TATIANAMONTOYAGARCÍA

UNIVERSIDADDESEVILLA

FACULTADDEFARMACIA

EFECTO ANTIINFLAMATORIODE LA OLEUROPEÍNA ENCÉLULASSW982

FacultaddeFarmacia

DepartamentodeFarmacología

UniversidaddeSevilla

TrabajoFindeGradoExperimental

GradoenFarmacia

EFECTOANTIINFLAMATORIODELAOLEUROPEÍNAENCÉLULASSW982

Realizadopor:TatianaMontoyaGarcía.

Dirigidopor:CatalinaAlarcóndelaLastraRomero.CatedráticadeFarmacología.

FacultaddeFarmacia,Sevilla.

7dejuliode2016

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RESUMEN

Introducción: La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica

crónicadeetiologíaautoinmunecaracterizadaporunasinovitiserosivaenlacualeltejidode

granulación de origen sinovial (pannus), invade y erosiona el cartílago y el hueso de las

articulacionesdiartrodiales.Losfibrobalstossinoviales(FS)osinoviocitosdetipofibroblástico

jueganunpapelfundamentalenlapersistenciadelainflamacióncrónicayeneldañoarticular,

siendounasdelaspoblacionescelularesmásabundantesdelpannus.

Laoleuropeína(OLE)esunsecoiridoide,componentefenólicomayoritariodelapulpadelfruto

y hojas de Olea europaea L. y, que a su vez, se encuentra en el aceite de oliva. Se han

documentado diversas actividades farmacológicas del citado secoiridoide, entre las que se

destaca la antioxidante y antiinflamatoria. No obstante no existen, hasta la fecha, estudios

experimentalesenfibroblastoshumanosquevalidensupotencialantirreumático,asícomolos

mecanismosbioquímicosymolecularesimplicados.

Objetivos:EsteestudiopretendeevaluarelefectoantiinflamatoriodeOLEenlalínea

celularSW982 inducidacon IL-1β,medianteelanálisisde laproducciónde laproducciónde

mediadorespro-inflamatorios,asícomo,lasvíasdeseñalizacióninvolucradas.

Materiales ymétodos: LascélulasSW982 fueroncultivadasenDMEMyestimuladas

con IL-1β (5 ng/mL) en presencia o ausencia deOLE (50 y 100 μM). La viabilidad celular se

determinó mediante un ensayo con sulforrodamina B (SRB). Los niveles de TNF-α e IL-6

fueronevaluadosporlatécnicaELISA.LaexpresióndelasproteínasinflamatoriasCOX-2ym-

PGES-1y,estudiodelasvíasdeseñalizacióncelularfueronllevadosacabomedianteWestern

blot.

Resultados:EltratamientoconOLEredujosignificativamentelosnivelesdeIL-6yTNF-

α, y además disminuyó la sobreexpresión de COX-2 y m-PGES-1. Este compuesto a las

concentraciones ensayadas fue capaz, además, de modular la activación de JNK y p38,

impidiendosufosforilación.

Conclusión:OLEreducelaproduccióndecitocinaspro-inflamatorias IL-6yTNF-αy la

expresiónproteícadeCOX-2ym-PGES-1,posiblementea travésde la inhibiciónde lavíade

señalizacióndeMAPK:PJNKyp38,enfibroblastossinovialeshumanosSW982estimuladoscon

IL-1β.

PALABRASCLAVE:Oleuropeína–inflamación–fibroblastosinovial–SW982

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ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓNYANTENCEDENTESDELTEMA……………………..3

§ Oleuropeína

§ Actividadfarmacológicadelaoleuropeína

II. JUSTIFICACIÓNYOBJETIVOS…………………………………………………17

III. METODOLOGÍA…………………………………………………………………….18

§ Oleuropeína:Extracciónycaracterizaciónquímica

§ Cultivocelular

§ Viabilidadcelular

§ Determinacióndecitocinas:IL-6yTNF-α

§ Determinacióndelaexpresiónproteíca

§ Evaluaciónestadísticadelosresultados

IV. RESULTADOS………………………………………………………………………..23

§ Efectosdelaoleuropeínaenlaviabilidadcelular

§ Efectosdelaoleuropeínaenlaproduccióndecitocinaspro-inflamatorias

Interleucina-6 (IL-6) y Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) en células

SW982

§ EfectosdelaoleuropeínasobrelaexpresióndeCiclooxigenasa-2(COX-2)y

ProstaglandinaESintasa1microsomal(m-PGES-1)encélulasSW982

§ Estudiodevíasdeseñalización

V. DISCUSIÓN………………………………………………………………….………28

VI. CONCLUSIONES…......………………………..………………….....…….....30

VII. ABREVIATURASYSIGLAS……………………………………….…………….31

VIII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..32

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INTRODUCCIÓNYANTECEDENTESDELTEMA

I. OLEUROPEÍNAA. Característicasquímicasydistribuciónenlanaturaleza

Laoleuropeína(OLE)esunglucósidosecoiridoideesterificadoconunalcoholfenilpropanoide.

En concreto esta sustancia esta constituida por la unión de tres moléculas: hidroxitirosol,

glucosayácidoenólico.Químicamente se conoce comounésterdeloleósido-11-metil-éster

(ácidoelenólicoglucosado)conel3,4-dihidroxifeniletanoló3,4-DHPEA(Figura1).

Figura1:Estructuraquímicadelaoleuropeína.

OLEesabundanteenlasfamiliasGentinaceae,Cornaleae,Oleaceae.Enestaúltimafamilia,el

secoiridoidesepuedeencontraryaislardenumerososgéneros,yhasidodescritaenFraxinus

americana L., F. excelsior L., F. chinenis Roxb., (Sanz y cols., 2012) Syringa pubescens

Turcz.(Deng y cols., 2010), S. josikaea J.Jacq. ex Rchb., S. vulgaris L., S. reticulata (Blume)

H.Hara.,(Biycols.,2011),LigustrumlucidumAit.(Guoycols.,2011),L.vulgareL.,L.ovalifolim

Hassk.,Philyrea latifoliaL.,entreotras(Soler-Rivas,2000).Sinembargo, lamáscomúnmente

conocidaeslaOleaeuropaeaL.(quedanombrealglicósido),siendoelcomponentefenólico

mayoritariodelapulpadelasaceitunasverdes,aunquetambiénlashojasdelolivocontienen

OLE como componente principal; asimismo, se puede encontrar en el aceite de oliva virgen

extra(AOVE),alquedasusaboramargo.

La rutadelácidomevalónicoes la responsablede la síntesisde los secoiridoides oleósidos

comoOLE.Estasrutasmetabólicassoncomplejasysepuedenverseafectadaspornumerosas

variables tales como la variedad del fruto, las condiciones del crecimiento y el estrés

ambiental,entreotros(Ryanycols.,2002).

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B. Variaciones cuali y cuantitativas en el contenido de oleuropeína en Olea

europaeaL.

Se han usado diversos métodos para analizar la presencia cualitativa y cuantitativa de

compuestosfenólicosysecoiridoides:desdetécnicassimplescomocromatografíadecapafina

(CCF),cromatografíaliquidadealtaeficacia(HPLC),cromatografíademasas-espectrometriade

masas (GC-MS) y electroforesis capilar (CE); y métodos sofisticados como Full Automatic

ModellingSystem(FAMS)otetrametilsilanoNMR,ionizaciónporelectrospray-espectroscopía

demasa(ESI-MS/MS)(Omar,2010).

El contenido de OLE varía según el origen, condiciones de cosecha, condiciones

meteorológicas, grado de humedad, sistema de procesado (secado y extracción), grado de

contaminacióndel suelo (Ahmad-Qasemycols.,2013),entreotros.Apesardeello,esen la

hoja donde este componente alcanza unmayor contenido que varía de 1% a 14%, frente a

0.005%y0.12%quepuedepresentarseenelaceitedeoliva(Tabla1).

