enzimas

Enzirnas: propiedades generales

Los temas considerados en este capitulo incluyen las clases de reacciones catalizadas por enzirnas, la par- ticipacibn de coenzimas en reacciones de transfemcia de grupo catalizadas por enzima y aspectos de la especificidad enzimiitica. Asimismo, se introducen los m ttodos para purificación, análisis y deteminacibn de la distribucilin intracetular de enzimas. Luego se describen las isoenzimas, el. diagnbstico y el significado pronóstico de las enzirnas dricas, concluyendo con el uso de endonucleasas restrictivas en el diagnostico de enfermedades geneticas.

IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Sin enzimas no sería posible la vida que conocemos. Igual que [a biocatálisis que regula [a velocidad a la cual tienen lugar los procesos fisiológicos, las enzimas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfemedad. Mientras que en estado de salud todos los -esos fisiológicos se llevan a cabo de una manera ordenada, regulada y se conserva la homeostasia, durante los estados patoldgicos, esta última puede ser perturbada de manera profunda. Por ejemplo, el dafío tisular grave que caracteriza a la cirrosis hepfitica puede deteriorar de modo notable la propiedad de las células para producir enzimas que catalizan procesos metabólicos claves como la sintesis de urea. La incapacidad celular para convertir el arno- niaco tbxico a urea no tóxica es seguida por intoxicacibn con amoniaco y, por último, coma hephtico. Un conjunto de enfermedades genbticas raras, pero con frecuencia debilitaiites y a menudo mortales, proporciona otros ejemplos impresionantes de las drásticas consecuencias fisiolbgicas del deterioro de la actividad enzirnhtica, incfusive de una sola enzima.

Despues del daflo tisular grave (por ejemplo, infarto del miocardio o pulmonar, trituracidn de un miembro) o posterior a la multiplicación celular descontrolada (como en el carcinoma prostktico), las enzimas propias de los tejidos específicos pasan a la sangre. Por tanto, la determinación de estas enzirnas intracelulares en el suero sanguineo proporciona a los m6dicos inforrnacidn valiosa para el diagnbstico y pronóstico.

LAS ENZIMAS SE CLASIFICAN POR TIPO DE REACCIÓN Y MECANISMO

Hace un siglo s61o se conocían algunas enzimas, muchas de las cuales catalizaban la hidrbtisis de enlaces covalentes. Esm enzimas se identificaban por la adición del sufijo -asa al nombre de la sustancia o sustrato que hidrolizaban. De este modo, las lipasas hidrolizaban grasas (lipos, en griego); las amilasas, alrnidbn (amylon, en griego) y las proteasas, proteinas. Aunque hasta hoy persisten numerosos ves- tigios de esta terminología, demostr6 ser inadecuada cuando se descubrieron varias enzimas que catalizaban reacciones diferentes del mismo sustrato; por ejemplo, oxidacibn o reducción de la función alcohol de un azúcar. Aunque el sufijo -asa sigue en uso, en la actualidad los nombres de las enzirnas enfatizan el tipo de reaccidn catalizada. Por ejemplo, las deshidrogenasas catalizan la eliminacibn de hidrógeno y 1% transferasas, reacciones de transferencia de grupo. Con el descubrimiento de m&- y mhs enzimas, sur- gieron ambigtiedades inevitables y con frecuencia no estaba claro cukl era la enzima que un investigador deseaba estudiar. Para remediar esta deficiencia, la Uni6n Internacional de Bioquirnica (IIJB, del inglis, Internotional Union of Biochemistry) adoptó un sistema complejo, pero inequivoco, de la nomenclatura

enzimhtica basado en el mecanismo de reacción. Aunque su claridad y carencia de ambigüedad recomiendan a[ sistema de nomenclatura IUB para trabajos de invcs- tigación, nombres mis ambiguos, pero afortunada- mente: bastante mhs cortos persisten en libros de texto y en el laboratorio clínico. Por esta razón, a con- tinuación se presentan sólo principios generales del sistema IUR:

1) Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en seis cIases principales, cada una con 4 a 13 subclases.

2) El nombre de la enzima tiene dos partes. La primera es el nombre del o de los sustratos; Ia segunda, con terminación -asa, indica el tipo de reacción catalizada.

3) Infonnacion adicional, si es necesario aclarar la reacción, puede seguir en paréntesis, Por ejemplo, la enzima que cataliza ],-malato + NAD' = pinivato + COI + NADH t H', S/

denomina como 1.1.1.37 ~-malato:NAD oxidorreductasa (descarboxi lante).

4) Cada enzima tiene un número clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccibn segun la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y sub-subdase (tercer digito). El cuarto digito es para la enzima especifica. AsC, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa}, subclase 7 (transferencia de fosfato), sub-subclase 1 (una función alcohol como aceptor de fosfato). El último digito denota a la enzima hexocinasa o ATP:D-hexosa-6-fosfotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo del carbono 6 de la glucosa.

MUCHAS ENZIMAS NECESITAN UNA COENZIMA

Muchas enzimas que catalizan la transferencia de grupos y otras reacciones necesitan, ademb de su sustrato, una segunda mol~cula orghnica conocida como coenzima, sin la cual son inactivas. Para distin- guirlas de iones methlicos activadores y de las enzimas mismas, las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestables, de peso molecular bajo, necesarias para ta actividad de las enzimas. La mayoda de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes. Las que forman enlaces covalentes con las enzirnas se denominan tambikn grupos prostkticos.

Entre las reacciones que necesitan coenzimas están las oxidorreducciones, las reacciones de transferencia de grupo e isomerizacibn y las reacciones que forman enlaces covalentes (claves 1, 2, 5 y 6 de la

IUB). Las reacciones liticas que comprenden reacciones hidroliticas catali~adas por enzimas digestivas no necesitan de coenzimas.

Las coenzimas pueden considerarse como segundo sustrato

Puede ser útil considerar a la coenzima como un segundo sustrato por dos razones. En primer lugar, los cambios químicos en la cOenzima compensan exactamente a los que se realizan en el sustrato. Por ejemplo, en las reacciones de oxidorreducci6n (deshidrogenasa), cuando una rnolecula de sustrato es oxidada, una rnoIkcula de coenzima es reducida (figura 8-1).

Una segunda raz6n para dar igual tiifasis a las reacciones de la coenzima es que este aspecto de lareac- ción es el que puede tener el mayor significado fisio- Pogico fundamental. Un caso es la importancia de la capacidad det músculo que trabaja en condiciones anaerobias para convertir el piruvato en lactato no reside en el piruvato ni en el lactato. La reacción sirve solamente para oxidar la coenzima reducida NADH a NAD'. Sin N A D ' la glucólisis no puede continuar y 3a sintesis anaerobia de ATP (y por tanto, el trabajo) tiene que cesar. En condiciones anaerobias, la reduc- cion del piruvato en lactato reoxida al NADH y permite la sintesis de ATP. Otras reacciones pueden servir iguaImente bien. Por ejemplo, en las bacterias o Fe- vaduras que crecen en un medio anaerobio, algunos metabolitos derivados del piruvato son utilizados como oxidantes para el NADH y ellos mismos son reducidos (cuadro 8-1).

Las coenzimas funcionan como reactivos en la transferencia de grupos

Las reacciones bioquímicas de transferencia de grupo del tipo

O , c-Lactato

o x piruvato

NAD" NADH + H+

Flgura 8-1. El NAD+ actúa como cosustrato en la reaccibn de la lactato deshidrogenasa

Enzimas: propiedades generales 79

Cuadro 8-1. Mecanismos para la regeneración obia de iu A n+

- - - -

Para la transferencia de grupos distintos del hidrógeno:

ia viviente Fosfatos de azucares. COA-SH. Pirofosfato de tiamina.

4 Fosfato de piridoxal. i Coenzimas del folato. * Biotina.

Coenzimas de cobalamina (R 12).

* Ácido lipoico.

-

Pir -

la. bacterias IVIUSLU

lácrica:

Levadi L :ctaldeh ido ira

.,.La.,, u,,

dihidroxini -

Frr ias lietert Para la transferencia del hidrbgeno:

NAD+, NADP+ FMN, FAD. Ácido lipoico. Coenzima Q.

en la cual un grupo funcional, G, es transferido de una moIecula donadora, D - G , a una moltcula aceptora. A, por lo gencral comprende la participaci~n de una coenzima como ultimo aceptor (por ejemplo, las reaccic- ne? de deshidrogenación) o como portador intermediario del grupo (como las reacciones de transaminacion). El esquema siguiente muestra el ultimo concepto.

Muchas coenzimas derivan de vitaminas B y del monofosfato de adenosina

Las vitaminas i3 forman parte de la estructura de numerosas coenzimas. Las nicotinamida, tiamina, siboflavina y iicido pantoténico son constituytntes esenciales de las coenzirnas para las oxidaciones y las re- ducciones bioIógicas mientras que las coenzimas Bcido fhlico y cobamida funcionan en el metabolismo de compuestos de un solo carbono. Numerosas coenzimas contienen adenina, ribosa y fosfato y se derivan del monofosfato de adenosina (AMP. del inglés, adenmine monopho.~phate). tos ejemplos incluyen NAD' y NADP' (tlgura 8-2).

Aunque esto sugiere la fomacion de un complejo sencillo C o E 4 , durante el curso de la reacción global, pueden intervenir varios complejos intermediarios C o E 4 en una reacción particular (como la transaminacibn).

Cuando eI grupo transferido es el hidrhgeno, se acostumbra representar s61o la "mitad izquierda de la reaccion ":

Las enzimas son catalizadores estereoespecificos

Casi todos los sustratos forman por lo menos tres enlaces con las enzirnas. Esta "adherencia en tres puntos" puede conferir asimetría a una moldcula por otro lado cimCtrica. La figura 8-3 muestra una molécula de sustrato, representada como un átomo de carbono que tiene tres grupos diferentes, pr6ximos a adherirse en tres puntos a un sitio de la enzima. Si el sitio puede ser alcanzado sblo desde un lado y úni- camente los fitomoc compIementarios y los sitios pueden interactuar (ambas suposiciones válidas para las enzimas reales), la molécula se unira sólo en una forma. La reaccibn misma puede estar confinada a los Atomos unidos en los sitios 1 y 2 aun cuando los hto- mos 1 y 4 sean idénticos. Girando mentalmente la moldcula de sustrato en el espacio, nótese que puede adherirse en tres puntos a un costado del sitio planar con una sola orientaci6n. En consecuencia, los Atomos 1 y 4, aunque sean idénticos, vienen a ser distintos

Que esto representa en realidad sólo un caso especial de la transferencia general de grupos puede apreciarse mejor en tkrminos de las reacciones que tienen lugar en las células intactas (cuadro 8-1 ). Se pueden representar de la siguiente manera:

Las coenzimas pueden clasificarse de acuerdo al grupo cuya transferencia facilitan

BacBndose en este concepto, podrían clasificarse las coenzirnas del siguiente modo:

80 Bioquimica de Harper

Figura 8-2. NAD(P)+. En NAD', -R = H; en NADP*, R = 0~03"'.

cuando el sustrato esta adherido a la enzima. Por tanto, un cambio químico puede afectar e1 &tomo 1 (pero no el Btomo 4) o viceversa. Si bien los sitios activos de las enzimas no son las supeficies planas que se muestran en la figura 8-3, la figura no puede mostrar la causa de que la reducción catalizada por la enzima del piruvato sin actividad bpticaproduzca L-lactato en vez de D, L-lactato

Sitio enzimatim Sustrato

Figura 8 3 . Representación de la adherencia en tres puntos de un sustrato a un sitio activo planar da una enzima.

MUCHAS ENZlMAS CATALIZAN UNA REACCION O UN TIPO DE REACCION ESPEC~F ICA

L a capacidad de una enzima para catalizar una reac- ción específica y esencialmente ninguna otra, es qui7A su propiedad miis significativa. De este modo, las velocidades de procesos metabólicos especificas pueden regularse por cambios en la eficiencia catalitica de enzimas específicas. Sin embargo, la mayoría de las enzima~ catalizm el mismo tipo de reacción (transferencia de fosfato, oxidación-reduccióin, etcdtera) con un pequeflo numero de sustratos relacionados estructu- ralmente. Las reacciones con otros sustratos alternativos tienden a efectuarse si ellos se encuentran en altas concentraciones. Que todas las reacciones posibles ocurran en el microorganismo vivo depende de la concentracibn relativa de sustratos alternativos en las células y de la afinidad relativa de la enzima para esos sustratos.

Las enzimas muestran especificidad óptica

Excepto las epimerasas (racernasas), que.catalizan la interconversión de 10s idmeros bpticos, las enzimas por lo general muestran una especificidad bptica absoluta por lo menos para una porción de la rnoldcula de sustrato. Asi, las enzirnas de la via glucolitica y de la oxidativa directa catalizan la interconversibn de los D- pero no de los L-fosfoanjcares. Con unas cuantas excepciones (por ejemplo, la D-am inoacidooxidasa del riilon), la pan mayoría de las enzirnac de los marniferos actúan sobre los L-isbmeros de los aminohcidos.

L a especificidad 6ptica se puede extender a una porción de la mol~cula del sustrato o a su totalidad. Las glucosidasas proporcionan ejemplos de ambos casos. Estas enzimas catalizan la hidrblisis de las uniones glucosidicas entre aziicares y alcoholes, y son altamente especificas para la porcibn azúcar y para la uni6n (alfa o beta), pero relativamente inespecíficas para la porcion alcohólica o aglicona.

Las enzimas presentan un alta especificidad para el tipo de reacciiin que catalizan

Las enzimas líticas actúan sobre grupos de compuestos quimicos particulares, por ejemplo, glucosi- das% sobre glucbsidos, pepsina y tripsina sobre los enlaces peptidicos y las esterasas sobe los ksteres. Un p a n numero de sustratos pueden ser atacados re- duciendo asi, el número de enzirnas digestivas que de otro modo serian requeridas. Numerosas proteasas

Enzimm: propied~des generales 81

catalizan tarnbidn la hidrólisis de los tsteres. En tanto que esto es probablemente de importancia fisioldgica limitada, el uso de ésteres como sustratos sinttticos ha sido importante en el estudio del mecanismo de accion de las proteasas.

Ciertas enzimas líticas presentan alta especiftci- dad. La quimiotripsina hidroliza los enlaces peptidicos en tos cuales el grupo carboxilo es apostado por los aminohcido~ aromhticos fenilalanina, tirosina o triptbfano. Las carboxipeptidasas y las aminopeptidasas desdoblan los aminoácidos I por 1 de la terminal carboxilo o de la amino de [as cadenas polipeptldicas, respectivamente.

Aunque algunas oxidorreductasas funcionan igualmente bien, ya sea con NAD' o con NADP' como aceptores de electrones, la mayor parte de ellas usan exclusivamente uno o el otro. En general, las oxidorreductasas funcionales en los procesos biosintéticos de los sistemas de mamlferos (por ejemplo, en la síntesis de ácidos grasos o de esteroles) utilizan NADPH como reductor, mientras que las funcionales en los procesos de degradación (por ejemplo, la glucólisis, la oxidacibn de [os hcidos grasos) utilizan NADkomo oxidante.

LA ACTIVIDAD CATAL~TICA DE UNA ENZIMA FACILITA SU IDENTIFICACI~N

Las pequeiías cantidades de enzimas presentes en la célula obstaculizan la rnedicidn de la cantidad de una enzima en liquidos o extractos de tejidos. Por fortuna, la actividad catitalitica de una enzima provee un dispositivo sensible y especifico para su propia medición.

Para medir la cantidad de una enzima en una muestra de extracto tisular o de algún liquido biológico, se establece la velocidad de la reacción catalizada por ella. En circunstancias apropiadas, la velocidad medida es proporcional a la cantidad de enzima presente. Dado que es dificil determinar el número de mol&culas o la masa de enzima presente, los resultados se expresan en unidades enzimáticas. Las cantidades relativas de la enzima se pueden entonces comparar en diferentes extractos. Tales unidades se expresan mejor en micromoles (prnol; 1Q4 mot), nanomoles (nmol; lo4 rnol) o picomoles (pmol; 10-'' mol) de sustrato reaccionante o de producto formada por mi- nuto. Las unidades internacionales enzimáticas correspondientes son pU, nU y pU.

Las deshidragenasas que dependen de NAO' puede analizarse a 340 nm

En las reacciones que interviene el NAD' o el NADP' (deshidrogenasas) se utiliza la propiedad del NADH

o del NADPH (pero no del NAD' o del NADP') para absorber la luz a una longitud de onda de 340 nm (figura 8-41. La oxidación de NADH en NAD' se acompaíia de una disminucibn de la densidad bptica (DO) a 340 nm, proporcional a la cantidad de NAD que se oxida. De igual manera, cuando el NAD' se reduce, la DO aumenta en proporcion a la cantidad de NADH que se produce. Este cambio de DO, se puede utilizar para el anhlisis cuantitativo de cualquier NAD' o NADP' dependientes de deshidrogenasa, tal como sigue. Para una deshidrogenasa que cataliza la oxidación de NADH, mediante su s u s ~ o oxidado, la velocidad de decrecimiento de DO a 340 nm es directamente proporcional a la concentracibn enzimática. Por tanto, la medicibn de la velocidad de decrecimiento en DO a 340 nrn permite deducir la cantidad de enzima, expresada en unidades de actividad, presente en una muestra biológica dada como suero o extracto de tejido.

Muchas enzirnas pueden analizarse por acoplamiento de una reacción a una deshidrogenasa

En el ejemplo anterior se midi6 la velocidad de for- maci6n de un producto (NADH} para determinar ta actividad enzimatica. TambEen es posible analizar la actividad de otras enzimas diferentes de las deshidrogenasas por la medicibn de la velocidad de aparición

1 1 1 I 1

200 233 300 350 600

Longitud de onda (nm)

Figura 84, Espectros de absorcibn del NADt y del NADH. Las densidades corresponden a una solucibn de 44 mgk en una celdilla de 1 m de paso de luz. El NADP* y el NADPH tlenen espectros semejantes a los de NAD* y NADH, respectivamente.

82 Rioquimicu de Harper (Capitulo 8)

Glucosa

1 mecanismos reguladores que operan a nivel de la

ATP, ~ g " catálisis, derivan en gran medida de los estudios de

[HEXC)CINASAI enzima purificadas. La información fidedigna refe-

ADP, h2+ rente a la cinética, cofactores, sitios activos, estructura y mecanismo de acción tam bien nccesita cnzinias

Gluwsa 6-fosfato altamente purificadas.

GLUCO-SA 6-FOSFATO DESHIDROGENASA

NADPH + H'

Figura 8-5. Andlisis acoplado para la actividad de la hexocinasa La reaccibn se acopla a la catalizada por la glucosa-6- fosfato deshidrogenasa. Todos los reactivos, glucosa- 6-focfato deshidrogenasa, glumsa, ATP, y NADP*. se agregan en exceso. Entonces, la cantidad de hexocinasa presente determina la velocidad de la reacción acoplada global y. por tanto, la velocrdad de formación del NADPH, la cual puede ser medida a 340 nrn

de uii produclo (o, de modo menos común, la velocidad dc desaparición de un sustrato). Las propiedades fisictiquimicac del producto o sustrato determinan el mEtodo especifico seleccionado para la cuaníifica- cihn. A menudo es conveniente "acoplar" el producto de una reacción a una deshidrogenasapara la cual este producto representa un sustrato (figura 8-5).

ES ESENCIAL DISPONER DE ENZlMAS

La purificación incrementa la actividad especifica

El objetivo de la purificacihn de la enziina es aislar una proteina enzimhtica especifica dc un cxtracio crudo de celulas que contienen muchos otros compci- nentes. Idas moléculas pequeiias pueden eliininarse por dialisis o por filtracidn en gel, los Licidos nucleicos por precipitacihn con el antibiótico estreptomicina, etcktera. El problema es separar la enzima deseada de una me7cla de cientos de proteínas quirnica y fisicamente semejantes.

En el cuadro &-2 se muestra el progreso de la puri~~cación tipica de una enzima hepática con una recupcraci6n adecuada y una purificación de 490 veces. Nótese la forma en que se calcuEan la actividad especifica y la recuperacibn de la actividad inicial El objetivoes lograr la actividad especiiica máxima ( m i -

dades de enzima por miligramo de proteína) coi1 la mayor recuperación posible de la actividad inicial.

Para la purificación se emplean crornatografía de intercambio ionico y cromatografía con soportes de exclusion de tamaño

PURAS PARA COMPRENDER SU Los procedimientos de purificacibn clásicos útiles ESTRUCTURA, SU FUNCIÓN,~ incluyen la precipitacilin con concentraciones salinas SU MECANISMO DE REACCION variables (por lo general con sulfato de sodio o de Y SU REGWLACION amonio) o solventes (acetato o etanol), la dcsnaturali-

zacidn diferencial por calor o pH, Ia centrifugación E:l conocimiento de las reaccionecy los intermediarios diferencial, la filtracihn en gel y la electroforesis. La quimicus en las vias meiabólicas así como de los absorción celcctiva y la elucion de las proteínas en

izado criidc ~rcnadante con (NIld

l a 20 a 350 ri, columna )?SO4 43 a

iesumen 1

luemn típ ico de pu

iteina tota (m rr)

Cuai de un esq rificación de una e - - Actividad 1

accibn dc ia ~ i i ~ i r r i a (m CJ) * -

Hornogene 100 00(. Liquido sol 98 995 I'recipitado 90 OOC .,. A, .A

Precipitado con acetor /u L ~ U Fracciones 80 a 1 1 0 e DBAE 29 I'recipitado con (NH4 4 8% 20 Prirneroc cristales 12 Recristalixacion 49 O00 1

"A--"" . - -- 49

. - . .- - - -

* mlJ = milienzima: milimolcs de sustrato que cambian por minu

celulosa de intercambio aniónico, dietilarninoetilcelu- losa (DEAE del ingles, diefhyIunainoe/hyo y en !a de intercambio catiónico carboximetilcclulosa (CMC. dcl inglds, carhox,vmeih~~/celJul~ tambien han sido extremadamente utiles para la purificación extensa y ripida de proteínas.

Por ejemplo. un extracto acuoso de tejido hepático se ajusta a pH 7.5, valor en el cual la mayoría de las proteínas tienen una carga negativa neta. Luego, se adiciona la mezcla de proteínas solubles a una oo- lurnna de celulosa D E A E amortiguada a pH 7.5, valor al cual llt;,AE tiene carga positiva. Las proteínas con carga negativa sc Lincn a DEAE por interacción de cargas opuestas, eii tanto que las proieínas sin carga o con carga positiva fluyen libremente a traves de la columna. Luego, la coliimna se eluye, por lo común usando iin gradiente de NaCl que va de concentración ba,ja a alta, disuelto en amortiguador con pH 7.5. Dado que CI-compite con las proteínas por sitios de fijación cn cl soporte con carga positiva, éstas se eluyen de manera selectiva, primero las que se enlazan débil- mente y, al último, las de enlace fuerte. Separaciones proteínicas an5logac emplean un soporte crin cargia negativa como carboximetiIceIulosa o fosfocelulosa a un p l l algo menor, para asegurar que ias proteínas tcngaii una carga m i s positiva

Las separaciones de proteínas también pueden lograrsc sobre nrateriales porosos conocidos como -'filtros moleculares". Cuando una mezcla de pro- teínas fluye a través de una columna que contiene un filtro molecular, las proteinac pequeñas se distribuyen cn Iris espacios entre las partículas y en los espacios internos o poros del soporte. Conforme urja me7.cla de proteínas de diferentes tarnafios fluye al través de la columna, la movilidad de las protefnas pequeflas se retarda en relación con proteínas demasiado grandcs para pasar estos poros. Asi, las proteinas grandcs salen de la columna antes que las menores. E1 perfil de la clución presenta un patrón graduado que va desde las proteinas mas grandes hasta las pequefias. Sin embargo, los filtros rnoleculares tienen capacidad limitada y eil general sOlo se usan después de haber logrado una piirificación previa por otras técnicas.

