432

Biochimica et Biophysica Acta, 563 (1979) 432--444 © Elsevier/North-Holland Biomedical Press

BBA 99483

ETUDE DE LA REGULATION DU DEVELOPPEMENT PLASTIDIAL CHEZ E U G L E N A G R A C I L I S

II. LOCALISATION FONCTIONNELLE ET SYNTHESE DES PARTICULES RIBOSOMIQUES CHLOROPLASTIQUES

G. LEDOIGT and C. LOUVEL

Laboratoire de Cytophysiologie de la Photosynth~se, C.N.R.S,, 91190 Gif-sur- Yvette (France)

(Received January 29th, 1979)

Key words: Chloroplast development; Greening; rRNA gene; (Euglena)

Study of the regulation of plastid development in Euglena gracilis II. Functional loealisation and synthesis of ribosomal chloroplast particles

Summary

Chloroplast ribosomes in greening cells of Euglena gracilis are found either in the stroma or bound to thylakoid membranes. The membrane-bound chloro- plast ribosomes are of two main types: those which can be released by 0.5 M KCI or by puromycin and 0.5 M KCI, and those which are released by detergent (deoxycholate or Triton X-100) and KC1. The ribosomes which are released by puromycin are presumably bound to chloroplast membrane by nascent peptide chains. Ribosomes released by puromycin are found only during the course of plastidial differentiation at the t ime of active thylacoid membrane synthesis. Following greening, those ribosomes remain bound to the membranes but can be removed by KCI alone.

An analysis o f RNA labelling showed that 30-S but not 53-S subunits of membrane-bound ribosomes are of uniform specific activity. This suggests that 30-S subunit exchange in a common pool while 53 S subunits remain mem- brane bound and do not exchange in a common pool. Membrane-bound chloro- plast ribosomes which are released either by puromycin or by detergent are originally derived from loosely bound particles, released by 0.5 M KCI.

R6sum6

Au cours du verdissement cellulaire, les ribosomes chloroplastiques d'Euglena gracilis sont localis6s dans le s troma et dans la fraction lamellaire, de

433

mani~re specifique. Les chlororibosomes membranaires sont de deux types: les uns sont lib~r~s par le KC1 (0.5 M) seul ou par la puromycine et le KC1 (0.5 M), et les autres sont lib~r~s par l 'action d 'un d~tergent (d~soxycholate de sodium ou Triton X-100) en presence de KC1 (0.5 M). Les chlororibosomes lib~r~s par la puromycine correspondraient aux polysomes attaches aux membranes plas- tidiales par leurs chaines polypeptidiques naissantes et ne sont mis en evidence que pendant la p~riode de synth~se active des prot~ines lameUaires. A la fin de la diff~renciation plastidiale, ces ribosomes restent fixes aux membranes et peuvent alors ~tre rel~ch~s par l 'action du KC1 (0.5 M) seul.

L'analyse du marquage des ARN ribosomiques par l'uracile triti~ met en ~vidence une radioactivit~ sp~cifique uniforme pour les sous-unit~s 30-S des chlororibosomes membranaires, mais non pour. les sous-unit~s 53-S. Ces donn~es montrent un ~change entre les sous-unit~s 30-S des ribosomes mem- branaires, tandis que les sous-unit~s 53 S restent plus sp~cifiquement fix~es aux membranes. I1 est alors montr~ que les chlororibosomes membranaires lib~r~s par la puromycine ou un d~tergent proviennent de la synth~se de particules plus faiblement li~es, lib~r~es par le KC1 (0.5 M) seul.

Int roduct ion

Dans les syst~mes cellulaires eucaryotiques ou procaryotiques, une s~gr~ga- tion darts la localisation des particules r ibosomiques a ~t~ montr~e [1]. Tr~s tSt, il a ~t~ mis en ~vidence des r ibosomes libres dans le cytoplasme et des ribo- somes attaches aux membranes du reticulum endoplasmique ]2] .

Les cellules animales qui synth~tisent de grandes quantit~s de prot~ines de secretion, cont iennent une grande proport ion de ribosomes li~s aux mem- branes. I1 a ~t~ montr~ que les prot~ines de secretion sont synth~tis~es prin- cipalement sur les polyribosomes membranaires, tandis que les prot~ines restant dans le cytoplasme le sont principalement sur les polyribosomes libms [3--5].

Des ribosomes li~s aux membranes sont aussi trouv~s dans la plupart des types cellulaires, en l 'absence de fonction secr~trice connue [6,7]. Ils peuvent dans ce cas ~tre impliqu~s dans la synth~se de certains composants membra- naires [8,9]. Les m~canismes cellulaires qui r~glent cet te s~gr~gation des fonc- tions ribosomiques sont encore mal connus.

Les ribosomes libres et li~s peuvent ~tre s~par~s par fract ionnement cellulaire. La liaison des ribosomes membranaires s 'effectue par leur grande sous-unit~ ]10] . Dans le cas des cellules secr~trices, la cha~ne polypept idique naissante, qui cro~t sur la grande sous-unit~ des ribosomes membranaires, est transferee dans la lumi~re du r~ticulum endoplasmique [11,12 ]. Cependant la liaison r ibosome-membrane ne requiert pas n~cessalrement la presence d 'une cha~ne polypeptidique [ 13,14 ].

Parmi les ribosomes membranaires, certains peuvent ~tre rel~ch~s ~ la suite de l ' inhibition de la synth~se prot~ique par la puromycine [7] le NaF [15] ou la privation d'acides amines [16] et d'autres, par l 'action de d~tergent [14] . Ainsi est n~ le concept de l 'existence de deux classes de ribosomes mem- branaires, ' faiblement ' et ' for tement ' li~s.

