inhibición enzimática

Ingeniería de las enzimas 2014

Traducido por: Cecilia Carpio 1

1| Cinética de las reacciones

Las mediciones cinéticas de reacciones catalizadas enzimáticamente están entre las técnicas más poderosas

para elucidar los mecanismos catalíticos de las enzimas. La cinética enzimática es una rama de la cinética

química por tanto comparte rasgos de la cinética química.

D | Las reacciones bisustrato siguen una de varias ecuaciones de velocidad

Hasta aquí hemos estado preocupados con las reacciones simples de un solo sustrato que obedecen el

modelo de Michaelis-Menten. No obstante, las reacciones enzimáticas que requieren múltiples sustratos y

rinden múltiples productos son muy comunes. En verdad, aquellas que involucran dos sustratos y rinden

dos productos

suman aproximadamente el 60% de las reacciones bioquímicas conocidas. Casi todas ellas llamadas

reacciones bisustrato son reacciones de transferencia en las cuales la enzima cataliza la transferencia de un

grupo funcional específico, X, de uno de los sustratos al otro:

O reacciones de óxido-reducción en las cuales equivalentes reductores son transferidos entre dos sustratos.

Por ejemplo, la hidrólisis de un enlace peptídico por la tripsina es la transferencia del grupo carbonilo del

átomo de N del péptido al agua (a), mientras que en la reacción de la alcohol deshidrogenasa, un ion

hidruro es formalmente transferido del etanol al NAD+ (b). A pesar de que las reacciones bisustrato pueden,

en principio, ocurrir a través de una vasta variedad de mecanismos, solamente se observan comúnmente

unos pocos tipos.



Las reacciones secuenciales ocurren vía desplazamientos simples. Las reacciones en las cuales todos

los sustratos deben combinarse con la enzima antes de que pueda ocurrir la reacción y sean liberados los

productos se conocen como reacciones secuenciales. En tales reacciones, el grupo que está siendo

transferido, X, es pasado directamente desde A (=P-X) a B, rindiendo P+Q (=B-X). Así, tales reacciones se

llaman también reacciones de desplazamiento simple.

Las reacciones secuenciales se pueden subclasificar en aquellas con un orden obligatorio de adición de

sustrato a la enzima, a las cuales se dice que tienen un mecanismo ordenado, y aquellas sin preferencia por

el orden de adición de sustrato, las cuales se describen como que tienen un mecanismo al azar. En el

mecanismo ordenado, el enlazamiento del primer sustrato aparentemente se requiere para formar el sitio de

enlazamiento para el segundo sustrato, mientras en el mecanismo al azar, ambos sitios de enlazamiento

están presentes en la enzima libre.

En la notación desarrollada por W.W. Cleland, los sustratos se designan mediante las letras A y B en el

orden en el cual se añaden a la enzima, los productos se designan como P y Q en el orden que dejan la

enzima, la enzima está representada por una línea horizontal, y las adiciones sucesivas de sustrato y

liberaciones de productos son designados por flechas verticales.

Una reacción bisustrato ordenada se diagrama por tanto:

donde A y B se dice que son los sustratos lider y siguiente, respectivamente. Muchas deshidrogenasas que

requieren NAD+ y NADP

+ siguen un mecanismo bisustrato ordenado en el cual el coenzima es el sustrato

líder.

Una reacción bisustrato al azar se diagrama:



Algunas deshidrogenasas y quinasas operan a través de mecanismos bisustrato al azar (las quinasas son

enzimas que transfieren grupos fosforilo del ATP a otros compuestos o viceversa).

Las reacciones ping pong ocurren vía doble desplazamiento. Las reacciones de transferencia de grupo

en las cuales uno o más productos son liberados antes de que todos los sustratos hayan sido añadidos se

conocen como reacciones ping pong. La reacción ping pong bisustruato se representa por:

Aquí, un grupo funcional X del primer sustrato A (=P-X) es desplazado desde el sustrato mediante la

enzima E para rendir el primer producto P y una forma estable de la enzima F (=E-X) en la cual X está

fuertemente (con frecuencia covalentemente) enlazado a la enzima (Ping). En la segunda etapa de la

reacción, X es desplazada desde la enzima por el segundo sustrato B para rendir el segundo producto Q

(=B-X), regenerando por tanto la forma original de la enzima, E (Pong). Tales reacciones son, por tanto,

conocidas como reacciones de doble desplazamiento. Note que en las reacciones ping pong, los sustratos

A y B no se encuentran el uno al otro en la superficie de la enzima. Muchas enzimas, incluyendo la tripsina

(en la cual F es el intermediario acil-enzima), transaminaciones y algunas flavoenzimas, reaccionan con

mecanismos Ping Pong.

