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11.1. ¿Qué hacemos con el material usado?

Limpieza, desinfección y esterilización

El material que se utiliza en un laboratorio de análisis se ensucia y se contamina con gérmenes. Al reutilizarlo, este material puede transmitir los gérmenes a otras personas o a la muestra que se está analizando, contaminándola y afectando a los resultados de los análisis que se lleven a cabo con ella. Ambos problemas conducen a enfermedades, a repetición de análisis, a errores en el diagnóstico, etc. Para evitar esos riesgos tenemos dos opciones:

- Utilizar material desechable, que se elimina después de un solo uso.

- Lavar el material utilizado, desinfectarlo y, si es necesario, esterilizarlo antes de su reutilización.

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Conviene definir cada uno de estos conceptos:

• El lavado es un procedimiento que elimina la suciedad de los objetos, para evitar la aparición de los gérmenes patógenos que se "refugian" en ella.

• La desinfección destruye la mayoría de los gérmenes patógenos de un objeto o, como mínimo, reduce su multiplicación para dificultar infecciones futuras.

• La esterilización elimina todos los gérmenes de una superficie o de un material. Es imprescindible para mucho del material de laboratorio: tubos, puntas de pipeta, bolsas de stomacher, ...

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Material desechable y material reutilizable

El material desechable se utiliza cada vez más, ya que llega estéril desde el proveedor y a menudo es más barato tirarlo, aunque sea metálico, que limpiarlo y esterilizarlo. Además, evita los riesgos derivados de un lavado poco cuidadoso o de una esterilización incorrecta. Sin embargo, debe tratarse con cuidado, como un residuo sanitario contaminante.No puede afirmarse que utilizar material desechable sea mejor que usarlo reutilizable, ni tampoco lo contrario. Cada uno tiene sus ventajas y sus desventajas, tal como puedes ver en la tabla:

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Desechable Reutilizable

Ventajas - Menos riesgo de infección del personal y de alteración de los análisis

- Más cómodo y rápido

- Menos contaminante para el medio

Desventajas - Más contaminante para el medio

- Se necesita un sistema de recogida y procesamiento del material desechado, antes de poder eliminarlo.

- Se necesita un depósito más grande

- Procedimientos de limpieza complicados y caros (ya sea en tiempo, en energía, en productos químicos, en aparatos, etc.)

- Mayor riesgo de infección del personal y de alteración de los análisis.

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11.2 La esterilizaciónHemos explicado que incluso los procedimientos de

desinfección mas potentes pueden dejar esporas, que más adelante se reactivarán. Para evitar este riesgo se aplica la

esterilización.

La esterilización es un procedimiento físico, químico o combinado, que destruye todos los microorganismos y las

esporas de una superficie o de un material. Por su agresividad, es un procedimiento que no se puede utilizar

sobre tejidos vivos.

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Podemos clasificar en tres grupos los objetos que se esterilizan en un laboratorio de análisis:

• Aquellos que utilizarás para tomar muestra, siempre que haya de hacerse con material estéril: frascos contenedores, espátulas, bisturís, pinzas, ...

• Los objetos de vidrio o de acero inoxidable que usarás en los distintos análisis microbiológicos: los tubos de vidrio en los que se han realizado las diluciones decimales, las pipetas, ...

• Los medios de cultivo, antes de inocular en ellos los gérmenes que van a estudiarse.

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7.4.1. Métodos físicos de esterilización

Del mismo modo que la desinfección, la esterilización se puede llevar a cabo usando métodos físicos o químicos.

Los métodos físicos se basan en aplicar a un objeto una energía tan intensa que elimine los seres vivos. Esta energía puede producirse mediante calor seco, calor húmedo o irradiación con rayos gamma, aunque también se puede esterilizar utilizando filtros que impidan el paso de los microorganismos.

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La esterilización mediante calor secoEl calor seco oxida las proteínas o incluso carboniza la materia orgánica. Puede aplicarse mediante incineración, flameado o calor seco.

- La incineraciónLos objetos o los productos de desecho se introducen en un horno, que se calienta a una temperatura muy alta, de modo que elimina los microorganismos al mismo tiempo que destruye el objeto.En ellos se incineran los residuos clínicos infecciosos o los cadáveres de animales de experimentación o sus órganos. En empresas especializadas se incineran residuos químicos, como fármacos citostáticos, medicamentos caducados, productos del revelado de radiografías, envases vacíos de anestésicos o incluso envases del plástico PVC.

- El flameadoEl flameado consiste en colocar el objeto dentro de una llama durante un mínimo de 20 segundos. Este procedimiento está actualmente en desuso.

