síntesis de polihidroxialcanoatos a partir de bacterias diazótrofas aisladas de nódulos de...

SÍNTESIS DE POLIHIDROXIALCANOATOS A PARTIR DE BACTERIAS DIAZÓTROFAS AISLADAS DE NÓDULOS DE

LEGUMINOSAS DE LA SUBFAMILIAFABOIDEAE EN BOSQUES ALTOANDINOS DEL DEPARTAMENTO DE NARIÑO

SUMMARY POLYHYDROXYALKANOATE DIAZOTROPHIC BACTERIA FROM ISOLATEDFROM NODULES OF LEGUMES IN THE WOODS FAMILY FABACEAE ANDEAN

HIGHLANDS OF NARIÑODaniel Bravo Benavides*; Pablo Fernández Izquierdo *

* Departamento de Biología, Universidad de Nariño RESUMENEvaluamos la producción de Polihidroxialcanoatos (PHAs) en 115 aislamientosbacterianos de la familia Rhizobiaceae obtenidos a partir de nódulos de 121plantas silvestres pertenecientes a 23 especies de la familia Fabaceae. Encomparación con otros aislamientos bacterianos la cepa DPAV3T4 sintetizó altosniveles de PHAs en un caldo con manitol como fuente de carbono. La cepa fuecaracterizada mediante pruebas fisiológicas y electroforesis de isoenzimasmultiloci. Todos los aislamientos bacterianos sintetizaron el homopolímeroPolihidroxibutirato (PHB).

Palabras Clave: Polihidroxialcanoatos, Diazótrofos, leguminosas,Bradyrhizobium.

ABSTRACT

The production of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) was evaluated in 115 bacterialisolates of the Rhizobiaceae family obtained through 121 nodules of wild plantswhich are members of 23 species of the Fabaceae family. In comparison withother bacterial isolates the strain DPAV3T4 synthesized high levels of PHAs inculture medium using manitol as carbon source. The strain was characterizedthrough physiological and electrophoresis multiloci isozyme tests. All bacterialisolates synthesized Polyhydroxybutyrate (PHB) homopolymer.

Keywords: Polyhydroxyalkanoates, Diazotrophs, Legumes, Bradyrhizobium.

Recibido: agosto 30 2009Aceptado: septiembre 15 de 2009

Correspondencia: Universidad de Nariño Ciudadela Universitaria Torobajo,Bloque 3 Piso3. Grupo de Biotecnología Microbiana. Email: [email protected]

Rev. Asoc. Col. Cienc. Biol. (Col.), 21: 11-19; 2009

Síntesis de polihidroxialcanoatos

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1. INTRODUCCIÓN diazótrofas aisladas de plantasleguminosas silvestres de la subfamilia

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son Faboideae. Para ello se identificópoliésteres de origen bacteriano con taxonómicamente plantas hospederaspropiedades fisicoquímicas, similares de bacterias rizobianas; se aislóa los plásticos xenobióticos con la bacterias rizobianas con capacidad departicularidad de ser biodegradables producción de PHAs, sedeterminó las(2, 3). Las bacterias productoras de condiciones de síntesis in vitro dePHAs representan nichos con PHA, se seleccionó un aislamientoadaptaciones fisiológicas particulares. bacteriano con mayor rendimiento deUn nicho poco explorado es el gremio PHAen diferentes fuentes de carbono yde los rizobios productores de PHAs se caracterizó el tipo de polímero(1, 12, 17, 18). sintetizado.

