni (15 - 30% NaCl)

Halotolerantni mikroorganizmi podnose vie koncentracije soli, ali ih ne trebaju.

b) osmofili - rastu pri visokim koncentracijama ugljikohidrata.c) kserofili - rastu na vrlo suhim supstratima.


30

tzv. ekstremna stanita prokariota i malog broja eukariota:

geotermalni izvori (80 - 121C)

polarni pojasevi (-20 do 20C)

kiseli (pH < 4) i alkalni (pH > 8) izvori

slana jezera (2 - 5 M NaCl)

hladne dubine (< 5C) oceana uz visoki tlak

vulkani i hidrotermalni izvori (< 400C)

Ovi su mikroorganizmi vrlo moan alat za provoenje potencijalnih industrijskih bioprocesa i to zbog stabilnosti njihovih enzima pri visokim temperaturama, ekstremnim vrijednostima pH i tlaka, visokim koncentracijama soli i organskih otapala, kao i relativno visokim koncentracijama metala.


31

neki primjeri enzima izoliranih iz mikroorganizama i cjelovitih stanica mikroorganizama koji obitavaju u tzv. ekstremnim stanitima, a koji nalaze primjenu u industrijskoj biotehnologiji:

mikroorganizam stanite s enzim/stanica primjena u proizvodnjitermofil visokom temp. amilaze glukoze, fruktoze (zaslaivai)

45 - 65C ksilanaze papira (izbjeljivanje)65 - 85C proteaze piva, detergenata, itd.< 85 DNA polim. rekomb. mo (gen. inenjerstvo)

psihrofil niskom temp. proteaze sira, mlijenih proizvodadehidrogenaze biosenzoraamilaze detergenata (razgr. polimera)

acidofil niskom pH vrijednosti oks. sumpora ugljenaalkalofil visokom pH vrijednost celulaze detergenata (razgr. polimera), PHBhalofil visokom konc. soli celulaze poli(-glutaminske kiseline)(PGA)piezofil visokim tlakom cjelovite stanice mo gelova i granula krobametalofil visokom konc. metala cjelovite stanice mo metala izluivanjem, bioremedijac.radiofil visokom radijacijom cjelovite stanice mo radionuklida bioremedijacijommikroaerofil niskom konc. O2 (< 21%)


32

jo primjera ekstremnih uvjeta u kojima rastu i preivljavaju neki mikroorganizmi

Pyrococcus sp., Pyrodictium sp. 105C (vulkanska podruja, gejziri)Sulfolobus sp. pH 1, 80C (vulkanska podruja)Bacillus alkalophilus, Natronobacterium sp. pH 10.5 (alkalna jezera)Thiobacillus ferroxidans pH 2.0 - 8.0 (rudarske isplake)Halobacterium sp. 30% NaCl (slana jezera, soljena riba)osmofilni kvasci i plijesni 50% eera (pekmez, eerni sirupi)kserofilne gljive 90% suhe tvari (brano, sueno voe)


33

Uzgoj mikroorganizama u laboratoriju:

1. POVRINSKI (kosi agar, Petryjeva zdjelica)2. SUBMERZNO (u tekuoj hranjivoj podlozi u epruveti,

u tikvici u termostatu ili laboratorijskom bioreaktoru

a) arni uzgoj (krivulja rasta)b) pritoni uzgojc) polukontinuirani uzgojb) kontinuirani uzgoj (kemostat)

3. NA (POLU-)VRSTIM SUPSTRATIMA/SIROVINAMA


34

1. A.L. Demain (2001) Genetics and microbiology of industrial microorganisms. Molecular genetics and industrial microbiology - 30 years of marriage, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 27, 352-356.

2. D.C. Demirjan, F. Mors-Varas, C.S. Cassidy (2001) Enzymes from extremophiles, Current Opinion in Chemical Biology5, 144-151.

3. K. Egorova, G. Antranikian (2005) Industral relevance of thermophilic Archaea, Current Opinion in Microbiology 8, 649-655.

4. Grupa autora: Hrvatski opi leksikon, A. Kovaec (ed.) Leksikografski zavod Miroslav Krlea, Zagreb (1996).5. Grupa autora: Biotehnologija - osnovna znanja, P. Raspor (ed.), Bia, Ljubljana (1996).6. D.R. Higgins Overview of protein expression in Pichia pastoris, Current Protocols in Protein Science, J.E. Coligan, B.M.

Dunn, D.W. Speicher, P.T. Wingfield (eds.), Chapter 5: Unit5.7. (2001). 7. C.P.Hollenberg, G. Gellissen (1997) Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts, Current Opinion in

Biotechnology 8, 554-560. 8. J. Hugenholtz, E.J. Smid (2002) Nutraceutical production with food-grade microorganisms, Current Opinion in

Biotechnology 13, 497-507.9. M. Ikeda (2003) Advances in biochemical engineering / biotechnology, vol. 79. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp

1-35.10. A. Kern, E. Tilley, I.S. Hunter, M. Legia, A. Glieder (2007) Engineering primary metabolic pathways of industrial micro-

organisms, Journal of Biotechnology 129, 6-29. 11. www.ebtna.net (European Biotechnology Thematic Network Association)

literatura (1)

35

12. O.P. Kuipers (1999) Genomics for food biotechnology: prospects of the use of high-throughput technologies for the improvement of food microorganisms, Current Opinion in Biotechnology 10, 511-516.

13. W. Leuchtenberger, K. Huthmacher, K. Drauz (2005) Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects, Applyed Microbiology and Biotechnology 69, 1-8.

14. P. Li, A. Anumanthan, X.G. Gao, K. Ilangovan, V.V. Suzara, N. Dzgne, V. Renugopalakrishnan (2007) Expression of recombinant protens in Pichia pastoris, Applied Biochemistry and Biotechnology 142, 105-124.

15. V. Mari, B. antek: Biokemijsko inenjerstvo, A. Reetar (ed.) Golden marketing - Tehnika knjiga, Zagreb (2009).16. Z.S. Olempiska-Beer, R.I. Merker, M.D. Ditto, M.J. DiNovi (2006) Food-processing enzymes from recombinant

microorganisms a review, Regulatory Toxicology and Pharmacology 45, 144-158.

17. R.N. Patel (2001) Biocatalytic synthesis of intermediates for the synthesis of chiral drug substances, Current Opinion in Biotechnology 12, 587-604.

18. M. Rai, H. Padh (2001) Expression systems for production of heterologous proteins, Current Science 80, 1121-1128.

19. K.M.A. Gartland, F. Bruschi, M. Dundar, P.B. Gahan, M.P. Viola Magni, Y. Akbarova (2013) Progress towards the Golden Age of biotechnology, Current Opinion in Biotechnology 24S, S6-S13.

20. the ENCODE project, http://www.genome.gov/1000510721. the brain research through innovative neurotechnologies (BRAIN), http://www.humanbrainproject.eu

literatura (2)

36

METODE U FIZIOLOGIJI INDUSTRIJSKIH MIKROORGANIZAMA

37

- pomou razliitih metoda mogue je:

identificirati, okarakterizirati i izolirati (izdvojiti) pojedine mikroorganizme i proizvode u ciljane svrhe;

opisati rasprostranjenost i aktivnost odreenih mikroorganizama;

(bio)kemijsko i fizikalno-kemijsko meudjelovanje mikroorganizama i njihovih stanita;

povezanost biokemijskih reakcija u stanici i dogaanja na nivou stanice i itave populacije;

razliite biokemijske puteve i mehanizme prijenosa informacije u stanici i izvan stanice;

mehanike karakteristike stanice (npr. turgor, elastinost, ...);

raspodjelu i kretanje odreenih molekula u razliitim odjeljcima stanice;

...

metode u fiziologiji industrijskih mikroorganizama

38

- vizualizacija: stanice (udjel vode u stanici!)

organela

molekula (!)

neke metode koje se mogu primijeniti u istraivanju fiziologije stanice (2)

* k = 103 a K = 2102801024 Yyotta-2701021 Zzetta-2601018 Eexa-2501015Ppeta-2401012Ttera-230109Ggiga-220106Mmega-210103k ili K *kilo---102 hhecto---101 Ddeka-20100--(-)--10-1 ddeci---10-2 ccenti---10-3 mmilli---10-6 mmicro---10-9 nnano---10-12 ppico---10-15 ffemto---10-18 aatto---10-21 zzepto---10-24 yyocto-

potencija baze 2potencija baze 10simbol(i)prefiks

* k = 103 a K = 2102801024 Yyotta-2701021 Zzetta-2601018 Eexa-2501015Ppeta-2401012Ttera-230109Ggiga-220106Mmega-210103k ili K *kilo---102 hhecto---101 Ddeka-20100--(-)--10-1 ddeci---10-2 ccenti---10-3 mmilli---10-6 mmicro---10-9 nnano---10-12 ppico---10-15 ffemto---10-18 aatto---10-21 zzepto---10-24 yyocto-

potencija baze 2potencija baze 10simbol(i)prefiks

39

mikroskopija (1)

1. svjetlosna mikroskopija = 0.4 - 0.7 m (boje)rezolucija 0.2 m ili 200 nm (difrakcija)

- izravna (transmisijska)- fazno-kontrastna- diferencijalno-kontrastna (Nomarski)- tamnog polja

2. elektronska mikroskopija (rezolucija 1 , 100x bolja od svjetlosne) - eng. Transmission Electron Microscope (TEM)- eng. Scanning Electron Microscope (SEM)