Tabla1:Contenidodeoleuropeínaendiferentespartesdelolivo(Barbaroycols.,2014).

PartedelolivoContenidodeOleuropeínaReferencia

Hojas93-134mg/g(PS)Charoenpraserty

Mitchell,2012

6.1-13.3mg/g(PS)Savourninycols.,2001

5.6-9.2mg/g(PS)Ansariycols.,2011

34.0-38.1mg/g(PF)Tayoubycols.,2012

60-90mg/g(PS)MalikyBradford,2006

2.1-24.8mg/g(PS)Omar,2010

Ramas11-14g/kg(PS)AltinyayyAltum,2006

18.9g/kg(PS)Japón-Lujany

LuquedeCastro,2007

Raíces1.9-6.0g/kg(PS)Ortega-GarcíayPeragón,2010

Capullos15.7-58.4mg/g(PF)MalikyBradford,2006

Flores15.3-20.9mg/g(PF)MalikyBradford,2006

Aceitunas(fruto)2.5-8.9mg/g(PF)Ranalliycols.,2006

0.6-1.1mg/g(PS)Ansariycols.,2011

13.6-50.8mg/g(PF)MalikyBradford,2006

0.4-21.7mg/g(PS)Omar,2010

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1.3-5.8mg/g(PF)Bouazizycols.,2010

0.3-3.5mg/g(PF)Estiycols.,1998

Aceitunasdemesa0.0-0.1mg/g(PS)Omar,2010

0.0-0-5mg/g(PF)Zoidouycols.,2010

Aceitedeolivavirgen0.0-11.2mg/kgPerriycols.,1999

0.0-4.7mg/kgCaponioycols.,1999

2.0mg/kgTruckyHayball,2002

3.8mg/kgTuberosoycols.,2007

AceitedeolivaSedesconoceVisioliyGalli,2000

Pulpadelaaceituna0.4mg/g(PS)Kanakisycols.,2013

Aguaresidualdela6.5mg/g(PS)Goldsmithycols.,2014

moliendadelaaceitunaSedesconoceAlloucheycols.,2004

PS:Pesoseco/PF:Pesofresco

ElhechodequeOLEseamásabundanteencantidadenlashojasyfrutosjóvenes,esdebidoa

reaccionesquímicasyenzimáticasquetienen lugaren laplantadurante lamaduraciónde la

aceituna (De laTorre-Carbotycols.,2005).En la formacióndel frutodelolivo, sedistinguen

tresfases:unafasedecrecimiento,enlaqueseacumulaOLE;unafasedemaduraciónverde,

quecoincideconunareducciónenelniveldeclorofilayOLE;yunafasedemaduraciónnegra,

que se caracteriza por la aparición de antocianinas y durante la cual OLE continúa

disminuyendo.Así,el secoiridoideesmuyabundanteenestadostempranos;aunquemenor,

su nivel continúa siendo importante en la cosecha de cultivos verdes selectos. En cultivos

negros,esteniveldesciende rápidamentedurante lamaduración, llegando inclusoaceroen

algunasvariedadescuandoelfrutoestacompletamentenegro(Omar,2010).

Las enzimas endógenas hidrolíticas, principalmente las glucosidasas, entre ellas, la β-

glucosidasa, pueden activarse durante procesos de molienda o maceración en extractos

acuosos y catalizar la hidrólisis de los fenoles comoOLE con la consiguiente producción del

aglicón,quese isomeriza rápidamentea travésde la formaenólicaadialdéhido (Fernandez-

Bolañosycols.,2002)(Figura2).

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Figura2.Hidrólisisydegradaciónparcialdeoleuropeínaenhojasdelolivo.

C. Biosíntesis

ElprincipalprecursordelasíntesisdeOLEeselácidomevalónicocomosehacomentado,que

es el substrato para la síntesis del oleósido 11-metil-ester (ácido elenólico glucosado). El

primerpasoqueocurreenlarutabiosintéticaeslacatalizaciónporgeraniolsintasa(GES),yla

conversióndelgeraniola10-hidroxigeraniolporlaenzimageraniol10-hidroxilasa(GE10H).La

actividadbioquímicadelNADHdeshidrogenasa(NDHI)sobreel10-hidroxigeranioldapasoal

aglicón ácido deoxilogánico (Alagna y cols., 2012). La transferencia de grupos glucosílo al

aglicón ácido deoxilogánico para la formación de ácido deoxilogánico (precursor de varios

monoterpenos alcaloides indólicos yOLE) es catalizadapor glucosiltransferasa (GT). El ácido

deoxilogánicoexperimentauna7-α-hidroxilacióndelanillociclopentano,formandoelácido7-

epilogánico(Obiedycols.,2007),elcualrápidamentepasaaácido7-cetologánicomediantela

oxidacióndelgrupohidroxiloporNHDI.Lametilacióndeesteácidoescatalizadaporlaácido

logánicometiltransferasa(ALMT),dandolugarala7-cetologanina.Enestepunto,laexpresión

constitutivadesecologaninasintasa(SLS)oxidaelgrupocetónico,yseformaeléster11-metil

oleósido,elcualesinmediatamenteglicosiladoa7-β-1-D-glucopiranosil-11-metiloleósidopor

la GT. Este último componente experimenta una reacción de esterificación con tirosol que

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formaelligustrósido,yfinalmente,OLEseformaporhidroxilación(Alagnaetal.,2012)(Figura

3).

Figura3:Esquemadelarutabiosintéticadelaoleuropeína.

D. Metabolismoybiodisponibilidad

Loscompuestosfenólicoshandemostradoseraltamentebiodisponibles.Laadministracióndel

aglicónOLE presenta un 55-60%de absorción en humanos (Vissers y cols., 2002). Además,

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otros estudios han demostrado que OLE se absorbe rápidamente en el intestino delgado y

colon tras su administraciónoral, alcanzando sumáxima concentraciónplasmática a las dos

horas de la administración (Katsoulieris, 2016). Sin embargo, el mecanismo por el cual se

absorbepermaneceaúndesconocido.

Se distribuye rápidamente en sangre, unido a lipoproteínas humanas; y se excreta en orina

principalmentecomoglucurónidoo,enmenorconcentración,comoforma libre (Tanycols.,

2003)(Boccioycols.,2003).

Asuvezsehademostradoqueun15%deOLEglicosiladaadministradaenhumanossanosse

excretaenorinacomohidroxitirosol,principalmetabolito,ytirosol(Vissersycols.,2002).

II. ACTIVIDADFARMACOLÓGICADELAOLEUROPEÍNA

Muchos estudios in vitro e in vivo han documentado numerosas e importantes actividades

farmacológicas de OLE como la antioxidante, antidiabética, antimicrobiana, antivírica,

antitumoral, hepatoprotectora, cardioprotectora, neuroprotectora, antienvejecimiento y

antiinflamatoria(Carrera-Gonzálezycols.,2013;FuentesyPalomo,2014;Rubióycols.,2014;

Sepportaycols.,2014).

A. Actividadantioxidante

Una de las propiedades deOLE demayor interés es su potente actividad antioxidante ante

radicales libres (Cicerale y cols., 2012), la cual fue atribuida a su habilidad para donar

electrones,estabilizandoestosradicaleslibres(Leeycols.,2009;Visioliycols.,2000).Tantosu

capacidadparaeliminarradicaleslibrescomosuactividadquelantesobremetales,parecenser

lasresponsablesdelahabilidadprotectoradelasmembranasfrentealaperoxidaciónlipídica.