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- Las estufas de esterilizaciónEn términos sencillos, una estufa de esterilización funciona como un horno eléctrico: unas resistencias calientan su interior hasta 200ºC y un reloj y un termostato regulan el proceso. El aparato tiene estantes y una pared doble, aislante, para conservar el calor y evitar quemaduras a las personas que lo manipulan. Existen dos variantes de estas estufas: la estufa Poupinel, que es más pequeña, y el horno Pasteur.

En las estufas de calor seco pueden esterilizarse los objetos de vidrio o de porcelana y los instrumentos metálicos, después de empaquetarlos en cajas metálicas o en bolsas de papel de aluminio. Se necesita 1 hora a 170 °C para los dos primeros y 2 horas a 160°C para los segundos y el tiempo empieza a contar desde que el aparato alcanza la temperatura indicada. Por eso la duración total del ciclo de esterilización, incluyendo calentamiento y enfriamiento, puede ser de dos horas en el primer caso y de más de dos horas y media en el segundo.

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La estufa de calor seco tiene varias desventajas:

• Es un sistema lento (porque se esterilizan pocos instrumentos en cada ciclo).

• Algunos materiales no soportan estas temperaturas (los plásticos, las gomas o los tejidos).

• Deteriora el filo de los instrumentos metálicos delicados.

Aun así, es un método sencillo y relativamente barato y su utilización es frecuente en laboratorios farmacéuticos y veterinarios.

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Procedimiento de uso de la estufa de esterilización

1. Coloca los instrumentos en el interior de la estufa, una vez empaquetados.

2. Ponla en marcha.3. Selecciona la temperatura en el termostato y el tiempo

en el reloj, en función del material que vayas a esterilizar. La temperatura se va elevando progresivamente hasta alcanzar la seleccionada, algo que puedes ir comprobando con el termómetro interior.

4. El aparato se detiene cuando se consume el tiempo programado.

5. Deja que vaya descendiendo la temperatura hasta que esté a menos de 30 °C. Abre entonces el horno y cierra las cajas de instrumental antes de sacarlas.

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La esterilización mediante calor húmedo

El método de esterilización más conocido que utiliza el calor húmedo es el autoclave, aunque con él puede conseguirse esterilización o desinfección, en función del tiempo y de la temperatura seleccionados.

El autoclaveEn nuestra vida cotidiana aprovechamos dos cualidades del vapor de agua: su penetración y su facilidad para difundir el calor. Estas dos cualidades son la base del autoclave.El autoclave es un recipiente de paredes gruesas con tapa hermética, con mandos para regular la temperatura, el tiempo y la presión. En términos sencillos, un autoclave funciona como una olla a presión. El vapor de agua es mucho más penetrante que el calor seco, lo que permite que el autoclave pueda trabajar a temperaturas más bajas que la estufa Poupinel y conseguir el mismo resultado.

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En las unidades de esterilización de los grandes laboratorios tienen autoclaves muy grandes, mientras que en los laboratorios más pequeños, los aparatos son menores y por ello los denominan miniclaves.

En el interior del autoclave se encuentran el termómetro, el manómetro y la rejilla sobre la que se colocan los objetos dentro de sus paquetes. En el fondo está el recipiente para el agua destilada, la que se calentará por acción de las resistencias y se convertirá en vapor.

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El autoclave dispone de una llave que puede colocarse en distintas posiciones, cada una con su objetivo:

• VA. Vaciado. Permite sacar el agua interior y añadirle más para el ciclo siguiente.

• V. Vapor. Deja salir el vapor de agua, mezclado con el aire, mientras el interior del autoclave se calienta. Así se elimina todo el aire interior y únicamente queda vapor, que saturará el interior del aparato y difundirá de forma homogénea el calor.

• C. Cerrado. Evita la salida de vapor, de modo que la presión interna aumenta.

• El último elemento del autoclave que hay que destacar es la válvula de seguridad. Si la presión interna en el aparato sobrepasara la que ésta puede tolerar, la válvula se abriría y dejaría salir vapor de agua.