- tehnike: diferencijalno bojanjemikrotomski presjekeng. freeze-fractureeng. freeze-etch

(TEM) (SEM)

freeze-fracture

freeze-etch

40

mikroskopija (2)

2. elektronskamikroskopija

41

difrakcija X-zraka

- = 10 - 0.01 nm- prouavanje strukture makromolekula (, 0.1 nm, 10-10 m)

difrakcija X-zraka primjer: aktivno mjesto enzima

supstrat

struktura proteina / enzima

42

dobivanje i analiza ekstrakta stanica

- dobivanje ekstrakta stanica: ultrazvukomosmotskim okomu tarionicima i kuglinim mlinovimaproputanjem kroz mali otvor pod visokim tlakom

- upotreba ekstrakcijskih reagensa: liza stanice i ekstrakcija (rekombinantnih) proteina iz E. coli npr. B-PER(eng. Bacterial Protein Extraction Reagent)

- analiza: izolacija i proiavanje proteina i dr. makromolekulaodreivanje enzimske aktivnosti (kinetika)primjena inhibitora i analogona

1 - vijak

2 - teflonska kuglica

3 - cilindar

4 - pokretni klip

5 - suspenzija stanica

6 - donji cilindar

7 - ekstrakt stanica

43

frakcioniranje staninih sastojaka: ultracentrifugiranje

- primjena ultracentrifuga- diferencijalno centrifugiranje

male brzine npr.1,000 g / 10 minsrednje brzine 20,000 g / 20 minvelike brzine 80,000 g / 1 satvrlo velike brzine 150,000 g / 3 sata

g relativna centrifugalna sila ili centrifugalni uinak

- razdvajanje u gradijentu gustoe (saharoza, CsCl)

- razdvajanje na temelju gustoe plutanja- mikroskopska, kemijska i/ili enzimska analiza razliitih frakcija stanica

animacija: The Meselson-Stahl Experiment (CsCl gradient)

animacija: Cell Fractionation (Sonication, Differential and Buoyant Density Centrifugation)

izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija (1)

- kromatografija: razdjelna (tankoslojna, papirna)kromatografija u koloni: ionsko-izmjenjivaka (A)

gel-filtracija (B)bio-specifina (afinitetna) kromatografija

(npr. epoksi-aktivirana sefaroza za izdvajanje i proiavanje amilaza)

Superdex 200 HR 10/30 MonoQA - protein B - protein

44eng. Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)


- kromatografija: razdjelna (tankoslojna, papirna)kromatografija u koloni: ionsko-izmjenjivaka (C)

gel-filtracijabio-specifina (afinitetna) kromatografija

Supelcogel C-610H

.

C - oligosaharidi (G2 G7)

45eng. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

- N- i C-terminalni tag-ovi: Strep(NH2-WSHPQFEK-COOH)

His (6 x His)GST Flag

Strep-tag


46

glutation-S-transferaza (GST), 35 kDa

FPLC

izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija (3a)

47

- N- i C-terminalni tag-ovi

- nanoLC, hplc-chip-ms_384 hyperlink

- 2D tekuinska kromatografija (npr. IEX + RP)

izdvajanje, proiavanje i analiza makromolekula: tekuinska kromatografija i MS (4)

48

- GC i 2D GC

izdvajanje, proiavanje i analiza aminokiselina: plinska kromatografija (5)

GC analiza AT-1701 kolona (Alltech Heliflex) (V = 2 L, 1 : 6 split ratio)

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

5 7 9 11 13 15 17 19

U

(

V

)

t (min)

A

l

a

G

l

y

V

a

l

L

e

u

I

l

e

P

r

o

P

h

e

M

e

t

t

r

a

n

s

-

U

C

A

L

y

s

T

y

r

T

r

p

G

l

u

A

s

p

C

y

s

H

i

s

T

h

r

S

e

r

A

s

n

G

l

n

49

R COOH

CH

NH2

aminokiselina

izobutil kloroformatmetanol / piridin

RT / 2 min

CHR

NH

O

O

CH3

OCH2CH(CH3)2

N-alkoksikarbonil ester

derivatizacija aminokiselina

50

Izdvajanje, proiavanje i analiza proteina: gel elektroforeza

- gel elektroforeza (SDS-PAGE, native PAGE, IEF, 2D)

SDS-PAGE native-PAGE IEF

1 2 pI calibration kit

5.85

5.20

4.55

pH

M

W

2D elektroforeza

animacija: Gel Electrophoresis (DNA)Heat Changes Protein Structure

51

analiza proteina: UV/Vis spektrofotometrija

- UV/Vis spektrofotometrija

FAD-zavisna oksidaza D-aminokiselina

H3C

H3C

N

N N

NH

O

O

H

H

FADH2

C HH

C

C

C

C

H

H

H

H H

OH

OH

OH

O

PO O

O

-

PO O

O

- CH2O

H

HO OH

H HH

N

N N

N

NH2

52

analiza proteina: specifine (ciljane) modifikacije (1) - tokasta mutacija

ionsko-izmjenjivaka kromatografija (FPLC) - Mono Q

53

analiza proteina: specifine (ciljane) modifikacije (2) i kemijske modifikacije

FAD

CD

-SH + DTNB

-SH + DTNB

tokasta mutacija

54

aktivnost enzima: primjena mikrosenzora (O2) (1)

55

aktivnost enzima: primjena mikrosenzora (O2) (2)

time (min)

4 6 8 10 12 14 16 18 20

o

x

y

g

e

n

(

m

o

l

l

-

1

)

0

200

400

600

800

1000

1200

s0 (O2) (mol l-1)

0 200 400 600 800 1000 1200

v

0

(

m

o

l

l

-

1

s

-

1

)

0

2

4

6

8

10

12

14rDAO

Cys108Asp

princip: smanjenje intenziteta fluorescencije

(eng. quenching) kisikom

56

analiza proteina: kapilarna elektrokromatografija

- kapilarna elektrokromatografijaHPLC + CE (kapilarna elektroforeza),elektrolit prolazi kroz kolonu (kapilaru) tjeran elektrinim poljem,detekcija: UV/Vis, fluorecencija, MS i dr.

uzorak pufer pufer

kapilara

elektrode

detekcija p (2-12 bar)

V = 25 kVC jakost (A)t = 20Cp = 10-12 bar25 mM ACN/Tris.HCl, pH 8

57

luminiscencija: molekule odreene tvari u pobuenom stanju emitiraju svjetlost odreene valneduljine

fosforescencija: e- u orbitali vieg energetskog nivoa ima isti spin kao e- u orbitali nieg (osnovnog) energetskog nivoa, povratak e- u orbitalu nije povoljan i odvija se relativno sporo (103-100 s-1) uz emisiju fotona

fluorescencija: e- u orbitali vieg energetskog nivoa ima suprotan spin s obzirom na e- u orbitali nieg energetskog nivoa, povratak u orbitalu je povoljan i odvija se brzo (108 s-1) uz emisiju fotona

analiza proteina: fluorescentna spektrometrija

210

S0

Jaboski dijagram

S1

S2

apsorpcijahA

meukonverzija

hA hFfluorescencija T1

fosforescencija

hP

prijelaz izmeu dvaju sustava

58

fluorescentna spektrometrija: GFP i nekovalentno obiljeavanje proteina

amonijeva sol 8-anilino-1-naftalen sulfonske kiseline (ANS)

GFP (eng. Green Fluorescent Protein)

- npr. Aequorea victoria, Renilla reniformis, itd.

- varijacije GFP (cijan, uti, crveni,...)

- FRET (eng. Fluorescence Resonance Energy

Transfer)

- neke primjene GFP-a: obiljeavanje stanica i

organela, porijeklo stanica, marker kod fuzije,

ekspresija gena, protein-protein meudjelovanje,

lokalizacija proteina,...

oksidaza 1 + ANS

oksidaza 2 + ANS

oksidaza 3 + ANS

EX = 388 nmEM = 495-460 nm

59

oksidativna posttranslacijska modifikacija: FAD-zavisna oksidaza D-aminokiselina (TvDAO)

Predviena trodimenzionalna struktura TvDAO

N

N*

Cys108 is alkylated

Cys108 is oxidized to Cys-SO2H

loop Pro98-Pro112

MS

60

mehanizam inaktivacije: oksidacija (signalno cijepanje - fragmentacija) i agregacija TvDAO

N...nativeN*..oxidatively modifiedF...fragmentedA...apo-protein form green...activered...inactive

animacija: Life Cycle of a Protein

61

protona citometrija

- vrlo precizna metoda koja koristi principe apsorpcije svjetlosti, rasapa svjetlosti (eng. light scattering), pobuivanja svjetlou (eng. light excitation) i emisije svjetlosti odreene valne duljine

- tijekom analize uzorka (estica, dijelova stanice ili cijelih stanica promjera 0.5-40 m) nastaje set vieparametarskih podataka koji su karakteristini za uzorak

specifina fluorescencija

uzorak

komora

optika

hidrodinamiko fokusiranje

izvor svjetlostinpr. laser

- prvi spektrometar masa- prvi MS strunjak: Antoine Laurent de Lavoisier (1743-1794)

- MS analiza: prikupljanje, obrada i interpretacija spektara masa iona i njihovih fragmenata

J. B. Fenn, Nobelova nagrada za kemiju 2002. godine (1/4),Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. (1989) Electrospray ionization for mass spectrometry of

large biomolecules, Science, 246(4926):64-71.Karas M., Hillenkamp F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons,

Anal. Chem. 60(20):2299-301.