Los mecanismos bisustrato se pueden distinguir mediante mediciones cinéticas. Las ecuaciones de

velocidad que describen los mecanismos bisustrato foregoing son considerablemente más complicadas que

la ecuación para una reacción de un solo sustrato. De hecho, las ecuaciones para mecanismos bisustrato

contienen tantas constantes cinéticas como 4 versus 2 (Vmáx y KM) para la ecuación de Michaelis-Menten.

No obstante, se pueden usar las medidas cinéticas en estado estacionario para distinguir entre los varios

mecanismos bisustrato.

Las ecuaciones de velocidad para mecanismos ping pong son claramente complejas de derivar y se requiere

usualmente varias aproximaciones a fin de obtener expresiones cinéticas coherentes. Una expresión

simplificada de velocidad ha sido propuesta por Marangoni basada en el hecho de que el paso limitante de

la velocidad es la transición desde el complejo secundario E’B a EQ.



2| Inhibición de enzimas

Muchas sustancias alteran la actividad de una enzima combinándose con ella de forma que influye el

enlazamiento del sustrato y/o el número de recambio.Las sustancias que reducen la actividad de la enzima

en esta forma se conocen como inhibidores.Gran parte del arsenal farmacéutico moderno consta de

inhibidores de enzimas. Por ejemplo, el SIDA es tratado casi exclusivamente con drogas que inhiben las

actividades de una variedad de enzimas virales.

Los inhibidores de enzimas actúan a través de una variedad de mecanismos. Los inhibidores irreversibles

de enzimas, o inactivadores, se ligan a la enzima tan fuertemente que bloquean permanentemente la

actividad de la enzima. Los reactivos que modifican químicamente residuos de aminoácidos específicos

pueden actuar como inactivadores. Por ejemplo, los compuestos usados para identificar los residuos

catalíticos de Ser e His de las serinproteasas son inactivadores de estas enzimas.

Los inhibidores de enzima reversibles disminuyen la actividad de la enzima interactuando reversiblemente

con ella. Algunos inhibidores de enzima son sustancias que se parecen estructuralmente a los sustratos de

las enzimas pero bien sea que no reaccionan o reaccionan muy lentamente. Estas sustancias se usan

comúnmente para probar la naturaleza química y conformacional del sitio activo de una enzima en un

esfuerzo por aclarar el mecanismo catalítico de las enzimas. Otros inhibidores afectan la actividad catalítica

sin interferir con el enlazamiento del sustrato.

A | La inhibición competitiva involucra el enlazamiento del inhibidor en el sitio activo de la

enzima

Una sustancia que compite directamente con un sustrato normal por el sitio de enlazamiento del sustrato de

la enzima se conoce como inhibidor competitivo. Tal inhibidor usualmente se parece al sustrato de modo

que se enlaza específicamente al sitio activo pero difiere del sustrato de modo que no puede reaccionar

como el sustrato lo hace. Por ejemplo, la succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo del ácido cítrico

que convierte el succinato a fumarato, es inhibida competitivamente por el malonato, el cual se parece

estructuralmente al succinato pero no puede ser deshidrogenado:

La efectividad del malonato como inhibidor competitivo de la succinato deshidrogenasa fuertemente

sugiere que el sitio de enlazamiento del sustrato de la enzima está diseñado para ligar ambos grupos

carboxilato del sustrato, presumiblemente a través de la influencia de residuos positivamente cargados

colocados apropiadamente.



Principios similares son responsables para la inhibición por producto. En este fenómeno, un producto de

la reacción, el cual necesariamente es capaz de enlazarse al sitio activo de la enzima, puede acumularse y

competir con el sustrato para el enlazamiento a la enzima en ciclos catalíticos subsecuentes. La inhibición

por producto es una vía mediante la cual las células controlan las actividades de sus enzimas.

Los análogos del estado de transición son inhibidores particularmente efectivos. Esto es porque la

catálisis efectiva depende de la capacidad de la enzima para ligarse a y estabilizar el estado de transción de

la reacción. Un compuesto que imite el estado de transición explota estas interacciones de enlazamiento en

formas que un sustrato o análogo de sustrato no puede. Por ejemplo, la adenosin desaminasa convierte el

nucleósido adenosina a inosina como sigue:

La KM de la enzima para el sustrato adenosina es 3 x 10-5

M. El producto adenosina actúa como un inhibidor de la

reacción, con una constante de inhibición (KI, la constante de disociación del enlazamiento enzima-inhibidor) de 3 x

10-4

. Sin embargo, un análogo del estado de transición, inhibe la reacción con una KI de 1.5 x 10-13

M.