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Veamos el funcionamiento del aparato:

1. Una vez ubicados los paquetes en su interior, ciérralo herméticamente y ponlo en marcha con la llave de purga en posición V.2. Cambia la llave de purga a C sólo cuando salga bastante vapor por el conducto de purga. Si queda aire en el interior del autoclave, la esterilización no será correcta.3. A partir de entonces, observa cómo suben la presión y la temperatura.4. Cuando la presión y la temperatura lleguen a los valores deseados, modera la fuente de calor para que se mantengan estables durante el tiempo necesario.5. Al finalizar el programa de esterilización, rota la llave de purga a V para que salga el vapor y el interior pueda enfriarse rápidamente.6. Podrás abrir la tapa del autoclave cuando deje de salir vapor y el manómetro indique la misma presión que la atmosférica.7. Sin embargo, deja enfriar todavía un poco más su contenido antes de sacar los paquetes con los objetos esterilizados.8. Finalmente, verifica si el proceso se ha llevado a cabo correctamente, del modo que explicaremos al final de la unidad.

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Los autoclaves tienen una bomba de vacío que primero aspira el aire para acelerar la purga, y más adelante, una vez finalizado el programa,aspira el vapor, con lo que el material se seca y se enfría más rápidamente; de modo que se acorta el ciclo de esterilización.

En resumen, los autoclaves modernos realizan los ciclos automáticamente, de modo que, si funcionan correctamente, puedes ponerlos en marcha y hacer otro trabajo. El problema de tener máquinas automáticas es que algunas personas de las que las utilizan no han aprendido qué es lo que sucede dentro de ellas, y saberlo es imprescindible, como mínimo para poder percatarse de si algún paso se ha realizado de una forma incorrecta.

En el autoclave se pueden esterilizar objetos de goma y caucho, como guantes, tejidos, gasas, cristal, metal, líquidos, etc. Los programas de tiempo y temperaturas varían en función del objeto que se esterilice.

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La esterilización en frío

La esterilización en frío se consigue usando rayos gamma, una forma de radioactividad, que son radiaciones con mucha energía, capaces de destruir los gérmenes.

Estas radiaciones son tan penetrantes que esterilizan el material aunque esté envuelto en plástico e incluso dentro de cajas de cartón o madera. La irradiación no deja residuos radioactivos en los objetos. Ahora bien, a causa de esta inmensa capacidad de penetración, es imprescindible que las instalaciones para la irradiación estén muy bien aisladas, para evitar que los rayos gamma afecten a las personas o se dispersen por el ambiente.

Dado que estas instalaciones son muy complejas y caras, las emplean las industrias especializadas que fabrican material desechable, como catéteres intravenosos, válvulas, placas de Petri o material plástico de un solo uso, como asas de siembra, pipetas y puntas de pipeta.

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Los filtros

Los filtros son dispositivos formados por unas telas continuas con poros; estos poros son más pequeños que los microorganismos (filtros Milipore). A través del filtro se hacen pasar líquidos o gases, de modo que los gérmenes quedan retenidos en él. Los filtros son útiles para esterilizar líquidos o gases que contienen sustancias químicas o biológicas que se destruirían con el calentamiento.

La filtración se realiza en aparatos estériles, formados por dos piezas desmontables, unidas por una pieza donde se sitúa el filtro. El recipiente superior tiene una entrada con tapón hermético por la que se vierte el líquido. Al principio el líquido pasa por sí solo del recipiente superior al inferior, pero después es necesario acoplar una bomba de vacío, que impulse o que aspire, para que el líquido siga fluyendo, porque el filtro opone mucha resistencia al paso de aquel.

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7.4.2. Los métodos químicos de esterilización

Algunos instrumentos no soportan temperaturas superiores a 60ºC, como los que contienen fibra óptica o los plásticos termolábiles, por lo que es necesario esterilizarlos en frío mediante sustancias químicas. El problema es que las sustancias químicas, utilizadas en concentraciones y durante períodos suficientes para ser letales para todos los microorganismos, son tóxicas también para las personas, de modo que hay que usarlas con unas precauciones especiales.

Existen diferentes compuestos utilizables como esterilizadores químicos: el más común es el glutaraldehído.

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El glutaraldehídoEl glutaraldehído es un bactericida potente y rápido, útil para esterilizar los instrumentos termosensibles que han de tocar las mucosas o las cavidades no estériles del organismo.

Los instrumentos deben sumergirse durante 6 horas en una solución al 2 % alcalinizada a pH cercano a 8 y después enjuagarse muy bien con agua destilada abundante.

Si preparas la disolución con agua caliente se formarán vapores tóxicos; por este motivo, los recipientes para el glutaraldehído deben tener tapadera y durante la manipulación debes usar guantes, mascarilla y protección ocular. La zona de esterilización con glutaraldehído debe estar separada de las demás áreas de trabajo o debe disponer de ventilación o de extracción de vapores.

La solución base de glutaraldehído es estable durante dos años si se conserva en un lugar fresco, mientras que la solución activada dura unos 14 días.