Les organites cellulaires pr~sentent une s~gr~gation analogue de leurs

434

particules ribosomiques. Les chloroplastes contiennent au moins deux classes de r ibosomes qui different dans leur localisation; l 'une comprend les ribosomes situ~s dans le stroma, l 'autre comprend ceux li~s aux lamelles photosynth~- tiques [17--20] , qui peuvent se presenter sous forme de polysomes, comme chez Chlamydomonas reinhardi [21] ou comme chez les plantes sup~rieures [22 ,23] .

La mise ~ la lumi~re de cellules ~tiol~es d'Euglena gracilis, entra~ne la syn- th~se et la mise en place des structures plastidiales. Nous avons donc analys~, dans ce travail, la synth~se, la mise en place et la r~partition des particules chlororibosomiques au cours de la diff~renciation plastidiale, en fonction de l'~tat m~tabolique des eugl~nes.

Materiel et M~thodes

Cultures cellulaires. Eugle~m gracilis, souche Z (No. 1224-5 D de l 'algoth~que de Cambridge) est cultiv~ ~ l'obscurit~, ~ 28°C, sur milieu mineral suppl~- ment~ en lactate [24] . Dans ces conditions, les euglbnes ont un temps de g~n~ration d'environ 12 h et la phase stationnaire de croissance est atteinte en trois jours pour une concentrat ion cellulaire situ~e entre 2.5 et 3 • 106 cellules par ml.

Les cellules ~tiol~es, en fin de phase exponentielle de croissance (environ 8" l0 s cellules/ml) sont transferees dans un mileu de je~ne [25] ~ raison de 400 ml de pr~culture dans un litre de milieu de je~ne. Les eugl~nes sont laiss~es

jefiner trois jours ~ l 'obscurit~, pour ~puiser le milieu de culture r~siduel et leurs r~serves; elles effectuent encore environ deux divisions, Puis la culture est transferee ~ la lumi~re pour l '~tude du verdissement, qui est suivi pendant les 7 2 premieres heures d'~clairement.

Fractionnement ceUulaire. La s~paration des ribosomes chloroplastiques li~s aux membranes ou libres dans le stroma est effectu~e selon une m~thode adapt~e de celle d~crite par Chua et al. [ 21] pour Chlarnydomonas (Tableau I).

Traitement de la fraction membranaire. La fraction membranaire, contenant les thylaco'ides, est s~par~e en trois parties aliquotes.

La premiere est d~pos~e directement sur un gradient de saccharose de haute force ionique (Tampon TKMD 500).

La seconde est incub~e pendant 15 mn ~ 37°C en presence de puromycine (puromycine hydrochloride, Sigma, 1 mM), puis d~pos~e sur un gradient de saccharose de haute force ionique (Tampon TKMD 500).

La troisi~me est trait~e par un d~tergent doux, le desoxycholate de sodium (Merck) ou le Triton X-100, ~ 0.5% ou 1%, avant d 'etre imm~diatement d~pos~e sur un gradient de saccharose ~ haute force ionique {Tampon TKMD 500).

Dosage des pigments chlorophylliens. Les pigments chlorophylliens sont extraits dans l 'ac~tone ~ 80% et leur teneur est ~valu~e suivant la m~thode de Mac Kinney [26] .

Cornptage des cellules. La croissance ceUulaire est suivie par comptage des cellules immobilis~es dans l ' iodure de potassium ~ 10%, ~ l'aide d 'une ceUule de Malassez.

Incorporation des prdeurseurs radioaetifs. Le marquage des RNA riboso-

435

T A B L E A U I

S E P A R A T I O N DES R I B O S O M E S C H L O R O P L A S T I Q U E S LIES AUX M E M B R A N E S OU L I B R E S DANS LE STROMA. ( A D A P T A T I O N DE LA M E T H O D E D E C R I T E PAR CHUA ET AL. [ 2 1 ] )

Pr$1dvement ce l lu la i re cent r i fug$ (4 0 0 0 X g, 5 ran)

a l i q u o t s

c o m p t a g e dosage su rnagean t cu lo t r e s u s p e n d u dans des des dcart~ le t a m p o n TKMD 25 cel lu les c h l o r o p h y l l e s cen t r i fugd (4 000 × g, 5 ran)

s u r n a g e a n t cu lo t r e s u s p e n d u dans ~cart~ le t a m p o n TKMD 25

(1 ~ 2 • 108 ce l lu l e s /ml )

b royage ~ la presse de F rench (500 k g / c m 2)

c e n t r i f u g a t i o n (17 000 X g, 15 ran)

s u r n a g e a n t cu lo t r e suspendu darts = S17 ~ le t a m p o n TKMD 25

/ p~Lr homogSn~ i sa t i on au Po t t e r E lveh jem

3 fois c e n t r i f u g a t i o n (17 0 0 0 X g, 15 ran)

s u r n a g e a n t ~ cu lo t f ina l = P1 7 ~cart~ r e suspendu darts le

t a m p o n TKMD 25 pa r homog~n~ i sa t i on au P o t t e r E lveh jem

Tris (HC1) 25 mM (pH 7.5) KC1 25 mM MgCI2 25 mM D i t h i o t h r $ i t o l 5 mM

M e m e t a m p o n sauf KC1

T a m p o n TKMD 25

T a m p o n 500 mM

miques est effectu~ par l ' incorporation in vivo d'uracile triti~ ([5(U)-3H]- uracile; 24 Ci/mM; CEA Saclay).

