• Estudo da velocidade da reação enzimática bem como osfatores que a influença

- Quantidade de produto formado por unidade de tempo

-Quantidade de substrato transformado por unidade de tempo

Pode ser medido por:

ou

Cinética enzimática

V = - S/ t = P/ t

2[S][S]

3[S]4[S]5[S]

tempo

[pro

duto

]

Cinética enzimática

[S]

Velo

cida

de

da re

ação

• Atividade enzimática pode ser medida pela velocidade da reação catalisada

V0 varia com a concentração de substrato

V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar e um ponto máximo onde a velocidade não aumenta mesmo em concentrações maiores de substrato.

Velocidade da reação é proporcional a S

Substrato satura todasas moléculas de enzima

Cinética enzimática com único substrato

E + ES E + PK1

K -1

K2

K -2

S

Hipótese: segunda reação é a étapa limitante

Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E]

e [ES] é alcançado

Cinética enzimática com único substrato

E + S ES E + PK1

K -1

K2

V0 – Velocidade Inicial

Estado estacionário – [ES] constante

Então Formação de [ES] = Degradação de [ES]

Vo = K2 [ES] [Et]=[E] + [ES]

V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]

Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]

K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES] K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]

[ES] = [Et] [S]

[S] + (K –1+ K2) / k1)

Km

[ES] = [Et] [S] Se, V0 = k2 [ES]

Km + [S]

Então: V0 = k2 [Et] [S]

Km +[S]

Em V máxima [Et] = [ES]

Então V max = k2 [Et]

Sendo assim Vo = Vmax [S]

Km +[S]

Quando V = Vmax 2

Km= [S]

Vmax = 2

Vmax . [S]

Km +[S]

2 . [S] - [S] Km =

Uma propriedade importante:

Propriedades importantes de Km:• É numericamente igual a [S] É numericamente igual a [S] na qual a velocidade da reação na qual a velocidade da reação é metade da Vmax.é metade da Vmax.• Característico de cada Característico de cada enzima.enzima.• Reflete a afinidade da enzima Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.pelo seu substrato.

Km = [S]

2 . [S]Km +[S] =

Gráfico Linewevear-Burk

• A VELOCIDADE DA REAÇÃO É PROPORCIONAL À CONCENTRAÇÃO DA ENZIMA

• FACILITA A DETERMINAÇAO DA CONCENTRACAO DE UMA ENZIMA

• DOSAGENS (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina)

v0

[E]

Ex: ATP + Glicose ADP + Glicose 6- Phexocinase

Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou grupos funcionais de um substrato para o outro:

Sequencial (formação do complexo ternário)

Pingue-pongue ou duplo deslocamento

Reações enzimáticas com mais de um substrato

Inibidores A atividade das enzimas pode ser diminuida ou parada por várias substâncias chamadas de inibidores. Tem inibidores naturais fazendo parte dos constituintes da célula e outros estranhos ao organismo que podem provocar alterações do metabolismo celular. Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fiosiologia. Esses inibidores permitem ás células um controle preciso da velocidade de algumas reações chaves permetindo uma resposta integrada à mudanca das condições fisiológicas.

Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações farmacológicas ex: sulfonamidos (sulfadoxina, ...)Usados para combater as infecções bacterianas

Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO em pacientes HIV + Infecção do tracto urinárioShigelose (Desinteria)Algumas infecções por protozoários (Plasmodium falciparum)Sulfonamidos são inibidores competitivos da dihidropteroato sintetase (dhps) enzima importante envolvida no metabolismo dos folatos de muitos organismos menos o homem.Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta.Toxicidade seletiva para bactérias.

Largo campo de aplicaçacão para o combate de insetosEx: enzimas digestivas de insetos como as -amilases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas a-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijao foram identificados 4 desses inhibidores)Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao ataque das pragas contribuindo para a redução do uso de inseticidas químicos.

