25

INTRODUCTIONDe l’antiquité à nos jours, l’homme s’est toujours donné les

moyens de combattre l’inflammation ; ces moyens efficaces ou non

lui sont souvent fournis par son environnement naturel et sont

essentiellement à base de plantes.

Dès le début du XVIIème siècle, le problème de

l’inflammation est entré dans le domaine scientifique

(POLLICARD, 1965). De nombreux travaux ont été consacrés à

l’étiopathologie de la réaction inflammatoire (PERRIN et

LAURENT, 1987). Cet intérêt résulte du fait que de nombreuses

maladies, une grande partie des lésions tissulaires est due à la

réaction inflammatoire, elle-même responsable de l’inconfort

induit par la maladie.

L’inflammation est un processus physiologique de défense et

d’adaptation de l’organisme contre toute agression qui entraîne

une altération tissulaire. Elle peut être déclenchée par une

brûlure, un traumatisme, une irradiation ou par la pénétration

d’agents pathogènes extérieurs (virus, bactéries, antigènes, …)…

(SCHORODERET, 1992)

Le plus souvent cette réaction est bénéfique pour l’hôte

agressé. Cette réaction met en jeu de nombreux système

biologique qui visent à détruire ou à éliminer la substance

étrangère. Cependant, une activation très prolongée ou

importante peut entraîner des altération plus ou moins

importantes.

25

L’inflammation est une réaction du tissu conjonctif et des

vaisseaux dans laquelle on distingue plusieurs phases

successives. On distingue, les inflammations primaires qui ont

une cause immédiate, localisée et les inflammations secondaires

qui sont des réactions systématiques qui se développent à

distance.

Le processus inflammatoire quel que soit son origine

s’effectue en différentes phases qui sont les suivantes :

PHASE EXSUDATIVE PRECOCE : Celle-ci succède directement à

l’agression ;

Cette phase associe :

-DES PHENOMENES VASCULAIRES, induits par la libération de

médiateurs

humoraux préexistants (bradykine , histamine, sérotonine…) ou

néosynthésés par les membranes de certaines cellules :

PROSTAGLANDINES (PGs), LEUCOTRIENE et PAF (patelet activating

factor).

Ces phénomènes vasculaires se caractérisent par une

vasodilatation une augmentation de la perméabilité vasculaire,

d’où la rougeur des téguments, et l’hyperthermie locale.

-DES PHENOMENES TISSULAIRES : conséquences directes des

précédentes, qui se caractérisent par une extravasation

plasmatique et donc une infiltration tissulaire d’un liquide

plus ou moins riche en fibrogène, en albumine, et en globuline,

d’où la tuméfaction, l’œdème, et épanchements, source de

douleur.

25

- DES PHENOMENES CELLULAIRES avec la migration extravasculaire

de cellules sanguines, en polynucléaires neutrophiles ( PMMs )

et monocytes.

PHASE PROLIFERATIVE TARDIVE :

Celle-ci intervient à la persistance de l’agression ou à la

dénaturation des protéines endogènes, source de néoantigènes

déclenchant une réponse immunitaire. On constate alors un

infiltrat cellulaire important avec prédominance de cellules

mononucléées : ( macrophages, Lymphocytes et plasmocytes).

Cet afflux cellulaire, aggravé par un chimiotactisme positif,

s’accompagne d’une hyperproduction de collagène, de

néovascularisation et donc de fibrose tissulaire.

Concernant les modalités évolutives, celles-ci dépendent autant

de la nature, de l’importance et de la durée de l’agression que

du terrain sur lequel elle survient. On peut distinguer deux

modalités :

- L’inflammation aiguë, essentiellement à polynucléaires

neutrophiles (PMMs), que l’on rencontre dans les crises de

gouttes ou dans de nombreuses infections. Elle régresse dès la

disparition du stimulus inflammatoire, mais peut laisser des

séquelles tissulaires.

- L’inflammation chronique, traduisant la persistance du

stimulus ou des perturbations des réactions immunitaires.

L’évolution peut se faire en deux modes : fibrose ou

granulome.

25

L'inflammation fait intervenir des cellules, des vaisseaux,

des modifications de la matrice extracellulaire et de nombreux

médiateurs chimiques qui peuvent être pro ou anti-inflammatoires

et qui peuvent modifier ou entretenir la réponse inflammatoire.

Quelle que soit son siège et la nature de l'agent pathogène, le

déroulement d'une réaction inflammatoire présente des caractères

morphologiques généraux et des mécanismes communs. Néanmoins les

différentes étapes présentent des variations liées à la nature

de l'agent pathogène, l'organe où elle se déroule, le terrain

physiologique de l'hôte : tous ces éléments conditionnent

l'intensité, la durée de la réaction inflammatoire et l'aspect

lésionnel.

Il existe 3 types d’inflammation : L’inflammation aigüe,

subaigüe et chronique.