Los soportes de cromatografía por afinidad sirven para identificar regiones específicas de las enzimas

L,a característica sobresaliente de la cromatografia por afinidad es sil capacidad para remover selectivamente de una mezcla proteínica compleja, una protcína particular o un pequeiio número de ellas. La técnica emplea un ligando inmovilizado que interactúai cspecificamente con la enzima cuya purificacilin se desea. Cuando la mezcla proteínica se expone a este ligando inmovilizado, las iinicas proteinas que se unen son las que interactúan fuertemente con él. Por su parte

la proteína indeseada fluye a lo largo de la columna y 5e descarta. La proteina deseada se eluye del Iigando inmovilizado, por lo general con una concentración elevada de sal o de la Coma soluble dcl ligando. Las pusificaciones logradas por las técnicas de cromatn- grafia por afinidad son iinpresioriantes. a menudo superando las posibles por la aplicaci~n sucesiba de numerosas técnicas clásicas.

Los ligandos favorecidos son derivados dc sustratos y coenzimas adheridos por covalencia a un soporte como Sephadex. en general por niedio de utia mtilécula enla7~dora de 3 a 8 carbonos de longitud Sin embargo, la introducción de Hn "ligando" hidrbfobo complica la scparacihn, al agregar a la cromatrigrafia ese elem~nto hidrdfoha (vCase después), Entre Ins ejemplos de aplicación exitosa de la cromatograt'ía por aiinidad se incluyen la purificación de muchas dcshidrogenasas diferentes sobre soportes dc afinidad de NAD'. Dado que numerosas deshidrogcnasas puedcn fijarse y ser eluidas juntas cuando la columna es tratada con NAD' soluble, el emplco subsiguiente de sustsato (mas que de coenzima) a los soportes afínes o la elución con una "mezcla ternaría abortiva" de un producto y un sustrato han probado tener éxito en muchos casos.

La crornatografía de ligando colorante y ligando hidrófobo son técnicas análogas de cromatografia por afinidad

La crornatografia de Iigando colorante en soportes como Sepharose azul, verde o rojo y Ea cromatografia de ligando hidrofobo como octil o fenil-Sepharose son técnicas con relación estrecha con la crornatografía pos afinidad. La primera emplea como ligando inmovilizado a un colorante organice que sirve como análogo del sustrato, coenzima a efecror alostCrico. En general, la elución se logra usando gradientes salinus.

En la cromatografía de ligando hidrlifobo, un hidrocarburo alquil o aril se adhiere a un soporte como Sephadex. La retención de proteínas en estos soportes comprende interaccioncc hidrofbbicac entre la cadena alquil y ias regiones hidrófobas de la proteina. Las pro- teínas se adicionan a soluciones que contienen una concentración alta de una sal (por ejemplo, [NH4]2S04) y se eluyen con gradientes decrecientes de la misma sal.

La tecnología del DNA recombinante puede ser una fuente abundante de enzimas

Hasta fechas relativaniente recientes, los únicos ma- teriales iniciales disponibles para preparar enzimas purificadas eran las células de animales, plantas o

84 Bioquímica de Harper (Capitulo 8)

bacterias, en Ias cuales se encuentran dichas enzimas. La cantidad existente de una enzima dada en muchos casos era muy pequefía, lo que imponía un límite máximo z la cantidad de enzima purificada que se podía obtener con un costo razonable. Esta situación se ha modificado en gran medida por la tecnología del DNA recombinante, ya que [os genes que codifican muchas enzimas se han donado y secuenciado y pueden colocarse en un vector de expresibn derivado de pllismido o fago, bajo el control de un promotor fuerte. Estos vectores se trasladan al interior de d lu - las, ya sea de Escherichia coli, levaduras o de cultivos de mamíferos. En presencia de un inductor apropiado, la maquinaria de síntesis proteinica de la célula huésped se [leva a la shtesis de Ea enzima deseada. La purificación subsecuente se facilita tanto por las cantidades relativamente grandes de la enzima recombinante como por el hecho de que, al provenir de una forma de vida diferente a la del hubsped puede diferir en grado significativo de las propiedades de las pro- teínas de éste, como serfa Ea estabilidad al calor. Las levaduras varían desde pocos, hasta cientos de mili- gramos de proteína homogCnea por litro de celdas de Escherichia coli, cantidades adecuadas para los am- plios estudios de cristalografía de rayos X y otros anklisis fisicos necesarios para deteminar la estructura tridimensional.

La electroforesis en gel de po!iacrjlamida detecta contarni nantec

La homogeneidad de las proteínas se valora mejor por electroforesis en gel de poiiacrilamida (EGPA) bajo diversas condiciones. La EGPA unidimensional de la proteina original revelará, si se aplica suficiente muestra, la presencia de contaminantes protelnicos mayores y menores. En la EGPA bidimensional (O'Farrell), la primera dimensibn separa a las proteinas desnaturalizadas con base en sus valores pI, equilibrindolos en un campo eldctrico que contiene urea y se mantiene un gradiente de pH por los anfblitos polimerizados. Entonces, la segunda dimensibn separa a las protefnas, despuds de su tratamiento con SDS, con base en los tamailos moleculares de sus unidades protoméricas.

LAS EN2 IMAS PUEDEN ENCONTRARSE EN ORGANELOS ESPEC~FICOS

El ordenamiento espacial y la compartimentaiizacibn de enzimas, sustratos y cofactores dentro de las c&lulas son de importancia cardinal. Por ejemplo, en las cklulas hepáticas, las enzimas de la gluc6lisis están locali- zadas en el citoplasma, en tanto que [as del ciclo del

hcido cíirico están en las mitocondnas. La distribución de las enzimas entre !3s organelos subcelulares puede estudiarse despues de fraccionar los hornogeneizados de células mediante ultracentrifugación. Entonces, se examina el contenido enzimátiw de cada fraccidn.

La localizaci6n de una enzima particular en un tejido o cdlula, en estado relativamente inalterado, se puede lograr frecuentemente por procedimientos his- toquimicos (histoenzimologia}. Cortes delgados de tejido congelado (2 a 10 pm) son tratados con un sustrato para una enzima particular. En las regiones donde se encuentra la enzima se forma el producto de la reac- ción catalizada por ella. Si el producto es colorido e insofuble, permanece en el sitio de formaci6n y sirve como un indice para la localizaci6n de la enzima. La histoenzimologia proporciona una imagen grhfica y relativamente fisiológica de los patrones de dis- tribucibn enzimática.

LAS ISOZIMAS SON FORMAS F~SICAMENTE DISTINTAS CON LA MISMA ACTIVIDAD CATALITICA

Cuando se aplicaron las tdcnicas de purificación de enzirnas a la malato dechidrogenasa de diversas fuentes (por ejemplo, hfgado de rata y Escherichia coli), pronto se obsenib que, si bien la malato deshidrogenasa de hlgado de rata y la de E. coli, catalizan la misma reaccidn, sus propiedades físicas y quimicas exhibían numerosas diferencias importantes. Pueden existir formas físicamente distintas con la misma actividad catalitica en diferentes tejidos del mismo organismo, en distintos tipos celulares, en compartimientos subcelulares o en pr-otas como E coli Este descubrimiento fue una consecuencia de aplicar los procedimientos de separacidn electroforktica a la separaci6n de entidades electroforéticamente distintas de una actividad enzimktica particular.

Mientras que el t tmino "isozima" (isoenzirna) podría utilizarse para englobar a todos los ejemplos anteriores de formas fisicarnente distintas con una actividad catalftica dada, en la prhctica, en especial en la medicina clínica, la "isozima" tiene un significado más restringido, es decir, las formas distintas y f í s i - camente separables de una enzima dada, presentes en tipos celulares diferentes o en compartimientos subcelulares de un ser humano. Las isozimas son comunes en los sueros y los tejidos de todos los vertebrados, insectos, vegetales y microorganisrnos unicelulares. Tanto la clase como el número de enzima involucradas es igualmente diverso. Se han localimdo isozimas de numerosas deshidrogenasas, oxidasas, tramaminasas, fosfatasas, transfosforilasas y proteasas. Tejidos diferentes pueden contener isozimas distintas y tstas a su vez diferir en su afinidad por los sustratos.

Enzimas . propiedades generoles 85

La capacidad para separar e identificar isozimas tiene valor diagnóstico

El interds mCdico en las isotimas fue estimulado por el descubrimiento de que tos sueros humanos con- tenían varias isozimas de la lactato deshidrogenasa y quesus proporciones relativascambian significativamente en ciertos estados patol~gicos. Posteriormente, se han descrito numerosos ejemplos adicionales de cambios en las proporciones de isozimas como consecuencia de una enfermedad.

Las isozimas de la lactato deshidrogenasa del suero pueden demostrarse sometiendo una muestm de suero a laelectroforesis, usualmente a pH 8.6, usando un gel de almidon, agar o poliacrilamida como soporte. Las isozimas tienen diferentes cargas a este pH y emigran a cinco regiones distintas del electroferograrna. Luego, se localizan por medio de su capacidad para catalizar la reducción de un colorante incoloro a su forma colotida e insoluble.

Una mezcla tipica para anhlisis de deshidrogenasa contiene NADA, un sustrato reducido, la forma oxidada de un colorante redox como nitroaml de tetrazolio (NBT, del ingles, litro blue lelrmolrum) intermediario necesario para la transferencia de eIec- trones de NADH a NBT, amortiguador e iones acti- vantes segun sea necesario. La figura 8 4 ilustra la aplicacibn de este tipo de anklisis para visualizar y cuantificar isozimas de lactato deshidrogenasa shica (LDH, del inglks, lactnle dehydrogenuse) en el laboratorio clínico. La lactato deshidrogenasa cataliza la transferencia de dos electrones y un ion hidrbgeno del lactato al NAD' (figura 8-1). La reaccibn procede a una velocidad mensurable s61o en presenciade la lactato deshidrogenasa. Cuando la mezcla se rocía sobre el electroferograma y se incuba a 37 "C, tienen lugar las reacciones coordinadas de transferencia de electrones s61o en aquellas regiones donde se encuentra la lactato deshidrogenasa (figura 8 4 ) . Las intensidades relativas de las bandas pueden ser cuantificadas por un foriimetra de barrido (figura 8-7). La isozima mas negativa, se denomina 1

Las isozimas son productos de genes estrechamente relacionados

Las enzimas oiigoméricas con varios protómeros disimiles pueden existir en diversas formas. Con fre- zuencia, un tejido produce un protornero de manera predominante y otro tejido sintetiza un prothmero diferente. Si es posible que Cstos se combinen de varios modos para construir una enzima activa (por ejemplo, un tetrhmero), se dice que se han formado isozimas de esa actividad enzirnática. Este fenómeno se representa despues mediante una enzima de importancia en el diagnóstico: la deshidrogenasa Ifictica.

(Lactato) sH2 WCTATO S (Pjruvatc) kDESH IDROGENASAJ

FMS reducido ~ ~ C ' o x i d a d o

NBT oxidado (incoloro) (azul)

Flgura 84. Reacciones acopladas para la demostración de la actividad de la lactato deshidrogenasa en un etectrofero- grama. (NBT nttroazuF de tetrazoilo, PMS, metoculfato de fenacina.)

Las isozimas de la laciato dcshidrtigeiiasa difieren en el orden de la estructura cuaternaria. La molécula oligomérica de la lactato deshidrogenasa activa (peso molecular de 130 000) consiste en cuatro protomeros de dos tipos. E-1 y M (peso molecular aproximado de 34 000). Sólo la molécula tetramirica posee actividad catalitica. Si cl urden no e i iinpor- tante, estos prothmeros pueden Fer combinado'; de cinco maneras diferentes como se muestra en seguida:

HHHH HHHM HHMM HMMM MMMM

Market ha usado condiciones que se sabe disgregan y reforman la estructura cuatemaria para esclarecer las relaciones entre las isozimas de la lactato deshidrogenasa i,, o de la lactato deshidrogenasa I s . La separacidn y reconstitución no produce nuevas isozí- mas las cuales, por tanto, consisten en un solo tipo de protómeso. Cuando una mezcla de lactato deshidrogenasa I l y lactato deshidrogenasa 1s son sujetas al mismo tratamiento, tarnbikn se producen las lactato deshidrogenasas Iz, 1, e 14. Las proporciones aproxi- madas de las isozimas encontradas son las que resul- tarian si la relacibn fuera:

lsazirna lactato

des hidrogenasa Subunidades 1 1 HHHH 12 H H H M 13 HHMM 14 HMMM 15 MMMM

86 Bioquimica de Harper (CapifuJo 81

NORMAL

Figura 8-7. Patrones normal y patolbgioo de las isozimas de la laetato deshidrogenasa (LDH) en suero humano. Las isozimas de LDH del suero fueron separadasen acetatode celulosa a pH 8.6 y tenidas en busca d e la presencia d e enzimas. El fotbmetro de rastreo muestra la produccibn de las isozimas El patrbn A es suero de un pauente con infarto del rniocardio, B es suero normat y C de un paciente con enfermedad hsphtica. (Cortesía del Dr. Melvin Black y Mr. Hugh Miller, St Luke's Hospital, San Francisco.)

La sfntesis de subunidades H y M es controlada por valores hasta de un mil1611 de veces inferiores a los de distintos Iocr geneticos que estiin expresados de los tejidos. Su presencia en el plasma en cifras ma- manera diferencial en diversos tejidos, por ejemplo, yores que tos valores normales sugiere una velocidad el coraz6n y el mUsculo esquel&ico. aumentada de destruccibn tisular. Por tanto, la

medicion de estos valores de enzimas plasmhticas no funcionales puede constituir para el médico una

EL ANALISIS CUANTITATIVO DE prueba valiosa de diagnóstico y pronóstico clínico. CIERTAS ENZIMAS PLASMÁTICAS Las enzimas plasrnhcicas no funcionafes com-

TIENE SIGNIFICADO DIAGNOSTICO prenden a las que existen en las secreciones exocrinac v a las enzimas intracelulares verdaderas. Las enzimas

Ciertas enzimas, proenzimas y sus sustratos se encuentran siempre en la circulacibn de las personas normales y realizan una funcibn fisiológica en la sangre. Algunas de estas enzimas plasmhticas funcionales son la lipoproteinlipasa, la seudocolinesterasa y las proenzimas de la coagulacibn sanguinea y de la disolución del cohgulo. Generalmente son sinteti- zadas en el hlgado, pero tarnbikn se encuentran en la sangre a concentraciones equivalentes o mayores que en los tejidos.

Como lo dice su nombre, las enzimas plasmáti- cas no funcionales no desempeiian ninguna funcibn conocida en la sangre. Los sustratos de ellas con frecuencia faltan en el plasma y las propias enzimas se encuentran en la sangre de personas normales en

exocrinas, amilasa pancsektica, lipasa, fosfatasa biliar alcalina y fosfazasa ácida prostática, difunden en forma pasiva al plasma. Las enzimas intracelu lares verdaderas estiin normalmente ausentes de Ea circulacion.

La destrucción normal de c&lulas conduce a la presencia en plasma de concentraciones bajas de enzimas no funcionaIes

Los valores bajos de enzima no funcionales que se encuentran por lo general en el plasma, aparentemente proceden de la desmiccibn rutinaria normal de los eritrocitos, leucocitos y otras cdlulas. Con la muerte acelerada de las c~lulas, las enzimas solubles entran

Enzimas. propiedades generales * 87

LAS ENDONUCLEASAS RESTRICTIVAS FACILITAN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS

en la circulación. Aunque los valores elevados de enzirnas plasmiiticas se interpretan generalmente como prueba de necrosis celular, el ejercicio intenso tambikn libera cantidades importantes de enzimas musculares. El diagnbstico de las enfermedades genéticas ha reci-

bido un impulso tremendo con la tecnología del DNA recombinante. Aunque desde hace tiempo se sabe que todas las enfermedades moleculares son consecuencia de una alteracibn del DNA, las técnicas para el examen directo de las secuencias del DNA s610 se han desarrollado en épocas recientes. El desarrollo de pruebas de hibridización para fragmentos de DNA ha conducido a técnicas de sensibilidad suficiente para investigar, desde antes del nacimiento, los trastornos hereditarios p r mapeo de enzirnas de mtricci6n de t DN A derivado de las cklulas fetales en el líquido amnibtico.

Las pruebas para el DNA pueden, en principio, ser preparadas para el diagnástico de la mayoría de las enfermedades gendticas. Por ejemplo, para la detección prenatal de talasemias (que se caracterizan por un defecto en la sintesis de las subunidades de la hemoglobina; capitulo 7), una prueba preparada contra una porcidn del gen para una subunidad de una hemoglc- bina normal puede detectar un fmgmento de rwtnccibn acortado o inexistente, el cual proviene de unasupresidn en ese gen, como sucede en atgunas alfa talasemias y en ciertos tipos poco frecuentes de beta y beta, delta talasemias. De manera alternativa, se ha preparado un detector o probador de cDNA sintktico que se hibridiza a la secuencia de una beta-globina que contiene una rnutacidn sin sentido, presente en ciertas beta-talasemias, pero no en el gen normal de la beta-globina. La ausencia del inhibidor de la proteasa plasmática alfa,-antilipsina se ha relacionado con el enfisema y con la cirrosis hephtica infantil. La presencia de una alfa,-antitripsina inactiva se ha identificado por un probador construido contra el alelo inactivo que contiene una mutacián en un punto en el gen para la alfai-antitripsina.

Los detectores de hibridizacidn tambitn pueden utilizarse para averiguar alteraciones genkticas que conducen a la pdrdida del sitio de una endonueleasa de restriccibn (capitulo 42). Por ejemplo, la mutación en un punto del coddn Glu (GAG) al codbn Y al (GTG) tipica de la enfermedad de c6lulas falcifonnes puede detectarse en el gen de la beta-globina en las células contenidas en cantidades tan pequeiías de hasta 10 mL de liquido amniótico usando la endonucleasa de res- triccion MstII o SauI.

Las enzimas plasmáticas no funcionales ayudan en el diagnóstico y pronóstico

Por mucho tiempo, la práctica profesional médica ha usada la cuantificacibn de ciertas enzimas plasmaticas no funcionales. Esta valiosa inforrnacidn para el diag- nóstico y el pronóstico se obtiene muchas veces con equipos totalmente automáticos. El cuadro 8-3 contiene una lista de lar enzimas principales utilizadas en el campo de la enzimologla para diagnóstico. En el Apendice se incluye la escala de valores normales de las principales enzimas usadas con propositos de diagnostico.

Cuadra 8-3. Principales enzimas séricas utitizadas en el diagnóstico clinico. Muchas de kstas no son

cas para la enferm - A -. -- -

ncionada ,-.-A-

na sérica I Usa u i i r r iu i r i i cu u r i i i c iua I

A ferasas o aminoti

rerasa (rtST o SGOTI 1 Infariu uei ~ n i u aminotr

LT o SGR

Enzin

,minotrans! Aspartat

, *

Alanina ferasa (A

. .... :reat~tis aguda -- n- j c

." . . . . , , . -,,,,,-M - ,

'eruloplasn ticu

i ina hepatote :rrnedad I

-" - Creatinacine e

infa

F iíio Carcinoma rnr de la prhstata

-

Eosfatasa alcalina (isozi- Varias enfermedades bseas, 1s-

usculares cardio

stornos m rto del mi0

mas) tras' truci

tornos he1 tivos LA DIGESTIQN RESTRICTIVA DE

PROBADORES PUEDE REVELAR GENES HOM~LOGOS CON DIFERENTES SECUENCIAS DE BASES

- - y-Glutamil t k m 1 3 p ~ C l ~ , ~ ~ a 1 Varias entermcdades he-

L (isozirnas) -- -- L Pancreatitis aguda - --

rto del mio cardio actato d e . . nasa Infa

Los detectores de DNA tambibn pueden usarse para encontrar secuencias de DN A íntimamente enlazadas ipasa

al gen que interesa, pero en realidad no dentro de 4. Los análisis pueden extenderse a la identificacibn de variaciones específicas de cromosomas (diferencias en la secuencia entre cromosomas hom6logos). La digestión del DNA con una endonucleasa de restric- ci6n genera diferentes mapas (patrones de fragmentos de DNA) de genes hornúlogos que contienen secuencias diferentes de bases. Este fenómeno se denomina "polilimorfismo de la Longitud del fragmento de restriccibn" (PLFR). En una enfermedad genética ligada a un polimorfismo de la longitud de restriccibn, el portador de la enfermedad poseerá un cromosoma con un gen nomal y uno con un gen defectuoso. Cuando los fragmentos de restriccibn se analizan y sondean, se detectan dos bandas de hibndizacibn (que es distinto a una sola banda cuando ambos genes son idénticos). Los descendientes que heredan el cromosoma portador del defecto exhiben una sola banda de hibridizacibn que difiere de la producida por cro- mosornas normales. El fenbmeno de PLFR relacionado se ha aplicado al anhlisis de rasgo de las cdlulas falcifomes (bastsándose en un PLFR I-lpal relacionado) y de la beta-talasemia (ligada a un PLFR HindIII y BamHII.

Se h a desarrollado una exploracibn basada en los PLFR para identificar la fenilcetonuria infantil (capítu- lo 32): Sin embargo, debe notarse que este enfbque general no es infalible, puesto que el PLFR no causa la enfermedad sino que simplemente se localiza cerca del gen defectuoso. Al parecer, la importancia firtura del PLFR radica en que es punto de partida para la identificacion del gen de las enfemidades relacionadas. Este enfoque que se ha empleado recientemente en la búsqueda de los fenómenos mutacionales que intervienen en la formación de los retinoblastomas y la enfermedad de Huntington.

En el capitulo 42 se encuentran más ejemplos de los usos de las enzimas de restriccibn para diag- nóstico.

RNA CATALITICOS

Aunque es evidente que no son proteinas, ciertos ácidos ribonucleicos (RNA) presentan actividad catalitica altamente específica de sustrato. Estos RNA, que cumplen con todos los criterios clhsicos de la definicibn de enzirnas, se conocen como ribozimas. Aunque los sitios de accibn de las ribozimas se limitan a los enlaces fosfodiésteres de RNA, la especificidad de su acci6n se compara plenamente con la de las enzimas clksicas. Las ribozimas catalizan la truns- esterificacibn y, en iiltirna instancia, la hidrólisis, de los enlaces fosfodidcttres en moléculas de RNA. Estas reacciones son facilitadas por grupos libres --OH, por ejemplo, en residuos de guanosil. Las ribozimas inter-

vienen de manera clave en procesos de separacidn de intrones esenciales para la conversián de pre- mRNA a m RNA maduro (capítulo 39).

RESUMEN

Las enzimas son catalizadores protelnicos que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiolbgi- cos. En consecuencia, las deficiencias en la función enzim htica con frecuencia causan patología. Las enzimas que catalizan reacciones que comprenden trasferen- cia de grupo, isomerimción, oxidomducción o sintesis de enlaces covalentes necesitan un cosustrato conocido como coenzima. Dado que numerosas coenzimas son derivados de la vitamina B, las deficiencias vi- tamínicas pueden afectar de modo adverso la funci6n enzimiitica y, por ende, la homeostasia. Varias coenzimas también contienen e[ nudebtido AMP. La mayoría de las enzimas tienen especificidad elevada por sus sustratos, coenzirnas y tipo de reaccion catalizada. Sin embargo, algunas proteasas tambiéri escinden esteres. Las enzimas que actúan sobre sustratos de peso molecular bajo, tambikn pueden reacciona. con análogos de sustratos, pero en general a velocidades bajas.

