purificacao de proteinas

Disciplina: Engenharia de Proteínas

Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira Ma. Flávia Campos Freitas Vieira

Métodos de Purificação de Proteínas

1. Trabalhando com proteínas;

2. Purificação Proteica;

3. Métodos Cromatográficos;

4. Análise de Proteínas;

5. Quantificação de Proteínas.

Trabalhando com Proteínas

• Compreensão sobre estrutura e função de proteínas proteínas individuais.

• Separadas de outras de forma pura a partir da determinação de suas propriedades.

• Proteína pura essencial para que suas propriedades e atividades sejam determinadas.


Como purificar uma proteína

Métodos clássicos

Diferença de propriedades das proteínas: carga,

tamanho, ligantes.

Métodos modernos

Clonagem de DNA, sequenciamento

genômico, chips de proteínas, etc.


• Proteína nova precedentes estabelecidos e bom senso.

• Mais de um método de purificação utilizado.

• Escolha do método: empírico.

• Levar em consideração métodos descritos para proteínas semelhantes.

• Iniciar com métodos de baixo custo.

Purificação Proteica: Fonte Proteica

Purificação Proteica: Isolamento

Extrato Bruto

Purificação Proteica: Fracionamento

• Fracionamento Separação das proteínas do extrato em diferentes frações com base no tamanho, carga.

Função do pH, temperatura, concentração de sais e outros fatores.

Diferenças na solubilidade proteica

Purificação Proteica: Fracionamento

• Salting out

• Precipitação proteica com elevada concentração salina.

• ((NH4)2SO4)

Purificação Proteica: Preparação

• Solução proteica passa por modificações para uma purificação eficiente.

• Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se aproveitando do maior tamanho das proteínas.

• Ex: Remoção de sulfato de

amônio da amostra.

Métodos Cromatográficos

• Poderoso método de fracionamento.

• Diferença de tamanho, carga, afinidade de ligação e outros.

• Velocidade da migração depende da propriedade da proteína.

Cromatografia em Coluna

Lehninger, 5ª ed. 2010

Métodos Cromatográficos

Tipos de Cromatografia em Coluna:

o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);

o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;

o Afinidade;

o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).

Cromatografia de troca iônica

• Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga elétrica líquida de proteínas em um dado pH.

• Resina: o Trocadora de cátions (grupos aniônicos);

o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).

Cromatografia de troca iônica

• Afinidade afetada:

o pH (determina o estado de ionização da molécula);

o concentração dos íons dos sais livres que competem na solução circundante.

Cromatografia de troca catiônica

• Matriz carregada negativamente.

• Proteínas com carga líquida positiva migram mais lentamente.

• Expansão da solução proteica na fase móvel: o separação de proteínas com diferentes

propriedades

o espalhamento difusional.


Cromatografia de troca catiônica

• Tamanho da coluna aumenta, a resolução de dois tipos de proteínas com cargas líquidas também aumenta.

• A velocidade da solução proteica diminui com o tamanho da coluna.

• Quanto mais devagar a solução proteica gasta na coluna, a resolução diminui (espalhamento difusional).

Cromatografia de exclusão por tamanho

• Ou gel-filtração.

• Separação por tamanho.

• Fase sólida: grânulos de polímero com ligações cruzadas, com poros de tamanho específico.

• Proteínas grandes saem da coluna antes que as pequenas.

Cromatografia de exclusão por tamanho

• Proteínas grandes não entram nas cavidades e são eluídas mais rapidamente.

• Enquanto proteínas menores percorrem um caminho maior dentro dos poros.


Cromatografia líquida de alta eficiência

(HPLC) • CLAE

• Bombas de alta pressão aceleram o movimento de moléculas de proteína através da coluna.

• Reduzindo o tempo de trânsito na coluna, a difusão de bandas é diminuída e a resolução aumentada.

Cromatografia de afinidade

• Baseado na afinidade de ligação.

• Resina: ligante (grupo químico covalentemente ligado).

• Proteínas com afinidade se ligam ao ligante.


• Formado um complexo entre proteína e ligante.

• As proteínas que não se ligam são lavadas da coluna.

• Proteína de interesse é eluída com uma elevada concentração de sal e do ligante livre.

• O sal interfere nas ligações iônicas que ligam a proteína ao ligante.

• O ligante livre se liga a coluna de afinidade.


Fonte:V. Gaberc-Porekar, V. Menartr, 2001.

Resina: Níquel

Ligante: Histidinas

Fig. 1. Schematic illustration of the protein binding to a metal-chelated affinity support. Strong binding of a protein onto the IMAC matrix is achieved predominately by multi-point attachment of native or engineered surface histidines; (a)., or by histidine tag; (b.) added to the N- or C-terminus of the protein. There are many possibilities for the construction of efficient His tags considering the number of histidines, their location and microenvironment. However, in practice some simple solutions consisting of consecutive histidine residues, e.g., His6 or His10, prevail.

