aula 4: enzimas cinética e regulação - unesp: câmpus ... · inibição enzimática reversível...

Disciplina de Engenharia de Proteínas

Curso de Ciências Biológicas

Aula 4: Enzimas – Cinética

e Regulação

Prof. Marcos Túlio de Oliveira [email protected]

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

mailto:[email protected]

Enzimas

GRANDE maioria formada por proteínas

(algumas enzimas são formadas por RNA)

Enzimas

GRANDE maioria formada por proteínas

(algumas enzimas são formadas por RNA)

Função:

CATALIZADORES de reações químicas

(aceleração das reações químicas,

especificidade pelo substrato,

funcionam em diversas condições de temperatura e pH)

Enzimas

+ +

Enzima holozima

Apoenzima parte proteica

Parte Não proteica (cofator)

metal

coenzima

.

Enzimas

apoenzima holoenzima

Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação

Enzimas

Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada: Urease – hidrolisa a uréia DNA-polimerase – polimeriza DNA Agora…. Nomenclatura oficial das enzimas é dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC 3.6.1.3 - é uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contém fosfato..........3.6.1 - esse anidrido é ATP.....................3.6.1.3

1. Óxido-redutases

( Reações de óxido-

redução).

Transferência de elétrons

Se uma molécula se

reduz, há outra que se

oxida.

2. Transferases

(Transferência de grupos

funcionais)

•grupos aldeído

•gupos acila

•grupos glucosil

•grupos fosfatos (quinases)

3. Hidrolases

(Reações de hidrólise)

•Transformam polímeros em monômeros.

Atuam sobre:

•Ligações éster

•Ligações glicosídicas

•Ligações peptídicas

•Ligações C-N

4. Liases

(Adição a ligações

duplas)

•Entre C e C

•Entre C e O •Entre C e N

5. Isomerases

(Reações de

isomerização)

6. Ligases

(Formação de ligações

covalentes com gasto de

ATP)

•Entre C e O

•Entre C e S

•Entre C e N

•Entre C e C

Enzimas – Classificação

Como Enzimas Funcionam...

enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato


como a reação progride

mudança de

energia durante

a reação


variação de energia livre

padrão (bioquímica)

energias de

ativação


... e não aqui!

É aqui que as enzimas

agem!!!


energia de

ativação SEM

catalizador

energia de

ativação COM

catalizador


intermediários da

reação


passo limitante

da reação

Enzimas

+ +

A energia de ativação é monstruosa!!!

Enzima

Velocidade na

ausência de enzima

“Reações/segundo”

Velocidade da

reação catalisada

“Reações/segundo”

Poder

catalítico

Anidrase carbônica

Triosefosfato isomerase

Carboxipeptidase A

AMP nucleosidase

Nuclease de estafilococos

1.3 X 10 –1

4.3 X 10 –6

3.0 X 10 –9

1.0 X 10 –11

1.7 X 10 -13

1.0 X 106

4.300

578

60

95

7.7 X 106

1.0 X 109

1.9X 1011

6.0 X 1012

5.6 X 1014

Compare esses números !



enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato formação de

ligações

covalentes

transientes

com o

substrato!


Intermediário

ES

(E e S ligados

covalentemente)


enzima

sítio ativo

(catalítico)

substrato

formação de

várias ligações

fracas dão

especificidade

para ES!

sítio de ligação


energia de

ligação

Maior fonte

de energia

livre usada

por enzimas

para abaixar

as energias de

ativação das

reações


+

formação de

várias ligações

fracas dão

especificidade

para ES!

Modelo chave-fechadura Nesse modelo,

o sítio ativo da enzima é pre-formado e

tem a forma complementar à molécula

do Substrato, de modo que outras

moléculas não teriam acesso a ela.

Modelo de encaixe induzido Nesse

modelo, o contacto com a molécula do

substrato induz mudanças

conformacio-nais na enzima, que

otimizam as intera-ções com os resíduos

do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje

em dia.