Colombia al ser un país biodiverso 2. MATERIALESYMÉTODOSposee una gran variedad de ambientesque permiten la proliferación de Se colectaron plantas leguminosas desistemas vivos nativos. Cabe señalar siete bosques altoandinos delque el departamento de Nariño cuenta departamento de Nariño: Alto de Daza,con varios ecosistemas que permiten Buesaco, Páramo de Laguna Negra,apreciar la diversidad biótica Páramo de Pueblo Viejo, Balalaika,representativa del neotrópico. Dentro Páramo de Laguna Azufral, Bosquede esos ecosistemas se encuentran los Laguna de Telpis. En cada bosque sepáramos y los bosques altoandinos ubicaron parcelas de muestreo de 50maltamente conservados con especies x 2m (5). Las leguminosas fueronleguminosas silvestres las cuales son identificadas por comparación conlos hospederos preferenciales de ejemplares del herbario PSO de lacomunidades rizobianas. A pesar de Universidad de Nariño (4) y medianteello el conocimiento existente con claves taxonómicas (5,6). Las muestrasrespecto a la síntesis de PHAs en nodulares se transportaron albacterias diazótrofas es muy escaso en laboratorio de Biotecnología de lala comunidad científica (1,17,18), y se Universidad de Nariño en donde sepuede decir que el rol de PHAs en aislaron bacterias productoras derizobios es poco estudiado (1, 17). En PHAs en agar levadura manitolNariño, aunque fueron descritas 478 (YMA) suplementado con Azul Nilo alespecies de plantas nativas de la 0,1% (8), aquellas colonias que bajosubfamilia Faboideae (4), no se luz UV presentaron fluorescenciasconocía la relación fuente de carbono- rojas, amarillas y verdes fueronmetabolismo de PHAs en los seleccionadas como PHApositivas.endosimbiontes.

Inicialmente se asignaron comoPor esa razón y por primera vez en el rizobios aquellos aislamientos quedepartamento de Nariño se investigó la formaron colonias después de tres díasproducción de PHAs en bacterias de cultivo, y que presentaron

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Bravo B., Daniel; Fernández I., Pablo

características culturales similares a las / presión con agitación constante endescritas por Trujillo y colaboradores agitador orbital termostatado a 250(11), posteriormente estos aislamientos rpm durante 48 horas a unase cultivaron bajo condiciones de temperatura de 30ºC (1, 17). Seanaerobiosis en medio de cultivo seleccionó aislamientos bacterianoscarente de sales de nitrógeno (11). como productores de PHAs aquellosF i n a l m e n t e s e r e a l i z ó u n a que resultaron positivos a la prueba decaracterización mediante tinciones de azul nilo y tinción con sudan negro IIgram, perfil de antibióticos (con: (8, 13). Para estimar la síntesis deAmikacina, Ampicilina, Bacitracina, P H A s e n l o s a i s l a m i e n t o sCeftazidima, Ácido Fuscídico, seleccionados se utilizó el medio deL i n c o m i c i n a , N o v o b i o c i n a , cultivo líquido levadura manitol YMTirmetroprim Sulfametoxasol , (1), y se determinó como variables deVa n c o m i c i n a ) ( 1 6 ) , p r u e b a s respuesta la biomasa total medida porbioquímicas (como: Citrato de gravimetría, la producción de PHAsSimmons, ureasa, bilis esculina, calculado por CG y el rendimientoreducción de nitrato, reducción de D- producto /biomasa (Yp/x) (10, 17). ElManosa, Maltosa, Ramnosa y Manitol) aislamiento bacteriano con mayor(12) y por electroforesis de tres producción de PHAs fue cultivado conisoenzimas multiloci: Alanina diferentes fuentes de carbono (19)Deshidrogenasa (ALD), Fosfatasa glucosa, sacarosa, galactosa y xilosa,

-1Alcalina (FAK) y Peroxidasa (POX) cada una a concentración de 10 g.l en(11,15). Mediante la matriz obtenida medio base compuesto por loscon los marcadores descritos se realizó nutrientes mencionados en el párrafoun dendrograma de simili tud anterior.poblacional usando el paquetebioinformático NTSys versión 5.01, El polímero se extrajo de acuerdo conaplicando el método de distancia la metodología propuesta por Hesse (9)UPGMA y una matriz Euclidiana (23). y modificada por Fernández (10). LaLas condiciones de la corrida muestra de polímero se esterificóelectroforética se realizaron según la mediante la metodología propuesta pormetodología propuesta por Eardly Braunegg (25) y se identificó por(24). cromatografía de gases utilizando las

condiciones de corrida de FernándezTo d o s l o s e x p e r i m e n t o s d e (14) que consistieron en inyectar 1 µLfermentación se realizaron en de muestra en cromatógrafo de gasesErlenmeyers de 500mL con 210 ml de (CGSM) marca Shimadzu GC-17ª,caldo de cultivo constituido por (en versión 3, con puerto de inyección

