determinaciÓn de proteinas
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DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS.
DE AMINOÁCIDOS QUE EXHIBEN UNA AMPLIA GAMA DE ESTRUCTURAS Y FUNCIONES .LAS PROTEÍNAS COMO UN GRUPO DE BIOMOLÈCULAS , DESEMPEÑAN UNA GRAN VARIEDAD DE FUNCIONES , ALGUNAS PARTICIPAN EN LA CONTRACCIÓN MUSCULAR Y SIRVEN PARA DAR SOPORTE ESTRUCTURAL, OTRAS TRASPORTAN Y ALMACENAN MOLÉCULAS PEQUEÑAS.
PROTEÍNAS SON COMPONENTES ABUNDANTES EN
TODAS LAS CÉLULAS.
CASI TODAS (EXCEPTO LAS DE ALMACENAMIENTO) SON IMPORTANTES PARA LAS FUNCIONES BIOLÓGICAS Y/O LA ESTRUCTURA CELULAR.
LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS SON MUY COMPLEJAS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS ESTÁN CONSTITUÍDAS POR:
HIDRÓGENO, CARBONO, NITRÓGENO, OXÍGENO Y AZÚFRE.
LOS “BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN” DE LAS PROTEÍNAS SON 20
∞-AMINOÁCIDOS.
LAS UNIONES ENTRE RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS EN UNA PROTEÍNA SON ENLACES PEPTÍDICOS.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS EL NITRÓGENO ES EL ELEMENTO MÁS DISTINTIVO
PRESENTE EN LAS PROTEÍNAS.
GENERALMENTE LAS PROTEÍNAS RICAS EN AMINOÁCIDOS BÁSICOS CONTIENEN MÁS NITRÓGENO.
SIN EMBARGO, EL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN VARIAS PROTEÍNAS ALIMENTICIAS VARÍA DE 13.4 19.1% DEBIDO A LA VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS ESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS.
CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS COMPOSICIÓN
ESTRUCTURA
FUNCIÓN BIOLÓGICA
PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD
COMPLICACIONES EN ELANÁLISIS DE PROTEÍNAS
CARACTERÍSTICAS FÍSICO QUÍMICAS DE LOS ALIMENTOS
SIMILARES A LOS DE LAS PROTEÍNAS
FUENTES DE NITRÓGENO NO PROTÉICO
AMINOÁCIDOS LIBRES PEQUEÑOS PÉPTIDOS ÁCIDOS NUCLÉICOS FOSFOLÍPIDOS AZÚCARES AMINAS PORFIRINA ALGUNAS VITAMINAS
FUENTES DE NITRÓGENONO PROTÉICO
ALCALOIDES ÁCIDO ÚRICO UREA IONES DE AMONIO
OTROS MACROCOMPONENTES DE LOS ALIMENTOS QUE PUEDEN INTERFERIR CON EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
CARBOHIDRATOS LÍPIDOS
MÉTODOS DESARROLLADOS PARA MEDIR EL CONTENIDO PROTÉICO
FUNDAMENTOS: DETERMINACIONES DE NITRÓGENO ENLACES PEPTÍDICOS ÁCIDOS AROMÁTICOS ABSORTIVIDAD UV DE LAS PROTEÍNAS GRUPOS AMINO LIBRES PROPIEDADES DE DISPERSIÓN DE LA LUZ CAPACIDAD DE ADHESIÓN DE
COLORANTES
IMPORTANCIA DEL ANÁLISISDE PROTEÍNAS
DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA. EJEMPLO: PECTINASAS DURANTE LA MADURACIÓN DE FRUTOS.
INVESTIGACIÓN SOBRE PROPIEDADES FUNCIONALES. EJMPLO: GLIADINA Y GLUTENINAS PARA LA ELABORACIÓN DEL PAN.