Grupo quelante: Imidazol

Cromatografia de afinidade: Exemplo

Fonte: Vieira, 2014.

Expressão Heteróloga de Proteínas

Representação Esquemática de um Vetor de

Expressão Procariótico

Fonte: Hanning e Makrides, 1998.

Representação Esquemática de um Vetor de

Expressão Procariótico – pET SUMO

Promotor forte IPTG induzido

Operador lac

Repressor lac

Proteína fusionada

Gene de seleção em E. coli

Origem de replicação

Interage com a pBR322 ori

Sítio de clonagem 6x His tag

Tags de Fusão de Proteína Comuns

Produção recombinante de insulina

humana

Análise de Proteínas

• Eletroforese;

• Focalização Isoelétrica;

• Eletroforese Bidimensional (2D).

Eletroforese de Proteínas

• Eletroforese: separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico.

• Não é utilizado para purificar grandes quantidades de proteínas porque afetam sua estrutura e a função.


Vantagens

• Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas.

• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza.

• Permite determinação do ponto

isoelétrico e massa molecular

aproximada.


• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.

• Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína.


SDS-PAGE

• SDS (sodium dodecyl sulfate)

• 1 molécula de SDS para cada 2

resíduos de aminoácidos.

• Contribui com grande carga negativa.

• SDS desdobra parcialmente as proteínas, assumindo forma semelhantes.


• Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular.

• Polipeptídeos menores migram mais rápido.

• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.

• Aproximação da massa

molecular para proteínas

desconhecidas.

Focalização Isoelétrica

• Processo utilizado para a determinação do ponto isoelétrico (pI) de uma proteína.

• Quando uma mistura de proteínas é aplicada em um gel com gradiente de pH, essas migram até que seu pH coincida com seu pI.

Eletroforese Bidimensional

• Combinação sequencial da focalização isoelétrica e SDS-PAGE.

• Separação de mistura complexa proteica.

• Mais sensível que os métodos

isolados.

• Massa molecular e pI.

Exemplo de Purificação Proteica

M L S1 P1

M FT1 W1 E1

M [E1] S2 P2 S3 P3

M P.D. FT2 W2 E2

M F PP

XAC1201

Fonte: Vieira, 2014

Quantificação de Proteínas

• Todos os processos de purificação requerem um método para a quantificação ou a avaliação da proteína de interesse na presença de outras proteínas.

• A purificação pode ser monitorada pela avaliação da atividade específica.

• A quantificação de proteínas é um método empregado em análises clínicas, nutrição animal, ciência de alimentos, bioquímica de proteínas, entre outros.

Enzimas

Quantidade determinada: aumento na velocidade pela qual o substrato é convertido a produtos da reação quando a enzima está presente.

Quantificação de Enzimas

a) A equação global da reação catalisada;

b) Um processo analítico para a determinação do desaparecimento do substrato ou o aparecimento de um produto de reação;

c) Se a enzima requer cofatores como íons metálicos ou coenzimas;

d) A dependência da atividade enzimática na concentração de substrato;

e) O pH ótimo;

f) A faixa de temperatura na qual a enzima é estável e possui atividade mais alta.


• 1,0 unidade de atividade enzimática a quantidade de enzima que promove a transformação de 1,0 µmol de substrato por minuto a 25ºC sob condições ótimas de medida.

• Atividade total de unidades da enzima em uma solução.

• Atividade específica número de unidades de enzima por miligrama de proteína total.


• A atividade e o total de proteínas decrescem a cada passo e a atividade específica aumenta.

• A atividade específica é uma medida de pureza da enzima: aumenta durante a purificação de uma enzima e torna-se máxima e constante quando a enzima está pura.

• Proteína pura quando etapas adicionais de purificação não aumentam a atividade específica e somente uma única espécie proteica pode ser detectada.

Quantificação de Proteínas

Outras proteínas

• Outros métodos de quantificação;

• Testadas quanto ao efeito biológico que produzem;

• Exemplos:

o Proteínas de transporte;

o Hormônios e toxinas;

o Proteínas estruturais.

Métodos de Quantificação Proteica

• Os métodos espectrofotométricos utilizam comprimentos de onda na região do ultravioleta ou do visível (métodos colorimétricos ou colorimetria).


• A colorimetria é uma técnica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda específicos.

• A medida da luz absorvida permite interferir sobre a concentração de soluto em uma determinada solução ou material biológico.


Principais ensaios de quantificação de proteínas

Fonte: http://www.labome.com.br/method/Protein-Quantitation.html


Quantificações de proteínas-alvo específicas

• Várias técnicas são empregadas para quantificar uma proteína específica. As mais utilizadas são:

o ELISA;

o Western Blot;

o Espectrometria de massa.

http://www.labome.com.br/method/Antibody-Applications.html

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