- naredna generacija MS sustava: MS putovnice (identifikacija proteoma)- naredna generacija MS strunjaka: carinski slubenik- POVIJEST I PRIPREMA UZORKA!(npr. denaturacija proteina, redukcija, alkilacija, tripsin, zaustavljanje reakcije)- komponentne MS sustava:

62

spektrometrija masa (eng. mass spectrometry, MS)

ulaz uzorka

ionizacija analizator detektorspremanje i obrada podataka

63

spektrometrija masa (MS): ESI (eng. ElectroSpray Ionization) (soft ionization) (1)

ulaz otopine iz nanoLC sustava ili pomou pumpe s pricom

igla ili kapilara sprej

konusna elektroda

kapilara

smjer strujanja N2

skimmer

dalje u spektrometar masa do detektora

izvor napona

+ -

kapljica otopinevrh igle ili kapilare

molekula

isparavanje otapala

Rayleigh limit

Coloumb eksplozija

konusna elektroda

kapljica otopine s viestrukim nabojem

ion

p M + p e-

p M+ + 2p e-

ionizacija

fragmentacija(CID)

q M+ r A+ s B+

p = q + r + s

64

spektrometrija masa (MS): ESI (eng. ElectroSpray Ionization) (soft ionization) (2)

Software: ChemStation

nanoLC

ion trap

65

spektrometrija masa (MS): IT (eng. Ion Trap) spektrometar masa (3)

rf napon

dodatni ac

spektar masa

pojaiva signala

m/z(u, amu, Da, Th)

eng. collision induced dissociation (CID)

NH2 R CO NH R CO NH R COOH

x y z

a b c

hyperlinksdampinggas capture scanning_ms detection_ms elimination collision trapping_msms scanning_msms

66

spektrometrija masa (MS): analiza FAD-zavisne oksidaze D-aminokiselina (ESI/MS)

67

peptid 2

slijed a.k. VEADIAGHGQEVLIR

masa (m) 1605.8

naboj (z) + 2

m/z 803.9

spektrometrija masa (MS): analiza mioglobina (nanoLC/ESI/MS, MaxRes)

Izotopi (gr. isos- isti, topos- mjesto)

su atomi istog kemijskog elementa koji

imaju isti broj protona i elektrona, a

razliit broj neutrona, zbog ega imaju

ista kemijska svojstva, ali razliiti

atomski broj.

68

spektrometrija masa (MS): odreivanje primarne strukture mioglobina (nanoLC/ESI/MS/MS)

298.2

383.21+

500.41+

690.9

834.5

951.61+

1008.71+

1079.71+

1192.81+

1319.71+

1432.81+

39. +MS2(804.3), 33.4-33.9min (#909-#924)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

5x10Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

b2229.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

VE A D I A G H G Q E V L I R

b3300.4

y2288.2

y3401.3

b4415.3

y4

b5528.2

y5629.5

y6757.4

b6599.2

b7656.3

b8793.4

b9850.6

b10978.6

b111107.5

b121206.6

b13

b14

y8

y9

y10

y121307.8

y131378.9

y141507.9

b151588.8

69

spektrometrija masa: on-line interpretacija i vrednovanje rezultataPeptide Mass Search: Matrix ScienceUser: Anita Email: [email protected] Search title : MS data file: C:\Dokumente und Einstellungen\Slavica\EigeneDateien\Data\DataAnalysis\Anita051202\

MyoDenaturatedDigTry051202-2\Analysis.mgf Database: SwissProt 40.39 (201563 sequences; 110352130 residues) Timestamp: 24 Jan 2003 at 08:32:44 GMT Significant hits: P02188 Myoglobin STANDARD VARSPLIC; STANDARD VARIANT; STANDARD CONFLICT FROM P02188P02188-00-00-01 Myoglobin STANDARD VARSPLIC; STANDARD VARIANT; REF. 1 FROM P02188 P02170 Myoglobin P02187 Myoglobin P14396 Myoglobin Probability Based Mowse Score

Score is -10*Log(P), where P is the probability that theobserved match is a randomevent. Individual ions scores> 40 indicate identity or extensive homology (p

70

in silico analiza i interpretacija MS spektara peptide sequencing (Sherenga, Spectrum Mill v2.7)User: Anita Email: [email protected]

peptide 7 (analysis via Spectrum Mill)

GGEQEGGSTAYAPSYGFESSGALH104GK

preferential ionization of His residues

N

N

O

N

O O

NN

N O

NN

O

N

Zn

2.09

2.14

2.05

2.05 2.52 109.3

108.7

112.2

94.5

127.6His 64

His 62

His 104

pentanoic acid

98.3

Fe

71

in silico analiza: de novo sequencing

Gln158 - Cys159 (opposite direction)

Cys145 Ile146

disulfide bond Asn192 Cys193

peptide de novo sequencing (Sherenga, Spectrum Mill v2.7)User: Anita Email: [email protected]

72

in silico analiza: eng. multiple sequence alignment

Pam250, ClustalW

cysteine residues are not conserved (< 30 sequences, search in TrEMBL)