Les fractions de cultures d'eugl~nes (400 ml) sont mises en contact avec l'uracile triti~ (5 pCi/ml), soit au moment de la mise ~ la lumi~re des cellules ~tiol~es (t0-72), soit apr6s 24 h de lumi~re (t24-72) et analys~es apr~s 72 h d'6clairement; une autre condition est la mise en contract des cellules ~tiol~es avec le pr~curseur radioactif pendant les 24 premieres heures d'6clairement (t0-24) seulement.

La mesure de la radioactivit~ sur des aliquots des fractions obtenus apr~s ~lution de gradients de saccharose, est effectu~e dans 5 ml de liquide de Bray [ 27 ], ~ l'aide d'un compteur ~ scintillation Intertechnique (SL 40).

Microscopie dlectronique. Les cellules, ou fractions cellulaires, sont fix~es, in situ, par la glutarald~hyde ~ 2% pendant 15 mn, puis par la glutarald~hyde

436

4% dans un tampon phosphate (pH 7) pendant 1 h. Apr~s lavage, les ~chantil- lons sont fixes par le t~troxyde d'osmium (de 15 mn ~ 1 h), inclus darts la gblose et d~shydrat6s progressivement par des bains d'~thanol (de 20% ~ 100%) et d'oxyde de propyl~ne. Les preparations sont ensuite incluses dans une r~sine synth~tique (bpon-araldite).

L'observation ~lectronique est effectu~e ~ l'aide un microscope Hitachi HU 12 sur des coupes ultrafines (ultramicrotome LKB).

Une preparation sp6cifique, d~crite par Karnovsky [28] a ~t~ aussi employ6e pour l'observation in situ des particules ribosomiques.

Inhibiteurs des synthdses protdiques chloroplastiques. La spectinomycine (Upjohn) sous forme de chlorhydrate en poudre (64.5%) est utilis~e en solution aqueuse, st~rilis~e par filtration ~ travers un filtre Millipore (GS 0.22 #m).

R6sultats

Microscopie dlec tronique L'observation de coupes fines de chloroplastes d'eugl~nes apr~s 72 h de

verdissement sur milieu de jefine, montre la presence de nombreuses particules chlororibosomiques situ6es entre le r6seau lamellaire (Fig. 1A). L'observation de coupes fines de chloroplastes d'eugl~nes ~ plus fort grossissement, apr~s fixation par la glutarald6hyde et coloration ~ l'acide osmique, montre la presence de polysomes et ribosomes chloroplastiques interlamellaires dont certains semblent attaches aux thylaco'ides (Fig. 1B). Le traitement pr~alable des cellules en verdissement par une faible concentration de spectinomycine (5 pg/ml), qui est un inhibiteur traductionnel des syntheses prot6iques chloro- plastiques, montre la pr6sence de chlororibosomes membranaires et une diminution apparente des chlororibosomes interlameUaires (Fig. 1C); par contre la quantit~ relative des RNA chlororibosomiques par rapport aux RNA cyto- ribosomiques, (mesur~e apr~s ~lectrophor~se en gel de polyacrylamide par le rapport 16 S--20 S) ne montre pas de difference signifieative avec l'~chantillon t6moin. Dans les m~mes conditions de culture, on peut aussi noter, dans les mitochondries d'eugl~nes, la pr6sence de ribosomes proches de la membrane interne (Fig. 1D).

Variations quantitatives et fonctionnelles des chlororibosornes suivant leur localisation

Le surnageant de broyage (fraction S~7) contient les phases mobiles cellulaires. La s6dimentation des particules de cette fraction en gradient de saccharose montre la pr6sence de plusieurs pics d'absorption ~ 260 nm qui, par comparaison aux ribosome 69-S d'Anacystis nidulans, et par l'analyse de leurs RNA, sont reli6s ~ la migration de monosomes chloroplastiques 68,8 ou cyto- plasmiques 88-S et ~ ceUe de polysomes (Fig. 2). II faut noter particuli~rement, en pr6sence de dithiothr~itol comme seul agent protecteur, la presence de peu ou pas de 'miniribosomes' chloroplastiques 53-S, et ceci en l'absence de spermidine n6cessaire, darts d'autres conditions d'extraction, au maintien des structures chlororibosomiques [ 29 ].

Le culot membranaire (fraction P17) contient les thylacoides chloro- plastiques, et les particules ribosomiques qui y sont attach6es. L'analyse par

437

Fig. 1. Mise en ~vidence, in si tu, des partictt les r ibosomiques d'Euglena gracilis. A, r ibosomes de chloro- plaste (chl) et du cy top lasme (cy) c o l o r , s sp~ci f iquement pa r la m~thode de K a r n o v s k y [28] (G X 80 000) les s t ruc tu res membrana i r e s ne son t pas appazentes , seules les par t icules r ibosomiques sont visibles. B, ch lo ro r ibosomes d 'eugldnes verdies 72 h en milieu de non-divis ion (G X 155 000)~ darts les cercles: par t icules r ibosomiques membranaixes . C, ch lo ro r ibosomes d 'eugldnes verdies 72 h e n presence de spec- t i n o m y c i n e (5/~g/ml) (G X 125 000) . D, r ibosomes m i t o c h o n d r i a u x d 'eugldnes (notds pa r le cercle) (G × 73 60O).

4 3 8

8BS /, 6BS

O, J- b 110 15

VOI.UME ~ml.I

% I)

i ~, ," i \~ /

; f .,, /

~,()1 t ME (roLl

Fig. 2. S ~ d i m e n t a t i o n des paxticules r i b o s o m i q u e s en g rad ien t de saccharose (10- -45%) . (Spinco B e c k m a n r o t o r SW 27, 26 000 r e v . / m i n - - t = 5 h, t0 -15°C) . C o u r b e a ( en t ra i t plein) : f rac t ion SI 7 (phases mob i l e s cellulaires) de cellules ~tiol~es d'Euglena gracilis raises 72 h & la lumi~re, c o u r b e b (en po in t i l lO: par t i cu les r i b o s o m i q u e s isol~es d'Anacystis niduMns.