-1g.L de agua destilada) Manitol, 10g; Split/Splitless, se utilizó un detectorExtracto de levadura, 0,2 g; Peptona, FiD, Split: 80:1, con una columna DB50,8 g; MgSO 7.H O, 0,5 g; K HPO , (30 mt x 0.25 mm de diámetro; 25 µm4 2 2 4

0,5 g; NaCl, 0,1 g. Concentración final de espesor); el gas de arrastre fue Helio-1de nitrógeno: 1 g.L ; pH: 6,8 a 100 KPascales de Presión, con

-1Esterilización a 121ºC x 15 min. 15 Lbs velocidad lineal de 40 cm.seg ; flujo

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-1interno de 1 mL.min ; la rampa de m u e s t r e o t o t a l ; 6 e s p e c i e s-1temperatura fue de 60º (@6ºC.min correspondieron a los bosques

hasta 90ºC 5 minutos), el total de aledaños a la Laguna Negra y Lagunacorrida fue de 12 minutos. Los tiempos de Telpis al sur este del departamento,de retención calculados se compararon valor equivalente al 21%; y 4 especiescon patrones de copolímero Poli-3- correspondieron a la los bosques dehidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato Balalaika, Laguna Azufral y Pueblode marca Supelco®, según las viejo, valor equivalente a un 15% delcondiciones del método de Hesse y esfuerzo total de muestreo. Lo anteriorSaroul (8), se utilizó como muestra evidenció que en los bosques Alto depatrón derivados metilados de Daza y Buesaco, se presentó unac o p o l í m e r o B I O P O L P o l i - mayor cantidad de especies.(Hidroxibutirato-co–Hidroxivalerato80:21) disponibles en el laboratorio de De las 23 especies de plantas fabáceas,Biotecnología de la Universidad de 16 presentaron nódulos determinados;Nariño. El análisis estadístico se y 7 p r e s e n t a r o n n ó d u l o srealizó mediante el programa indeterminados. Se obtuvo un total deStatgraphics plus 5.1. 115 asi lamientos bacter ianos

nodulares. Cabe destacar que todos los3.RESULTADOSYANÁLISIS aislamientos bacterianos fueron gram

negativos, con formación de coloniasSe mues t rea ron 101 p lan tas mucoides, de borde regular y elevaciónpertenecientes a 23 especies de cóncava. En nódulos determinados seleguminosas de la subfamilia aislaron colonias separadas yF a b o i d e a e , e n 7 b o s q u e s p e q u e ñ a s ; y e n n ó d u l o scorrespondientes a las tres zonas de indeterminados se obtuvo coloniasaltamontaña del departamento de grandes y mucoides. La descripciónNariño. Para todos los bosques, el macroscópica se ajustó a lasmuestreo se realizó en época seca, descripciones realizadas por Dowlingdurante los meses de Junio a Octubre. (11) y Trujillo (12) para bacteriasEntre las especies observadas se fijadoras de nitrógeno simbiontes dedestacaron Desmodium uncinatum leguminosas. Los resultados de las(Jacq D.C.), la cual presentó nódulos pruebas confirmatorias con tinción deindeterminados. Phaseolus vulgaris azul nilo y sudan negro son iguales a( L . ) q u e p r e s e n t ó n ó d u l o s las reportadas por Vásquez-Arroyodeterminados y grandes; y Lupinus (15) y Vinuesa (16), quienes afirmanpubescens (Benth) el cual formó que éstas características ubican a losnódulos indeterminados. aislamientos seleccionados dentro de

la familia Rhizobiaceae.De las 23 especies de plantascolectadas, 13 correspondieron a los De los 115 aislamientos 15 resultaronbosques alto de Daza y Buesaco PHA positivos por fluorescencia enubicados al noreste del departamento azul nilo y se utilizaron para estimar lade Nariño, lo cual equivale al 65% del producción de PHAs. De acuerdo con