L’inflammation aigüe présente une réponse immédiate à un

agent agresseur, de courte durée (quelques jours ou semaines),

d'installation souvent brutale et caractérisée par des

phénomènes vasculo-exsudatifs intenses. Les inflammations aiguës

guérissent spontanément ou avec un traitement, mais peuvent

laisser des séquelles si la destruction tissulaire est

importante.

L’inflammation sub-aigüe . ????

L’inflammation chronique est définie comme une inflammation

n'ayant aucune tendance à la guérison spontanée et qui évolue en

persistant ou en s'aggravant pendant plusieurs mois ou plusieurs

années. On peut distinguer deux types de circonstances de

survenue des inflammations chroniques :

25

• les inflammations aiguës évoluent en inflammations

prolongées subaiguës et chroniques lorsque l'agent pathogène

initial persiste dans les tissus (détersion incomplète) ou

lorsqu’une inflammation aiguë récidive de façon répétée dans le

même organe en entraînant à chaque épisode des destructions

tissulaires de moins en moins bien réparées.

• Les inflammations peuvent parfois se manifester d'emblée

sous une forme apparemment chronique. La phase aiguë vasculo-

exsudative est passée inaperçue car brève ou asymptomatique.

C'est souvent le cas de maladies auto-immunes, ou d'affections

où les mécanismes dysimmunitaires sont prépondérants (exemple :

hépatite chronique active secondaire à une infection par virus

de l'hépatite B ou C).

L’inflammation aigüe qui dure de quelques jours à quelques

semaines est caractérisée par les quatre signes typiques de

l’inflammation qui sont l’œdème, la douleur, la chaleur et la rougeur.

Elle peut également s’accompagnée d’atteintes fonctionnelles

régionales selon la gravité de l’agression (BOTTING ET BOTTING,

2000).

L’inflammation aigüe peut être divisée en trois grandes

phases : une PHASE VASCULAIRE IMMEDIATE (de l’ordre de minutes)

caractérisée par des modifications de la microcirculation

locale, UNE PHASE CELLULAIRE consécutive caractérisée par la

mobilisation de nombreuses cellules immunitaires qui permettra

l’élimination des microorganismes pathogènes et des tissus

lésés, et une PHASE DE CICATRISATION qui en quelques jours

conduira à la restauration des tissus (WEILL ET al., 2003).

25

La phase vasculaire constitue la première étape de

l’inflammation aigüe. L’activation des plaquettes qui

surviennent suite à des lésions cellulaires touchant ou pas les

veinules ou les artérioles (Steinhubl, 2007). Les mastocytes

résidant qui peuvent aussi être activés par un très grand nombre

de stimuli sont également susceptibles d’initier la réaction

inflammatoire (Botting et Botting, 2000). Une fois ces deux

types de cellules activés, plusieurs médiateurs tels que la

SEROTONINE, HISTAMINE, et des dérivés de l’acide arachidonique

(PROSTAGLANDINE ET LEUCOTRIENES) sont libérés. D’une autre

part, l’activation de la cascade de réaction de coagulation et

du système de complément conduit à la génération de divers

médiateurs doués d’activité vasodilatatrices et chimio

attractante comme le FACTEUR XII, FIBRINE, BRADYKININE, C3a ET

C5a (Fauve et Hevin, 1998). Ceci induit une augmentation de la

perméabilité capillaire. Cette dernière est due à l’augmentation

des fenêtres intercellulaires ce qui permet une extravasation

des protéines plasmatiques vers les tissus lésés (EXSUDATION

PLASMATIQUE). L’exsudation plasmatique induit un œdème par

distension des tissus et provoque une hyperpression sur les

terminaisons nerveuses locales ce qui explique les sensations de

tuméfaction et de douleur. L’augmentation du débit circulatoire

au niveau du site enflammé explique partiellement l’apparition

de CHALEUR et de ROUGEUR. (WEILL ET al., 2003)

La phase cellulaire est la deuxième phase de l’inflammation

aigüe et se déroule comme suit. L’exsudation plasmatique permet

l’apparition de plusieurs substances dans les espaces

25

extravasculaires telle que: anticorps, substances bactéricides,

facteurs de coagulation, composant du complément, kininogènes,

Interleukines, interférons, et des dérivés de l’acide

arachidonique. Ceci conduit à un afflux extravasculaire des

leucocytes attirés par les chimio attractants existant dans

l’exsudat et ceux libérés au niveau du site enflammé

(SCORODERET, 1992)

