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Desarrollos metodológicos para el análisis de
polimorfismos de los genes del sistema HLA y
otros genes, no HLA, predisponentes a
enfermedades autoinmunes
Doctorat en Immunologia
Universitat Autònoma de Barcelona
Facultat de Ciències
Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia
Estíbaliz Ruiz Ortiz de Arrizabaleta; Mayo - 2013
1 Índice
ÍNDICE
ÍNDICE ...................................................................................................................................................... 0
ABREVIATURAS ........................................................................................................................................ 4
RESUMEN ................................................................................................................................................ 6
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................... 7
ENFERMEDADES AUTOINMUNES .......................................................................................................... 7 ¿Qué son las enfermedades autoinmunes? ...................................................................................... 7
Introducción a la Enfermedad Celiaca ........................................................................................................... 7 Introducción a la Enfermedad de Graves ...................................................................................................... 8
BIOMARCADORES .............................................................................................................................. 10 ¿Qué es un biomarcador? .............................................................................................................. 10
Definición .................................................................................................................................................. 10 Tipos de biomarcadores ............................................................................................................................. 10
Biomarcadores serológicos ............................................................................................................ 11 Enfermedad Celiaca ................................................................................................................................... 12 Enfermedad de Graves ............................................................................................................................... 13
Biomarcadores genéticos .............................................................................................................. 13 Sistema HLA .............................................................................................................................................. 14
Regiones HLA y características genéticas ...................................................................................... 14 Moléculas HLA, diversidad y función ............................................................................................. 17 Nomenclatura .............................................................................................................................. 19 Técnicas de tipificación del sistema HLA ....................................................................................... 20 Sistema HLA como biomarcador de enfermedades autoinmunes .................................................. 24
- Posible combinación de alelos HLA y alelos de otros genes como biomarcadores ...................... 27 - Alelos HLA en la Enfermedad Celiaca........................................................................................ 27 - Alelos HLA en la Enfermedad de Graves ................................................................................... 28
Sistema HLA como biomarcador de reacciones de hipersensibilidad .............................................. 28 Otros factores genéticos en la Enfermedad de Graves ................................................................................ 29
CTLA4 .......................................................................................................................................... 29 PTPN22 ........................................................................................................................................ 29
HIPÓTESIS .............................................................................................................................................. 31
OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 32
CARACTERIZACIÓN DE BIOMARCADORES HLA EN ENFERMEDADES AUTOINMUNES ............................. 32 Objetivo 1_Biomarcadores HLA en la Enfermedad Celiaca............................................................. 32 Objetivo 2_Biomarcadores en la Enfermedad de Graves ............................................................... 32 Objetivo 3_Desarrollo de la tipificación del locus A del sistema HLA por PCR a tiempo real ........... 32
MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................................................... 33
MUESTRAS GENERALES ...................................................................................................................... 33 MÉTODOS GENERALES........................................................................................................................ 33
Extracción de DNA ......................................................................................................................... 33 Reacciones de PCR a tiempo real ................................................................................................... 33
Diseño de primers ...................................................................................................................................... 34 Diseño de sondas ....................................................................................................................................... 34 Parámetros a tener en cuenta en cada reacción ......................................................................................... 35
BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA .......................................................................... 36 Muestras ....................................................................................................................................... 36 Métodos ........................................................................................................................................ 36
Primers y sondas utilizados ........................................................................................................................ 36 Condiciones óptimas de reacción ............................................................................................................... 37 Determinación de Ac asociados a la Enfermedad Celiaca ............................................................................ 41 Realización de biopsia intestinal ................................................................................................................. 41
BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES............................................................................. 43 Muestras ....................................................................................................................................... 43
2 Índice
Métodos ........................................................................................................................................ 43 Primers y sondas utilizados ........................................................................................................................ 43 Condiciones óptimas de reacción ............................................................................................................... 44
DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO REAL ................. 48 Muestras ....................................................................................................................................... 48 Métodos ........................................................................................................................................ 48
Primers y sondas utilizados ........................................................................................................................ 48 Condiciones óptimas de reacción ............................................................................................................... 49 Análisis de las confusiones ......................................................................................................................... 51
RESULTADOS .......................................................................................................................................... 52
RESULTADO 1_BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA .................................................. 52 Determinación del genotipo HLA asociado a Celiaquía mediante PCR a tiempo real ..................... 52
Tipificación HLA-DQ2/DQ8 ......................................................................................................................... 52 Dosis génica HLA-DQB1*02 ........................................................................................................................ 52
Informatividad de los marcadores HLA en el estudio de sospecha de la Enfermedad Celiaca......... 53 HLA-DQ2/DQ8 ........................................................................................................................................... 53 HLA-DQB1*02 ............................................................................................................................................ 54
Correlación de los biomarcadores HLA con otros biomarcadores de la Enfermedad Celiaca .......... 56 Dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 y anticuerpos anti-Tg2........................................................................ 56 Dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 y datos de biopsia .............................................................................. 56 Anticuerpos anti-Tg2 y datos de biopsia ..................................................................................................... 57
RESULTADO 2_BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES...................................................... 59 Determinación de biomarcadores genéticos asociados a Enfermedad de Graves mediante PCR a tiempo real .................................................................................................................................... 59
Alelos HLA de clase I .................................................................................................................................. 59 Polimorfismos de PTPN22 y CTLA4 ............................................................................................................. 59
Informatividad de los biomarcadores genéticos asociados a Enfermedad de Graves..................... 59 Alelos HLA de clase I .................................................................................................................................. 60 Polimorfismos de PTPN22 y CTLA4 ............................................................................................................. 62 Alelos HLA de clase I y polimorfismos en genes no HLA ............................................................................... 63
RESULTADO 3_DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR RT-PCR ............. 66 Reacciones e información proporcionada por éstas ....................................................................... 66 Resolución obtenida ...................................................................................................................... 68
DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 69
BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA .......................................................................... 69 Tipificación HLA asociado a Celiaquía mediante PCR a tiempo real ............................................... 70 Informatividad de los marcadores HLA en el estudio de sospecha de la Enfermedad Celiaca......... 70 Otros biomarcadores genéticos en la Enfermedad Celiaca ............................................................ 71
BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES............................................................................. 71 Alelos HLA asociados con la Enfermedad de Graves ...................................................................... 72 Polimorfismos en PTPN22 y CTLA4 asociados con la Enfermedad de Graves .................................. 72
DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO REAL ................. 73 Reacciones desarrolladas por PCR a tiempo real para el tipaje del HLA-A ..................................... 74
CONCLUSIONES ...................................................................................................................................... 76
ESTUDIOS HLA Y ENFERMEDAD ........................................................................................................... 76 TIPAJE DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO REAL .............................................................................. 76
ANEXOS ................................................................................................................................................. 77
ANEXO 1_BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA ............................................................ 77 Reacciones para la determinación de HLA-DQ2/DQ8..................................................................... 77 Reacciones para la determinación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 ............................... 77 Resultados obtenidos .................................................................................................................... 79
ANEXO 2_BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES ............................................................... 84 Alelos HLA de clase I ...................................................................................................................... 84
Interpretación de los resultados obtenidos ................................................................................................. 87
3 Índice
Polimorfismos de PTPN22 y CTLA4 ................................................................................................. 88 Resultados obtenidos .................................................................................................................... 89
ANEXO 3_DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO ............ 94 Reacciones utilizadas en la tipificación del locus A del sistema HLA por RT-PCR ............................ 94
Interpretación de los resultados obtenidos ................................................................................................. 95 Resolución obtenida por esta metodología...................................................................................104
BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................................106
4 Abreviaturas
ABREVIATURAS
Ac Anticuerpo
ADR Reacciones adversas a fármacos
AID Enfermedades autoinmunes
AITD Enfermedades autoinmunes tiroideas
Ag Antígeno
APC Células presentadoras de antígenos
CD Enfermedad Celiaca
DGP Formas deaminadas de la gliadina
DHS Síndrome de hipersensibilidad frente a fármacos
DRESS Reacciones frente al fármaco con eosinofilia y síntomas sistémicos
dsDNA DNA de doble cadena
EFI European Federation of Immunogenetics
ELISA Enzimoinmunoensayo
EMA Endomisio
ESPGHAN European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition
FDA US Food and Drug Administration
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
GD Enfermedad de Graves
GFD Dieta libre de gluten
GWAS Estudios de asociación genómica
HIV Virus de la inmunodeficiencia humana
HLA Human leukocyte antigen
Antígeno de histocompatibilidad leucocitario
HRM High resolution melting
HT Tiroiditis de Hashimoto
IFI Inmunofluorescencia indirecta
Ig Inmunoglobulina
kDa kilodalton
LB Linfocitos B
LT Linfocitos T
LTreg Células T reguladoras
MHC Major Histocompatibility Complex
Complejo principal de histocompatibilidad
MIC MHC class I chain related
mM milimolar
NGS Secuenciación de nueva generación
OMIM Online Mendelian Inheritance in Man
OR Odds ratio
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PCR-SBT PCR-tipaje basado en la secuenciación
PCR-SSO PCR-sondas específicas de secuencia
PCR-SSP PCR-cebadores específicos de secuencia
5 Abreviaturas
RA Artritis reumatoide
RE Retículo endoplasmático
REG 1A Reg I alpha
RR Riesgo relativo
RT-PCR PCR a tiempo real
SLE Lupus eritematoso sistémico
SNP Single nucleotide polimorphism
ssDNA DNA de cadena sencilla
Tg Tiroglobulina
Tg2 Transglutaminasa tipo 2
TH Tiroiditis de Hashimoto
Tm Temperatura de Melting
TNF Tumor necrosis factor
TPH Trasplante de progenitores hematopoyéticos
TPO Peroxidasa tiroidal
TSHR Receptor de la hormona estimulante del tiroides
T1D Diabetes tipo 1
T3 Triyodotironina libre
T4 Tiroxina
VPN Valor Predictivo Negativo
VPP Valor Predictivo Positivo
μM Micromolar
6 Resumen
RESUMEN
Las enfermedades autoinmunes son enfermedades multifactoriales donde la genética, el
sistema inmune y factores ambientales se encuentran relacionados. En muchas de ellas el
Sistema Principal de Histocompatibilidad o HLA juega un papel importante. El HLA es un sistema
molecular constituido por un conjunto de proteínas de membrana que son extraordinariamente
polimórficas y que, debido a que se encuentran en una misma localización cromosómica con
alto desequilibrio de ligamiento, se heredan en haplotipos. Su función principal es la
presentación de péptidos a los linfocitos T, definiendo por ello el rechazo en el trasplante
alogénico.
Como consecuencia de estas características la determinación del polimorfismo HLA (tipificación
HLA) es útil en diferentes campos biomédicos.
Hay diferentes técnicas que permiten la definición de estos antígenos HLA a diferentes niveles
de resolución. Por un lado se encuentran las técnicas de baja-media resolución como son las
técnicas serológicas (microlinfocitotoxicidad) u otras basadas en la amplificación de DNA (PCR-
SSP, PCR-SSO) y por otro las de alta resolución cuyo gold standard es la secuenciación (PCR-SBT).
Esta aproximación junto con las nuevas metodologías de secuenciación (deep sequencing) ha
hecho posible resolver los problemas de ambigüedades en la alta resolución. No obstante, en
algunas ocasiones no es necesaria una tipificación HLA de alta resolución y por ello no está
justificado el uso de una metodología tan costosa, sin embargo las técnicas de baja-media
resolución, ampliamente utilizadas en los laboratorios de HLA, también presentan ciertas
limitaciones.
Este trabajo pretende abordar la complejidad del sistema HLA desde dos puntos de vista;
primero explorando la asociación HLA (y otros genes no HLA) y enfermedad, concretamente en
el caso de la celiaquía y de la enfermedad de Graves-Basedow y segundo definiendo una
metodología de tipificación de baja resolución del locus A del sistema HLA mediante PCR a
tiempo real. Para ello, se han puesto a punto técnicas de tipificación de familias de alelos HLA
concretos como son HLA-DQ2/DQ8 para el estudio de la celiaquía y HLA-B*08/44 y HLA-
C*03/07/16 en el caso de la enfermedad de Graves-Basedow, y en este último además se han
estudiado polimorfismos en otros genes no HLA como son CTLA4 (una molécula de
coestimulación inhibidora) y PTPN22 (una fosfatasa con funciones también inhibidoras). Con
esto se ha pretendido desarrollar un conjunto de pruebas que nos permitan predecir mejor la
susceptibilidad a padecer estas enfermedades y ver la correlación con otros parámetros clínicos
post-diagnóstico.
7 Introducción
INTRODUCCIÓN
ENFERMEDADES AUTOINMUNES
¿Qué son las enfermedades autoinmunes?
Las enfermedades autoinmunes (AID) (OMIM 109100) constituyen un amplio grupo de
enfermedades crónicas cuya patogénesis está mediada por la pérdida de tolerancia
inmunológica frente a antígenos (Ag) propios. Tolerancia es el proceso por el cual se eliminan o
neutralizan células auto-reactivas y un fallo, a nivel central o periférico, en el funcionamiento de
este sistema desencadena una respuesta inmune anormal frente a Ag propios, lo que se conoce
como autoinmunidad [1, 2]. Estas enfermedades, que afectan aproximadamente a un 5% de la
población mundial, representan un grupo heterogéneo de desórdenes que pueden afectar a
órganos o tejidos específicos como en el caso de la diabetes tipo 1 (T1D) (OMIM 222100) o las
enfermedades autoinmunes tiroideas (AITD) o a múltiples sistemas, como el lupus eritematoso
sistémico (SLE) (OMIM 152700) o la artritis reumatoide (RA) (OMIM 180300) [3, 4].
Introducción a la Enfermedad Celiaca
La Enfermedad Celiaca (CD) (OMIM 212750) es un desorden inflamatorio sistémico con un
componente autoinmune que es desencadenado por la ingesta de gluten y prolaminas
relacionadas, en individuos genéticamente susceptibles [5]. Aunque los síntomas y signos de la
enfermedad se conocen desde hace más de 100 años, fue en 1940 cuando un pediatra holandés,
Dicke, estableció la asociación entre la exposición al gluten y la CD [6].
Esta enfermedad se caracteriza por la presencia de una combinación variable de
manifestaciones clínicas, dependientes de la ingesta de gluten, que incluyen manifestaciones
gastro-intestinales, como son diarrea, distensión o dolor abdominal y retraso en el crecimiento,
pero además alrededor de un 50% de pacientes presentan también manifestaciones extra-
intestinales, como dermatitis herpetiforme, anemia, síntomas neurológicos u osteoporosis [7,
8]. La enfermedad puede comenzar a cualquier edad, sin embargo la presentación clínica puede
variar entre niños y adultos, siendo el dolor abdominal muy frecuente en niños, mientras que la
anemia, osteoporosis e hipertransaminasemia es un modo de presentación más frecuente en
adultos [9].
La prevalencia de la CD en Europa y EEUU es de un 1-3% [10]. Sin embargo esta prevalencia se
encuentra incrementada en familiares de primer grado de pacientes con CD (10-15%), en
pacientes con otras AID, como T1D (3-12%), AITD (5%) y enfermedad hepática autoinmune, en
pacientes con desórdenes causados por aberraciones cromosómicas, como el síndrome de
Turner (3%) o el síndrome de Down (5%), y en pacientes con déficit selectivo de
Inmunoglobulina A (IgA) (9%) [11, 12].
La ingesta de gluten produce una respuesta inflamatoria crónica, mediada por los linfocitos T
(LT) CD4+ de la lámina propia intestinal, que puede llegar a producir atrofia intestinal, siendo
ésta la lesión extrema de un espectro de lesiones. Según la clasificación de Marsh (1992) la
8 Introducción
lesión preinfiltrativa (Marsh 0) corresponde a individuos genéticamente susceptibles con biopsia
intestinal normal y a partir de aquí podemos encontrar desde un infiltrado linfocitario de la
mucosa, sin cambios estructurales (Marsh 1) o con hiperplasia de las criptas (Marsh 2) hasta una
atrofia parcial, subtotal o total de las vellosidades intestinales (Marsh 3A, 3B o 3C
respectivamente) [13]. Estos cambios se evalúan mediante una biopsia intestinal, no obstante,
existen biomarcadores serológicos para el diagnóstico de esta enfermedad, que se explicarán
más adelante.
