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Editores: Manuel Rey MéndezJacobo Fernández CasalMónica Izquierdo Rodríguez

ORGANIZADO POR:Padroado de Turismo do Concello de O Grove

Dpto. de Bioquímica e Bioloxía Molecular da Universidade de Santiago de Compostela • Insuiña, S.L.PATROCINADO POR:

Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento • Consellería de Pesca e Asuntos MarítimosUniversidade de Santiago de Compostela • Fundación Alfonso Martín Escudero

Padroado de Turismo do Concello de O Grove • Insuiña, S.L. PescanovaColegio oficial de Biólogos. Delegación de Galicia • Skretting • Hotel Louxo. A Toxa

Abelló-Linde, S.A. • Acquariumgalicia • Acquavisión/Galicia • Extrafort • Cortiplas • Ferrovial

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VI FORO DOS RECURSOS MARIÑOS E DA ACUICULTURA DAS RÍAS

GALEGAS

XV CICLO CULTIVANDO O MAR

“MAREAS NEGRAS: CASO PRESTIGE”

Illa de A Toxa (O Grove), 9 e 10 de outubro do 2003

Os Coordinadores deste VI FORO DOS RECURSOS MARIÑOSE DA ACUICULTURA DAS RÍAS GALEGAS dan as graciaspola súa colaboración ás seguintes entidades:

Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento. Xunta de GaliciaConsellería de Pesca e Asuntos Marítimos. Xunta de GaliciaUniversidade de Santiago de CompostelaFundación Alfonso Martín EscuderoPadroado de Turismo do Concello de O GroveInsuiña, S.L. PescanovaColexio Oficial de Biólogos. Delegación de GaliciaSkrettingHotel Louxo. A ToxaAbelló-Linde, S.A.AcquariumgaliciaAcquavisión/GaliciaExtrafortCortiplasFerrovialÓ público pola súa participación

Composición: Jorge Rodríguez Castro e Aurora Seijas FajínDepósito Legal: C-897-2004ISBN: 84-608-0102-0

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La Subclase Copepoda esta integrada por más de 7500 especies de vida libre y parásitaen vertebrados e invertebrados. El parasitismo como forma de vida, ha impacto dramáticamentesobre la morfología típica de un copépodo, sufriendo adaptaciones morfológicas altamenteespecializadas para esta forma de vida. Debido a esto los estudios taxonómicos y las diagno-sis de especies nuevas en algunos casos son poco confiables, complicadas y confusas. Sieteespecies del genero Clavella (familia Lernaeopodidae) han sido documentados para las costasdel Cono Sur, de las cuales 5 habitan en aguas chilenas. Anisotremus scapularis es pez propiode la costa norte de Chile, en la cual co-habitan Clavella caudata y Clavella applicata, junto aotras especies congenéricas que infectan diversos sitios en el pez, y sobre los cuales no se tienecerteza de su afiliación taxonómica. Una tercera especie (Clavella simplex) es encontrada sobreIsacia conceptionis también en la región Norte. En base a la secuenciación parcial del gen codi-ficante de la Citocromo oxidasa I (COI) se construyó un árbol filogenético tomando como gru-pos externos a Neobrachiella kabatai (Fam. Lernaeopodidae), Metapeniculus antofagastensis,Peniculus sp (Fam. Pennellidae) y Tigriopus japonicus (Harpacticoidea). Los resultados indi-can que 9 de las 10 especies indeterminadas que parasitan a A.scapularis se asocian fielmentecon C. applicata, y una con C. caudata. Se evidencia una fuerte divergencia de la especieC.simplex con respecto al clade que agrupa a las Clavella, donde se discute su afiliación gené-rica actual.

IDENTIFICACION DE ESPECIES BASADA EN LA SECUENCIA DELCOI (ADNmt) DEL GENERO Clavella OKEN, 1815 (Copepoda: Sipho-nostomatoida: Lernaeopodidae) PARASITO DE PECES DE LA COSTANORTE DE CHILE

Burgos, R*; Quiteiro, J.; López-Sánchez, P.; Pérez-Brun, D; Tubío, A; Rey-Méndez, M.*[email protected] de Bioquímica e Bioloxía Molecular Facultade de Bioloxía, Universidade de San-tiago de Compostela.

