aula 4: enzimas cinética e regulação - unesp: câmpus ... · inibição enzimática reversível...

of 68 /68
Disciplina de Engenharia de Proteínas Curso de Ciências Biológicas Aula 4: Enzimas Cinética e Regulação Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected] Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Author: phamdieu

Post on 02-Dec-2018

219 views

Category:

Documents


0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • Disciplina de Engenharia de Protenas

    Curso de Cincias Biolgicas

    Aula 4: Enzimas Cintica

    e Regulao

    Prof. Marcos Tlio de Oliveira [email protected]

    Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias de Jaboticabal

    Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho

    mailto:[email protected]

  • Enzimas

    GRANDE maioria formada por protenas

    (algumas enzimas so formadas por RNA)

  • Enzimas

    GRANDE maioria formada por protenas

    (algumas enzimas so formadas por RNA)

    Funo:

    CATALIZADORES de reaes qumicas

    (acelerao das reaes qumicas,

    especificidade pelo substrato,

    funcionam em diversas condies de temperatura e pH)

  • Enzimas

    + +

  • Enzima holozima

    Apoenzima parte proteica

    Parte No proteica (cofator)

    metal

    coenzima

    .

    Enzimas

    apoenzima holoenzima

  • Coenzimas participam do ciclo cataltico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos qumicos para a reao

  • Enzimas

  • Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou atividade realizada: Urease hidrolisa a uria DNA-polimerase polimeriza DNA Agora. Nomenclatura oficial das enzimas dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3 - uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contm fosfato..........3.6.1 - esse anidrido ATP.....................3.6.1.3

    1. xido-redutases

    ( Reaes de xido-

    reduo).

    Transferncia de eltrons

    Se uma molcula se

    reduz, h outra que se

    oxida.

    2. Transferases

    (Transferncia de grupos

    funcionais)

    grupos aldedo

    gupos acila

    grupos glucosil

    grupos fosfatos (quinases)

    3. Hidrolases

    (Reaes de hidrlise)

    Transformam polmeros em monmeros.

    Atuam sobre:

    Ligaes ster

    Ligaes glicosdicas

    Ligaes peptdicas

    Ligaes C-N

    4. Liases

    (Adio a ligaes

    duplas)

    Entre C e C

    Entre C e O Entre C e N

    5. Isomerases

    (Reaes de

    isomerizao)

    6. Ligases

    (Formao de ligaes

    covalentes com gasto de

    ATP)

    Entre C e O

    Entre C e S

    Entre C e N

    Entre C e C

    Enzimas Classificao

  • Como Enzimas Funcionam...

    enzima

    stio ativo

    (cataltico)

    substrato

  • Como Enzimas Funcionam...

  • Como Enzimas Funcionam...

    como a reao progride

    mudana de

    energia durante

    a reao

  • Como Enzimas Funcionam...

    variao de energia livre

    padro (bioqumica)

    energias de

    ativao

  • Como Enzimas Funcionam...

    ... e no aqui!

    aqui que as enzimas

    agem!!!

  • Como Enzimas Funcionam...

    energia de

    ativao SEM

    catalizador

    energia de

    ativao COM

    catalizador

  • Como Enzimas Funcionam...

    intermedirios da

    reao

  • Como Enzimas Funcionam...

    passo limitante

    da reao

  • Enzimas

    + +

    A energia de ativao monstruosa!!!

  • Enzima

    Velocidade na

    ausncia de enzima

    Reaes/segundo

    Velocidade da

    reao catalisada

    Reaes/segundo

    Poder

    cataltico

    Anidrase carbnica

    Triosefosfato isomerase

    Carboxipeptidase A

    AMP nucleosidase

    Nuclease de estafilococos

    1.3 X 10 1

    4.3 X 10 6

    3.0 X 10 9

    1.0 X 10 11

    1.7 X 10 -13

    1.0 X 106

    4.300

    578

    60

    95

    7.7 X 106

    1.0 X 109

    1.9X 1011

    6.0 X 1012

    5.6 X 1014

    Compare esses nmeros !

    Como Enzimas Funcionam...

  • Como Enzimas Funcionam...

    enzima

    stio ativo

    (cataltico)

    substrato formao de

    ligaes

    covalentes

    transientes

    com o

    substrato!

  • Como Enzimas Funcionam...

    Intermedirio

    ES

    (E e S ligados

    covalentemente)

  • Como Enzimas Funcionam...

    enzima

    stio ativo

    (cataltico)

    substrato

    formao de

    vrias ligaes

    fracas do

    especificidade

    para ES!

    stio de ligao

  • Como Enzimas Funcionam...

    energia de

    ligao

    Maior fonte

    de energia

    livre usada

    por enzimas

    para abaixar

    as energias de

    ativao das

    reaes

  • Como Enzimas Funcionam...

  • Como Enzimas Funcionam...

    +

    formao de

    vrias ligaes

    fracas do

    especificidade

    para ES!

  • Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

    o stio ativo da enzima pre-formado e

    tem a forma complementar molcula

    do Substrato, de modo que outras

    molculas no teriam acesso a ela.

    Modelo de encaixe induzido Nesse

    modelo, o contacto com a molcula do

    substrato induz mudanas

    conformacio-nais na enzima, que

    otimizam as intera-es com os resduos

    do stio ativo. Esse o modelo aceito hoje

    em dia.

    Modelo Chave-Fechadura

    Modelo de encaixe induzido

    Como as Enzimas Funcionam...