La asociación de los genes HLA (Human Leukocyte Antigen), responsables de la presentación
antigénica como se comentará posteriormente, con las AID es bien conocida. En concreto, los
genes HLA de clase II son responsables de aproximadamente un 40% del riesgo genético para la
CD, el otro 60% de la susceptibilidad genética a esta enfermedad viene dado por un número
desconocido de genes no HLA (se han identificado en torno a 40), muchos de los cuales codifican
proteínas con funciones en el sistema inmune y son comunes a varias AID (CTLA4, IL-2, IL-21,
CCR3, IL-12A, IL-18RAP, RGS1, etc [14]. Tabla 1). A pesar de ello, su contribución al riesgo de
desarrollar la CD es menor que la de los genes HLA [15, 16].
Introducción a la Enfermedad de Graves
Dentro de las AID, las más comunes son aquellas en las que la respuesta inmune, humoral y
celular, va dirigida contra la glándula tiroides y dentro de las cuales se incluyen la Tiroiditis de
Hashimoto (HT) (OMIM 140300) y la enfermedad de Graves-Basedow (GD) (OMIM 275000) [17].
Ambas se caracterizan por la presencia de un infiltrado linfocitario en el órgano diana que en el
caso de la HT desencadena en apoptosis de las células tiroideas e hipotiroidismo y en el caso de
la GD provoca la formación de anticuerpos (Ac) anti-Receptor de la hormona estimulante del
tiroides (TSHR) que estimulan este receptor, induciendo la secreción de un exceso de hormona y
causando hipertiroidismo [18]. La presencia de auto Ac contra Ag tiroideos, como la
tiroglobulina (Tg), la peroxidasa tiroidal (TPO) y TSHR se utiliza como biomarcador en estas
enfermedades, ya que reflejan actividad y progresión de la enfermedad [19].
La GD se describió por primera vez en 1825 por Caleb Parry, aunque debe su nombre a Robert
Graves debido a la publicación de 4 casos en 1835. Basedow fue el primero en poner de
manifiesto la asociación de esta enfermedad con la exoftalmia en 1840. Es la causa más
frecuente de hipertiroidismo, representa entre un 60-80% de los casos y la prevalencia de esta
enfermedad se encuentra en torno al 1% en mujeres con una edad comprendida entre 35-60
años mientras que la frecuencia en hombres es entre 5-10 veces menor [20].
El cuadro clínico se caracteriza por hipertiroidismo, bocio difuso y oftalmopatía. A esta tríada
diagnóstica cabría añadir un cuarto elemento, de aparición poco frecuente, que es la
dermopatía infiltrativa. No obstante, la enfermedad se presenta a menudo con una forma clínica
incompleta.
Como hemos comentado anteriormente, el principal mecanismo efector de la GD es la
producción de Ac circulantes dirigidos contra el TSHR produciendo la activación de éste, ya que
son capaces de simular el efecto del ligando natural, la TSH. No obstante, los niveles de estos Ac
9 Introducción
no correlacionan con el nivel de hormonas tiroideas o con la severidad de la enfermedad,
debido a otros factores que pueden ocurrir de manera simultánea como son por ejemplo la
respuesta frente a otros auto Ag o la producción de Ac bloqueantes que actúan reduciendo los
efectos de los Ac estimulantes.
La GD es una enfermedad compleja cuya etiología incluye la interacción de componentes
genéticos y factores ambientales [21]. Han sido identificados diferentes genes de susceptibilidad
a la GD (Tabla 1), dentro de los cuales se encuentran genes específicos de tejido (Tg y TSHR) o
genes inmuno-reguladores (HLA-DR, CTLA4, PTPN22 y CD40) [21-23].
Locus Gen Probable función inmune OR - CD OR - AITD
6p21 HLA Presentación antigénica 6-20 2.0-4.0
2q23 CTLA4 Receptor para CD80 y CD86
Regulador negativo de la activación de linfocitos T X 1.5-2.2
4q27 IL2, IL21 IL2: factor de crecimiento para linfocitos T
IL21: promueve la función de células T, B y NK 1.41 -
1q31 RGS1 Expresada por linfocitos intraepiteliales 1.41 -
2q12 IL1R1, IL18R1, IL18RAP
IL1R1: activación de NF-κB dependiente de IL1
IL18R1 y IL18RAP codifican para el receptor de la IL18
IL18 promueve la producción de IFN-γ
1.27 -
3p21 CCR1, CCR2, CCR3,
CCR5 Receptores de quimiocinas 1.21 -
3q25 IL12A Favorece la diferenciación de linfocitos Th1 1.21 -
3q28 LPP LIM domain containing preferred translocation partner in
lipoma. Función no bien conocida 1.21 -
6q25 TAGAP Se expresa en linfocitos T, modula cambios a nivel del
citoesqueleto 1.21 -
12q23 SH2B3 Involucrado en la señalización en linfocitos 1.19 -
18p11 PTPN2 Tirosin fosfatasa de linfocitos T; regulador negativo de la
inflamación X -
6q23 TNFAIP3 Proteína dedos de zinc que inhibe la actividad de NF-κB;
procesos de apoptosis mediada por TNF 1.25 -
2p13 REL Componente del complejo NF-κB X -
20q11 CD40 Molécula coestimuladora, participa en la activación de los
linfocitos B - 1.3-1.8
10p15 IL2RA (CD25) Componente del receptor de la IL2 - 1.1-1.4
1q23 FCRL3 Fc Receptor-like protein 3 - 1.1-1.3
8q24 Tg Tiroglobulina - 1.3-1.6
14q31 TSHR Receptor de la hormona estimulante del tiroides - 1.4-2.6
1p13 PTPN22 Regulador de la activación de linfocitos T X 1.4-1.9
Tabla 1: loci de susceptibilidad para la CD y para las AITD (aquellos marcados con una X no hay datos de
OR a pesar de que se ha visto cierta asociación)
10 Introducción
BIOMARCADORES
El diagnóstico, monitorización y tratamiento de pacientes con AID continúa siendo hoy en día un
reto para los clínicos que siguen estos pacientes, por ello la búsqueda de mejores
biomarcadores capaces de caracterizar mejor este tipo de enfermedades sigue siendo necesaria
[24, 25].
¿Qué es un biomarcador?
Definición
Es una característica biológica que puede ser medida de forma objetiva y evaluada como un
indicador de un proceso biológico normal, de un proceso patológico o de respuesta
farmacológica a una intervención terapéutica [26]. En la práctica los biomarcadores incluyen las
herramientas y tecnologías que ayudan a entender la causa, progresión, predicción, respuesta al
tratamiento, etc, de una enfermedad.
Tipos de biomarcadores
Se pueden clasificar en dos principales tipos: biomarcadores de exposición, los cuales se usan
para predecir el riesgo de padecer una determinada enfermedad o biomarcadores de
enfermedad usados en el diagnóstico y monitorización de una enfermedad [27].
Biomarcadores de exposición: modifican (incrementan o disminuyen) el riesgo de
padecer una determinada enfermedad.
Dentro de estos se encuentra, por ejemplo, la susceptibilidad genética. Variantes
genéticas que son necesarias aunque no suficientes para padecer una enfermedad,
como ocurre con algunos polimorfismos de genes HLA de clase I y II y ciertas AID [3].
Biomarcadores de enfermedad: son indicadores de un factor biológico que representa
una manifestación subclínica o no de la enfermedad.
Se utilizan para identificar individuos que se encuentran en estadios pre-clínicos, para
reducir la variabilidad dentro de la enfermedad en estudios clínicos o epidemiológicos o
como reflejo de la historia natural de la enfermedad (fases de inducción, latencia, …)
[27].
Evaluar la validez de un biomarcador en el diagnóstico, evaluación y pronóstico del paciente es
un proceso complejo, se deben tener en cuenta diferentes aspectos, como son el grado en el
que el biomarcador refleja el fenómeno biológico estudiado o manifestaciones de la
enfermedad, así como la correlación del biomarcador con una enfermedad de forma específica
[28]. Esto último se puede evaluar mediante el uso de unos indicadores como son la sensibilidad
y especificidad y los valores predictivos, positivo (VPP) y negativo (VPN):
11 Introducción
Sensibilidad y especificidad describen las propiedades de un biomarcador para
discriminar entre sujetos enfermos y sanos.
o Sensibilidad: probabilidad de que un sujeto enfermo tenga el biomarcador en
cuestión positivo. Aquellos biomarcadores que se utilizan para el cribaje de una
enfermedad, es necesario que tengan una buena sensibilidad.
o Especificidad: probabilidad de que un sujeto sano tenga el biomarcador en
cuestión negativo. Aquellos biomarcadores que se utilizan para confirmar un
diagnóstico, es necesario que tengan una buena especificidad.
Los valores predictivos dan idea de la probabilidad de tener o no la enfermedad
teniendo un resultado positivo (VPP) o negativo (VPN) para el biomarcador en cuestión.
Estos valores predictivos responden a la cuestión que los clínicos se plantean delante de
un paciente con un biomarcador positivo o negativo ¿cuál es la probabilidad de estar
enfermo o no?
La utilidad de los valores predictivos se ve limitada por la dependencia que estos tienen
según la prevalencia de la enfermedad en cuestión en la población en estudio [29, 30].
Estos indicadores se calculan utilizando tablas de contingencia 2x2 teniendo en cuenta la
presencia o no del biomarcador en individuos enfermos y en sujetos sanos (Tabla 2):
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
Enfermedad VPP y VPN
Enfermedad
+(g) - (h) +(g) - (h)
Biomarcador +(e) (a) (b)
Biomarcador +(e) (a) (b)
-(f) (c) (d) -(f) (c) (d)
Sensibilidad = a/g
Especificidad = d/h
VPP = a/e
VPN = d/f
Tabla 2: cálculo de indicadores para el análisis de un biomarcador; sensibilidad, especificidad, VPP y VPN
Debido su utilidad en la práctica clínica, la búsqueda y descubrimiento de nuevos biomarcadores
es un área importante de trabajo en la investigación traslacional.
Biomarcadores serológicos
En el caso de las AID, una de las consecuencias de la respuesta inmune que tiene lugar con la
activación de LT y LB es la producción de Ac dirigidos contra Ag propios. Estos Ac pueden ser
detectados en el suero del paciente y usados como guía en el diagnóstico y/o seguimiento de
éste. Hay Ac que pueden ser usados como marcadores de actividad o severidad de la
enfermedad, otros que sirven para clasificar estas enfermedades o que se utilizan como
predictores [19].
Por ello, ahora revisaremos los diferentes Ac que se utilizan como biomarcadores en la CD y en
la GD.
12 Introducción
Enfermedad Celiaca
A pesar de que la confirmación histológica sigue siendo el método gold standard para confirmar
el diagnóstico de CD, la presencia de Ac específicos de esta enfermedad sirve para apoyar este
diagnóstico y permite a los clínicos valorar la necesidad de realizar una biopsia [31, 32] (Figura
1).
En la actualidad, existen 3 biomarcadores serológicos: los Ac anti-transglutaminasa 2 (Tg2), Ac
anti-endomisio (EMA) y Ac anti-formas deaminadas de la gliadina (DGP) [33]. Los Ac
relacionados con la CD son de tipo IgA, sin embargo, en individuos con bajos niveles séricos de
IgA (<20 mg/dl), lo cual es más frecuente en pacientes con CD que en la población general, los
biomarcadores utilizados son de tipo IgG, con el objetivo de evitar resultados falsos negativos.
La determinación de Ac anti-Tg2 y anti-DGP se realiza mediante enzimoinmunoensayo (ELISA)
mientras que la determinación de Ac anti-EMA se realiza por inmunofluorescencia indirecta (IFI)
sobre esófago de mono. A pesar de que la evaluación de los Ac anti-EMA, mediante microscopía,
requiere de personal especializado y puede haber cierta variación inter-observador, sigue siendo
el método de referencia para la determinación de Ac específicos de esta enfermedad.
Valores elevados de Ac anti-Tg2 y Ac anti-EMA tienen una elevada sensibilidad y especificidad
(>90%) mayor que la de los Ac anti-DGP. Los VPP y VPN de los Ac anti-Tg2 y anti-EMA también
son realmente elevados (>90%) [8]. En niños y adolescentes con síntomas sugestivos de CD y
niveles de Ac anti-Tg2 superiores a 10 veces el límite de normalidad, la probabilidad de
presentar una atrofia de las vellosidades intestinales de grado Marsh 3 es elevada, por ello, en
estos casos se evalúa la posibilidad de hacer el diagnóstico sin realizar biopsia al paciente [11].
Los niveles de Ac anti-Tg2 también se utilizan en el seguimiento y monitorización de la
enfermedad, ya que se ha visto que disminuyen tras 6-24 meses con una dieta libre de gluten
(GFD), el único tratamiento efectivo conocido hasta el momento.
Figura 1: algoritmo diagnóstico utilizado para el diagnóstico de la CD
13 Introducción
Otros biomarcadores
En esta búsqueda de nuevos biomarcadores, miembros de nuestro laboratorio han estudiado el
papel de la proteína REG 1A como auto Ag y biomarcador en la T1D [34, 35] y la CD. REG 1Α
pertenece a una familia de genes, REG, que a su vez forma parte de una superfamilia de genes
con un dominio lectina dependiente de calcio (C-type lectin). Estos genes codifican un grupo de
proteínas secretoras involucradas en fenómenos de regeneración tisular. Es una familia de
proteínas con características estructurales y funcionales comunes [36] que actúan como
reactantes de fase aguda, factores anti-apoptóticos, factores de crecimiento para células beta-
pancreáticas, células epiteliales del sistema digestivo, etc.
Recientemente, se ha descrito un incremento significativo de los niveles de REG 1Α en el suero
de pacientes celiacos en el momento del diagnóstico de la enfermedad disminuyendo tras 6
meses con una GFD, al igual que ocurre con los Ac anti-Tg2. Por eso, se ha postulado que los
niveles de REG 1Α pueden ser usados como biomarcador para el diagnóstico y monitorización de
la CD [37, 38].
Enfermedad de Graves
En el estudio de la GD se utiliza la determinación de los niveles de TSH, y si estos son bajos se
miden también los niveles de tiroxina (T4) y triyodotironina libre (T3), estos últimos
normalmente se encuentran elevados.
No obstante, también hay Ac que pueden ser detectados por ELISA y utilizados como
biomarcadores de esta enfermedad. Los más específicos son los Ac anti-TSHR que pueden ser
detectados en más del 95% de los pacientes con GD y confirman este diagnóstico. Además
resultan especialmente útiles en el diagnóstico diferencial con otras formas de hipertiroidismo,
como criterio de remisión de la enfermedad, en el diagnóstico de la oftalmopatía de Graves o a
la hora de evaluar el riesgo de GD neonatal en mujeres embarazadas con GD.
Estos pacientes además pueden presentar niveles elevados de Ac dirigidos contra la Tg y TPO
aunque estos no son específicos de la GD, ya que pueden aparecer también en pacientes con
HT, T1D, y con una frecuencia entre el 5-25% en la población general [39]. Como ya ha sido
descrito también en otras enfermedades, estos Ac pueden aparecer años antes del debut clínico
de la enfermedad y como era de esperar los Ac anti-TPO y Tg aparecen más tempranamente que
los Ac anti-TSHR [40].
Biomarcadores genéticos
Dentro de los biomarcadores genéticos de susceptibilidad a las AID, ya hemos comentado que el
sistema HLA juega un papel muy relevante. Polimorfismos en los genes HLA de clase I y II
constituyen los factores genéticos de susceptibilidad a estas enfermedades más fuertes de todo
el genoma [3]. Por ello, este sistema merece una mención especial.