El grado de inhibición competitiva varía con la fracción de enzima que ha enlazado al inhibidor. El modelo general

para la inhibición competitiva está dado por el siguiente esquema de reacción:

Aquí, I es el inhibidor, EI es el complejo enzima-inhibidor inactivo, y se asume que el inhibidor se enlaza

reversiblemente a la enzima y está en rápido equilibrio con ella de modo que

Un inhibidor competitivo por tanto reduce la concentración de la enzima disponible para el enlazamiento

con el sustrato.

La ecuación de Michaelis-Menten para una reacción inhibida competitivamente se deriva como antes, pero

con un término adicional para incluir la fracción de la [E]T que se enlaza a I para formanar EI ([E]T = [E] +



[ES] + [EI]). La ecuación resultante, es la ecuación de Michaelis que ha sido modificada por un factor, ,

que se define como

12-31

12-32

Note que , una función de la concentración del inhibidor y su afinidad por la enzima, no puede ser menos

de 1. La comparación de las ecuaciones 12-25 y 12-31 indica que

donde

es la KM

aparente, esto es, el valor de KM que se mediría en ausencia del conocimiento de que el inhibidor está

presente. La figura 12-6 muestra los gráficos hiperbólicos de la ecuación 12-31 para valores crecientes de

. La presencia de I hace que [S] parezca ser menor que lo que realmente es (hace que KM parezca ser más

grande de lo que realmente es), una consecuencia del enlazamiento de I y S a E que es mutuamente

excluyente. Sin embargo, incrementando [S] puede overwhelm al inhibidor competitivo. De hecho, es el

factor por el cual [S] se debe incrementar a fin de superar el efecto de la presencia del inhibidor.

Conforme [S] se aproxima a infinito, v0 se aproxima a Vmáx para cualquier valor de (que es, para

cualquier concentración del inhibidor). Así, el inhibidor no afecta el número de recambio de la enzima.

La inhibición competitiva es el principio detrás del uso de etanol para tratar el envenenamiento por

metanol. El metanol por sí mismo es solo ligeramente tóxico. Sin embargo, la enzima hepática alcohol

deshidrogenasa convierte el metanol a formaldehído altamente tóxico, que con solo pequeñas cantidades

causa la seguera y muerte. El etanol compite con el metanol por el enlazamiento al sitio activo de la alcohol

deshidrogenasa hepática, enlenteciendo por tanto la producción de formaldehído a partir de metanol (el

etanol es convertido a acetaldehído rápidamente metabolizable):

Así, a través de la administración de etanol, una gran porción del metanol será excretada del cuerpo sin

peligro en la orina antes de que pueda ser convertido a formaldehído. El mismo principio subyace el uso de

etanol para tratar el envenenamiento por el anticongelante (etilen glicol, HOCH2 CH2OH), el cual debido a

su sabor dulce, con frecuencia aflige a perros y gatos.

KI puede ser medido. Replanteando la ecuación 12-31 en la forma de dobles recíprocas rinde:

12-33



Un gráfico de esta ecuación es lineal y tiene una pendiente de KM/Vmáx, un intercepto en 1/S de -1/KM y

un intercepto en 1/v0 de 1/Vmáx (Fig. 12-7). Los gráficos de doble recíproco para un inhibidor competitivo a

varias concentraciones de I intercepta en 1/Vmáx sobre el eje 1/v0, una propiedad que es diagnóstico de la

inhibición competitiva.

El valor de KI para un inhibidor competitivo se puede determinar a partir del gráfico de

vs [I]; su intercepto sobre el eje [I] es –KI. KI también puede ser calculada a partir de la ecuación

12-32 si

se determina a una [I] conocida para una enzima de conocido. El comparar los

valores de KI de inhibidores competitivos con diferentes estructuras puede proporcionar información sobre

las propiedades de enlazamiento de una enzima al sitio activo y por tanto su mecanismo catalítico. Por

ejemplo, para determinar la importancia de los varios segmentos de la molécula de ATP para enlazarse al

sitio activo de las enzimas que requieren ATP, uno, debe determinar la KI, dígase para ADP, AMP, ribosa,

trifosfato, etc. Dado que muchos de estos componentes no son reactivos, los estudios de inhibición son los

métodos más convenientes de monitorear su enlazamiento a la enzima.

Los estudios de inhibición competitiva también se usan para determinar las afinidades de los análogos del

estado de transición para el sitio activo de una enzima. Por ejemplo, los inhibidores de la proteasa del VIH

han sido diseñados para imitar el estado de transición y así enlazarse a la enzima con alta afinidad. Los

estudios de los inhibidores son los pilares fundamentales del desarrollo de tales drogas.