La première étape de cette afflux consiste en une

marginalisation des leucocytes grâce à l’expression d’adhésine

au niveau des cellules endothéliales et des leucocytes activés

(FAUVE ET HEVIN, 1998) Ceci permet l’interaction entre

l’endothéliale et les phagocytes du sang, principalement les

POLYNUCLEAIRES NEUTROPHILES et les MONOCYTES et leur passage à

travers les cellules endothéliales contractés sous l’effet de

certains médiateurs tels que la BRADYKININES (SCHORODERET,

1992). Guidés par le gradient de concentration des chimio

attractants, les leucocytes arrivent aux tissus lésés (WEILL et

al., 1992). Les monocytes achèvent leurs différenciations en

macrophages et amorcent avec les polynucléaires neutrophiles la

phagocytose des agents extérieurs et/ou les débris cellulaires

La PHASE DE RESOLUTION est la troisième phase caractérisée

par le rétablissement de l’homéostasie après une agression mais

nécessite d’abord l’arrêt de la réaction immunitaire et ensuite

la réparation des tissus lésés. L’arrêt de l’inflammation fait

intervenir plusieurs médiateurs tels que les CYTOKINES anti-

inflammatoire et l’apoptose des cellules inflammatoires (EMING

ET al., 2007). La réparation des tissus fait intervenir les

macrophages, les cellules endothéliales et les fibroblastes

25

(EMING ET al., 2007). Dans les conditions les plus agréables les

agents agresseurs sont éliminés par les polynucléaires

neutrophiles. Les produits de dégradations ainsi que les débris

cellulaires sont phagocytés par les macrophages. Le retour à

l’état physiologique consiste dans un premier temps à la

réparation de l’endothélium par les cellules endothéliales

elles-mêmes (WEILL ET al., 2003). Si l’atteinte est plus

sérieuse et entraîne une destruction tissulaire, ce sont surtout

les fibrocytes (protéine de la matrice intercellulaire) qui

produisent les protéines de la matrice intercellulaire comme les

collagènes, fibronectine pour mettre la reconstruction des

tissus. Le système d’angiogenèse est ainsi remis au repos et la

réaction inflammatoire peut s’éteindre.

25

Dans le cas d’une inflammation chronique, une thérapeutique

anti-inflammatoire sera nécessaire. Actuellement, il existe deux

catégories de médicaments anti-inflammatoires : les anti-

inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et les dérivés

glucocorticoïdes (corticoïdes). Ces anti-inflammatoires agissent

essentiellement sur la synthèse des dérivés de l’acide

arachidonique, dont les prostaglandines et les leucotriènes qui

sont des médiateurs de l’inflammation. Les AINS bloquent la

cyclooxygénase et n’agissent pas sur la voie des lipoxygenases

et augmentent la synthèse des leucotriènes. Par contre, les

corticoïdes bloquent la phospholipase A2 et inhibent les deux

voies métaboliques de l’acide arachidonique (VALATS, 1999 ;

FIALIP, 2002).

L’un des inconvénients majeurs des anti-inflammatoires

réside dans le risque d’irritations gastroduodénales pouvant

25

aller jusqu’à l’ulcère (NETTER, 1987 ; POUBELLE, 2000 ; ADNET et

al., 2000).

Malgré le développement spectaculaire de l’industrie

pharmaceutique, la phytothérapie garde toute son importance,

surtout dans les pays du tiers monde où plus de 70 % de la

population s’y adonnent presque exclusivement.

«La médecine traditionnelle qui est la somme totale des

connaissances, compétences et pratiques reposant rationnellement

ou non, sur les théories, croyances et expériences propres à une

culture, est utilisée pour maintenir les êtres humains en santé

ainsi que pour prévenir, diagnostiquer, traiter et guérir des

maladies physiques et mentales » (OMS, 2003).

La survie de l’Homme allait dépendre des plantes surtout

parce que trois de ces acides gras vitaux ne sont présent que

chez les plantes (FLEMMING, 1997). Aujourd’hui alors qu’on

commence à prendre conscience de son corps et qu’on rejette les

effets secondaires de certains médicaments modernes puissants,

les plantes retrouvent leur place dans notre vie quotidienne

(FLEMMING, 1997).

La pratique au long des siècles de la Médecine

Traditionnelle et l’expérience transmise de génération en

génération semblent être preuve de l’innocuité et de

l’efficacité de cette médecine (OMS, 2003).

A Madagascar la phytothérapie est utilisée depuis toujours

dans le secteur de la médecine traditionnelle. Aujourd’hui les

25

plantes jouent encore un rôle très important dans les traditions

thérapeutiques et la vie des habitants, mais les règles de leur

utilisation manquent parfois de rigueur et ne tiennent pas

compte des nouvelles exigences de la thérapeutique moderne. Ces

dernières années, beaucoup de recherches se sont orientés vers

la valorisation de la médecine traditionnelle en vue de vérifier

la sureté et l’efficacité des plantes utilisées et d’établir des

règles scientifiques pour l’usage de ces plantes.

Dans ce contexte s’inscrit ce présent travail de recherche

dont l’objectif essentiel consiste à vérifier l’activité anti-

inflammatoire de l’extrait NNI 0413 F1.

Différents modèles d’inflammation chez les souris ont été

réalisés: un modèle d’inflammation aiguë par voie orale, un

modèle d’inflammation aiguë par voie topique, un modèle

d’inflammation subaigüe et un modèle d’inflammation chronique.

Pour étudier l’activité de la plante après une inflammation

aigue, un œdème local provoque par la carragénine et un œdème

topique provoqué par l’huile de croton (WINTER, 1962 ; SINGH et

al., 1989 ; FLEURENTIN et al., 1997) seront effectués.