La medicihn de la actividad enzimática es fundamental pam la cuantificacián de enzimas en investigacibn o en e3 laboratorio clínico. La actividad de deshidrogenasas dependientes de NAD(P)' se analiza en espectrofotrimetro a través de la medición del cambio en la absorcion a 340 nrn que acompafla a la oxidacibn o reducción de NAD(P)+/NAD(P)H. Acoplar otras enzimas a las deshidrogenasas puede facilitar su análisis. En la investigacidn de su estructura, mecanismo de accián y regulacibn de su actividad, las enzimas deben purificarse a una homogeneidad mayor de 95 por ciento. Las tdcnicac para purificar enzimas incluyen precipitación selectiva por sales o solventes orgánicos y cromatografía en soportes de intercambio idnico, fi ttracibn en gel, afinidad por sustrato o interac- cibn ligando colorante o ligando hidrbfobo, La capacidad para explotar tdcnicas de QNA secombinante en la expresión de enzimas en hutspedes utiles ha revolu- cionado la puriftcacibn de enzimas al proporcionar cantidades grandes de enzimas que en la mayorÍa de tos casos ya pueden purificarse hasta la homogeneidad. El progreso de una purificación se valora con la medición del incremento en la actividad especifica de la enzima (actividad por unidad de masa) y su homogeneidad final mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida (EGPA). La localizacibn intracelular precisa de enzimas se infiere por medio de tbcnicas de histoquimica y fraccionamiento celular acopladas con análisis enzimático de cortes de tejido o de fracciones de hornogeneizados celulares. En todas las formas de vida y tejidos existen isozimas, que son formas fisi-

Enzrmas: propiedades generales 89

camente distintas con la misma actividad catatítica. Patrones distintivos de isozimas de enzimas skricas no funcionales revelan daíio de tejidos humanos específi- cos y proporcionan informacibn valiosa para el diag- nóstico y el pronostico. Por Ultimo, la propiedad de las endonucleasas restrictivas para detectar cambios sutiles en la estructura de los gcnes permite al médico el diagnhstico de enfermedades genkticas donde las mu-

taciones conducen a sintesis de enzimas defectuosas o no funcionales.

Aunque casi todas las enzirnas son proteínas, se conocen RNA catalíticos, como las ribozimas que catalizan de manera muy especifica la hidrolisis de enlaces fosfodiéster en el RNA. Estas reacciones son importantes en fenómenos de procesamiento que incluyen la maduración de pre-mRNA.

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Vicfor W Rodwell, PhD

Muchas caracterisiicas de la cinetica enzirnática provienen, por lógica, de conceptos propios de la cinbtica de reacciones químicas no catalizadas. Por tanto, este capitulo describe primero aspectos de la teoría de la velocidad de reaccidn, válidos para reacciones químicas en general y luego considera los factores exclusivos para reacciones cata1 izadas por enzimas.

Todos los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas (concentración de enzima y de sustrato, temperatura, pH y presencia de inhibidores) tienen interés en clínica. EI principio biológico principal del estado homeostático de buena salud requiere que la composición del medio interno corporal se conserve dentro de limites relativamente estrechos. Por tanto, la buena salud exige no sólo que se produzcan cientos de reacciones catalizadas por enzimas, sino que procedan a velocidades apropiadas. No lograrlo perturba el equilibrio horntostatíco de los tejidos, con profundas consecuencias potenciales. El medico debe comprender el modo en que el pH, la concentraci6n de enzimas y de sustrato así como los inhibidores influyen en las velocidades de esas reacciones. Algunos ejemplos escogidos ejemplifican sobre este puitto.

La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzirnas responde a las desviaciones sutiles del pH intracelular que caracterizan a la acidosis o alcalosis metabdlica. Además, dado que esta velocidad se eleva o baja en respuesta a las fluctuaciones correspondientes en temperatura, la fiebre y la hipotermia perturban

la homeostasia al modificar la velocidad de numerosas reacciones catalizadas por enzirnas. Sin embargo, eszos cambios mínimos pueden convertirse en ventaja para el mtdico. Por ejemplo, la disminucibn en la actividad de todas las enzimas que tiene lugar a temperatura corporal baja (hipotermia), puede explotarse para reducir la demanda rnetabolica global durante cirugia a coraz6n abierto o en el transporte de órganos para trasplante quirúrgico.

Por su parte, la toxicologia y la farmacología aprovechan eI conocimiento de los factores que modifican la velocidad de reacciones enzimiticas. Los venenos metabiilicos como los mercuriales, el curare y los gases nerviosos ejercen su toxicidad mediante la inhibicibn de enzimas y en consecuencia toman lentas o anulan reaccionasmetaMlicas esenciales. Por ultimo, numerosos fármacos importantes en terapéutica actúan por reduc- cjon de las velocidades de reacciones metabblicas al competir con el sustrato natural por una enzima clave. A menudo estos medicamentos tienen una estructura anhloga a la del sustrato natural. Ejemplos son la lovastatina y la zidovudina (AZT), famacos usados para tratar la hipercolesterolemia y el SlDA, respectivamente. Ambos tienen efectos teraptuticos mediante la alteracion de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

LAS REACCIONES PROCEDEN A TRAVÉS DE ESTADOS DE TRANSICIÓN

El concepto de estados de transicidn es fundamental para la comprensibn de las catfilisis de cualquier tipo, incluyendo la enzirnhtica. Por ejemplo, considkrese unareacción de desplazamiento donde un grupo L que

92 Bioqrcím ica de IJarpw

se desprende, adherido en uii principio a R, es desplazado por la entrada del grupo E:

E + R - L = E - R + L

En realidad este desplazamiento pasa por un estado de transicion, E- R.. L, cuya íormacibn y desinte- gración subsiguiente puede representarse con dos ''reacciones parciales". cada una con un cambio carac- teristico en la energia libre:

E + R - L = E. .R. . L AGF E . . R * . L = E - R + L Gn

AGF y AGD son 10s cambios de energia libre que se producen en la formación y dcsintegracibn del estado de transicibn, respectivamente. EZ AG, cambio de energía libre relacionado con la reacción global, es igual a la suma de las energías libres de Ea Iormacibn y degradación del estado de transicihn:

De la misma manera que en cualquier ecuación con dos tCrminos, no es posible inferir el signo o magnitud de AGF y AGn por observación del signo algcbraico y magnitud de AG. De otro modo, es iniposible, a partir de la concideracihn del cambio de energia libre en la reaccihn global, AG, inferir dato alguno respecto a los cambios de la energia libre relacionados con la foma- ción y degradación de los estados de transición, Dado que la catalisis se relaciona de manera intima con AGF y AGn, se deduce que la termodinamica de la reacción global (AG) no puede proporcionar indicios del camino que una reacción sigue [es decir. su mecanismo). Esta es tarea de la cinética.

Reacciones m i s complejas involucran varios y sucesivos estados de transición y proceden a travhs de una seric de reacciones parciales, cada una con un cambio de energia libre. Es importante observar que el cambio de energia libre para la reacción global, AG, es independiente del número de estados de transi- ción. Esto se deriva del hecho de que AG es la suma algebraica de los cambios de energía libre para cada reacción parcial participante.

NUMEROSOS FACTORES MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

La teoria cinética o de colisión de la cindticaquimica, incorpora dos conceptos claves: 1) s61o las maltculas que chocan; es decir, que se acercan una de otra a distancias suficientes para formar enlaces, pueden

reaccionar; y 2) para cada reaccion química. hay una barrera energetica que debe superarse para que la reacción tenga lugar. Para que una colisibn termine en una reacción, las moléculas reactantes deben poseer energia suficiente para sobrepasar esta barrera ener- ghtica. Por tanto, cualquier cosa que: a) eleve la energía cinética de las nioléculas reactantes, b) abata la barrera energktica para la reacción o c) incrernente la frecuencia de colisión, deberá aumentar la velocidad de reacción.

Temperatura

Elevar la temperatura incrementa el número de moléculas que pueden reaccionar, ya que aumenta la energia cincrica e incrementa la frecuencia de las colisioncs. Como se muestra en la figura 9-1, el numero de mol&culas cuya energia cindtica excede la barrera energktíca para la reaccion (barra vertical) aumenta cuando la temperatura sube desde un valor bajo (A) a travds de uno intermedio (B) a uno alto (C). Adernhs, cualquier elevación de temperatura, acelera el movimiento molecular y, por ende, la frecuencia de colisión. Los dos factores contribuyen al incremento en la velocidad de reacción que acompafia a un aumento dc temperatura. Sin embargo, este incremento de la velocidad de reacción no continua de manera indefinida, dado que finalmente se alcanza una temperatura a la cual las mol6culas reactantes ya no son estables. Esta temperatura limitante tiende a ser en extremo elevada para reactantes inorghtcos, modwa- damente alta para gran parte de las rnolkculas orgáni- cas, pero bastante menor de 100 "C para la mayoría de las reacciones de interés biolbgico.

Concentración de reactantes

A concentraciones elevadas de reactantes, tanto la cantidad de mol&culas con energia suficiente para reaccionar como su frecuencia de colisión son altas. Esto es verdad, ya sea que todas o s61o una fraccion de las mol&culas posean energia suficiente para reac-

Barrera de energia

Figuta 3-1. Barrera energética para las reaeeiones químicas

cionar. Considtsrense reacciones que comprendan dos moléculas diferentes, A y R:

Duplicar la concentración de A o de 13 elevará la velocidad de reacción al doble, Dupticar la concen- tración de ambas. A y B, incrementarh cuatro veces la probabilidad de colision. Por tanto, la velocidad pe reacción aumenta al cuádruple. I,a velocidad de reaccihn es proporcional a las concentraciones de las moléculas reactantes. Los corchetes denotan concentraciones molaresk* cr sigriifica "proporcional a". La expresihn de la velocidad es:

la expresidn apropiada de la velocidad es:

Velocidad a [AnBd

La reversibilidad se presenta por flechas dobles:

Esta expresión se lee: "ri moléculas de A y m molécu- las de B están en equilibrio con A,B,,". El signo "proporcional a" (E) puede reemplazarse con un signo de igualdad mediante la inserción de una constante de proporcionalidad, k, característica de la reac- ci6n en estudio. Para el caso general

Velocidad E [rnolbculas reactantes]

o Velocidad s: [A] [B]

las expresiones para las velocidades de reacción hacia la derecha (velocidad I ) y la izquierda (velocidad -I)

son:

Para la situaciiin representada por:

la expresihn de la velocidad es:

Velocldad m [A][B][B]

o Velocidad or [A][B]~

Para el caso general donde n moléculas de A reac- cionen con m rnoldculas de B:

la expresibn de la velocidad es:

Velocldad a [Aln[BIm

K,, es una proporción de constantes de velocidad

Dado que todas las reacciones qulmicas son reversibles, para la reacci6n inversa donde A,B, forman n moléculas de A y m moléculas de B:

* Hablando de manera estricta, en lugar de concentraciones debería decirse actividades molares.

Cuando las velocidades de las reacciones hacia la derecha e iquierda son iguales, se dice que el sistema esta en equilibrio, es decir,

luego ki[AIn[B]"' = k-~[AnBrn]

Y

La proporción de ki a ki se conoce como la constante de equilibrio, TG,. Deberh tenerse en mente las siguientes propiedades importantes de un sistema en equilibrio.

1) La constante de equilibrio es la proporción de las constantes de la velocidad de reacción, kik-1.

2) En el equilibrio, las velocidades (no las constantes de la velocidad} de las reacciones hacia la derecha y hacia Ia izquierda con iguales.

3) El equilibrio es un estado dinámico. Aunque en el equilibrio no existe un cambio neto en la concentracion de nioléculas reactantes o productos, A y B se están convirtiendo de manera continua a AnRm y viceversa.

4) La constante de equilibrio puede tener un valor numérico si se conocen las concentraciones de A, B y AnBm en el equilibrio.

94 a Bioauimica de Hur~er

AGO puede calcularse a parkir de K,,

La constante de equilibrio se relaciona con AG' de la siguiente manera:

R es la constante de los gases y T, la temperatura absoluta. Dado que estas se conocen, el conocimiento del valor numérico de K, permite el chlculo del valor para AGa. Si la constante de equilibrio es > 1, la reac- ción es espontánea; es decir, se favorece la reacci6n según se ha escrito (de izquierda a derecha). Si es < 1, tiene lugar lo contrario; es decir, es mas probable que la reacción proceda de derecha a izquierda. Sin embargo, nbtese que aunque la constante de equilibrio para una reacci6n indica la direccidn a la cual una seaccibn es espontánea, no indica s i tendra lugar con rapidez. Esto es, no informa acerca de la magnitud de la barrera energttica para la reacci6n (es decir, AGF, vkase antes). Esto se debe a que K, determina a AGO, que previamente se demostrb concierne sólo a los estados inicial y final. Las velocidades de reacción dependen de la magnitud de la barrera energética, no de la magnitud de AGO.

La mayoría de los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzirnas lo hacen mediante el cambio de la concentraci6n local de reactantes.

Las enzimas proporcionan estados de transición alteinoc

Igual que en toda catálisis verdadera, las enzimas se recuperan sin cambio después que la reaccibn termina. No obstante, durante el proceso, las enzimas participan de manera directa en la formación de estados de transición. De manera tipica, los estados de transicibn enzima-sustrato estan en niveles energeticos significativamente menores que los estados de transici6n cuando la misma reaccibn procede en ausencia de catalisis enzimhtica. Por tanto, un factor importante que contribuye a la capacidad de una enzima para acelerar la velocidad de una reacci6n dada es que el AGF para formar un estado de transicidn enzima-sustrato sea bastante menor que el AGF para la reaccibn no catalizada correspondiente. De otra manera, Ias

enzimas disminuyen la barrera energéticaen una reaccibn. En consecuencia, una proporcibn mayor de moléculas de sustrato son capaces de reaccionar. Sin embargo, nbtese que si bien las enzimas afectan a AGr;, no modifican a AG. La AGn de la reacci6n global es igual estt catalizada o no por enzimas. Debido a que la constante de equilibrio para una reacción química es una funcibn del cambio de energia libre estandar para una reacciiin

se deduce que en las enzimas y otros catalizadores no tienen efecto sobre la constante de equilibrio para una reaccibn.

Las enzimas catalisan la formación o rotura de enlaces covalentes

Para la reacci6n de transferencia de grupo:

un grupo, el G, es transferido de un donador, D 4 , a un aceptor, A. La reacción global comprende tanto la rotura del enlace D-G como la forrnacidn de un nuevo enlace A-G.

Las reacciones de transferencia de grupo, catalizadas por enzimas, pueden representarse de la siguiente manera:

Esto enfatiza tres características importantes de las reacciones de transferencia de grupo, caializadas por enzirnas:

1) Cada reaccibn parcial comprende tanto la rotura como 3a formacibn de un enlace covalente.

2) La enzima es un reactante coeguivalente con D-G y con A.

3) Si bien en la reaccidn global la enzima actiia de manera catalitica (es decir, se requiere 5610 en oligocantidades y puede recuperarse sin cambio cuando lareaccibn ha terminado), para cada reaccidn parcial, la enzima es un reactante estequiomktrico (esto es, se requiere en proporcibn molar 1: 1 con los demhs reactantes).

Numerosas reacciones bioquímicas adicionales pueden considerarse casos especiaks de la transferencia de grupo en la cual D, A o ambas pueden estar ausentes. Por ejemplo, reacciones de isomerización (como la interconversión de glucosa 6-fosfato y glu-

Enzimus: cinética 9 j

cosa 1 -fosfato) podrían presentarse como reacciones en las cuales tanto D como A estan ausentes:

Los complejos EnzS participan en la catálisis

Las representaciones anteriores todavia no son suficientes para enfatizar otra característica fundamental de las reacciones catalizadas por enzimas, la partici- pacibn en la reacción global de dos o más fonnas intermediarias del complejo EnzS y la participación consecuente de u11 canjunto de varias reacciones parciales secuenciales. Una representación de una reacción de transferencia de grupo que enfatiza estas carac- terísticas podria ser:

en la cual EnzG, EnzG* y EnzG* * representan sucesi- vamente los complejos EnzS formados durante la reaccion global.

Las enzirnas incrementan la proximidad del reactivo y la concentración local

Para que cualquiera de las reacciones anteriores tenga lugar, todos los reactantes deben encontrarse, uno del otro, a una distancia que posibilite la formacidn de enlaces (o su rotura). Para una solucibn quinrica ho- mogenea, en ausencia de catalizadores, la concen- ación de las mol~culas reactantes es constante en toda la solución. Estacondición yano se cumple despuks de introducir un catalizador. Los catalizadores tienen sus propios dominios de superficie para unirse a las moIdculas reactantes. Aunque este enlace es un procese reversible, la constante global de equilibrio para la unión favorece fuertemente las formas enlazadas miis que las libres de mol6culas reactantes. De manera cualitativa, esto podria representarse asl:

Reactante + catarizador complejo reactante-catalizador

Cuantitativamente, se podría expresar la fortaleza de la relación entre un reactante, R, y un catalizador, C,

en términos de la constante de disociacibn, &, para el complejo R-C o la constante de equilibrio para la reacción:

R - C R * C

Así, un valor bajo para Kd representa un complejo R - C fuerte.

Una consecuencia importante es que cuando un reactivo se une a un catalizador, éste aumenta la concentracion del reactante en un Area localizada de la solución, por arriba de su concentracion en soluci6n libre. De este modo, ya no m m o s con una soluci6n qui- mica homogbnea, sino heterogknea.

Si el catalizador para una reacción bimolecular (dos reactantes) se une a ambos, laconcentracibn local de cada uno aumenta en razún de un factor que depende de su afinidad individual (valor &) por el catalizador. Puesto que la velocidad de la reaccibn biomolecular global

es, como se ve, proporcional a la concentracibn de ambos, A y B, la fijación de los dos A y l3 por e! catalizador puede conducir a un incremento enorme (varias miles de veces) en la velocidad de la reacción global.

LA CATALISIS SE PRODUCE EN EL SITIO ACTIVO

Una propiedad esencial de las enzimas es su capacidad para fijar los reactantes la cual se acompafia de incremento en la soncenmación local de estos y, por ende, en la velocidad de la reaccihn. Las enzirnas son catalizadores extremadamente eficaces y muy selectivos. Para comprender estas propiedades distintivas de las enzimas, se ha introducido el concepto de sitio "activo" o "catalitico"*.

El gran tamafío de las proteínas en relación con los sustratos condujo al concepto de que una region restringida de la enzima, el "sitio activo", se ocupaba de la catálisis. Inicialmente, era extremadamente enig-

* Aunque en muchos textos se establece una equivalencia entre los sitios activos y los catalíticos de las enzimas, hay sobre éstas, otros sitios "activos" que se relacionan con la regulación de la actividad enzimática m& que con la enzimologIa intermediaria del proceso cataIítico.

matico para los bioquimicos el porqug las enzimas cran tan grandes ciiando s6Io una porción de su estmctura parecía requerirse para unirse con el sustrato y para la catAlisis. Hoy en día, se reconoce que una porcion mucho mayor de la proteina actua reciprocamente con el sustrato que la que se suponia antes. Cuando aparece también la necesidad de sitios alostdricos de igual ramaiio ya no debe sorprender e! tamafio de las enzimas.

El modelo de un sitio catalitico rígido explica muchas de las propiedades de las enzirnas

El modelo de un sitio catalitico, propuesto por Emil Fischer, represenro la accion reciproca del sustrato y la enzima en tkrminos de la analogia de una "cerradura y Ilave". Este modelo dc cerradura y Ilave o modelo de plantilla rigida (figura 9-2), todavía es útil para entender ciertas propiedades de las enzimas, por ejemplo, la unión ordenada de dos o más sustratos (figura 9-3) o la cin6tica dc una curva de saturación del sustraio simple.

Los sustratos inducen un cambio de conformación en la enzima

1Jn a caractcristica desafortunada del modelo de Ficher es que implica rigidez del sitio catalitico. Un modelo mis geneml es el del "ajiiste inducido" de Koshland, el cual ha recibido un considerable apoyo experimental. En elmodelo de Fischer se presume que el sitio catalitico esta prefigurado para adaptarse al sustrato. En el modelo de ajuste inducido, el sustrato induce un cambio en la conformación de la enzima. Esto aIlnea los residuos de aminoácidos y otros grupos de la enzima en ia orientación espacial correcta para la combi- nacion del sustrato, la cathlisis o ambas.

En el ejemplo (figura 9 4 ) , los grupos hidrófobos [porción rayada) y los grupos cargados (área pun- teada) se encuentran implicados en la combinacibn del sustrato. Una fosfoserina (-P) y el -SH de un residuo de cisteina intervienen en la catálisis. Otros residuos, no implicados en proceso alguno, están representados

Figura 9-2. Reprecentacidn de la fomacibn de un complejo EnzS de acuerdo con la hipdtesis de la plantilla de Fischer

Figura 9-3. Representacibn de la absorcibn sucesiva de una uienzima (CoE) y de dos sustratos ($1 y $2) sobre una en- cima en término de la hipbtesis de la plantilla. Se supone que la coenzima porta un grupo esencial que se une al primer sustrato [Si), el cual a su vez es necesarbo para unir a S2

por los de lisina y metionina. En ausencia de sustrato. el grupo catalitlcci y el fijador de sustrato estíh separados por varios enlaces. Ida aproximación del sustrato induce un cambio en la conformacibn dc la proteína enzimatica, alineando los grupos correctamesite par.1 combinarse con el sustrato y para la catálisis. A1 mismo tiempo, las orientaciones espaciales de otras regiones tambikn están alteradas -la lisina y la metionina están ahora más juntas (tigura 9 4 ) .

Los anhlogos del sustrato pueden causar algunos, pero no todos, los cambios en la confomacibn correctos (figura 9-5). Al adherirse el verdadero sustrato (A), todos los grupos (representados como circulos negros en todas las ilustraciones) son alineados correctamente. La adherencia de un análogo del sustrato que es demasiado "voluminoso'' (figura 9-5 B) o demasiado "delgadc" (figura 9-5C) induce una alineación inco- rrecta. Una caracteristica final es el sitio mostrado como una pequefia muesca a 12 derecha de la enzima. Tal vez se pueda imaginar una molécula reguladora uniéndose en este punto y "bajando" uno de los braz.0~ polipeptídicos que portan un grupo catat itico. Enton- ces puede producirse la uni6n del sustrato, pero no la catalisis. Como se puede observar en el modelo de ajuste inducido, los residuos qtie comprenden el sitio catalitico, pueder! estar niuy distantes entre si en la estructura primaria, pero especialmente cercanos cuando se considera la estructura tridimensional (terciaria).

Figura 9 4 . Representacibn bidimensional de un ajuste inducido por un cambio de conformación en la estructura de la proteina Obsérvenselas pastciones relativas de los residuos clave antes y despues de la unibn del custrato

Enz + S EnzS A B C

Figura 9 4 . Representación de cambios de c~nformacibn~en la protelna enrimatica cuando ocurre la unión can el sustrato (A) a análogos inactivos del sustrato (B) y (C). (Según Koshland.)

Muchos residuos arninoacilo participan en el sitio activo

¿Qué partes de una enzima conforman y participan eii su sitio activo? EI sentido de esta pregunta se entiende mejor mediante el examen de las estructuras tridimen- sionales de un complejo terciario (tres componentes) formado por unaenzima y dos sustratos. Sin embargo, incluso en el estado de cristales, si estan presentes todos los siistratos se producira la catAlisis, lo cual complica Ia interpretacihn de los datos. Por tamo, se ha dei.,ostrado que es iitil el examen de la estructura de los denoiniiiados complqjoc terciarios abortivos compuestos de un sustrato y uti producto, o de complejos enzima-sustrato anhlogos al inhibidor. Estos complejos, que no pueden pasarse por alto, proper- cionan una estrecha aproximacibn al sitio activo durante el paso inicial de erilace con el sustrato en la ca tá l~s is . Estos estudios muestran que muchos residuos aminoacilo esthn en contacto con sustratos o coenzimas unidos y, por tanto, constituyen parte del sitio activo.

El tamaiio amplio y 61 carhcter tridimensional de los sitios activos determinan su visualizacibn 6ptima en las pantallas de computadoras mediante programas que permiten girar la estructura en todas las direcciones, verlas en tres dimensiones y acercar las partes que interesan. Las limitaciones de la hoja impresa tan solo permiten una representacibn iinperfecta de los sitios activos. Sin embargo, se pueden establecer algunas generalizaciones.

