aula 4: enzimas cinética e regulação - unesp: câmpus ... · inibição enzimática reversível...
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Disciplina de Engenharia de Protenas
Curso de Cincias Biolgicas
Aula 4: Enzimas Cintica
e Regulao
Prof. Marcos Tlio de Oliveira [email protected]
Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias de Jaboticabal
Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho
mailto:[email protected]
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Enzimas
GRANDE maioria formada por protenas
(algumas enzimas so formadas por RNA)
-
Enzimas
GRANDE maioria formada por protenas
(algumas enzimas so formadas por RNA)
Funo:
CATALIZADORES de reaes qumicas
(acelerao das reaes qumicas,
especificidade pelo substrato,
funcionam em diversas condies de temperatura e pH)
-
Enzimas
+ +
-
Enzima holozima
Apoenzima parte proteica
Parte No proteica (cofator)
metal
coenzima
.
Enzimas
apoenzima holoenzima
-
Coenzimas participam do ciclo cataltico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos qumicos para a reao
-
Enzimas
-
Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou atividade realizada: Urease hidrolisa a uria DNA-polimerase polimeriza DNA Agora. Nomenclatura oficial das enzimas dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3 - uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contm fosfato..........3.6.1 - esse anidrido ATP.....................3.6.1.3
1. xido-redutases
( Reaes de xido-
reduo).
Transferncia de eltrons
Se uma molcula se
reduz, h outra que se
oxida.
2. Transferases
(Transferncia de grupos
funcionais)
grupos aldedo
gupos acila
grupos glucosil
grupos fosfatos (quinases)
3. Hidrolases
(Reaes de hidrlise)
Transformam polmeros em monmeros.
Atuam sobre:
Ligaes ster
Ligaes glicosdicas
Ligaes peptdicas
Ligaes C-N
4. Liases
(Adio a ligaes
duplas)
Entre C e C
Entre C e O Entre C e N
5. Isomerases
(Reaes de
isomerizao)
6. Ligases
(Formao de ligaes
covalentes com gasto de
ATP)
Entre C e O
Entre C e S
Entre C e N
Entre C e C
Enzimas Classificao
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Como Enzimas Funcionam...
enzima
stio ativo
(cataltico)
substrato
-
Como Enzimas Funcionam...
-
Como Enzimas Funcionam...
como a reao progride
mudana de
energia durante
a reao
-
Como Enzimas Funcionam...
variao de energia livre
padro (bioqumica)
energias de
ativao
-
Como Enzimas Funcionam...
... e no aqui!
aqui que as enzimas
agem!!!
-
Como Enzimas Funcionam...
energia de
ativao SEM
catalizador
energia de
ativao COM
catalizador
-
Como Enzimas Funcionam...
intermedirios da
reao
-
Como Enzimas Funcionam...
passo limitante
da reao
-
Enzimas
+ +
A energia de ativao monstruosa!!!
-
Enzima
Velocidade na
ausncia de enzima
Reaes/segundo
Velocidade da
reao catalisada
Reaes/segundo
Poder
cataltico
Anidrase carbnica
Triosefosfato isomerase
Carboxipeptidase A
AMP nucleosidase
Nuclease de estafilococos
1.3 X 10 1
4.3 X 10 6
3.0 X 10 9
1.0 X 10 11
1.7 X 10 -13
1.0 X 106
4.300
578
60
95
7.7 X 106
1.0 X 109
1.9X 1011
6.0 X 1012
5.6 X 1014
Compare esses nmeros !
Como Enzimas Funcionam...
-
Como Enzimas Funcionam...
enzima
stio ativo
(cataltico)
substrato formao de
ligaes
covalentes
transientes
com o
substrato!
-
Como Enzimas Funcionam...
Intermedirio
ES
(E e S ligados
covalentemente)
-
Como Enzimas Funcionam...
enzima
stio ativo
(cataltico)
substrato
formao de
vrias ligaes
fracas do
especificidade
para ES!
stio de ligao
-
Como Enzimas Funcionam...
energia de
ligao
Maior fonte
de energia
livre usada
por enzimas
para abaixar
as energias de
ativao das
reaes
-
Como Enzimas Funcionam...
-
Como Enzimas Funcionam...
+
formao de
vrias ligaes
fracas do
especificidade
para ES!
-
Modelo chave-fechadura Nesse modelo,
o stio ativo da enzima pre-formado e
tem a forma complementar molcula
do Substrato, de modo que outras
molculas no teriam acesso a ela.
Modelo de encaixe induzido Nesse
modelo, o contacto com a molcula do
substrato induz mudanas
conformacio-nais na enzima, que
otimizam as intera-es com os resduos
do stio ativo. Esse o modelo aceito hoje
em dia.
Modelo Chave-Fechadura
Modelo de encaixe induzido
Como as Enzimas Funcionam...
-
Em B: A ligao do substrato dipeptdico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudana conformacional nas vizinhanas do stio ativo da carboxipeptidase A.