14 Introducción
Sistema HLA
El análisis del sistema HLA se inició, por parte de Peter Medawar, con experimentos sobre los
procesos inmunológicos responsables del rechazo de trasplantes, donde mostraba que la
estructura antigénica reconocida por el receptor como extraña no sólo se encontraba en tejido
trasplantado, sino también en otras células como los leucocitos. Observaciones posteriores en el
hombre, llevaron a que en 1952 Jean Dausset descubriera que después de recibir diversas
transfusiones sanguíneas se desarrollaban Ac contra leucocitos, los cuales reaccionaban
selectivamente contra las células de los individuos donadores. Posteriormente de estos estudios
surgió la descripción de la primera especificidad antigénica del sistema HLA, identificada como
MAC que ahora se conoce con el nombre de HLA-A2. Debido a estos descubrimientos Medawar
y Dausset fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1960 y 1980,
respectivamente [41, 42].
El Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) es un complejo genético que contiene loci
altamente polimórficos que codifican para unas glicoproteínas de membrana cuya función es la
de presentar péptidos antigénicos a los LT con el fin de iniciar la respuesta inmune. En humanos
dichas proteínas también se conocen con el nombre de moléculas HLA. La agrupación de los loci
HLA en un complejo génico es una característica que comparten todos los vertebrados
gnatostomados [43].
Regiones HLA y características genéticas
El sistema HLA está ubicado en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3) y comprende unos 3.6
Mpb que contienen genes que codifican para más de 160 proteínas. Está dividido en 3 grandes
regiones génicas: clase I, clase II y clase III (Figura 2).
Figura 2: situación de la región HLA en el cromosoma 6; dbMHC Home (Graphic View)
15 Introducción
La región de clase I es la más telomérica y contiene los loci codificantes para las moléculas HLA
de clase I, la de clase II, la más cercana al centrómero, contiene los loci codificantes para las
moléculas HLA de clase II (Figura 3). Además dentro de la región de clase II también
encontramos los loci de un grupo de genes que codifican proteínas necesarias para la
presentación de Ag, algunos de la vía de clase I (TAP-1, TAP-2, LMP-2 y LMP-7) y otros de la vía
de clase II (DOA, DOB, DMA y DMB), que se explicará más adelante [44].
Figura 3: regiones HLA de clase I y clase II [45]
La región de clase III (Figura 4) se encuentra situada entre la región de clase I y la región de clase
II y a pesar de que los genes contenidos en esta región no codifican para moléculas
presentadoras de Ag, su localización genómica hace que sea necesario al menos citar su
existencia. En dicha región se encuentran genes que codifican moléculas con funciones muy
diversas, algunas de ellas relacionadas con el sistema inmune. Se encuentran desde diversos
componentes del sistema del complemento (C2, C4 y factor Bf) hasta genes como los que
codifican para diversas citocinas que tienen un papel en vías inflamatorias, como el TNF (Tumor
Necrosis Factor) y las linfotoxinas α y β [46].
AID como por ejemplo el SLE o la GD se han visto asociadas a polimorfismos o variación en el
número de copias de los genes contenidos en esta región [47].
Figura 4: región HLA de clase III [45]
El sistema HLA tiene unas características génicas que lo diferencian del resto del genoma y son
fundamentales para garantizar la función de las moléculas que codifica [48, 49]. Se trata de un
sistema poligénico, donde cada uno de los genes es a su vez polimórfico y sus alelos son
codominantes.
16 Introducción
Polimorfismo: el sistema HLA es un sistema altamente polimórfico (son los genes
más polimórficos de todo el genoma humano) [50] como se puede comprobar por el
gran número de alelos que se ha descrito y se encuentran clasificados en la base de
datos IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/; Figura 5). A principios de 2013 el
número de alelos HLA estaba situado en torno a 8.800 (6.920 HLA de clase I y 1.880
HLA de clase II).
En cada locus, el polimorfismo de los loci HLA se ha generado por fenómenos de
conversión génica, mutación puntual, inserción, deleción y recombinación. Esto hace
que alelos de un mismo locus a pesar de pertenecer a especificidades serológicas
diferentes tengan gran parte de su secuencia similar, pero además estas semejanzas
también ocurren entre distintos loci, por ejemplo entre HLA-A, HLA-B y HLA-C.
Desequilibrio de ligamiento: es la asociación alélica que se observa en una
determinada región génica y que hace que las frecuencias de los alelos en la
población no sean las esperadas si los alelos estuvieran en equilibrio de Hardy-
Weinberg [51].
En el caso de los loci HLA se observó que en determinadas poblaciones algunos
alelos HLA (tanto de clase I como de clase II) eran más frecuentes que otros y que en
poblaciones diferentes no eran los mismos los alelos predominantes.
Este hecho se explica por la presencia de desequilibrio de ligamiento entre los loci
HLA. Así, la mayor parte de los alelos que se presentan habitualmente junto a otros
en concreto son determinados por una herencia en haplotipos [52], esto es, la
combinación de alelos de cada locus HLA en un cromosoma, este término se utilizó
por primera vez en 1967. Cada individuo hereda un haplotipo paterno y otro
materno [53].
Además los genes de ambos cromosomas se expresan de manera simultánea: lo que
se conoce con el nombre de codominancia [51].
17 Introducción
Figura 5: número de alelos HLA de clase I y clase II nombrados desde 1968 (fecha de creación de HLA
Nomenclature Committee) hasta Marzo del 2013. IMGT/HLA Database
Moléculas HLA, diversidad y función
Las principales moléculas codificadas en el MHC son las glicoproteínas HLA, están implicadas en
la definición de lo propio y permiten al sistema inmune discriminar entre lo que pertenece al
individuo y lo extraño a él. Por ello juegan un papel muy importante en los trasplantes, de hecho
se descubrieron debido a que son las moléculas responsables de los fenómenos de rechazo que
ocurrían en estos, tal y como he comentado anteriormente.
Moléculas HLA de clase I
Los principales representantes de estas moléculas son HLA-A, HLA-B y HLA-C y vienen
codificados por los loci de clase I A, B y C correspondientes. Estas moléculas están presentes en
la superficie de todas las células (excepto eritrocitos) y son las responsables de presentar Ag,
provenientes de patógenos intracelulares, a los LT CD8+ [54].
Estructuralmente están formadas por una cadena α (polimórfica) de unos 45 kDa, anclada a
membrana (codificada en el cromosoma 6) y unida de forma no covalente a una cadena β2
microglobulina (invariante) de 12 kDa (que está codificada en el cromosoma 15 fuera de la
región MHC). La cadena α contiene aproximadamente 340 aminoácidos organizados en 3
regiones; una extracelular dividida en 3 dominios globulares: α1, α2 y α3 cada uno de los cuales
contiene aproximadamente 90 aminoácidos, otra transmembrana y otra intracelular. El
polimorfismo de la cadena α está localizado principalmente en los dominios α1 y α2, que forman
parte de la zona de unión al péptido (Figura 6); a nivel génico, estos dominios vienen codificados
en los exones 2 y 3. El dominio α3 es el que define la interacción con la molécula CD8 de los LT
citotóxicos (los que reconocen los Ag presentados por estas moléculas HLA de clase I).
18 Introducción
Existen otras moléculas de HLA I denominadas “no clásicas”, como son: HLA-E, HLA-F y HLA-G.
Son moléculas menos polimórficas y tienen una expresión más restringida de tejido [55].
Además también existen otras moléculas relacionadas con clase I (MHC class I chain related =
MIC) como son MICA y MICB y un gran número de pseudogenes y genes truncados (HLA-X,
MICC,…) similares a los genes de clase I.
Moléculas HLA de clase II
Las principales moléculas de clase II son: DP, DQ y DR. Estas moléculas están presentes de forma
constitutiva en la superficie de las células presentadoras de Ag (APC): linfocitos B (LB),
macrófagos y células dendríticas. También pueden encontrarse en LT activados y otras células
(endoteliales o epiteliales, especialmente activadas). Son las responsables de presentar Ag,
provenientes de patógenos extracelulares, a los LT CD4+ [56].
Están formadas por dos cadenas, una cadena α de 34 kDa y una cadena β de 29 kDa, unidas a
membrana y asociadas entre sí de manera no covalente. En este caso, es la cadena β la más
polimórfica. Cada cadena está compuesta de 230 aminoácidos que están organizados en región
extracelular (que comprende los dominios α1 y α2 y β1 y β2, cada uno de los cuales tiene
aproximadamente 90 aminoácidos), transmembrana e intracelular. El polimorfismo de las
moléculas HLA de clase II está localizado principalmente en los dominios α1 y β1 (en DQ, DP y
DR), que forman parte de la zona de unión al péptido (Figura 6); a nivel génico, estos dominios
vienen codificados en los exones 2 de cada locus.
Figura 6: estructura de las moléculas
HLA de clase I y II [57, 58]
Conviene recordar aquí que para realizar la función de presentación antigénica, además de las
moléculas HLA muchas otras moléculas son también fundamentales y algunas, como se ha
citado anteriormente, están también codificadas por locus génicos situados en la región de clase
II. Así:
Vía de clase I: moléculas TAP-1 y TAP-2, son transportadores de membrana que forman
un complejo encargado de translocar péptidos del citoplasma hacia el lumen del retículo
endoplasmático (RE), para que puedan ser presentados vía clase I. Moléculas LMP-2 y
19 Introducción
LMP-7, forman parte del proteasoma, un complejo implicado en la digestión proteolítica
de un elevado número de proteínas citoplasmáticas.
Deficiencias en la expresión de estas moléculas tienen como consecuencia una
ineficiente presentación antigénica y en algunos casos de neoplasias puede suponer un
mecanismo de escape del sistema inmune [59]. También se han descrito mutaciones en
TAP1 y TAP2 causantes de una rara enfermedad conocida como déficit de HLA de clase I
o Síndrome del linfocito desnudo tipo I (Bare lymphocyte syndrome type I; OMIM
604571) [60, 61].
Vía de clase II: se encuentran los loci DOA, DOB, DMA y DMB, que codifican las
moléculas HLA-DO y HLA-DM respectivamente, moléculas no clásicas de clase II,
relacionadas con el tránsito intracelular y la carga de péptidos a las moléculas de clase II.
Existe una interesante unión entre las 2 vías llamada “cross-presentación” donde Ag exógenos
pueden ser presentados por moléculas HLA de clase I y Ag endógenos por moléculas HLA de
clase II. Es una propiedad atípica pero sin embargo esencial en el inicio de la respuesta inmune
frente a virus que no infectan APC [62].
Nomenclatura
Debido al gran número de alelos existentes, en 1968 se creó el comité para la nomenclatura de
los diferentes alelos HLA “WHO Nomenclature Comittee for factors of the HLA System”.
Según las directrices de este comité, cada alelo HLA se denomina por el nombre del locus
seguido de un asterisco (para indicar que se trata de información alélica) y después seguido de
una cifra numérica que puede contener de 1 a 4 campos de dígitos. Todos los alelos tienen un
nombre de como mínimo 2 campos de dígitos y los nombres de 3 y 4 campos son sólo asignados
cuando es necesario diferenciar [63] (Tabla 3).
NOMENCLATURA INDICA
HLA Prefijo
HLA-A Un locus particular del sistema HLA
HLA-A*01 Familia alélica a la que pertenece el alelo. Baja resolución [64]
HLA-A*01:01 Variante alélica dentro de la misma familia. Alta resolución
HLA-A*02:01:01 Este alelo presenta diversas variantes nucleotídicas que no provocan cambios
de aminoácidos en la proteína
HLA-A*02:01:01:01 Se han descrito polimorfismos en zonas no codificantes del alelo en cuestión
HLA-A*24:09N Alelo nulo, que no presenta expresión
HLA-A*24:02:01:02L Alelo que codifica una proteína con expresión de superficie reducida
HLA-B*44:02:01:02S Alelo que codifica una proteína que sólo presenta forma soluble
Tabla 3: estructura de la nomenclatura de alelos HLA
20 Introducción
Cuando se habla de especificidades serológicas el nombre de los loci no va seguido de un
asterisco y sólo continúa con los dígitos indicativos de la familia alélica a la que pertenece.
Para alelos HLA de clase I, la descripción del locus indica el gen que codifica para la cadena α
mientras que en el caso de los alelos HLA de clase II ambos genes (el que codifica para la cadena
α y el que lo hace para la β) deben informarse, por ejemplo DQA y DQB.
Todos los alelos descritos por laboratorios de diferentes partes del mundo se encuentran
recogidos en la base de datos IMGT/HLA [65].
Técnicas de tipificación del sistema HLA
La tolerancia del injerto por el receptor en los trasplantes depende en gran medida de que
ambos compartan el mayor número posible de alelos HLA en sus genes. La necesidad de
determinar la identidad HLA de donante y receptor para optimizar la eficacia de los trasplantes y
evitar, en la medida de lo posible, el rechazo del órgano trasplantado ha conllevado el desarrollo
de diversas generaciones de técnicas de tipificación [66]. Los métodos para la identificación de
los alelos HLA han cambiado significativamente desde que este grupo de proteínas altamente
polimórficas fueron caracterizadas por primera vez mediante métodos serológicos en los años
60 y 70 [67].
Clásicamente se habla de una tipificación de baja resolución para referirnos a familia alélica y
cuando decimos alta resolución hacemos referencia a variante alélica dentro de una misma
familia [64, 68].
Aunque tradicionalmente se utilizaban tanto técnicas serológicas como moleculares, hoy en día
la mayor parte de los laboratorios realizan estas determinaciones a nivel molecular y, debido a
la gran complejidad polimórfica que tiene el sistema HLA, la técnica de referencia es la
secuenciación. No obstante, las técnicas serológicas pueden ser interesantes a la hora de
investigar la expresión de las moléculas HLA [67].
Técnicas de tipificación serológicas
Linfocitotoxicidad
Tradicionalmente, los Ag HLA fueron definidos usando técnicas serológicas [69, 70]. La
implementación del complemento junto a la optimización de pequeños volúmenes permitió
definir el estándar de serotipificación a través de lo que conocemos como
microlinfocitotoxicidad [71, 72].
Esta técnica parte de la obtención de preparaciones viables de linfocitos de la persona a tipificar
y enfrenta estas células a diferentes sueros que contengan Ac específicos contra un HLA
concreto. El problema de la utilización de estos sueros es que pueden tener más de una
especificidad y por ello se ha de utilizar un amplio panel bien caracterizado. La reactividad se
evalúa mirando la citotoxicidad que se produce al añadir el complemento. Las fuentes
21 Introducción
principales de Ac utilizadas en la microlinfocitotoxicidad proceden de sueros
descomplementados de personas sensibilizadas (mujeres multíparas, pacientes transfundidos y
trasplantados), aunque también existen Ac monoclonales que permiten evitar la limitación de
disponibilidad de los sueros. Por su parte el complemento a utilizar suele provenir de suero de
conejo. Con esta metodología los alelos nulos (alelos que no se expresan) quedan
enmascarados.
Técnicas de tipificación moleculares
Con el tiempo, han sido las técnicas de tipificación basadas en el análisis del DNA las que han
substituido a las técnicas serológicas en la mayoría de laboratorios HLA, ya que desde los inicios
de su utilización se vio que los métodos basados en la PCR presentaban una serie de ventajas
respecto a la serología [73-75]. Las más destacadas son las que permiten obtener una resolución
más elevada, evitan las reacciones cruzadas de los Ac y tienen un alto nivel de precisión y
reproducibilidad. Además la obtención de los reactivos a utilizar es más sencilla y se pueden
actualizar más fácilmente en función de los nuevos alelos que se van descubriendo. Por todo
ello, los métodos de tipificación basados en la PCR han experimentado un importante
crecimiento.
Actualmente en los laboratorios HLA la tipificación se realiza mediante una combinación de
técnicas siendo común, en general, partir de una amplificación (PCR) y consiguiendo la
especificidad de la tipificación ya sea gracias a la especificidad de los cebadores o primers (PCR-
SSP) o por los oligonucleótidos con los que se hibridan los fragmentos de DNA amplificados
(PCR-SSO). En todo caso, en muchas ocasiones estas técnicas necesitan continuarse mediante
secuenciación (PCR-SBT), gold standard, para resolver ambigüedades que no pueden definirse
sólo con técnicas precedentes [76].