Fig. 3. S 4 d i m e n t a t i o n en g rad ien t de saccharose (10 - -45%) de par t icu les r i b o s o m i q u e s d'Euglena gracilis apr~s 24 h de lumi~re. Les c o n d i t i o n s d ' ana lyses son t donn~es darts la F i g 2. Courbe a: f rac t ion PI 7 lamel la i re analys~e en pr6sence de 500 m M KCI, c o u r b e b: f r ac t ion SI 7 analys6e en p resence de 25 r a m KC1, c o u r b e c : f r ac t ion S 17 analys6e en pr6sence de 500 m M KC1.

ultracentrifugation en gradient de saccharose dans le tampon TKMD 500 de cette fraction P~7 met en evidence la liberation d'une partie des chlororibo- somes membranaires, qui apparaissent alors, sous forme dissoci~e, (Fig. 3). Une faible quan~it~ de particules ribosomiques de coefficient de s~dimentation 67--68 S est observ~e surtout au d~but du verdissement cellulaire; elle peut provenir soit de la non-dissociation de certains monosomes chloroplastiques, soit de la presence de contaminants cytoribosomiques, lib~r~s des membranes (Fig. 3).

L'analyse du tableau II, du point de rue qualitatif, montre que la liberation

T A B L E A U iI

V A R I A T I O N Q U A N T I T A T I V E DES R I B O S O M E S A U C O U R S DU V E R D I S S E M E N T (A ± 10%).

CH1, ch lorop las t : cYt, c y t o p l a s m e .

F r a c t i o n T y p e de g rad ien t T y p e r i b o s o m i q u e mesurd A 260 n m p o u r 109 cenules apr~s v e r d i u e m e n t

24 h ( t 0 - 2 4 ) 72 h ( t 0 - 7 2 )

S17

P I ~

25 m M KC1 68 S chl. 3 . 3 5

88 S cyt . 2.7 4.5 500 m M KCI 67 S + 46 S cyt . 14 .3 11

500 m M KCI 5 3 S chl . 2.5 7.5 500 m M KCI + p u r o m y e i n e 53 S chl. 3.6 7.5 500 m M KCI + DOC 1% 5 3 S cb-l. 10 17

25 m M KCI pas de r i b o s o m e s d4tach~s 25 m M KCI + DOC 1% 68 S cbl. 0 .8 1 . 9

439

des particules ribosomiques des membranes n6cessite la pr6sence d 'une haute concentrat ion en KC1 (500 mM), et met ainsi en 6vidence un type de liaison commun aux chlororibosomes membranaires. La puromycine, suivie de l 'action d 'une haute concentrat ion en KCI (500 mM), d6tache, au d6but du verdisse- ment cellulaire (to-24), plus de particules chlororibosomiques des membranes, que l 'action seule du KC1 500 mM (Tableau II). Ainsi, est mis en 6vidence un deuxi6me type de liaison chlororibosome-thylacoide, par l 'interm6diaire de la cha~ne polypeptidique naissante. De m~me, l 'action d 'un d6tergent doux (DOC ~ 1%), en pr4sence de 500 mM KCI, lib6re encore plus de particules chlororibosomiques de la fraction P~7, que la-puromycine, quelle que soit la p6riode du verdissement cellulaire (Tableau II); des chlororibosomes for tement int6gr6s aux membranes plastidiales sont ainsi mis en evidence.

D'autre part, l 'analyse du Tableau II montre un accroissement des quantit6s de r ibosomes chloroplastiques et de monosomes cytoplasmiques, entre 24 h et 72 h de lumi6re. Notamment , les quantit6s de chlororibosomes libres dans le stroma (fraction S,7) et de chlororibosomes membranaires lib~r~s par le d6soxycholate, en pr6sence de 500 mM KC1 (fraction P~7) s'accroissent d 'un m~me facteur (1.7), qui correspond ~ l 'augmentation de la quantit6 des RNA chlororibosomiques mesur6e dans le m6me temps, par 61ectrophor~se en gel de polyacrylamide de fractions ribonucl6iques totales [ 30,31 ].

La mesure de la quantit6 de cytor ibosomes (67-S + 46 S), apr~s dissociation en gradients de saccharose ( tampon TKMD 500) pr6sente une valeur sup6rieure

celle des monosomes 88-S, ce qui implique la dissociation des polysomes cytoplasmiques. De 24 h ~ 72 h de lumi~re, nous voyons que la quantit6 cellulaire de particules cytor ibosomiques diminue (Tableau II); ce fait rejoint l 'observation de la diminution de la quantit6 des RNA cytoribosomiques, mesur6e par dosage, au cours du verdissement cellulaire [31]. Le rapport de la quantit6 de particules cytor ibosomiques (67-S + 46-S) ~ celle des monosomes cytoplasmiques (88-S) d6cro~t aussi entre 2 4 h et 7 2 h de verdissement (Tableau II) et met ainsi en evidence une diminution de la quantit6 de poly- somes cytoplasmiques ~ la fin de la diff~renciation plastidiale.

Parmi les chlororibosomes membranaires de la fraction P~7, on observe que la quantit4 des r ibosomes faiblement li4s, lib4r6s par action de la puromycine et du KCI 500 mM, double entre 24 h et 72 h de verdissement. Dans cette cat6gorie de chlororibosomes, nous observons que la quantit6 des r ibosomes non fonctionnels, c'est-~-dire lib4r6s par le KCI 500 mM seul, qui correspond aux 2/3 environ des r ibosomes faiblement li6s (lib4r6s par puromycine + 500 mM KC1) ~ 24 h de verdissement, en repr6sente la totalit6 apr~s 72 h de lumi6re (Tableau II). Ainsi, en fin de verdissement, la plupart des synth6ses chloro- plastiques termin6es, les chlororibosomes faiblement li6s restent attach6s ~ la surface des lamelles, sous forme non fonctionnelle.