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Métodos minoritarios de esterilización

- El formaldehído es un líquido muy tóxico que se utiliza para esterilizar, pero únicamente en manos de profesionales especializados.

- El peróxido de hidrógeno en estado de plasma (un estado intermedio entre líquido y gas) es un esterilizador con muchas ventajas: no necesita calor, el ciclo dura entre 55 y 75 minutos y tampoco requiere ventilación posterior, porque no deja ningún residuo tóxico. Tiene como inconveniente, no obstante, que es muy caro.

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7.4.3. La calidad de la esterilizaciónQue la esterilización ha sido correcta se puede comprobar de diversas formas:

• Por las gráficas del autoclave que recogen la evolución de las presiones y de las temperaturas en su interior.

• Por el cambio de color del producto químico que impregna la cinta adhesiva que se adhiere a la envoltura de plástico del objeto.

• Por la comprobación de las bacterias en medio acuoso que se introducen en el aparato: Bacillus stearotermophilus, para el autoclave y Bacillus subtillis para calor seco.

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7.5. La unidad de esterilización

En los laboratorios grandes, que procesan centenares o miles de muestras cada día, existe una unidad de esterilización perfectamente definida tanto física como funcionalmente, mientras que en los laboratorios medianos o pequeños basta con un área en la que se realicen las operaciones de limpieza, desinfección y esterilización,

aunque no esté aislada del resto de las instalaciones. En este apartado describiremos la unidad de esterilización separada del resto de actividades del laboratorio.

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7.5.1. Organización de la unidad de esterilización

La unidad de esterilización se encarga de recibir el material, clasificarlo como estéril o no, preparar el que no lo es para su esterilización, llevar a cabo el procedimiento, almacenar el material estéril y distribuirlo al resto de las unidades del laboratorio a medida que lo necesiten.

La mayoría de las tareas de la unidad de esterilización puede realizarlas un auxiliar bien preparado, aunque siempre deberá supervisarlas el personal técnico.

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La unidad de esterilización de un laboratorio tiene una estructura establecida, con las áreas de trabajo distribuidas de forma secuencial. El diseño básico es el siguiente:

• 1. Un punto de recepción de material contaminado.

• 2. Una zona de trabajo con el material contaminado, en la que se revisa el material:

- Comprobando que está limpio y que funciona.- O, si no está lo bastante limpio, se vuelve a lavar o bien se devuelve

al remitente, según lo que especifique el protocolo del centro.

• 3. Una zona de empaquetado, donde se preparan los paquetes y los recipientes apropiados según el material que deba esterilizarse y el procedimiento adecuado para hacerlo.

• 4. Una zona de esterilización, con autoclaves, hornos Pasteur, etc.

• 5. Una zona de almacenado, donde se guarda el material estéril.

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La unidad de esterilización: normas y precauciones específicas

- Al entrar, cámbiate el uniforme y el calzado (o bien ponte calzas), lávate las manos y los antebrazos y cúbrete el cabello con un gorro.

- No lleves pulseras, anillos ni reloj.

- En la zona estéril debes llevar guantes y bata estériles.

- Si sales de la unidad, tendrás que volver a vestir el uniforme del laboratorio y volver a lavarte y ponerte ropa estéril y calzas al entrar de nuevo en la unidad.

- Transporta los paquetes estériles en una bandeja o en un carro, minimizando los roces con los vestidos

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7.5.2. El procedimiento de esterilización

El manejo del material dentro de la unidad de esterilización sigue un procedimiento largo, que explicamos paso a paso.

1. Comprueba que el material esté correctamente limpio y que funcione, en el momento de recibirlo.

2. Clasifica los instrumentos según el mecanismo de esterilización que necesiten y sepáralos para introducirlos en cajas metálicas, en tubos de ensayo o en paquetes.

3. Empaquétalo. El envoltorio debe ser poroso, para permitir el paso del vapor o del producto químico, pero también impermeable a los microorganismos. Los envoltorios más comunes se consiguen con bolsas mixtas, tallas de tela o papel y con cajas metálicas perforadas.

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- Bolsas mixtas. Una de sus caras es de papel y la otra, de plástico, habitualmente de polietileno o polipropileno. La bolsa se sella por termosoldadura y se deja cerrada, antes de esterilizar. Estas bolsas son envases ideales porque se pueden almacenar, conservando la esterilidad durante seis meses y porque el sistema de apertura permite abrirlas con una manipulación mínima.