PCR-SSO
Fue el primer método molecular de tipificación que se desarrolló inicialmente para detectar
alelos HLA de clase II. Se basa en la hibridación de DNA, amplificado previamente de forma
genérica por PCR, con sondas oligonucleotídicas específicas de una región polimórfica, sobre una
membrana de hibridación.
Cada sonda específica utilizada tiene una secuencia que puede ser compartida por diferentes
alelos. Es necesario tener en cuenta este hecho a la hora de dar una tipificación, así, se analizan
patrones de sondas unidas que corresponden a patrones de secuencias polimórficas que definen
cada alelo [77].
Hoy en día existe una variante de esta técnica que se denomina Luminex y se basa en la
citometría de flujo y en la utilización de sondas oligonucleotídicas inmovilizadas en microesferas,
en lugar de la membrana de la descripción original. Se mide la fluorescencia intrínseca de las
microesferas y la luz emitida por los fluorocromos unidos a los productos de PCR hibridados con
las sondas. El equipo permite el análisis simultáneo de distintas muestras en un único test [78,
79].
22 Introducción
PCR-SSP
Se basa en el uso de primers específicos de secuencia. Una amplificación con primers totalmente
complementarios a la secuencia escogida y que a su vez contengan polimorfismos en su región
3’ con los otros alelos consigue únicamente la amplificación de las variantes totalmente
complementarias. Es un método de tipificación ideal para realizarlo en muestras individuales y
también se utiliza como método confirmatorio o de resolución de ambigüedades, ya que
permite la detección de alelos concretos. También es útil para la tipificación de alelos HLA
asociados a enfermedad. Sin embargo, requiere procesamiento post-PCR y es un método muy
costoso para dar una tipificación completa [67].
PCR-SBT
Se basa en la utilización de primers específicos de un locus situados generalmente en los
intrones o bien en una zona exónica común a todos los alelos a amplificar y posteriormente se
realiza la reacción de secuenciación nucleotídica mediante el método de Sanger. Los productos
generados se someten a electroforesis capilar para obtener los electroferogramas, de los cuales
se deduce la secuencia de nucleótidos. Para la tipificación de los loci de clase I es imprescindible
la amplificación y secuenciación de los exones 2 y 3 y para los loci de clase II el exón 2 [80]. Es
recomendable, para la correcta tipificación, realizar 2 reacciones para cada exón (sentido o
forward y antisentido o reverse).
Dentro de las técnicas basadas en la secuenciación, actualmente se habla de una secuenciación
de nueva generación (Next Generation Sequencing o NGS). Desde que en el año 2001 se
completó la secuenciación del genoma humano [81] se han desarrollado una serie de nuevas
tecnologías de secuenciación. Algunas de ellas ya están comercialmente disponibles mientras
que otras se encuentran en fase de desarrollo. El objetivo de estas técnicas es una secuenciación
clonal o de una única molécula de DNA y para ello el proceso consta de diferentes pasos como
son la fragmentación al azar del DNA genómico, posteriormente, la inmovilización de los
fragmentos individuales de DNA generados en el paso anterior y su amplificación clonal
mediante PCR, para después secuenciarlos usando fluorescencia o quimioluminiscencia [67, 82,
83]. Actualmente se está desarrollando la aplicación de esta tecnología en la tipificación HLA
[82, 83].
PCR en tiempo real
Principio:
La PCR en tiempo real (RT-PCR; técnica cinética) permite medir la cantidad de molde inicial, cosa
que no se puede hacer con las técnicas a punto final. La medición se consigue mediante el
análisis del punto de inicio de la curva de reacción mientras que en la PCR convencional se mide
el producto final de la reacción [84]. Para realizar una medición continua de la reacción es
necesario introducir un componente trazable (fluorocromo). Entre las distintas opciones de
detección destacamos aquí la hibridación con una sonda fluorescente, un proceso adicional y
23 Introducción
simultáneo a la PCR, que se produce con la amplificación (y/o al final) y que puede informar
además de aspectos de la secuencia que reconoce. La RT-PCR combina la amplificación y
detección en un único tubo evitando por ello las manipulaciones post-PCR que pueden
introducir errores especialmente por contaminación cruzada de muestras [85].
Hay una alta correlación entre la señal y la cantidad de producto presente inicialmente. Durante
los primeros ciclos de la reacción hay pequeños cambios en la señal de fluorescencia pero a
medida que la reacción progresa la señal de fluorescencia comienza a aumentar con cada ciclo
de manera exponencial, lo que ha permitido utilizar esta técnica para la amplificación
cuantitativa de cDNA.
Como se ha apuntado, el uso de sondas de hibridación permite también obtener información de
las secuencias que hibridan. A menudo se realiza en un paso adicional que permite determinar
lo que se conoce como curva de fusión (o melting) de una sonda. Una curva de fusión es el
cambio de fluorescencia observado cuando el DNA de doble cadena (dsDNA) se disocia en DNA
de cadena simple (ssDNA) al aumentar la temperatura de la reacción [86].
Sistemas de detección usados en RT-PCR:
Intercalante SYBR® Green I
SYBR® Green es un colorante que sólo presenta fluorescencia detectable cuando está unido a
dsDNA. La intensidad de la señal depende de la cantidad de dsDNA que está presente en el
producto de PCR. De este modo la señal de detección es proporcional a la concentración de
DNA. Este método no es tan específico como el uso de sondas ya que el colorante se une
indiscriminadamente a todo el dsDNA formado durante la PCR detectando también DNA
artefactual como, por ejemplo, los dímeros de primers. No obstante, se han desarrollado
sistemas de tipificación de HLA-DR basados en RT-PCR en combinación con SYBR® Green I [87].
También hay otros sistemas como el High Resolution Melting (HRM) que utilizan una nueva
generación de intercalantes LCGreen® y LCGreen Plus® (Idaho Technology), que pueden unirse
de manera saturante al DNA y permiten ver cambios de una base [88, 89].
Detección mediante sondas de hibridación
Taqman®: este sistema utiliza una sonda oligonucleotídica de 18-22 pb que tiene dos
marcadores conjugados, uno en el extremo 5’ (reportador-reporter) y otro en el
extremo 3’ (apagador-quencher), que hibridará con el fragmento de PCR amplificado.
Mientras la sonda está intacta, la molécula quencher absorbe la fluorescencia emitida
por el fluorocromo reporter. Durante la amplificación, la actividad 5’ exonucleasa de la
Taq DNA polimerasa degrada la sonda hibridada, liberando el reporter correspondiente.
Cuando esto ocurre, se registra un aumento en la emisión de fluorescencia que es
proporcional a la cantidad de producto amplificado.
Sondas Light Cycler FRET: Consiste en dos sondas oligonucleotídicas, separadas entre sí
de 1-5 bases, marcadas fluorescentemente, cada una de ellas con un solo fluorocromo
24 Introducción
(sondas anchor / sensor). Una de ellas tiene en posición 3’ un fluorocromo donador de
fluorescencia y la otra en posición 5’ con un fluorocromo aceptor. A medida que la
amplificación de la PCR ocurre, las sondas se unen al producto de PCR, con lo que los
dos fluorocromos quedan situados de forma cercana, produciéndose entonces el
fenómeno de transferencia de energía entre ambos: FRET (Fluorescence Resonance
Energy Transfer), que se traduce en una señal fluorescente.
Previamente, en nuestro laboratorio se han desarrollado una serie de reacciones
basadas en RT-PCR en combinación con sondas FRET para la determinación del
polimorfismo de los loci HLA-DR y HLA-B [90, 91].
Sistema HLA como biomarcador de enfermedades autoinmunes
Como consecuencia de las características del sistema HLA, la determinación de su polimorfismo
o tipificación HLA es útil en diferentes campos biomédicos. Ya hemos mencionado la
importancia a nivel del trasplante, pero además la tipificación HLA es también útil en el
diagnóstico de enfermedades, especialmente de AID.
Es ampliamente conocido que las enfermedades de base inmunitaria, y especialmente las AID,
tienen una base genética que predispone a los individuos a sufrirlas. A diferencia de las
enfermedades monogénicas, este tipo de enfermedades se producen debido a interacciones
entre diferentes factores genéticos, cada uno de los cuales puede influir de manera modesta, y
factores ambientales, tales como la dieta, toxinas ambientales y/o infecciones. En muchos casos,
los genes que contribuyen en mayor grado a la predisposición genética a ciertas AID son los
genes HLA (desde un 15% en la Esclerosis Múltiple hasta un 42% en la T1D).
Hay diferentes hipótesis que relacionan la asociación entre los genes HLA y las AID como son:
La influencia de las moléculas HLA en la selección positiva y negativa de los LT en el
timo. Por ejemplo, algunas moléculas HLA asociadas a ciertas enfermedades pueden
unir débilmente epítopos críticos de potenciales auto Ag, causando un déficit en la
tolerancia a lo propio. Otra posibilidad es que moléculas HLA con efecto protector
respecto a ciertas AID, puedan promover la selección tímica de células T reguladoras
(LTreg).
La presentación preferente de péptidos modificados post-translacionalmente por
moléculas HLA concretas, hecho que explicaría la pérdida de tolerancia a Ag propios,
como ocurre en el caso de la CD.
La semejanza molecular entre péptidos de un agente infeccioso y de un auto Ag que se
une preferentemente a un HLA concreto [92, 93].
Por todo ello, en algunas AID el sistema HLA se utiliza como biomarcador genético. El grado de
asociación de un biomarcador genético con una enfermedad determinada se calcula mediante el
riesgo relativo (RR) que es un índice de asociación que mide la probabilidad de tener una
25 Introducción
determinada patología por parte de una persona que posee la variante del gen en cuestión que
confiere riesgo, respecto al riesgo propio de padecer esta enfermedad por parte de las personas
que no tienen esta variante genética. Cuanto más alto sea el valor del RR, más fuerte es la
asociación entre el biomarcador genético y la enfermedad en cuestión y más útil es su
determinación. No obstante, la presencia de un determinado alelo HLA asociado a una
enfermedad no es diagnóstico de ella, sin embargo, su ausencia puede ayudar a descartar una
enfermedad concreta. Otro índice utilizado para valorar esta asociación es la razón de
probabilidad u odds ratio (OR), que mide el RR en estudios comparativos entre pacientes y
controles, en este contexto la OR se define como el cociente entre el riesgo de tener el alelo o
genotipo asociado a una enfermedad y estar realmente enfermo y el riesgo de tener el alelo o
genotipo asociado a una enfermedad pero estar sano [51].
Un RR o una OR igual a 1 significan que existe el mismo riesgo de presentar la enfermedad tanto
si se tiene el factor como si no. Si el RR o la OR son inferiores a 1 el factor a estudio presenta un
efecto protector y si el RR o la OR son superiores a 1, el hecho de presentar el factor confiere un
mayor riesgo a padecer la enfermedad.
Ambos se calculan utilizando tablas de contingencia 2x2 teniendo en cuenta la presencia o
ausencia del factor de riesgo en cuestión en individuos enfermos y en sujetos sanos (Tabla 4):
RIESGO RELATIVO
ODDS RATIO
Enfermedad
+ -
alelo HLA +(e) (a) (b)
-(f) (c) (d)
RR= (a/e)/(c/f)
OR= (a/b)/(c/d)
Tabla 4: cálculo del RR y OR
En 1973 se describió por primera vez que la espondilitis anquilopoyética está fuertemente
relacionada con el HLA-B*27 [94]. Desde entonces se han encontrado que algunos genes HLA de
clase I y de clase II predisponen a padecer ciertas AID [57].
A continuación se detallan las asociaciones más importantes, así como el grado de asociación
(RR) (Tabla 5):
HLA y Enfermedad
ENFERMEDAD HLA RR Ref
ENFERMEDADES
REUMATOLÓGICAS
ESPONDILITIS ANQUILOPOYÉTICA B27 87,4 [94]
ARTROPATÍAS REACTIVAS, incluido el
SDR. REITER B27 37
[57] ARTRITIS REUMATOIDE DR4 4,2
ENFERMEDADES
SISTÉMICAS
LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO DR3 5,8
SDR. SJÖGREN DQA1*05:01 [95]
DR3 9,7 [57]
26 Introducción
ENFERMEDADES
ENDOCRINAS
DIABETES MELLITUS TIPO I
B*39 1,4 [96]
DR3 3,3
[57]
DQB1*02:01 2,4
DR4 6,4
DQB1*03:02 9,5
DR2 0,19
DRB1*15:01 0,03-0,2
DQB1*06:02 0,15
[57] ENF. DE ADDISON IDIOPÁTICA DR3 6,3
ENF. DE GRAVES
DR3 3,7
C3, C7 [97]
B8
TIROIDITIS DE HASHIMOTO DR11 3,2
[57] TIROIDITIS POST-PARTO DR4 5,3
ENFERMEDADES
DIGESTIVAS ENF. CELIACA
DR3 10,8
DQB1*02:01 [98]
DQA1*05:01
[57]
DR7, 11 6,0-10,0
ENFERMEDADES
RENALES
GLOMERULONEFRITIS MEMBRANOSA
IDIOPÁTICA DR3 12
SDR. GOODPASTURE DR2 15,9
ENFERMEDADES
NEUROLÓGICAS
ESCLEROSIS MÚLTIPLE
DR2 4,1
DRB1*15:01
[99] DRB5*01:01
DQB1*06:02
MIASTENIA GRAVIS DR3 2,5
[57] B8 3,4
NARCOLEPSIA DQB1*06:02 [100,
101]
ENFERMEDADES
OCULARES
RETINOPATÍA DE BIRDSHOT A29 109 [57]
UVEITIS B27 [102]
ENFERMEDADES
DERMATOLÓGICAS
ENF. DE BEHÇET B51 3,8 [57]
PÉNFIGO VULGAR (judíos Ashkenazi) DRB1*04:02 14,4
PÉNFIGO VULGAR DRB1*04, 08, 14 4,0-6,0
[103] DRB1*03, 07, 15 0,3
PSORIASIS VULGARIS Cw6 13,3 [57]
DERMATITIS HERPETIFORME DR3 15,9
Tabla 5: asociación entre la presencia de alelos HLA (de clase I y II) y AID (en azul están aquellos que
presentan un efecto protector; RR<1)
En los últimos años los estudios de asociación genómica (Genome-Wide Association Studies;
GWAS) han adquirido una gran importancia a la hora de identificar factores genéticos,
diferentes al sistema HLA, que confieren riesgo para enfermedades complejas [3, 51].
Estos estudios han podido corroborar factores genéticos ya identificados y encontrar nuevos no
descritos previamente. Además han contribuido en gran medida en el conocimiento
27 Introducción
fisiopatológico de estas enfermedades aunque no han podido explicar la mayor parte del
componente genético causal que se observa. En estos estudios se asume que este tipo de
enfermedades están asociadas a variantes génicas frecuentes en la población pero podría darse
el caso que parte de la predisposición genética viniera dada por la interacción de múltiples
variantes genéticas infrecuentes a nivel poblacional y por tanto no detectables en estos
estudios, hecho que explicaría porque la base genética de estas AID está todavía incompleta.
- Posible combinación de alelos HLA y alelos de otros genes como biomarcadores
Tal y como acabamos de comentar, muchos de los genes identificados como biomarcadores en
las AID tienen efectos menores (bajo RR u OR), pero a veces, es la interacción entre diferentes
genes lo que predispone a padecer una determinada enfermedad, como ocurre en el caso del
gen de la Tg y HLA-DRB1-Arg74.
Se han detectado 3 variantes aminoacídicas del gen de la Tg (A734S, V1027M y W1999R)
asociadas con AID, estas diferentes variantes alteran la degradación de la Tg lo que
resulta en un repertorio de péptidos patogénico. Por otro lado, se ha identificado que
una arginina en la posición 74 de la cadena beta del HLA-DR (HLA-DRB1-Arg74) confiere
susceptibilidad a la GD (que se explicará más adelante), ya que puede unir
preferentemente unos péptidos determinados, mientras que una glutamina en esta
misma posición tiene efecto protector [104]. Pero además, si un mismo paciente
presenta la variante W1999R y el HLA-DRB1-Arg74, la susceptibilidad a la GD es mayor
[18].