Pour l’étude de l’inflammation subaigüe, un granulome

inflammatoire provoque par des corps étrangers sera utilisé

(BASILE et al., 1988 ; AHMED et al., 1993 ; SINGH et al., 1997)

et des arthrites expérimentales induites par l’adjuvant de

Freund complet (NEWBOULD,1963 ; SAXENA et al., 1984 ; SINGH et

al., 1997) seront utilisés dans le cas d’une inflammation

chronique expérimentale.

25

Afin d’apporter plus de connaissances sur cette plante, des

études sur les activités analgésique, anti érythémateux et une

étude sur la toxicité gastrique seront effectuées.

25

MATERIELS ET METHODES

25

A- ETUDE PHYTOCHIMIQUE   :

L’extrait a été fourni par la Société de Transformation

Malgache et d’Exportation (SOTRAMEX) Ambavahaditokana Itaosy

dans le cadre de la collaboration entre cette société et notre

Laboratoire LPGP (Laboratoire de Pharmacologie Générale et de

Pharmacocinétique).

Criblage phytochimique:

Un criblage phytochimique a été effectué pour identifier les

constituants chimiques présents dans l’extrait. Il s'agit d'une

analyse qualitative basée sur des réactions de coloration et/ou

de précipitation en présence de réactifs spécifiques pour chaque

famille chimique (Tableau I) (IGAN C., 1982)

Afin de quantifier la proportion relative des différentes

familles. Les signes suivants ont été utilisés :

- : absence (de changement de couleur, de précipité, de

mousse)

+ : présence en faible concentration

++ : Présence en moyenne concentration

+++ : Présence en forte concentration

Tableau I : Tests utilisés pour détecter les différentes

familles chimiques présentes dans l’extrait N.N.I 0413 (IGAN C.

1982)

25

FAMILLES

CHIMIQUES

TESTS REACTIFS OBSERVATIONS CONCLUSIONS

Alcaloïdes

-Dragendorff (NO2)2

BI/IK Précipitatio

n JAUNE

ORANGEEALCALOÏDE

-Mayer HgCl2/IK Précipitatio

n BLANC

CASSE-Wagner I2/IK Précipitatio

n JAUNE

MARRON

Tanins

gélatine-

NaCl

+FeCl3

Précipitatio

n VERTE

Tanins

CATECHIQUESPrécipitatio

n BLEUE

Tanins

GALLIQUESSaponines

MOUSSE AgitationPersistance

d’une mousse

(3cm

d’épaisseur)

30

minutes

après

agitation

Saponines

HEMOLYTIQUEAddition

de Décoloration

25

quelques

gouttes

de sang

dans

l’extrait

du sang

Coumarines Ammoniaqu

es

Fluorescence

BLEUE à la

lampe UV

Coumarines

Flavonoïdes

et

Leucoanthocyane

s

WILSTATER Ruban de

Magnésium

+ HCl

concentré

Coloration

ROUGE

FLAVONOIDES

BATE-SMITH HCl

concentré

+ KOH

Intensificat

ion de

couleur

Composés

PHENOLIQUES

SUCRES

REDUCTEURS

Une

goutte de

solution

ammoniaca

le

liqueur

de

Fehling

Coloration

ROUGE BRIQUE

SUCRES

REDUCTEURS

POLYSACCHARIDES Acétone

(goutte à

goutte)

TROUBLE POLYSACCHARIDES

STEROIDES BADJET KOH +

Acide

Coloration Stéroïdes

lactoniques:

25

et TERPENOIDES picrique ORANGE Glycosides

cardiotoniquesKEDDE KOH +

Réactif

de KEDDE

Coloration

Violette

LIEBERMANN-

BURCHAR

Anhydride

Acétique

Coloration

VERDATRE

STEROLS

Anneau ROUGE TRITERPENOIDES

B- TESTS BIOLOGIQUES :

Afin de vérifier les hypothèses avancées dans la première

partie du devoir, des test biologiques ont été nécessaires.

I- PREPARATION DE L’EXTRAIT ET DES PRODUITS DE

REFERENCES   :

L’extrait NNI 0413 a été fourni par la SOTRAMEX sous forme de

Lyophilisat ; il a été dissout dans l’eau distillée.

Tandis que le produit de référence, l’Indométacine qui est un

produit liposoluble, a été préparé dans un solvant qui est le

Tween 1/80.

II- ANIMAUX D’EXPERIMENTATION   :

25

Afin d’évaluer les propriétés anti-inflammatoire de

l’extrait et la toxicité aiguë, des souris de race blanche de

deux sexes, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 20 à 30 g

élevées au sein de l’animalerie du laboratoire de Pharmacologie

générale et pharmacocinétique, ont été utilisées (OTARI K. V.

et al., 2010).

Durant toute l’expérience, les animaux ont été nourris avec

de la provende LFL 1420 et ont eu de l’eau à volonté

III-ETUDE DE L’ACTIVITE ANTI-INFLAMMATOIRE DE L’EXTRAIT NNI 0413-F1 :

.