B | La inhibición incompetitiva involucra el enlazamiento del inhibidor al complejo Enzima-

Sustrato.

En la inhibición incompetitiva, el inhibidor se enlaza directamente al complejo enzima-sustrato pero no a la

enzima libre:

En este caso, el paso de enlazamiento del inhibidor tiene la constante de disociación

El enlazamiento del inhibidor incompetitivo, el cual no necesita parecerse al sustrato, presumiblemente

distorsiona el sitio activo, rindiendo por tanto la enzima catalíticamente inactiva.

La ecuación de Michaelis-Menten para la inhibición incompetitiva y la ecuación para sus dobles recíprocos

están dadas en la Tabla 12-2. El gráfico de doble recíprocos consiste de una familia de líneas paralelas (Fig

12-8) con pendiente KM /Vmáx, el intercepto de 1/v0 de ’/Vmáx, y el intercepto de 1/[S] de -’/KM. Note que

en la inhibición incompetitiva, ambos

y

disminuyen, pero que

. En contraste al caso para la inhibición competitiva, la adición de sustrato no revierte el efecto de

del inhibidor incompetitivo porque el enlazamiento del sustrato no interfiere con el enlazamiento del

inhibidor incompetitivo.



El inhibidor incompetitivo requiere que el inhibidor afecte la función catalítica de la enzima pero no su

enlazamiento del sustrato. Esto es difícil de imaginar para enzimas de un solo sustrato. En realidad, la

inhibición incompetitiva es significativa solamente paa enzimas multisustrato.

C | La inhibición mezclada involucra el enlazamiento del inhibidor a ambos a la enzima libre y al

complejo Enzima-sustrato

Muchos inhibidores reversibles interactúan con la enzima en forma que afecta el enlazamiento al sustrato

así como la actividad catalítica. En otras palabras, ambas, la enzima y el complejo enzima-sustrato enlazan

al inhibidor, dando como resultado el siguiente modelo:

Este fenómeno se conoce como inhibición mezclada (alternativamente, inhibición no competitiva).

Presumiblemente, un inhibidor mezclado se enlaza a los sitios de la enzima que participan en ambos: el

enlazamiento al sustrato y la catálisis. Por ejemplo, los iones metálicos, los cuales no compiten

directamente con los sustratos por el enlazamiento al sitio activo de la enzima, como lo hacen los

inhibidores competitivos, pueden actuar como inhibidores mezclados. Las dos constantes de disociación

para el enlazamiento al inhibidor no son necesariamente equivalentes.



12-25

La ecuación de Michaelis-Menten y la ecuación de doble recíprocos correspondiente para la inhibición

mezclada están dadas en la Tabla 12-2. Como en la inhibición incompetitiva, los valores aparentes de KM y

Vmáx están modulados por la presencia del inhibidor. El nombre inhibición mezclada proviene del hecho de

que el denominador de la ecuación de Michaelis-Menten tiene el factor multiplicando a la KM como en la

inhibición competitiva y el factor ’ multiplicando a la concentración de sustrato [S] como en la inhibición

incompetitiva. Así KMapp

= (/’) KM y Vmáxapp

= Vmáx/’.

Dependiendo de los valores relativos de y ’ (y por tanto KI y KI’), KMapp

puede incrementar (como en la

inhibición competitiva) o disminuir. Si la enzima y el complejo enzima-sustrato se enlazan a I con igual

afinidad, entonces = ’ y el valor de KMapp

no cambia con relación a KM para la reacción en ausencia de

inhibidor. En este caso, solamente Vmáx es afectado, un fenómeno que se llama inhibición no competitiva

pura.

Los gráficos de doble recíproco para la inhibición mezclada consta de líneas que tienen la pendiente KM/

Vmáx, un intercepto de ’/Vmáx y un intercepto en 1/S de ’/ KM. Las líneas para valores crecientes de [I]

(que representan saturación creciente de E y ES con I) intersectan a la izquierda del eje 1/V0. Para la

inhibición no competitiva pura, las lineas intersectan sobre el eje 1/S a -1/ KM. Como con la inhibición

incompetitiva, el enlazamiento del sustrato no revierte los efectos de la inhibición mezclada.

La cinética de un inactivador de enzima (inhibidor irreversible) se parece a aquella de un inhibidor no

competitivo puro porque el inactivador reduce la concentración de la enzima funcional a todas las



concentraciones de sustrato. Consecuentemente, Vmáx disminuye y KM no cambia. Los gráficos de doble

recíproco para inactivación irreversible se parecen por tanto a aquellos de la inhibición no-competitiva pura

(las líneas intersectan sobre el eje 1/[S].