- Alelos HLA en la Enfermedad Celiaca
La participación del sistema HLA en la fisiopatología de la CD está perfectamente definida y
explica la asociación genética. Se describió por primera vez en los años 70 [105, 106]. Dentro de
los pacientes con CD alrededor del 90% expresan el HLA-DQ2, heterodímero formado por los
alelos HLA-DQA1*05 y DQB1*02 en relación al 20% de individuos que lo expresan en la
población general. Del resto de pacientes celíacos, un 5% presentan el HLA-DQ8 (HLA-
DQA1*0301 y DQB1*0302) y el 5% restante tienen uno de los 2 genes que forma el HLA-DQ2
pero no presentan el heterodímero completo [107].
Se ha visto que en función del genotipo hay un rango de riesgo diferencial de asociación con la
CD, siendo de mayor a menor riesgo aquellos individuos DQ2/DQ2, DQ2/otro, DQ8/otro y por
último los que presentan sólo uno de los 2 alelos que forman el HLA-DQ2 [108]. Individuos HLA-
DQ2 homocigotos tienen hasta 5 veces mayor riesgo de desarrollar la enfermedad que
individuos HLA-DQ2 heterocigotos [11]. La presencia de los genes HLA relacionados es necesaria
para causar la enfermedad [11], no obstante sólo un 3% de los individuos HLA-DQ2/DQ8
positivos la desarrollarán tras la exposición al gluten [108]. Por ello el VPP de este biomarcador
no es demasiado elevado. Al contrario, la probabilidad de que un individuo con HLA-DQ2/DQ8
negativo tenga CD es verdaderamente pequeña, es decir el VPN de este biomarcador es
realmente importante. Esto implica que el estudio genético es útil para delimitar población de
riesgo susceptible de evaluación y seguimiento.
28 Introducción
La base molecular de esta asociación ha sido ampliamente estudiada, parece ser que hay una
unión preferente por parte de los HLA-DQ2 y HLA-DQ8 a péptidos derivados del gluten
resistentes a la proteólisis, que presentan residuos de glutamato cargados negativamente y que
han sido introducidos por la enzima Tg2 [14].
- Alelos HLA en la Enfermedad de Graves
En relación a los genes del sistema HLA, aunque inicialmente, fueron los Ag HLA de clase II los
primeros en asociarse con la GD, en concreto el HLA-DRB1*03 [109], recientemente también se
ha demostrado una regulación positiva de moléculas HLA de clase I en células tiroideas en
respuesta a la infiltración linfocitaria de la glándula y se postula que estas moléculas puedan
tener un papel relevante en la patogénesis de esta enfermedad [97]. Así el HLA-C*07 y HLA-
B*08 son factores predisponentes (OR=1.63 y 1.62 respectivamente), mientras que los alelos
HLA-C*03, HLA-C*16 y HLA-B*44 tienen efectos protectores (OR=0.54, 0.36 y 0.64
respectivamente) [97].
Sistema HLA como biomarcador de reacciones de hipersensibilidad
A pesar de que el conocimiento en el campo farmacológico está en continuo crecimiento, las
reacciones adversas a fármacos (ADR) ocurren con frecuencia y constituyen una causa de
morbilidad y mortalidad importante a nivel mundial. La organización mundial de la salud define
estas ADR como una respuesta al fármaco que es nociva y no intencionada y que ocurre a las
dosis que normalmente se utilizan como profilaxis, diagnóstico o tratamiento de una
enfermedad o para la modificación de una función fisiológica.
Hay dos principales categorías de ADR, aquella predecible, asociada con la actividad
farmacológica del fármaco en cuestión y aquella idiosincrática, causada por una reacción
inmune frente al fármaco. Variantes de esta última son por ejemplo el síndrome de
hipersensibilidad frente a fármacos (DHS) o reacciones frente al fármaco con eosinofilia y
síntomas sistémicos (DRESS) [110, 111].
En este contexto, el sistema HLA constituye un importante factor genético en el DHS. Desde
hace años es conocida la relación entre el alelo HLA-B*57:01 y las DHS al abacavir, un inhibidor
de la transcriptasa inversa utilizado en el tratamiento de la infección por el virus de la
inmunodeficiencia humana (HIV) [112]. La determinación de la presencia de este alelo, en
individuos susceptibles de ser tratados con este fármaco, es recomendada desde la FDA (US
Food and Drug Administration) y en concreto en el laboratorio de HLA (LIRAD) también se realiza
mediante un método basado en la RT-PCR.
De la misma manera, recientemente se ha asociado la presencia del alelo HLA-A*31:01 con las
reacciones de hipersensibilidad inducidas por carbamazepina (un fármaco antiepiléptico) en
individuos de origen europeo. La presencia de este alelo incrementa el riesgo de sufrir estas
reacciones de un 5 a un 26% mientras que su ausencia lo disminuye de un 5 a un 3.8% [111,
113].
29 Introducción
Otros factores genéticos en la Enfermedad de Graves
En relación a genes no HLA de susceptibilidad a AITD, aquellos que afectan a la activación de LT
como son CTLA4 (cromosoma 2q33.2) y PTPN22 (cromosoma 1p13.2) han sido ampliamente
estudiados.
CTLA4
CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte-associated factor; CD152) es un miembro de la superfamilia de
las Igs, proteína inmuno-reguladora que se expresa en los LT activados y constituye un regulador
negativo para los LT. El CTLA4 presintetizado se almacena en vesículas intracelulares y como
consecuencia de la activación de los LT, aumentan los niveles de calcio intracelular, lo que
provoca la liberación de esta molécula a la superficie celular [114]. Actúa uniéndose a B7-1
(CD80) y B7-2 (CD86) en las APC, igual que lo hace CD28 pero con entre 500 - 2500 veces más
afinidad y efecto opuesto. Es decir, CTLA4 y CD28 compiten por su unión a CD80 y CD86, pero
mientras que CD28 tiene un efecto estimulador, CTLA4 lo tiene inhibidor [115].
Esta proteína juega un papel importante en el mantenimiento de la tolerancia a nivel periférico
además de en la terminación de las respuestas mediadas por los LT. Una subpoblación de LT que
tienen un papel crucial en la tolerancia periférica es la subpoblación de LTreg y estos expresan
de forma constitutiva CTLA4 en su superficie [114]. Se ha postulado que polimorfismos en este
gen que reduzcan su expresión y/o función pueden predisponer a sufrir autoinmunidad, ya que
sería de esperar que aumentara la activación de LT [104].
Se han encontrado diferentes variantes y las 3 que presentan una asociación más consistente
son una repetición AT en la región 3’UTR: (AT)n, una transición A/G en la posición 49 (exón 1;
péptido señal; rs231775) que resulta en una sustitución de una alanina por una treonina (A/G49)
y otro cambio A/G fuera de la región 3’UTR (CT60) [104, 116]. También hay estudios que hablan
de un posible papel sinérgico entre polimorfismos en este gen y determinados alelos HLA en
relación a la GD [117].
PTPN22
PTPN22 (protein tyrosine phosphatase-22) codifica para una proteína intracelular LYP (lymphoid
tyrosine phosphatase) que tiene un papel central en el mantenimiento de la tolerancia
inmunológica y por lo tanto en la prevención de las AID [118]. Al igual que CTLA4, juega un papel
negativo en la señalización de LT [119]. Esta proteína LYP tiene 807 aminoácidos y contiene un
dominio catalítico y 4 sitios de unión a SH3 [120]. Polimorfismos en este gen, y en CTLA4,
muestran diferencias en cuanto a sus frecuencias en diferentes poblaciones étnicas, tal y como
se puede ver en la base de datos ENSEMBL (http://www.ensembl.org). El principal SNP (single
nucleotide polymorphism) asociado a enfermedad es debido a un cambio missense en la
posición 1858 (C>T) que tiene como consecuencia una substitución de una arginina (Arg; R) por
un triptófano (Trp; W) en el codón 620 (R620W; rs2476601). Este SNP se ha visto asociado con
AITD además de con otras AID [104] como son T1D, donde fue inicialmente descrita, RA, SLE, sin
30 Introducción
embargo esta asociación no se ha observado en pacientes con esclerosis sistémica, enfermedad
de Crohn, colitis ulcerosa o esclerosis múltiple [120]. Este polimorfismo, localizado en la región
N terminal de uno de los dominios de unión a SH3, disminuye su eficacia de unión a estos
dominios de determinadas proteínas, como por ejemplo Csk y recientemente se ha visto que
este cambio resulta en una variante con ganancia de función con aumento de la capacidad
catalítica. Sin embargo, todavía no está del todo claro como este potencial incremento en la
inhibición de la activación del TCR puede acabar desencadenando procesos autoinmunes [118,
121].
31 Hipótesis
HIPÓTESIS
La determinación del polimorfismo del sistema HLA (tipificación HLA) es útil en diferentes
campos biomédicos, como son la histocompatibilidad a nivel de trasplante o en relación con el
diagnóstico de enfermedades, especialmente AID. Para ello, los laboratorios de HLA hoy en día
utilizan una combinación de diferentes técnicas moleculares, que incluyen la PCR-SSP, PCR-SSO
o PCR-SBT.
No obstante, la metodología de la RT-PCR en combinación con sondas de hibridación tiene una
serie de ventajas como pueden ser el menor tiempo de procesado o menor riesgo de
contaminación post-PCR, que pueden resultar útiles en la práctica diagnóstica a la hora de
determinar tanto el polimorfismo del sistema HLA como polimorfismos en otros genes que se
utilizan como biomarcadores en ciertas AID.
32 Objetivos
OBJETIVOS
CARACTERIZACIÓN DE BIOMARCADORES HLA EN ENFERMEDADES AUTOINMUNES
El objetivo de este trabajo es el diseño de reacciones de RT-PCR para la caracterización y
evaluación de biomarcadores genéticos, principalmente pertenecientes al sistema HLA, para el
estudio de AID como son la CD y la GD. El análisis de los biomarcadores del sistema HLA,
juntamente con polimorfismos en otros genes cuya función está relacionada con el sistema
inmune, como por ejemplo PTPN22 y CTLA4, puede permitirnos predecir mejor la
susceptibilidad a padecer estas enfermedades.
Objetivo 1_Biomarcadores HLA en la Enfermedad Celiaca
Diseñar, poner a punto mediante RT-PCR y validar las reacciones necesarias para
implementar la técnica de tipificación HLA-DQ2/DQ8 asociado a CD. Detectar la
presencia del alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o en heterocigosis y su relación con la
CD.
Estudiar la presencia del alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o heterocigosis en
pacientes con CD y correlacionar la presencia de este alelo con otros biomarcadores de
la enfermedad y su gravedad.
Objetivo 2_Biomarcadores en la Enfermedad de Graves
Diseñar, poner a punto mediante RT-PCR y validar las reacciones necesarias para la
detección de los alelos HLA de clase I (HLA-B*08/B*44 y HLA-C*03/C*07/C*16) y para la
determinación de los polimorfismos de los genes PTPN22 y CTLA4 (rs2476601 y
rs231775 respectivamente), que han sido descritos como loci de susceptibilidad para la
GD en otras poblaciones.
Analizar las frecuencias de los alelos HLA de clase I y de los polimorfismos rs2476601 y
rs231775 y confirmar que estos loci realmente constituyen loci de susceptibilidad para
la GD en una cohorte de pacientes de nuestra región geográfica.
Objetivo 3_Desarrollo de la tipificación del locus A del sistema HLA por PCR a tiempo real
Diseñar, poner a punto mediante RT-PCR y validar un sistema de tipificación para el
locus A del sistema HLA que complemente a otras reacciones ya desarrolladas en el
laboratorio por esta misma metodología (HLA-B y DR) [90, 91]. Obtener una tipificación
de baja resolución que pueda ser utilizada con diferentes aplicaciones como por
ejemplo, el estudio de variantes HLA-A asociadas a enfermedad o susceptibilidad a
ciertos medicamentos.
33 Material y métodos
MATERIAL Y MÉTODOS
MUESTRAS GENERALES
Para la puesta a punto de las reacciones utilizadas en este trabajo para el tipaje del sistema HLA
(tanto en el caso del locus A así como de los diferentes alelos HLA asociados a AID (HLA-
DQ2/DQ8 en el caso de la CD y HLA-B*08/44 y HLA-C*03/07/16 en el caso de la GD)), se han
utilizado aproximadamente 200 muestras de DNA genómico del laboratorio de HLA del LIRAD
(Laboratori d'Immunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnòstiques).
Estas muestras habían sido previamente analizadas mediante tecnologías convencionales (por
baja, PCR-SSP o PCR-SSO, o alta resolución, PCR-SBT) para los loci HLA de clase I y/o clase II y han
sido escogidas según su tipificación de manera que hubiera la máxima variedad de tipificaciones
posibles, tanto de muestras homocigotas como heterocigotas.
MÉTODOS GENERALES
Extracción de DNA
A todas las muestras se les realizó extracción de DNA por uno de los siguientes métodos:
QIAmp DNA Blood mini Kit QIAGEN (Qiagen GMBH, Hilden, Germany):
El DNA, liberado por lisis celular, es adsorbido en la membrana de la columna. Los
lavados posteriores de la misma eliminan los posibles contaminantes. El DNA purificado
se eluye de forma concentrada.
Kit de purificación de DNA Maxwell (Promega®, Madison, USA):
El DNA, liberado por lisis celular, se une a bolas magnéticas y mediante lavados
posteriores de la muestra se eliminan los posibles contaminantes. Finalmente
obtenemos el DNA purificado de alta calidad.
Kit QIAsymphony DSP AXpH DNA (Qiagen GMBH, Hilden, Germany):
Igual que en el método anterior, el DNA, liberado por lisis celular, se une a bolas
magnéticas y mediante lavados posteriores de la muestra se eliminan los posibles
contaminantes, obteniendo así el DNA purificado.
Reacciones de PCR a tiempo real
Las reacciones de RT-PCR se han realizado en un LightCycler® 480 (Roche, Mannheim, Germany)
combinando la amplificación con primers locus-específicos (amplifican de manera general todos
los alelos de un mismo locus) o alelo-específicos (amplifican alelos o grupos de alelos concretos)
con la detección mediante sondas específicas marcadas con fluorocromos. Las sondas utilizadas
para el tipaje del locus A del sistema HLA así como para la determinación de los alelos HLA o
polimorfismos en otros genes asociados a GD (PTPN22) han sido sondas FRET, sin embargo para
estudiar la presencia del alelo HLA-DQB1*02 (asociado a CD) en homocigosis o heterocigosis y el
34 Material y métodos
polimorfismo en CTLA4 relacionado con GD se han utilizado sondas Taqman®. El volumen final
de las reacciones ha sido 10 μl.
Diseño de primers
Se obtuvieron las secuencias de los diferentes alelos HLA-A, B, C y DQB1 a partir de la base de
datos http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ [122], se alinearon con el fin de localizar las zonas
comunes donde colocar los primers que amplificaran la región a estudio y no amplificaran
secuencias no interesadas de otros loci, con el fin de evitar amplificaciones inespecíficas, debido
a su similitud.
Para valorar la tendencia que tienen los primers a formar dímeros entre sí se utilizó el programa
OligoTM de Medprobe y para calcular la temperatura teórica de fusión se utilizó la aplicación
meltcalc99free.xlm® [123].
Diseño de sondas
A partir de la alineación de las secuencias de los diferentes alelos, se han valorado las zonas de
mayor variabilidad definiendo para cada grupo de alelos aquellas secuencias más específicas,
donde colocar las sondas que nos permitan discriminar unos alelos de otros.
Para el diseño de sondas FRET se han tenido en cuenta los siguientes factores:
La familia alélica o alelo que queremos discriminar con la sonda. Para ello deberemos
diseñar la sonda en cuestión de tal manera que se una a una zona que sea diferente en
esa familia al resto de familias alélicas.
La longitud de las sondas (anchor y sensor) debe ser en torno a 18-20 bases.
La separación entre ambas sondas en la secuencia molde no debe superar las 5 bases, ya
que el proceso de transferencia de energía es dependiente de la distancia a la que estén
situadas ambas.