Esta hipótesis es apoyada por Czerwisńka y cols. (2012), quienes publicaron que este

secoiridoidesuprimelaproduccióndeespeciesreactivasdeoxígeno(ERO)(aniónsuperóxido,

peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso) y especies reactivas de nitrógeno (ERN) (óxido

nítrico,peroxinitrito)ensistemascelulares invitro.También,elexperimentodeČabarkapay

cols. (2014) y Kyriakopoulou y cols. (2012), en leucocitos periféricos humanos y células de

carcinoma hepatocelular (HepG2) con daño en el ADN inducido con H2O2, confirma esta

actividaddeOLE.

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Invivo, utilizandoconejosdiabéticos inducidosporaloxano (Al-AzzawieyAlhamdani,2006),

ratas alimentadas condietas ricas en colesterol (Jemai y cols., 2008)y en ratas expuestas a

arsénico (Kotyzová y cols., 2011),OLE fue capazde inducir un incremento en los niveles y

actividaddeenzimasantioxidantescomolasuperóxidodismutasa(SOD),glutationperoxidasa

(GPx), glutation reductasa (GRx), catalasa (CAT), yunaumentodelniveldeantioxidantesno

enzimáticoscomoelglutation(GHS),α-tocoferol,β-carotenoyácidoascórbico.

B. Actividadantidiabética

En los 90, González y cols., usando un modelo animal de diabetes mellitus inducida con

aloxano,postularonporprimeravezelpapelprotectorehipoglucemiantedeOLEextraídade

hojasdelolivo(Gonzalezycols.,1992).

Estudiosposterioresmostraronunaevidenteunióndelaacciónantidiabéticaconlosefectos

antioxidantesdel secoiridoide.El tratamiento conOLEde conejos condiabetes inducidapor

aloxano, mostró efectos hipoglucemiantes significativos comparados con los animales

diabéticos control, asociados con el restablecimiento de los niveles de malondialdehído

(subproductoderivadodelmetabolismodelípidos)ysobretodo,deantioxidantesendógenos

enzimáticosynoenzimáticos(Al-AzzawieyAlhamdani,2006).

C. Actividadantimicrobianayantivírica

OLE hamostradouna gran actividad antimicrobiana frente bacteriasGrampositivas yGram

negativas, como Lactobacillus plantarum, Bacillus cereus y Salmonella enteritidis (Cicerale y

cols.,2012).Además,estudiosinvitromostraronactividadcontramicoplasmas,inclusofrente

alasqueeranresistentesatratamientosantibióticos(Furneriycols.,2002).

Estaspropiedadespodríansugerirelusodelcompuestofenólicocomounaditivoalimentarioy

como tratamiento en infecciones humanas del tracto digestivo o respiratorio (Bisignano y

cols.,1999).

Su actividad se debe al daño sobre la membrana bacteriana y/o la desorganización de los

péptidoglucanos(Caturlaycols.,2005).Sinembargo,elmecanismomolecularporelqueactúa

sedesconoce.Entrelosposiblesprocedimientossebarajalainterferenciaenlaproducciónde

ciertosaminoácidosnecesariosparaelcrecimiento;o,laestimulacióndirectadelafagocitosis

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como respuestadel sistema inmune frentea todo tipodemicroorganismos (Saija yUccella,

2001).

En cuanto a la actividad antiviral, se ha demostrado su eficacia sobre células de carcinoma

hepatocelular (HepG2 2.2.15) infectadas frente septicemia hemorrágica viral (Micol y cols.,

2005);virusdelahepatitisB(VHB)(Zhaoycols.,2009)yvirusdeinmunodeficienciahumana

(VIH)(Lee-Huangycols.,2007).Enestecasosumecanismodeacciónsebasaenlainhibición

delaintegrasavíricayalteracióndelaenvolturavírica.

D. Actividadantitumoral

Varios estudios han confirmado la actividad anticancerosa/antitumoral de OLE y han

dilucidadolosposiblesmecanismosenlaúltimadécada.HamdiyCastellonhanvalidado,tanto

en estudios in vivo e in vitro, que el secoiridoide inhibe el crecimiento celular, movilidad

celular,capacidaddeinvasióneinduceunefectoproapoptóticoenlíneascelularescancerosascomoglioblastoma(LN-18),eritroleucemia(TF-1a),célulasdeadenocarcinomarenal (786-O),

carcinomametastásicodederramepleural (T-47D), adenocarcinomade glándulamamariao

derrame pleural (MCF-7), melanoma maligno de piel o nodo linfático (RPMI-7951) y

adenocarcinoma colorectal o región metastásica supraclavicular (LoVo) (Hamdi y Castellon,

2005).

Enbaseaesto,estudiosexperimentalesenanimaleshandeterminadoqueeltratamientocon

OLE previene el desarrollo de cáncer de piel (Kimura y Sumiyoshi, 2009), tejidos blandos

(HamdiyCastellon,2005)ycáncerdepulmón(Sepportaycols.,2014).

Además de actuar directamente sobre el tumor, OLE puede desempeñar una función

antiangiogénica, inhibiendo laproliferacióndelendotelio,produciendoasíunareduccióndel

númerodevasossanguíneos.Estofuedemostradoporestudiosenmembranacorioalantoidea

depolloyenmodelosderatón(Hamdiycols.,2003).

Portodoesto,HamdiyCastellonserefierenestesecoiridoidecomounanuevaclasedeagente

anticanceroso,queactúaen laprogresióndel tumor,activa sistemasreparadoresdeADNe

inhibedelaangiogénesis.

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E. Actividadhepatoprotectora

Se ha observado en diversos estudios un efecto hepatoprotector, demostrando que el

tratamiento con OLE disminuye significativamente las transaminasas en plasma,

especialmente la alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en

ratones intoxicados con tetracloruro de carbono. Estos resultados se asocian con una clara

regresióndeáreasnecróticasyunmarcadoaumentodelaactividadSODylaconcentraciónde

GHS.LainmunoquímicatambiénrevelóqueOLEatenúadeformadosis-dependienteERO/ERN

ysuprimelainflamación(Domitrovic´ycols.,2012)(Kimycols.,2014).

Además,enhígadoderata tratadoconhidroxitoluenobutilado,el secoiridoide fuecapazde

reducir losnivelesdeureanitrogenadaensangre, transaminasaglutámicopirúvicaensuero

(sGPT), transaminasa glutámico oxalacética (GOT), fosfatasa alcalina (FA), lactato

deshidrogenasa (LDH), triacilglicéridos (TG) y creatinina (Lin y cols., 2007); además de

minimizarlageneracióndefibrosisynecrosis(Fangycols.,2008)(Kimycols.,2014).

Portanto,estosestudiosvalidanelpotencialhepatoprotectordeOLE,proponiéndolacomoun

nuevoagenteseguroyprotectoraestenivel(Hassenycols.,2015).

F. Actividadcardioprotectora

La actividad cardioprotectora de OLE en modelos de experimentación in vivo ha sido

demostrada en diversos estudios. En ratas con cardiotoxicidad aguda inducida por

doxorrubicina (DXR), se realizaron inyecciones intravenosas de OLE, produciéndose un

descensoenelniveldecreatinquinasa(CK),creatinquinasa-MB(CK-MB),LDH,ASTyALT.Asu

vez,lainmunoquimicarevelóunareducciónenelcontenidodecarbonilos,nitrotirosinas,iNOS

y peroxidación lipídica en tejido miocárdico; y en histopatología, la reducción de la

vascularización citoplasmática en cardiomiocitos reveló su efecto protector frente a la

cardiotoxicidadinducidaporDXR(Andreadouycols.,2007).

Elpretratamientoconelcompuestofenólicoenratonesconinfartoagudodemiocardio(IAM),

mostró un efecto protector frente al IAM, previniendo el desarrollo de un fallo cardiaco

secundario al mismo, al descenso en los niveles séricos de CK-MB, troponina I, LDH

(Janahmadiycols.,2014).

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G. Actividadneuroprotectora

Tanto OLE como los polifenoles del olivo exhiben un efecto neuroprotector significativo en

modelos experimentales y sugiriéndose una nueva estrategia terapéutica potencial en

enfermedadesneurodegenerativascomoParkinsonyAlzheimer.