Trigonopsi 1 : ---MAKIVVIGAGVAGLTTALQLLR-KGHEVTIVSEFTPGDLSIGYTSPWAGANWLTFYDGGKLADYDAVSYPILRELARSSPEAGIRLISQRS--HVLK : 94 Fusarium_s 1 : --MSNTIVVVGAGVIGLTSALLLSKNKGNKITVVAKHMPGDYDVEYASPFAGANHSPMATEE-SSEWERRTWYEFKRLVEEVPEAGVHFQKSRIQRRNVD : 97 Rhodospori 1 : MHSQKRVVVLGSGVIGLSSALILARKGYSVHILARDLPEDVSSQTFASPWAGANWTPFMTLTDGPRQAKWEESTFKKWVELVPTG------------HAM : 88 Mus_muscul 1 : ----MRVAVIGAGVIGLSTALCIHERYHPTQP-LHMKIYADRFTPFTTSDVAAGLWQPYLSDPSN-PQEAEWSQQTFDYLLSCLHSPNAEK--------M : 86 Rattus_nor 1 : ----MRVAVIGAGVIGLSTALCIHERYHPAQP-LHMKIYADRFTPFTTSDVAAGLWQPYLSDPSN-PQEAEWNQQTFDHLQSCLHSPNAEK--------M : 86 Sus_scrofa 1 : ----MRVVVIGAGVIGLSTALCIHERYHSVLQPLDVKVYADRFTPFTTTDVAAGLWQPYTSEPSN-PQEANWNQQTFNYLLSHIGSPNAAN--------M : 87 homo_sapie 1 : ----MRVVVIGAGVIGLSTALCIHERYHSVLQPLDIKVYADRFTPLTTTDVAAGLWQPYLSDPNN-PQEADWSQQTFDYLLSHVHSPNAEN--------L : 87 Oryctolagu 1 : ----MRVVVIGAGVIGLSTALCIHELYHSALQPLDMTIYADRFTPLTNTDVAAGLWQPYLSDPSN-PQEADWSRQTFNHLLSHIHSPSAEK--------M : 87 Caenorhabd 1 : --MANIIPKIAIIGEGVIGCTSALQISKAIPNAKITVLHDKPFKKSCSAGPAGLFRIDYEENTEYGRASFAWFSHLYRTTK---GSETGVK--------L : 87 Trigonopsi 95 : RDLPKLEVAMSAICQRNPWFKNTVDSFEIIEDR--SRIVHDDVAYLVEFRSVCIHTGVYLNWLMSQCLSLGATVVKRRVNHIKDANLLHSSGSRPDVIVN : 192 Fusarium_s 98 : TEKAQRSGFPDALFSKEPWFKNMFEDFREQHPS--EVIPGYDSG--CEFTSVCINTAIYLPWLLGQCIKNGVIVKRAILNDISEAKKLSHAGKTPNIIVN : 193 Rhodospori 89 : WLKGTRRFAQNEDGLLGHWYKDITPNYRPLPSS--ECPPGAIGVT---YDTLSVHAPKYCQYLARELQKLGATFERRTVTSLEQAFDG------ADLVVN : 177 Mus_muscul 87 : GLALISGYNLFRDEVPDPFWKNAVLGFRKLTPS-EMDLFPDYG-YGWFNTSLLLEGKSYLPWLTERLTERGVNLIHRKVESLEEVARGG-----VDVIIN : 179 Rattus_nor 87 : GLALISGYNLFRDEVPDPFWKSTVLGFRKLTPS-ELDMFPDYS-YGWFNTSLLLEGKSYLSWLTERLTERGVKFIHRKVASFEEVVRGG-----VDVIIN : 179 Sus_scrofa 88 : GLTPVSGYNLFREAVPDPYWKDMVLGFRKLTPR-ELDMFPDYR-YGWFNTSLILEGRKYLQWLTERLTERGVKFFLRKVESFEEVARGG-----ADVIIN : 180 homo_sapie 88 : GLFLISGYNLFHEAIPDPSWKDTVLGFRKLTPR-ELDMFPDYG-YGWFHTSLILEGKNYLQWLTERLTERGVKFFQRKVESFEEVAREG-----ADVIVN : 180 Oryctolagu 88 : GLALISGYNLFRKAVPDPSWKDTVLGFRKLTLR-ELDMFPGYS-YGWFNTSLILDGRSYLQWLTKRLTERGVKLFQRKVESFDEVAGGG-----VDVIVN : 180 Caenorhabd 88 : VSGHIQSDNLESLKQQQRAYGDIVYNFRFLDDRERLDIFPEPSKHCIHYTAYASEGNKYVPYLKNLLLEQKIEFKQQEVTSLDAVADAG-----YDVIVN : 182 Trigonopsi 193 : CSGLFARFLGGVEDKKMYPIRGQVVLVRNSLPFMASFSSTPEKENEDEALYIMTRFDG-TSIIGGCFQPNNWSSEPDPSLTHRILSRALDRFPELTKDG- : 290 Fusarium_s 194 : ATGLGSYKLGGVEDKTMAPARGQIVVVRNESSPMLLTSGVE--DGGADVMYLMQRAAGGGTILGGTYDVGNWESQPDPNIANRIMQRIVEVRPEIANGKG : 291 Rhodospori 178 : ATGLGAKSIAGIDDQAAEPIRGQTVLVKSPCKRCTMDSSDP-----ASPAYIIPRPGG-EVICGGTYGVGDWDLSVNPETVQRILKHCLRLDPTISSDGT : 271 Mus_muscul 180 : CTGVWAGALQADA--SLQPGRGQIIQVEAPWIKHFILTHDPSLGIYNSPYIIP---GSKTVTLGGIFQLGNWSGLNSVRDHNTIWKSCCKLEPTLKNARI : 274 Rattus_nor 180 : CTGVWAGALQADA--SLQPGRGQIIQVEAPWIKHFILTHDPSLGIYNSPYIIP---GSKTVTLGGVFQLGNWSELNSVHDHNTIWKSCCQLEPTLKNARI : 274 Sus_scrofa 181 : CTGVWAGVLQPDP--LLQPGRGQIIKVDAPWLKNFIITHDLERGIYNSPYIIP---GLQAVTLGGTFQVGNWNEINNIQDHNTIWEGCCRLEPTLKDAKI : 275 homo_sapie 181 : CTGVWAGALQRDP--LLQPGRGQIMKVDAPWMKHFILTHDPERGIYNSPYIIP---GTQTVTLGGIFQLGNWSELNNIQDHNTIWEGCCRLEPTLKNARI : 275 Oryctolagu 181 : CTGVWASALQPDP--LLQPGRGQIIKVDAPWVKHFIITHDPESGIYKSPYIIP---GVHAVTLGGIFQMGNWSEGNSTDDHNTIWKGCCSLEPTLKDARI : 275 Caenorhabd 183 : CAGLYGGKLAGDDD-TCYPIRGVILEVDAPWHKHFNYRD-------FTTFTIP---KEHSVVVGSTKQDNRWDLEITDEDRNDILKRYIALHPGMREPKI : 271 Trigonopsi 291 : --PLDIVRECVGHRPGREGGPRVELEKIPG----------------------VGFVVHNYGAAGAGYQSSYGMADEAVSYVERALTRPNL-------- : 356 Fusarium_s 292 : VKGLSVIRHAVGMRPWRKDGVRIEEEKLDD----------------------ETWIVHNYGHSGWGYQGSYGCAENVVQLVDKVGKAAKSKL------ : 361 Rhodospori 272 : IEGIEVLRHNVGLRPARRGGPRVEAERIVLPLDRTKSPLSLGRGSARAAKEKEVTLVHAYGFSSAGYQQSWGAAEDVAQLVDEAFQRYHGAARESKL- : 368 Mus_muscul 275 : VGELTGFRPVR--PQVRLEREWLRFGSS------------------------SAEVIHNYGHGGYGLTIHWGCAMEAANLFGKILEEKKLSRLPPSHL : 346 Rattus_nor 275 : MGELTGFRPVR--PQVRLERERLRFGSS------------------------SAEVIHNYGHGGYGLTIHWGCAMEAANLFGKILEEKNLSRMPPSHL : 346 Sus_scrofa 276 : VGEYTGFRPVR--PQVRLEREQLRFGSS------------------------NTEVIHNYGHGGYGLTIHWGCALEVAKLFGKVLEERNLLTMPPSHL : 347 homo_sapie 276 : IGERTGFRPVR--PQIRLEREQLRTGPS------------------------NTEVIHNYGHGGYGLTIHWGCALEAAKLFGRILEEKKLSRMPPSHL : 347 Oryctolagu 276 : VGEWTGFRPVR--PQIRLGREQLSAGPS------------------------KTEVIHNYGHGGYGLTIHWGCALEAAKLFGKILEEKKSSRMPPSHL : 347 Caenorhabd 272 : IKEWSALRPGR--KHVRIEAQKRTSVGNSK----------------------DYMVVHHYGHGSNGFTLGWGTAIEATKLVKTALGL----------- : 334

Cys 193

in silico analiza: eng. multiple sequence alignmentLactobacillus sp. alpha-amylases consisted of 412-440 amino acid residues (Vector NTI Software)

(alignment settings: ClustalW2,

slow alignment, gap open 10, gap

extension 0.20, gap distance 5,

no end gaps, clustering NJ)

74

in silico analiza: 3D model proteina

http://swissmodel.expasy.org

hyperlink

75

in silico modeli

- set primarnih informacija koji se odnosi na odreeni (mikro)organizam

- baza podataka nainjena od biokemijskih, genetikih i drugih podataka iji se meuodnos moe

opisati matematikim jednadbama

76

in silico modeli: razvoj metabolikog modela E. coli

reakcijegenimetaboliti

godina

razvoj

genomika era

b

r

o

j

p

u

b

l

i

k

a

c

i

j

a

rekonstrukcija odjeljaka stanice (periplazma)metabolizam stanine stijenka (fosfolipidi, murein, LPS)termodinamika reakcija

drugi putevi koritenja ugljikakarakterizacija kinonabilanca razliitih elemenata i naboja

metabolizam masnih kiselinatransport u i iz stanice - proirena verzijadio genoma

biosinteza sastojaka stanine stijenkebiosinteza kofaktorafunkcije biomase vezane uz rast stanica

sinteza aminokiselina i nukleotida

77

in silico model stanice patogena Mycoplasma genitalium

FtsZ protein formira prsten gdje se kasnije formira septum (dioba bakt. stanice);ordinary differential equation, ODE.

1. Odabrano 28 kljunih procesa u stanici;

2. za svaki od 28 odabranih procesa u stanici formiran matematiki model;

3. simulacija funkcioniranja stanice ograniena na korake u trajanju od t = 1 s;

4. na kraju svakog koraka dobiju se vrijednosti za 16 varijabli;

5. simulacija zavrava/zapoinje diobom stanice.

1.2.4.

5.

78

primjena kemostata u istraivanjima fiziologije mikroorganizama - istraivanja uz koritenje kultura uzgojenih arnim postupkom npr. tijekom uzgoja uz stresanje:

hranjiva podloga nacijepljena relativno niskom koncentracijom stanica,

stanice rastu uz stalno smanjenje koncentracije supstrata,

stanice iz eksponencijalne faze rasta.

D = - uzgoj stanica u (ne)kontroliranim (ustaljeno stanje) i ponovljivim uvjetima- stanice kemostat kulture natjeu se za limitirajui supstrat

- problemi vezani za uspostavljanje ustaljenog stanja:neidealno mijeanje (koncentracijski gradijenti)rast biomase na stijenkamakoncentriranje stanica u pjenivrijeme obrade uzorka prije analize

- kemostat

- konstantan volumen odrava se preljevnom cijevi

- supstrat ulazi u bioreaktor i troi se za rast stanica

pa je konc. supstrata u izlaznom toku manja od ulazne

- stanice u reaktoru rastu brzinom () koja je odreenadotokom svjee podloge (D), a istom se brzinom i

razrjeuju, pa je konc. stanica u reaktoru konstantna

79

primjena kemostata u istraivanjima fiziologije mikroorganizama

limitacija supstratom

suboptimalni uvjeti rasta stanice (glad, D!)

alarmon mutacija

(brza) promjena i prilagodba na novonastale uvjete

transport

metabolizam

respiracija

evolucija

- istraivanje odziva staninog metabolizma na promjene u okolini stanice, stupnjevite i pulsne

80

primjena kemostata kod in vivo istraivanja fiziologije mikroorganizama (1)

- uzorkovanje (A) i analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i

energetskih spojeva ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s

A1B

B1 B2 B3

J. Villadsen, M. Reuss

(CSTR)

(vakumirane ohlaene epruvete koje sadre odgovarajuu smjesu)

stopped-flow metod a(enzimska kinetika)

komora za

mijeanje

S. cerevisiae: dinamika glikolize

A2

B1S

B1P1

B1P2

B1P3

81


- analiza (B) supstrata i vanstaninih proizvoda (B1), unutarstaninih meuspojeva (B2) i energetskih spojeva

ATP/ADP/AMP/Pi (B3) nakon pulsa glukoze u vremenu t = 0 - 120 s

Metabolic Control Analysis (MCA)

kontinuirani uzgoj, puls glukoze

(npr. S = 20 mg L-1, puls glukoze S = 1 g L-1)

promjene u koncentraciji spojeva (t s) zbog regulacije metabolizma

(promjene konc. proteina zanemarive)

BB1 B2 B3



B1S

B1P1

B1P2

B1P3

82





glukoza glicerol (B1P1)acetat (B1P2)

etanol (B1P3)

BB1 B2 B3



B1S

B1P1

B1P2

B1P3

83





promjena koncentracije unutarstaninih

meuspojeva pokazuje kontrolu metabolizma

glukoze povratnom spregom

nakon pulsa glukoze raste brzina metabolizma

glukoze za 6 puta (B1S) viak glukoze se fosforilira (heksokinaza, HK) i

tako se poveava unutarstanina koncentracija

G6P (B2) (aktivnost fosfofruktokinaze,PFK, je slaba)