- Tallas de tela o de papel especial desechable. En estos casos debe aplicarse un doble envoltorio, uno interno y otro externo. Este último tiene que estar precintado con cinta adhesiva termorresistente.Los objetos punzantes o cortantes deben ir protegidos para evitar que rompan las bolsas. Estos objetos también se pueden esterilizar metiéndolos en unos tubos debidamente preparados.

4. Añade los indicadores necesarios en cada punto, que servirán para comprobar al finalizar el proceso que la esterilización ha sido correcta.

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5. Rotula los paquetes con las fechas de envasado y, si es necesario, con su identificación. Todos deben llevar una fecha de caducidad, porque el envoltorio preserva la esterilidad únicamente durante un cierto tiempo, aunque el paquete esté correctamente cerrado y se mantenga en condiciones óptimas de almacenamiento, manipulación y transporte. Por ejemplo, las bolsas mixtas termoselladas la mantienen entre seis y doce meses.

6. Comprueba que el paquete sea correcto y clasificalo en bandejas, según el proceso de esterilización que necesite. Cuida que el material no esté amontonado en el interior de la cámara.

7. Acciona la máquina y vigila su funcionamiento.

8. Comprueba mediante los indicadores que la esterilización ha sido correcta.

9. Clasifica el material estéril en función de la unidad a la que pertenece y guárdalo en el almacén, bien ordenado.

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7.5.3. Los indicadores de comprobación de la esterilidad

Para evaluar si el proceso de esterilización se ha realizado correctamente disponemos de diferentes indicadores, que nos permiten verificar la efectividad del sistema y en consecuencia confiar en su esterilidad. Estos indicadores son de tres tipos: los físicos, los químicos y los biológicos y se utilizan los tres al mismo tiempo.

- Indicadores físicos. Son los termómetros, manómetros y relojes que llevan incorporados los aparatos, que permiten comprobar que se han alcanzado las condiciones de presión y temperatura adecuadas en el ciclo de esterilización.

También hay sondas termométricas, que se colocan en el interior del equipo y continuamente registran la temperatura en ese punto y van transmitiendo la información a un ordenador, que dibuja la gráfica del ciclo completo, asegurando que en todo momento se ha mantenido la temperatura adecuada.

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- Indicadores químicos. Los indicadores químicos son sustancias que impregnan una tira de papel y que cambian de color al calentarse a 100 °C a la presión adecuada. Sin embargo, ello no significa que estas condiciones se hayan mantenido durante todo el ciclo. Estos indicadores deben colocarse en cada paquete que tiene que esterilizarse.

Se emplean dos indicadores en cada paquete, uno externo y otro interno. El externo sirve para saber que el paquete ha sido introducido efectivamente en el autoclave. El interno o de penetración se coloca en el centro del paquete, con el material, y permite comprobar que el vapor ha llegado a todo el paquete y durante un tiempo determinado.

Además, en el primer ciclo de esterilización de cada día se añade un tercer indicador, que se deposita en un lugar recóndito de la cámara. Si al acabar este ciclo en el indicador se produce un cambio de color uniforme, esto significa que el vapor o el gas llegan incluso a los lugares más difíciles. En cambio, el hecho de que en el indicador se observe una zona central rosa, señala que estos no se difunden lo bastante como para garantizar la correcta esterilización.

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- Indicadores biológicos. Son preparados comerciales que contienen esporas de las bacterias Bacillus stearothermophilus para el autoclave o Bacillus subtilis para la cámara de óxido de etileno, unas especies muy resistentes a los agentes físicos y químicos y al mismo tiempo inocuas. Las esporas se encuentran en tiras de papel, en ampollas o simplemente en placas de Petri.

Siempre siguiendo las instrucciones del fabricante, introduce los envases con esporas en la cámara. Después del ciclo, incúbalos a las condiciones de temperatura y tiempo marcadas en el protocolo de uso. Si no crece nada, significa que la esterilización los ha destruido, es decir, que el proceso ha sido correcto.

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Si los gérmenes crecen en el cultivo, la esterilización ha sido incorrecta y no se puede confiar en ninguno de los productos tratados en ese intervalo de tiempo. Si se trataba de material, debe esterilizarse de nuevo. Si se trataba de medios de cultivo, puede rechazarse todo el lote o bien incubar una pequeña parte de los mismos sin inocular nada, en las mismas condiciones a las que se incubó la muestra, con el fin de asegurar que no crecen microorganismos interferentes. La opción dependerá de los criterios de seguimiento de la calidad que se tengan establecidos en el laboratorio.

Como puedes suponer, esto significa que el material esterilizado tiene que estar en cuarentena durante el intervalo que dura la prueba, hasta estar seguros de que la esterilización se ha efectuado correctamente.