RESUMEN

INTRODUCCIÓN GENERAL A LOS COPEPODOS PARASITOS

La Subclase Copepoda esta integrada por más de 7500 especies de vida libre que formanparte del zooplancton y comunidades bentónicas, y otro grupo especializado en la vida parási-ta de invertebrados y vertebrados marinos y dulceacuícolas. El parasitismo como forma devida, ha impacto dramáticamente sobre la morfología típica de un copépodo, el cual está com-pletamente modificado y altamente especializado para esta forma de vida, notada especialmen-te en parásitos de peces (Kabata, 1979). Distinto es el caso de los copépodos asociados coninvertebrados, que muestran amplios grados de intimidad con sus huéspedes exhibiendo unenorme espectro de diversidad estructural que en muchos casos son indistinguible de un indivi-duo de vida libre, salvo por su ecología y comportamiento que revela su unión obligatoria a unhospedador (Gotto, 1993). Entre las adaptaciones al modo de vida parasítico podemos encon-trar además, la reducción de estados larvales y el desarrollo de nuevos “tipos” larvales a su ciclode vida, que junto a las adaptaciones morfológicas exhibidas por los adultos tienen dos grandesobjetivos, a) asegurar la mantención del copépodo sobre el hospedador, mediante el desarrollo

Identificacion de especies basada en la secuencia del coi (adnmt) del genero clavella oken, 1815…

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de variados mecanismos de sujeción, tales como poderosas pinzas derivadas de las segundasantenas o el sobrecrecimiento de algunas regiones corporales que forman complejos sistemasde anclaje “holdfast” que se embeben en el tejido del hospedador, y b) incrementar la activi-dad reproductiva (Kabata, 1992). La extensión de la modificación estructural sufrida por uncopépodo parásito está determinada por el nivel de intimidad de la relación huésped-parásito yel grado de adaptación al parasitismo. Una de las más simples vías por las cuales un copépo-do cambia una vez que se fija a un hospedador es mediante el proceso conocido como “creci-miento difásico”. Este comienza su primera fase con un crecimiento vigoroso de su región ante-rior inmediatamente después del encuentro con su hospedador, en el cual se desarrolla rápida-mente el mecanismo de adhesión y la obtención de alimento. Una vez asegurada la sujeción yobtención fija de alimento disminuye la tasa de crecimiento de esta región y se incrementa enla región posterior vital para la reproducción (segunda fase). Muchos copépodos exhiben másde dos regiones bien desarrolladas en diferentes tiempos y tasas de crecimiento, en estos casoshablamos de crecimientos polifásicos (Kabata, 1979).

Es difícil actualmente determinar con certeza el numero actual de copépodos parásitosde peces. Kazachenko y Titar (1985) estimaron que alrededor de 1700 especies parasitan peces,de los cuales el 85,3% son especies marinas. La estimación más reciente fue indicada en 1988por Kabata, estimando este número entre los 1600 a 1800 especimenes Sin embargo, este rangose encuentra bajo frecuentes modificaciones, es decir, nuevas descripciones incrementan elnumero año a año, como también revisiones taxonómicas y reexaminaciones lo disminuyen.(Kabata, 1992).

Las especies parásitas se agrupan dentro de tres grandes taxas en una proporción muydesigual. Alrededor del 75% pertenecen al Orden Siphonostomatoida, el 20% a los Poecilos-tomatoida y el 5% a Cyclopoida (Kabata, 1992). Todos ellos constituyen el grupo de crustáce-os parásitos más comunes en los peces (Roberts, 2001). Estos parásitos no sólo pueden pro-ducir graves epizootias sobre su hospedador por su acción mecánica sobre la piel y branquias,si no que además pueden funcionar como vectores de enfermedades virales (Nylund et al,1994) e incluso agentes bacterianos primarios (Almendras & Fuentealba, 1997; Cusack &Cone, 1986) u oportunistas (Burgos et al, no publicado).