En un ensayo en ratas OLE mostró un número mayor de neuronas en la sustancia negra,

respecto a las ratas sin tratar. De hecho, las investigaciones con GC-MS describieron al

secoiridoide como una molécula de unión no covalente al péptido β-amieloide (1-40),

contrarrestando la producción y generación de la placa amieloide (Bazoti y cols., 2006). En

adición,elsecoiridoidefuecapazdeinhibir laproteínaTau,queformaagregadosamieloides

característicos del Alzheimer, en ratones (Daccache y cols., 2011).Estos resultados avalan a

esta molécula como una novedosa diana farmacológica en la prevención o atenuación del

dañoopérdidadeneuronasdopaminérgicasenpatologíasneurodegenerativas.

H. Actividadantienvejecimiento

LosFSsufrenlasenescenciaporla influenciadefactoresgenéticosyambientales.Lafunción

fisiológicadelproteosoma,unaproteasanoliposomalmulticatalítica,sedeterioraconelpaso

del tiempo, de formamás acentuada en fibroblastos durante la senescencia. Katsiki y cols.,

demostraronqueOLEmejoralaactividaddelosproteosomasinvitro,deformamáseficazque

otros quimioactivadores conocidos, posiblementemediante cambios en la conformación de

éstos. Además, el tratamiento continuo de fibroblastos embrionarios en fase temprana con

OLE,disminuyólosnivelesintracelularesdeERO,reduciendolacantidaddeproteínasoxidadas

mediante el incremento de la tasa de degradación mediada por proteosomas y,

manteniéndose la función del proteosoma durante la senescencia replicativa. De forma

importante,loscultivoscelularestratadosconOLEexhibieronunademoraenlaapariciónde

la senescencia, y su tiempo de vida se extendió aproximadamente un 15% (Katsiki y cols.,

2007).

I. Actividadantiinflamatoria

Lainflamaciónesunarespuestafundamentalinducidaporelsistemainmuneparaprotegerel

organismocontrapatógenos,dañotisularyestrés.

Unaampliavariedaddeestudioshandemostradolaevidenciadelacontribucióndecitocinas

enlainflamaciónyeltejidodañado.Lascitocinaspro-inflamatoriascomoIL-6,IL-1βyelfactor

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denecrosistumoralα(TNF-α)seactivanporvíasdeseñalizaciónimplicadasenlainflamación,

entrelasqueseincluyenlosfactoresnuclearesdetranscripciónNF-kBylasproteínascinasas

activadas por mitógenos (MAPK): c-Jun NH2 –terminal cinasa (JNK), p38 cinasa y cinasa

reguladapor señalextracelular (ERK), fundamentalmente (Aupperley cols.,2001;McInnesy

Schett,2011).

ElfactordetranscripciónNF-ĸBjuegaunpapelfundamentalenlafunciónbiológicay

en lapatogeniadedesórdenes inflamatoriosyautoinmunes (Suny cols.,2013). Esun factor

transcripcional regulador de la expresión de numerosos genes que codifican moléculas

involucradasenelprocesoinflamatorio,entrelosquepodemosincluírciclooxigenasa-2(COX-

2),óxidonítrico sintasa inducible (iNOS),protaglandinaE sintasa-1microsomal (m-PGES-1) y

ciertascitocinasproinflamatoriasentrelascualesse incluyenTNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17eIL-23

(Cho,2006;Neurathycols.,1998).

ElNF-κβestáreguladopor lavíade lasMAPK,queensuestado inactivo(nofosforilado)

residen en el citoplasma, pero cuando se activan son fosforiladas y a su vez fosforilan en

serinasytreoninasalosfactoresdetranscripción.Estosúltimospromuevenlatranscripciónde

genes responsables de la activación de las células inflamatorias e inmunocompetentes y la

expresióndeproteínasmediadorasclaveconelconsiguienteefectobiológico (Ghoshycols.,

2003).

La víade lasMAPKparece jugarunpapel importanteenel controlde la inflamación (Weiy

Feng, 2010). Las vías de la cinasa N- terminal p38 y JNK se activan por el estrés celular

(Kyriakis y Avruch, 2001). La MAPK p38 también está involucrada en el control post-

transcripcional de la expresión génica mediante la estabilización de los ARN mensajeros

(ARNm). De igual manera, se ha descrito que puede regular la producción de citocinas en

respuestaaunavariedaddeestímulosy lasobreexpresióndeCOX-2 (Hommesycols.,2002)

(Figura4).

El efectoantiinflamatoriodeOLEestamediadopor su capacidadde inhibir la actividadpro-

inflamatoriadeEROlibresproducidasporenzimas,comolaCOX-2eiNOSymodulardiferentes

víasdeseñalización:inhibicióndelNF-kβysutranslocaciónalnúcleo,IL-1β,MAPK,mediante

laalteracióndelosprocesosredoxencélulasinmunessensibles(Cárdenoycols.,2013).

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Figura4:Esquemadelmecanismoantiinflamatoriodecompuestosfenólicos(Cárdenoycols.,

2013).

A continuación, se incluyen los estudios in vitro e in vivo más significativos que avalan la

actividadantiinflamatoriadeOLE.

o EstudiosinvitroconOLE

Dell’Agliycols.,investigaronelefectodelaglicónOLE,extraídodeaceitedeolivavirgenextra

(AOVE), en la expresión demetaloproteasas de lamatriz-9 (MMP-9) en células de leucemia

agudamonocítica(THP-1),elcualprevienelaestimulacióndelaexpresióndedichaenzimaen

célulasTHP-1estimuladasconTNF-α,debidoalaalteraciónenlaseñalizacióndeNF-kB.Esto

evidencióelmecanismoporelqueelAOVEreducía la inflamaciónasociadaaenfermedades

(Dell’Agliycols.,2010).

Otrosestudios,en la líneacelularRAW-264.7(macórgafosmonocíticos inducidosporelvirus

de leucemia murina de Abselon), estimulada con lipopolisacáridos (LPS) pusieron de

manifiesto que el compuesto fenólico inhibe la producción de citocinas pro-inflamatorias

como la IL-1β e IL-6 y la generación de óxido nítrico (NO), mediante la supresión de la

expresión de enzimas pro-inflamatorias, iNOS y COX-2. Así mismo,se observó una

disminucuióndelaactivacióndelasMAPK(ERK1/2yJNK),lascualesseasocianalprocesode

inflamación(Ryuycols.,2015).

MembranePhospholipids

Araquidonic Acid

PGG2

PGH2

PGD2,PGE2,PGF2,PGI2

(TxA2)TxB2

PGsynthases TXsynthase

PLA2

COX-2

OLIVEOILPOLYPHENOLS

MMP-9

NF-ƘB

IƘBα

p65 p50

NF-ƘB

STAT-1p

STAT-1

STAT-1p

STAT-1p

STAT-1

p

MAPKsp38,JNK,ERK

iNOSNO

Pro-inflammatorycytokines

Transcriptionoftargetgenes

15

Además, se demostró que OLE reducía el efecto de lamieloperoxidasa (MPO) (enzima que

cataliza la formacióndeácidohipocloroso)enneutrófiloshumanosde formaconcentración-

dependiente(Czerwisńkaycols.,2012).

o EstudiosinvivoconOLE

LaeficaciadeOLEenmodelosinvivodeinflamaciónhasidoprobadacongranextensión.Este

secoiridoidetambiénhamostradounosbuenosbeneficiospreventivosanivelgastrointestinal,

enelmodelodeúlceragástrica inducidaconetanol,disminuyendoel índicedeulceracióne

incrementando la actividadde enzimas con actividad antioxidante en ratas, el contenidode

GHS,SODyCATentejidogástrico(Alirezaeiycols.,2012).