el primer diseño experimental, a partir las fuentes de carbono en aislamientosde los 15 aislamientos bacterianos se silvestre de rizobios nodulantesrealizaron fermentaciones por comparándolo con otros reportadostriplicado para un total de 45 (17,18).fermentaciones. Para cada réplica en elexperimento se obtuvo resultados para Se destaca la alta producción dellas variables del diseño como biomasa, aislado DPAV3T4, comparado con losPHB y rendimiento Yp/x, las cuales se otros aislamientos nativos, ya que elpromediaron como se observa en la PHA en rizobios, además del roltabla 1. tradicional cumple con otras funciones

como por ejemplo, controla el estadoTabla 1. Estimación de la producción de PHAs celular del potencial redox, disminuyea partir de 15 aislamientos bacterianos las concentraciones de oxígeno yobtenidos de nódulos de plantas silvestres de lapermite un concurrente incremento ensubfamilia Fabaceae en la zona andina delDepartamento de Nariño. los niveles celulares de NADP (18),además activa la inhibición de laenzima isocitrato deshidrogenasaNADP dependiente y citrato sintasa.Esta inhibición enzimática, dirige elAcetil-CoA y niveles de NADP yelectrones desde el ciclo de Krebshacia la síntesis de PHB. Por tanto, laproducción de PHA en DPAV3T4probablemente está asociado con lacondición fisiológica de bacterias denódulos determinados, como es el casode los obtenidos a partir de Phaseolusvulgaris (L) (18, 26). El efecto de lasfuentes de carbono a partir del segundodiseño experimental planteado sepuede apreciar en la tabla 2.

Tabla 2. Efecto de las fuentes de carbono en laA través de un análisis de varianza se síntesis de PHB en el aislamiento DPAV3T4estableció que el aislamientobacteriano con mayor producción debiomasa y de PHA fue DPAV3T4obtenido a partir de Phaseolus vulgaris(L.). Se determinó que la máximaconcentración de PHB de bacteriasdiazótrofas asociadas a leguminosas

-1 En DPAV3T4, la cinética desilvestres de Nariño fue de 0.10 g.L encrecimiento con glucosa como fuenteun medio sin optimizar con manitol.de carbono (Figura 1), permiteEste es un buen reporte inicial para laobservar dos fases de crecimiento:producción de polímero en función de

AISLAMIENTO X g/L PHB g/L Y p/x

ALANT5fr2 0,05±0,33 0,03±0.22 0,60

ALANT2c3 0,03±0,00 0,01±0.57 0,33

ALANT2m 0,05±0,35 0,02±0.85 0,40

DCRO2T2 0,05±0,36 0,02±0.04 0,40

DPAV3T4 0,11±0,00 0,10±0.02 0,91

ALANT5f1 0,02±0.27 0,01±0.18 0,50

DERY2T4 0,01±0.57 0,00±0.00 0,00

DCRO2T4 0,06±0,00 0,02±0.66 0,33

TLCA2T1G 0,05±0,41 0,01±0.89 0,21

TLCA2T1 0,08±0.33 0,01±0.85 0,13

DERY2T5 0,03±0,66 0,00±0.00 0,00

TLCA2T1g 0,07±0.66 0,01±0.81 0,14

TTCA3T3g 0,03±0,33 0,01±0.55 0,33

DPAV2T3 0,02±0.66 0,01±0.00 0,50

TTCA3T5g 0,21±0,47 0,00±0.00 0,00

Fuente de Carbono Biomasa g/L PHA g/L µ Yp/x

Glucosa 1,02±0.03 0,13±0.02 0,94 0,13

Sacarosa 0,99±0.02 0,07±0.01 0,92 0,07

Galactosa 0,88±0.01 0,05±0.03 0,73 0,06

Xilosa 0,26±0.04 0,01±0.01 0,69 0,04



exponencial y estacionaria. La glucosa lo cual, las fuentes de carbono influyenes un carbohidrato sencillo y la directamente en el nivel de síntesis demayoría de los organismos vivos PHB en el aislamiento DPAV3T4.pueden catabolizarlo y en el caso de lasbacterias la glucosa es fácilmente Con los perfiles bioquímicos detransportada a través de la membrana antibióticos e isoenzimáticos sec i t o p l a s m á t i c a y p u e d e s e r demostró que el aislamiento DPAV3T4transformada en polímeros de reserva tiene un patrón de respuestas similar aintracelular (21, 21). l a c e p a s c o m e r c i a l e s d e