El Genero Clavella Oken, 1816

Los copépodos parásitos del género Clavella, viven exclusivamente sobre peces teleós-teos y están ampliamente distribuidos en los océanos Atlántico y Pacífico, principalmente en elhemisferio Norte. Hasta el año 1985, sólo dos especies se conocían en aguas del hemisferioSur, C. adunca sobre Doydixodon fasciatus en la costa Oeste de Suramérica (Wilson, 1923)y C. bowmani en Patagonotothen sima desde el Estrecho de Magallanes (Kabata, 1963). Pos-teriores contribuciones al conocimiento de esta especie han sido hechas por Castro y Baeza enla costa chilena, con la descripción de 5 especies nuevas; Clavella applicata y C. caudata (Cas-tro y Baeza, 1985a), C. simplex (Castro y Baeza, 1985b), C. convergentis y C. chiloensis (Cas-tro, 1994); y una nueva distribución y hospedador para C. parva (Castro y Baeza, 1985a) y C.adunca (Castro, 1994). Conjuntamente en la costa peruana se documentó la presencia de C.simplex y C. applicata sobre sus hospedadores originales (Luque y Farfan, 1990) . Actual-mente el género Clavella esta compuesto por 31 especies nominales, aunque la validez de algu-nas de ellas han sido cuestionada por Kabata (1979).

VI Foro dos Recursos Mariños e da Acuicultura das Rías Galegas

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De las siete especies descritas para las costas chilenas, dos especies comparten elmismo hospedador (Anisotremus scapularis) solapando sus sitios de infección. C. caudata sefija sobre las aletas pectorales y superficie interna del opérculo, mientras que C. applicata lohace exclusivamente sobre las aletas pectorales. Especimenes pertenecientes al genero Clave-lla sobre este mismo hospedador han sido observados adheridos en diferentes regiones corpo-rales, tales como el maxilar superior, aleta pectoral, aleta ventral y espacios intermaxilares.Estudios preliminares sugieren la presencia de una nueva especie (Castro y Burgos; no publi-cado), sin embargo, el diminuto tamaño y baja prevalencia sobre el hospedador resultan en unaescasa disponibilidad de material para su estudio, lo cual sumado a la complicada taxonomía deeste grupo y la carencia de descripciones confiables hacen difícil realizar una buena diagnosis.

Tradicionalmente los estudios taxonómicos y filogenéticos de los copépodos parásitos hansido basados sólo sobre aspectos morfológicos (Huy & Boxshall, 1991; Boxshall, 1986; Kabata,1979). Actualmente en copépodos parásitos del orden Siphonostomatoida, se conoce la secuenciaparcial del gen 18s (rARN) y ITS1 de Lepeophtheirus salmonis (familia Caligidae) (Shinn et al,2000) y solo referencias de otras siete familias, con las regiones parciales del COI (citocromo oxi-dasa I) y 16s (ADNmt) presentados en el I CONGRESO INTERNACIONAL DE COPEPOLO-GOS EN TAIWAN (Dippenaar y Crandrall, 2002) resultados que no han sido publicados.

El gen mitocondrial COI ha sido utilizado satisfactoriamente en la diferenciación entreespecies congenéricas y claramente emparentadas entre copépodos harpacticoideos (Burton &Lee, 1994; Rocha-Olivares et al, 2001), calanoideos (Hill et al, 2001), especie de insectos(Brown et al, 1994), nemátodos (Blouin, 2002) y entre diversos grupos de invertebrados (Fol-mer et al, 1994).

La evaluación molecular de las divergencias genéticas y relaciones filogenéticas entreespecie congenéricas de los copépodos parásitos, es importante para mejorar el conocimientoactual de la fauna parásita que afecta a los peces de las costa de Chile, pudiendo contribuir deesta forma al mejor entendimiento de aspectos relacionados con su taxonomía, distribución geo-gráfica, especificidad en sus hospedadores, relaciones ecología y dinámica poblacional.

En este estudio la amplificación parcial del gen COI fue utilizada como un carácter sis-temático molecular para la diferenciación entre especies del genero Clavella y corresponde a lasprimeras secuencias para este gen en las familias Lernaeopodidae y Pennellidae.

MATERIALES Y METODOS

Colección de la muestras.

A partir de peces juveniles y adultos de la especie Anisotremus scapularis “Sargo” yIsacia conceptionis “cabinza”, capturados mediante buceo autónomo y pesca artesanal desdela costa de Antofagasta, Norte de Chile (23º 24’ S – 70º 36’ W), se obtuvieron ejemplares adul-tos de Clavella spp. Estos fueron extraídos directamente desde el tegumento de los peces, lava-dos en agua de mar filtrada a 0,45 µm, identificados y posteriormente preservados en etanol 70ºhasta el momento de su análisis. Hembras ovígeras de tres especies nominales y 10 indetermi-nadas fueron utilizadas en este estudio. La tabla 2 resume las especies, hospedador y sitio deinfección de los diferentes ejemplares obtenidos.