REFERENCIA

Voet,D., Voet, J.G. and Pratt, C.W. . 2008. Fundamentals of Biochemistry. Life at the molecular level.

pp. 377-393.

Determinación de los parámetros cinéticos para reacciones monosustrato bajo

inhibición

Una forma conveniente de expresar las ecuaciones de velocidad para reacciones sujetas a inhibición es en

términos de parámetros aparentes:

Donde los parámetros VAP y KAP son funciones de la concentración del inhibidor.

Para la inhibición competitiva: KAP> K y VAP = V.

Para inhibición no competitiva pura: KAP = K y VAP < V

Para el tipo de inhibición mezclada hay tres casos:

i. KAP > K y VAP < V

ii. KAP > K y VAP > V

iii. KAP < K y VAP < V

En la inhibición mezclada, caso i, el efecto neto será negativo independientemente de los valores de KAP y

VAP. En los otros dos casos el efecto neto podría ser negativo (inhibición) o positivo (activación)

dependiendo de los valores de KAP y VAP. Si Kap<K y VAP>V el efecto neto será positivo (activación)

independientemente de los valores de KAP y VAP. La activación por productos de la reacción no es tan

frecuente como la inhibición, pero se han reportado casos donde la activación por producto es significativa.

Excepto para el caso de inhibición incompetitiva por alta concentración de sustrato, todos los mecanismos

de inhibición pueden ser representados mediante la ecuación 3.45 la cual es una expresión muy conveniente

para determinar los parámetros cinéticos de las ecuaciones de velocidad correspondientes.

La determinación experimental de los parámetros cinéticos para los mecanismos de inhibición siguen el

mismo patrón como en la cinética simple de Michaelis-Menten. Los métodos de linealización son

particularmente útiles para determinar el mecanismo de inhibición como un paso previo para la

cuantificación de los parámetros cinéticos. El diseño experimental consiste de una matriz en la cual los

datos de velocidad inicial son obtenidos a diferentes concentraciones de sustrato y de inhibidor (S e I,

respectivamente). El inhibidor se considera aquí en términos generales como cualquier sustancia que ejerce

inhibición, sea ésta el producto de la reacción, o un compuesto catalíticamente inerte. Por supuesto la



inhibición por productos y/o por sustrato es más tecnológicamente relevante, puesto que a los inhibidores

catalíticamente inertes simplemente se los puede mantener fuera del medio de reacción.

Si se linealizan los datos usando el gráfico de dobles recíprocas de Lineweaver-Burk:

La representación gráfica de la ecuación 3.46 para todos los mecanismos está en la Fig 3.5. Los gráficos de

Lineweaver-Burk son muy útiles para determinar los mecanismos cinéticos. La inhibición competitiva se

representará mediante líneas rectas con un intercepto común en el eje Y, mientras la inhibición no

competitiva pura se representará mediante líneas rectas con un intercepto común en el eje X. La inhibición

incompetitiva se representará mediante líneas paralelas (no si el sustrato mismo es el inhibidor puesto que

en ese caso no se obtienen líneas rectas). La inhibición mezclada se representará mediante líneas que se

interceptan en algún lugar del segundo cuadrante lejos de los dos ejes. Los resultados tienen que ser

juiciosamente analizados y validados estadísticamente para determinar apropiadamente el mecanismo que

más cercanamente representa los datos experimentales.

Una vez que se ha identificado el mecanismo de inhibición, las expresiones para los parámetros cinéticos

aparentes para cada mecanismo de inhibición se obtienen a partir de la ecuación 3.41 y la Tabla 3.4. Sus

valores se determinan experimentalmente a partir de los interceptos de los gráficos de dobles recíprocos,

como se muestra en la Fig. 3.5 y luego, usando gráficos lineales secundarios, se pueden determinar las

constantes cinéticas correspondientes como se muestra en la Fig. 3.6.



Los mecanismos totales y parciales no se discriminan fácilmente en gráficos de dobles recíprocos. Para

evaluar la naturaleza total o parcial de la inhibición, un gráfico de VAP vs I es adecuado dado que en el



primer caso V tenderá a cero conforme I se incrementa, mientras en el segundo caso tenderá a un valor

finito como se muestra en la Fig. 3.7. El parámetro V’ se puede determinar convenientemente como el

límite de VAP cuando I tiende a infinito. De hecho:

donde KI representa K2, K2” y K

” para inhibición no competitiva, mezclada e incompetitiva,

respectivamente. La regresión no lineal de los datos permite la determinación directa de V’ a partir del

gráfico. El error será más alto cuando el inhibidor es poco soluble y no son alcanzables valores altos de I.