Pour déterminer les propriétés anti-inflammatoires de

l’extrait, des modèles d’inflammation expérimentale aiguë,

subaigüe, et chronique ont été réalisés.

1- INFLAMMATION EXPERIMENTALE AIGÜE  :

L’inflammation aigüe est caractérisée par les quatre signes

cardinaux : douleur, rougeur, chaleur, et tumeur (œdème).

L’extrait NNI O413 a une activité anti-inflammatoire sur la

phase aigüe s’il a un effet anti-œdémateux, analgésique, anti-

érythémateux et antipyrétique.

Dans ce travail seul l’activité anti-œdémateuse, analgésique

et anti-érythémateuse ont été mis en avant.

1-1-1. ACTIVITE ANTI-OEDEMATEUSE DE L’EXTRAIT   :

25

L’étude de l’activité anti-œdémateuse de l’extrait peut se

faire à deux niveaux, par voie générale et par voie topique.

a) Activité anti-œdémateuse par voie générale   :

L’œdème peut être provoqué par plusieurs agents

phlogogènes : formol, ovalbumines, kaolin, carragénine… Pour

cette étude, la carragénine a été utilisée pour induire

l’inflammation.

L’étude expérimental de l’activité anti-inflammatoire a été

réalisée selon la méthode décrite par WINTER selon laquelle

l’inflammation est induite par injection de la carragénine au

niveau de la voute plantaire de la patte postérieure droite de

la souris. L’œdème causé par cet agent phlogogène a été traduit

en volume mesuré par le pléthysmomètre (UGOBASILE 7140) ce qui

permet de suivre l’évolution du processus inflammatoire.

Pour cette étude, cinq lots de six souris ont été utilisés :

le lot témoin a reçu 300μl d’eau distillée par voie orale, les

trois lots traités ont reçu l’extrait NNI 0413 à raison de 100,

200 et 400mg/kg. Le lot ayant servi de référence a reçu

l’INDOMETACINE à 10mg/kg (AHMED et al., 1993; SARITA et al.,

1993 ; SINGH et al., 1997).

Avant injection de la carragénine, le volume Vo de la patte

des souris a été mesuré à l’aide d’un pléthysmomètre (UGOBASILE

7140).

Trente minutes après l’administration de l’eau distillée, de

l’extrait à doses différentes et de l’indométacine, 50μl de

suspension de ƛ carragénine à 1% dans du sérum physiologique

25

(NaCl 0,9%) a été injectée dans la voute plantaire de la patte

postérieure droite (WINTER, 1962 ; SINGH et al., 1989 ;

FLEURENTIN et al., 1997) pour provoquer l’inflammation.

Juste après injection de l’agent phobogène les mesures ont

été refaites, puis 1, 2, 3, 4, 5 et 6 heures après cette

injection (WINTER C. A. et al., 1962).

L’activité anti-inflammatoire des produits testés et son

évolution ont été estimées par la détermination des pourcentages

moyens d’inhibition de l’œdème, calculés suivant la formule

(GARDENER, 1960)

V0 représente le volume de la patte à T=0 (avant

injection de la carragénine)

Vt représente le volume de la patte à un temps T

quelconque.

Une diminution du volume de l’œdème a été considérée comme

effet anti-inflammatoire de l’extrait NNI.

b) Activité anti-œdémateuse par voie topique   :

L’inflammation a été provoquée par application d’une

solution d’huile de croton pure sur la face interne de l’oreille

droite des souris. (LOMPO M. et al., 1998)

Cinq lots de cinq souris ont été utilisés pour ce test : les

lots traités ont reçu sur la face interne de l’oreille droite

Pourcentage d’inhibition=(vt−vo)témoin−(vt−vo )traité

(vt−vo)témoin x 100

25

15µl d’huile de croton pure. Les trois lots traités ont reçu

l’extrait dissout dans l’huile de croton à raison de 10, 20 et

40µg/µl et le lot de référence a reçu l’INDOMETACINE à raison de

50µg/µl.

L'oreille gauche n'a pas été traitée et a servi de témoin

(LOMP0 M. et al., 1998).

Les cinq lots ont été observés pendant 6h (TUBARO ; 1985).

Les animaux ont été ensuite sacrifiés par dislocation cervicale.

Les oreilles droites et gauches ont été sectionnées au ras de

leur implantation. A l’aide d’une perce bouton de 7 mm de

diamètre, un morceau du pavillon de l’oreille a été prélevé au

niveau de la marge en pointe et pesés immédiatement (LOMP0 M. et

al., 1998).

Les tests ont été effectués de 10h à 16 h pour éviter les

éventuelles variations des réponses dues aux fluctuations

circadiennes des corticostéroïdes des animaux (TUBARO ; 1985).

Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’inhibition

de l’œdème :

P=(DM−DMT)

DM *100

Avec :

D M : la différence moyenne de poids entre les morceaux

des oreilles droites traitées à l'huile de croton et ceux

des oreilles gauches non traitées du lot témoin.