Los sitios activos a menudo se localizan en hendiduras

Para las enzimas que consisten en una subunidad cnica, el sitio activo amenudo radica en una hendidura de la enzima. Un ejemplo es la lisozima, enzima presente en las lágrimas y en el moco nasal, la cual lisa las paredes celulares de muchas bacterias grarnpositivas trasmitidas por el aire. Está constituida por una soIa

cadena polipéptida de 129 residuos y tiene una profunda hendidura central que alberga un sitio catalitico con seis subsitios (figura 9 4 ) los cuares enla;ían varios susrratos. Los residuos que originan la rotura del enlace se encuentran entre los sitios D y E, cerca de los grupos carhoxiIo de Asp 52 y Glu 35. Al parecer, este último cede prolones al enIace acethlico de1 sris- @ato, en tanto que Asp 52 Con carga negativa estabiliza el ion ca rb~n desde el lado posterior.

El sitio catalItico de la ribonucleasa también radica dentro de una hendidura semejante a la anterior, a través de la cual se encuenmn His 12 e FIis 1 19, residuos que, segiin la evidencia química, soii el sitio catalitico.

Los sitios activos de enzimas multiméricas pueden encontrarse en subunidades de interface

Para ciertas enzimas que contienen multiples polipkp- tidos o subunidades, el sitio activo se encuentra en la interfase entre estas. Los residuos aminoacilo de ambos sustratos contribuycn al sitio activo, al servir para enlazar sustratos o para funcionar en la cathlisis. Uno de estos ejemplos es la enzima HMG-COA reductasa, que es la enziina limitante de la velocidad de colesterologenesis (figura 9-7).

Los residuos cataliticoc se conservan mucho

Ciertos arninoacidos, cn particular la cisteína y otros aminolicidos hidroxllicos, Cicídos o bhsicos tienen funciones claves en la catllisis. Estos residuos sirven como nucle6fi los, como catalimdores generales bhicos

Tri 63 '

Asn 46

Ser 36

F, Arg114 h Figura 9-6. Representacibn 'bidimencional del sitio catalitico en la regibn hendida de la Ircozima De la A a la F representan las fracciones glucosilo de un hexasadrido Algunos residuos en la región hendida se muestran junto con sus números en las secuencias en la Iisorima (Adaptado de Koshland )

98 Bioauim ica de Hurper ~Cu~íieclo 9)

Figura 9-7. Estructura de una subunidad rjnica de HMG-COA reductasa de la bacteria Pseudomonasmevalonii La subunidad consta de dos dominios, el mAs pequeíio de los cuales (abajo izquierda) contiene un enlace nuclebtido doblado compuesto de hola beta y h6licec alfa Los residuos aminoacilo esun numerados para facilitar el trazo del polipéptido desde su terminal amino (N) hasta su teminal carboxilo (C). Observese que el polipéptido inicia en el dominio grande, entra al dominio pequeno y al final termina en el dominio grande (Rediseriada con autorizaubn de Lawrence CM, Rodwell VW, Stauffacher CV. Crystal structure of Pseudo- monas mevalon~i HMG-COA reductase at 3 O angstrom resolution Science 1995:268 1758 )

o acicidos o como aceptores de un grupo que esth experi- mentando transferencia. Es probable que, para todas las formas de una enzima que cataliza una reacción o una ciase de reaccibn dadas, el mecanismo de reaccidn sea idéntico sin importar el tejido o forma de vida original. En consecuencia, los aminoácidos que tienen funciones altamente especificas en la cathlisis y, hasta cierto grado, Ios aminoácidos adyacentes, tienden a mostrar una conservación elevada, inclusive entre

tzi m a

generos. El cuadro 9-1 muestra esta conservacibn de la estructura primaria en los sitios cataliticos de en7i- mas hidroliticas relacionadas, pero diferentes. Por su parte, el cuadro 9-2 aclara la conservaci0n de "tipos" estructurales primarios a través de los gkneros para la enzima biosintética HMGXoA reductasa. No obstante, dado que un "tipo" estructural terciario puede construirse a partir de varias estructuras primarias diferentes, la estructura primariaglobal de las enzimas esta mucho menos conservada que la terciaria.

MULTIPLES FACTORES INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

Temperatura

Aunque la elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccihn cata1 izada por enzimas, esto es verdad s610 dentro de limites estrictos de tempem- tura (figura 9-81. Al principio, la velocidad de la reacci6n aumenta cuando latemperatura se eleva, debido al incremento en la energía cinktica de las moléculas reactantes. Sin embargo, al final, la energía cinetica de Ia enzima excede a la barrera energética para romper los enlaces dkbiles de hidr6geno e hidrdfobos que conservan su estructura secundaria-terciaria, A esta temperatura, predomina la desnaturalización con pérdida precipitada de la actividad cataiitica. Por tanto, las enzimas muestran una temperatura optima. No obstante, kste no es un parhmetro fundamental, ya que la temperatura óptima depende de la duración del analisis usado para determinarla, es decir, mientras mhs tiempo se conserve una enzima a una temperatura a la cual su estructura es apenas estable, mayor probabilidad tiene de experimentar desnaturalizacibn.

Cuadro 9-1. Swuenrrlaa de los aminohcidos en la vecindad de los sitios catalíticos de varias proteasas bovinas. Las regiones que se muestran son las situadas a cada lada de los residuos serilo S e histidilo

' 7 J1l Sitio Ir'! -- ' -

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Quimotripsina A

lo mn autor 1, 1972.

Secuenci

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-2. La es e un sitio os generr --.S--

Cuadre 9- tructura primaria de algunas regiones d, catalttico puede conservarse a través de 1 is. Se piensa que los aminoki- dos, mostiar~ua aurit rodeando al residuo eluta- n n la catá - la e A reduc 10s

subrayados se desvian de Ea secuencia consensual :ima de marniferos

- . - - - - - -. . - -.

- Aminohcidc

L

Ser humano Y C F

Levadura" m - - --

tisis reali ,tasa. L(

n

izada por i s residi

El factor por el cual la velocidad de un proceso biológico aumentacon un incremento de temperatura de 10 O C es el coeficiente de temperatura o Qio. La velocidad de numerosos procesos biolbgicos, como la contracci6n de un cosaz6n fuera de la cavidad toiricica, casi se duplica con una elevacibn de 10 "C en Ia temperatura (Qio = 2). La alteracidn en las velocidades de numerosas reacciones catalizadas por enzimas que acompaña a una elevacibn o caida de la temperatura corporal, constituye una caracteristica de supervivencia esencial para formas de vida como las lagartijas que no conservan constante su temperatura corporal. Por el contrario, organismos homottmicos como el ser humano toleran sblo alteraciones estrictamente limi- tadas en su temperatura. Por tanto, los cambios en la velocidad de reacción en el ser humano, debidos a

alteraciones en la temperatura tienen escaso significado fisiológico, excepto cuando hay fiebre o hipotermia.

Dado que el aumento en el nhrnero de moléculas con energia cinética suficiente para superar la barrera energktica, ofkce escasas opciones para los organismos homotkrmicos, entonces, ¿cómo incrementan sus velocidades de reaccibn? La respuesta se apoya en la propiedad de las enzimas de abatir las barreras ener- géticas para las reacciones y elevar las concentraciones locales de reactantes.

Para casi todas las enzimas, las temperaturas 6p- timas son iguales o mayores a las de las células en las que se encuentran. Las de los microorganismos adap- tados para crecer en aguas termales o en áreas oceáni- cas termales profundas muestran temperaturas bptimas prbxirnas al punto de ebullición del agua.

Cuando se mide la actividad enzimAtica a diversos pH, la hptima generalmente se observa entre los valores de 5.0 y 9.0. Sin embargo, unas cuantas enzimas, como la pepsina, son activadas a valores de pH muy alejados de estos límites.

La fomia de las curvas de pT-1 bptimo estii determinada por:

1) Desnaturalizaci6n de la enzima a valores de pH altos o bajos.

2) Alteraciones en el estado de carga de la enzima del sustrato o de ambos. Para la enzima, los cambios de carga pueden afectar la actividad, ya sea cambiando la estructura o la carga en un residuo que funciona para ligar el sustrato o en la catálisis. Para aclarar esto, considérese una enzima con carga negativa (Enz-) que reacciona con un sustrato cuya carga es positiva (SH*):

Temperatura dptime I

A pH bajo, la Enz-adquiere protones y pierde su carga negativa:

A valores de pH altos, SH' se ioniza y pierde su carga positiva:

Figura 9-8. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reaocibn hipotetia catalizada por enzimas.

Puesto que, por definicibn para este ejemplo, las uni- cas formas que interaccionan son SH' y Enz-, los valores extremos de pH disminuirán las concentraciones efectivas de Enz- y SH', con lo cual se reduce la

100 Rioquímica de Harper (Capítulo 99)

m SH* X m Enz

Figura 9-9. Efectos del pH cobre la actividad enzimhtica.

velocidad de reacción (figura 9-9). Solamente en el área som breada con rayas cruzadas, se encuentran Enz y S en el estado ibnico apropiado y sus concentraciones rnliximas están correctamente cargadas a pH X.

Ademh, las enzimaspueden experimentar cambios de conformación con las variaciones del pH. Podría ser necesario un grupo cargado dista1 a la región donde el sustrato se ha fijado, para conservar una estructura activa terciaria o cuaternaria. Conforme cambia la carga en este grupo, la proteína puede desenrollarse, volverse más compacta o disociarse en protiimeros, todo lo cual conduce a la pérdida de la actividad. Dependiendo de la gravedad de estos cambios, la actividad puede ser restablecida o no cuando la enzima regresa a su pH bptimo.

Las enzimas no afectan las constantes de equilibrio

La enzima es un reactivo que se combina con el sustrato formando un complejo enzirna-sustrato, EnzS, que se descompone para formar un producto, P, y la enzima libre. En su f m a miis simple, esto puede representarse como:

Aunque las expresiones de la velocidad para las reacciones hacia la derecha e izquierda y global incluyen el tCrmino [Enz],

velocidad^ = kl [Enz] [S]

Veloeidad.i = kl [Enz] [P]

en la expresihn de la constan.te de equilibrio glohaI la [Enz] se cancela.

Así, la concentración de la enzima no tiene efectas sobre la constante de equilibrio. Dicho de otra manera, puesto que las enzimas afectan a las velocidades y no a las constantes de velocidad, no pueden modificar a K,, que es una relacion de constantes de velocidad. Entonces, la K,, de una reaccibn es la misma sin importar que se alcance el equilibrio con catálisis enzirnhtica o sin ella (recordar A G ~ . Las enzirnas cambian la via de la reacci6n, pero no afectan las concentraciones de equilibrio inicial y final de los reactantes y productos, los cuales son los factores que determinan a K,, y AGO.

LA VELOCIDAD INICIAL ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

La velocidad inicial de una reacción es la velocidad medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción inversa ocurra. Además, la velocidad inicial de una reacción enzirnática es siempre proporcional a la concentracibn de la enzima. No obstante, obsdrvese que este enunciado se sostiene sole para velocidades in t iales.

LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATOAFECTALA VElOClDAD DE LAS REACCIONES

En la explicación siguiente, las reacciones enzimáti- cas son tratadas como si tuvieran un solo sustrato y un producto unico. Aunque Cste es el caso de algunas reacciones catalizadas por enzirnas, la mayorla de ellas tienen dos o mas sustratos y productos. No obstante, esta consideración no invalida lo siguiente.

Si se aumenta la concentracion del sustrato [S1 mientras que todas las demás condiciones se conservan constantes, la velocidad inicial medida, v, (la velocidad medida cuando m u y poco sustrato ha reac- cionado), crece hasta un valor mfiximo, V,,,, y no mas (figura 9-1 0) .

La velocidad se incrementa al aumentar la concentracibn del sustrato hasta el punto donde se dice que la enzima estli "saturada" con el mismo. La velocidad inicial medida alcan7a un valor máximo y no es afectada por el incremento ulterior en la concen- traci6n del sustrato, debido a que este está presente en

Figura 9-10. Efecto de la ooncentracibn del suctrato sobre la velocidad de una reaacibn catalizada por enzimas.

un gran exceso molar con relación a la enzima. Por ejemplo, si una enzima de peso molecular de 100 000 actúa sobre un sustrato de peso molecular de 100 y ambos se encuentran a la concentración de 1 mg/mL; existen 1 O00 moles de sustrato por cada mol de enzima. Cifras mhs realistas serian:

[Enz] = 0.1 pglmL = 7 0 ~ molar [S] = 0.1 mglm L = 1 o4 molar

dando un exceso molar de lo6 de sustrato sobre la enzima. Incluso si [S] decreciera 100 veces, el sustrato todavia estaria presente en un exceso molar de 10 000 veces sobre la enzima.

La situación en los puntos A, B y C de la figura 9-1 0 se aclara en la figura 9-1 1. En los puntos A y B solamente una porcihn de la enzima presente estl combinada con el sustrato, aun cuando haya muchas mhs molkculas de sustrato que de enzima. Esto se debe a que la constante de equilibrio para la reaccihn

Enz + S & EnzS (formación del complejo EnzS) no es infinitamente grande. En los puntos A o B al aumentar o disminuir [S], aumenta o disminuye la cantidad de Enz ligada con S como EnzS: de aquí que VI dependa de [S].

En C, esencialmente toda la enzima se encuentra combinada con el sustrato, de manera que un incremento ulterior en [S], aunque praduce un aumento en la frecuencia de las colisiones entre Enz y S, no puede causar incrementos en la velocidad de reacción, puesto que no existe enzima libre disponible para reaccionar.

El caso B presenta una situacibn de mayor interés tebrico donde exactamente la mitad de las rnol&culas de enzima esthn "saturadas con" sustrato. De acuerdo con esto, la velocidad es la mitad dc la vclocidad rnbxima alcanzable {V,,/2) a esa concentración particular de la enzima.

LAS ECUACIONES DE MICHAELIS-MENTEN DE HlLL REPRESENTAN LOS EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO

La ecuación de Michaelis-Menten

La concentraci6n del sustrato que produce la mitad de la velocidad mhxima, llamada valor K, o constante de Michaelis, se puede determinar experimentalmente graficando v, como funcibn de [S] (figura 9-10). La Km tiene las dimensiones de la concentracidn molar.

Cuando [S] es aproximadamente igual a K,,, v, es muy sensible a los cambios en [S] y la enzima esta trabajando precisamente a la mitad de su vclocidad máxima. De hecho, muchas de las enzimas poseen

Figura 4-11. Representacibn de una enzima a concentraciones bajas (A), altas (C) y a la wncentracibn Km del sustrato (6) Los puntos A, B y C corresponden a los de la figura 9-1 0

valores de Km que se aproximan a la concentraci6n fisioliigica de sus sustratos.

La expresión de Michaelis-Menten

describe el comportamiento de muchas enzimas de acuerdo a las variaciones de la concentracibn de sustrato. Ln dependencia de la velocidad inicial de una reacción catali7ada por enzirnas en [S] y en Km puede aclararse valorando la ecuaci6n Michaelis-Menten como sigue:

1 ) Cuando ISI es mucho menor que Km (punto A en las figuras 9-1 O y 9-1 1). Aííadiendo ahora [S] a Km en el denominador, cambia muy poco su valor, de modo que el término [S] puede ser eliminado dcI denominador. Dado que tanto Vmav como Km son constantes, se puede reemplazar su relación por una nueva constante, K:

v,, Fl - vi = !!!?%N = be [S] K [S] yi " K m + [SI ' K m Km

[a significa "aproximadamente igual a"]. En otras palabras, esto significa que cuando la concenlracihn del sustrato es considerable- mente inferior a la requerida para producir la miiad de la velocidad miixirna (el valor U,), la velocidad inicial v,, depende de la concen- traci6n del sustrato [S].

2) Cuando [S] es mucho mayor que Km (punto C, figuras 9-10 y 9-1 1). Agregando ahora Km a [S] en el denominador, el valor de [S] cambia muy poco, por lo tanto el tCrmino Km se elimina del denominador.

Esto establece que cuando la concentración del sustrato [S] excede con mucho el valor de Km, la velocidad inicial v,, es mhxima, Y,,.

3) Cuando [Si = Km (punto B, figuras 9-10 y 9-1 1).

V d x [SI - V m h [SI Vrns! V d x [SI = - - - VI = ' Km + [C] ' p] SI+ [S] 2 [SI - 2

Esto expresa que cuando la concentracion del sustrato es igual al valor de Km, la velocidad inicial vi es semimáxima. Tambikn indica la forma de evaluar a Km, esto es, de determinar de manera experimental la concentracion del sustrato donde la velocidad inicial es la mitad de la rnhxirna.

Para determinar Km y V,A, se usa una forma lineal de La ecuación de Michaelis-Menten

Puesto que numerosas enzimas dan curvas de saturación que no permiten fácilmente la valoración de Vmex (y por tanto de Km), cuando la v, es graficada contra [S], es conveniente reordenar la expresión de Michaelis-Menten para simplificar la valoracihn de Km y V,,,. La ecuacihn de Michaelis-Menten puede ser invertida y factorizada como sigue:

Invirtiendo:

Simplificando:

~ s t a es la ecuación de una linea recta:

donde:

Si y, o 1/v, se grafican en función de x, o de l/[S], la interseccion en y, b, es IIV,,, y la pendiente, a, es K,/V,h. La interseccibn negativa en x puede ser valorada haciendo y = O. Entonces

Esta gráfica es llamada gráfica del doble reciproco, por ejemplo, el reclproco de v,(l lv,) se grhfica contra el reciproco de [S] (l/[S]).

El valor dc K,, puede: ser calculado a partir de la grhfica de Lineweawer-Burk o del doble reciproco (figura 9-1 2) usando la pendiente y la intersección en y o la interseccibn negativa en x. Puesto que el [S] está expresado en rnolaridad, las dimensiones de Km esthn en molaridad o moles por litro. La velocidad, v,, se puede expresar en cualquier tipo de unidad, puesto que Km es independiente de [Enzl. El

Figura 9-12. Gráfica de Lineweaver-Burk o de/ doble reciproco, l lv , contra [S] usado para valorar Km y Vmh

tratamienta por el doble recíproco requiere relativamente pocos puntos para definir Km y es el método más utilizado para determinarla.

De manera experimental, el uso de la grhfica de Lineweaver-Burk para valorar Km puede dar origen a una importancia no justificada de los datos reunidos a concentraciones bajas del sustrata. Éste cs el caso cuando las concentraciones del sustrato, seleccionadas para el estiidfo, difieren por un incremento constante. Este inconveniente puede superarse seleccionando las concentracioncs de sustratos, cuyos reciprocos difieren por incrementos constantes.

Un enfoque alternativo a la evaluaci6n experimental de Km y V,,, es el de Eddie y Hofstee. La ecuación de Michaelis-Menten puede reordenarse a

Para evaluar Km y V,,,, se grafica v,l[S] (eje y) contra v, (eje x} . Entonces la interstccidn en y es V,,,/K, y la intersección en x es Vmk. La pendiente es -1 /Km.

Aunque la gráfica de Lineweaver-Rruk y el enfoque de Eadie-Hofstee son útiles en los ejemplos escogidos, la determinación rigurosa de Km y V,, rcquiere de tratamiento estadistico.

Los valores de K,, son de importancia prActica considerable. A una concentracion de sustrato de 100 veces K,,, la enzima actuará esencialmente a velocidad mhxima y por tanto la velocidad mhxima (V,,,) reflejara la cantidad de enzima activa presente. Por lo general, en el análisis de enzimas esta situación es deseable. El valor de Km indica la cantidad de sustrato que debe usarse para medir V,,,,. Los tratamientos con el doble reciproca también tienen aplicacihn extensa en la cvaluacion de los inhibidorcs dc enzimas.

Km puede aproximarse a una constante de fijación

La afinidad de una enzima por su sustrato es igual al inverso de la constante de disociación, Kd, para el comple.jo enzima-sustrato, EnzS.

Esto es, mientras menor sea la tendencia del sustrato y de la enzima para disociarse, mayor será la afinidad de la enzima por el sustrato.

El valor Km de una enzima para su sustrato puede servir también corno una medida de su Kd. Sin embargo, para que esto sea verdadero, debe ser válida una hipótesis incluida en la derivacidn de la expresión de Mfchaelis-Menten. La derivación supone que el primer paso de Izt reacción catalizada enzimáti- camente

es rapido y siempre esta en equilibrio. En otras palabras. la velocidad de dicaciacion de EnzS a Enz + S debe ser mucho mhs rápida que su disociación a enzima + producto.

En la expresion de Michaelis-Menten, 13 [S] que da v,= V,8,/2 es:

kr + k-1 [S] = - kl - - Km

pero cuando k-, >> k2

entonces kz + k-.r k-I

En estas condiciones, 1/K, = Kd = afinidad. Si kz es no a proximadamente igual a km,, entonces liK, subestima la afinidad, 1 /Kd.

104 Bioquímica de Harper

La ecuación de Hill

Ciertas enzimas y otras proteinas que -jan ligandos, como la hemoglobina, no muestran la cinética clásica de saturación de Michaelis-Menten. Cuando [S] ce grafica contra v,, la curva de saturacibn es sigmoide (figura 9-13). Esto indica, por lo general, el enlace cooperativo del sustrato a sitios múltiples. El enlace en un sitio afecta el enlace en otros como se describió en el capitulo 7 para la hemoglobina.

Para la cinktica de saturacibn del sustrato sigmoide no son válidos los métodos dc evaluacibn gráfi- cas de la concentración del sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, como se describib (no se producen rectas). Para valorar la sigmoide de Ta cinttica de saturacibn se utiliza una representacidn gráfica de la ecuación de Hill, que originalmente se derivó para describir el enlace cooperativo de moléculas de oxígeno a la hemoglobina. Escrita de manera lineal, la ecuacihn

- de Hitl es

log k'

donde k' es una constante compleja. La ecuación afirma que cuando [S] es baja comparada con k', la velocidad de reacción aumenta a la enésima potencia de [S]. La figura 9-1 4 presenta una gráfica de Hill de datos cinéticos para una enzima con cinbtica de enlace cooperativo. Una grAfica de v,/V,,, -vi) contra log [S] proporciona una recta con pendiente = n, donde n es un pariirnetro empírico cuyo valor depende del número de sitios de enlace del sustrato y del numero y tipo de interacciones entre los sitios de enlace. Cuando n = 1, los sitios de union achian de modo independiente uno del otro. Si pl 1 1, los sitios son cooperativos; y cuanto mayor sea el valor de n, tanto

mejor será el cooperativismo y, de este modo, será m& "sigmoide" la cinética de saturación. Si rr < 1, se dice que los sitios exhiben una cooperativismo negativo.

A la mitad de la velocidad máxima (v, = V,,/2), v,J(Y,,, - v,)= 1, y por tanto, log v,/(V,, - v,) = O. De este modo, para determinar S r o (concenlracibn del sustrato que produce la mitad de la velocidad maxima), se traza una Ilnea perpendicular al eje de las x desde el punto donde log v,J(V,a, - v,) = 0.

EL ANALISIS CINETICO DISTINGUE ENTRE INHIBICIÓN COMPETlTlVA Y NO COMPETITIVA

Aunque de manera tebtica se distinguen los inhibidores de la actividad enzimática con base en si la inhibici~n se anula o no por el incremento de la concentraci6n del sustrato, numerosos inhibidores no muestran las propiedades ideales de inhibicibn competitiva o no competitiva puras que se describen despubs. Un crite- rio alternativo para la clasificación de inhibidores es su sitio de acción. Algunos se unen a la enzima en el mismo sitio que el sustrato (el sitio catalitico); otros lo hacen en alguna región alejada de &te (un sitio alostérico).

Los inhibidores competitivos típicos se asemejan al sustrato

La inhibicibn competitiva clásica tiene lugar en el sitio de unión del sustrato (catalitico). La estructura qulmica de un inhibidor (1) analogo del sustrato (S)

Figura 9-1 3. Sigrnoide de la cinética de saturacibn.