PFK se aktivira zbog opadanja konc. ATP (B3) i

zbog poveanja konc. F6P (B2), AMP i ADP (B3)

BB1 B2 B3



heksokinaza

B1S

B1P1

B1P2

B1P3

84





opada potronja glukoze jer G6P (B2) inhibira

njezin transport (transport permeazom)

koncentracije F1,6P i GAP (B2) ostaju visoke

kroz period od 100 s zbog regulacijeglikolize i pentoza-P puta

porast konc. G6P na poetku povezan je s

porastom konc. 6P-glukonata i porastom

potronje glukoze kroz pentoza-P put

zbog toga i konc. F1,6P i GAP ostaju

relativno konstantne i visoke kroz ovaj period

BB1 B2 B3



heksokinaza

B1S

B1P1

B1P2

B1P3

85





koncentracija PEP (B2) opada zbog aktivacije

piruvat kinaze (PK) i to visokom konc. F1,6P

porast konc. F1,6P vodi ka brzom

opadanju konc. PEP koji se prevodi u piruvat

nakon pulsa glukoze val ugljika prenosi se niz

glikolizu

BB1 B2 B3



B1S

B1P1

B1P2

B1P3

86





raste konc. NADH u citoplazmi kao i konc. PO43-

(B3); PK vue 1,3-DPG; odvija se transport

glicerola iz stanice (B1P1) i smanjuje se konc.

NADH u stanici

BB1 B2 B3



B1S

B1P1

B1P2

B1P3

87





konc. ATP opada brzo nakon pulsa glukoze

ATP se troi za fosforilaciju (HK i PFK) bre

nego to ATP nastaje u kasnijim reakcijama glikolize

ne nastaje glikogen jer je za taj proces potrebna

visoka konc. ATP

BB1 B2 B3



B1S

B1P1

B1P2

B1P3

88

NMR analiza metabolikih flukseva (1)

NMR - nuklearna magnetna rezonancija

- in vivo NMR je neinvazivna metoda odreivanja koncentracije metabolitau razliitim odjeljcima stanice

- princip: u magnetnom polju elektroni odreenog atoma krue u smjeru ovog polja;kruenjem elektrona nastaje drugo, suprotno magnetno polje oko jezgre atoma; gustoa elektrona oko jezgre atoma ovisi o vrsti jezgre i vrsti veza kod odreenemolekule (npr. metanol)B

B

metanol

89


- princip: jezgre atoma koji imaju neparan atomski broj (npr. 1H i 13C) imaju spin (slian spinu elektrona);jezgra predstavlja nabijenu esticu koja se kree i samim time stvara magnetno polje; bez

vanjskog magnetnog polja jezgre atoma imaju tzv. sluajnu orijentaciju, primjenom magnetnogpolja jezgre ovih atoma orijentiraju se paralelno s poljem; EM se koristi za okretanje (eng. flip)spinova; koliina energije koju je potrebno uloiti za flip ovisi o jaini magnetnog polja

bez magnetnog polja magnetno polje

B

h

pobueno stanje

B

90


- osnovne komponente NMR sustava: uzorak smjeten u magnetnom polju pobudi se pulsevimaradio frekvencije, tada magnetno polje inducira radio signalkoji se koristi za formiranje izlaznog signala, Fourier analizakompleksnih izlaznih signala formira konani spektar

- primjena: NMR analiza 31P omoguavapraenje metabolizma ugljikohidratajer se ovom metodom mogu razlikovati unutarstanini i van-stanini anorganski fosfat, zatimpirofosfat, ATP, ...;NMR analiza 13C zahtijevakoritenje spojeva bogatih naovom izotopu;metaboliko inenjerstvo

91

NMR analiza metabolikih flukseva (3a)

92

primjena radioizotopa

- Geiger i scintilacijski brojai- primjena:

stupnjevita (eng. step) ili udarna (eng. pulse-chase) pobuda(kratkotrajna pobuda radioaktivnim materijalom koji se ispire i zamjenjuje molekulama koje ne pokazuju radioaktivnost)

odreivanje redoslijeda reakcija u biokemijskim putevimapraenje ugradnje graevnih blokova u polimere

lokalizacija odreenih funkcija u staniciautoradiografija (istraivanje funkcija tkiva pod mikroskopom)analiza frakcija stanica

prouavanje transporta u stanicu

93

primjena radioizotopa - transport supstrata u stanicu mikroorganizma

transport glukoze u stanice kvasca Saccharomyces cerevisiae

scintilacijsko brojanje: odreivanje radioaktivnog raspada odreene tvari tj. odreivanje koliine radioaktvnosti u uzorku.U koktelu se odvijaju fizikalno-kemijske reakcije tj. energija koja se oslobaa tijekom radioaktivnog raspada prevodi se u energiju koja se mjeri scintilacijskim brojaem.

scintilacijski broja: fotoelija visoke rezolucije koja moe detektirati -estice (jezgre He), -estice (elektroni), - i x-zrake, te pozitrone, Comptonove i Angerove elektrone.

Najee su se koristile 14C, 3H i 32P tj. detektirale -estice.

94

- protuijela su proteini koje proizvode kraljenjacikao obranu nakon infekcije

- to su jedinstveni proteini koji prepoznajuspecifinu molekulu - antigen

- odreeni antigen izaziva sintezu odreenogproteina

- obiljeavanje fluorecentnim spojevima(fluorescentna mikroskopija, FM)

primjena protutijela

- visoka specifinost reakcije antigen-protutijelo- antigeni: proteini, DNA, RNA, polisaharidi,

organeli, druga antitijela

- heteroklonska protutijela (B-limfociti, antiserum, ivotinje)

- monoklonska protutijela (tehnologija hibridoma)

antitijelo

antigen

95

primjena antitijela kloniranje B-limfocita koji proizvode

jednu vrstu antitijela

(homogena monoklonalna antitijela)

B-limfociti iz imunizirane ivotinje

fuzirani s besmrtnim tumornim B-

limfocitima

animacija: Producing Monoclonal Antibodies

96

primjena antitijela

Primarne stanicestanice osloboene od ostalog dijela tkiva uzgojene u prikladnim uvjetimarastu i razmnoavaju se tek nekoliko generacija

Besmrtne stanice(kontinuirane stanine linije)posebni izolati koji se razmnoavaju beskonano

Hibridoma hibrid izmeu primarnih stanica B limfocita i mutiranih - tumornih stanicaB limfocita,besmrtne stanice sa znaajkama primarnih stanica

Uzgoj biljnih i ivotinjskih stanica omoguava industrijsku proizvodnjuvakcina, virusa, specifinih proteina koji se ne mogu proizvesti drugim organizmima; monoklonska antitijela u terapeutske, dijagnostike i znanstvene svrhe;specifinih metabolita biljaka i ivotinja (prehrambeni aditivi, parfemi, agrokemikalije,insekticidi, ...)

97

primjena antitijela

- mogunost kvalitativne i kvantitativne analizespecifinih antigena

- RIA (eng. RadioImmunoAssay; antitijela sa radioizotopom)

- ELISA (eng. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay;antitijela s enzimom)

animacija: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Direct & Indirect ELISA Method)

98

primjena antitijela

- imunocitokemija (antitijela s feritinom za TEM;fluorescentna antitijela za FM)

- afinitetna kromatografija (High-Performance Immuno Affinity Chromatography, HPIAC):

izdvajanje i analiza specifinih biolokih spojeva(RF, GC, CE, kiralni spojevi, tandem affinity)

analiza teofilina pomou HPIAC, kompetitivno vezanje teofilina na imuno-afinitetnu kolonu, teofilin povezan s liposomom koji sadrikarboksifluorescein kao marker

99

proizvodni mikroorganizam moe biti izolat iz prirode (nasumino)inducirani mutant (nasumino)konstruiran tehnologijom rDNA (selektivnost)

povijesni pregled1869 Miescher izolirao DNA1944 Avery dokazao da je genetika informacija zapisana u DNA, a ne u proteinima1953 Watson i Crick prikazali strukturu DNA modelom dvostruke uzvojnice na temelju rezultata

kristalografije X-zrakama za koji su zasluni Franklin i Wilkins1961 Marmur i Doty otkrili renaturaciju DNA ime su omoguene reakcije hibridizacije DNA1962 Arber otkrio restrikcijske endonukleaze, za njihovu purifikaciju i primjenu u genetikom

inenjerstvu zasluni Nathans i H. Smith1966 Nirenberg, Ochoa i Khorana objanjavaju genetiki kod1967 Gellert otkrio DNA ligazu, enzim koji se koristi za spajanje fragmenata DNA1972-1973 Boyer, Cohen, Berg (Stanford, UC San Francisco) razvili tehnike kloniranja1975-1977 Sanger i Barrel, te Maxam i Gilbert razvili brzu metodu za sekvencioniranje DNA (odreivanje redosljeda

nukleotida)

genetika informacija moe biti prepisana iz DNA davatelja gena (niska selektivnost)banke gena davatelja (vii stupanj selektivnosti)mRNA davatelja gena (vii stupanj selektivnosti)

genetiko inenjerstvo - tehnologija rekombinantne DNA (rDNA)