Delamismaforma,sehareportadoqueOLEatenúalaextensiónyseveridadencolitisaguda

inducidaconDSSalavezquereducelainfiltracióndeneutrófilos,laproduccióndeNO,IL-1β,

IL-6yTNF-α,losnivelesexpresióngénicadeproteínaiNOS,COX-2,MMP-9ylatranslocaciónal

núcleosubunidadp65deNF-kBentejidodecolón(Ginerycols.,2011,2013).

Sonconocidos losefectosantiinflamatoriosdelaglicónOLEen ratonesconartritis colágeno-

inducida (CIA). Por ejemplo, el aglicón OLE atenúa el desarrollo de la artritis causada por

inyección de colágeno tipo II en ratones, mejorando el estado histológico tanto en la

articulacióncomoenlapata,elgradodedañooxidativoynitrosativoylosnivelesplasmáticos

decitocinaspro-inflamatorias(Impellizzeriycols.,2011).Asimismo,eltratamientoconaglicón

OLE disminuyó significativamente el daño histológico, la producción de citocinas pro-

inflamatorias(TNF-αeIL-1β), laexpresióndeiNOs,lainfiltracióndeneutrófilos, laformación

denitrotirosinaylosnivelesdefactorneurotróficoderivadodecélulasgliales(GDNF),através

delainhibicióndelavíadeseñalizaciónNF-kBeimpidiendoladegradacióndelaproteína

inhibitoria IKB-α. Del mismo modo, el aglicón OLE fue capaz de reducir actividad de la

proteinquinasaA(PKA),yestimulólaapoptosis,enelmismomodeloexperimentalenratones

(Impellizzeriycols.,2012)(Tabla2).

16

Tabla2:Estudiosinvivoeinvitrodelaactividadantiinflamatoriadelaoleuropeína.

Referencia Polifenol Métododeexperimentación

Mecanismosdeacción Dosisusadas

InVitro

Dell’Agliy

cols.,2010

AglicónOLE

CélulasTHP-1TNF-α

estimuladas

InhibicióndelaexpresiónanómaladeMMP-9

mediantelaseñalNF-kB

2.5-50μM

Ryuycols.,

2015

OLE

RAW264.7LPSestimuladas

SupresióndelaproduccióndeiNOS,COX-2,IL-1β,IL-6

yMAPK

100,200,300μM

Czerwisńkaycols.,2012

OLE Neutrófiloshumanos

ReduccióndeMPO 5-50μM

InVivo

Alirezaeiy

cols.,2012

OLE

Úlceragástricainducidaconetanolenratas

Elevacióndelaactividaddeenzimasantioxidantes,aumentodelíndicedeúlcerasinhibidas,el

contenidodeGSH,SODyCATeneltejidogástrico

12y18mg/kg

Ginerycols.,

2011

OLE

Colitisaguda

inducidaconDSS

Reduccióndelainfiltracióndeneutrófilos,la

produccióndeNO,IL-1β,IL-6,yTNF-α;laexpresióndeiNOS,COX-2,yMMP-9;ylatranslocaciónalnúcleodelasubunidadp65NF-kB

2%OLendieta

Impellizzeriy

cols.,2011

Impellizzeriy

cols.2012

AgliconOLE

Enfermedaddelamédulaespinal

enratónArtritis(colágenotipoII)enratón

Disminucióndeldañohistológicamente,TNF-αeIL-1β,iNOS,inlfiltracióndeneutrófilos,peroxidaciónlipídica,nitrotirosina,

formacióndePKA,nivelesdeGDNF,inhibicióndela

expresióndeNF-kB,degradacióndeIkB-αeinduccióndeapoptosis

20,40,100μg/kg

17

JUSTIFICACIÓNYOBJETIVOS

SegúnlaOrganizaciónMundialdelaSalud,lasenfermedadesreumáticassonunadelascausas

más frecuentes de incapacidad en elmundo. En España estas patologías están relacionadas

con el 50,7% de las incapacidades laborales y son la principal causa de bajas laborales

permanentes.EspecialrelevanciatienelaAR,porsusrepercusionessobrelacalidaddevidade

lospacientesyeldeterioroprogresivoqueproduceestaenfermedad.

AR es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y sistémica que se caracteriza por

unasinovitiserosivasimétrica,enlacualeltejidodegranulacióndeorigensinovial(pannus),

invadeyerosionaelcartílagoyelhuesode lasarticulacionesdiartrodiales. LosFS jueganun

papelfundamentalenlapersistenciadelainflamacióncrónicayeneldañoarticular,siendo

unas de las poblaciones celulares más abundantes en el pannus. Actúan directamente

degradando lamatriz del cartílago, e indirectamente sobre el hueso como inductores de la

diferenciaciónyactivacióndelososteoclastos(Fauci,2010).

El abordaje terapéutico de la AR es multidisciplinar, dirigida a la supresión inespecífica del

proceso inflamatorio, con el objetivo de mitigar los síntomas y signos de la enfermedad,

englobandotratamientofisioterápicoyfarmacológico.Noobstante,dadolaslimitacionesen

eficaciayseguridaddelafarmacoterapiaactualantirreumática,sehageneradoenlosúltimos

años, un auge en el uso de otras estrategias terapéuticas, entre las que destaca la terapia

nutricionalyelusodenutracéuticos(Fauci,2010).

Recientemente nuestro grupo de investigación ha puesto de manifiesto el potencial

antirreumáticodelAOVE,basedenuestradietamediterránea,desufracciónpolifenólicayde

un unodesus fenolesderivadodelhidroxitirosol (acetatodehidroxitirosol) (Rosilloycols.,

2014,2015,2016) enunmodelo invivodeartritis inducidaporcolágenoenratonesDBA/1.

Noobstante,noexistenhasta la fecha,estudiosexperimentales in vitroencélulashumanas

quevalidenelpotencialantirreumáticodelossecoiridoides,yenparticulardeOLEasícomo

losmecanismosbioquímicosymolecularesimplicados.

En base a la actividad antiinflamatoria de OLE puesta de manifiesto en modelos

experimentales in vitro e in vivo, se plantea llevar a cabo un desarrollo experimental cuyo

objetivoprincipalesllegaralconocimientodelfuncionalismodeestesecoiridoideenunalínea

celular validada para el estudio de la AR de FS humanos (SW982) y dilucidar los posibles

mecanismosmoleculares,asícomo,lasvíasdeseñalizacióninvolucradas.

18

METODOLOGÍA1. Oleuropeína:Extracciónycaracterizaciónquímica

Para la extracción de OLE a partir de hojas de olivo, se siguió el método descrito por

(Stamatopoulos y cols., 2014). Posteriormente, el extracto se concentró a sequedad y el

residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (Diclorometano-

metanol 10:1--->5:1) obteniéndose OLE como un sólido débilmente amarillo que fue

analiazadoposteriormenteporRMNdealtaresolución(ServiciosGeneralesdelaUniversidad

deSevilla,Citius,quecuentaconequiposBrukerAdvanceIII500y700MHz).

2. Cultivocelular

La línea celular de FS humanos SW982 se obtuvo de American Tissue Culture Collection

(ATTC®,NumberHTB-93(Manassas,VA,EE.UU.)).LascélulasSW982secultivaronenflasksT-

150(NuncTM,Barcelona,España),conDulbecco'sModifiedEagleMedium(DMEM)con2mM

deL-glutamina,suerofetalbovinoal10%(SFB)ypenicilina-estreptomicinaal1%,a37ºCy5%

CO2.