Incorporation d'uracile tritid clans les particules ribosomiques Cytoribosomes. L'analyse des cytor ibosomes (88-S) de la fraction soluble

($25) montre une radioactivit6 sp6cifique (cpm/1 A) sup6rieure pour la p6riode de marquage to -- t24 que pour les p~riodes t24 -- t72 et t o - t72 (respectivement d 'un facteur 4 et 2) (Tableau III).

La synth6se de cytor ibosomes est donc observ6e au d6but de l ' illumination

4 4 0

T A B L E A U I I I

R a d i o a c t i v i t 6 sp~cifique des particules r i b o s o m i q u e d'Euglena gracilis en f o n c t i o n du t e m p s d ' i l l u m i n a t i o n des ceUules 6tiol6es, e t du type de par t i cu le r i b o s o m i q u e

o4 - S 2 S : f r a c t i o n so luble ana lys6e darts 25 m M KC1,

- S s 0 0 : f r a c t i o n soluble ana lysde darts 500 m M KCI, - K: f r a c t i o n m e m b r a n a i r e analys6e dans 500 m M KC1,

- P: f r a c t i o n m e m b r a n a i r e t ra i t6e ~i la p u r o m y c i n e (1 raM) , pu i s analys~e dans 500 m M KC1. - D: t r a c t i o n m e m b r a n a i r e ( T r i t o n 0 .5% + 500 m m KC1).

Par t icu les F r a c t i o n s

T y p e Va leu r S

Pe r iodes de m a r q u a g e ( R A spec . : c p m × 104 /1 A)

t 0 - 2 4 t24- '72 t0-72

C y t o r i b o s o m e s l ibres 88 S $25 18.6 2.6 7.7

C h l o r o r i b o s o m e s l lbres 68 S $25 31.2 15.2 30.8

Sous-uni t~s c h l o r o r i b o s o m i q u e s

l ibres 53 S SSO 0 21.6 10.8 36.6

30 S 23.3

m e m b r a n a i x e s 53 S K 11.1 4.6 7.7

P 6.6 5.8 9.8 D 6.9 - - 11.9

30 S K - - 4.3 12.5 P 11 .0 3.9 9,3 D 7.8 - - 11.4

des cellules. Comme la valeur de la radioactivit6 sp6cifique des cytoribosomes pour la p6riode de marquage t~72, est inf6rieure h celle qui correspond h la p~riode de synth~se des cytoribosomes (t0-24) (Tableau III), une d6gradation des cytoribosomes est ainsi mise en ~vidence au cours du verdissement cellulaire. L'analyse et le dosage des RNA cytoribosomiques au cours du verdissement cellulaire rejoignent ces conclusions [ 31 ].

Chlororibosomes du stroma. Les valeurs de la radioactivit~ sp~cifique des chlororibosomes du stroma (fraction $25) (Tableau III) sont peu diff~rentes pour les p~riodes de marquages t0-24 et t0-72, indiquant une stabilit6 de ces particules chlororibosomiques au cours de la diff~renciation plastidiale. La valeur de la radioactivit6 sp~cifique observ6e pour un marquage t24-72 repr6sente environ la moiti6 de celle des marquages pr6c6dents et rejoint le fait, not6 pr6c6demment ou observ6 par l 'analyse des RNA ribosomiques [30,31], que 60% environ, des chlororibosomes sont synth6tis6s dans la premiere journ6e d'~clairement. I1 faut noter que l ' incorporation de l'uracile triti6 dans les chlororibosomes repr6sente alors environ 85% du marquage des ribosomes ceUulaires, pendant cette p+riode (t24_+2) (Fig. 4).

La mesure de la radioactivit+ sp+cifique des sous-unit~s chlororibosomiques du stroma (fraction Ss00) suivant ces 3 modalit6s de marquage (Tableau III), montre:

pour la grande sous-unit6 53-S, une valeur plus importante pour les p6riodes de marquage t0-24 et t0_72 que pour la p+riode de marquage t24_72 (respective- ment d 'un facteur 2 et 3.5).

pour la peti te sous-unit6 30-S, une valeur qui n'est pas significativement diff+rente pour les p+riodes de marquage, t0-24 et t0-72, mais qui est 2 fois plus

441

~ s s

Ii

h

!L

I' i i

8 a ~

-

~o oeo

,ooo

~, ,,,i 4 io zo

I R \ ( : I I( )NN

Fig. 4. S ~ d i m e n t a t i o n d e s p a r t i c u l e s r i b o s o m i q u e s d'Euglena gracilis ( f r a c t i o n S 17) e n g r a d i e n t d e saecha- rose (1{)---45% d a n s le t a m p o n T K M D 25) ( S p i n c o B e c k m a n , r o t o r SW 27, ~t 26 0 0 0 r e v . / m i n t = 6 h ; t O : 15°C) . Apr~s 2 4 h d ' i l l u m i n a t i o n , les ce l lu les e n v e r d i s s e m e n t o n t e n s u i t e 6 t6 r a i s e s e n c o n t a c t avec

de l ' u r a c i l e t r i t i~ (5 ~ C i / m l ; 1 7 C i / m M ) p e n d a n t 4 8 h ~ la l umi~ re ( t 2 4 - 7 2 ) . C o u r b e e n t ra i t p l e i n : A 2 6 0 n m des f r a c t i o n s de 0 .5 m l du g r a d i e n t , c o u r b e e n p o i n t i l l 6 s : R a d i o a c t i v i t 6 e n c p m , d ' a l i q u o t s de

0.1 m l de c e s f r a c t i ons .

faible pour la p6riode de marquage t24-72. Ces r6sultats montrent la pr6sence d'un 'pool ' de nucl6otides pour la syn-

th~se de la grande sous-unite 53-S, qui n'intervient pas dans la synth~se de la petite sous-unit6 30-S des chlororibosomes du stroma.