100

genetiko inenjerstvo

restrikcijske endonukleaze restrikcijski fragmenti i restrikcijske mape DNA ligaza: kloniranje heterologne DNA uplazmide i viruse

transformacija plazmidne ili virusne DNA ustanicu domaina

tehnike hibridizacije reverzna transkriptaza: kopiranje mRNA ucDNA (komplementarna, kopirana)

(automatsko) odreivanje redosljeda baza(eng. sequencing)

odreivanje redosljeda aminokiselinaproteina iz redoslijeda baza

genomika (sekvencioniranje ukupnoggenoma; omics)

proteinsko inenjerstvo

http://www.neb.com/nebecomm/products/productN6701.asp

101

vanost genetikog inenjerstva u biotehnologiji:

mogunost dobivanja rijetkih proteina iz bilo kojeg izvora u dostatnim koliinama zaistraivanje,

odreivanje redoslijeda aminokiselina u proteinima preko redoslijeda nukleotida u DNA, odreivanje redoslijeda nukleotida cijelog genoma,

proizvodnja specifinih proteina u industrijskom mjerilu, metaboliko inenjerstvo (dobivanje novih proizvoda metabolizma ubacivanjem gena za nove enzime),

razvitak vektora za ubacivanje heterolognih gena u ivotinjske i biljne stanice(transgenine ivotinje i biljke).

genetiko inenjerstvo - tehnologija rekombinantne DNA (rDNA)

102

baze podataka

103

genetiko inenjerstvo

dobivanje i prouavanje mutanata mutanti: apsolutni i uvjetni (npr. temperaturni) odreivanje redoslijeda reakcija kod biokemijskih puteva prouavanje regulacijskih mehanizama prouavanje transporta izrada genetike mape (genetike rekombinacije)

ccpA catabolite control protein A

cre catabolite responsive element

noxE NADH oksidaza (H2O)

animacije:The Meselson-Stahl ExperimentHigh-Throughput SequencingConstruction of a DNA Library

Life Cycle of an mRNAThe Polymerase Chain Reaction (PCR)Plasmid Cloning

104

1. L. Bachmann, W.W. Schmitt (1971) Improved cryofixation applicable to freeze etching, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 68, 2149-2152.

2. D. Branton et al. (2005) The invention of freeze fracture EM and the determination of membrane structure, The Journal of Cell Biology 168, 174-175.

3. B.F. Brehm-Stecher , E.A. Johnson (2004) Single-cell microbiology: tools, technologies, and applications, Microbiology and Molecular Biology Reviews 68(3), 538-559.

4. B-PER Protein Extraction Reagents : http://www.piercenet.com/products.5. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. (1989) Electrospray ionization for mass spectrometry of

large biomolecules, Science, 246(4926):64-71.6. A.M. Feist, B.. Palsson (2008) The growing scope of applications of genome-scale metabolic reconstructions using

Escherichia coli, Nature Biotechnology 26(6) 659-667.7. T. Ferenci (2007) Bacterial physiology, regulation and mutational adaptation in a chemostat environment, Advances in

Microbial Physiology 53, 169-229.8. Genome News Network: http://www.genomenewsnetwork.org/articles/03_01/Genomes_lit.shtml9. Grupa autora: Biochemical Engineering Principles, M. Berovi, A.W. Nienow (eds.), Faculty of Chemistry and Chemical

Technology, University of Ljubljana, Slovenia (2006).10. D.S. Hage (1999) Affinity chromatography: a review of clinical applications, Clinical Chemistry 45, 593-615.11. Huek, P. (1995) Simultaneous profile analysis of plasma amino and organic acids by capillary gas chromatography,

Journal of Chromatography B, 669, 352-357.12. Karas M., Hillenkamp F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000

daltons, Anal. Chem. 60(20):2299-301. 13. J.R. Lakowicz: Pinciples of Fluorescence Spectroscopy, 2nd edition , Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York

(1999).14. V. Mari, B. antek: Biokemijsko inenjerstvo, S. Grba, P. Horvat, P. Raspor (eds.) Golden marketing - Tehnika

knjiga, Zagreb (2009).15. M. Mueller, R. Kratzer, M. Schiller, A. Slavica, G. Rechberger, M. Kollroser, B. Nidetzky (2010) The role of Cys108 in

Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase examined through chemical oxidation studies and point mutations C108S and C108D, Biochimica et Biophysica Acta, 1804: 1483-1491.

literatura (1)

105

16. A. Mueller-Taubenberger, K.L. Anderson (2007) Recent advances using green and red fluorescent protein variants, Applied Microbiology and Biotechnology 77, 1-12.

17. Plazmid: http://www.neb.com/nebecomm/products/productN6701.asp 18. A.R. Neves et al. (2005) Overview on sugar metabolism and its control in Lactococcus lactis The input from in vivo

NMR, FEMS Microbiology Reviews 29, 531-554.

19. Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb.

20. D. Santos Pontes et al. (2007) Molecular approaches: advantages and artifacts in assesing bacterial diversity, Industrial Microbiology and Biotechnology 34, 463-473.

21. A. Slavica, I. Dib, B. Nidetzky (2005) Single-site oxidation, cysteine 108 to cysteine sulfinic acid, in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis and its structural and functional consequences, Applied and Environmental Microbiology 71(12):8061-8068.

22. D. Straganz, A. Slavica, H. Hofer, U. Mandl, W. Steiner, B. Nidetzky, (2005) Integrated approach for production of recombinant acetylacetone dioxygenase from Acinetobacter johnsoni, Biocatalysis and Biotransformation 23(3-4):261-9, 2005.

23.The Genome Database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov24. C. Trampitsch, A. Slavica, W. Riethorst, B. Nidetzky (2005) Reaction of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with

2,6-dichloroindophenol: kinetic characterization and development of an oxygen-independent assay of the enzyme activity, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 32:271-278.

25. Trodimenzionalni model proteina: http://swissmodel.expasy.org26. J.V. Shanks (1988) Metabolic engineering applications of in vivo 31P and 13C NMR studies of Saccharomyces

cerevisiae, PhD Thesis.

27. A. Trontel, et al., A. Slavica, S. Novak (2010) (analysis of amino acids) to be published.28. A. Trontel, et al., A. Slavica, S. Novak (2010) (analysis of oligosaccharides) to be published.

literatura (2)

106

29. J. Varnerm D. Ramkrishna (1999) Mathematical models of methabolic pathways, Current Opinion in Biotechnology 10, 146-150.

30. R.A. Weusthuis et al., Chemostat cultivation as a tool for studies on sugar transport in yeasts, Microbiological Reviews 58, 616-630.

31. J. Gunawardena (2012) Silicon dreams of cells into symbols, Nature Biotechnology 30, 838-840.32. http://www.ncbi.nlm.nih.gov

literatura (3)

107

BIOMEMBRANE GRAA I FUNKCIJA

108

biomembrane (1)

plazmina membrana: hidrofobni lipidni dvosloj irine 4-5 nm (30 -10 nm), dinamino organiziran okomitoi lateralno, predstavlja granicu ivota i smrti za stanicu

kako i gdje je nastala prva stanica ?

(ko-)evolucija citoplazme i membrane: meudjelovanje povrina i problem formiranja stanice

109

biomembrane - zajednike karakteristike (2)

sastoje se iz lipida (35-50%) i proteina (50-65%)

molekule lipida poredane su u neprekinuti dvostruki sloj (lipidni dvosloj)

lanci masnih kiselina su hidrofobni, dok je ostatak polaranpolarna glava: glicerol + fosforna kiselina + alkoholamin

molekula fosfolipida je amfifilna

lipidni dvosloj predstavlja osmotsku barijeru (nepropustan je za veinu u vodi otopljenih molekula)

proteini membrane (membranski proteini) otopljeni su u lipidnom dvosloju

lipidni dvosloj je dvodimenzionalna tekuina, ima dinaminu i fluidnu strukturu (velika horizontalnapokretljivost molekula lipida i proteina)

lipidomics

oko 5% gena eukariotske stanice kodira za sintezu lipida

citoplazma

periplazma

110

biomembrane - zajednike karakteristike (3)

lipidomics - MS/MS

ionizacija

kvadrupol

kolizijaMS

(kvadrupol, TOF, IT)

detektor,pojaiva signala

2. m/z filter1. m/z filter

111

biomembrane - sinteza i transport lipida (4) sinteza lipida odvija se u

endoplazmatskom retikulumu (mreici) i brzo setransportiraju do drugih organela; Golgi kompleksu i transportiraju doendosoma, vakuola, ER, plazminemembrane;mitohondrijima (kvasci i sisavci)

plazmina membrana nije odjeljakgdje se odvija autonomna sintezastrukturnih lipida, ovdje se odvijajuspecifine reakcije (protein-lipidreakcije) kao dio signalnih kaskada

sve organele sadre lipide koji sutransportirani od odjeljka gdje susintetizirani

sisavci kvasci

PL - fosfolipid

plavi PL - struktura

crveni PL - signaling

CHOL - kolesterol (sisavci)

ERG - ergosterol (kvasci)

PC - fosfatidil-kolin

PE - fosfatidil-etanolamin

PI - fosfatidil-inozitol

PS - fosfatidil-serin

PA - fosfatidna kiselina

PG - fosfatidil-glicerol

Cer - ceramid

TG - triacilglicerol

SM - sfingomijelin

GSL - glikosfingolipid

ISL - inozitol-sfingolipid

DAG - diacil-glicerol

CL - kardiolipin

Sph - sfingozin

plazmina membrana

endoplazmatski restikulum

mitohondrij

Golgi

nucleus

endosom

112

biomembrane - lipidi (5)

struktura lipida membrane

1 i 2 - masne kiseline

N+(CH3)3

113


struktura lipida membrane

arhebakterije: eteri glicerola i dugolananih alkohola izoprenske strukture (C20-C40)

prave bakterije i eukarioti: esteri glicerola tzv. glicerofosfolipidi (derivati fosfatidne kiseline)najei: fosfatidil-kolin (eukarioti)

fosfatidil-etanolamin (eukarioti i eubakterije)fosfatidil-serin (eukarioti i eubakterije)fosfatidil-inozitol (eukarioti)

114

struktura lipida membrane glicerofosfolipidi fosfatidil-glicerolbisfosfatidil-glicerol

generika imena za cijelu grupu spojeva ovisno o tome koji su radikali (acili)masnih kiselina vezani za molekulu glicerola; u pravilu su to masne kiseline sparnim brojem ugljikovih atoma (C10-C20); po strukturi to mogu biti:

1. ravni zasieni lanci: najee palmitinska (C16) i stearinska kiselina (C18; CH3(CH2)14COO-).