D M T : la différence moyenne de poids entre les morceaux

des oreilles droites traitées aux produits à tester dans

25

l'huile de croton et ceux des oreilles gauches non

traitées des lots traités (LOMP0 M. et al., 1998).

Une diminution du poids du morceau de l’oreille a été

considérée comme effet anti-inflammatoire de l’extrait.

1-1-2. ACTIVITE ANTI-ERYTHEMATEUSE DE L’EXTRAIT   :

Il s’agit d’apprécier l’intensité de la coloration rouge de

la peau épilée du dos de la souris soumise aux rayons UV en

présence et en absence d’anti-inflammatoire. (COYEN, 1986)

Cinq lots de 6 souris de 6 à 8 semaines des deux sexes

pesant en moyenne 20 à 30g ont été utilisés pour ce test. Le

lot témoin a reçu de l’eau distillée à raison de 10ml/kg ; Le

lot de référence a reçu 10mg/kg d’INDOMETACINE et Les trois lots

traités ont reçu l’extrait à 100, 200 et 400 mg/kg.

Vingt-quatre heures avant le test, le dos des animaux ont

été épilés. Et l’administration des produits a été faite 30 min

avant l’irradiation. Puis, les animaux ont été soumis

directement à une irradiation à la lampe UV (UVB entre 290-320

nm) sous une lampe MINUVIS 254-366nm (De saga Germany). Pendant

l’irradiation, un dispositif permettant de cacher les yeux des

souris a été utilisé. Les souris ont été placées à une distance

de 20 cm environ de la lampe.

Des évaluations optique et macroscopique ont été ensuite

effectuées.

Evaluation optique : le degré de rougeur a été visualisé

0 : pas d’érythème

1 : faible

25

2 : fort

4 très fort (YAWALKAR ET Coll., 1991)

Pour l’évaluation macroscopique le matériel utilisé était le

« SKIN ANALYZER », puis les résultats obtenus ont été

analysés par le logiciel Sigma Scan Pro 5.0.

1-1-3. ACTIVITE ANALGESIQUE DE L’EXTRAIT   :

L’effet anti-inflammatoire de l’extrait a été évalué par la

diminution de la perception de la douleur. Pour cette présente

étude, le formol a été choisi comme agent algogène.

Le formol a été injectée au niveau de la voute plantaire des

souris pour provoquer la douleur.

Les souris ont été divisées en 5 lots de 5 souris. Le lot

témoin avait reçu de l’eau distillée (10 ml/kg) par voie

orale ; chez le lot de référence 10 mg/kg d’INDOMETACINE leur a

été administré et les extraits à doses de 100, 200, 400mg/kg ont

été administrés aux souris des trois lots traités.

Trente minutes après l’injection de ces produits, 50µl d’une

solution de formol 2.5% a été injectée dans la voute plantaire

droite de chaque souris. Elles ont été placées individuellement

en observation pendant 45 minutes en bloc de 5 min. La réponse

de la douleur se fait en deux phases : la première est observée

les 5 premières minutes qui suivent l’injection tandis que la

phase tardive ne se manifeste que durant les 30 dernières

minutes. (DUBUISSON et al., 1977)

Le paramètre à étudier a été le temps de léchage de la patte

là où le formol a été injecté.

25

INFLAMMATION SUB -AIGÜE Benincá JP, Montanher AB, Zucolotto SM, Schenkel EP, FrödeTS. Antiinflammatory effects of the Passiflora edulis: forma flavicarpa Degener inhibition of leukocytes, enzymes and pro-inflammatory cytokine levels in the air pouch model, in mice. Food Chem 2007; 104(3); 1097–1105.]

L’inflammation subaigüe est caractérisée par l’infiltration

leucocytaire. De ce fait, l’extrait NNI 0413 F1 présente un

effet anti-inflammatoire sur la phase aigüe s’il a la capacité

de diminuer ce phénomène. L’inflammation subaigüe a été induite

en formant une poche d’aire dans laquelle, une substance

irritante, la carragénine, a été injectée. La poche d’aire

jouera le rôle d’espace clos dans laquelle se développera

l’inflammation.

Vingt- quatre heures avant le test, le dos des animaux a été

rasé. Ils ont été mis à jeun pendant 18h mais ayant eu de l’eau

à volonté:

Cinq lots de 5 souris de deux sexes pesant entre 20 et 30g

ont été utilisés. Le lot traité a reçu de l’eau distillée à

raison de 10mg/kg. Les trois lots traités ont reçu l’extrait NNI

0413 à des doses de 100, 200 et 400 mg/kg et le lot de

référence a reçu de l’INDOMETACINE à 10 mg/kg. L’administration

de ces produits a été faite à la même heure pendant 7 jours.

Sous anesthésie, avec une aiguille très fine, 6ml d’air a

été injecté sous la peau pour provoquer une poche. Au quatrième

jour, cette opération a été refaite mais en injectant cette

fois-ci 4ml d’air. Au 6ème jour, 1ml de carragénine à 2% dilué

dans du sérum physiologique a été injectée dans la poche d’air.