Em A: o stio cataltico dessa enzima formado pelos resduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, direita) e de Glu270 (centro), e um tomo de Zn2+, que est acima do Glu270.
A B
Exemplo do modelo de encaixe induxido
(Carbopeptidase)
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Como Enzimas Funcionam...
-
Como Enzimas Funcionam...
substrato
estado de
transio
-
Determinar a taxa (velocidade) da reao e como esta
muda em resposta a mudanas nos parmetros
experimentais abordagem central para estudar o
mecanismo de reaes catalisadas por enzimas.
Cintica Enzimtica
-
[S] muda com o passar do tempo em uma reao
enzimtica in vitro. E da?
Cintica Enzimtica
tempo
[S]
1 2 3 4 5 6
-
Cintica Enzimtica
[S] [E] Enzima funciona a todo vapor e a mudana na [S]
mnima durante o estgio inicial da reao.
tempo
[S]
15 30 45 60
-
por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)
Cintica Enzimtica
-
Praticamente linear; ou
seja, quanto mais
substrato, maior a V0
Cintica Enzimtica
Saturao! No adianta
adicionar substrato, a V0 no
muda significativamente.
-
[S],
portanto
[ES]
favorecido
Cintica Enzimtica
[S], portanto
[E]
favorecido
-
[S],
portanto
[ES]
favorecido
Cintica Enzimtica
[S], portanto
[E]
favorecido
-
Equao de Michaelis-Menten:
Cintica Enzimtica
V0 = Vmax [S]
Km + [S]
-
V0 = Vmax [S]
Km + [S]
-
Cintica Enzimtica
-
Cintica Enzimtica
-
Cintica Enzimtica
-
Cintica Enzimtica
Km = k-1 = Kd
k1
Nesta condio, Km mede a afinidade da
enzima pelo substrato
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Interao Protena-Ligante
concentrao do ligante
porcentagem dos stios de ligao ocupados
concentrao constante da protena
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Cintica Enzimtica
kcat
descreve a taxa do passo limitante da reao
equivalente ao nmero de molculas de
substrato convertidas a produto em uma
unidade de tempo em uma molcula de enzima,
quando a enzima est saturada com substrato
-
Cintica Enzimtica
moles de S catalisado por segundo
moles de enzima
Nmero
de
turnover
=
-
Eficincia cataltica
kcat/Km Parmetro mais adequado para
comparaes cinticas
-
Condies do meio que afetam estabilidade protica
pH
temperatura
% a
tivid
ad
e e
nzim
ti
ca
m
xim
a
pH timo=1,5 pH timo=6,8 pH timo=9,9
O pH timo de uma enzima reflete
variaes no estado de ionizao de
resduos de aminocidos do stio
ativo.
Fatores que afetam a atividade enzimtica
-
1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas
Variaes de pH: pH timo
Variaes de temperatura: temperatura tima
100-
50-
0-
% a
tivid
ad
e e
nzim
ti
ca
m
xim
a
Temperatura
tima
Desnaturao
trmica da
protena
Pouca energia
para a reao
acontecer Ao contrrio da curva em
forma de sino no caso da
atividade enzimtica versus
pH, a enzima s est
desnaturada em temperaturas
acima da temperatura tima.
Fatores que afetam a atividade enzimtica
-
Cintica Enzimtica
y = a . x + b equao da reta
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Inibio Enzimtica
irreversvel
-
Inibio Enzimtica
reversvel
-
Inibio Enzimtica
Vmax no
muda
Km aumenta
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Inibio Enzimtica
Vmax diminui
Km diminui
-
Inibio Enzimtica
Vmax diminui
Km aumenta
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Enzimas Reguladoras
presentes em sistemas multienzimticos...
+ +
-
Enzimas Reguladoras
geralmente possuem
subunidades mltiplas...
stio ativo e stio(s) regulador(es)
em subunidades separadas
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Enzimas Alostricas
formas mais ou menos
ativas so geradas por
alteraes de
conformao induzidas
por um ou mais
moduladores...
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Enzimas Alostricas
formas mais ou menos ativas so
geradas por alteraes de
conformao induzidas por um ou
mais moduladores...
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Enzimas Alostricas
X
hiperblica sigmide
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Enzimas Alostricas
alterao no K0.5
alterao na Vmax
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Modificaes Covalentes Reversveis
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Modificaes Covalentes Reversveis
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Modificaes Covalentes Reversveis
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Proprotenas, Proenzimas e Zimognios
precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a
forma ativa...
modificaes irreversveis
pr-colgeno colgeno
fibrognio fibrina
protrombina trombina
pr-insulina insulina
quimotripsinognio quimotripsina
tripsinognio tripsina
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Proprotenas, Proenzimas e Zimognios
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Proprotenas, Proenzimas e Zimognios
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Disciplina de Engenharia de Protenas
Curso de Biologia
Prxima aula: 06/09 Engenheirando Protenas