Para la determinación experimental de los parámetros cinéticos de inhibición es deseable usar no menos de

8 concentraciones de sustrato y 5 concentraciones iniciales de inhibidor (incluyendo cero), los puntos de

datos deben estar igualmente distribuidos y el rango de concentraciones de sustrato e inhibidor deben

contener los valores de las constantes de Michaelis-Menten e inhibición respectivamente.

REFERENCIAS Illanes (editor) “Enzyme biocatalysis. Principles and Applications”. Capítulos 3.

3| Control de la actividad enzimática

Un organismo puede ser capaz de controlar las actividades enzimáticas de sus enzimas componentes de

modo que pueda coordinar sus numerosos procesos metabólicos, responder a cambios en su

medioambiente, y crecer y diferenciarse, todo ordenadamente. Hay dos formas que esto pueda ocurrir:

1. Control de la disponibilidad de enzima. La cantidad de una enzima dada en una célula depende de

ambas, su velocidad de síntesis y su velocidad de degradación. Cada una de estas velocidades es

controlada directamente por la célula y está sujeta a cambios dramáticos en el espacio de minutos (en

las bacterias) a horas (en organismos superiores).

2. Control de la actividad enzimática. La actividad catalítica de la enzima puede ser controlada

directamente a través de alteraciones estructurales que influyen la afinidad de enlazamiento del sustrato

de la enzima o el número de recambio. Justo como la afinidad de enlazamiento del oxígeno de la



hemoglobina es regulado alostéricamente mediante el enlazamiento de ligandos tales como el O2, CO2,

H+ y BPG , la afinidad de enlazamiento del sustrato de la enzima puede igualmente variar con el

enlazamiento de pequeñas moléculas, llamadas efectores alostéricos. Los mecanismos alostéricos

pueden causar grandes cambios en la actividad enzimática. Las actividades de muchas enzimas están

similarmente controladas mediante modificación covalente, usualmente fosforilación y

desfosforilación de residuos específicos de Ser, Thr o Tyr.

A | El control alostérico involucra el enlazamiento a un sitio diferente al sitio activo de la enzima

El control alostérico de la actividad enzimática considerando el ejemplo de la aspartato transcarbomilasa

(ATCasa) de E. coli.

Esta reacción es el primer paso único para la biosíntesis de pirimidinas. El comportamiento alostérico de la

ATCasa de E. coli ha sido estudiado por John Gerhart y Howard Schachman, quienes demostraron que ambos

sustratos se unen cooperativamente a la enzima. Más aún, la ATCasa es inhibida alostéricamente por citidina

trifosfato (CTP), un nucleótido de pirimidina, y es activada alostéricamente por adenosina trifosfato (ATP), un

nucleótido de purina.

La curva de v0 versus [S] para la ATCasa (Fig 12-10) es sigmoidal, antes que hiperbólica como en las enzimas

que siguen el modelo de Michaelis-Menten. Esto es consistente con el enlazamiento cooperativo del sustrato. Los



efectores alostéricos de la ATCasa desvían la curva completa hacia la derecha o hacia la izquierda: A una

concentración de sustrato dada, la CTP disminuye la velocidad catalítica de la enzima, mientras el ATP la

incrementa.

La CTP, la cual es el producto de la vía de biosíntesis de pirimidina, es un ejemplo de un inhibidor por

retroalimentación, puesto que inhibe un paso de los primeros de su propia biosíntesis (Fig. 12-11). Así, cuando

los niveles de CTP son altos, CTP se liga a la ATCasa, reduciendo, por tanto, la velocidad de síntesis de CTP. A

la inversa, cuando la [CTP] disminuye, la CTP se disocia de la ATCasa y la biosíntesis de CTP se acelera.

Inhibición por retroalimentación

Es un fenómeno en el cual un

metabolito, generalmente el producto

final de una ruta metabólica, inhibe la

actividad de una enzima anterior que

generalmente es la primera de la

secuencia.

En la inhibición por retroalimentación

“Inhibición alostérica”, el inhibidor

(producto final) no se parece en tamaño,

forma o carga al sustrato de la enzima.

El significado metabólico de la activación del ATP por la ATCasa es que tiende a coordinar las velocidades de

síntesis de nucleótidos de purina y pirimidina, los cuales se requieren en cantidades aproximadamente iguales en

la biosíntesis de ácidos nucleicos. Por ejemplo, si la concentración de ATP es mucho más grande que aquella de

CTP, la ATCasa es activada para sintetizar nucleótidos de pirimidina hasta que las concentraciones de ATP y

CTP se lleguen a balancear. A la inversa, si la concentración de CTP es más grande que la ATP, la inhibición de

la ATCasa por la CTP permite la biosíntesis de nucleótidos de purina para balancear las concentraciones de ATP

y CTP.