Au 7ème jour, la poche a été ouverte et l’exsudat s’y

trouvant a été collecté par une seringue. Le volume de l’exsudat

a été mesuré, le poids du granulome a été pesé et la numération

25

leucocytaire a été effectuée. (MAIER P. et al., 1978 ; De

BritoFB., 1989)

1- INFLAMMATION CHRONIQUE   :

L’arthrite induite par l’Adjuvant Complet de Freund (A.C.F) a

été utilisée comme model d’inflammation chronique

expérimentale.

L’injection intra-articulaire dans la patte postérieure du rat

d’adjuvant complet de Freund (suspension de bacilles tuberculeux

tués) provoque une réaction œdémateuse qui se développe

immédiatement (inflammation primaire).

En deux ou trois semaines devraient apparaitre à distance sur

les pattes antérieures, aux oreilles une réaction avec

gonflement, et rougeur (inflammation secondaire)

Les anti-inflammatoires administrés pendant l’essai devraient

empêcher les réactions primaires et secondaires.

Cinq lots de 5 souris ont été utilisés dont 1 lot témoin qui

a reçu de l’eau distillée. Les 3 autres lots ont reçu par voie

orale l’extrait à 100, 200, et 400 mg/kg. Le dernier lot a reçu

le produit de référence : l’IND 10mg/kg (SAXENA et al., 1984 ;

BASILE et al., 1988 ; SINGH et al., 1997). L’administration de

l’extrait a été faite 24 heures avant la provocation de

l’inflammation (NEWBOULD, 1963 ; SAXENA et al., 1984 ; SINGH et

al., 1997)

Pour provoquer l’inflammation chronique, 0.03ml d’adjuvant de

Freund Complet (AFC) 0.5% a été injecté dans la région plantaire

de la patte postérieure droite de la souris.

25

L’extrait ainsi que les produits de références ont été

administrés par la suite une fois par jour pendant 21 jours

(MANGESH S. B. et al., 2011).

Le volume de la patte a été mesuré avec un Pléthysmomètre (UGO

BASILE 7140) le 4e, 8e, 13e et le 21e jour après la première

administration des produits pour suivre l’évolution de

l’inflammation (MANGESH S. B. et al., 2011).

Les réactions secondaires ont été également observées (poids

de l’animal, gonflement, rougeur à distance du point

d’injection…) et le diamètre de l’articulation a été mesuré en

utilisant un pied à coulisse.

Pour l’inflammation expérimentale chronique, l’activité anti-

inflammatoire de l’extrait a été exprimée en pourcentage

d’inhibition du volume de l’œdème obtenu, selon la formule :

IV- ETUDE DE LA TOXICITE 1- TOXICITE AIGÜE  :

Pour évaluer la toxicité aigüe de l’extrait, 4 lots de 5

souris ont été utilisés. Les animaux du lot témoin ont reçu de

l’eau distillée tandis que les trois autres lots ont reçu

chacun, par voie orale, une seule dose de l’extrait : 800

mg/kg ; 1.6 g/kg ; 3.2 g/kg.

Les signes d’intoxication ainsi que le taux de mortalité ont

été observés à 5, 15, 20 minutes et à 1, 2, 4, 6 heures après

Pourcentage d’inhibition=(vt−vo)témoin−(vt−vo )traité

(vt−vo)témoin x 100

25

administration de l’extrait. Ensuite, ils ont été observés une

fois par jour jusqu’au septième jour (MALONE et al., 1991).

RESULTATS

1) Criblage biologique

Les résultats du criblage phytochimique effectué sur

l’extrait NNI 0413-F1 sont résumés dans le tableau ???? Ils

révèlent la présence de FLAVONOÏDES de type FLAVONES en forte

concentration, une quantité moyenne en LEUCOANTHOCYANE et

POLYSACCHARIDES et une faible teneur en COUMARINE, POLYPHENOLS

et en SUCRE REDUCTEUR. Par contre l’extrait ne contient ni de

QUINONE ni d’ANTHRAQUINONE ni de TANINS.

25

2) Etude de l’activité anti-inflammatoire de l’extrait

NNI 0413-F1   :

2-1) Inflammation aigüe   :

a. Activité anti-œdémateuse de l’extrait   :

i. Activité anti-œdémateuse par voie générale   :

Evolution de T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6

FAMILLES

CHIMIQUES

CONCENTRATION

FLAVONOIDES :

FLAVONE + + +LEUCOANTHOCYANE + + +

POLYSACCHARIDES + + +

COUMARINES + +POLYPHENOLS +SUCRES REDUCTEURS +TANINS –QUINONES –

ANTHRAQUINONE –

25

l'œdème en

fonction du tempsTEMOIN 0,28 0,668 0,75 0,844 0,874 0,768 0,722NNI 100 mg/kg 0,262 0,756 0,832 0,904 0,752 0,664 0,558NNI 200 mg/kg 0,262 0,664 0,798 0,848 0,64 0,52 0,39NNI 400mg/kg 0,254 0,736 0,794 0,806 0,66 0,502 0,368INDOMETACINE 10mg/kg 0,246 0,802 0,88 0,788 0,68 0,51 0,306

ii. Activité anti-œdémateuse par voie

topique   :

