determinacion de proteinas

Download Determinacion de Proteinas

Post on 28-Dec-2015

31 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • PROTENAS. MTODOS

    DE

    DETERMINACIN.

    MTODOS DE

    EVALUACIN DE CALIDAD CURSO: ANLISIS DE PAI

  • INDICE

    Consideraciones generales

    Cuantificacin de protenas

    Determinacin de la calidad de las protenas.

  • CONSIDERACIONES GENERALES

    Componentes abundantes en las clulas.

    Importantes para funciones biolgicas y

    estructura de las clulas.

    Las protenas estn formadas por 20 -aminocidos en configuracin L.

    Los aminocidos estn compuestos por C, H, N, O, S.

    Los aminocidos se caracterizan por poseer:

    grupo carboxilo (-COOH)

    grupo amino (-NH2).

  • CONSIDERACIONES GENERALES

    Elemento mas abundante: N (13.4 - 19.1%).

    Clasificacin:

    Composicin

    Estructura

    Funcin biolgica

    Solubilidad

    Presentan conformaciones nicas, pueden

    cambiar por:

    Calor

    cidos

    Bases

    Disolventes orgnicos

    Detergentes

  • FUENTES DE NITRGENO NO PROTEICO

    Aminocidos libres

    Pequeos pptidos

    cidos nucleicos

    Fosfolpidos

    Azcares aminas

    Porfirina

    Algunas vitaminas

    Alcaloides

    cido rico

    Urea

    Iones de amonio

  • MACRO COMPONENTES DE LOS ALIMENTOS

    QUE PUEDEN INTERFERIR CON EL ANLISIS

    DE PROTENAS

    Lpidos

    Carbohidratos

  • MTODOS DESARROLLADOS PARA MEDIR

    EL CONTENIDO PROTEICO

    Fundamentos:

    Determinaciones de nitrgeno

    Enlaces peptdicos

    cidos aromticos

    Absortividad UV de las protenas

    Grupos amino libres

    Propiedades de dispersin de la luz

    Capacidad de adhesin de colorantes

  • IMPORTANCIA DEL ANLISIS

    DE PROTENAS

    Determinacin de actividad biolgica. Ejemplo:

    pectinasas durante la maduracin de frutos.

    Investigacin sobre propiedades funcionales.

    Ejemplo: gliadina y gluteninas para la

    elaboracin del pan.

    Etiquetado nutricional

  • NECESIDAD DEL ANLISIS DE PROTENAS

    Contenido proteico total

    Composicin de aminocidos

    Contenido de alguna protena particular en una

    mezcla

    Contenido proteico durante el aislamiento y

    purificacin de una protena

    Nitrgeno no proteico

    Valor nutritivo (digestibilidad, balance proteico.

  • CONTENIDO PROTEICO

    EN LOS ALIMENTOS

  • MTODOS DE DETERMINACIN DE

    PROTENAS

    Mtodo de Kjeldahl

    Mtodo de Biuret

    Mtodo de Lowry

    Mtodo del cido bicinconnico (bca)

    Mtodo de absorcin UV a 280nm

    Mtodo de adhesin de colorante

    Mtodo de Bradford

    Mtodo de la ninhidrina

    Mtodo turbidimtrico

  • MTODO KJELDAHL

    Fundamento:

    Protenas y otros componentes son digeridos con cido

    sulfrico en presencia de catalizadores.

    Contenido total de nitrgeno orgnico es transformado a

    sulfato de amonio.

    El digerido se neutraliza con lcali y se destila sobre una

    solucin de cido brico.

    Aniones borato formados se titulan con cido valorado, el

    cul a su vez se convierte en nitrgeno.

    Resultado: nitrgeno bruto.

  • MTODO KJELDAHL

    Preparacin de la muestra:

    Triturar la muestra seca y homogenea.

    Tamizar por una mala de 20 mesh.

    Determinacin de protenas en leche.

    http://www.youtube.com/watch?v=3n2RAKK1xmQ

  • DIGESTIN

    PROTENA

    cido Sulfrico

    Calor, catalizador

    (NH4)2 SO4

  • MODIFICACIONES EN LA DIGESTIN

    Se han aadido catalizadores como: Hg, Cu, Se, Ti al H2SO4

    para lograr una digestin completa.

    Hg es mas satisfactorio.

    El dixido de selenio y el sulfato de cobre en proporcin 3:1

    son muy efectivos en la digestin.

    El sulfato de potasio se utiliza para aumentar el punto de

    ebullicin del cido sulfrico para acelerar la digestin.

    El sulfuro o tiosulfato de sodio se aaden a la digesta

    diluida para ayudar a liberar el nitrgeno del Hg el cual

    tiende a adherir amonio.

  • REACCIONES DE LA NEUTRALIZACIN Y LA

    DESTILACIN

    (NH)2SO4+ 2NaOH 2NH3+Na2SO4+2H2O

    NH3+ H3BO3 NH4 + H2BO3-

    (cido brico) (in borato)

  • REACCIONES DE LA TITULACIN

    El anin borato (proporcional a la cantidad de

    nitrgeno) se titula con HCl estandarizado:

    H2BO3- + H+ H3BO3

  • MODIFICACIONES EN LA TITULACIN

    Se utilizan la colorimetra y la cromatografa inica para determinar el contenido de nitrgeno posterior a la digestin.