La sonda anchor debe tener un mínimo de 3-5 ºC de temperatura de fusión más que la
sonda sensor.
Las no-complementariedades que presenta esa familia alélica respecto al resto de
familias deben quedar lo más centradas posible.
Debemos evitar que entre ambas sondas queden nucleótidos de guanosina, sobre todo
en la cadena donde hibridará la fluoresceína ya que disminuyen la señal.
Debemos tener en cuenta la tendencia que tienen las sondas de formar dímeros con
ellas mismas, con la otra sonda o con los primers utilizados en la amplificación.
Se deben bloquear los extremos 3’, si no llevan marcaje, con un grupo fosfato, para
evitar amplificaciones inespecíficas.
Para valorar la tendencia que tienen las sondas para generar artefactos entre sí, al igual que
pasa con los primers, se utilizó el programa OligoTM de Medprobe y se utilizó la aplicación
meltcalc99free.xlm® para calcular la temperatura de melting (Tm) de cada una de las sondas, así
35 Material y métodos
como para calcular la temperatura teórica de fusión obtenida de todas las hibridaciones
incompatibles diferentes.
Las sondas fueron compradas a TIB MOLBIOL (Berlín, Germany), OPERON Biotechnologies
(Cologne, Germany) y SIGMA-ALDRICH (St. Louis, USA).
Parámetros a tener en cuenta en cada reacción
Para establecer las condiciones óptimas de reacción de cada una de las sondas se ha realizado,
con cada una de ellas, una primera RT-PCR en la que se ha probado distintas concentraciones
asimétricas [124] de primers teniendo en cuenta la orientación (sentido o sense o antisentido o
antisense) de la sonda a estudio y diferentes concentraciones de MgCl2. Por ejemplo, si la sonda
tiene orientación sense será necesario poner más concentración del primer antisense y
viceversa.
En aquellos casos en los cuales sea posible combinar sondas diferentes (multiplicidad de sondas)
una vez optimizadas éstas de manera aislada, se ensaya la validez del uso simultáneo (en un
mismo tubo) de aquellas con condiciones de PCR similares, [125] para ello se ha tenido en
cuenta:
Que estén situadas en el mismo exón y así solo será necesario una amplificación.
Que tengan la misma orientación (sense o antisense), ya que de ello dependerá la
concentración de los primers a utilizar.
Que estén lo más separadas posible en su localización dentro del exón, para que no haya
problemas en la unión de las sondas al DNA.
Que estén marcadas con fluorocromos distintos, para que seamos capaces de
visualizarlas en canales diferentes.
Una vez optimizado este paso, se han añadido los primers y sondas necesarios para detectar el
gen de la beta-globina (control de amplificación). A veces al realizar estas reacciones múltiples
ha sido necesario realizar pequeños ajustes en las concentraciones de los primers, sondas o el
MgCl2.
36 Material y métodos
BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA
Muestras
Se han utilizado muestras de pacientes (n=143) procedentes de los servicios de Pediatría o
Digestivo del Hospital Universitari Germans Trias i Pujol (HUGTiP), a los cuales se les ha
solicitado la determinación de HLA-DQ2/DQ8 asociado a CD. Aquellos pacientes que han
presentado un estudio serológico compatible con CD forman parte del grupo de enfermos
(n=57; 39.9%; Tabla 6) y aquellos que no han presentado un estudio serológico compatible
componen el grupo control (n=86; 60.1%).
Pacientes CD (n=57)
n %
Sexo
Hombre 20 35.09
Mujer 37 64.91
Edad al diagnóstico
Menor de 2 años 4 7.02
2-6 años 20 35.09
6-18 años 26 45.61
Mayor de 18 años 7 12.28
Tabla 6: características del grupo de pacientes con CD
Métodos
Primers y sondas utilizados
Los primers y sondas utilizados en la reacción del gen control (beta-globina) así como aquellos
utilizados en la genotipificación HLA-DQ2/DQ8 y en la evaluación de la dosis génica del alelo
HLA-DQB1*02 se muestran a continuación (Tablas 7, 8 y 9):
Reacción de la beta-globina
Primers Secuencia 5’-3’ Long
PCO3 ACACAACTGTGTTCACTAGC 20
PCO4 CAACTTCATCCACGTTCACC 20
Sondas Secuencia 5’-3’ Marcaje 5’ Marcaje 3’ Long
CT-Cy5 AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAA Cy5 Phosphat 29
CT-FL CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA FAM 35
Tabla 7: beta-globina; secuencias de los primers y sondas
37 Material y métodos
HLA-DQ2/DQ8
Sondas Secuencia 5'-3' Marcaje 5' Marcaje 3'
DQA5s TCATAACTCTCCTCAGCAGAA FAM Phosphat
DQA5a CCCCAGTGCTCCACCTTGC
LC-Red 640
R1a-640 CCACGTCGCTGTCGAAGC LC-Red 640 Phosphat
R1s TCACCGCCCGATACACC
FAM
Primers Secuencia 5'-3'
DQB1*02-03_F GACRGAGCGCGTGCGTCT
DQB1*02-03_R GCAAGGTCGTGCGGAGCT
DQA1*05_F TTCTTCAAGATCGTTACCTCACCC
DQA1*05_R CCCAGTGTTTCAGAAGAGGCTT
D354 CTGTTCCAGTACTCGGCGG
Tabla 8: HLA-DQ2/DQ8; secuencias de los primers (forward (F) y reverse (R)) y sondas (sensor (s) y anchor
(a))
Evaluación dosis génica alelo HLA-DQB1*02
Nombre Secuencia 5'-3' Modificaciones
Longitud 5' 3'
Reacción de la beta-globina
PCO3 ACACAACTGTGTTCACTAGC
20
PCO4 CAACTTCATCCACGTTCACC
20
Sonda bg CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA Hex TAMRA 35
Reacción HLA-DQB1*02
DQB1*02_ex1_F CAATTATGTCTTGGAAAAAGG
21
DQB1*02_ex1_R GAGCCTGTTCCCAGAGTA
18
Sonda_ex1 ACTGTGACCTTGATGCTGTCGAT Fam TAMRA 23
Reacción HLA no DQB1*02
Sense_no DQB1*02 GGCNGGCGGGAACTGGA
17
Antisense_3_no DQB1*02 TCGGTTATAGATGTRTCTGG
20
Sonda_no DQB1*02 TGTGCTACTTCACCAACGGGAC Fam TAMRA 22
Sonda_0601 TGTGCTACTTCACCAATGGGAC Fam TAMRA 22
Tabla 9: HLA-DQB1*02; secuencias de los primers (forward (F) o sense y reverse (R) o antisense) y sondas
La localización de los diferentes primers y sondas sobre la secuencia de los alelos HLA se
muestra en el anexo 1.
Condiciones óptimas de reacción
Protocolo de amplificación
Para el estudio del HLA-DQ2/DQ8 se ha definido un protocolo de amplificación que es el mismo
que se utiliza en la amplificación de las otras metodologías de tipificación HLA basadas en la RT-
38 Material y métodos
PCR en combinación con sondas FRET que se han desarrollado en el laboratorio. El protocolo de
amplificación establecido para todas las reacciones fue el siguiente (Tabla 10):
10 min de desnaturalización inicial y activación del enzima Taq (FastStart Taq DNA Polymerase;
Roche) a 95 ºC seguidos de 55 ciclos de amplificación. Cada ciclo de amplificación está
compuesto por 10 seg de desnaturalización a 95 ºC, 10 seg de hibridación a 62 ºC y 20 seg de
extensión a 72 ºC. Las curvas de fusión (o Melting) se generaron a 95 ºC para 0 seg, 75 ºC para
15 seg, 42 ºC 4 min y 80 ºC 0 seg seguidas de un paso de enfriamiento de 20 seg a 40 ºC.
PROTOCOLO LIGHTCYCLER® 480
DESNATURALIZACIÓN y ACTIVACIÓN Taq
95 ºC 10 min
CICLOS AMPLIFICACIÓN 55
95 ºC 10 seg
62 ºC 10 seg
72 ºC 20 seg
GENERACIÓN de CURVAS MELTING
95 ºC 0 seg
75 ºC 15 seg
42 ºC 4 min
ENFRIAMIENTO
40 ºC 20 seg
Tabla 10: HLA-DQ2/DQ8; protocolo de reacción
Para el estudio de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 se ha definido un protocolo de
amplificación que consta de los siguientes pasos (Tabla 11):
10 min de desnaturalización inicial y activación del enzima Taq (FastStart Taq DNA Polymerase;
Roche) a 95 ºC seguidos de 55 ciclos de amplificación. Cada ciclo de amplificación está
compuesto por 10 seg de desnaturalización a 95 ºC, 1 min de hibridación-extensión a 62 ºC.
Finalmente, un paso de enfriamiento de 30 seg a 40 ºC.
PROTOCOLO LIGHTCYCLER® 480
DESNATURALIZACIÓN y ACTIVACIÓN Taq
95 ºC 10 min
CICLOS AMPLIFICACIÓN 55
95 ºC 10 seg
62 ºC 1 min
ENFRIAMIENTO
40 ºC 30 seg
Tabla 11: HLA-DQB1*02; protocolo de reacción
39 Material y métodos
Concentraciones óptimas de reactivos
Se determinaron las concentraciones óptimas de cada reactivo utilizado en las reacciones
diseñadas, con muestras previamente tipadas con otros métodos. Las concentraciones de uso
así como el volumen (µl) necesario de cada reactivo se muestran a continuación (Tablas 12 y 13):
Reactivos Reacción 1 Reacción 2 Reacción 3
PCO3 (10 µM) 0.2 0.2 0.4
PCO4 (10 µM) 0.3 1.6 0.4
Sonda bg anchor (10 µM) 0.2 0.2 0.2
Sonda bg sensor (10 µM) 0.2 0.2 0.2
DQB1*02-03_F (10 µM) 0.5 . 1.6
DQB1*02-03_R (10 µM) 0.1 . .
DQA1*05_F (10 µM) - 0.4 .
DQA1*05_R (10 µM) - 0.1 .
D354 (10 µM) - - 0.3
DQA5s (10 µM) - 0.2 -
DQA5a (10 µM) - 0.2 -
R1a-640 (10 µM) 0.2 - 0.2
R1s (10 µM) 0.2 - 0.2
Buffer (10x) 1 1 1
MgCl2 (25 mM) 0.8 0.6 0.6
dNTPs (10 µM) 0.2 0.2 0.2
Taq FastStart (5 U/µl) 0.1 0.1 0.1
Betaine (10x) - - 0.5
Agua 5.0 4.0 3.1
DNA a estudio 1.0 1.0 1.0
Tabla 12: HLA-DQ2/DQ8; concentraciones óptimas de los reactivos
40 Material y métodos
Reacción HLA-DQB1*02 Reacción HLA no DQB1*02
Reactivos (concentración) µl
Reactivos (concentración) µl
PCO3 (10 µM) 0.5 PCO3 (10 µM) 0.15
PCO4 (10 µM) 0.5 PCO4 (10 µM) 0.15
Sonda bg (10 µM) 0.2 Sonda bg (10 µM) 0.2
DQB1*02_ex1_F (10 µM) 0.5 Sense_no DQB1*02 (10 µM) 0.75
DQB1*02_ex1_R (10 µM) 0.5 Antisense_3_no DQB1*02 (10 µM) 0.75
Sonda_ex1 (10 µM) 0.3 Sonda_no DQB1*02 (10 µM) 0.15
Buffer (10x) 1 Sonda_0601 (10 µM) 0.15
MgCl2 (25 mM) 0.8 Buffer (10x) 1
dNTPs (10 µM) 0.2 MgCl2 (25 mM) 1.2
Taq FastStart (5 U/µl) 0.2 dNTPs (10 µM) 0.2
Agua 3.3 Taq FastStart (5 U/µl) 0.2
DNA a estudio 1.0 GC_Rich Sol (5x) 2
Agua 1.1
DNA a estudio 1.0
Tabla 13: HLA-DQB1*02; concentraciones óptimas de los reactivos
A continuación se muestran ejemplos de estas reacciones (Figuras 7 y 8):
Reacción 1 Reacción 2
Reacción 3 Beta-globina
Figura 7: ejemplo de las reacciones para la genotipificación HLA-DQ2/DQ8 asociado a CD (reacciones 1, 2,
3 y beta-globina)
41 Material y métodos
Reacción HLA-DQB1*02 Reacción HLA no DQB1*02
Beta-globina Beta-globina
Figura 8: ejemplo de las reacciones para la determinación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02, así
como la reacción de la beta-globina
Determinación de Ac asociados a la Enfermedad Celiaca
La determinación de Ac relacionados con CD se realizó siguiendo el algoritmo de la Figura 1.
En primer lugar se determinó si el paciente presentaba niveles de IgA >20 mg/dl por
nefelometría (Siemens, Munich, Germany) y según esto se realizó el estudio correspondiente de
Ac IgA (si IgA >20 mg/dl) o IgG (si IgA <20 mg/dl). La determinación de Ac anti-Tg y anti-DGP se
realizó por ELISA (Orgentec, Mainz, Germany) considerándose un resultado positivo cuando los
valores de estos fueron >10 U/mL y >12 U/mL respectivamente. Por otro lado, la determinación
de Ac anti-EMA ha sido realizada mediante IFI sobre esófago de mono (Movaco, Barcelona,
España) y en este caso el resultado se ha informado como positivo o negativo.
Realización de biopsia intestinal
En 37 de los 57 pacientes (64.9%) se dispone de datos correspondientes a la biopsia intestinal.
Para el estudio de estas biopsias de intestino delgado se ha realizado una tinción
hematoxilina/eosina para ver si hay atrofia de las vellosidades intestinales así como una tinción
inmunohistoquímica con Ac monoclonal anti-CD3 para ver la presencia del infiltrado linfocitario.
La evaluación histológica de estos pacientes se muestra a continuación (Tabla 14) según la
clasificación de Marsh:
42 Material y métodos
Datos biopsia intestinal
Nº pacientes (%)
Pacientes sin datos 20 (35.1%)
Pacientes con datos 37 (64.9%)
Marsh 0 1 (1.8%)
Marsh 1 4 (7.0%)
Marsh 2 0 (0%)
Marsh 3 32 (56.1%)
3 sin especificar 4 (7.0%)
3A 1 (1.8%)
3B 11 (19.3%)
3C 16 (28.0%)
Tabla 14: datos obtenidos en la biopsia intestinal [13]
43 Material y métodos
BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES
Muestras
Se han utilizado muestras de pacientes con GD (n=175) y como grupo control se han utilizado
muestras del banco de cordón (n=152) seleccionadas al azar. Las muestras de pacientes con GD
provienen de los servicios de Endocrinología del HUGTiP y del Hospital Josep Trueta (de Girona).