  • Em B: A ligao do substrato dipeptdico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudana conformacional nas vizinhanas do stio ativo da carboxipeptidase A.

    Em A: o stio cataltico dessa enzima formado pelos resduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, direita) e de Glu270 (centro), e um tomo de Zn2+, que est acima do Glu270.

    A B

    Exemplo do modelo de encaixe induxido

    (Carbopeptidase)

  • Como Enzimas Funcionam...

  • Como Enzimas Funcionam...

    substrato

    estado de

    transio

  • Determinar a taxa (velocidade) da reao e como esta

    muda em resposta a mudanas nos parmetros

    experimentais abordagem central para estudar o

    mecanismo de reaes catalisadas por enzimas.

    Cintica Enzimtica

  • [S] muda com o passar do tempo em uma reao

    enzimtica in vitro. E da?

    Cintica Enzimtica

    tempo

    [S]

    1 2 3 4 5 6

  • Cintica Enzimtica

    [S] [E] Enzima funciona a todo vapor e a mudana na [S]

    mnima durante o estgio inicial da reao.

    tempo

    [S]

    15 30 45 60

  • por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)

    Cintica Enzimtica

  • Praticamente linear; ou

    seja, quanto mais

    substrato, maior a V0

    Cintica Enzimtica

    Saturao! No adianta

    adicionar substrato, a V0 no

    muda significativamente.

  • [S],

    portanto

    [ES]

    favorecido

    Cintica Enzimtica

    [S], portanto

    [E]

    favorecido

  • [S],

    portanto

    [ES]

    favorecido

    Cintica Enzimtica

    [S], portanto

    [E]

    favorecido

  • Equao de Michaelis-Menten:

    Cintica Enzimtica

    V0 = Vmax [S]

    Km + [S]

  • V0 = Vmax [S]

    Km + [S]

  • Cintica Enzimtica

  • Cintica Enzimtica

  • Cintica Enzimtica

  • Cintica Enzimtica

    Km = k-1 = Kd

    k1

    Nesta condio, Km mede a afinidade da

    enzima pelo substrato

  • Interao Protena-Ligante

    concentrao do ligante

    porcentagem dos stios de ligao ocupados

    concentrao constante da protena

  • Cintica Enzimtica

    kcat

    descreve a taxa do passo limitante da reao

    equivalente ao nmero de molculas de

    substrato convertidas a produto em uma

    unidade de tempo em uma molcula de enzima,

    quando a enzima est saturada com substrato

  • Cintica Enzimtica

    moles de S catalisado por segundo

    moles de enzima

    Nmero

    de

    turnover

    =

  • Eficincia cataltica

    kcat/Km Parmetro mais adequado para

    comparaes cinticas

  • Condies do meio que afetam estabilidade protica

    pH

    temperatura

    % a

    tivid

    ad

    e e

    nzim

    ti

    ca

    m

    xim

    a

    pH timo=1,5 pH timo=6,8 pH timo=9,9

    O pH timo de uma enzima reflete

    variaes no estado de ionizao de

    resduos de aminocidos do stio

    ativo.

    Fatores que afetam a atividade enzimtica

  • 1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

    Variaes de pH: pH timo

    Variaes de temperatura: temperatura tima

    100-

    50-

    0-

    % a

    tivid

    ad

    e e

    nzim

    ti

    ca

    m

    xim

    a

    Temperatura

    tima

    Desnaturao

    trmica da

    protena

    Pouca energia

    para a reao

    acontecer Ao contrrio da curva em

    forma de sino no caso da

    atividade enzimtica versus

    pH, a enzima s est

    desnaturada em temperaturas

    acima da temperatura tima.

    Fatores que afetam a atividade enzimtica

  • Cintica Enzimtica

    y = a . x + b equao da reta

  • Inibio Enzimtica

    irreversvel

  • Inibio Enzimtica

    reversvel

  • Inibio Enzimtica

    Vmax no

    muda

    Km aumenta

  • Inibio Enzimtica

    Vmax diminui

    Km diminui

  • Inibio Enzimtica

    Vmax diminui

    Km aumenta

  • Enzimas Reguladoras

    presentes em sistemas multienzimticos...

    + +

  • Enzimas Reguladoras

    geralmente possuem

    subunidades mltiplas...

    stio ativo e stio(s) regulador(es)

    em subunidades separadas

  • Enzimas Alostricas

    formas mais ou menos

    ativas so geradas por

    alteraes de

    conformao induzidas

    por um ou mais

    moduladores...

  • Enzimas Alostricas

    formas mais ou menos ativas so

    geradas por alteraes de

    conformao induzidas por um ou

    mais moduladores...

  • Enzimas Alostricas

    X

    hiperblica sigmide

  • Enzimas Alostricas

    alterao no K0.5

    alterao na Vmax

  • Modificaes Covalentes Reversveis

  • Modificaes Covalentes Reversveis

  • Modificaes Covalentes Reversveis

  • Proprotenas, Proenzimas e Zimognios

    precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a

    forma ativa...

    modificaes irreversveis

    pr-colgeno colgeno

    fibrognio fibrina

    protrombina trombina

    pr-insulina insulina

    quimotripsinognio quimotripsina

    tripsinognio tripsina

  • Proprotenas, Proenzimas e Zimognios

  • Proprotenas, Proenzimas e Zimognios

  • Disciplina de Engenharia de Protenas

    Curso de Biologia

    Prxima aula: 06/09 Engenheirando Protenas