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Procesamiento de la muestras.

Los ejemplares fueron lavados en agua estéril y se procedió a retirar el macho adherido alsoma del copépodo hembra. Los sacos ovígeros fueron cortados y el resto del soma fue conserva-do a –20 ºC en etanol a 70º como respaldo. La extracción del ADN total fue realizada mediante lautilización del kit comercial “Dneasy Tissue Kit (Qiagen)” y finalmente eluidos en 50 ul.

Amplificación de ADN.

Una región del mtCOI en torno a los 650 pb fue amplificado utilizando los primers deacuerdo a las secuencias publicadas por Folmer et al (1994). LCO-1490 (5’-GGTCAA-CAAATCATAAAGATATTGG-3’) y HCO-2198 (5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-CA-3’) (Bucklin et al, 1998). Reacciones de amplificación con un volumen de 12,5 µl fueronpreparadas utilizando la enzima Taq-Polimerasa Promega, PCR Buffer II, dNTPs y en concen-traciones de 1,5 a 3,5 mM de MgCl2 en un termociclador Gene Amp FR System Modelo 9700(Applied Biosystem). El protocolo de PCR es una modificación del seguido por Bucklin et al(1998 y 2003) : 94ºC por 3 min de desnaturalización inicial, y 40 ciclos : 94ºC por 1 min dedesnaturalizacion, 37º por 2 min de anillamiento, 72ºC por 3 min de extensión, 72ºC por 5 minextensión final y 4ºC por 5 min de enfriamiento. Los productos de PCR obtenidos fueron ana-lizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5% utilizando buffer TAE (2mM EDTA,40 mM Tris acetato a pH 8,5), suplementados con bromuro de etidio (0,5 g-1 ml-1) en presen-cia de luz UV.

Secuenciación mtCOI.Con el fin de eliminar los restos de primers, dNTPs y polimerasa, los productos de PCR

fueron digeridos con 0,5 µl de Exonucleasa I y Fosfatasa alcalina de camarón a 37º C por 30min y desnaturalizada a 80º por 15 min en un termociclador. Los productos de PCR purifcados


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fueron directamente secuenciados en forward y las muestras problemáticas en ambas direccio-nes, utilizando el Kit comercial de secuenciación BigDye version 3.0 sequencing Kit (AppliedBiosystem). Los productos de extensión fueron separadas y detectadas en un gel de acrilamidacon un secuenciador automático (Modelo ABI PRISM 377, Perkin-Elmer Corporation, USA).

Los electroferográmas obtenidos fueron alineados manualmente con el BioEdit v. 5.0.2(Hall, 1999) y revisados utilizando el programa Clustal W (Thompson et al , 1994). Los datosbásicos acerca de las secuencias fueron obtenidos con el programa DAMBE (Xia & Xie, 2001).Las reconstrucciones filogenéticas fueron realizadas basándose en la estimación de distanciasde Tamura-Nei (Tamura & Nei, 1993) y elaboración de árboles mediante el método de Neigbor-joining (Saitou & Nei, 1987) y estimación del soporte de cada rama mediante el análisis debootstrapping con el programa MEGA (Kumar et al, 1993). Las secuencias traducidas a ami-noácidos fueron usadas para elabora un árbol alternativo.

RESULTADOS

Descripción de la secuencia.