Métodos
Primers y sondas utilizados
Las secuencias de los primers y sondas utilizados en la reacción del gen de la beta-globina
(control interno) son los mismos que los utilizados para el tipaje de HLA-DQ2/DQ8 asociado con
CD (Tabla 7), sin embargo aquellos utilizados en las reacciones para el tipaje de alelos HLA de
clase I y de los polimorfismos de PTPN22 y CTLA4 relacionados con GD se muestran a
continuación (Tablas 15 y 16):
Reacciones de alelos HLA asociados con enfermedad de Graves
Alelo Nombre Secuencia 5'-3' Modificaciones
Pos Long Producto 5' 3'
HLA-B*08
F_B08 CCACTCCATGAGGTATTTCG - - 490 20 179
R_B08 CGGTCAGTCTGTGTGTTGGT - - 689 20
P18s CGAGTCCGAGAGAGGAGCC Fam PH 606 19 -
P1a TGAGGTTCGACAGCGACGCC - LC Red 640 585 20 -
HLA-B*44
p127 GGAGCCCCGCTTCATCA - - 539 17 235
A25_44as TACGTGGGGGATGGGGA - - 591 17
P18s CGAGTCCGAGAGAGGAGCC Fam PH 607 19 -
P1a TGAGGTTCGACAGCGACGCC - LC Red 640 586 20 -
p127 GGAGCCCCGCTTCATCA - - 539 17 235
A25_44as TACGTGGGGGATGGGGA - - 591 17
P20s GGAACCTGCGCGGCTACTACAACCA - Fam 721 25 -
P20a AGCGAGGCCGGTGAGTGACCCCGG LC Red 640 PH 747 24 -
HLA-C*03
F_C03 ATCGCCCTGAACGAGGAT - - 1100 18 129
R_C03 GCGTCTCCTTCCCATTCTT - - 1247 19
S_C03s CTGGAGGGCCTGTGCGTG LC Red 640 PH 1208 18 -
S_C03a GGCGGAGCAGCTGAGAGCCTA - Fam 1186 21 -
HLA-C*07
F_C07 GCGGGGCTCGGGGGACT - - 962 17 193
R_C07 CGCACGGGCCGCCTCCA - - 1172 17
S_C7/16s CGGACACCGCGGCTCAGAT LC Red 640 PH 1139 19 -
S_C7/16a GACCTGCGCTCCTGGACCGCC - Fam 1117 21 -
HLA-C*16
F_C16 GTCTCACACCCTCCAGT - - 1004 17 177
R_C16 CTCCAGGTAGGCTCTCT - - 1198 17
S_C7/16s CGGACACCGCGGCTCAGAT LC Red 640 PH 1138 19 -
S_C7/16a GACCTGCGCTCCTGGACCGCC - Fam 1116 21 -
Tabla 15: secuencias y posición de los primers (forward (F) y reverse (R)) y sondas (S) (sensor (s) y anchor
(a)) utilizados en las reacciones de los diferentes alelos HLA de clase I asociados a GD
44 Material y métodos
La localización de los diferentes primers y sondas en la secuencia de los alelos HLA-B y HLA-C se
muestra en el anexo 2.
Primers Secuencia 5'-3'
2476601_F CCTCAAACTCAAGGCTC
2476601_R CCTTTGGATTGTTCTAATTAAC
231775_F GGTTTTGCTCTACTTCCTG
231775_R AGTCTCACTCACCTTTGCA
Sondas Secuencia 5'-3'
(orientación antisense)
Modificaciones
5' 3'
2476601_a AATCATTTATTGTGGTTGAGGAAGCT Cy-5 Ph
2476601_s ACTTCCTGTACGGACACCT FAM
231775_wt tccTggTagCcaGgttc FAM BHQ1
231775_mut tccTggCagCcaGgttc HEX BHQ1
Tabla 16: secuencias de los primers (forward (F) y reverse (R)) y sondas FRET (sensor (s) y anchor (a)) o
Taqman® (con secuencia complementaria al alelo normal (wt) y secuencia complementaria al alelo
mutado (mut)) utilizados en las reacciones de los polimorfismos rs2476601 y rs231775 asociados a GD
Condiciones óptimas de reacción
Protocolo de amplificación
El protocolo de amplificación utilizado para el tipaje de alelos HLA asociados con GD es el mismo
que el utilizado para el tipaje HLA-DQ2/DQ8 asociado a CD (Tabla 9). Para la determinación del
polimorfismo rs2476601 el protocolo es ligeramente diferente, siendo en este caso la
temperatura de hibridación a 58ºC (Tabla 17):
PROTOCOLO LIGHTCYCLER® 480
DESNATURALIZACIÓN y ACTIVACIÓN Taq
95 ºC 10 min
CICLOS AMPLIFICACIÓN 55
95 ºC 10 seg
58 ºC 10 seg
72 ºC 20 seg
GENERACIÓN de CURVAS MELTING
95 ºC 0 seg
75 ºC 15 seg
42 ºC 4 min
ENFRIAMIENTO
40 ºC 20 seg
Tabla 17: polimorfismo rs2476601; protocolo de reacción
45 Material y métodos
En el caso del polimorfismo rs231775, la reacción utiliza el mismo protocolo que el empleado
para la reacción del HLA-DQB1*02 (Tabla 11).
Concentraciones óptimas de reactivos
Previamente al tipaje de muestras de pacientes con GD, se determinaron las concentraciones
óptimas de cada reactivo utilizado en las reacciones diseñadas, con muestras previamente
tipadas con otros métodos. Las concentraciones de uso así como el volumen (µl) necesario de
cada reactivo se muestran a continuación:
B*08 B*44_1 B*44_2 C*03 C*07 C*16
[] final Vol [] final Vol [] final Vol [] final Vol [] final Vol [] final Vol
Beta-globina Beta-globina
PCO3 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.5 μM 0.5 μl 0.4 μM 0.4 μl PCO3 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl
PCO4 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.5 μM 0.5 μl 0.4 μM 0.4 μl PCO4 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl
CT-Fluos (10 μM) 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl CT-Fluos (10 μM) 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl
CT-LC (10 μM) 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl CT-LC (10 μM) 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl 0.1 μM 0.1 μl
Primers Primers
F_08 / p127 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl F_03 / 07 / 16 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl
R_08 / A25_44as (10 μM) 2.4 μM 2.4 μl 2.0 μM 2.0 μl 2.0 μM 2.0 μl R_03 / 07 / 16 (10 μM) 1.0 μM 1.0 μl 1.2 μM 1.2 μl 1.0 μM 1.0 μl
Sondas Sondas
P1a / P20a (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl S_03 / 07 / 16 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl
P18s / P20s (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl A_03 / 07 / 16 (10 μM) 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl 0.2 μM 0.2 μl
Master Mix Master Mix
Buffer (10x) 1x 1.0 μl 1x 1.0 μl 1x 1.0 μl Buffer (10x) 1x 1.0 μl 1x 1.0 μl 1x 1.0 μl
MgCl2 (25 mM) 2 mM 0.8 μl 2 mM 0.8 μl 3 mM 1.2 μl MgCl2 (25 mM) 2 mM 0.8 μl 2 mM 0.8 μl 2 mM 0.8 μl
dNTPs (10 μM) 2 μM 0.2 μl 2 μM 0.2 μl 2 μM 0.2 μl dNTPs (10 μM) 2 μM 0.2 μl 2 μM 0.2 μl 2 μM 0.2 μl
Taq (5 U/ μl) 1 U/μl 0.2 μl 1 U/μl 0.2 μl 1 U/μl 0.2 μl Taq (5 U/ μl) 1 U/μl 0.2 μl 1 U/μl 0.2 μl 1 U/μl 0.2 μl
DMSO (100%) 3% 0.3 μl - - 2% 0.2 μl Agua - 4.4 μl - 4.4 μl - 4.6 μl
GC Rich (5x) - - 1x 2.0 μl - - DNA a estudio - 1.0 μl - 1.0 μl - 1.0 μl
Agua - 2.9 μl - 1.0 μl - 2.6 μl
DNA a estudio - 1.0 μl - 1.0 μl - 1.0 μl
Tabla 18: concentraciones óptimas de los reactivos utilizados en cada reacción para el tipaje de alelos HLA
de clase I
Reacción rs2476601 Reacción rs231775
Reactivos (concentración) µl
Reactivos (concentración) µl
2476601_F (10 µM) 1.0 231775_F (10 µM) 0.5
2476601_R (10 µM) 0.1 231775_R (10 µM) 0.5
2476601_a (10 µM) 0.2 231775_wt (10 µM) 0.2
2476601_s (10 µM) 0.2 231775_mut (10 µM) 0.2
Buffer + MgCl2 (10x) 1.0 Buffer + MgCl2 (10x) 1.0
dNTPs (10 µM) 0.2 dNTPs (10 µM) 0.2
Taq FastStart (5 U/µl) 0.1 Taq FastStart (5 U/µl) 0.2
Agua 6.2 Agua 6.2
DNA a estudio 1.0 DNA a estudio 1.0
Tabla 19: polimorfismos de PTPN22 y CTLA4: concentraciones óptimas de los reactivos
46 Material y métodos
A continuación se muestran ejemplos de estas reacciones:
HLA-B*08 HLA-B*44
Reacciones HLA-B relacionados con Graves
Reacción de la Beta-Globina
HLA-C*03 HLA-C*07 HLA-C*16
Reacciones HLA-C relacionados con Graves
Reacción de la Beta-Globina
Figura 14: ejemplo de las reacciones para el tipaje de los alelos HLA de clase I relacionados con la GD. La
interpretación de los resultados obtenidos según la Tm en cada una de las reacciones se muestra en el
anexo 2
47 Material y métodos
Figura 15: ejemplo de las reacciones para la determinación del polimorfismo rs2476601 (PTPN22); a)
corresponde a la amplificación y b) a las curvas de melting (Tm=59ºC para el alelo G y Tm=49ºC para el
alelo A). En rosa están aquellas muestras homocigotas para el alelo A, en negro aquellas homocigotas para
el alelo G y en azul las heterocigotas AG
Figura 16: ejemplo de las reacciones para la determinación del polimorfismo rs231775 (CTLA4); a)
corresponde a la sonda complementaria a la secuencia WT (wt) y b) corresponde a la sonda
complementaria a la secuencia con el cambio (mut). En rojo están aquellas muestras homocigotas para el
alelo A, en verde aquellas homocigotas para el alelo G y en azul las heterocigotas AG
48 Material y métodos
DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO REAL
Muestras
Para la validación de este método de tipificación del locus A del sistema HLA se han empleado
45 muestras previamente tipadas por alta resolución (PCR-SBT) seleccionadas al azar.
Métodos
Primers y sondas utilizados
Hemos diseñado 2 parejas diferentes de primers (Tabla 20), unos para lograr la amplificación del
exón 2 (Sv2 y As-gral) y otros para amplificar el exón 3 (Intrón 2_forward e Intrón 3_reverse) del
locus A del sistema HLA. Cada pareja amplifica específicamente dichos exones de todos los
alelos HLA-A.
Los primers diseñados se pueden utilizar de forma conjunta con los primers que amplifican el
gen de la beta-globina, que es el gen que se ha utilizado como control interno de la reacción de
PCR (Tabla 7). Como consecuencia, en cada reacción tienen lugar 2 amplificaciones diferentes.
PRIMERS SECUENCIA LONGITUD ORIENTACIÓN EXÓN
Sv2 5' CSGCCTCTGYGGGGAGA 3' 17 SENTIDO 2
As-gral 5' TCTCGGACCCGGAGACTGT 3' 19 ANTISENTIDO 2
Intrón 2_forward 5' CGAGACCCTTGHCCCGG 3' 17 SENTIDO 3
Intrón 3_reverse 5' CCTCTCCCTCAGGACCAG 3' 18 ANTISENTIDO 3
Tabla 20: secuencias de los primers utilizados para la amplificación general de los exones 2 y 3 del HLA-A
En dos de las reacciones se han utilizado dos primers antisense específicos de secuencia que se
han combinado con el primer forward del exón 3. Las secuencias de estos primers específicos se
muestran a continuación (Tabla 21):
PRIMERS SECUENCIA LONGITUD ORIENTACIÓN EXÓN
SSP_66_CG GAGCCCGTCCACGCACCG 18 ANTISENTIDO 3
SSP_66_AC GAGCCACTCCACGCACCG 18 ANTISENTIDO 3
Tabla 21: secuencias de los primers específicos de secuencia
Para el diseño de las sondas, primero se localizaron dentro de cada exón aquellas regiones que
eran más polimórficas y en base a estas regiones se determinaron aquellas que permitían
diferenciar unas familias alélicas de otras.
En estas “regiones propias de familia alélica” se diseñaron 10 pares de sondas FRET (Tabla 22), 4
parejas situadas en el exón 2 y 6 parejas en el exón 3 del locus A del sistema HLA.
49 Material y métodos
SONDA SECUENCIA LONGITUD MARCAJE ORIENTACIÓN EXÓN POSICIÓN*
S2a 5' GCAGGAGGGGCCGGAGTA 3'-M 18 Fluoresceína SENTIDO 2 361-378
S2s M-5' TGGGACCGGAACACACGGA 3'-P 19 LC-Red 640 SENTIDO 2 380-398
S3a M-5' ACAACCAGAGCGAGGCCGGTG 3'-P 21 Fluoresceína SENTIDO 2 456-476
S3s 5' GGATCCGCGCTCCGCTAC 3'-M 17 LC-Red 640 SENTIDO 2 438-454
S240a 5’ GCGCCGTGGATAGAGCAGG 3’-M 19 LC-Red 610 SENTIDO 2 347-365
S240s M-5’ GAGGCCTGAGTATTGGGAC 3’-P 19 Fluoresceína SENTIDO 2 367-385
S9a M-5' CGGCGTCGCTGTCGAACC 3'-P 18 LC-Red 610 ANTISENTIDO 2 306-323
S9s 5' GCTCCATCTTCTGGCTG 3'-M 17 Fluoresceína ANTISENTIDO 2 325-341
S350_a 5’ GACCCCACGTCGCAGCCATACAT 3’-M 23 Fluoresceína ANTISENTIDO 3 735-757
S350_s M-5’ TCTGGACGGTGTGAGAACC 3’-P 19 LC-Red 610 ANTISENTIDO 3 714-732
S5a 5' TTCAGGGCGATGTAATCCTTGCCGT 3'-M 25 Fluoresceína ANTISENTIDO 3 799-823
S5s M-5' GTAGGCGTACTGGTGGTACCCG 3'-P 22 LC-Red 640 ANTISENTIDO 3 776-797
S5a 5' TTCAGGGCGATGTAATCCTTGCCGT 3'-M 25 Fluoresceína ANTISENTIDO 3 799-823
S5_30s M-5' GTAGGCGTGCTGTTCATACCC 3'-P 21 LC-Red 640 ANTISENTIDO 3 777-797
S14a 5' TTGGACCGCGGCGGACATGGC 3'-M 21 Fluoresceína SENTIDO 3 839-859
S14s M-5' CTCAGATCACCCAGCGCAAG 3'-P 20 LC-Red 610 SENTIDO 3 862-880
S570a M-5’ CAGATACCTGGAGAACGGGAAGGA 3’-P 24 Fluoresceína SENTIDO 3 950-973
S570s 5’ GTGCGTGGAGTGGCTCC 3’-M 17 LC-Red-640 SENTIDO 3 932-948
S540a M-5’ CGGAGCAGCAGAGAGCCTA 3’-P 19 LC-Red 610 SENTIDO 3 901-919
S540s 5’ GCGCAAGTGAGAGGCGGCCCATG 3’-M 23 Fluoresceína SENTIDO 3 875-897
Tabla 22: secuencias de las sondas utilizadas para el tipaje de los alelos HLA-A
La localización de los diferentes primers y sondas sobre la secuencia de los alelos HLA-A se
muestra en el anexo 3.
Condiciones óptimas de reacción
Protocolo de amplificación
El protocolo de amplificación es el mismo que el utilizado para el tipaje de otros alelos HLA
(Tabla 9).