Chlororibosomes membranaires. Les valeurs de la radioactivit6 sp6cifique des sous-unit~ chlororibosomiques 53-S, lib~r~es par la puromycine (P) ou le d6tergent (D}, sont plus importantes pour la p~riode de marquage t0-72 que pour la p6riode t0-24 (Tableau III). Dans le m~me temps, une diminution de la valeur de la radioactivit6 sp6cifique des sous-unit6s 53-S lib6r6es par le KC1 500 mM seul (K), est observ6e. En consid~rant la p~riode de marquage to-24, d 'une part et les p6riodes t24-72 et t0-72, d'autre part (Tableau III), une inversion dans le rapport de marquage des sous-unit~ 53-S est alors no t re entre les particules lib~r~es seulement par 500 mM KC1 (K) et celles lib~r~es par la puromycine (P) ou le d~tergent (D). Ainsi, les sous-unit~s membranaires 53-S nouvellement synth~tis~es ne pr6sentent qu 'un seul lien, de type 61ectro- statique, avec la membrane, et seraient ~ l'origine des particules plus for tement integr6es aux thylacoides.

Les valeurs de la radioactivit6 sp6cifique des sous-unit6s 30 S, dans une m~me p~riode de marquage (Tableau III), ne pr6sentent pas, dans l 'ensemble, de differences notables en fonct ion de l 'agent employ6 pour d6tacher les chlororibosomes membranaires. Cela sugg~re une grande facilit6 d'~change des sous-unit6s 30-S des chlororibosomes membranaires. Par contre, pour la p6riode de marquage t24-~2, les valeurs de la radioactivit6 sp6cifique des sous-unit6s 30-S, comme celles des sous-unit~s 53-S, sont significativement diff~rentes de ceUes observ~es dans les p~riodes de marquages t0-24 et t24-72 (Tableau III). Comme dans le cas des sous-unit6s chlororibosomiques du stroma, une syn- th~se continue des particules membranaires, ainsi qu 'une grande stabilit6 de

442

celles-ci, sont donc observ~es au cours du verdissement cellulaire. Par ailleurs, il faut noter que les culots membranaires, m~me apr~s l 'action

du d~tergent en haute force ionique, pr~sentent encore une certaine radio- activit6.

Discussion

Localisation des chlororibosomes Dans les chloroplastes d'eugl~.nes coexistent deux classes distinctes de ribo-

somes. Les uns sont libres dans le stroma, les autres sont attaches aux lamelles photosynth~t iques (Fig. 1) et peuvent ~tre lib6r6s par l 'action de diff~rents agents. Ces particules chlororibosomiques fix~es aux thylacoides ne corres- pondent pas ~ une contaminat ion de la fraction membranaire par des ribo- somes libres, car la s~dimentation d'un aliquot de cette fraction ~ travers un gradient de saccharose de faible force ionique (KC1 25 mM) n'en lib~re pas. L 'adsorpt ion sur les thylacoides de ribosomes du stroma, au cours du fraction- nement cellulaire, peut ~tre exclue, car des cytor ibosomes d'eugl~nes marquis

l'uracile trit6, ajout6s au culot cellulaire avant broyage, ne sont pas retrouv~s dans les diff6rents gradients d'analyse de la fraction membranaire P17.

Certains chlororibosomes membranaires d'eugl~nes sont lib~r6s et dissoci~s en presence d 'une haute force ionique seule et correspondent ainsi ~ des particules ribosomiques uniquement li~es aux lameUes par des forces 61ectro- statique (ribosomes faiblement li~s); ces particules ribosomiques ne seraient pas engag~es dans un processus de synth~se de prot~ines membranaires; il se pourrait que tou t ou partie de ces chlororibosomes soit engag~ darts la synth~se de prot6ines solubles, mais cette alternative reste ~ ~tre pr6cis~e.

L' incubation du culot membranaire d'eugl~nes avec de la puromycine, suivie d 'une s6dimentation ~ travers un gradient de saccharose dans un tampon contenant 500 mM KC1, lib~re une quantit~ plus importante de particules chlororibosomiques que la seule s6dimentation ~ travers le gradient de saccharose (TKMD 500) (Tableau II), lorsque cette analyse est effectu~e au cours de la synth6se active des structures chloroplastiques (t0-24). Par contre, en fin de diff~renciation des chloroplastes (~ 72 h de lumi~re), il n 'y a plus de difference significative entre les deux traitements (Tableau II).

I1 a 6t6 montr~ que l 'utilisation de la puromycine cause la perte de la cha~ne naissante peptidique [32] . Les polypept ides incomplets sont alors pr~matur~- ment rel~ch6s [33] et restent accroch6s aux membranes. La liberation des r ibosomes membranaires par la puromycine n'appara~t qu 'aux forces ioniques ~lev~es, entrainant l 'existence de deux points d 'at tache du ribosome avec la membrane [ 34,35] .