El fragmento amplificado incluye alrededor de 650 pares de bases (pb) del gen mitocondrialCOI. A partir de las secuencias obtenidas se elaboró un alineamiento de 515 pb de secuencias obte-nidas a partir de 13 hembras del genero Clavella, correspondientes a tres individuos de referencia,caracterizados morfológicamente, de especies nominales (C.caudata, C.simplex y C.applicata) y10 individuos de especie indeterminada (Clavella spp), junto a la especie Neobrachiella kabatai(fam. Lernaeopodidae) y 4 representantes de la familia Pennellidae, dos de Metapeniculus antofa-gastensis y dos de Peniculus sp, estos últimos considerados como grupo externo (Tabla Nº 2). Lasecuencia obtenida para las especies utilizadas en este estudio se ubican dentro de la primera mitaddel gen que codifica la citocromo oxidasa I (CO I) en el ADN mitocondrial y su traducción resul-ta en un fragmento de 171 residuos aminoacídicos (aa). En la composición nucleotídica de los espe-cimenes de Clavella se observa una tendencia a mayor presencia de Timina en todos los sitios enlos codones en Clavella applicata, C. caudata y Clavella spp (T=0,42), sin embargo, en Clavellasimplex disminuye esta proporción (T=0,36) pero se incrementa la presencia de Citosina (figura 1).A pesar de ello, se mantiene la homogeneidad en la frecuencia nucleotídica en todos los individuosanalizados (x2= 61,76; gl.= 39; P<0,0116). La diversidad nucleotídica (π) es de 0,1011 ± 0,0484.En el alineamiento de las secuencias parciales de gen COI, fueron identificadas 143 (27,8 %) posi-ciones variables, sugiriendo un moderada variabilidad. Normalmente la variación nucleotídica deesta secuencia codificante es más frecuente en el tercer codón. La relación de transiciones y tran-versiones de las secuencias estudiadas muestran que las sustituciones transicionales (AG, TC) sepresentan con una mayor frecuencia con respecto a las transversiones para el total de las posicio-nes nucleotídicas y todos los niveles de divergencia (figura 2).

La distancia media (Tamura-Nei) entre las secuencias analizadas pertenecientes al géne-ro Clavella es de 0,103. La distancia media intra-específica, dentro de las especies del géneroClavella es de 0,004, mientras que la distancia interespecífica entre las tres especies analizadases de 0,217. Este distinto rango de valores de distancias intraespecíficas e interespecíficas esadecuado para la labor de identificación ya que permite una inequívoca asignación de la mues-tra problema a un clade/especie concreta. En el árbol de NJ, los individuos de especies inde-terminadas (Cspsa 2 -13) se agrupan en un clado monofilético con la secuencia de referencia


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CAPP1 perteneciente a C. applicata. El valor de bootstrapping de este agrupamiento es eleva-do (100%). El clado hermano al anterior, soportado también por un elevado valor de bootsrap-ping (100%) incluye la secuencias de C. caudata y la perteneciente a la especie indeterminadaCspsa 14 (100%). Ambos clados se agrupan con un elevado valor de bootstrapping (91%).Todos los individuos problema presentan escasos valores de divergencia respecto a las secuen-cias pertenecientes a las especies de referencia (Fig.3), permitiendo la fiable asignación de losindividuos problema a las especies C. applicata y C. caudata.

En el árbol no enraizado (Fig. 3) se observa que el grupo de Clavella caudata y C. applicata seagrupan con la secuencia de Neobrachiella kabatai con un valor medio de bootstrapping (60%). Por elcontrario, las secuencias pertenecientes a la especie cogenérica C. simplex se localizan en un posiciónmás divergente. La distancia interspecífica de C. simplex respecto a las cogenéricas C. caudata y C.applicata es de 0,268, mayor que la observada entre dichas especies y Neobrachiella kabatai (0,194).

En una posición basal y divergente se sitúan las especies Metapeniculus antofagasten-sis y Penicullus spp. La distancia interespecífica entre las especies de Familia Penellidae es de0,237, similar a la observada entre las especies del género Clavella.

Para verificar la posición relativa de Neobrachiella kabatai respecto al género Clavellay la monofilia de este último género, se reconstruyeron las relaciones filogenéticas con la pre-sencia de un grupo externo: Tigriopus japonicus (Fig.4). En este caso se observa la monofiliadel género Clavella situándose Neobrachiella kabatai en una posición divergente. Sin embar-go los valores de bootstrapping son no significativos (menor del 50%), observándose una trico-tomía no resuelta afectando a la posición relativa de N. kabatai y C. simplex.

Las secuencias pertenecientes al gen mitocondrial Citocromo Oxidasa I presentan el suficientenivel de polimorfismo y señal filogenética para la elucidación de relaciones filogenéticas entre especiescercanas del género Clavella. Una aplicación práctica de las metodologías de reconstrucción filogenéti-ca, como la asignación de individuos a una especie concreta ha sido posible mediante la utilización deesta secuencia y de especies de referencia caracterizadas morfológicamente. Las especies a la que perte-necen estos individuos problema, C. caudata y C. applicata, son especies simpátricas, parasitarias deidéntico hospedador (A. scapularis ), las cuales muestran unos valores de divergencia lo suficientemen-te elevados como para agruparse monofileticamente con elevados valores de distancia interespecífica.