2. ravni nezasieni lanci (cis dvostruka veza): oleinska kiselina (C18:1; CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COO-).

3. razgranati lanci (prokarioti).

4. lanci sa ciklopropanom (prokarioti).


CH3

CO

CH3(CH2)6CH2C

O

COH3C

H3C

CO

H3C

115


pored glicerofosfolipida u grai lipida membrane sudjeluju iglikolipidi (oligosaharidi vezani na glicerofosfolipid)steroli (kolesterol, zimosterol, ergosterol)

steroli stabiliziraju membranu i poveavaju fluidnost membrane; regulacija fluidnosti membrane od bitne jevanosti za stanine funkcije, naroito za funkcije proteina membrane.

fluidnost lipidnog dvosloja ovisi o strukturi lipida membrane

116


osnovne funkcije lipida u stanici:

spremite energije i spojeva (m. kis. i steroli) za biogenezu membrana stanice

polarni lipidi dio su matriksa staninih membrana (entropijski povoljna reakcija asocijacijehidrofobnih dijelova lipida, kao i njihovih hidrofilnih dijelova koji reagiraju jedni s drugima i smolekulama vode, osnova je spontanog formiranja membrana/organela)

osim barijere, lipidi omoguavaju pupanje, fuziju i druge promjene membrana kojesu preduvjet za procese diobe stanice, reprodukcije i transporta

lipidi sudjeluju u procesima prijenosa signala/informacija u membrani (hidrofobni dio) icitosolu (hidrofilni dio)

117

biomembrane - lipidi: struktura i signaling (10)

hidrofobnost

(eng. messenger lipids)

118


osnovne funkcije lipidnog dvosloja:

osmotska barijera

smjetaj proteina membrane koji obavljaju brojne funkcije membrane:

- transport odreenih molekula u stanicu i iz stanice- oksidoredukcijske reakcije (respiracijski lanac)- fosforilacija (H+-ATP-sintaze)- fotofosforilacija- biosinteza stanine stijenke- primanje signala iz okoline stanice (proteini-receptori)- povezivanje citoskeletona i vanjskog omotaa (strukturni proteini)- pretvorba energije potrebne organelima za proces pokretanja

prokarioti: sve pobrojane funkcije odvijaju se u plazminoj membrani; ako ova povrina nije dostatna zapotrebe stanice, onda se obino povrina membrane poveava invaginacijom u obliku mjeinica, cjevica,membranskih slojeva i tilakoida

eukarioti: stanice su znatno vee, pa je i omjer povrine i volumena znatno manji; manjakmembranskepovrine nadoknauje se unutarstaninim membranama koje formiraju odvojene odjeljke stanice -organele; kod ivotinjskih stanica plazmina membrana ini samo 2-5% ukupnih membrana stanice.

citoplazma

periplazma

119

biomembrane - proteini (12)

veina proteina membrane ugraeno je u lipidni dvosloj hidrofobnim interakcijama sa lipidnim molekulama

nano-motor za pumpanje protona

mitohondrijska sekundarna

pumpa

citosol pH 7,4

matriks pH 7,4

membrana

membrana

meumembranskiprostor mitohondija pH 7,0

animacija: ATP Synthase Mechanism

120

biomembrane - odjeljci stanice (13)

121

organele s dvostrukom membranomjezgra mitohondrij

kloroplast

biomembrane - organele (14)

122

organele s jednostrukom membranom

endoplazmatska mreica (retikulum) Golgijev kompleks (usmjeravanje proteina ka razliitim odreditima)

lizozom peroksizom

biomembrane - organele (15)animacija: Vesicle Budding and Fusing

123

biomembrane - organele (16)

124

biomembrane (17)poveimo prvo predavanje i biomembrane: proizvodnja aminokiselina s pomou bakterija C. glutamicum i

E. coli - transport molekula i iona u stanicu i iz stanice

125

biomembrane (18) transport vezikulama kod eukariota

a1, a2, a3, a4-izoforme ATPaze

animacija: Vesicle Budding and Fusing

Protein Secretion

126

1. A. Burkovski, R. Krmer (2002) Bacterial amino acid transport proteins: occurence, functions, and significance for biotechnological applications, Applied Microbiology and Biotechnology 58, 265-274.

2. G. Griffiths (2007) Cell evolution and the problem of membrane topology, Nature Reviews 8, 1018-1024.3. Grupa autora: Molecular biology of the cell, B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson (eds.),

Garland Publishing, Inc., New York (1983).4. Grupa autora: Biology of the procaryotes, J.W. Lengeler, G. Drews, H.G. Schlegel (eds.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart,

Germany (1999).5. Grupa autora: Applied Microbial Physiology, P.M. Rhodes, P.F. Stanbury (eds.), IRL Press at Oxford University Press,

Oxford, UK (1997).6. V. Marshansky, M. Futai (2008) The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function, Current

Opinion in Cell Biology 20, 415-426.7. S. Martens, H.T. McMahon (2008) Mechanisms of membrane fusion: disparate players and common principles, Nature

Reviews 9, 543-556.8. A.G. Moat, J.W. Foster: Microbial physiology, 3rd edition, A.G. Moat, J.W. Foster (eds.), Wiley-Liss, New York, USA

(1995).9. G. van Meer, D.R. Voelker, G.W. Feigenson (2008) Membrane lipids: where they are and how they behave, Nature

Reviews 9, 112-12410. C. Wolf, P.J.Quinn (2008) Lipidomics: practical aspects and applications, Progress in Lipid Research 47,15-36.

literatura

127

BIOMEMBRANE I BIOENERGETIKA

128

bioenergetika (1) bioenergetika prouava molekulske mehanizme pretvorbe energije u ivim stanicama

sa gledita termodinamikeiva stanica je NEIZOLIRANI, OTVORENI SUSTAV to znai da moe obavljati izmjenu

tvari i energije s okolinom;

iva stanica je vrlo ureena struktura (niske entropije) koja ima sposobnost

samoreprodukcije pretvorbom jednostavnih kemijskih spojeva iz okoline;

(iva stanica naizgled prkosi II zakonu termodinamike; meutim,...)

IVA JE STANICA KEMIJSKI SUSTAV KOJI DJELUJE U UVJETIMA KONSTANTNOG TLAKA,

VOLUMENA I TEMPERATURE I PROVODI PRETVORBU ENERGIJE IZ JEDNOG OBLIKA U

DRUGI, U SKLADU SA ZAKONIMA TERMODINAMIKE.

129

bioenergetika (2)

STANICA NE MOE PROIZVODITI ENERGIJU IZ NIEGA (I zakon termodinamike), NITI MOE TERMALNU ENERGIJU PRETVARATI U DRUGE OBLIKE SLOBODNE ENERGIJE (II zakon

termodinamike)

POVEANJE REDA (SMANJENJE ENTROPIJE) U STANICI POSLJEDICA JE POVEANJA NEREDA (ENTROPIJE) U OKOLINI STANICE

130

bioenergetika (3) iva stanica koristi ove izvore energije:1. KEMIJSKA ENERGIJA (sva iva bia)

1.1. reducirani spojevi (SUPSTRATI: metan, alkani, alkoholi, organskekiseline, ugljikohidrati, H2, H2S, NH3, itd.; KOENZIMI:NAD(P)H + H+, FAD(H2), FMN(H2))

1.2. spojevi sa velikom energijom hidrolize (SUPSTRATI: 1,3-BPG, PEP, PP, acetil-CoA,

acetil-fosfat; KOENZIMI: ATP, ADP, GTP i drugi trifosfonukleotidi)

1.3. gradijent protona (p)

2. ENERGIJA SVJETLOSTI (h)

131

bioenergetika: transmembranski gradijent protona pokree niz energetskih procesa u stanici (4)

potencijal elektrona

E

GRADIJENT PROTONA

p

proizvodnja topline

sinteza NADPH

aktivni transport

rotacija bakterijskih

flagelaATP

~P

132

kemijske reakcije koje u ukupnosti ine metabolizam stanice dijele se na katabolike i anabolike

KATABOLIZAM ANABOLIZAM

razgradnja sinteza

dobivanje energije troenje energije

dobivanje ATP troenje ATP

dobivanje ekvivalenata redukcije troenje ekvivalenata redukcije

poveanje entropije smanjenje entropije

energetski metabolizam biosinteza staninog materijala

bioenergetika: metabolizam stanice (5)

133

dobivanje ATP u katabolikim reakcijama odvija se na tri naina:1. fosforilacija u lancu supstrata (citoplazma, glikoliza)