Los cambios alostéricos alteran los sitios de unIón al sustrato de la ATCasa. La ATCasa de E. coli (300 kD)

tiene una composición c6r6, donde c y r representan sus subunidades catalíticas y regulatorias. Las subunidades

catalíticas están arregladas como dos grupos de trímeros (c3) en complejo con tres grupos de dímeros regulatorios

(r2). Cada dímero regulatorios une dos subunidades catalítcias en trímeros c3 diferentes. Los trímeros catalíticos



aislados son catalíticamente activos, tienen una máxima velocidad catalítica que aquella de la ATCasa intacta,

exhiben una curva de saturación de sustrato hiperbólica no cooperativa, y no son afectadas por la presencia de

ATP o CTP. Los dímeros regulatorios aislados enlazan a los efectores alostéricos pero carecen de actividad

enzimática. Evidentemente, las subunidades alostéricamente reducen la actividad de las subunidades catalícas en

la enzima intacta.

Como la teoría alostérica produce, el activador ATP preferencialmene enlaza al estado activo de la ATCasa (R

relajada o de alta actividad), mientras el inhibidor CTP se enlaza preferencialmente al estado de la enzima

inactiva (T tensa o sustrato de baja afinidad). Similarmente, el análogo análogo bisustrato no negativo N al estado

R pero no al estado T de la ATCasa.

El enlazamiento de los modificadores alostéricos causa cambios estructurales en la ATCasa. La base estructura

para los efectos de la CTP y APT sobre la actividad de la ATCasa han sido develados parcialmente. Ambos el

inhibidor CTP y el activador ATP se ligan al mismo sitio sobre el filo más externo de la subunidad regulatoria,

alrededor de 60 Å lejos del sitio catlítico más cercano. CTP se liga preferencialmente al estado T, incrementando

su estabilidad, mientras el ATP se enlaza preferencialmente al estado R, incrementando su estabilidad.

El enlazamiento de CTP y ATP a sus estados de la enzima menos favorecidos también tienen consecuencias

estructurales. Cuando CTP se enlaza al estado R de la ATCasa, induce a la contracción en el dímero regulatorio

que causa que los trímeros catalíticos se unan alrededor de 0.5 Å (volviéndose más parecido al estado T, menos

activo). Este, a su vez, reorienta residuos claves en los sitios activos de la enzima, decreciendo por tanto la

actividad catalítica de la enzima. El ATP tiene esencialmente efectos opuestos cuando se enlaza al estado T de la

enzima: esto causa que los trímeros catalíticos se separen 0.4 Å (volviéndose más parecido a R, que es, más

activo), reorientando por tanto residuos claves en los sitios catalíticos de la enzima como para incrementar la

actividad catalítica de la enzima.

B | El control por modificación covalente usualmente involucra fosforilación de la proteína

Además de las interacciones alostéricas, muchas enzimas pueden estar sujetas a control por modificación

covalente. En eucariotes, la más común de tales modificaciones es la fosforilación y desfosforilación (en

enlazamiento y remoción de un grupo fosforilo) del grupo hidroxilo de residuos de Ser, Thr o Tyr.

Tales procesos enzimáticos de modificación/desmodificación, los cuales son catalizados por enzimas conocidas como

proteínquinasas y proteínfosfatasas, alteran las actividades de las proteínas modificadas. En verdad, 30% de



proteínas humanas, que colectivamente participan en casi todos los procesos biológicos, están sujetos a control por

fosforilación reversible.

Como ejemplo de una enzima cuya actividad es controlada por modificación covalente, está la glucógeno fosforilasa

(o simplemente fosforilasa), la cual catliza las fosforólisis (ruptura del enlace mediante sustitución de un grupo

fosfato) del glucógeno (polisacárido similar al almidón que consiste principalmente de residuos de glucosa unidos por

enlace (1-4); para rendir glucosa-1-fosfato (G1P):

Este es el paso que controla la velocidad en la vía metabólica de ruptura del glucógeno, un suminstrador importante de

combustible para actividades metabólicas.

Los mamíferos expresan tres isozimas (catalíticamente y estructuralmente similares pero genéticamente distintas a

partir del mismo organismo; también llamadas isoformas) de glucógeno fosforilasa, aquellos del músculo, cerebro e

hígado. La glucógeno fosforilasa del músculo, es un dímero de unidades idénticas de 842-residuos. Está regulada tanto

por interacciones alostéricas y por fosforilación y desfosforilación. La forma fosforilada de la enzima, la fosforilasa a,

tienen un grupo fosforilo esterificado a su Ser 14. La forma desfosfo se llama fosforilasa b.