Sin embargo, la definición del género Clavella como monofilético solo es aportada porla topología basada en el análisis de las secuencias aminoacídicas. Tanto la ausencia de espe-cies en los análisis realizados como la rápida divergencia de N. kabatai y C. simplex, o la natu-raleza polifilética del género Clavella pueden justificar estos resultados, siendo necesario lainclusión de un mayor número de taxa para resolver esta cuestión.

Figura 1: Composición media de nucleótidos en la secuencias parciales de la COImt.


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Figura 2: Relación entre las transiciones (sustituciones) v/s transversiones en función dela distancia de Timura & Nei (1983) para todas las posiciones nucleotídicas.

Figura 3. Árbol filogenético no enraizado basado en distancias de Tamura-Nei y elmétodo de neigbor-joining. Bajo las líneas se incluyen los valores de distancia y por

encima se detallan los valores del análisis de boostrapping (1000 réplicas), mostrándosesólo aquellos valores superiores al 50%. La figuas geométricas indican el hospedador

(Anisotremus scapularis (triángulo); Isacia conceptionis (cuadrado); Odontesthes regiaregia (circulo azul) y Hemilutjanus macrophthalmus).


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Figura 4. Árbol filogenético enraizado basado en distancias de Tamura-Nei y el método de neigbor-joining. Bajo las líneas se incluyen los valores de distancia y por encima se detallan los valores delanálisis de boostrapping (1000 réplicas), mostrándose sólo aquellos valores superiores al 50%. Lafiguas geométricas indican el hospedador (Anisotremus scapularis (triángulo); Isacia conceptionis

(cuadrado); Odontesthes regia regia (circulo azul) y Hemilutjanus macrophthalmus).

Figura 5. Árbol filogenético enraizado basado en distancias de Tamura-Nei y el método deneigbor-joining utilizando la traducción a aminoacidos de la secuencia COImt. Bajo las líneas

se incluyen los valores de distancia y por encima se detallan los valores del análisis deboostrapping (1000 réplicas), mostrándose sólo aquellos valores superiores al 50%.


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El gen mitocondrial COI muestra suficiente variación en su secuencia de nucleótidos entreespecies congenericas como para permitir fácilmente resolver diferencias entre las especies de Copé-podos Lernaeopodeos. Esto es consistente con estudios previos utilizando el COI para examinar lavariación dentro de copépodos harpacticodeos (Burton & Lee, 1994), calanoideos (Hill et al, 2001),entre especies de insectos (Brown et al, 1994) y en las reconstrucciones de las relaciones filogenéti-cas de grupos de especies claramente relacionados en un amplio rango de taxas (Brown et al, 1994),aunque la cantidad de diferencias en las secuencias y de nucleótidos en los estudios de comparaciónde especies difiere entre los taxas estudiados. El fragmento amplificado del COI fue de alrededor de650 pb en todas las especies estudiadas, lo cual esta en concordancia con los resultados obtenidos porBucklin et al (1998 y 2003) en copépodos calanidos utilizando el mis juego de primers.