  • FUNCIN DEL BLANCO EN LA

    DETERMINACIN DE PROTENAS

    Se debe utilizar un blanco con reactivos para

    sustraer el nitrgeno reactivo del nitrgeno de la

    muestra.

  • CLCULOS

    N HCl = Normalidad del HCl en moles /1000 mL

    Vol. cido corregido = mL de cido estndar para

    la muestra) (mL de cido estndar para el blanco)

    14 = peso atmico del nitrgeno

    %N = N HCl X VOLUMEN DE CID CORR. X 14g/Mol N2 X 100

    g. DE MUESTRA

  • FACTOR

    Se utiliza un factor de conversin de % de N a % de protena cruda.

    La mayora de las protenas contienen 16% de N El factor de conversin es:

    16.0

    %Pr%

    25.6%Pr%

    25.61610025.6

    Noteina

    Nxoteina

  • FACTOR DE CONVERSIN PARA ALGUNOS

    ALIMENTOS

    Alimento %N2 protena Factor

    Huevo o 16.0 6.25

    Carne, maz

    Leche 15.7 6.38

    Trigo 18.0 5.7

    Soya 17.51 5.71

    Avena 17.15 5.83

  • VENTAJAS DEL MTODO DE KJELDAHL

    Aplicable a todo tipo de alimentos

    Relativamente simple

    Barato

    Preciso

    Es el mtodo oficial para medir el contenido de

    protena cruda

  • DESVENTAJAS DEL MTODO DE KJELDAHL

    Mide el nitrgeno orgnico total, no slo el nitrgeno

    protico

    Consume mucho tiempo (al menos 2 horas para

    completarse)

    Precisin ms pobre que el mtodo de biuret

    Usa reactivos corrosivos

  • OTROS MTODOS

    http://www.youtube.com/watch?v=xubq3xOssWU

  • DETERMINACIN DE PROTENAS POR EL

    MTODO DE BIURET

    Fundamento Al formar complejos los iones cpricos con los

    enlaces peptdicos de las protenas se produce un color violeta-morado bajo condiciones alcalinas.

    La absorbancia del color producido es ledo a 540nm.

    La intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido protico de la muestra

  • PROCEDIMIENTO PARA EL MTODO DE

    BIURET

    5 mL de reactivo de biuret se mezcla con 1mL de

    solucin protica (1-10 mg de protena/mL).

    El reactivo incluye sulfato de cobre, NaOH, y

    tartrato de sodio y potasio el cual se utiliza para

    estabilizar el in cobre en la solucin alcalina

  • PROCEDIMIENTO PARA EL MTODO DE

    BIURET

    Despus de reposo a temperatura ambiente

    durante 15 a 30 minutos, se lee la absorbancia a

    540 nm contra un blanco con slo reactivo.

    Si la reaccin no es clara debe centrifugarse la

    muestra previo a la lectura de la absorbancia

  • PROCEDIMIENTO PARA EL MTODO DE

    BIURET

    Se debe elaborar una curva estndar de

    concentracin vs absorbancia utilizando

    albmina de suero de bovino (BSA) para

    comparacin con la muestra bajo estudio.

  • VENTAJAS DEL MTODO DE BIURET

    Menos caro que el mtodo de kjeldahl

    Rpido (se puede completar en menos de 30 minutos)

    Es el mtodo ms simple de anlisis de protenas

    No es frecuente encontrar derivaciones de color

    Pocas substancias no proteicas interfieren con la reaccin de biuret

    No detecta N de fuentes no proticas o no peptdicas

  • DESVENTAJAS DEL MTODO DE BIURET

    No es muy sensible comparado con el mtodo de Lowry

    Requiere de al menos 2 a 4 mg de protena por prueba

    Las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reaccin

    Puede ocurrir opalescencia en la solucin final si estn presentes altas concentraciones de lpidos o carbohidratos

    Debe estandarizarse el color mediante cantidades de protena conocidas

  • MTODO DE LOWRY

    Fundamento

    Combina la reaccin de biuret con la reduccin del reactivo de fenol folin-ciocalteau (cido fosfomolbdico-fosfotngstico) por los residuos de tirosina y triptofano de las protenas.

    El color azuloso desarrollado es ledo a 750nm (alta sensibilidad para una concentracin protica baja) o a 500nm (alta sensibilidad para una concentracin protica alta)

  • VENTAJAS DEL MTODO DE LOWRY

    Muy sensible

    Menos afectado por la turbidez de la muestra

    Ms especfico que la mayora de los otros mtodos

    Relativamente simple

    Se puede completar en 1 a 1.5 horas

  • DESVENTAJAS DEL MTODO DE LOWRY

    El color vara con diferentes protenas (ms que el mtodo de biuret)

    El color no es estrictamente proporcional a la concentracin de protenas

    La sacarosa, lpidos, buffers fosfato, monosacridos y hexoaminas interfieren con la reaccin

    Las altas concentraciones de azcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfhidrilo interfieren con la reaccin

  • MTODO DEL CIDO BICINCONNICO

    (BCA)

    Fundamen