ETIQUETAMIENTO NUTRICIONAL
NECESIDAD DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
¤CONTENIDO PROTÉICO TOTAL
¤COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
¤CONTENIDO DE ALGUNA PROTEÍNA PARTICULAR EN UNA MEZCLA
¤CONTENIDO PORTEÍCO DURANTE EL AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA
¤NITRÓGENO NO PROTÉICO
¤VALOR NUTRITIVO DE UNA (DIGESTIBILIDAD, BALANCE PROTÉICO)
CONTENIDO PROTÉICOEN LOS ALIMENTOS
PRODUCTOS LÁCTEOS
LECHE ENTERA 3.5%LECHE DESHIDRATADA DESG. 35.9%QUESO CHEDDAR 25%HUEVOS 12.9%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS
CARNES
RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA 28.6%PUERCO, MAGRO 17.1%PECHUGA DE POLLO 27.3%
PESCADO
BACALAO COCINADO 28.5%ATÚN EN ACEITE ENLATADO 24.2%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS
CEREALES
ARROZ, INTEGRAL, CRUDO 7.5% ARROZ REFINADO, CRUDO 6.7% HARINA DE TRIGO INTEGRAL 13.3% HARINA DE MAÍZ 7.8% SPAGHETTI, SECO 12.5% ALMIDÓN DE MAÍZ 0.3%
CONTENIDO PROTÉICO ENLOS ALIMENTOS
FRUTAS Y VEGETALES PAPA ENTERA, 1.6% ESPÁRRAGOS 2.5% TAPIOCA 0.6%FRIJOLES 22.3%SOYA SECA 34.1%
CONTENIDO PROTÉICO EN LOSALIMENTOS
FRUTAS Y SEMILLAS
MANZANA ENTERA, CRUD 0.2%
ALMENDRAS ENTERAS 18.6%
MÉTODOS DE DETERMINACIÓNDE PROTEÍNAS
MÉTODO DE KJELDAHLMÉTODO DE BIURETMÉTODO DE LOWRYMÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)MÉTODO DE ABSORCIÓN UV A 280nmMÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTEMÉTODO DE BRADFORDMÉTODO DE LA NINHIDRINAMÉTODO TURBIDIMÉTRICO
MÉTODO DE KJELDAHL(JOHANN KJELDAHL, 1883)
DIGESTIÓN CON H2SO4 CON LA ADICIÓN DE PERMANGANATO DE POTASIO PARA COMPLETAR LA OXIDACIÓN Y CONVERSIÓN DEL NITRÓGENO A SULFATO DE AMONIO.
NEUTRANLIZACIÓN DE LA DIGESTA DILUIDA, SEGUIDA DE UNA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO ESTÁNDAR CON UN CONTENIDO DE IODURO DE POTASIO E YODATO.
TITULACIÓN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO DE SODIO ESTÁNDAR
MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
SE HAN AÑADIDO CATALIZADORES COMO: Hg, Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA LOGRAR UNA DIGESTIÓN COMPLETA.
EL DIÓXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO DE COBRE EN PROPORCIÓN 3:1 SON MUY EFECTIVOS EN LA DIGESTIÓN.
MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE
KJELDAHL
EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA AUMENTAR EL PUNTO DE EBULLICIÓN DEL ÁCIDO SULFÚRICO PARA ACELERAR LA DIGESTIÓN.
EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE AÑADEN A LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR A LIBERAR EL NITRÓGENO DEL Hg EL CUAL TIENDE A ADHERIR AMONIO.
MODIFICACIONES PARA EL
MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL
EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO Y ES SEGUIDO DE UNA TITULACIÓN CON UN ÁCIDO ESTÁNDAR.
SE UTILIZAN LA COLORIMETRÍA Y LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE NITRÓGENO
POSTERIOR A LA DIGESTIÓN.
PROCEDIMIENTO GENERALY REACCIONES
DIGESTIÓN
EL SULFATO DE AMONIO NO VOLÁTIL SE FORMA DE LA REACCIÓN DEL NITRÓGENO Y EL ÁCIDO SULFÚRICO.
DURANTE LA DIGESTIÓN SE LIBERA EL NITRÓGENO PROTÉICO PARA FORMAR IONES DE AMONIO.
EL ÁCIDO SULFÚRICO OXIDA LA MATERIA ORGÁNICA Y SE COMBINA CON EL AMONIO FORMADO.
DIGESTIÓN
LOS ELEMENTOS CARBONO E HIDRÓGENO SE CONVIERTEN EN DIÓXIDO DE CARBONO Y AGUA
PROTEÍNAÁcido SulfúricoCalor, catalizador
(NH4)2 SO4
NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN
LA MUESTRA DIGERIDA SE DILUYE CON AGUA.
SE AÑADE EL ÁLCALI QUE CONTIENE TIOSULFATO DE SODIO PARA NEUTRALIZAR AL ÁCIDO SULFÚRICO.
EL AMONÍACO FORMADO SE DESTILA EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO QUE CONTIENE LOS INDICADORES AZÚL DE METILENO Y ROJO DE METILO.