Chez Euglena gracilis, une cat~gorie de chlororibosomes ayant deux points d 'at tache avec les lamelles, est ainsi mise en ~vidence au cours de la differentia- tion du chloroplaste et implique donc l 'existence de polysomes membranaires qui synth6tiseraient certaines prot6ines int~gr~es aux lamelles chloroplastiques. Lorsque la diff~renciation plastidiale est achev~e chez Euglena gracilis (apr~s 72 h de lumi6re), cette cat6gorie de chlororibosomes ne peut ~tre mise en ~vidence et un accroissement corr~latif des chlororibosomes fixes aux mem- branes par les seules forces 61ectrostatiques est not6. Pr6c~demment, chez une

443

autre algue unicellulaire, Chlamydomonas, Margulies et al [36] avaient montr~ la d&harge vectorielle des cha~nes polypeptidiques naissantes attach~es aux thylacoides.

L'utilisation de d&ergents, d~soxycholate ou Triton X-100, ~ faible con- centration (0.5 fi 1%), permet la liberation d 'un troisi~me type de chlororibo- somes membranaires chez Euglena gracilis, m~me en fin de diff~renciation plastidiale. Cette fraction de chlororibosomes for tement int~gr~e aux thylaco'ides a aussi ~t~ mise en ~vidence chez Chlamydomonas [37] . Chez les plantes sup~rieures, des micrographies ~lectroniques ont ~galement r~v~l~ la presence de polysomes chloroplastiques ~ organisation circulaire dans les mem- branes des thylaco'ides [20,38] .

Relations entre les diffdrents groupes de chlororibosomes Au cours de la diff~renciation plastidiale, les quantit~s de chlororibosomes,

libres dans le s troma ou attaches aux thylaco'/des, croissent dans la m~me proport ion (Tableau II). Par ailleurs, une ~volution diff~rente dans le marquage des sous-unit~s chlororibosomiques 53-S et 30-S entre ces deux categories de chlororibosomes, est mise en ~vidence par l ' incorporation d'uracile triti~ (Tableau III). Ainsi les chlororibosomes libres dans le stroma ou attaches aux membranes forment, ici, deux categories distinctes. I1 n'est pas exclu que dans certaines conditions exp~rimentales, telle l 'action de la spectinomycine, (Fig. 1), il y ait des modifications dans la localisation des particules chlororibo- somiques, comme ce fut montr~ pr~c~demment chez Chlamydomonas, avec le chloramph~nicol [21] . Les trac~s d'~lution des gradients de saccharose montrent , dans toutes les p~riodes de marquage, une faible quantit~ de poly- ribosomes chloroplastiques dans le stroma (Fig. 4); cette observation rejoint celle effectu~e chez Chlamydomonas [ 39 ].

Parmi les chlororibosomes membranaires, la petite sous-unit~ 30-S a une radioactivit~ sp~cifique sensiblement ~gale quel que soit le mode d 'a t tachement des ribosomes. Par contre, celle de la grande sous-unit~ 53-S varie en fonction du mode de liberation des particules ribosomiques membranaires, suivant la p~riode de marquage. Cela indique une localisation plus sp~cifique de la grande sous-unit~ chlororibosomique sur les membranes des thylacoYdes. Enfin, nous avons not~ par l ' incorporation d'uracile triti~ que les chlororibosomes, plus for tement integr~s aux membranes proviendraient de la synth~se de particules faiblement li~es. Ainsi, chez Euglena gracilis comme chez d'autres organismes, plusieurs categories de chlororibosomes, ~ localisation sp~cifique dans l 'organite, sont mises en ~vidence, dont l 'existence peut &re reli~e ~ celle de certaines syntheses prot~iques [ 31,40,41] .

Remerciements

Nous remercions Mmes C. Maillefer et A. Santa Maria pour leur collaboration technique. Ce travail a bdndfici~ d 'une subvention du CEA (Saclay).

R~f~rences

1 RoLleston, F.S. (1974) Sub-cell. Biochem. 3, 9 1 - - 1 1 7 2 Palade, G.F . ( 1955 ) J . Biophys . Biochem. Cytol . 1, 59 - -68

4 4 4

3 R e d m a n , C.M. ( 1 9 6 8 ) B i o c h e m . B i o p h y s . Res . C o m m u n . 3 1 , 8 4 5 - - 8 5 0 4 Takag i , M., T a n a k a , T. e t O g a t a , K . ( 1 9 7 0 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 1 7 , 1 4 8 - - 1 5 8 5 Vassal l i , P., L i s o w s k a - B e r n s t e i n , B. e t L a m m , M.E. ( 1 9 7 1 ) J . Mol. Biol . 56 , 1 - - 1 9 6 A t t a r d i , B., C r a v i o t o , B. e t A t t a r d i , G. ( 1 9 6 9 ) J . Mol . Biol . 44 , 4 7 - - 7 0 7 R o s b a h , M. e t P e n m a n , S. ( 1 9 7 1 ) J . Mol. Biol. 59, 2 2 7 - - 2 4 1 8 Da l lne r , G., S i ekev i t z , P. et Pa l ade , G.E. ( 1 9 6 6 ) J . Cell Biol . 30, 7 3 - - 1 1 7 9 B i n g h a m , R .W. e t C a m p b e l l , P .N . ( 1 9 7 2 ) B i o c h e m . J . 1 2 6 , 2 1 1 - - 2 1 5