3. Viabilidadcelular

Lascélulasfueronsembradasenplacasde96pocillos(1x105células/pocillo)eincubadasen

presenciaoausenciadeOLEdurante24h.Transcurridoestetiempodeexposición,elefecto

delcompuestoenlaviabilidadcelularfueanalizadomedianteelensayodelasulforrodaminaB

(SRB) (Skehan y cols., 1990). Después del periodo de incubación, las células adherentes del

cultivo fueron fijadas a la placa, añadiendo 50 mL de ácido tricloroacético (50% p/v) frío

(Sigma-Aldrich®,Madrid,España)e incubadasdurante60minutosa4ºC.El sobrenadantese

descartó,ylasplacasselavaroncincovecesconaguadestiladaysesecaronalaire.Seañadióa

cada pocillo 50 µL de solución SRB (Sigma-Aldrich®, Madrid, España) (0.4% p/v) en ácido

acético al 1% (Panreac®, Barcelona, España) y se incubó durante 30minutos a temperatura

ambiente. Se eliminó la solución SRB de las placas y posteriormente, fueron lavadas cinco

vecesconácidoacéticoal1%.Seguidamente,sesecaronlasplacasyseañadieron100µLpor

pocillo de Tris base (100 mmol/L, pH 10.5) (Sigma-Aldrich®, Madrid, España), leyendo, a

continuación, la absorbancia a 510 nm utilizando un lector de placas (BioRad®, Madrid,

España).Finalmente,laviabilidaddelascélulassecalculócomoelporcentajedeabsorbancia

comparadoconelobtenidoenlascélulassintratar,alosqueselesasignóelvalor100%.

19

4. Determinacióndecitocinas:IL-6yTNF-α

Las células SW982 se sembraron en placas de 24 pocillos (2.5x105 células/pocillo). 48 h

despuésdesembrarlas,seincubaronenpresenciaoausenciadeOLE(50y100µM)durante24

h en DMEM con 10% (v/v) de SFB en una atmósfera del 5% CO2a 37ºC.Seguidamente, se

estimularon con IL-1β (5ng/mL) y se incubaron durante 24 h. Los sobrenadantes del cultivo

fueronrecogidosyconservadosa-80ºC.

LosnivelesdeIL-6ydeTNF-αsehanvaloradomedianteunenzimoinmunoanálisis(ELISA)tipo

competitivo usando un kit comercial de eBioscience®( SanDiego, CA, EE.UU.), siguiendo las

instruccionesindicadasenlosmismos.ElmétodoestuvobasadoenlacompeticiónentrelaIL-

6yTNF-αdelamuestra,yunestándarporlauniónaunanticuerpo(Ac)policlonalanti-IL-6o

anti-TNF-αquerevestíalaplaca.Traslaincubación,seañadióunAcmonoclonalqueseunióal

anterior,y esta ligadoa laenzimacatalasa (enzimadedetección).Trasunnuevo lavado,se

adicionóelsubstratoylareacciónenzimáticaprodujouncolorcuyaintensidadsemidióa450

nm en lector de placa Labsystems Multiskan Ex. (Helsinki, Finlandia) siendo directamente

proporcionalalacantidaddeIL-6odeTNF-αdelasmuestras.

5. Determinacióndelaexpresiónproteica

Con este estudio, se determinaron los cambios en la expresión de determinadas proteínas

presentes en las células SW982 mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico

(SDS)/poliacrilamiday,posteriortransferenciaaunamembranadenitrocelulosa,ydetección

mediante una reacción de quimioluminiscencia empleando anticuerpos específicos de la

proteínadeinterés(Westernblot)(Figura5).

Las células se incubaron en presencia o ausencia de OLE (50 y 100 µM) durante 24 h y se

estimularonconIL-1β(5ng/mL)adistintostiempos,dependiendodelaproteínaestudiada(30

mino 24h). Pasadoel tiempodeestímulo, las células se lisaronutilizandoun tampón, que

conteníauncocktaildeinhibidoresdeproteasasyfosfatasas,yseprocesaronsegúndescriben

Sánchez-Hidalgoycols.(2005)paraaislarlasproteínas.

Laconcentraciónproteicadecadamuestrasedeterminódeacuerdoalmétodocolorimétrico

descritoporBradford.Enesteensayo,5µldecadaunadelasmuestrasadeterminarfueron

añadidosymezcladosconelreactivodeBio-Radproteinassay(Bio-Rad®),elcualalcanzauna

absorbanciamáximaa595nm,permitiendosuposteriorlecturaenunespectrofotómetro.

20

Lasmuestrassedesnaturalizaronporcalor(95ºC,10min)enpresenciadeltampóndecarga

(Laemly1x),conteniendoagentesdesnaturalizantescomoelβ-mercaptoetanolySDS(recubre

lascargasnetasnegativashaciendoquelamigraciónseaproporcionalalacargaytamañode

lamolécula).LaseparacióndelasproteínasserealizómedianteelectroforesisengeldeSDS-

poliacrilamida al 10 %, cargando las muestras, desnaturalizadas y con igual cantidad de

proteína (25µg), en lospocillos formadosenel gel de concentración junto almarcadorde

pesomolecular (Bio-Rad Laboratories®,California, EE.UU.). Laelectroforesis tuvo lugar enel

sistema Mini Protean-II (Bio-Rad Laboratorios®, CA, EE.UU.) en presencia de tampón de

electroforesis (1x). Inicialmente se aplicó una corriente de 70 voltios (V) y se aumentó

paulatinamentehastaalcanzarlos150Vunavezqueelfrentedemigraciónalcanzóelgelde

separación.

En el siguiente paso, las proteínas se transfirieron electroforéticamente desde el gel a una

membranadenitrocelulosa,paraelloseempleóelsistemadetransferenciahúmeda.

Figura5.RepresentaciónesquemáticadelatécnicadeWesternBlotting.

Seguidamente se saturó la membrana con una solución de bloqueo (para evitar uniones

inespecíficasdelAc)durante1ha temperaturaambiente. Traselbloqueo, se incubaron las

membranas con los Ac primarios específicos para las proteínas a determinar diluidos en

tampóndebloqueodurantealmenos1hatemperaturaambienteydespuéstodalanochea

4ºCenunagitadorrotatorio(MovilRod,Selecta®).

21

Cada membrana se lavó con las soluciones C, B, PBS 1X consecutivamente, durante 15

minutos. Seguidamente se incubaron con Ac secundario correspondiente durante 1-2 h a

temperaturaambiente(Tabla3).

Tabla3.AnticuerposusadosenelestudiodelasproteínasCOX-2,m-PGES-1,pJNKypp38.

Anticuerpoprimario Dilución Anticuerposecundario Dilución

Anti-COX-2 conejo (Cayman

Chemical®,Michigan,EE.UU.)

1:1000 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,

Michigan,EE.UU.)

1:50000

Anti-m-PGES-1 rata (Cayman

Chemical,EE.UU.)

1:200 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,

Michigan,EE.UU.)

1:50000

Anti-pJNK ratón (Santa Cruz

Biotechnology®, Santa Cruz, CA,

EE.UU.)

1:200 Antimouse (Dako®,Atlanta,GA,

EE.UU.)

1:2000

Anti-JNK rata (Santa Cruz

Biotechnology®, Santa Cruz, CA,

EE.UU.)

1:200 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,

Michigan,EE.UU.)

1:50000

Anti-pp38 ratón (Santa Cruz

Biotechnology®, Santa Cruz, CA,

EE.UU.)

1:200 Antimouse (Dako®,Atlanta,GA,

EE.UU.)

1:2000

Anti-P38 rata (Santa Cruz

Biotechnology®, Santa Cruz, CA,

EE.UU.)

1:200 Anti-rabbit (Cayman Chemical®,

Michigan,EE.UU.)