La distancia genética (TN) entre los individuos indeterminados de Clavella agrupados con C.applicata mostró un valor medio de 0,4% (0,2 – 0,4%) (ver árbol NJ figura 3). Esto sugiere que todaslas especies de Clavella indeterminadas (Cspsa 2 a 13) corresponden a la especie C. applicata. Segúnestos resultados podemos inferir además que C.applicata puede infectar otros sitios en el hospedador(ver tabla 2), lo que se contrapone en cierta medida a lo documentado por Castro & Baeza (1985a) enla descripción original de la especie, donde indican que esta se fija exclusivamente sobre las aletas pec-torales, en efecto, sólo 3 de las 9 especies agrupadas con C.applicata se encontraron en este sitio. Enel grupo de Clavella caudata las distancias genéticas entre las especies (Ccau1, Ccau2b y Ccau3) fuecero, y entre estas y Cspsa 14 no superaron el 0,4%, sugiriendo que esta última pertenece a la espe-cie. El sitio de infección está de acuerdo al descrito por Castro & Baeza (1985a). La distancia gené-tica observada entre Clavella simplex y las especies congenéricas esta en torno al 27%, valor muchomás elevado al registrado entre C.caudata y C. applicata (11%), Neobrachiella kabatai y el grupo C.caudata – C. applicata (19%) y entre géneros distintos de la familia Pennellidae; Peniculus spp yMetapeniculus antofagastensis (24%). Bucklin et al (1999) encontraron que el porcentaje de dife-rencia entre especies de copépodos congenéricas de Calanus, Neocalanus y Pseudocalanus, para unfragmento de 300 pb de la región del COI estuvo entre un 13 y 22%, Por otra parte, las diferenciasgenéticas observadas entre 34 especies provenientes de diferentes mares, y pertenecientes a 10 géne-ros de las familias Calanidae y Clausocalanidae para un fragmento de 639 pb del COI, para especiesde diferentes géneros se movió entre un 12% a 25% y entre especies congenéricas difirieron entre un9 a 24%. La elevada divergencia que presenta Clavella simplex, que se pone en evidencia con losvalores de distancia genética y la topología de los árboles filogenéticos, pone en duda su afiliacióngenérica. Castro & Baeza (1985b) en la descripción original de la especie indican que ambas ramasdel segundo par de antenas presentan el mismo tamaño, así como en la estructura del primer par demaxilas, la cual no es propio del genero e indican que esta característica en la especie debe ser consi-derada como un miembro atípico del genero, aún cuando la morfología de su cuerpo lo sitúa en elgénero Clavella con un alto grado de certeza, donde sólo la descripción del macho disiparía las dudassobre su verdadera afiliación genérica. Los dos aspectos mas importantes acerca de los machos en lafamilia Lernaeopodidae es su diminuto tamaño (particularmente en el grupo de las Clavellas) y su efí-mero ciclo de vida que normalmente culmina con la inseminación de la hembra a la cual permanecenadheridos durante su tiempo de vida. Esto dificulta estudiar su morfología, la cual puede ser consi-derada como una ayuda en la diagnosis genérica. Kabata (1979) clasifica a los machos en tres gru-pos en base a su morfología, la cual sirve para orientar en la clasificación de una especie. Asílos machos de los géneros Advena, Alella, Clavellisa, Clavellodes y Clavellomimus compor-tante la topología del macho de Clavella. Sin embargo, ya que existe esta homología, ¿es posi-

DISCUSION


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ble que machos de especies que co-habiten un mismo hospedador puedan hibridar entre estasespecies y originar una descendencia con una diferencia morfológica tan sutil que no permitauna clara identificación?.

Otra característica importante lo muestra Clavella caudata, la cual presenta pequeñosurópodos modificados en posición dorsal a los orificios de los oviductos (etimología del nom-bre = caudata) (castro & Baeza, 1985a) y que es una característica diagnóstica entre las dosespecies que comparten hospedador. Filogenéticamente y desde el punto de vista morfológico,esta estructura se relaciona con copépodos parásitos de elasmobranquios y que componen larama que soporta el grupo- Charopinus (según el árbol de filogenia para la Familia Lernaeo-podidae, propuesto por Kabata, 1979), y que se diferencia de la otra gran rama que soporta algrupo- Lernaeopoda por la presencia de urópodos modificados, pero en posición ventral a losoviductos. De este brazo emergen las Neobrachiella, grupo el cual puede o no presentar uró-podos. Castro & Baeza (1985a) indicaron que los urópodos de C.caudata aproximaban el grupode Clavellas a la rama del grupo- Charopinus (Kabata, 1979) por la disposición de los urópo-dos, sin embargo, la reconstrucción parcial filogenética realizada partir de las secuencias nucle-otídicas y amioacídicas del gen COI indicarían lo contrario. No obstante, la ausencia de géne-ros claves en este estudio que representen al menos a las principales ramas del árbol, no permi-ten resolver con propiedad esta problemática, como también, es posible que en el grupo de lasClavellas pueda existir una afiliación polifilética que quede al descubierto incorporando en esteestudio otros géneros de la familia Lernaeopodidae.

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identificacion de especies basada en la secuencia del coi (adnmt) del genero clavella oken, 1815...

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