Figura 3-14. Evaluación grafica de la ecuacibn de Hill para determinar la concentracibn de sustratos que produce la mitad de velocidad mhxima. Este método se emplea cuando la curva de la cinbtica de saturacibn del sustrato es un sigmoide

por lo general es similar a la de este. Puede, por tanto, combinarse de manera reversible con la enzima, formando un complejo enzima-inhibidor (EnzI) en lugar de un complejo EnzS. Cuando tanto el sustrato como este tipo de inhibidor están presentes, compiten por los mismos sitios de unión sobre la superficie de la enzima. Un caso muy estudiado de inhibición competitiva es el del malonato ( 1 ) con el succinato (S) por la succinato deshidrogenasa.

La succinato deshidrogenasa cataliza la forma- ci6n de fumarato mediante la remacibn de un htomo de hidrbgeno de cada htomo de carbono alfa del succinato (figura 9-1 5).

El malonato (DOC-CT-iz-C003 puede combinarse con la deshidrogenasa formando un complejo EnzI. Este no puede ser deshidrogenado, puesta que no hay manera de quitar ni siquiera un atomo de hidrógeno del único atomo de carbono alfa del malonato sin formar un átomo de carbono pentava- lente. La única reaccion que puede experimentar el complejo EnzI es la descomposicibn regresiva en enzima más inhibidor.

Para la reaccibn reversible,

ki ERA+ S $ Enz + I

k-i

la constante de equilibrio Ki es:

La accibn de los inhibidores competitivos se puede entender en tkrminos de las siguientes reacciones:

Enzl (inactivo)+ Enz + P

Enz

EnzS (activa) -+ Enz + P

La velocidad de formacibn del producto depende sOIo de la concentracibn de EnzS. Sup6ngase que el inhibidor

H I

H -C -COO - H- C-COO- 1 - 2H II

-0012- C-H - -OOC-C-H

Succinato Fumarato

Figura 9-1 5. Reaeeibn del suminato deshidrogenasa.

se fija firmemente a la enzima (K, = una cifra pequefla). Ahora hay una cantidad escasa de enzima libre (Enz) disponible para combinarse con S para formar EnzS y finalmente Enz + P. Así, la velocidad de reaccibn (formación de P) sera lenta. Por razones anhlogas, una concentración igual de un inhibidor unido con menor fuerza (K, = un numero mayor) no hará disminuir la velocidad de la reaccibn de manera tan marcada.

Supbngase que a una concentración fija de 1 se agrega más S. Esto aumenta la probabilidad de que Enz se combine con S, en lugar de hacerlo con 1. La proporcion de EnzS a EnzI y la velocidad de reacción se incrementan. A una concentracibn suficientemente elevada de S, la concentración relativa de EnzI desa- parecerá. Si esto es asi, la velocidad de la reacción catalizada sera la misma que en ausencia del inhibidor (figura 9-1 6).

La gráfica del doble recíproco facilita la evaluación de los inhi bidores

La figura 9-1 6 representa un caso tipico de inhibición competitivamostrada gráficamente en la forma de una línea de Lineweaver-Burk. La velocidad de reacción (v,) a una concentración fija del inhibidor fue medida a diversas concentraciones de S. Las líneas trazadas a travds de los puntos experimentales coinciden en el eje de las y. Puesto que la jnterseccibn en y es lIV,,, esto dice que a una concentración infinitamente grande de S ( l /S = O ) , v, es la misma que en ausencia del inhibidor. Sin embargo, la interseccibn sobre el eje de las x (que está relacionado a Km) varia con la concentración del inhibidor y se convierte en un número mayor (-1 K', es mayor que -1/K,) en presencia del inhibidor. Así, un inhibidor competitivo eleva la Km aparente (K',) para el sustrato; puesto

Figura 9-16. GrAfica de Lineweaver-Burk de la inhibicidn cornpetiwa c l h s k . O b s é ~ e s e la liberacibn de la inhibición a concentración alta [S] (1I[S] baja).

106 nioquim ica de Har-p~r

que Km es la concentración del sustraío a la cual la concentraci6n de enzima libre es igual a la concen- tración de enzima como EnzS, una cantidad sustancial de enzima libre estd disponible para combinarse con el inhibidor. Para la inhibicion competitiva simple, la intersección sobre el eje de las x es:

El valor de Km puede ser evaluado en ausencia de 1, y K, también puede serlo usando Ia ecuación anterior. Si el nbmero de moles de 1 agregado es mucho mayor que el numero de moles de enzima presente [1] puede ser generalmente tomado como la concentracián agre- gada (conocida) der in hi bidor.

Los valores de K,, para una serie de inhibidores análogos al susirato (competitivos), indican cuales son los mas eficaces. A una concentración baja, con los valores más bajos dc K, produciran el mayor grado de inhibición. Muchos medicamentos eficaces en clíiiica actúan corno inhibidores competitivos de actividades enzimkticas importantes en las células mi- crobianas y animales,

Los inhibidores no competitivos reversibles reducen Vmax pero no afectan a K m

En la inhibicibn no competitiva no hay competencia entre S e 1. Usualmente el inhibidor no muestra analogía estructural con S o esta es muy escasa y puede asu- mirse que se une a un espacio diferente en la enzima. Los inhibidores reversibles no competitivos disminuyen la velocidad rnfixima alcanzable con una cantidad dada de enzima (reducen V,,) pero por lo general no afectan a K,,. Puesto que S e I se pueden combinar en diferentes sitios es posibje la formacibn de complejos En21 y EnzIS. Ya que EnzlS puede descompanerse para formar el producto a una velocidad menor que la de EnzS, la reaccihn puede retrasarse pero no im- pedirse Es posible que se presenten las siguientes reacciones de competencia:

Si S tiene igual afinidad par Enz y por En21 (1 no afecta la afinidad de Enz por S), los resultados que se mues-

tran en la figura 9-1 7 son los que se obtienen cuando l l v , es graficado contra 1 /[S], en presencia y en ausencia de inhibidor. Se supone que no ha habido ninguna alteracion importante en la conformacibn del sitio activo cuando está unido 1.

In hibidores irreversibles "envenenan" a las enzimas

Unagran variedad de "venenos'knzimáticos tales como la yodoacetarnida, los iones de metales pesados (Ag', 1-Ig2'), agentes oxidantes, etcétera, reducen la actividad enzimhtica. Puesto que estos inhibidores no tienen semejanza estructural con el sustrato, un incremento en la concentración de éste, en general, es ineficaz para suprimir esta inhibicr~n. Sin embargo, la presencia de uno o más sustratos o productos pueden proteger a la enzima contra la inactivacion. Un análisis cinetico del tipo anteriormente tratado puede no distinguir entre venenos enzirnáticos e inhibidores no competitivos reversibles verdaderos. La inhibicidn reversible no competitiva cs, en todo caso, rara. Por desgracia, esto no se aprecia siempre, ya que tanto la inhibicihn no competitiva reversible, como la irreversible, muestran cinética serne.jantc.

La mayoría de las reacciones implica a dos o mas sustratos

Ida exposición anterior de las reacciones enzimhlicas catalizadas considera 3610 las reacciones que involucran sustratos y productos únicos. Sin embargo, la mayoria de las reacciones bioquímicas implican dos o más sustratos y productos. Aunque el análisis deta- llado de la cinCtíca de los mecanismos de las reacciones de rnultisustrato esta m& allá dcl asunto de este capítulo, a continuación se comentan las reacciones de dos sustratos y de dos productos, denominadas "Bi Bi".

Figura 9-17. Gráfica de Lineweaver-Burk para inhibición reversible no competitiva.

Términos especiales describen las reacciones enzimáticas complejas

Los siguientes términos convencionalec se emplean pasa caracterizar reacciones compIe,jas catalizadas por enzirnas. Idos sustratos se denominan A. B, C y D de acuerdo al orden en que se agregan a la enzima. Dc igual manera. los productos se designan P, Q, R y S de acuerdo al o r d ~ n en que se separan de la enzima. Los diferentes tipos de la enzima se denominan E, F y G, en las cuales la E corresponde a la enzima libre.

Los términos Uni ( 1 ), Bi ( 2 ) , Ter (3, y Cuater (4) denotan el número de reactantes y productos. Aun cuando muchas reacciones catalizadas por enzimas involucran mis reactantes y productos (por e.jernplo, reacciones Bi Ter), aquí sblo se consideran las reacciones Bi Bi, es decir, aquellas que tienen dos sustraios y dos productos.

Reacciones en secuencia o de desplazamiento unico

En las reaccioncs en secuencia todos los sustratos deben combinarse con la enzima antes de liberar cualquier producto. Estas tambikn se denominan reacciones de desplazamiento unico porque el grupo sujeto a transferencia (G) se pasa directamente desde el sustrato donador A-G al sustrato aceptor B.

Dependiendo del modo en el cual los sustratos se agregan a la enzima, se distingue entre reacciones en orden aleatorio y reacciones en orden compulsorio. En las primeras, cualquier sustrato puede agregarse primero para formar ya sea E-A o E-8, mientras que en las segundas solo A puede reaccionar con E, en tanto que B reacciona c61o con el complejo E-A (figura 9-1 8). Una explicación para un orden compulsorio en la adicibn de sustratos es que agregar A induce un cambio en la conformación que alinea residuos escnciales para el enlace de B.

Reacciones en ping pong

El tkrmino ping pong se aplica a mecanismos en los cuales uno o más productos se desprenden de la enzima antes de la adicibn de todos los sustratos. Las reacciones Bi Ri ping-pong son reacciones de doble desplazamiento porque el grupo sujeto a transferencia (G) primero es desplazado de A 4 por E y a continuación de E-G por B, con formación del producto Q-G.

tos datos cineticos sirven para distinguir los tipos de mecanismos

Los datos sobre el estado de reposo cinbtico y las ecuaciones apropiadas respecto a la velocidad se utili-

t t E EA EAB-EPQ EQ E

P B a

t t E EA-FP F FB-EQ E

Figura 9-18. Reprecentaci6n de tres clases de mecanismos de reacuones Bi Bi Las líneas representan la enzima y las flechas la adición de sustrato y desprendimiento de productos Arriba: Un mecanismo Bi 61 ordenado, característico de muchas oxidorreductasas dependientes de NAD(P) Centro: Una reacción BI Bi aleatoria, típica de algunas deshidrogenasas y cinasas. Abajo: Una reacción de ping pong, propia de las arninotransferasas (transaminasas) y de la quimiotripsina

zan para distinguir entre diferentes mecanismos. Aun- que Ios t&rminoc en estas ecuaciones cinéticas son m& numerosos, son análogos a los de la ecuación de sustrato único de Michaelis-Menten; incluyen: 1) V,,, velocidad de reacción media cuando están presentes tanto A como B en concentraciones saturadas; 2) las concentraciones de A y B que dan como resultado la mitad de la velocidad mkirna cuando el otro sustrato esth presente en concentracion saturada, y 3 ) las constantes de disociación para el desprendimiento de A y B de la enzima.

Las gráficas de doble reciproco diferencian entre los mecanismos ping pong y los secuenciales

Para distinguir entre diversos tipos de mecanismos, se mide la dependencia de la velocidad inicial en la concentracihn del sustrato A en varias series de concentraciones diferentes (pero constantes) del sustrato B. Los datos se obtienen ahora considerando B coma el sustrato variable y A como el sustrato constante. Los patrones de las lineas cuando 10s datos se representan mediante grhficas del doble recíproco muestran el tipo de mecanismo. Por ejemplo, las lineas paralelas indican un mecanismo Bi Bi ping pong, y las lintas que se intersectan en el cuadrante negativo, un mecanismo Bi Bi ordenado.

108 Bioquímica de Harper

Los estudios sobre inhibición de producto se utilizan para completar estos anhlisis cintticos y para distinguir entre mecanismos Bi Bi ordenados y Bi Bi aleatorios. Por qjemplo, en una reacción Bi Bi de equilibrio m i d o , cualquier producto es un inhibidor competitivo de A con [B] constante y de B con [A] constante. 1,os patrones mfis complejos de inhibiciOn de las reacciones B i Bi ordenadas involucran patrones de inhibición tanto competitivos como mixtos, dependiendo del producto que se estudie, de3 sustrato que varia y del que permanece constante.

RESUMEN

La temperatura, el pH, la concentración enzimática y de sustrato y los inhibidores alteran las velocidades de las reacciones catalizadas por entimas, con importantes implicaciones en la salud y la enfermedad. Las enzimas alteran las velocidades de reaccidn por medio de: 1) abatir la energía de activacidn para formar estados de transición, 2) servir como plantillas para incrementar las concentraciones tocales de sustrato y 3) proporcionar aminoicidos cuyos grupos funcionales cumplan con funciones especificas en la catiilisis. Aunque las enzimas modifican de manera profunda las velocidades de las reacciones, no afectan las constantes de equilibrio ni los cambios globales en la energía libre de esas reacciones. La catAlisis enzimática comprende estados de trancicibn de menor energía que los correspondientes en reacciones no catalizadas. De este modo, disminuye la barrera energetica para la reacci6n.

La fíjaci6n y catalisis del sustrato se produce en el sitio activo (catalitico), región tridimensional de una enxima que, además de residuos de aminoacidos, puede contener coenzimas o iones metálicos. Los sitios activos con frecuencia radican en hendiduras en las enzimas o en la interfase entre subunidades de enzimas multimericas. Cuando los sustratos se aproximan, los sitios cataliticos experimentan cambios de conformación que pueden propagarse mhs allá del sitio catalitico (recukrdese la fijaci6n de 01 a la hemoglobina). Estos cambios de conformaci6n inducidos por el sustrato pueden crear bolsas para su retenci6n y alinear residuos clave para la catálisis.

Cuando la temperahira de una enzima se eleva, la velocidad de reaccion aumenta, pero sblo hasta que el nivel de la energia cinetica de la enzima excede a la de rotura de las ddbiles fuerzas no covalentes que mantienen su estructura secundaria y terciaria nativa. En este punto, la actividad decrece en forma precipitada. Cambios de temperatura mAs moderados también afectan la velocidad de reacciones catalizadas por enzimas in vivo, aunque a un grado estrictamente

limitado en organismos homotérmicos, como el ser humano.

Los cambios moderados del pH (es decir, en Ia regibn de pH 5 a 9) afectan la actividad enzimktica al alterar la carga de grupos R bcidos o bhsicos dkbites de los arninoácidos que actúan en la caaisis, fijación de sustrato o conformaci6n del sitio catalltico. Las variaciones de pH tambih pueden alterar la carga elkctrica de los sustratos. Por tanto, las enzimas tienen valores de pH a los cuales muestran actividad 6ptima (pI-l óptimo). Los extremos de pH desnaturalizan las enzimas al protonizar o desprotonizar residuos de arninoácidos acidicos o alcalinos, de modo que ya no pueden formar los enlaces salinos que conservan la estructura secundaria y terciaria de la enzima.

En casi todas las situaciones de ínter&s fisio- 16gic0, la concentraci6n molar de una enzima [E] es de un orden de magnitud menorque laconcentración molar de su sustrato [S]. Dado que se dispone de abundante sustrato para reaccionar con la enzima libre, cualquier incremento o decremento en la concentración de la enzima va acornpaflado de un aumento o disminucidn en la velocidad de reacción. Sin embargo, los cambios en la concentraci6n del sustrato [S] afectan la velocidad de reacción sbIo cuando alrededor hay suficiente enzima libre para reaccionar. Cuando toda la enzima está unida como complejo EnzS (condiciones de V,,,), incrementos mayores de [S] ya no aumentan la velocidad de la reaccihn. Ida ecuacidn de Michaelis- Menten describe los efectos de la concentracihn del sustrato sobre la actividad de numerosas enzimas. La constante de Michaelis (Km) es la concentracihn de sustrato que produce la mitad de lavelocidad de reaccibn mhxima (V,,,/2; la mitad de la enzima se encuentra como EnzS). Los valores de Km tienen dimensiones de molaridad y se determinan mediante grhficas. Para una gráfica de doble recipraco de 1 /v, contra I/[S], la intercepcidn en el eje horizontal es - 1 K y en el eje de Ins y es lIV,,,. El efecto de [S] sobre las velocidades de reacciones catalizadas por enzimas alostkricas es des- critopor laecuacibn de Hill. Lamayoriade las reacciones ca ta l idas por enzimas implican dos o más sustratos o productos. Los criterios para establecer las diferentes clases de reacciones Bi Bi (reacciones que involucran dos sustratos y dos productos) son si el sustrato se enlaza en secuencia o al azar y si el producto se libera antes de que se una la totalidad del sustrato (reacciones ping pond.

Los anhlogos de sustrato que se unen de manera reversible al sitio catalitico y actúan como inhibfdores competitivos de las enzima, incluyen muchos f h a - cos de valor en medicina. La mayoria de los compuestos quimicos con poca o nula semejanza estructural con sustratos y que se unen al sitio catalitico o a algún otro, actúan como inhibidores no competitivos de la actividad enzimhtica. De manera breve, los inhibidores competitivos decrecen la Km, pero no tienen efecto sobre

Vmb, en tanto que los inhibidores no competitivos decrecen V,, sin afectar a Km. Estos inhibidores pueden distinguirse por la medicion de la actividad enzimática a varias concentraciones de sustrato en presencia o ausencia del inhibidor. Luego, los dos conjuntos de datos se grafican como l/v,, contra lI[S]. En la inhibicibn competitiva clfisica, las dos líneas se intersec-

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REFERENCIAS

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tan en el eje y (es decir, V,,, no cambia), pero la intercepcibn (-IJK,) disminuye por la presencia de inhibidor (es decir, en apariencia Km ha disminuido). En la inhibicidn no competitiva, la intercepción en y (l/V,,) aumenta en presencia del inhibidor (es decir, V,b disminuye), pero la intercepcibn en x no se modifica. I

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Vtase tambikn las referencias del capitula T.

Enzimas: mecanismos de acción Victor W. Rodwell, PhD

INTRODUCCION IMPORTANCIA BIOMÉDICA

Los mecanismos de la catAlisis enzimática reflejan muy de cerca 10s mecanismos de las reacciones químicas. Sin embargo, en contraste con la catálisis inorgánica o la orgánica más sencilla, las enzimas muestran un orden en extremo alto de especificidad al sustrato y una enorme eficiencia catalítica; esto es consecuencia del prolongado desarrollo evolutivo de sitios adap- tados a la perfección pasa la cathlisis rripida y selectiva de reacciones individuales.

Los caminos o vías por los cuales las enzimas convierten los sustratos en productos involucran una sucesión de intermediarios, mas que uno solo entre la enzima y el sustrato. El propósito final de los estudios de estos mecanismos es entender, a nivel molecular. por qud las cnzimas son catalizadores eficientes y específicos. Este objetivo todavía lejos de alcanzarse, requiere de: la identificacion de la etapa o fase limitante de la velocidad en la reaccibn global; la caracteriza- ción de todos Tos intermediarias enlamdos en la enzima; la identificación de los iones metálicos o grupos funcionales en los residuos de aminohcidos, coenzimas o grupos prosteticos que participan en el enlace de sustratos, productos e intermediarios en el sitio activo; y, de ellos, identificación del participante directo en la cathlisis. Por anaIogia con e l estudio de los intcrme- diarios en las vías del metabolismo intermedio, el de los intermediarios enlazados a las enzimas que se forman durante la cathlisis, se denomina con toda propiedad "enzimología intermediaria". En este capitulo los principales comportamientos de la catálisis enzimática se ejemplifican Gon la enzima quimotripsina, una pro- teína comparativamente sencilla que no contiene coenzimas, grupos prostéticos ni iones metAl3cos.

Los fenbmenos moleculares que acompafian la conversibn de sustratos a productos constituyen el tema del mecanismo de acción enzimática. Estos estudios conducen a un enfoque racional para la terapéutica y la preparaciiin de medicamentos - á r e a s dc gran potencial de desarrollo en un futuro inmediato. La infor- macihn estructural de alta resolucion obtenida por cristalografía con rayos X, combinada con la informa- ción mecanicista, facilita ahora la preparación de far- macos que inhiben enzimas especlf'ícas como HMGXoA reductasa, la enzima limitante de la velocidad en la biosíntesis del ~olesterol. Asimismo, los estudios de los mecanismos sugieren ciimo puede usarsc la tecnologia del DNA recombinante y la mutagenesis dirigida a un sitio, con el fin de modificar la especificidad enzimática o la eficiencia catalítica. En ultimo caso, estas técnicas facilitarán el diseflo y la introducción en seres humanos de enzimas con las propiedades especificas deseadas.

LA "ENZIMOLOG~A INTERMEDIARIA" DE LA QUHMOTRIPSINA MUESTRA LAS CARACTER~TICAS GENERALES DE LA CATÁLISIS ENZIMATICA

La quimotripsina cataliza la hidrolisis de los enlaces peptidices en los que el grupo carboxilo es cedido por un aminohcido aromático (Fen, Tir, o Tri) o por uno con un grupo R voluminoso no polar (Met). Igual que muchas otras proteasas, la quimotripsina cataliza tam- bién la hidrólisis de ciertos ésteres. Aunque la propiedad de la quirnotipsinapara catalizar la hidriilisis de ésteres no tiene importancia fisiolbgica, si facilita el estudio del mecanismo catalitico.

Flgura 10-1. pNttrofenilacetato (PNPA)

El sustrato sintttico p-nitrofenilacetato (figura 10-1) facilita el análisis colorimétrico de la actividad de la quimotripsina, debido a que su hidrólisis libera p-nitrofenol. En un medio alcalino, Cste se convierte en el anión amarillo p-nitrofenilato.

LA CINÉTICA DE FLUJO INTERRUMPIDO REVELA LA "ENZIMOLOG~A INTERMEDIARIA" DE LA QUlMOTRlPSlNA

La cinética de la hidrólisis del p-nitrofenilacetato por la quimotripsina puede estudiarse en un aparato de "flujo interrumpido". Estos experimentos utilizan cantidades equivalentes de sustrato (mas o menos cantidades equimolares de enzima y sustrato) y ponderan los fenómenos que tienen lugar en los primeros milisegundos desputs de hacer la mezcla. EI aparato tiene dos jeringas: una para la quimotripsina y la otra para el p-nitrofenilacetato. La mezcla instantanea de la enzima y el sustrato se logra con un dispositivo mecanice que expele con rapidez y de manera simulthnea, el contenido de ambas jeringas en un tubo angosto que pasa a cravts de un espectrofot6metro. La densidad 6ptica como función del tiempo despuds de la mezcla, se registra en un tubo de rayos catbdicos.

O D

5 e - Z , Fase de "estallido'

1 Tiempo (mseg)

Fase de equilibrio

Figura 10-2. CinBtica de liberación del anión p-nrtrofenilato cuando la quimotripsina hidroliza al p-nitrofenrlacetato en un aparato de flujo interrumpido. En esta grfifica, el "fenol li- berado" se calwfb a partir de la densidad bptica del anión p-nitrofenilato.

Ilido", caracterizada por el desprendimiento mhs rApido del anión p-nitrofenilato y 2) una liberaci6n mhs lenta, subsiguiente, del mismo. El carhcter bifhico de la liberacibn del anión p-nitrofeniEato se comprende en tkrminos de los pasos sucesivos de la catdlisis mostrados en la figura 10-3.