1:50000

Tras los lavados del Ac secundario, la detección de los inmunocomplejos marcados con

peróxidos se realizómediante la reacción de quimioluminiscencia. Sobre lasmembranas se

añadieron losreactivosdelkitdeSupersignal®(Pierce®,Rockford, IL,EE.UU.), luminolyH2O2

(1:1) (la enzima peroxidasa cataliza la oxidación del sustrato luminol en presencia de H2O2

provocando una reacción quimioluminiscente). Por último, para valorar esta señal de

quimioluminiscencia, se introdujeron lasmembranasenel transluminadorLAS-3000 Imaging

SystemdeFujifilmImageReader(Stamford®,CT,EE.UU.),dispositivoquenospermitióobtener

22

unaimagendelaseñal.Losdatosdensitométricosobtenidosfueronestudiadossiguiendouna

normalizaciónconelcontrolβ-actina,ylasseñalesfueronanalizadasycuantificadasmediante

elprogramainformáticoImageJsoftware(Bethesda®,MD,EE.UU.).

6. Evaluaciónestadísticadelosresultados

Todoslosvaloresqueaparecenenlasfigurasyeltextoseexpresancomolamediaaritmética

±el error estándar (SEM), y la significaciónestadísticade lasdiferencias en cadaparámetro

entre los distintos grupos fue evaluada por análisis de varianza de una sola vía (ANOVA),

utilizando el test de comparaciónmúltiple de Tukey. Los valores de p<0.05 se consideraron

estadísticamentesignificativos.LosdatosfueronevaluadosconGraphPadPrism®version5.01

software(SanDiego,CA,EE.UU.).

Enlosexperimentosqueimplicandensitometría,losvaloresindicadossonrepresentativosde

almenostresexperimentosdistintosrealizadosendíasdiferentes.

23

RESULTADOS

1. Efectosdelaoleuropeínaenlaviabilidadcelular

LosefectosdeOLEsobre la laviabilidadde losfibroblastossinovialeshumanos(SW982), fue

realizadomediantelatécnicadeSRB.ElSRBesunmétodoeficienteparaevaluarlatoxicidad

de compuestos sobre células adherentes, basado en lamedición del contenido de proteína

celular.

Tras24h,losresultadosobtenidosdemostraronquelostratamientosconelsecoiridoidealas

concentraciones ensayadas [6,25-100 μM] no resultaron tóxicos, ya que, las células SW982

mostraronunaviabilidad>90%(Figura5).

Figura5.EfectodeOLEenviabilidadcelular.Lasconcentracionesusadasenesteestudiono

afectanalaviabilidaddelascélulasSW982.LascélulasfuerontratadasconOLE[1,6-200μM]

durante24h.Lasupervivenciacelularfueexpresadaenporcentajedeabsorbanciacomparado

conelcontenidoproteicaencélulascontrol(célulassinestimular).

24

2. Efectos de la oleuropeína en la producción de citocinas pro-inflamatorias

Interleucina-6(IL-6)yFactordeNecrosisTumoralα(TNF-α)encélulasSW982

Los resultados correspondientes a laproducciónde IL-6 y TNF-αpusierondemanifiestoun

incremento muy significativo de los niveles de ambas citocinas proinflamatorias tras la

estimulación con IL-1β en relación con los resultados obtenidos en las células SW982 no

estimuladas(***p<0.001vs.célulascontrolnoestimuladas).

Por el contrario, el tratamiento con las concentraciones ensayadas de OLE (50 y 100 μM)

indujo una disminución estadísticamente significativa de ambas citocinas con respecto al

grupodecélulascontrolestimuladasconIL-1β(+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladascon

IL-1β)(Figura6AyB).

Figura6.EfectoinhibidordeOLEenlaproduccióndeIL-6(A)yTNF-α(B)encélulasSW982.

LascélulasSW982fuerontratadasdurante24hconOLE(50y100μM)yestimuladasconIL-1β

(5ng/mL).Losdatossonexpresadoscomomedia±SEM (n=3).***p<0.001vs.célulascontrol

noestimuladas;+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β.

25

3. Efectos de la oleuropeína sobre la expresión de Ciclooxogena-2 (COX-2) y

ProstaglandinaESintasa1microsomal(m-PGES-1)encélulasSW982

Se estudiaron los posibles efectos de OLE sobre la expresión proteica de la COX-2. Tras

estimulardurante24hlascélulasSW982conIL-1β,seobservóunincrementosignificativoen

laexpresiónproteícadeCOX-2(***p<0.001vs.célulascontrolnoestimuladas).Sinembargo,

el tratamiento con OLE (50 y 100 μM) disminuyó la sobreexpresión de dicha proteína pro-

inflamatoria en las células SW982 tratadas respecto a las células control estimuladas (+++

p<0.001vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β)(Figura7).

Figura 7. Expresión proteica de COX-2 tras el tratamiento con OLE en células SW982. Las

célulasfueronnotratadasotratadasconOLE(50y100μM)durante24henpresenciadeIL-1β

(5ng/mL).LascélulascontrolnoestimuladasfueronincubadasenausenciadeIL-1β.Elgráfico

representalaintensidaddelabanda.Laβ-actinasirviócomocontrolparalanormalizaciónde

la igualdad de carga. Los datos mostrados son medias ± SEM (n=4). ***p<0.001 vs.células

controlsinestimular;+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β.

Lam-PGES-1esunaezima,queinducelaformacióndeprostaglandinaE2(PGE2),unimportatne

eicosanoide que contribuye a la patogéniesis de la AR actuando como mediador de la

inflamacion y el dolor, y promoviendo la destruccióndel hueso (Westman y cols., 2004). En

pacientes con AR, la expresión de m-PGES-1 esta marcadamente aumentada en el tejido

sinovial,sobretodoencélulasinflamatorias(Samuelssonycols.,2007).

26

Laexpresióndem-PGES-1(Figura8),fueincrementadaenFStraslaestimulaciónconIL-1βcon

respectoa losqueno fueronestimuladoscon la citocina (***p<0.001vs. células controlno

estimuladas). No obstante, el tratamiento con ambas dosis de OLE causó una disminución

estadísticamentesignificativade laexpresióndedichaproteínarespectoa lascélulascontrol

traslaestimulaciónconIL-1β(++p<0.01vs.célulascontrolestimuladasconIL-1β).

Figura8.Expresiónproteicadem-PGES-1traseltratamientoconOLEencélulasSW982.Las

célulasfueronnotratadasotratadasconOLE(50y100μM)durante24henpresenciadeIL-1β

(5ng/mL).LascélulascontrolnoestimuladasfueronincubadasenausenciadeIL-1β.Elgráfico

representalaintensidaddelabanda.Laβ-actinasirviócomocontrolparalanormalizaciónde

la igualdad de carga. Los datosmostrados sonmedias ± SEM (n=4). ***p<0.001 vs. células

controlsinestimular;++p<0.01célulascontrolestimuladasconIL-1β.

4. Estudiodevíasdeseñalización

Para explorar el posible mecanismo molecular de la actividad farmacológica de OLE en FS

humanos,determinamossusefectospotencialesenlavíadeseñalizacióndelasMAPK:JNKy

p38,tras30minutosdeestimuloconIL-1β.

NuestrosresultadospusierondemanifiestoquelosFSdela líneaSW982estimuladosconIL-

1β, inducían un aumento significativo de la fosforilación de las proteínas JNK y p38, en

comparaciónconlosfibroblastoscontrolnoestimulados.Porelcontrario,eltratamientocon

β-actina 46 kDa

m-PGES-1 16 kDa

27

OLE(50y100μM)redujosignificativamentelafosforilacióndeambasMAPK:JNKyp38,tras

30minutosdeestímuloconIL-1β(++p<0.01y+++p<0.001vs.célulascontrolestimuladascon

IL-1β)(Figura9).

Figura9.ExpresiónproteicadelasproteínasMAPK:pp38ypJNK.Lascélulasfuerontratadas

conOLE(50y100μM)durante24hyestimuladasconIL-1β(5ng/mL)durante30minutos.Las

células control no estimuladas se incubaron en ausencia de IL-1β. El gráfico muestra la

intensidaddelabanda.Elanálisisdensitométricoserealizótraslanormalizaciónconlosgenes

decontrol(JNKyp38)paralaigualdaddecarga.Losdatosmostradossonmedias±SEM(n=6).