Bradyrhizobiumsp. (16, 18). Se realizóun dendrograma de similitud paradeterminar el grado de cercanía entre lacepa evaluada en este trabajoDPAV3T4 (Figura 2) con la cepacomercial Bradyrhizobium japonicumDSMZ144 (11). Se utilizó comoOutgroup dos cepas de referenciautilizadas por Trujillo, pertenecientes adiferentes géneros: Ochrobactrumlupini LUP21T y MesorhizobiummediterraneumRch-984 (12).

Fi g u r a 1. Ci n é t i c a s d e c r e c i m i e n t o e n Gl u c o s a d e l a

c e p a DPAV3T4Los ais lamientos bacter ianosALANT5f1 (de Lupinus pubescensUna característica que se puedeBenth) Y DERY2T5 (de Desmodiumobservar en la producción de PHBuncinatum Jacq D.C.) mostraron dos(Figura 1) es que se inicia cuando elm o v i l i d a d e s e l e c t r o f o r é t i c a screcimiento celular llega a la faseperoxidasa diferentes a las reportadasestacionaria, aproximadamente a laspor la literatura, indicando la18 horas de fermentación. Por lo tanto,posibilidad de que cada uno de loslas fermentaciones son no asociadas alaislamientos presente dos tipos decrecimiento (21; 21); pero a pesar dei s o e n z i m a s d i f e r e n t e sello, no es un metabolito secundariocorrespondientes a los dos productosporque no es excretado al medio ni esproteicos observados en el patróntóxico para la bacteria (1,17).electroforético: Haloperoxidasas yAlquilhidroperoxidasas D (22).En la evaluación de las fuentes deMediante las pruebas realizadas secarbono, el mejor rendimiento se diopuede establecer que el aislamientobajo las fermentaciones que conteníanDPAV3T4 pertenece al géneroglucosa como fuente de carbono (Yp/xBradyrhizobium y se puede reportar0,13). Se encontraron diferenciascomo cepa Bradyrhizobium sp.significativas en la síntesis de PHB enDPAV3T4función de la biomasa con los

diferentes tratamientos empleados; por


Br a v o B., Da n i e l ; Fe r n á n d e z I., Pa b l o

En la región andina del departamentode Nariño, se reportan por primera vezaislamientos bacterianos fijadores denitrógeno productores de PHAs.

4. CONCL USIONE S

En 7 bosques altoandinos seobtuvo un total de 23 especiesvegetales pertenecientes a lasubfamilia Faboideae.De 115 aislamientos bacterianos

Fi g u r a 2. Ca r a c t e r i z a c i ó n d e l a c e p a DPAV3T4 obtenidos en esta investigación,m e d i a n t e p e r f i l d e b i o q u í m i c a s , a n t i b i ó t i c o s e 15 presentaron característicasi s o e n z i m a s fenot íp icas de la fami l ia

Rhizobiaceae y también fueronEn los cromatogramas de las muestrasproductores de PHAs.d e p o l í m e r o p r o d u c i d o p o rDe 15 aislamientos bacterianosBradyrhizobium sp. DPAV3T4 seproductores de PHA, DPAV3T4observa el pico representativo de lafue el mayor productor con 110fracción butirato con un tiempo demg por litro y alcanzó unaretención de 4.84 minutos (Figura 3),producción de 130mg por litro ensimilar al tiempo de retención delun medio de cultivo que utilizapatrón, por lo cual es posible afirmarglucosa como fuente de carbono.que Bradyrhizobium sp. DPAV3T4En el aislamiento DPAV3T4, lassintetiza el homopolímero poli-3-fuentes de carbono utilizadashidroxibutirato.influyen en el nivel de síntesis depolihidroxibutirato y no afectan lacomposición monomérica delpolímero.

5. R E FE R ENC IAS

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