La etapa lenta es la hidrólisis del complejo quimotripsina-acetato (CF-Ac)

Una vez que toda la quimocsipsina disponible forma parte del complejo CT-Ac, ya no puede haber más desprendimiento dep-nitrofenilato hasta que se libera quirnotripsina mediante la remocibn hidrolitica lenta del ani6n acetato procedente del complejo CT-AC (figura 10-3). La fase de "estallido" (figura 10-2) corresponde a la conversion de toda la quimotripsina libre disponible en el complejo CT-Ac, con liberaci6n simultánea del ani6n p-nitrofenilato. El p-nitrofenilato

La liberación del anión p-nitrofenilato (feno[ PNPA del ingl~s~p-nifropknylafe) ~ + ~ ~ o despds es bifasica de la fase de "estallido" es consecuencia de la forma-

ción lenta de quimotripsina libre por hidrbtisis del corn- La liberacihn del anión p-nitrofenilato tiene lugar en plejo CT-Ac. Esta quimotripsina libre queda entonces dos fases distintas (figura 10-2): 1) una fase de "esta- disponible para la formación posterior de complejos

CT + PNPA - CT-PNPA tCT-& ucT Rapida RBpida Lenta

Flgura 1 0 3 . Pasos intermedios en la cathlicis de la hidrblisis del p-nitrofenifacetato por la quimotripsina (CT, quirnotripsina, PNPA, p-nitrofenilacetato; CT-PNPA, complejo quimotripcina-pnitrofenilacetata; CT-Ac, complejo quimotripsina-acetato; fenol, anrbn pnitrofenilato, A F , anibn acetato.) La formación de los complejos CT-PNPA y CT-Ac es rápida en relacibn a la hidrblisis del complejo CT-Ac.

Enzirnas: mecanismos de acci& 1 13

CT-PNPA y CT-Ac con iiberacibn concurrente del PNPA. En realidad, la magnitud de la fase de "estallido'' (es decir, los moles dep-nitrofenilato liberados) es directamente proporcional al número de moles de quimotripsina presentes inicialmente.

La señina 195 tiene una funcibn clave en la catálisis

El grupo acil del intermediario acil-CT está enlaza'do a un residuo seril altamente reactivo -serina 195- de la quimotripsina. La elevada reactividad de la Ser 195 se demuestran por su capacidad (aunque no por la de los 27 residuos seril restantes de la quimotripsina) para reaccionar con el diisopropilfosfofluorjdato ( D 1 P F , d e 1 i n g Id S, diisopropylphosphoJuuridate) (figura 10-4). Reacciones análogas tienen lugar con otras proteasas de serina.

La fomacihn de derivados de la Ser 195 inactiva a la quimotripsina. Muchas otras proteasas son inac- tivadas por el DiPF mediante un mecanismo analogo. Estas se conocen como "serina proteasas".

Un sistema relevador de carga funciona como una lanzadera de protones durante la catá!isis

Este proceso utiliza tres residuos aminoacil que están bastante separados respecto a su estructura primaria, aunque a distancia suficiente para formar enlaces entre si, en el sentido de la estructura terciaria. Estos residuos son Asp 102, His 57 y Ser 195. Aunque la mayoría de los residuos cargados de la quimotripsina estan en la superficie de la molkcula, los que pertene- cen n la "lanzadera" estan "enterrados" en el interior no polar de la mol~cula. Los tres residuos se encuentm alineados en e! orden Asp 102-His 57-Ser 195.

Recuérdese que Ser 195 es el residuo acilado durante la catalisis por quirnotripsina. La aproximacibn del ani6n acetato (derivado del pnitrofenilacetato) al Btomo de oxígeno del grupo R de la Ser 195 desencadena el desplazamiento secuencia! de protones que se mueven como "lanzadera" de Ser 195 a travhs de His 5 7 a Asp 1 02 (figura 1 0-5).

'f . O Y o

l S"' I Enz-CH,OH+ F - P = O Enz-CH,-O-P=O

4 I

A DIPF

A Figura 1 0 4 . Reaccibn del hidroxilo primario de la Ser 195 de quimotripsina con el diisopropilfosfofluoridato (DIPF).

His ' Sus- (es decir. Ac-)

-C-O-H- - . N N-H O- Ser

A

Figura 10-5. Operacibn de la lanzadera de protones de la quimotripsina durante la acilacibn de Ser 195 por el sustrate (Sus3

Durante la desacilacion del intermediario acil-Ser 195, los protones se mueveii en direccidn contraria. Se cree que una serie análoga de desplazamiento de protones acompaña la hidrblisis de un sustrato fisio- 16gico de la quimotripsina, como la es un pCptido.

Al igual que muchas proteasas, la quimotripsina se libera desde los ribosomas como precursor de la enzima sin actividad catalitica denominado preenzima o cirnógeno. Tal como se explicara en el capitulo 1 1, la conversibn de la preenzima quimotripsinbgeno en la enzima activa quimotripsina implica una serie de fenomenos proteoliticos selectivos cuyo resultado final es la formación del sitio activo y el alineamiento del sistema relevador de carga responsable de la catálisis.

Catálisis mediante fructssa-2,6-bifosfatasa

La fructosa-2,6-bifosfatasa es una fosfohidrolasa (capitulo 21) que cataliza la remocibn mediante hidrdlisis del fosfato del carbono 2 de la fructosa- 2,6-bifosfato. La figura 10-6 muestra la funcibn de siete residuos de sitios activos en la catilisis efectuada por esta fosfohidrolasa. Igual que en la catálisis que producen las proteasas de serina, ésta implica una "triada catalitica", aunque una parte de ella consta de dos His y un residuo Glu. También se muestra la estabilizacibn por residuos de Arg y Lis con carga positiva, de la fuerte carga negativa del sustrato.

LAS COENZIMAS PARTICIPAN DIRECTAMENTE EN LA CATALISIS ENZIMÁTICA

La participación directa de las coenzimas para las enzimas conocidas como arninotransferasas, o, con mayor frecuencia, como transaminasas se explican en

E Fru-2,6-P, E-P Fru-6-P

Arg 307

His 392

*rg 257 HIS asa

E-P H,O EmP,

Figura 1 0 4 . Catálisis por fructosa-2,6-bifosfatasa. (1) La mrga negativa cuádruple del sustrato unido se estabiltza por las interacciones d e carga a carga con brg 257. Arg 307, Arg 352 y LIS 356. Uno de los integrantes de la trfada catalitica, Glu 327, estabiliza la carga positiva de His 392 (2) La nucleofilica His 392 ataca al carbono 2 del grupo fosforilo, y transfiere el fosfato a His 258 con formación d e u n fosfate intermedio Se desprende fructosa 6-fosfato de la enzima (3) Un segundo ataque nucleofilico por una rnol&cula de agua. posiblemente asistida por Glu 327 que actua como base, forma fosfato inorgánico. (4) Se desprende ortofosfato inorg8nim desde Arg 257 y Arg 307 (Reproducida con autorizaci6n de Pilkic SJ et al ,6-Phosphofructo-2-kinaselfru- cose-2,6-bisphosphatase. A rnetabotic signaling enzyrne Annu Rev Biochem 1995,64:799 )

seguida. Las transaminasas catalizan el intercambio de grupos alfa amino de los aminoacidos por grupos alfa 0x0 de los alfa oxoacidos del piruvato, oxnlacetato o aIh cetoglutarata; estas reacciones son fundamentales para la biosintesis y el catabolismo de los aminoácidos (capitulas 30 y 3 1). Lo mismo que muchas reacciones que requieren coenzimas, la catálisis por medio de las

transaminacas implica los mecanismos de ping pong que se expusieron en el capitulo 9, con liberacion de un producto antes de agregar el segundo sustrato (figura 10-7).

LOS RESIDUOS EN EL SITIO CATAL~TICO PUEDEN ACTUAR COMO CATALIZADORES ~ c i ~ o a Á s i c o s

Una vez que el sustrato se ha unido al sitio catalítice, los grupos funcionales cargados {o con posibilidad de tener carga) de las cadenas laterales de residuos aminoacil cercanos, pueden participar en la catálisis al funcionar como catalizadores Acidos o bhsicos,

Existen dos amplias categorías de catllisis aci- dobásica efectuada por enzimas: la catálisis Acida (o blsica) general y especifica. Por otro lado, aunque las reacciones cuyas velocidades varían en respuesta a los cambios en la concentraci6n de M ' o II3O1 son independientes de las concentraciones de otros hcidos o bases presentes en la soluci6n, se dice que están Sujetas a catálisis ácida específica o bhsica especifica. Por su parte, se dice que las reacciones con velocidades sen- sibles a todos los ácidos (donadores de protones) o a todas las bases (aceptores de protones} en Ia solucibn, astán sujetas a catálisis hcida general o básica general.

Las variaciones del pH y de las concentraciones de amortiguador establece la diferencia entre catálisis acidobásica general y la especifica

Si la velocidad de la reacci6n cambia como una función del pH a concentracion constante de amortiguador, se dice que es catálisis básica específica (cuando el pH es superior a 7) o catalisis iicida específica (con pH menor a7). Si seeleva lavelocidad de lareacci6n apH constante con los incrementos en la concentración del amortiguador, sediceque esthsujetaa catálisis bhsica general (cuando el pH es mayor de 7) o cathIisis hcida general (con pH inferior a 7).

N,,

E-cHo dcH0-E / C H z N H a L E - C H 2 ~ H 2 \ \ -E \ E-cHo ' A I ~ Pir KG Giu

Figura 10-7. Mecanismode ping pong de la transaminacibn. E-CHO y E-CH2NH2 representan los complejosenzima-fosfato de piridoxal y enzima-focfato de piridoxamina. respectwamente. (Ala, alanina; Pir. piruvato; KG, alfa-cetoglutarato, Glu, glutamato.)

Como ejemplo de catálisis ácida especifica, con- sidérese la conversihn de un sustrato (S) a un producto (P). El proceso tiene dos pasos, una transferencia de protones rápida y reversible,

seguida por un pasa más lento y, por tanto, determinante de la velocidad, de reordenamiento del sustrato protonado a producto:

El aumento de la concentracibn del ion hidronio [Hd3+j incrementa la velocidad de la reacción aI elevar la concentraci6n de SH', el acido conjugado del sustrato. que es a su vez el sustrato para el paso determinante de la velocidad en la reacción global. Expresado de manera matemhtica,

dlpl Velocidad = = WH 7 dt

donde P = producto, t = tiempo, k = constante especifica de la velocidad y [SH '1 = concentracion del acido conjugado del sustrato.

Dado que la concentraci~n de SH' depende de las concentraciones de S y de &O', la expresibn general de la velocidad para las reacciones catalizadas ácido especificas es:

Nótese que un requisito de la catálisis hcida especifica es que la expresión de la velocidad contenga $610 términos para S y para hO+.

Ademas, considbese que, en adicibn a la catlilisis ácida especifica descrita antes, hay también catalisis por el ian irnidazolio de un amortiguador imidazblico. Puesto que el imidazol es un ácido débil (pK, aproximadamente 7), es un donador de protones malo; por eso la reacción

es lenta y determina la velocidad para la reacción global. Nótese que el paso rhpido y el lento estan invertidos cuando el mecanismo cambia de catfilisis Bcida especifica a general. Las expresiones de velocidad para la cathlisis hcida general con frecuencia son complejas por lo cual no se describen aquí.

LA MUTAGENESIS DlRlGlDA A UN SITIO PROPORClONA NUEVAS PERSPECTIVAS

Las técnicas de la biologia molecular proporcionan herramientas poderosas para la investigacion del me-

canismo de accibn de las enzimas. Destaca entre ellas la posibilidad de alterar a voluntad Ia secuencia de bases de nucleótidos de los genes y expresar las pro- teínas en huespedes unicelulases como células de mamíferos cultivadas o la bacteria EScherichia col[ En combinaci6n con estudios de la estmctura tridi- rnensional en solución por cristalografía con rayos X

'y con investigaciones cinkticas clasicas, estas tdcnicas moleculares proporcionan nuevas perspectivas sobre los mecanismos de accibn de las enzirnas.

Cuando los datos físicos y cinhticos indican que un residuo aminoacídico dado desempefia una funcibn especifica en la catiilisis (es decir, que sirve como una base general o como un reactivo de transferencia de grupo), la posibilidad puede ser respaldada mediante el cambio del aminoacido por otro incapaz de ejecutar Ia funcián postulada. En algunos casos, esto puede lograrse con la modificaci6n química de la enzima. Sin embargo, un enfoque mhs general consiste en emplear la mutagenesis dirigida a un sitio para modificar el gen que codifica la enzima, luego expresarlo y caracterizar la enzima mutante. Por la alteración de la secuencia de bases de un codón especifico, la mu- tagknesic dirigida a un sitio, puede reemplazar un aminoácido dado por cualquier aminohcido proteínico deseado. Asimismo, la mutagénesis dirigida a un sitio puede producir numerosas mutantes en un punto. Un oligonuclebtido corto (es decir, un mer-F 9) que codifica un aminohcido mutante, generado por síntesis automatizada, es templado in vjtro al gen original aislado. Luego se produce un gen mutante por adición de DNA polisomerasa, DNA ligasa y trifosfatos de ribonucle6tidos. A continuación, ese gen se traslada a un vector para expresion detrfis de un promotor po- tente, se expresa y la enzima mutante que se obtiene es purificada para examinar SLIS propiedades.

LOS IONES METALICOS PUEDEN FACILITAR LA FIJACIÓN Y LA CATÁLISIS DEL SUSTRATO

Mfis de 25% de las enzima contienen iones metálicos firmemente unidos o los necesitan para su actividad. Las funciones de éstos se estudia por medio de la cristalografía con rayos X, e imágenes de resonancia rnagnktica (IRM), y resonancia del spin del electrón (RSE). Junto con el conocimiento de la formación y [a degradaci~n de los complejos metAlicos y de las reacciones dentro de las esferas de coerdinacion de los iones methlicos, proporcionan una perspectiva de sus funciones en la cathlisis enzimática, las cuales se consi- derarAn más tarde.

Las rnetaloenzimas contienen una cantidad de- finida de un ion methlico funcional que es retenido

116 e Binguímicade Harper (Cap íf u10 J O)

durante !a purificación. Las enzimas activadas por metales se unen con &.tos de manera menos firme, pero los necesitan para ser activas. Por tanto, la distin- ci6n entre rnetaloenzimas y enzimas activadas por metal radica en la afinidad de una enzima particular por su ion metálico. Los mecanismos que emplean los iones metAlicos para desempefiar sus funciones parecen ser semejantes en las metaloenzimas y en las enzirnas activadas por metal.

En la catálisis funcionan complejos ternarios con metales

Para los complejos temario5 (de tres componentes) del sitio catalítico (Enz), un ion metálico (M) y el sustrato (S) que presentan estequiometría 1 : 1 : 1, son posibles cuatro disposiciones:

Complejo con puente Complejo con puente de sustrato enzimatico

Complejo can puente Complejo con puente metálico cíclico metálico simple

Para las enzimas activadas por metal, las cuatro disposiciones son posibles, mientras que las rnetaloenzimas no pueden formar el complejo EnzSM, debido a que retienen al metal a travds de la purificacidn (es decir, ya son un complejo BnzM). Pueden enunciarse tres generalizaciones: 1) la mayoria, pero no todas las cinasas (ATP: fosfotransferasas) forman complejos con puente de sustrato del tip Enz-nuclebtido-M. 2) Las fosfotransferasas, que utilimn pinivato o fosfoenolpiruvato como sustrato, las enzimas que catalimn otras reacciones del fosfoenolpiruvato y las carboxilasas, forman complejos con puente rnethlico. 3) Una enzima dada puede formar un tipo de puente en el complejo con un sustrato y uno de tipo diferente con otro.

A. Complejos con puente enzimáfico (MEnzS) Se presume que los metales en los complejos con puente enzimático tienen funciones estructurales en el mantenimiento de la conformacibn activa (por ejemplo, la glutamina sintetasa) o forman un puente metiilico hacia el sustrato (por ejemplo, la piruvatocinasa). Ademhs de su función estructural, se cree que el ion

methtico en la piruvatocinasa mantiene un sustrato (ATP) en su lugar y lo activa.

Piruvatocinasa- ATP

\ Creatlna

B. Complejos cuyo puente es el sustrato (EnaSAfJ Al parecer, la fomaci6n de complejos ternarios de trifosfatos de nucleósido y enzima, metal y sustrato con puentes de sustrato, se atribuye al desplazamiento del HzO desde la esfera de coordinacibn del metal por el ATP:

ATP~' + M ( H ~ o ) ~ ~ ' ATP- M ( H ~ O ) ~ ~ ' + 3H20

Las enzimas entonces se enlazan, formando el complejo ternario:

En las reacciones de las fosfotransferasas, los iones met8licos se consideran como activadores de los áto- mos de fbsforo que ast forman un complejo rigido pol ifosfato-aden ina, de conformación apropiada en el complejo cuaternario activo.

C. Complejos con puente metálico

Los datos cristalogrhficos y de secuenciación han establecido que un residuo His interviene en la fi- jación del metal al sitio activo de muchas proteinas (por ejemplo, carboxipeptidasa A, citocromo c, mbre- doxina, rnetamioglobina y metahemogfobina; capitulo 7). Para los complejos binarioc (dos componentes) E n N , el paso limitante de la velocidad es en muchos casos la separación del agua de la esfera de coordi- nación del ion methlico. En muchas peptidasas, la activación por los iones metklicos es un proceso lento que requiere muchas horas. Es probable que la reac- ciOn lenta sea et reordenamiento confomacional del compIejo binario EnzM para llegar a la forma activa, por ejemplo:

Enzimas - mecanismos de acciún 1 1 7

Unibn del metal: un ion metklico puede "enmascarar" a un nuclebfilo y así prevenir una probable reaccibn secundaria. Fi- nalmente, el control estereoquimico del curso de una reacción catalizada por enzimas, puede lograrse con la propiedad de la esfera de coordinacibn del metal para actuar como un molde tridimensiona! para mantener los grupos reactivos en una orientación espacial especifica (cuadro 10-1).

Rhplda

Enz + M(Hfl)s -+ Enz-M{H20)6., + nH20

Reordenamiento a una conformacibn activa (Enz'):

Lenta

En~-M(Hz0)6.~ + E l i f 4 ! A ( H 2 0 ) ~ . ~

Sin embargo, en las metaloenzimas el compleio ternario con puente metfilico debe formarse mediante Ia combinación del sustrato (S) con el complejo binario EnzM :

RESUMEN

La quimotripsina proteasa (CT) ejempIifica numerosas características generales de la catalisis enzimática, las cuales incluyen la formación de intermediarios unidos a enzima (CT-PNPA y CT-Ac), la

/ Enz-iUi + S k E n z - M 4 o Enz '. I

S

naturaleza escalonada del proceso (tres reacciones parciales}, el carácter limitante de la velocidad de una reaccibn parcial sencilla (hidrdlisis de CT-Ac) y Ia liberacihn en secuencia de productos (fenol seguida '

por acetato). Idas funciones.de aminohcidos p&icu- lares en el sitio catalitico se mostraron por la función de un residuo Ser (SeriYs) como aceptor de un grupo (Ac-) que es transferido a agua y por las funciones de los residuos Ser, 1-Iis y Asp específicos en la formación

Los iones metálicos desempeñan múltiples funciones en la catálisis

d e un sistema relevados de carga. Además, este 1-0s iones methlicos pueden participar en cada 1 de los 4 mecanismos con los que se sabe las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones qufmicas: 1) catálisis acidobásica general, 2) catáIisis covalente, 3) aproxi- mación de los reactantes y 4) induccion de rigidez o tension en la enzima o el sustrato. Además del hierro y el manganeso que funcionan en las proteínas hémi- cas, los iones metálicos que intervienen más común- mente en la catálisis enzimática son ~ g ~ ' , ~ n " y ~ a ? ' , aunque otros iones metálicos (por ejemplo, K') son importantes para la actividad de ciertas enzirnas.

Los iones metblicos, al igual que los protones, son ácidos de Lewis (etectr6filos) y pueden compartir un par de electrones para formar un enlace sigma. Ademhs, pueden ser considerados "superácidos", dado que existen en soluci6n neutra, frecuentemente tienen una carga positiva > 1 y pueden formar enlaces pi. Asimismo (a diferencia de los protones), los metales pueden servir como plantillas tridirnensionaies para la orientación de los grupos bhsicos en la enzima o el sustrato.

Por otro lado, los iones metálicos pueden aceptar electrones a travhs de los enlaces sigma o pi para activar electrófilos o nucleófilos (catálisis acidobksica general). Mediante la donaci6n de electrones, los metales pueden activar a los nuclebfilos o actuar como nucleófi~os ellos mismos. La esfera de coordinación de un metal puede atraer a la enzima y al sustrato (aproximación) o crear una distorsión que produce quelatos en una o en otro (rigidez o tensión). Ademas,

sistema relevador de carga ejemplifica quc los residuos adicionales bastante separados en el sentido de una estructura primaria (Ser 195, His 57 y Asp 102)

Cuadro 10-1. Ejemplos escogidos de funciones dc? los el mecani IS

- :nzimas*

Funcion uei iuii irieiaiicu -

IIisnaina riesarninasa Cinasas, liasas, pirii- I 6- - valo u descarboxilasa

L - Ar i Activaciiin de un nuclebfilo -

En El meta! actiia como un nucieó-

- Pi

iones me.

rbbnica ~rnldicas

ruvato cal carboxipl alcohol dr nasa

-boxilasa, cptidasa, :shidroge-

-

IWeinas ftmt -- - Donación Piruvato cin

vato carl adeni latoci - - . --A -

FE Fosfotrancf

xilosa isi hemoproteirids 1

* Adaptado de Mildvan AS Meials in Pagc 456 in The Enzymes Boyer P (editors) Academrc Press 1970

m sin k m ,,,, ,,,,,,, , ,, ,,,, , .

asa, piru- ioxilasa,

nes pi (n) e y orienia

crasa, D- 3rnerasa, !.. . . i

nsionales

-- alysis Vol 2. , Myrhack K

enzyme cat; U, Lardy H

1 18 * Rioquimica de Hurper {Capitulo 10)

pueden formar porciones contiguas del sitio catalítico de una enzima. La proteblisis selectiva de la prepro- tefna quimotripsinbgeno inactiva crea el sitio activo de la quimotripsina y lleva los tres residuos que conforman el sistema relevador de carga a una distancia, uno de otro, que permita formar enlaces.

Durante la catllisis, los residuos del sitio catalitico pueden actuar como ácidos (Glu, Asp) o bases (His. Arp, Lis) generales. La adicion de sustratos y la liberación de productos pueden proceder en

forma ordenada o de una manera aleatoria. Bajo un mecanismo de ping pong (por ejemplo, transami- nación), la reaccibn avanza a travks de los fenómenos alternos de adicibn de sustrato y liberacibn de producto.

Los iones methlicos facilitan la fijación del sustrato y la catálisis mediante la creacibn de varias clases de complejos puente, constítuidoc por enzima, metal y sustrato. Los iones met8licos pueden actuar como catalizadores acidos generales o facilitar la aproxima- ci6n de los reactantes.

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Enzirnas: - regulación de actividades Victor W. Rodwell, PhD

En este capitulo, algunos ejempIos escogidos muestran los mecanismo^ que regulan los procesos metabólicos mediante la cantidad o eficiencia catalítica de las cnzimas. La intención es establecer las características de los patrones globales de regulación. En todo el libro se hace referencia a otros muchos ejemplos espectfi- cos para mostrar las diversas caracterís-ticas de la regulación metabólica.

IMPORTANCIA BIOMEDICA

¿De qué manera Ias células y ios organismos íntegros regulan y coordinan el metabolismo global? Esta pregunta interesa a los trahaiadores en áreas de las ciencias biornkdicas tan diversas como chncer, cardiopatias, envejecimiento, fisiologia microbiana, diferenciación, rnetakorfosis, accihn h-onal y de Fármacos. En todas estas áreas, se han encontrado ejemplos importantes de regulaciiin nomal o anormal. Por ejemplo, muchas celulas canmrosas exhikn anormalidades en Ia regulación de su complemento enzimático (carecen de induccion o de represiOn); caso que ejemplifica la conclusi6n ya es- tablecida, de qtic las alteraciones del control qenktico son fen6menoS fundamentales en las c&lulas cañcerosas. De nuevo, ciertos virus onctjgenos contienen un gen que codifica para una tirosina proteincinma. Cuando esta cinasa actúa en las células del hugsped, puede fosforilarmuchas proteínas y enzirnas que normalmente no lo estAn y, por tanto, conducir a cambios importantes en el fenotipo celular. Al parecer, un cambio de esta naturaleza es la base de ciertos tipos de transfor- macibn oncogenica vira!. La accibn de los famiacos proporciona otro ejemplo importante que comprende la regulación enzimática, pues la induccidn enzimática es una causa bioquimica importante en las interacciones medícamentosas, situaciones en las que la administracibn

de un medicamento provoca cambios significativos en el metabolismo de otro (capitulo 61).