1 0 S a b a t i n i , D.D. , N o n o m u r a , Y., M o r i m o t o , T. e t B lobe l , G. ( 1 9 7 2 ) FEBS Syrup . 23, 1 4 7 - - 1 7 3 11 R e d m a n , C.M. e t S a b a t i n i , D .D. ( 1 9 6 6 ) P roc . Nat l . A c a d . Sci. U.S. 5 6 , 6 0 8 - - 6 1 5 1 2 R e d m a n , C.M. ( 1 9 6 7 ) J . Biol . C h e m . 2 4 2 , 7 6 1 - - 7 6 9 1 3 S a b a t i n i , D .D. e t B lobe l , G. ( 1 9 7 0 ) J . Cell Biol. 45, 1 4 6 - - 1 5 7 1 4 A d e l m a n , M.R . , S a b a t i n i , D.D. et B lobe l , G. ( 1 9 7 3 ) J . Cell Biol. 56 , 2 0 6 - - 2 2 9 15 Ble ibe rg , I., Z a u d e r e r , M. e t Bag l ion i , C. ( 1 9 7 2 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 6 9 , 4 5 3 - - 4 6 4 16 Lee , S .Y. , K r s m a n o v i c , V. e t B r a w e r m a n , G. ( 1 9 7 1 ) J . Cell. Biol . 49, 6 8 3 - - 6 9 1 17 S p e n c e r , D. ( 1 9 6 5 ) A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 111 , 3 8 1 - - 3 8 8 1 8 B a m j i , M.S. e t J a g e n d o r f , A.T. ( 1 9 6 6 ) P l a n t P h y s i o l . 41 , 7 5 4 - - 7 6 1 1 9 G n a n a m , A. e t K a h n , J .S . ( 1 9 6 7 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 4 2 , 4 8 6 - - 4 9 3 2 0 P h i l i p o v i c h , I.I. , T o n g u r , A.M. et A l ina , B.A. ( 1 9 7 0 ) Exp . Cell Res. 62 , 3 9 9 - - 4 0 6 21 C h u a , N.H. , B lobe l , G. , S iekev i t z , P. e t Pa l ade , G .E . ( 1 9 7 6 ) J . Cell Biol . 7 1 , 4 9 7 - - 5 1 4 2 2 Fa lk , H . ( 1 9 6 9 ) J . Cell Biol . 42 , 5 8 2 - - 5 8 7 2 3 ]~hil ipovich, I .I . , N o z d r i n a , V.N. e t O p a r i n , A.I . ( 1 9 7 5 ) D o l k . A k a d . N a u k . S S S R 225 , 1, 2 2 3 - - 2 2 6 2 4 C a l v a y r a c , R . ( 1 9 7 0 ) A r c h . Mikxob io l . 7 3 , 3 0 8 - - 3 1 4 25 S t e r n , A. I . , E p s t e i n , H.T. et Seh i f f , J . A . ( 1 9 6 4 ) P l a n t Phys io l . 39, 226-- -231 2 6 Mc. K i n n e y , G. ( 1 9 4 1 ) J . Biol. C h e m . 1 4 0 , 3 1 5 - - 3 2 2 2 7 B r a y , G . A . ( 1 9 6 0 ) A n a l y t . B i o c h e m . 1, 2 7 9 - - 2 8 5 28 K a m o v s k y , M.J . ( 1 9 6 1 ) J . B i o p h y s . B i o c h e m . C y t o L 11, 7 2 9 - - 7 3 2 2 9 F r e y s s i n e t , G. e t Sch i f f , J .A . ( 1 9 7 4 ) P l a n t Phys io l . 53 , 4, 5 4 3 - - 5 5 4 3 0 H e , m a n n , P. ( 1 9 7 4 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 353 , 3, 3 0 1 - - 3 1 2 31 L e d o i g t , G. ( 1 9 7 6 ) Thdse , Univ . Paris 1 1 - O r s a y 32 N o m u r a , M. ( 1 9 7 0 ) Bac te r io l . Rev . 34, 3, 2 2 8 - - 2 7 7 3 3 S t e w a r t , P .R . ( 1 9 7 3 ) in T h e R N A s ( S t e w a r t , P .R . et L e t h a n , D.S. eds.) , p p . 1 5 1 - - 1 5 8 3 4 Margu l i e s , M. e t Michae l s , A. ( 1 9 7 4 ) J . Cell Biol . 60 , 6 5 - - 7 7 3 5 K r u p p a , J . et S a b a t i n i , D.D. ( 1 9 7 7 ) J . Cell Biol . 74 , 4 1 4 - - 4 2 7 36 Margu l i e s , M.M., T i f f a n y , H .L . e t Michae l s , A. ( 1 9 7 5 ) B i o c h e m . B i o p h y s . Res. C o m m u n . 64 , 2, 7 3 5 - -

7 3 9 37 Margu l i e s , M. e t W e i s t r o p , J . ( 1 9 7 6 ) in G e n e t i c s a n d B iogenes i s o f c h l o r o p l a s t s a n d m i t o c h o n d r i a

( B u c h e r , Th . e t ai. , eds . ) , pp . 6 5 7 - - 6 6 0 , E l s e v i e r - N o r t h - H o l l a n d B i o m e d i c a l Pres , A m s t e r d a m 38 Ph i l i pov ich , I .I . , N o z d r i n a , V.N. , K u p c h i n e n k o , V.V. e t O p a r i n , A.I . ( 1 9 7 6 ) B i o c h e m i s t r y 41 , 4, 2,

5 8 3 - - 5 9 0 39 B a u m g a r t e l , M. et H o w e l l , S .H. ( 1 9 7 6 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 5 4 , 3 3 8 - - 3 4 8 4 0 Ellis, R . J . ( 1 9 7 7 ) in Nuc l e i c A c i d s a n d P r o t e i n S y n t h e s i s in P l an t s ( B o g o r a d , L. e t Wel l , J .H . eds . ) ,

pp . 1 9 5 - - 2 1 2 , P l e n u m Press , N e w Y o r k 41 S h o r e , G.C. e t T a t a , J . R . ( 1 9 7 7 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 7 2 , 1 9 7 - - 2 3 6