InibidoresImportância:

• Agentes farmacêuticos• Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas• Ferramenta nos estudos das vias metabólicas

Inibidores

Reversíveis

Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente)

Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)

Inib. Mista

Inib. Não-competitiva (caso particular de inib. Mista)

Inibidores Irreversíveis

Inibidor irreversível

1-Reagentes específicos para grupo (R) 2- Análogos de substrato 3- inibidor suicida

1

2

Inibição Reversível

= inib. acompetitiva

Semelhança estrutural entre S e I

Não há semelhança estrutural entre S e I

Não há semelhança estrutural entre S e I

Inibição não-Competitiva •Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato•NÃO se liga no sítio ativo da enzima•Aumento da [substrato] não diminui a inibição •Km da enzima NÃO se altera •A VMAX DIMINUI na presença do inibidor

Inibidor competitivo • Estrutura semelhante à do substrato • Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima• Aumento da [substrato] diminui a inibição • A Vmax NÃO se altera•Km da enzima AUMENTANa presença do inibidor

0 1 2 3 4 5 6 70

5

10

15

Sem inibidor

Com inibidor

Substrato (mM)

V 0(m

ol.L

-1.m

in-1

)Substrato (mM) V0 (sem inibidor)

mmol.L-1.min-1 V0 (com inibidor)

mmol.L-1.min-1 0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5

Exemplo: Succinato desidrogenase

Inibição competitiva

Inibição competitiva Inibição não-competitiva

O inibidor se liga somente no complexo ES em sítio próprio.

Inibição acompetitiva

Analgésicos... inibidores de Prostaglandinas

Ligação covalenteInibidor irreversível (suicída) - Aspirina

Interações sem ligação covalente Inibidor competitivo e reversível – Ponstan

Regulação de perfusão renalAgregação plaquetáriaProtetora de mucosa gástrica

Inflamação

•Inibidor irreversível Ligação covalente Ácido acetil salicílico

•Inibidor competitivo e reversívelInterações sem ligação covalenteÁcido mefenâmico

Sítio Ativo da Ciclooxigenase

Inibidor competitivo e reversível da COX-1/2 Interação iônica

Dipirona sódica

Inibidor competitivo e reversível da COX-2

Meloxicam

Inibidores Competitivos de proteases do vírus HIV

Gag e Gag Pol são clivados pela protease do vírus HIV em 9 pontos específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar proteínas estruturais e o precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa, integrase e proteases.

Amprenavir

Processing of the env protein is carried out by a host cell enzyme, whereas the gag and gag-pol proteins are processed only by the viral aspartic protease (HIV-PR).

* Inibidores de proteases

Protease produz partículas virais infecciosas

Ciclo de Replicação do Vírus HIV

Inibidores Competitivos de proteases do vírus HIV

Gag e Gag Pol são clivados pela protease do vírus HIV em 9 pontos específicos para produzir proteínas funcionais. O precursor Gag vai originar proteínas estruturais e o precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa, integrase e proteases.

Amprenavir

Processing of the env protein is carried out by a host cell enzyme, whereas the gag and gag-pol proteins are processed only by the viral aspartic protease (HIV-PR).

Regulação da atividade enzimática das enzimas alostéricas

• Enz. alostéricas analogia com protéina alostérica (ex: Hb)

• Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!)

• Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parámetros cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten)

• Dois tipos: enzimas homotrópicas (reguladas pelo substrato) e heterotrópicas

Hiperbole Sigmoide

Enzimas alostéricas... O que é isso?

Sistema multienzimático sequencial

Enzimas alostéricas... O que é isso?

Ex: Aspartato Transcarbamilase (AtCase) -síntese de pirimidinas

Aspartato + carbamil-fosfato N-carbamil aspartato

AtCase

Citidina trifosfato

Uridina trifosfato

-Reguladas por moduladores alostéricos => envolvendo ou não o sítio ativo-Várias subunidades - Inibição por retroalimentação

Um modulador alostérico pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.

Michaellis-Menten

Enzimas Alostéricas

Enzima Homotrópica

Efeito moduladores

Efeito moduladores

Exemplos de enzimas regulatórias Fosfofrutokinase –1 (PFK-1):

ALOSTERIA MODIFICAÇÃO COVALENTE

ALOSTERIA

Glicogênio Fosforilase

Modificação covalente reversível

Ativação Proteolítica

Fatores que afetam a velocidade enzimática

pH

Temperatura

Concentração de substratos

Concentração de cofatores

Presença de Inibidores e/ou ativadores

Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc

Concentração de enzima