25

NNI 10µg/µl

NNI 20µg/µl

NNI 40µg/µl

IND0

102030405060708090

100

******

***

** MOYENNE

POUR

CENT

AGE

D'IN

HIBI

TION

DE

L'OE

DEME

b. Activité anti-érythémateuse de l’extrait   :

c. Activité analgésique de l’extrait   :

2-2) Inflammation subaigüe   :

2-3) Inflammation chronique   :

DISCUSSION

Le criblage de l’activité anti-inflammatoire est réalisé par

le test de la carragénine. Cet agent phlogogène induit au

niveau de la patte un œdème considéré comme un signe

caractéristique de l’inflammation et paramètre important dans

l’évaluation de l’activité anti-inflammatoire de plusieurs

composés.

25

Cette technique a été sélectionnée en raison de sa

simplicité d’exécution et en raison de sa reproductibilité.

L’évolution de l’œdème suite à une injection de la

carragénine évolue de manière temps dépendant et se divise en

deux phases : la première phase se situe de 0 à 1h ; la deuxième

phase est de 1 à 6h. Des études antérieures ont indiqué que la

troisième heure après administration de la carragénine

représente son effet maximal (KIRKOVA et al., 1992). En effet,

la carragénine induit une augmentation de la synthèse de

cyclooxygénase de type 2 (COX-2). L’augmentation de la

concentration de cette enzyme présente un pic à 1h. Cette

augmentation est accompagnée par une augmentation de la synthèse

en PROSTAGLANDINE essentiellement, la PROSTAGLENDINE type E2

(PGE2) impliquée dans les processus de la douleur et de

l’inflammation (NANTEL et al., 1999 ; POSADAS et al., 2004).

Ceci explique l’effet tardif des AINS comme l’INDOMETACINE qui

n’a d’effet qu’à 1h. Ceci est en relation avec leur mode

d’action qui passe par l’inhibition de la Prostaglandine par

stimulation de la COX-1 et COX-2 (VERGNE et al., 2000 ;

Editorial, 2005) et dont la courbe montre une stabilisation à

partir de 3h qui correspond à la stabilisation des médiateurs.

L’œdème de l’oreille induit par l’huile de croton chez la

souris qui est un modèle d’inflammation aigüe a été utilisé pour

évaluer l’effet anti-inflammatoire du traitement local par

l’extrait NNI 0413 fraction F1. Ce modèle expérimental est très

utilisé pour le criblage d’anti-inflammatoires synthétiques ou

naturels à effet local (Altinier et al., 2007).

25

L’effet phlogogénique de l’huile de croton est dû

principalement au principe actif 12-O-tetradecanoyl phorbol

acétate (TPA) qu’elle contient. Le TPA induit une réaction

inflammatoire caractérisée par une production importante de

médiateurs pro-inflammatoire, augmentation de la perméabilité

vasculaire, un œdème (Delaporte et al., 2004). Le poids de

l’œdème atteint son maximal 6h après application de l’huile de

croton (Tubaro et al., 1985).

Le mécanisme proposé par Murakawa et Yamaoka (2006) par

lequel le TPA contenu dans l’huile de croton suggère que celui-

ci met en jeu l’activation de la PROTEINE KINASE C (PKc), la

PHOSPHOLIPASE A2, la CYCLOOXYGENASE et la LIPOXYGENASE avec

l’induction de l’expression des CYTOKINES PRO-INFLAMATOIRE.

Aquila et ses collaborateurs (2009) suggèrent que le TPA

stimule l’expression de la COX-2 et de la N.O enzyme inductible

via l’activation de la PKc.

La douleur au formol se divise en deux phases : une phase

précoce qui se présente à 1min après injection du formol et une

phase tardive ou phase quiescente qui ne se manifeste qu’à la

15ème min. la phase initiale est surtout due à la stimulation

directe des nocicepteurs alors que la 2ème phase a lieu après une

période de sensibilisation pendant laquelle le phénomène

inflammatoire prend place (DUBUISSON et DENNIS, 1997).

La deuxième phase de la douleur inflammatoire semble être

due à la synthèse de Prostaglandine (SHIBATA et al., 1989 ;

TJOESEN et al., 1992). Histamine, Sérotonine, Prostaglandine,

N.O. et bradykinine prennent aussi part à la seconde phase de ce

phénomène (TJOESEN et al., 1992). Il est fort évident que la

25

procédure de l’inflammation périphérique est en relation avec

cette dernière phase. L’effet analgésique de l’extrait codé NNI

0413 –F1 sur la réponse nociceptive de la douleur au formol

pourrait être dû à cet effet périphérique.

L’extrait ainsi que l’indométacine semblent inhiber

seulement la deuxième phase de la douleur.

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