LA REGULACI~W DEL METABOLISMO LOGRA LA HOMEOSTASIA

El concepto de regulación homeostática del medio interno emitido por Claude Bernard a finales del siglo XIX hizo hincapie en la facultad de los animales para mantener constante su medio intracelular a pesar dc los cambios en el exterior. Este concepto impIica que todas las reacciones necesarias catalizadas por enzimas se efectúan a velocidades que responden a cambios tanto en el medio interno como en el externo. Una cCIula u organismo pueden considerarse enfermos cuando no responden o lo hacen inadecuada o incorrectamente a una seiial interna o a un esmés externo. El conocimiento de los factores que afectan las velocidades de las reacciones catalizadas por enzirnas, es esencial para entender el mecanismo de la homeostasia en las células normales y para comprender la base molecular de la enfermedad.

El flujo de metabolitos tiende a ser unidireccional

Todas las reacciones quirnicas, incluyendo las catalizadas pos enzimas, son en cierto grado reversibles*. Dentro de la celula viva, sin embargo, es posible que no se produzca la reversibilidad porque los productos

* Una reacciiin fácilmente reversible tiene un pequeao valor numérico de AG, micntras que una con un valor negativo grande para AG podría llamarse "realmentc irreveriihle" cn casi todas las siiuacioncs bioquimicas.

120 Bioquimica de Harper (Capibulo I 1)

de reacciiin son removidos con rapidez mediante reacciones adicionales catalizadas por enzimas. El flujo de metabolitos en una celulavivaes análogo al flujo de agua en un acueducto el cual aunque es capaz de transportar agua en ambas direcciones, en la prhctica el fi ujo es unidireccional. El flujo de metabotitos en la d l u l a también lo es en gran parte. El equilibrio verdadero, lejos de ser característico de la vida, se alcanza s61o a la muerte de la célula. La célula viva es un sistema dinámico estacionario conservado por un flujo unidi- seccional de metabolitos (figura 1 1-1). En las cklulas maduras, las concentraciones medias de los metabolitos permanecen relativamente constantes durante periodos considerables*. La flexibilidad del sistema estacionario se manifiesta en los delicados des- plazamientos y equilibrios mediante los cuales los microorganismos conservan constante el medio in- temo, a pesar de Ias amplias variaciones en alimen- taciiin, ingestibn de minerales y agua, rendimiento de trabajo o temperatura externa.

Las velocidades de reacción responden a las necesidades fisio~ogicas cambiantes

Para que la vida proceda de una manera ordenada, debe regularse el flujo de metabolitos a travks de las vías anabólica y catabólica. Es preciso que todos los fenómenos quimicos necesarios tengan lugar a velocidades congruentes con los requerimientos del organismo en relacidn con su medio. La produccidn de ATP, la sintesis de precursores macromoleculares, el transporte, la secreción y la resorción tubular, deben responder todos a cambios suti les del medio celular, del brgano y del animal integro. Se necesita que estos procesos sean coordinados y, además, respondan a cambios a corto plazo del medio externo (por ejemplo, la adicibn o la eliminaci6n de un nutriente), ncl como a sucesos intracelularcs periddicos (por ejemplo, la replicación del DNA). I-lasta ahora, los detalles moleculares de la regulacibn son mejor comprendidos en las bacterias, las cuales carecen de las compleji- dades del control hormonal o neurológico y en las cuales los estudios genéticos pueden llevarse a cabo con facilidad para analizar los acontecimientos moleculares. Sin embargo, nuestra comprensihn de la regulacibn rnolecular en la célula animal está en un estado de rhpida expansibn. En tanto que la regulacion metab6lica en los mamíferos difiere de modo signifi-

/ grandes \m

Figura 11-1. Una oélula ideal en estado de estabilidad. Obsérvese que el flujo de rnetabolitos es unidireccional.

cativo, de los fenómenos superficialmente semejantes de las bacterias, la regulacibn de los procesos metab6licos en &as ser6 el ejemplo a discutir debido a que proporciona un marco conceptual de referencia para considerar la regulación en el ser humano

TRES MECANISMOS GENERALES REGULAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTI~A

El flujo neto de carbono de una reacción catalizada enzirnAticamente podria ser influido: 3 ) cambiando la cantidad absoluta de enzima presente, 2) alterando el tamaiio del conjunto de reactantes distintos de la enzima y 3 ) alterando la eficacia catslitica de la enzima. Las tres opciones son utili~adas en casi todas las formas de vida.

Las velocidades de síntesis y degradación determinan la cantidad de enzima

La cantidad absoluta de una enzima presente esta determinada por su velocidad de sintesis (k,) y por Ia velocidad de su degradación (b,} (figura 1 1-2). La cantidad de una enzima dentro de una celula puede

Enzima

Aminoácidos

Figura 11-2. La cantidad de enzima se determina por el * Sin emhargo, si ocurren osciiaciones de corta duración en balance neto entre la sintesic de la enzima su degradación las concentraciones del meiaholito y de la enzima y tienen Las K, y Kdeg son las mnstantes de velocidad para el proceso gran importancia fisiológica. completo de sintesis y degradacibn, respectivamente

Enztmar: regulación de uctividudes 121

elevarse ya sea por un incremento en su velocidad de síntesis (incremento de k,), por una disminución en su velocidad de degradacibn (disminucion de h,), o por ambos. De manera semejante, una cantidad menor de enzima puede resultar de una disminucihn de k,, de un incremento en kdq, O deambos procesos. En el ser humano se encuentran ejemplos de cambios tanto en k, como en k+. En todas las formas de vida, la síntesis de enzimas a partir de los aminoAcidos y su degradacibn hasta aminohcidos son procesos distintos catalimdos por conjuntos de enzimas por completo diferentes. La regu- lación independiente de la sintesis y de la degradacihn de las enzimas se logra asl, fhcilmente (figura 1 1-2).

Los inductores pueden estimular la síntesis de enzirnas

Las celulas pueden sintetizar enzimas especificas en respuesta a la presencia de inductores especificos de peso molecular bajo. Por ejemplo, Escherichia colr cultivada en glucosa no cataboli~ara la lactosa debido a la falta de la enzima beta galactosidasa, que hidroliza la lactosa a galactosa y glucosa, Si al medio de cultivo se agrega lactosa o algunos otros beta galactosidos, hay inducción de síntesis de beta gaIactosidasa y entonces el cultivo puede catabolizar la Iactosa.

Aunque muchos inductores son sustratos para la enzima que inducen, ciertos compuestos estmctural- mente semejantes al sustrato pueden ser inductores, pero no sustratos; se les llama inductores gratuitos. A la inversa, un compuesto puede ser un sustrato, pero no un inductor. Frecuentemente, un inductor estimula a varias enzirnas de una ruta catabdlica(por ejemplo, tanto la beta galactosidopemeasa como la beta galactosidasa son inducidas por lactosa).

Las enzimas cuya concentraci6n en una ctIula es independiente de un inductor agregado se denominan enzimas constitutivas. Una enzima particular puede ser constitutiva en una cepa, inducible en otra, y ausente en una tercera. Las células capaces de ser inducidas por una enzima particular, por lo general contienen una cantidad basa1 pequefía medible de esta enzima, aun en ausencia del inductor agregado. La herencia gendtica de la ctlula determina así, tanto la naturaleza como la magnitud de la respuesta al inductor. t o s térmi- nos "constitutiva'" e "inducible" son, por tanto, términos relativos, como "caliente" o "frio", que representan los extremos de un amplio espectro de respuestas.

La induccibn enzimhtica tambitn existe en las células eucariotas. Ejemplos de enzimas inducibles en los animales son la triptbfano pirrolasa, la treonina deshidrogenasa, la tirosina alfa cetoglutaratotransami- nasa, la invertasa, las enzimas del ciclo de la u- la HMG-COA reductasa y el citocromo P450.

Los productos finales reprimen la síntesis de enzimas

La presencia de un metabolito biosintktico en el medio de crecimiento bacteriano, puede reducir la nueva síntesis del mismo por medio de la represión. Tanto en la induccion como la represión participan elemen- tos cis, secuencias especificas de DNA ubicadas en la parte superior de la cascada de genes que codifican una enzima dada, y proteínas reguladoras trunTac- tuantes. Además, metabolitos especificos sirven corno correpresores o coinductores que al enlazarse a pro- teínas transactuantes, lo mismo fortalecen que debili- tan su integracihn con un elemento cis. Por tanto, los valores intracelulares altos de un metabolito como una purina o un aminoácido pueden interrumpir la síntesis de las enzimas que participan en su propia biosíntesis. Por ejemplo, en Salrnonelh typhirnurrum, la adición de histidina reprime la síntesis de todas las enzimas que intervienen en su biosíntesis, mientras que la adicibn de leucina reprime la síntesis de las tres primeras enzimas peculiares para su biosíntesis. Despues de la eliminación o del agotamiento de un intermediario biosintético esencial del medio, de nuevo se produce la biosintesis enzirnitica. Esto constituye lo que se denomina dessepresión.

Los ejemplos anteriores muestran la represibn por retroalimentación con el. producto, típica de Ias vias biosinttticas de las bacterias. Por otro lado, la represión por catabolito es un fenómeno relacionado que se refiere a la facultad de un intermediario en una sucesi6n de reacciones catabólicas catalizadas por enzimas para reprimir la sintesis de las enzimas ca- tab0Iicas. Este efecto fue observado primero en cultivos de E. coli creciendo en una Euente de carbono (X) distinta de la glucosa. Se not6 que la adición de glucosa reprimía la síntesis de las enzimas encargadas de1 catabolismo de X y este fenómeno fue inicialmente llamado el "efecto de la glucosa*'. Puesto que otros nutrientes oxidables diferentes a este carbohidrato producen efectos semejantes, se ndopt6 el tdrrnino represidn por catabolito, la cual es mediada por el cAMP. Los mecanismos moleculares de la inducción, la represion y la desrepresidn se dcscribirhn en el capitulo 4 1 .

EL RECAMBIO DE PROTE~NAS TIENE LUGAR EN TODAS LAS FORMAS DE VIDA

Los procesos combinados de síntesis y degradacibn de [as enzimas constituyen el recambio enzimático reconocido como una propiedad característica de las c&IuIas de los tiamíferos, mucho tiempo antes de que

se mostrara que también tenia lugar en las bacterias. La existencia del recambio de proteínas en el ser humano se dedujo de experimentos dietkticos hace bastante más de un siglo, aunque fue hasta el trabajo clásico de Schoenheimer, justamente antes y durante la 11 Guerra Mundial, que se estableció concluyentemente. Midiendo las velocidades de incorporación de aminoácidos rnar- cados con NI5 a las proteinas y los índices de pCrdida de NI5 de las proteinas, Schoenheimer concluyó que las proteínas están en un estado de "equilibrio dinamico", un concepto extendido desde entonces a otros consti- tuyentes del cuerpo, incluyendo los Iípidos y los ficidos nucleicos.

Las velocidades de degradación de las enz'imas específicas están sujetas a regulación

La degrada~ion de proteínas de mamfferos por vías que dependen de ATP y ubiquitina, asi como las independientes dc ATP, se describen en el capitulo 3 1 . La susceptibilidad de una enzima a la degradacibn proreolitica depende de su ~onfomacibn. La presencia o la falta de sustratas, coenzirnas o iones metálicos, que pueden modificarla, alteran lasusceptibilidad pro- teolítica. De este modo, laconcenmci61-i de sustratos, de coenzímas y posiblemente de iones en las cklulas puede, influenciar las vclocidades a las cuales son degradadas enzimas especificas. La arginasa y la trip- tófano oxigenasa (tripthfano pirrolasa) e,jemplifican estos conceptos. La regulación de las cifias hephticas de arginasa puede incluir ya sea un cambio en k, o en L,. Despudc de la ingestidn de una dieta abundante en protehas, los valores hepriticos de arginasa se elevan debido a un incremento en la velocidad de su sintesis. Los mismos valores también aumentan en los animales hambrientos. Aquí, sin embargo, es la de- gradación de la arginasa la que está disminuida, en tanto que k, permanece inalterada.

En un segundo ejemplo, tanto la inyeccidn de glucocorticoides como la ingestión de triptófano aumentan 30s valores de triptofano oxigenasa en los mamíferos. El efecto de las hormonas es la elevacibn de la velocidad de síntesis de la oxigenasa (aumento de k). El triptófano, sin embargo, no ejerce efecto sobre k, pero abate be, estabilizando la oxigenasa respecto a la digestibn proteolitica. Estos dos casos contrastan con la inducción enzimática en las bacterias. En el caso de Ia arginasa, el incremento en la ingesti6n de ni- trhgeno por una dieta abundante en proteinas puede elevar las cifras hepáticas de arginasa (capitulo 3 1). El aumento en Ia velocidad de síntesis de la arginasa se parece así, superficialmente, a la induccibn por sustrato en las bacterias. En el caso de la triptdfano pirrolasa, sin embargo, aun cuando el triptbfano puede

actuar como un inductor en las bacterias (afecta k,), su efecto en los marniferos sc qjerce solamente sobre el proceso degradante (abate kd,,).

Los valores enzimaticos en los tejidos de marniferos pueden ser alterados por una amplia gama de factores fisiologicos, hormonales o dietéticos. Se conocen ejemplos para una diversidad de tejidos y vias metabólicas, pero nuestro conocimiento es frag- mentario acerca de los detalles molecularec que intervienen para producir estos cambios.

Los glucocorticoides incrementan Ia con~entración de tirosina trancaminasa estimulando su k,. Este fue el primer caso cSaro de una hormona reguladora de la sintesis dc una enzima de mamíferos. La insulina y cl glucagbn, no obstante sus cfectos fisiológicos mu- tuamente antagbnicos, incrementan k,, de manera independiente, de 4 a 5 veces. El efecto del glucagón probablemente es mediado a través del cAMP.

La síntesis de ciertas enrimas como precursores inactivos tienen ventajas en la regulación

La actividad enzimatica puede regularse con la con- versión de una proenzima inactiva a la forma catalítica activa. Para volverse catallticamente activa, la proenzima debe experimentar una proteólisis limitada, un proceso acompañado de cambios en la conformación que revelan o "crean" el sitio catalítico. Esto se mostrara después en relacibn con la enzima quimotripsina.

MUCHAS PROTEASAS SE SECRETAN COMO PROENZIMAS SIN ACTIVIDAD CATAL~TICA

Ciertas proteinas se elaboran y secretan en forma de proteinas precursoras inactivas conocidas como pro- proteínas. Cuando son enzimas, las proproteinas se denominan proenzimas o cimógenos. La conversion de una proteína en proteina madura implica la pro- teólisis selectiva, proceso que convierte la proproteina en una forma que tiene la actividad típica de la proteina madura (su actividad enzimfitica} mediante uno o más "cercenamientos" proteoliticos sucesivos. Los ejemplos de proteinas elaboradas como proproteinas incluyen la hormona insulina (proproteina = profn- sulina), las enzima5 digestivas pepsina, tripsina y qui- motnpsina (proproteínas = pepsindgeno, tripsindgeno y quimotripsinógeno, respectivamente), varios factores de la cascada de la coagulacibn sanguínea y de la disolución del cohgulo (capitulo 59), y la proteina cotágena del tejido conjuntivo (proproteina = proco- Iágena}.

La conversibn de proquimotripsina (pro-QT), polipéptido de 245 residuos aminoacilo, en la enzima alfa quimotripsina activa implica tres cercenamientos y la formación de un intermediario activo conocido como piquimotripsina (pi-QT) (figura 1 1-3).

En la alfa quimotripsina las cadenas A, B y C permanecen integradas en virtud de la presencia de dos enlaces disulfuro entre las cadenas (figura 1 1 4 ) .

Las proenzimas facilitan la movilización rápida de una actividad en respuesta a la demanda fisiológica

¿Por qu$ cicrias proteínas se secretan en la forma inactiva? Algunas son necesarias practicamenlc en todo momento, mientras que otras (como las enzimas de la fomacidn y disolucilin del coágulo sanguíneo) se requieren sólo de manera intermitente. Más aún, cuando estas últimas se necesitan de urgencia, Ciertos procesos flsiologicos como la digestión son inter- mitentes, pero bastante regulares y predecibles (aunque éste pudo no ser el caso para los seres humanos primitivos). Otros, como la formacibn y disolución de coágulos sanguíneos y la reparación tisular, tan rolo deben estar "en Iinea", para responder a la presibn de una necesidad fisiológica o fisiopatológica.

Puede apreciarse con facilidad que el proceso de formación y disoluci6n de coágulos sanguíneos debe ser coordinado en el tiempo para alcanzar Ia homeostasia. Además, la sintesis de proteasas como proteinas precursoras sin actividad catalítica sirve para proteger el tejido de origen (por ejemplo, el pfincreas) de la autodigestibn, lacual puede presentarse en lapancrea- iitis. La sintesis de nuvo de las protehas que se requieren puede no efectuarse con la rapidez suficiente para responder a la presión de una demanda fisiopa- tolégica como es la pérdida de sangre. Más aun, debe

estar disponible un conjunto completo de los aminohcidos precursores. Como consecuencia, cl proccso de secrecidn puede ser de lentitud relativa con relación a la demanda físiológica.

La activación de la proquimotripsina requiere de proteolisis selectiva

El e.jernplo de conversihn de una proproteína a s u forma madura con actividad fisiológica ejernplifica los principios generales siguientes de tal conversión:

1) El proceso implica la proteblisis selectiva que, en algunos casos, sb10 requiere un cerce- namiento proteolítico Único.

2) Los productos polipéptidos se pueden separar o permanecer integrados a la proteína madura.

3) El proceso puede (o no) cumplirse con cambio significativo en el peso molecular.

4) La principal consecuencia de la proteólisis selectiva es alcanzar una nucva conformación.

5) Si la proproteína es una enzima, el cambio men- cionado en Ta conformación origina el sitio catalítico de la enzima. En taI virtud, la proteolisis selectiva de una proenzima puede verse como un proceso que desencadena cambios esenciales en la conformación que "crean" el sitio catalitico.

Obskrvese que mientras His 57 y Asp 102 se encuentran sobre el peptido B de la alfa quimotripsina, Ser 195 se encuentra sobre el peptido C (figura 1 1-3). La proteblisis selectiva de la proquimotripsina (qui- motripsinógeno) facilita la aproximación de los tres residuos del sistema relevador de carga, lo cual muestra la manera en que la proteólisis selectiva da lugar al sitio catalítico. Nótcse que el contacto y los residuos

Figura 11 3. Convessi611 de la proquimotripsina {pro-QT) a pi-quimotflpsina (pi-QT) y de manera subsecuente a la enzima madura alfa quimotripsina (alfa-QT) con actividad catalitica.

S - S S-C S- S

Flgura 1 1 4 Enlaces de disulfuro intra e tntercadenas de la alfa quirnotripsina (alfa-QT).

cataliticos pueden localizarse sobre diferentes cade- describe la función de los "mecanismos de lanzadera" nas de péptidos, pero mantenerse a una distancia que para poder lograr el equilibrio de Ias confluencias permita formar enlaces con el sustrato enlazado. metabblicas dc equivalentes reductores, del ciclo del

hcido cltrico y de otros intermediarios anfibólicos.

EXISTEN MÚLTIPLES OPCIONES PARA REGULAR LA ACTIVIDAD LAS ENZIMAS PUEDEN FORMAR CATAL~TICA COMPLEJOS MACROMOLECULARES

Si una modificacibn fisiológica altera el grado de la actividad enzimatica, se puede preguntar si la cantidad de enzima ha cambiado o si la enzima es un catalizador más o menos eficaz. A todos los cambios de la actividad enzimatica sin modificación de la cantidad de enzima presente se les denominara como "efectos en la eficacia catalítica".

LA SEPARACIÓN DE ENZIMAS EN COMPARTlMlENTOS FACILITA LA REGULACI~N DEL METABOLISMO

No se puede pasar por alto la importancia de la dis- posicidn en compartimientos de Tos procesos metabh- licos en las ct5lulas eucariotas, que incluyen las de los mamíferos. La IocaZización de los procesos metabólicos especificas en el citosol o en los organelos subcelulares facilita la regulación de estos procesos independientemente de los que suceden en otras partes. La extensa formación de compartimientos de los procesos metabolicos tipicos de las formas superiores de vida confiere asi el potencial para un ajuste fino de la regu- lación del metabolismo. Al mismo tiempo, plantea problemas con respecto a lamovilizacion de metabolitos a través de las barreras de los compartimientos. Estos metabolitos pasan las barreras mediante "mecanismos de lanzadera", que convierten el metahlito en una forma permeable para la barrera del compartimiento, lo cual va seguido por el iransporte y la conversión a la forma original en el otro lado de la barrera. En cen- secuencia, estas interconversiones requieren, por ejemplo, formas citosólicas y mitocondriales de la misma actividad catalítica. Puesto que estas dos formas de la enzima están fisicamente separadas, su regu- lación independiente se facilita. En el capitulo 18 se

La organización de un conjunto de enzimas quecatalizan una secuencia de reacciones metabhlicas, coordina a las enzimas y a los canales intermediarios a lo largo de una via metabdlica. La alineacibn apropiada de las enzirnas puede facilitar la transferencia del producto entre las enzimas sin equilibrio previo con las confluencias metabblicas. Esto permite un modo más fino de control metabólico que el posible con los componentes aislados del complejo. Además, los cambios de confomacl6n en un componente del complejo puede transmitirse por interacciones de proteína con pro- teína hacia otras ennimas del ~omple~jo. De este iriodo es posible laamplificacion de los efectos reguladores.

LAS CONCENTRACIONES LOCALES DE SUSTRATOS, COENZIMAS Y CATIONES PUEDEN REGULAR LAS ENZIMAS

La concentracién intracelular media de un sustrato, una coenzima o un ion methlico puede tener escaso significado para el camportamiento rn vivo de una enzima. Es necesaria la informaci6n sobre las concentraciones de metabolitos esenciales en la vecindad inmediata de la enzima en cuestibn. Sin embargo, aun la medicibn de las concentraciones de metabolitos en compartimientos celulares diferentes no toma en cuenta las discontinuidades locales en su concentraci6n dentro de los compartimientos, causadas por factores como la proximidad al sitio de entrada o de producción de un metaboiito. Por último, generalmente se le da poca importancia a la discrepancia entre la concentracibn total y libre del metabolito. Por ejemplo, aunque la concentración total del 2,3-difosfoglicerato en los eritrocitos es extremadamente alta, la concentracidn

Enzimas: regulucidn de actividades 1.25

libre de bisfosfoglicerato (es decir, no unida a la h e m e globina) es comparable a la de otros tejidos. Considera- ciones semejantes se aplican a otros metabolitos en presencia de proteínas que los fijan de modo eficaz y que reducen su concentracibn en estado libre.

Una hiphtesis del enfoque cinético de Michaelis- Menten es que la concentración del sustrato total es igual en esencia a la concentración del sustrnto libre. Como se anot6, esta suposicibn puede no ser vilida in vivo, donde es posible que las concentraciones de los sustratos libres se aproximen a las de la concentracibn de enzimas.

Los iones metálicos que desempefian funciones catalíticas y estructurales en mas de una cuarta parte de todas las enzimas conocidas (capitulo 103, pueden tener tambien funciones reguladoras particularmente en las reacciones en que el ATP y otros polianiones son sustratos, Se observa la tlpica actividad mhxima cuando el cociente molar de ATP a metal es casi la unidad. El exceso de metal o de ATP son inhibitorios. Dado que los di y trifosfatos de nucleósidos forman complejos estables con los cationes divalentes, Ias concentraciones intracelulares de 30s nucle6tidos pueden influir sobre las concentraciones intracelulares de los iones methlicos libres y, por tanto, la actividad de ciertas enzimas.