2. oksidativna fosforilacija (biomembrane)

3. fotofosforilacija (biomembrane)

oksidativna fosforilacija (stanino disanje ili respiracija)prokarioti: plazmina membrana

eukarioti: unutranja membrana mitohondrija

povezivanje oksidativne fosforilacije i reakcije ATP-sintaze: oksido-redukcijske reakcije u membranidovode do stvaranja transmembranskog protonskog gradijenta; tok protona niz gradijent

koncentracije kroz protonski kanali (podjedinica F0 ATP-sintaze) dovodi do sinteze ATP iz ADP i

fosfata na podjedinici F1 ATP-sintaze

bioenergetika: dobivanje ATP (6)

134

prijenos elektrona - kemiosmotski mehanizam prijenos elektrona i stvaranje gradijenta protona

npr. procesi oksidacije metabolitaili h

proteini membrane

(lanac za prijenos elektrona)

ion-nepropusna membrana



transmembranski gradijent protona (p)

135

prijenos elektrona i fosforilacija ADP (eng. electron-transport-coupled phosphorylation, ETP)

standardni redoks potencijal (E0) razliitih donora i akceptora elektrona pri pH 7lanac za prijenos elektrona i ATP-sintaza u

citoplazmatskoj membrani bakterija

Dred donor (npr. sukcinat)

Aox akceptor (npr. O2)

cilj: sinteza ATP

oxphos

redoks parovi

Acetaldehid / etanolPiruvat / laktatDHAP / glicerol-POksaloacetat / malat

Fumarat / sukcinatNO2- / NH4+Trimetilamin oksid / trimetilaminDimetilsulfoksid / dimetilsulfid

136

QH2

aerobna i anaerobna respiracija (disanje) kod E. coli

glicerol-3-P dehidrogenaza

NADH dehidrogenaza

formijat dehidrogenaza

sukcinat dehidrogenaza

hidrogenaza

laktat dehidrogenaza

fumarat reduktaza

nitrat reduktaza

nitrit reduktaza

dimetil sulfoksid reduktaza

trimetilamin-N-oksid reduktaza

quinol oksidaza

fumarat

sukcinat

NO3-

NO2-

NO2-

NH4+

(CH3)2S=O

(CH3)2S

(CH3)3NO

(CH3)3NH+

O2

H2O

glicerol-P

DHAP

NADH

NAD+

HCO2-

CO2

sukcinat

fumarat

H2

2 H+

laktat

piruvat

Q

ubikinon/ubikonol, menakinon/menakinol ili

demetilmenakinon (-ol) je redoks medijator izmeu

dehidrogenaza i reduktaza (E. coli)

donori e-

(redukcija Q)

Q

akceptori e-

(oksidacija Q)

glc (aer)

animacija: Electron Transport: Aerobic and Anaerobic Conditions

137

RL eukarioti (unutranja membrana mitohondrija)

e- e- e-

kompleks I (protonska pumpa) NADH ubikinon oksidoreduktaza (L-oblik kod svih organizama)

kompleks II sukcinat dehidrogenaza (sukcinat kompleks II ubikinon)

kompleks III (protonska pumpa) ubikinol cytokrom c oksidoreduktaza (citokrom bc1 kompleks)

kompleks IV (protonska pumpa) citokrom c oksidaza

kompleks V F1F0-ATP sintaza (F0 pumpanje protona, F1 katalitika domena, sinteza ATP)

ATP energetska moneta u stanici

animacija: Electron Transport Chain

animacija: ATP Synthase Mechanism

138

RL protonske pumpekompleks I (protonska pumpa) NADH ubikinon oksidoreduktaza

NADH FMN FeSred QoksNAD+ FMNH2 FeSoks Qred

kompleks III (protonska pumpa) ubikinol cytokrom c oksidoreduktaza (citokrom bc1 kompleks)

QH2 cyt b (+3) FeS (+2) cyt c1 (+3) cyt c (+2)

Q cyt b (+2) FeS (+3) cyt c1 (+2) cyt c (+3)

kompleks IV (protonska pumpa) citokrom c oksidaza

cyt c (+2) cyt a (+3) cyt a3 (+2) Cu (+2) H2Ocyt c (+3) cyt a (+2) cyt a3 (+3) Cu (+1) O2

139

lanci za prijenos elektrona kod prokariota (Azotobacter vielandii) i eukariotaciklus limunske kiseline

(mitohondrij)

1135 mV

ulaz e- u RL

razgranati lanci za transport elektrona

NADH + H+

NADPH + H+

NADH + H+

140

neciklika oksidativna fosforilacija

FOTOSUSTAV I (+)

FOTOSUSTAV II

alge, fitoflagelati, zelene biljkefotosinteza (fotoliza vode) H2O + NADP+ NADPH + H+ + O2h

h h

1 V

1 V

(u tilakoidima)

NADPH + H+

animacija: Harvesting Light

141

RL: usporedba fotofosforilacije i oksidativne fosforilacijeQ - prijenosnik e- slian ubikinonu

e-

e-

e-

b-ckompleks

b-fkompleks

b-c1kompleks

citokromoksidaza

142

regulacija transporta H+ za sintezu citosolnog ATP (1)

143


144


145


146

RL: ovjek kompleks I kompleks II kompleks III kompleks IV kompleks V

sukcinat fumarat

147

bioenergetika: neki vani energijom bogati spojevi ATP/ADP/AMP i ATP-Mg2+ kompleks

Oadenin

OH

O CH2P

O-

O-

O

OP

O-

O

OP

O-

O

HO

N

N

N

N

NH2

ribozaadenozin

trifosfat

ATP

ADP

AMP

OCH2O- OP

O-

O

OP

O-

O

N

N

N

N

NH2

OHHO

OCH2O- OP

O-

O

N

N

N

N

NH2

OHHO

OCH2

N

N

N

N

NH2

OHHO

O OP

O

O

P

O OP

O

O

Mg2+

O

O

ATP-Mg2+ kompleks

anhidro-veze

148

ATP - energetska moneta stanice promjena standardne slobodne energije hidrolize nekih energijom bogatih spojeva u fiziolokim uvjetima

reakcija G0 (kJ mol-1)

PEP piruvat + ortofosfat -61.91,3-DPG 3-PG + ortofosfat -54.5acetil-P acetat + ortofosfat -42.3ATP AMP + difosfat -37.4acetil-CoA acetat + koenzim A -35.1aminoacil-tRNA aminokiselina + tRNA -35.1ATP ADP + ortofosfat -34.5difosfat 2 ortofosfata -33.4glc-1-P glukoza + ortofosfat -20.9alanin-glicin alanin + glicin -16.7glc-P glc + ortofosfat -13.8

ATP se po standardnoj slobodnoj energiji hidrolize nalazi izmeu spojeva koji sudjeluju u energetskommetabolizmu prilikom izgradnje organske tvari i spojeva koji predstavljaju graevne blokove za izgradnjuosnovnih sastojaka stanice (povezuje procese katabolizma i anabolizma)

149

hipoteza: integracija organela za pridobivanje energije u eukariotsku stanicu ili evolucija oksidativne fosforilacijeH+

ATP ADP + Pi

H+

ADP + Pi ATP

H+

e-

H+

e-

1

2

3

fermentacija (proizvodnja kiselina), unutarstanino zakiseljevanje pumpanje H+ izvan stanice na raun energije hidrolize ATP

pumpanje H+ bez hidrolize ATP, ATP seuva za druge procese u stanici, membranski

proteini energiju dobivenu tijekom prijenosa

e- sa razliitih molekula koriste za

pumpanje H+ izvan stanice

donori

akceptori

molekule razliitog redoks potencijala

nefermentabilne organske kiseline

elektrokemijski gradijent (p) nastao djelovanjem respiratornog (disajnog) lanca (RL) koristi se za

pumpanje H+ natrag u stanicu i na raun ovog

transporta (pridobivene energije) fosforilira se ADP

animacija: The Evolution of Cellular Organelles

150

1. A. Barrientos (2002) In vivo in organello assessment of OXPHOS activities, Methods 26, 307-316.2. Grupa autora: Molecular biology of the cell, B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D. Watson (eds.),

Garland Publishing, Inc., New York (1983).3. Grupa autora: Biology of the procaryotes, J.W. Lengeler, G. Drews, H.G. Schlegel (eds.) Georg Thieme Verlag, Stuttgart,

Germany (1999).4. Grupa autora: Applied Microbial Physiology, P.M. Rhodes, P.F. Stanbury (eds.), IRL Press at Oxford University Press,

Oxford, UK (1997). 5. M. Huettemann, I. Lee, A. Pecinova, P. Pecina, K. Przyklenik, J.W.Doan (2008) Regulation of oxidative phosphorylation,

the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease, Journal of Bioengineering and Biomembrane 40, 445-456.

6. M. Klingenberg (2008) The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier, Biochimica et Biophysica Acta 1778, 1978-2021.

7. A.G. Moat, J.W. Foster: Microbial physiology, 3rd edition, A.G. Moat, J.W. Foster (eds.), Wiley-Liss, New York, USA (1995).

8. H. Schaegger (2002) Respiratory chain supercomplexes of mitohondria and bacteria, Biochimica et Biophysica Acta1555, 154-159.

9. J. Vonck, E. Schfer (2008) Supramolecular organization of protein complexes in the mitohondrial inner membrane, Biochimica et Biophysica Acta , doi:10.1016/j.bbamcr.2008.05.19.

fim predavanja i dio bez adresa animacija

Documents