Modelo Chave-Fechadura

Modelo de encaixe induzido

Como as Enzimas Funcionam...

Em B: A ligação do substrato dipeptídico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

Em A: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, à direita) e de Glu270 (centro), e um átomo de Zn2+, que está acima do Glu270.

A B

Exemplo do modelo de encaixe induxido

(Carbopeptidase)


substrato

estado de

transição

Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta

muda em resposta a mudanças nos parâmetros

experimentais – abordagem central para estudar o

mecanismo de reações catalisadas por enzimas.

Cinética Enzimática

[S] muda com o passar do tempo em uma reação

enzimática in vitro. E daí?


tempo

[S]

1 2 3 4 5 6


[S] [E]

Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é

mínima durante o estágio inicial da reação.

tempo

[S]

15 30 45 60

É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V0)


Praticamente linear; ou

seja, quanto mais

substrato, maior a V0


Saturação! Não adianta

adicionar substrato, a V0 não

muda significativamente.

[S],

portanto

[ES] é

favorecido


[S],

portanto

[E] é

favorecido

Equação de Michaelis-Menten:


V0 = Vmax [S]

Km + [S]

V0 = Vmax [S]

Km + [S]


Km = k-1 = Kd

k1

Nesta condição, Km mede a afinidade da

enzima pelo substrato

Interação Proteína-Ligante

concentração do ligante

porcentagem dos sítios de ligação ocupados

concentração constante da proteína


kcat

descreve a taxa do passo limitante da reação

equivalente ao número de moléculas de

substrato convertidas a produto em uma

unidade de tempo em uma molécula de enzima,

quando a enzima está saturada com substrato


moles de S catalisado por segundo

moles de enzima

Número

de

turnover

=

Eficiência catalítica

kcat/Km Parâmetro mais adequado para

comparações cinéticas

Condições do meio que afetam estabilidade protéica

• pH

• temperatura

% a

tivid

ad

e e

nzim

áti

ca

má

xim

a

pH ótimo=1,5 pH ótimo=6,8 pH ótimo=9,9

O pH ótimo de uma enzima reflete

variações no estado de ionização de

resíduos de aminoácidos do sítio

ativo.

Fatores que afetam a atividade enzimática

1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas

• Variações de pH: pH ótimo

• Variações de temperatura: temperatura ótima

100-

50-

0-

% a

tivid

ad

e e

nzim

áti

ca

má

xim

a

Temperatura

ótima

Desnaturação

térmica da

proteína

Pouca energia

para a reação

acontecer Ao contrário da curva em

forma de sino no caso da

atividade enzimática versus

pH, a enzima só está

desnaturada em temperaturas

acima da temperatura ótima.

Fatores que afetam a atividade enzimática


y = a . x + b equação

da reta

Inibição Enzimática

irreversível


reversível


Vmax não

muda

Km aumenta


Vmax diminui

Km diminui


Vmax diminui

Km aumenta

Enzimas Reguladoras

presentes em sistemas multienzimáticos...

+ +

Enzimas Reguladoras

geralmente possuem

subunidades múltiplas...

sítio ativo e sítio(s) regulador(es)

em subunidades separadas

Enzimas Alostéricas

formas mais ou menos

ativas são geradas por

alterações de

conformação induzidas

por um ou mais

moduladores...


formas mais ou menos ativas são

geradas por alterações de

conformação induzidas por um ou

mais moduladores...


X

hiperbólica sigmóide


alteração no K0.5

alteração na Vmax

Modificações Covalentes Reversíveis

Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios

precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a

forma ativa...

modificações irreversíveis

pró-colágeno → colágeno

fibrogênio → fibrina

protrombina → trombina

pró-insulina → insulina

quimotripsinogênio → quimotripsina

tripsinogênio → tripsina

Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios

Disciplina de Engenharia de Proteínas

Curso de Biologia

Próxima aula: 06/09 – Engenheirando Proteínas

aula 4: enzimas cinética e regulação - unesp: câmpus ... · inibição enzimática reversível...

Documents