CIERTAS ENZIMAS SON REGULADAS POR EFECTORES ALOSTÉRICOS

La actividad catalítica de ciertas enzimas reguladoras es controlada por efectores alostericos de peso molecular bajo que por lo general tienen poca o ninguna seme- jan72 estructura1 con los sustratos o coenzimas para la enzima reguladora. La inhibición por retroalimentacibn se refiere a la inhibición de la actividad de una enzima inicial en una vía biosintktica, por medio de un producto final de esa vía. Para la biosíntesis de D a partir de A, catalizada por las enzimas En21 a Enq,

Enzi EUQ Eny

A + B + C - + D

una concentraci6n alta de D, inhibitii de manera típica la conversion de A en B. Esto no implica un simple "retraso" de los intermediarios sino la capacidad de D para unirse a Enzl e inhibirla. Asi, D actúa como un efector alostérico negativo o inhibidor por retroali- mentacihn de Enz,. Por tanto, la inhibicidn por retroalimentaci6n de Enzl mediante D regula la slntesis de D. De manera tlpica, D se une a la enzima sensible en un sitio alost4rico remato del sitio catalítico.

La cinetica de la inhibición por retroaccion puede ser no competitiva, competitiva, parcialmente compe-

titiva, no acoplada o mixta. Es la más común en tas vias biosinttticas. Frecuentemente, el inhibidor por retroacciones es la ultima molkcula pequefia antes de una macromol~cula (por ejemplo, arninohcidos antes de proteínas o nucleótidos antes de ácidos nucleicos). La regulacibn por retroacción tiene Iugar generalmente en el paso mhs temprano, funcionalmente irreversible*, que es exclusivo para una serie bia- sintética particular. Un ejemplo muy estudiado es la inhibición de aspartato transcarbamilasa bacteriana por CTP (véase después y capitulo 36).

Frecuentemente, una ruta biosintkticapuede estar ramificada, sirviendo la porción inicial para la síntesis de dos o mBs metabolitos esenciales. La figura 1 1-5 muestra los sitios probables de inhibición por setroac- ción simple en una vía biosintdtica ramificada (por ejemplo, para aminoácidos, purinas o pirimidinas). Los Si, S2 y S3 son precursores de los cuatro productos finales (A, B, C y D). El S4 e5 un precursor de B y C y S, es precursor únicamente de D; de este modo, las secuencias:

constituyen sucesiones de reacciones lineales de las que puede esperarse sean inhibidas por sus productos finales. De nuevo, la biosintesis d e nucleotido (capitulo 36) proporciona ejemplos especificas.

Circuitos múltiples de retroalimentación regulan vías biosintéticas ramificadas

Múltiples asas de retroalimentación (figura 3 1 4) proporcionan control fino adicional. Por ejemplo, si B se encuentra en exceso, disminuye el requerimiento de S. La capacidad de B para disminuir la producción de S2 confiere asi una ventaja biolbgíca. Sin embargo, si el exceso de B puede inhibir no 5610 la porción de la vía particular de su propia síntesis, sino tambitn porciones comunes a la de la síntesis de A, C o D, un exceso de B deberá reducir la síntesis de los cuatro productos finales. Claramente esto es indeseable. Sin embargo, existen mecanismos para evitar esta dificultad.

En la inhibicidn por retroalimentación acumulativa, el efecto inhibidor de dos o mhs productos finales sobre una sola enzima reguladora es estrictamente aditivo.

* Uno favorecido fuertemente (en terminos termodinami- cos) en una sola dirección, esto es, uno con un gran AG negativo

(Capítulo 11)

Flgura 11 -5. Sitios de inhibicibn por cetroalimentaubn en una via biosintética ramificada. SI o S5 son intermediarios en la biosintesis de los prcdudos finales R a D, las flechas rectas representan las entimas que catalizan las conver- siones indicadas. Las flechas curvas representan asas de relroalimentacibn e ~ndican los sitios probables de inhibicibn por retroalimentación medlante productos finales esnecificos.

En la inhibici6n por retroalimentación concertada o multivalente, la inhibicibn completa se produce sólo cuando dos o más productos finales están presentes en exceso.

En la inhibición por retroalimentación cooperativa, un solo producto final presente en exceso inhibe la enzirna regladora, pero la inhibición que se observa cuando se encuentran dos o m& productos finales excede, con mucho, a los efectos aditivos que se ven en la inhibición por retroalimentación acumulativa.

La enzima alosterica más estudiada es la aspartato transcarbamilasa

La aspartato transcarbamilasa (ATCasa) cataliza la primera reaccibn peculiar a Ea biosintesis de las pirimidinas (figura 1 1-7). La ATCasa es inhibida por retroacción mediante el trifosfato de citidina (CTP,

Figura ll4. lnhibicibn milltiple por retroalimentacidn por una via ramificada biocint&titica. Sobrepuestas a las asas de retroalimentación simple (flechas curvas de guiones) estfin las asas de retroalimentacidn múltiples (flechas curvas eon- tinuas) que regulan las enzirnas comunes a la biosíntesis de varios productos finales

del ingles, cyfidine triphosphate}. Después del tratamiento con compuestos mercuriales, la aspartato transcarbamilasa pierde su sensibilidad a la inhibicion por el CTP, pero retiene su actividad completa para la slntesis del carbamilaspartato. Esto sugiere que el CTP esta unido a un sitio (alostérico) diferente del de cada sustrato. La ATCasa consiste en múltiples protómeros cataliticos y reguladores. Cada protómero catalitico contiene cuatro sitios aspartato (sustrato) y cadaprotbmero regulador por lo menos dos sitios CTP (reguladores}.

Los sitios catalíticos y alostéricos muestran diferencia espacial

Monod observ6 la falta de semejanza estructural entre el inhibidor por retroalimentacibn y el sustrato para la enzima cuy a actividad regula. Dado que los efectos no son kocstéricos con un sustrato, sino alostéricos (ocupan otro espacio), este investigador propuso que las enzimas cuya actividad es regulada por efectores aIost&ricos (por ejemplo, los inhibidores por retroalimentacidn) fijan el efector en un sitio alostérica físi- camente distinto del sitio catalítico. Las enzimas alostdricas son, pues, enzirnas cuya actividad en el sitio catalítico puede ser regulada por la presencia de efectores en un sitio atostérico. Varias pruebas apoyan

Carbami'- + L-Aspartato fosfato

O - II

o-C,

HzN CHP I C

I H c ' 4 \

o H COO -

Figura 11-7. Reacción de la aspartato transcarbamilasa (ATC a sa) .

Emimus: regulación de actividades 127

la existencia de sitios alosttricos fisicamente distintos en las enzimas reguladas; entre ellas está la siguiente:

1 ) LE. eenzirnas reguladas, modificadas portkcnicac químicas o fisicas apropiadas, frecuentemente se vuelven insensibles a sus efectores alostkri- cos sin alteración de su actividad catalítica. La desnaturalización selectiva de los sitios alostéri- cos ha sido lograda mediante tratamiento con derivados del mercurio, con urea, rayos0X, enzima proteoliticas, fuerza ilinica o pH exm- mos. envejecimientode O a 5 "C opor congelación o calentamiento.

2) Lo efectos alostéricos frecuentemente protegen el sitio catalitico de la desnaturalización en condiciones en las cuales los propios sustratos no lo hacen. Dado que parece inverosfmíl que un efector unido al sitio catalitico proteja cuando no lo hacen los sustratos, esto sugiere un segundo sitio alostérico en cualquier otra parte de la molkcula enzirnAtica.

3) En ciertas células mutantes, bacterianas y de mamíferos, las propiedades para ia regulacion de las enzimas reguladoras tienen modificadas sus propiedades para la regulacidn, pero sus propiedades catalíticas son idénticas a las del tipo nativo de donde deriv6 la mutante. Así, la estructura de Ios sitios alost&ricos y catalitica son geneticamente distintos.

4) Los estudios sobre uni6n de sustratos y de efectos alost&ricos a las enzima5 reguladas muestran que cada uno se puede unir independientemente del otro.

S) En ciertos casos (por ejemplo, ATCasa), el sitio alostkrico se halla colocado en un protómero diferente al que posee el sitie catalitico.

Las enzírnas alostericas por lo general muestran una cinética sigmoidea de saturación con sustrato

En la figura 1 1-8 se muestra la velocidad de reaccibn catalizada por una tipica enzima alosttrica medida a varias concentracianes del sustrato, en presencia y ausencia de un inhibidor alostdrico. Cuando este último falta, se observa una cindtica de saturacidn hioerbólica normal. En su presencia. la curva de sahraciiin por sustrato es dis&rsionada de una hipdr- bola a una curva sigmeidea, que a concentraciones altas de sustrato puede coincidir con su forma hiper- bdlica. Nótese la analogía de la relacion con las curvas de saturación de 0 2 de la rnioglobina y la hemoglobina (capitulo 7).

El anhlisis cinktico de la inhibicibn por remalimen- taci6n parece ser competitivo, no competitivo, pmcial- mente competitivo de otros tipos. Si aconcentraciones

Figura 11-8. Curva sigmoide de saturación para el sustrato en presencia de un inhibidor alostérico.

elevadas de S, hay actividad comparable en presencia o ausencia del inhibidor aIostkrico, la cindtica superficialmente se parece a la de una inhibicibn competitiva. Sin embargo, dado que la curva de saturacibn por el sustrato es sigmoide y no hiperbólica, no es posible obtener resultados significativos graficando los datos para la inhibicibn alostérica por la tkcnica del doble recíproco. Este método de análisis fue elaborado para la inhibicibn competitiva con el suskato en el sitio catalítico. Puesto que los inhibidores alost&ricos actúan en un sitio diferente (alóstérico), el modelo cinético ya no es válido.

El carácter sigmoide de la curva de v respecto a [S] en presencia de un inhibidor alostérico, refleja el fenómeno de cooperatividad. A bajas concentraciones de sustrato, la actividad en presencia del inhibidor es baja con relacibn a la que se observa en su ausencia. Sin embargo, cuando [S] aumenta, el grado de in- hibición se vuelve m e w s intenso. Estas cinéticas son congruentes con la presencia de dos o más sitios de uni6n de sustrato que actuan reciprocamente, donde la presencia de una molécula de sustrato en un sitio catalitico facilita la unión de una segunda molkcula del mismo en un segundo sitio. La cooperatividad de la fijacibn del sustrato se describid en los capitulos 7 y 9: la curva sigmoide de saturación de Oz se forma a consecuencia de las interacciones cooperativas entre cuatro sitios de fljacj6n de oxígeno que se localizan en los diferentes protbmeros de hemoglobina y en el uso de la escala de Hill para cuantificar la cooperatividad.

(Capítulo I 1)

Los efectos alostéricos pueden ser en Km o sobre Y,,,

La referencia a fa cinktica de la inhibición como "competitiva'k ''no competitiva" respecto al sustrato lleva implicaciones mecanicistas que son desorien- tadoras. Es preferible referirse a dos amplias clases de enzimas reguladas, las de la serie K y las de la serie V. Para !as mzimas alostkricas de la serie K, la cinética de saturacibn por sustrato es competitiva en el sentido de que Km se eleva sin efecto alguno sobre Vmk. Para las enzimas de la serie V el inhibidor alostdrico abate V,, sin afectar la Km aparente. Probablemente las alteraciones en Km o en V,, resultan de cambios conforma- cionaies en el sitio catalitico, inducidos por Ia fijacion del efector alostérico en el sitio alostérico. Para una enzima alostérica de la serie K, este cambio en la conformación puede debilitar los enlaces entre el suctrato y los residuos que se fijan a &l. Para una de la serie V, es posible que el efecto primario sea alterar la orientacion o la carga de los residuos cataliticos, de modo que V,,, disminuya. Sin embargo, se pueden observar efectos intermedios sobre Km y Y,,, conse- cutivos a estos cambios en la confomacibn.

La fijación cooperativa de un sustrato confiere una ventaja fisiológica

Las ventajas de la cinCtica de fijación cooperativa de3 sustrato son anklogas a aquetlas que se producen por la fijación cooperativa del O? a Ia hemoglobina. h concentraciones bajas de sustrato, el efector alostérico es un inhibidor eficaz. De este modo, la regulación es más eficiente en el momento en que la necesidad es máxi- ma, es decir, cuando la concentración intracelular de los sustratos es baja. Si se comienza a disponer de más sustrato, entonces es menos necesaria una regulación rigurosa. Cuando la concentración del sustrato se eleva, el grado de inhibicion disminuye y se formauna cantidad mayor de producto. Al igual que con la hemoglobina, la curva sigrnoide de saturacion del sustrato en presencia del inhibidor también asegura que cambios relativamente pequefíos en la concentraci6n del sustrato ocasionan grandes modificaciones en la actividad. Asl, se logra un control sensible de la actividad catalitica mediante cambios pequefios en la concentración del sustrato. Finalmente, por analogla con las diferencias en l a curvas de saturacion de 01 de hemoglobinas de diferentes especies, las enzimas reguladoras de orígenes distintos pueden tener curvas sigmoideas de saturacibn desplazadas a la izquierda o a la derecha para acomodarse a los llmites de las concentraciones de sustrato que prevalecen in vivo.

LA REGULACIÓN POR RETROALIMENTACI~N, NO ES SINÓNIMO DE INHIBICIÓN POR WETROALIMENTACIÓN

En ambas clases de ctlulas, de mamíferos y bacterianas, los productos finales retroalimensan y controlan su propia síntesis. En muchos casos, esto involucra la inhibicibn por retroalimentacibn de una enzima bio- sintCtica inicial. Sin embargo, se debe distinguir entre regulacibn por retroalimentaci6n, un termino feno- menol~gico exento de implicaciones mecanísticas, e inhibición por retroalimentación, un mecanismo para fa regulación de numerosas enzimas bacterianas y de mamíferos. Por ejemplo, el colesterol de la dieta restringe la sintesis de1 procedente de acetatos en los tejidos de los mamíferas. No obstante, esta regulación al parecer no hace intervenir a la inhibicibn por retroalimentacidn de una enzima inicial de la biosintesis del ~olesterol. Una enzima inicial (HMG-COA reductasa) es afectada, pero el mecanismo comprende la interrupción de la expresibn de los genes que codifican para la formacibn de la HMG-Coh reductasa mediante el colesterol o un metabolito derivado de él. El colesterol agregado directamente a la HMG-COA reductasa no tiene efecto sobre su actividad catalitica.

LA MODIFICACIÓM COVALENTE REVERSIBLE REGULA ENZIMAS ESENCIALES DE MAM~FEROS

La modulacibn reversible de laactividad catalitica de las enzimas puede producirse por la adherencia covalente de un grupo fosfato a uno o mhs residuos Ser, Tri, Tir o His. Las enzimas que experimentan modificacibn covalente con regulacilin concomitante de su actividad se denominan "enzimas interconvertibles". Las enzirnas interconvertibles existen en dos condiciones de actividad, una de eficacia catalítica elevada y otra de baja eficacia. Dependiendo de la enzima de que se trate, el catalizador más activo puede ser la fosfoenzima o la que no posee grupo fosfato (cuadro 1 1-1).

Las enzirnac pueden tener numerosos sitios de fosforilación

Un residuo seril especifico es fosforilado, formando el O-fosfoseril o un residuo tirosil es fosforilado para formar el residuo O-fosfotirosil. Aunque una enzima interconvertible puede contener muchos residuos Ser o Tir, la fosforilación es sumamente selectiva y se produce s61o en un pequefio nUmero de sitios posibles. Probablemente estos sitios no f m e n parte del sitlo

E m i m m : reqialacihn de actividades 129

" >

Cuadro 1 1-1. Ejemplos de enzimas dc mamíferos cuya actividad catalítica está alterar'-

acihn-de! - -

La fosforilacion-desfosforilación consume ATP

Las reacciones de la figura 1 1-9 se parecen a las de la interconversión de gIricasa y gIucosa 6-fosfato o de fructosa-6-frrsfato y fnictosa- l,6-difosfato (capitulo 1 4). El resultado neto de la fosforilaci6n y luego de la desfocforilación de 1 m01 de sustrato (enzima o azúcar) representa la hidrálisis de 1 mol de ATP. Las actividades de Ias cinasas, que catalizan las reacciones 1 y 3 (abajo), y de lac fosfatasas, que catalizan las reacciones 2 y 4, deberhn, en sí mismas, ser reguladas, porque de otra manera podrian actuar juntas para catalizar de modo incontrolable la hidrolisis del ATP.

-

A< GI

HMG-COA ri

t I'iruvalo deshrdrogcnasr f

Glucbpcno fc Citratoliiisii l'cisforil¿isn b L I I I ~ M

IIMG-COA reductnsa cinnsa -- E. dcslosforocn7ima; EP, fosfuenzimn.

izime

,arboxilasa ntasa

Rnjo

11.P 1.; 1'

Alto

catalítico, ciiando menos en lo que se refiere a la ,- * ATP + ADP + Glucoca-fi-P estructura. primaria, por lo cual constituyen otro ejern- plo de iin sitio alosterico. 2. HzO + Glucosa-6-P + Pi + Glucosa

Las prateinas cinasas y las fosfatasas son proteinas convertidoras

Neto: HzO + ATP + ADP * Pi

3. Enz-Ser4i-I + ATP + ADP * E n z 4 e r 4 - P La fosforilaci0n y la desfosforilacion son catalizadas por una variedad de proteínas cinasas y proteina fosfatasa (proteinas ctinvertidoras), respectivamente (figura I 1-9). l.a capacidad de estas proteínas cfnasac para reconocer figuras o patrones distintivos de la estructura primaria esta relacionada en parte, con su alta especificidad. En casos especificas, las mismas protefnas convertidoras pueden ser enzimas converti- bles (cuadro 1 1 -1 ). De este modo hay proteína cinasa y prcrfeina cinasa fosfatasa que catalizan la intercon- versicin de estas ~roteinas convertidoras. Las tiruebas

4. HzO + Enr-Ser-O-P -+ Pi + E n z 4 e r 4 H --- Neto: H2O + ATP 4 ADP + Pi

La modificación covalente regula el flujo del metabolito

de que las proteha fosfatasa sean proteínas interconvertibles son menos convincentes, aunque su actividad es regulada. La actividad de la proteina cinasaestli regulada y, lo mismo que la de la proteina fosfatasa, csth baja control hormonal y neurolbgico, si bien los detalles precisos por los cliales estos agentes actúan están lejos de ser claros en la mayor parte de los casos.

La regulación de la actividad enzimática por medio de la fosfori lación-desfosfori lación tiene analogías con la regulacion mediante la inhibicibn por retroalimentaci~n. Ambas proporcionan una regulación a corto plazo, fhcilmente reversible, del flujo de metabolitos en respuesta a señales fisioldgicas específicas; actúan sin alterar la expresión gendtica; actúan cobre enzimas tempranas de una prolongada secuencia metabólíca (a meniido biosintética} y en los sitios alostéricos más que en los cataliticos. Sin embargo, la inhibición por retroacciiin incluye a una sola proteina y carece de las caracteristicas hormonales y neuroIógicas. Por el contrario, la regulación de las enzimas de los marniferos por fosforilacilin- desfosforil ación comprende a varias proteinas y ATP estk bajo directo control hormonal y ncurol6gica.

ATP ADP

RESUMEN

La regulaciiin de la actividad enzimática contribuye en gran parte a preservar la homeostasia que mantiene

Figura 11 -9. Modificacibn covalentede una enzima regulada por la focforilación-desfosfonlacibn de un residuo ser11

1311 Bioquímiea de Hurper

un entorno intracelular e intraorganismo relativamente constante en presencia de arnpl iaq fluctuaciones en el medio ambiente externo (como cambios de temperatura, presencia o ausencia de agua o tipos específicos de alimentos). Para lograr la homeostasia, las velocidades de numerosas reacciones bioquímicas deben responder a la necesidad físiolbgica. ¿Cómo se logra este propósito?

Las concentraciones locales de sustrato, Ia separacibn de enzimas en compartimientos y la secrecibn como proenzimas o cimiigenos (por ejemplo, quimotripsina) sin actividad catalitica, contribuyen a la regulacibn de los procesos metabólicos. Muchas proteasa y otras proteinac se secretan como propro- teínas biol6gicamente inertes que deben someterse a un desprendimiento proteolitico selectivo para formar una enzima u hormona con actividad biológica. Los ejemplos incluyen quirnotripsina, insulina y las proteasas de las cascadas de la formacibn y disolucibn de los coagulos sanguíneos. La secrecibn, como precursor inactivo, protege contra su acci6n hasta que surge la necesidad, al mismo tiempo que facilita la movilización rhpida de una actividad sin que se requiera nueva sintesis de la proteina. Uno o más procesos proreoliticos desencadenan cambios en la conformación, los cuales aproximan y alinean 30s residuos previamente distantes para formar el sitio catalítico. Los pkptidos que se forman por la proteblisis selectiva pueden descartar- se (qjernplo, dos dipéptidos de QT) o pueden permanecer unidos mediante enlaces disulfiro (los peptidos A, B, y C de la QT y las cadenas A y B de la insulina).

Además, las alteraciones rhpidas y minimas en la actividad catalitica de enzimas clave reguladas tienen funciones importantes en la canalizacibn selectiva de metabolitos hacia uno u otro proceso metabólico. Las enzimas reguladas tienden a ser aquellas que catalizan una reaccibn inicial única (con frecuencia la primera) de una secuencia detenninada de reaccionw metaMlicas. La actividad catalitica de las enzimas reguladas puede modularse (por qjernpto, cambios repetidos entre estados bajo y alto de actividad catalitica) cuando no hay nueva síntesis ni degradaciiin proteinica. La modu-

lacibn se logra cuando metabolitos específicos se fijan a la enzima regulada, en general a sitios (alost&rfcoc) bastante separados del sitio catalitico. La modulación de la actividad enzimbtica por cambios en la confor- mación del sitio catalitico puede incluir la alteración de Km para un sustrato, de V,,, para la reacción global o efectos sobre los dos, Km y V,,. A menudo, las curvas de saturacibn de sustrato para la inhibición aIostéríca son sigmoideas, por lo cual no se aplica la ecuación de Michaelis-Menten. La evaluacibn cuan- titativa de la cooperatividad de las enzimas alostericas utiliza la ecuacicin de Hill. Para procesos biosintéticos, la inhibicibn por retroalimentaciOn incluye metabo- iitos reguladores, que se encuentran en la biocintesis "corriente arriba" de la enzima regulada (por ejemplo, inhibición de la aspartato transcarhomilasa por CTP). En secuencias de reacciones catabólicas, metabolitos "corriente abajo en la biodegradacion" de la enzima en cuestibn actúan como reguladores (como la inhibición de fosfofructocinasa por ATP o citrato). Cuando más de un metabolito puede regular por retroalimentación a una enzima dada, la accion de estos metabolitos reguladores múltiples puede ser acumulativa, cooperativa o multivalente. Adernris, un metabolito dado puede regular la actividad de varias enzimas, cada una de ellas única para una secuencia particular de reacciones rnetabálicas (asas múltiples de retroalimentacibn).

En el ser humano y otros eucariotes, la actividad de numerosas enzimas es regulada por modificacibn covalente, siendo la forma más cornun la fosforilacibn dependiente de ATP con elirninaci6n hidrolitica de fosfato como ortofosfato inorgánico. La fosforilación selectiva y la desfosforilaciiin subsiguiente, cn parlicular de residuos específicos de Ser o Tír, son catalizados por proteínas cinasas y proteínas fosfatasas (cnzimas convertidoras). A su ve& la actividad de estas en7imas convertidoras puede ser regulada. Por tanto, la enzima blanco y sus enzimas convertidoras pueden constituir una porcibn de una cascada reguladora que responde a una sefial disparada por una hormona o por un segundo mensajero como cAMP. II

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