***p<0.001 vs. células control sin estimuladas; ++p<0.01 y +++p<0.001 vs. células control

estimuladasconIL-1β.

pJNK

JNK

46 KDa

46 KDa

38 kDa

38 kDa P38

pp38

28

DISCUSIÓN

LosFSdesempeñanunafunciónrelevanteenlapatogeniadelaAR.Enlamembranasinovial

reumatoide,losFSaumentanennúmeroymuestranunfenotipoalterado.Estetipodecélulas

producen citocinas, que junto con la producción de anticuerpos e inmunocomplejos,

mantienenlainflamacióncrónicaydestruyeneltejido,debidosobretodoalasobreexpresión

localdemediadoresinflamatorios,comoIL-6,entreotros(IzquierdoyPablos,2013).

Son varios los estudios llevados a cabo por nuestro grupo de investigación con distintos

compuestofenólicosenmodelosinvivoeinvitrodeAR(Rosilloycols.,2014,2015,2016).Sin

embargo,hasta lafecha,noseconoceelpotencialantirreumáticodeOLEen losfibroblastos

sinovialeshumanos.

Entre las principales citocinas pro-inflamatorias implicadas en la patogénesis de AR se

encuentran: TNF-α, IL-1β e IL-6. Principalmente, la IL-6 se encuentra en células sinoviales y

macrófagospromoviendoladegradacióndelcartílagoylaactivacióndeosteoclastos(Baillety

cols.,2015).NuestroestudiodemostrócomolaestimulaciónconIL-1β,producíaunaumento

enlaexpresióndeIL-6yTNF-αenlascélulasSW982,mientrasqueelpretratamientoconOLE

disminuyódeformasignificativalosnivelesdeambascitocinas.

Asímismo,laCOX-2,isoformainducibledeCOX,esunaenzimaclavequecatalizalabiosíntesis

dePGapartirdeácidoaraquidónico,yasuvez,de m-PGES-1,y juegaunpapelclaveen la

respuestainflamatoria.Nuestrosresultadospusierondemanifiestocomolaexpresiónproteica

de ambas enzimas (COX-2 ym-PGES-1) aumentaba de forma significativa en células SW982

estimuladaspor IL-1β;noobstante,el tratamientoconOLE indujoundescensoconsiderable

delaexpresióndeestasenzimasinflamatorias.

Estos resultados concuerdan con los obtenidos en otros estudios, en los que se demuestra

comoOLEes capazde reducir la repuesta inflamatoriamedianteunadisminuciónenen los

niveles de COX-2,m-PGES-1, IL-6, TNF-α, entre otros (Ryu y cols., 2015; Impellizzeri y cols.,

2011;Coronaycols.,2007).

Entre lasvíasdeseñalización implicadasen laARseencuentra lavíade lasMAPK (Smoleny

Steiner,2003).LasMAPKactivadas,ERK,JNKyp38selocalizaneneltejidosinovialypueden

ser estimuladas por citocinas proinflamatorias como IL-1β (Schett y cols., 2000). Delmismo

modo,ennuestrotrabajopudimosdemostrarcomocuandoestascélulassontratadasconOLE

se reducía la fosforilacióndeambasMAPK: JNKyp38,datos coincidentes con losobtenidos

29

por nuestro grupo de investigación en estudios llevados a cabo con otros compuestos

fenólicos enmodelosmurinos inducidos de artritis (Rosillo y cols., 2015), donde se puso de

manifiesto el efecto antirreumático de estos compuestos fenólicos mediante la drástica

disminucióndelaactivacióndelasMAPK.

En resumen, los resultados de este Trabajo Fin de Grado ponen demanifiesto unmarcado

efectoantiinflamatoriodeOLEsobrefibroblastossinovialeshumanos(SW982),caracterizado

por una disminución en los niveles de citocinas pro-inflamatorias: IL-6 y TNF-α. Entre los

distintosmecanismosdeacciónposiblemente implicadosfiguraneldescensode laexpresión

delaenzimainducibleCOX-2,yportanto,dem-PGES-1,atravésdelainhibicióndelavíade

señalizacióndeMAPK.

30

CONCLUSIÓN

LosresultadosdeesteTrabajoFindeGradopermitenconcluirque:

1. LaOLEpresentaunmarcadoefectoantiinflamatorio sobre losFShumanos (SW982),

caracterizadoporunadisminuciónenlosnivelesdecitocinaspro-inflamatorias:IL-6y

TNF-α. Entre los distintosmecanismos de acción posiblemente implicados figuran el

descensode laexpresiónde laenzima inducubleCOX-2,yportanto,dem-PGES-1,a

travésdelainhibicióndelavíadeseñalizaciónMAPK.

2. Estos resultadospreliminares sugierenqueOLEpodría participar en el desarrollo de

una nueva estrategia terapéutica dirigida a los elementos del sistema inmunitario,

cuyas limitaciones en eficacia y seguridad son bien conocidas, y constituir un

complemento nutricional de gran valor en tratamiento y/o prevención de la AR al

actuarsobreporcesosFS-dependientes.

31

ABREVIATURASYSIGLAS

o Ac:Anticuerpoo ALMT: Ácido logánico

metiltransferasao ALT:Alaninaaminotransferasao AOVE:Aceitedeolivavirgenextrao AR:Artritisreumatoideo ARNm:ARNmensajeroo AST:Aspartatoaminotransferasao CAT:Catalasao CCF:Cromatografíadecapafinao CE:Electroforesiscapilaro CIA:Artritiscolágeno-inducidao CK-MB:Creatinquinasa-MBo CK:Creatinquinasao COX-2:Ciclooxigenasa2o DMEM: Dulbecco'sModified Eagle

Mediumo DXR:Doxorrubicinao ELISA:Enzimoinmunoanálisiso ERK: Cinasa regulada por señal

extracelularo ERN: Especies reactivas de

nitrógenoo ERO:Especiasreactivasdeoxígenoo ESI-MS/MS: Ionización por

electrospray-espectrocopía demasa

o FA:Fosfatasaalcalinao FAMS: Full Automatic Modelling

Systemo FS:Fibroblastossinovialeso GC-MS: Cromatografía de masas-

espectrometríademasaso GDNF: Factor neutrófico derivado

decélulasglialeso GE10H:Geraniol10-hidroxilasao GES:Geraniolsintasa

o GHS:Glutationo GOT: Transaminasa glutámico

oxalacéticao GPx:Glutationperoxidasao GRx:Glutationreductasao GT:Glucosiltransferasao HPLC:Cromatografíalíquidadealta

eficaciao IAM:Infartoagudodemiocardioo IL:Interleucinao iNOS: Óxido nítirico sintasa

inducibleo JNK:c-JunNH2–terminalcinasao LDH:Lactatodeshidrogenasao LPS:Lipopolisacáridoso m-PGES-1:ProstaglandinaEsintasa-

1microsomalo MAPK: Proteínas cinasas activadas

pormitógenoso MMP:Metaloproteasadelamatrizo MPO:Mieloperoxidasao NDHI:NADHdeshidrogenasao NO:Óxidonítricoo OLE:Oleuropeínao PG2:ProstaglandinaE2o PKA:ProteinquinasaAo SDS:Dodecilsulfatosódicoo SEM:Errorestándardelamediao SFB:Suerofetalbovinoo sGPT: Transaminasa glutámico

pirúvicaensueroo SLS:Secologaninasintasao SOD:Superóxidodismutasao SRB:SulforrodaminaBo TG:Triacilglicéridoso TNF:Factordenecrosistumoralo VHB:VirusdelahepatitisBo VIH: Virus de la inmonodeficiencia

humana

32

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