Las dos fosforilasas a y b tienen un dominio N-terminal (484 residuos; el dominio conocido más grande) y un dominio

C terminal pequeño. El dominio N-terminal contiene el sitio de fosforilación (Ser 14), un sitio para efector alostérico,

un sitio de enlazamiento a glucógeno (llamado el sitio de almacenamiento del glucógeno), y todos los contactos

intersubunidades en el dímero. El sitio activo de la enzima está localizado al centro.

La desfosforilación y desfosforilación pueden alterar la actividad enzimática que se parece a control alostérico. La

glucógeno fosforilasa tiene dos estados conformacionales, la forma R y (residuos 282-284) que bloquea el acceso del

sustrato a su sitio de enlazamiento. En contraste, en el estado R de la enzima, la cadena lateral de la Arg 569 se ha



orientado como para ligar el ion fosfato sustrato y el lazo 282-284 no bloquea más el sitio activo, permitiendo, por

tanto, que la enzima se ligue al sustrato y catalice efectivamente la fosforólisis del glucógeno.

La fosforilación de la Ser 14 promueve el cambio de la conformación de la fosforilasa T(inactiva) R (activa). Más

aún, estas diferentes formas enzimáticas responden a diferentes factores alostéricos (Fig. 12-16). Así el ATP y la G6P;

a la cual el producto G1P de la reacción de la reacción de la glucógeno fosforilasa es convertido preferencialmente se

ligue al estado T de la fosforilasa b y, al hacer esto, inactive a la enzima, mientras el AMP se liga preferencialmente al

estado R de la fosforilasa b y por tanto la inactive. En contraste, el efector de solo la fosforilasa a es la glucosa, la cual

se enlaza al estado tenso T e inactiva la enzima. Note que ATP, G6P y glucosa están presentes en concentraciones

relativamente altas en el músculo bajo condiciones de bajo ejecicio, un estado cuando la degradación del glucógeno

sería superficial, mientras el AMP está presente en concentración relativamente alta en los músculos bajo condiciones

de alto ejercicio, un estado cuando la G1P, producto de la reacción de la fosforilasa ayuda a proveer combustible a la

contracción muscular.

El grupo fosfato, con su doble carga negativa (una propiedad no compartida con los residuos de aminoácido que se

producen normalmente) y su acoplamiento covalente a la proteína, puede inducir dramáticos cambios

conformacionales. En la fosforilasa a, el grupo fosfato de la Ser 14 forma pares iónicos con dos cadenas laterales

catiónicas de la Arg, enlazando por tanto el sitio activo, la interfase de la subunidad, y la región N-terminal, habiendo

sufrido la última una gran desviación conformacional desde su posición en el estado T de la enzima. Estas

interacciones de enlazamiento causa que las hélices de la torre de la glucógeno fosforilasa se desvíen y tiren separando

como para empacar más favorablemente, lo cual a su vez dispara una transición T R, la cual consiste

principalmente de una rotación relativa de las dos subunidades de 10°. Así el fosfato de la Ser 14 funciona como una

clase de efector alostérico interno que desvía el equilibrio T↔R de la enzima a favor del estado R.

Las cascadas de las proteín-quinasas hacen posible respuestas sensibles a necesidades metabólicas. Las enzimas que

catalizan la fosforilación y desfosforilación de la glucógeno fosforilasa se llaman fosforilasa quinasa y fosfoproteín-

fosfatasa (Fig. 12-16). Las actividades de estas enzimas posteriores se controlan a sí mismas, de ambas formas

alostéricamente o por fosforilación. Así, secuencias de proteín-quinasas y proteín-fosfatasas, ambas se enlazan en

forma de casacadas (Ej. la proteína quinasa X fosforila a la proteín-quinasa Y, la cual fosforila a la proteín-quinasa Z),

tienen mucha mayor capacidad para la amplificación de la señal (un pequeño cambio fraccional en la concentración

del efector causa un cambio fraccional más grande en la actividad de la enzima) y flexibilidad en respuesta a un mayor

número de efectores alostéricos (la actividad de cada proteína en la cascada puede ser influenciada por diferentes

grupos de efectores) que una enzima alostérica simple. En verdad, justo tales cascadas permiten a la glucógeno

fosforilasa responder con mayor sensibilidad a las necesidades metabólicas del organismo.

REFERENCIAS

Voet,D., Voet, J.G. and Pratt, C.W. . 2008. Fundamentals of Biochemistry. Life at the molecular level.

pp. 377-393.

inhibición enzimática

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