REACCIONES DE LANEUTRALIZACIÓN Y LA DESTILACIÓN
(NH)2SO4+ 2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O
NH3+ H3BO3 → NH4 + H2BO3-
(ácido bórico) (ión borato)
REACCIONES DE LATITULACIÓN
EL ANIÓN BORATO (PROPORCIONAL A LA CANTIDAD DE NITRÓGENO) SE TITULA CON HCl ESTANDARIZADO:
H2BO3- + H+ → H3BO3
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
NESSLERIZACIÓN
NH4OH + 2HGI2+ 2KI + 3KOH → NH4Hg2I +7KI + 4H2O ( rojo-naranja, 440nm)
RÁPIDO Y FÁCIL PERO EL IODURO DIMERCÚRICO DE AMONIO ES COLOIDE Y EL COLOR ES INESTABLE
PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE
DESTILACIÓN Y TITULACIÓN
MEDICIÓN DEL pH POSTERIOR A LA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO BÓRICO
MEDICIÓN DIRECTA DEL AMONÍACO, MEDIANTE EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA IÓNICA
VENTAJAS DEL MÉTODO DE KJELDAHL
¤APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS¤RELATIVAMENTE SIMPLE¤BARATO¤PRECISO¤ES EL MÉTODO OFICIAL PARA MEDIR EL CONTENIDO DE PROTEÍNA CRUDA
DESVENTAJAS DEL MÉTODODE KJELDAHL
MIDE EL NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL, NO SÓLO EL NITRÓGENO PROTÉICO
CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2 HORAS PARA COMPLETARSE)
PRECISIÓN MÁS POBRE QUE EL MÉTODO DE BIURET
USA REACTIVOS CORROSIVOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET
FUNDAMENTO
AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CÚPRICOS CON LOS ENLACES PEPTÍDICOS DE LAS PROTEÍNAS SE PRODUCE UN COLOR VIOLETA-MORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS.
LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEÍDO A 540nm.
LA INTENSIDAD DEL COLOR (ABSORBANCIA) ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.
PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET
5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE PROTEÍNA/mL).
EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE, NaOH, Y TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL CUAL SE UTILIZA PARA ESTABILIZAR EL IÓN COBRE EN LA SOLUCIÓN ALCALINA
PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET
DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SÓLO REACTIVO.
SI LA REACCIÓN NO ES CLARA DEBE CENTRIFUGARSE LA MUESTRA PREVIO A LA LECTURA DE LA ABSORBANCIA
PROCEDIMIENTO PARA ELMÉTODO DE BIURET
SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO
VENTAJAS DEL MÉTODO DE BIURET
MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL
RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS)
ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS
NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR
POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DE BIURET
NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
BIURETNO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRY
REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA
LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIÓN FINAL SI ESTÁN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES DE LÍPIDOS O CARBOHIDRATOS
DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS
MÉTODO DE LOWRY
FUNDAMENTO
COMBINA LA REACCIÓN DE BIURET CON LA REDUCCIÓN DEL
REACTIVO DE FENOL FOLIN-
CIOCALTEAU (ÁCIDO
FOSFOMOLÍBDICO-FOSFOTÚNGSTICO)
POR LOS RESIDUOS DE TIROSINA Y
TRIPTOFANO DE LAS PROTEÍNAS. EL
COLOR AZULOSO DESARROLLADO ES
LEÍDO A 750nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA
CONCENTRACIÓN PROTÉICA BAJA) O A 500nm
(ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN
PROTÉICA ALTA)
VENTAJAS DEL MÉTODO DE LOWRY
MUY SENSIBLE MENOS AFECTADO POR LA
TURBIDEZ DE LA MUESTRA MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA
DE LOS OTROS MÉTODOS RELATIVAMENTE SIMPLE SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5
HORAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELOWRY
EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET)
EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS
LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
FUNDAMENTO
SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTEÍNAS REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA
VENTAJAS DEL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO
DE LOWRY (0.5mg a 10mg)
LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE LOWRY
EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY
LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DELÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)
EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA.
LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.
LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL
MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280NM
FUNDAMENTO
LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE DEBIDO PRINCIPALMENTE A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA DE LAS PROTEÍNAS. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO LA LEY DE BEER
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ABSORCIÓN EN UV (280NM)
MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET)
NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER
MÉTODO NO DESTRUCTIVO UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-
COLUMNA DE LAS PROTEÍNAS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE ABSORCIÓN EN EL UV (280NM)
LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA REGIÓN DE 280nm
EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS.
LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS
SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA UTILIZAR ESTE MÉTODO
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR ADHESIÓN DE UN COLORANTE
ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
MÉTODO DE BRADFORD
ADHESIÓN DE COLORANTEANIÓNICO FUNDAMENTO LA MUESTRA PROTÉICA SE
MEZCLA CON UNA CANTIDAD EXCESIVA CONOCIDA DE UN COLORANTE ANIÓNICO EN UNA SOLUCIÓN BUFFER.
LAS PROTEÍNAS SE UNEN AL COLORANTE PARA FORMAR UN COMPLEJO INSOLUBLE.
ADHESIÓN DE COLORANTEANIÓNICO
FUNDAMENTO
SE MIDE EL COLORANTE NO ADHERIDO, SOLUBLE POSTERIOR A LA EQUILIBRACIÓN DE LA REACCIÓN Y LA REMOCIÓN DEL COMPLEJO INSOLUBLE POR CENTRIFUGACIÓN Y FILTRACIÓN. EL COLORANTE NO ADHERIDO ESTÁ INVERSAMENTE RELACIONADO AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA
ADHESIÓN DE COLORANTE
ANIÓNICOFUNDAMENTO
PROTEÍNA + EXCESO DE COLORANTE →
COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE INSOLUBLE + COLORANTE NO ADHERIDO SOLUBLE
COLORANTES UTILIZADOS EN ESTE MÉTODO
ÁCIDO SULFÓNICO ANIÓNICO NARANJA ÁCIDO 12 NARANJA G NEGRO AMIDO 10B
UNEN GRUPOS CATIÓNICOS DE LOS RESIDUOS BÁSICOS DE AMINOÁCIDOS (IMIDASOL DE LA HISTIDINA, GUANIDINA DE LA ARGININA Y EL GRUPO ε-AMINO DE LA LISINA) Y EL GRUPO LIBRE TERMINAL AMINO DE LAS PROTEÍNAS.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
MÉTODO RÁPIDO (15 MINUTOS O MENOS)
BARATO RELATIVAMENTE EXACTO PARA
EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS
PUEDE UTILIZARSE PARA ESTIMAR LOS CAMBIOS EN EL CONTENIDO DE LISINA DISPONIBLE DE LOS CEREALES DURANTE SU PROCESAMIENTO.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO
NO UTILIZA REACTIVOS CORROSIVOS
NO MIDE NITRÓGENO NO PROTÉICO
MÁS PRECISO QUE EL MÉTODO KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA ADHESIÓN DEL COLORANTE ANIÓNICO
LAS PROTEÍNAS DIFIEREN EN SU CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS BÁSICOS DIFIEREN EN SU CAPACIDAD DE ADHESIÓN DEL COLORANTE
SE NECESITA ELABORAR CURVA DE CALIBRACIÓN
MUCHOS COMPONENTES NO PROTÉICOS TAMBIÉN SE PUEDEN ADHERIR AL COLORANTE (ALMIDÒN), METALES (Ca O P) Y CAUSAR ERRORES EN LOS RESULTADOS
MÉTODO DE BRADFORD
FUNDAMENTO
EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO YE L MÁXIMO DE ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LA MUESTRA.
VENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN
SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS)
REPRODUCIBLE
SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE LOWRY)
NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+
VENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD
NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO
NO EXISTE INTERFERENCIA DE LOS POLIFENOLES NI CARBOHIDRATOS COMO LA SACAROSA
MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS CON UNA MASA MOLECULAR APROXIMADAMENTE IGUAL O MAYOR DE 4 000 DALTONS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD
EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZO
EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS.
LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO CUIDADO
INTERFERENCIA CON DETERGENTES.
MÉTODO DE LA NINHIDRINA
FUNDAMENTO
AL SER HERVIDOS EN UN BUFFER A UN pH DE 5.5 EN PRESENCIA DE NINHIDRINA E HIDRINDANTINA, LOS AMINOÁCIDOS, AMONÍACO, Y LOS GRUPOS AMINO PRIMARIOS, ORIGINAN UN COLOR MORADO RUHEMANN
VENTAJA DEL MÉTODO DE LA NINHIDRINA
MÉTODO RELATIVAMENTE RÁPIDO SI SE COMPARA CON EL MÉTODO DE KJELDAHL
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA NINHIDRINA
LA PRESENCIA DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS, AMINAS PRIMARIAS, Y AMONÍACO OCASIONA UNA SOBREESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO
BAJA PRECISIÓN
EL COLOR VARÍA CON LA DIFERENTE COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
SE NECESITA ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR EN CADA ANÁLISIS