Concentraciones óptimas de reactivos
Se determinaron las concentraciones óptimas de cada reactivo utilizado en las reacciones
diseñadas, con muestras previamente tipadas con otros métodos. Las concentraciones de uso
así como el volumen (µl) utilizado de cada reactivo para cada una de las reacciones se muestran
a continuación (Tabla 23):
50 Material y métodos
Reactivos TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7 TUBO 8 TUBO 9
PCO3 (10 μM) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
PCO4 (10 μM) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
CT-Cy5 (10 μM) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
CT-FL (10 μM) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Sv2 (10 μM) 0.1 0.1 1.0 - - - - - -
As-gral (10 μM) 1.4 1.0 0.1 - - - - - -
Intrón 2_forward (10 μM) - - - 1.0 0.2 0.2 0.1 0.8 1.5
Intrón 3_reverse (10 μM) - - - 0.1 - - 1.0 0.2 0.5
SSP_66_CG (10 μM) - - - - 0.8 - - - -
SSP_66_AC (10 μM) - - - - - 1.0 - - -
S2a (10 μM) 0.2 - - - - - - - -
S2s (10 μM) 0.2 - - - - - - - -
S3a (10 μM) - 0.2 - - - - - - -
S3s (10 μM) - 0.2 - - - - - - -
S240a (10 μM) - 0.2 - - - - - - -
S240s (10 μM) - 0.2 - - - - - - -
S9a (10 μM) - - 0.2 - - - - - -
S9s (10 μM) - - 0.2 - - - - - -
S350_a (10 μM) - - - - - - - 0.2 -
S350_s (10 μM) - - - - - - - 0.2 -
S5a (10 μM) - - - 0.2 - - - 0.2 -
S5s (10 μM) - - - 0.2 - - - - -
S5_30s (10 μM) - - - - - - - 0.2 -
S14a (10 μM) - - - - 0.2 0.2 - - -
S14s (10 μM) - - - - 0.2 0.2 - - -
S570a (10 μM) - - - - - - 0.2 - -
S570s (10 μM) - - - - - - 0.2 - -
S540a (10 μM) - - - - - - - - 0.2
S540s (10 μM) - - - - - - - - 0.2
Buffer (5x) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
MgCl2 (25 mM) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
dNTPs (10 μM) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Taq (5U/μl) 0.1 0.2 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua 3.4 3.3 3.7 3.7 3.9 3.6 3.7 3.4 2.8
DNA a estudio 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Tabla 23: concentraciones óptimas de los reactivos utilizados en cada reacción
51 Material y métodos
A continuación se muestran ejemplos de estas reacciones:
TUBO 1 - S2 TUBO 2 - S240
TUBO 8 - S5.30 Beta-globina
Tm 60 ºCTm 64 ºC
Tm 64 ºC
Figura 16: ejemplo de algunas de las reacciones para el tipaje del locus A del sistema HLA, remarcando
aquellas temperaturas de melting que son informativas
Análisis de las confusiones
Con el objetivo de predecir los resultados de tipificación ambiguos obtenidos, en muestras
heterocigotas para alelos HLA-A, con nuestro método de tipificación, se ha utilizado el software
Polygene 2.0, desarrollado previamente por miembros del grupo, que permite el análisis de las
diferentes Tm de cada sonda. Para ello se codificaron los diferentes resultados de Tm de cada
una de las sondas y para cada uno de los alelos en una tabla teórica en código binario, donde 1
significaba positivo y 0 negativo. El número codificado obtenido para cada alelo se analizó
mediante dicho software, que compara todos los posibles pares de resultados de tipificación
predichos para los alelos conocidos de HLA-A. Además se incluye en este análisis la frecuencia
de cada alelo (calculada como media de todos los datos conocidos sobre este alelo en la
población caucasoide; http://www.allelefrequencies.net). Y finalmente se determina qué
combinaciones de alelos generarán resultados ambiguos (cuando coexisten en una muestra
heterocigota) así como la frecuencia de cada combinación alélica.
52 Resultados
RESULTADOS
RESULTADO 1_BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA
Determinación del genotipo HLA asociado a Celiaquía mediante PCR a tiempo real
Se han diseñado, puesto a punto y validado las reacciones necesarias para poder determinar por
un lado la tipificación HLA-DQ2/DQ8 y por otro la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 (presencia
de éste en homocigosis o heterocigosis) en muestras de DNA genómico. Esta metodología se ha
implementado como técnica de uso rutinario en la tipificación de alelos HLA asociados con CD,
en nuestro laboratorio.
Tipificación HLA-DQ2/DQ8
Para la genotipificación de HLA-DQ2/DQ8 por RT-PCR con sondas de hibridación FRET, se han
diseñado, optimizado y validado 3 reacciones que permiten determinar la presencia de los alelos
HLA-DQA1*05, HLA-DQB1*02 (DQ2) y HLA-DQB1*03:02 (DQ8). En el apartado de métodos se ha
descrito el protocolo optimizado, que ha sido validado en 90 muestras que fueron tipificadas en
paralelo mediante PCR-SSP, obteniendo un 100% de concordancia en los resultados. Desde su
implementación en el laboratorio de HLA LIRAD, en el año 2008, este protocolo se ha utilizado
en la genotipificación de más de 5.000 muestras. De esta manera, con este protocolo de 3
reacciones, tendremos la siguiente interpretación de resultados:
Reacción 1 Reacción 2 Reacción 3
Resultado DQB1*02 DQB1*03 DQA1*05 DQB1*03:02
HLA-DQ2 + + +/- + -
HLA-DQ8 + +/- + - +
HLA-DQ2/DQ8 + + + + +
HLA-DQB1*02 + +/- - -
HLA-DQ2/DQ8 - - +/- + -
- +/- - -
Tabla 24: interpretación de las reacciones para la genotipificación HLA-DQ2/DQ8. En la reacción 1 existen
2 Tm diferentes (Tm1 para aquellas muestras que sean DQB1*02 o Tm2 para muestras DQB1*03)
Dosis génica HLA-DQB1*02
Para evaluar la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 se han diseñado 2 reacciones de RT-PCR en
combinación con sondas de hibridación Taqman® (Tabla 25). La primera reacción se utiliza para
ver si hay o no presencia del alelo HLA-DQB1*02 y la segunda para ver si hay presencia de otro
alelo HLA-DQB1 (distinto del HLA-DQB1*02). Los primers y sondas utilizados así como el
protocolo de amplificación han sido descritos en el apartado de la metodología. De esta manera,
con estas 2 reacciones, tenemos lo siguiente:
53 Resultados
Reacciones
Resultado (1) HLA-DQB1*02 (2) HLA no DQB1*02
HLA-DQB1*02 homocigosis + -
HLA DQB1*02 heterocigosis + +
Tabla 25: interpretación de las reacciones para el estudio de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02.
Aquellas muestras positivas para las reacciones (1) y (2) serán heterocigotas para el alelo HLA-DQB1*02,
mientras que aquellas que solo den señal en la reacción (1), serán homocigotas para el mismo
En todas estas reacciones la amplificación de los diferentes alelos HLA asociados con CD ocurre
de forma conjunta a la amplificación del gen de la beta-globina (control interno). Como
consecuencia, en cada reacción tienen lugar 2 amplificaciones diferentes.
Informatividad de los marcadores HLA en el estudio de sospecha de la Enfermedad Celiaca
En el periodo de tiempo comprendido entre junio de 2008 y diciembre de 2011 fueron
solicitados desde el HUGTiP un total de 143 estudios de HLA asociado a CD (HLA-DQ2/DQ8).
Todos los estudios correspondían a individuos con sospecha de CD pero en los cuales se
desconocía el diagnóstico definitivo. Todos ellos han sido analizados mediante la metodología
de tipificación aquí descrita.
HLA-DQ2/DQ8
En relación al estudio de genotipificación HLA-DQ2/DQ8, los resultados obtenidos para estos
143 pacientes fueron los siguientes: 76 (53.2%) pacientes HLA-DQ2 positivo, 18 (12.6%) HLA-
DQ8 positivo, 4 (2.8%) HLA-DQ2/DQ8 positivo y 45 (31.4%) HLA-DQ2/DQ8 negativo, 17 de estos
últimos presentaron el alelo HLA-DQB1*02 (Tabla 26).
HLA-DQA1*05 + - + - + - - +
HLA-DQB1*02 + + - - + + - -
HLA-DQB1*0302 - + + + + - - -
Resultado final DQ2 + DQ2/DQ8 + DQB1*02
Pacientes 76 (53.1%) 4 (2.8%) 17 (11.9%)
DQ2/DQ8 -
28 (19.6%)
HLA como biomarcador en CD
DQ8+
18 (12.6%)
Tabla 26: resultados de HLA-DQ2/DQ8 obtenidos en nuestro grupo de pacientes con sospecha de CD
De estos 143 estudios, 57 (39.9%) pacientes presentaron un estudio serológico (tal y como se ha
descrito en el apartado de material y métodos) compatible con CD. Finalmente desde el punto
de vista clínico 44 de ellos fueron diagnosticados de CD, 4 con un resultado de Ac anti-Tg2 <40
U/ml y biopsia normal o con grado Marsh 1 fueron considerados dudosos, 2 pacientes a los que
se les realizó el estudio por debut diabético no dispusieron de datos de biopsia y de 7 no se
dispuso de datos clínicos.
54 Resultados
Los resultados de HLA-DQ2/DQ8 obtenidos para estos 57 pacientes fueron:
47 HLA-DQ2 positivos, 6 HLA-DQ8 positivos, 3 HLA-DQ2/DQ8 positivos, sólo hubo un caso de un
paciente diagnosticado de CD (estudio serológico claramente positivo y biopsia con atrofia
vellositaria severa Marsh 3) que presentó un estudio HLA-DQ2/DQ8 negativo. No obstante,
tenía presencia del alelo HLA-DQB1*02.
Con todos estos datos se ha calculado la sensibilidad, especificidad y los valores predictivos para
la determinación de HLA-DQ2/DQ8 (Figura 18) en nuestra población. En concordancia a lo
descrito en la literatura, en nuestro grupo de pacientes también se cumple que el VPN de este
biomarcador para el estudio de la CD es altamente informativo.
Celiaquía
DQ2/DQ8 SI NO
SI 56 42 98
NO 1 44 45
57 86
Sensibilidad 98,25%
Especificidad 51,16%
VPP 57,14%
VPN 97,78%
Figura 18: tabla de contingencia 2x2 para el estudio HLA-DQ2/DQ8 en relación con la CD
HLA-DQB1*02
En relación al estudio de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02, a todos los individuos incluidos
en el estudio (con estudio serológico compatible o no) que presentaron este alelo HLA (n=100;
54 con estudio serológico compatible y 46 con estudio serológico no compatible) se les
realizaron las reacciones de RT-PCR para ver si lo presentaban en homocigosis o en
heterocigosis.
Los resultados obtenidos para cada una de las muestras se encuentran en el anexo 1. Se
compararon los resultados obtenidos de los pacientes con estudio serológico compatible o no
con CD con un grupo control.
La frecuencia del alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o heterocigosis para cada uno de los
grupos se muestra a continuación:
55 Resultados
Frecuencia HLA-DQB1*02
Pacientes CD Pacientes no CD Controles
HLA-DQB1*02 n=57 (%) n=86 (%) n=518 (%)
Homocigosis 22 (38.5) 6 (6.9) 38 (7.3)
Heterocigosis 32 (56.1) 40 (46.5) 193 (37.2)
Tabla 27: frecuencia del alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o heterocigosis
Se representaron los resultados obtenidos en tablas de contingencia (Figura 19):
a)
Celiaquía
SI NO
HLA-DQB1*02
Homocigosis 22 6 28
Heterocigosis 32 40 72
Negativo 3 40 43
57 86 143
b)
Celiaquía OR 4,58
SI NO RR 1,77
HLA-DQB1*02
Homocigosis 22 6 28 Sensibilidad 40,74%
Heterocigosis 32 40 72 Especificidad 86,96%
54 46 100 VPP 78,57%
VPN 55,56%
c)
Celiaquía OR 15,65
SI NO RR 7,74
HLA-DQB1*02
Presente 54 46 100 Sensibilidad 94,74%
Ausente 3 40 43 Especificidad 46,51%
57 86 143 VPP 54,00%
VPN 93,02%
Figura 19: tablas de contingencia 2x2 para el alelo HLA-DQB1*02 en relación con la CD: a) según las 3
opciones posibles, presencia en homocigosis o heterocigosis y ausencia; b) valorando solo el caso de
aquellos individuos que lo presenten; c) teniendo en cuenta solo presencia o ausencia, sin importar la
dosis génica
Se calcularon los índices de sensibilidad, especificidad así como el VPP y VPN, tanto para la
presencia del alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o heterocigosis (Figura 19 b) como para la
presencia o ausencia de este alelo, sin tener en cuenta si estaba en dosis única o en doble dosis
(Figura 19 c). Dentro del grupo de individuos que presentan el alelo HLA-DQB1*02 en
homocigosis un 78.6% tienen un estudio serológico compatible con CD, sin embargo de aquellos
con este alelo en heterocigosis sólo un 44.4% tienen un estudio serológico compatible (Figura
20).
56 Resultados
Homocigosis Heterocigosis Negativo0
10
20
30
40
50
no CD
CD
HLA-DQB1*02
pacie
nte
s (
n)
Figura 20: número de pacientes con estudio compatible o no de CD que presentan el alelo HLA-DQB1*02
en homocigosis o heterocigosis
Correlación de los biomarcadores HLA con otros biomarcadores de la Enfermedad Celiaca
Dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 y anticuerpos anti-Tg2
En el grupo de pacientes con un estudio serológico compatible con CD se compararon los niveles
de Ac anti-Tg2 (normalidad 0-10 UI/ml) de estos según tuvieran el alelo HLA-DQB1*02 en
homocigosis (Media±SD; 72.62±34.62) o heterocigosis (71.83±33.03). Como se puede ver en la
Figura 21 no se observaron diferencias significativas (p=0.47; ns).
HomocigosisHeterocigosis Negativo0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
HLA DQB1*02
p=0.4683 (ns)
niv
ele
s A
c a
nti
-Tg
2 (
UI/
ml)
Figura 21: niveles de Ac anti-Tg2 según la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02. La línea azul marca el límite
superior de normalidad y la línea roja el límite máximo de detección de la técnica utilizada para la
cuantificación de Ac anti-Tg2
Dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 y datos de biopsia
De los 57 pacientes con un estudio serológico compatible con CD, en 37 de ellos dispusimos de
datos obtenidos de la biopsia intestinal (según la clasificación de Marsh; Tabla 14) y según esto
57 Resultados
se analizó el porcentaje de pacientes que teniendo el alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o
heterocigosis, tenían una biopsia con más o menos alteraciones (Figura 22). Tampoco se
observaron diferencias en los datos obtenidos de la biopsia intestinal en pacientes con el alelo
HLA-DQB1*02 en homocigosis en relación a aquellos que presentaron este alelo en
heterocigosis.
0 1 2 30
10
20
30
40
50
DQB1*02
no DQB1*02
DQB1*02 homocigosis
DQB1*02 heterocigosis
Biopsia (clasificación Marsh)
pacie
nte
s (
%)
Figura 22: presencia del alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis o heterocigosis en relación a los datos
obtenidos de la biopsia intestinal
Anticuerpos anti-Tg2 y datos de biopsia
De acuerdo a lo descrito en la literatura [11, 126], también en nuestro grupo de pacientes con
estudio serológico compatible con CD los niveles de Ac anti-Tg2 (normalidad 0-10 UI/ml)
guardan relación con los datos obtenidos en la biopsia intestinal, tal y como se puede ver a
continuación (Figura 23):
0-1 30
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Datos biopsia (clasificación Marsh)
0.0014p=
niv
ele
s A
c a
nti
-Tg
2 (
UI/
ml)
Figura 23: niveles de Ac anti-Tg2 según el resultado obtenido en la biopsia intestinal
58 Resultados
En aquellos pacientes con una biopsia intestinal grado 0 o 1 los niveles de Ac anti-Tg2 fueron
menores que en aquellos pacientes con una biopsia intestinal de grado 3 (Media±SD;
33.54±12.37 vs 78.22±29.76; p=0.0014, **). En nuestro grupo de pacientes no hay ninguno con
biopsia de grado 2. Valores de Ac anti-Tg2 superiores a 60 U/ml solo se observan en pacientes
con biopsia intestinal de grado 3.
59 Resultados
RESULTADO 2_BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES
Determinación de biomarcadores genéticos asociados a Enfermedad de Graves mediante PCR
a tiempo real
Se han diseñado, puesto a punto mediante RT-PCR y validado las reacciones necesarias para la
detección de los alelos HLA de clase I: HLA-B*08 y HLA-B*44 y HLA-C*03, HLA-C*07 y HLA-C*16 y
para la determinación de los polimorfismos de los genes PTPN22 y CTLA4 (rs2476601 y rs231775
respectivamente), que han sido descritos como loci de susceptibilidad para la GD en otras
poblaciones.
Alelos HLA de clase I
Para la tipificación de los alelos HLA de clase I asociados con GD se han utilizado 6 reacciones de
RT-PCR en combinación con sondas de hibridación FRET. Estas reacciones se han utilizado de
forma conjunta con la reacción para la amplificación del gen de la beta-globina (control interno
de la PCR). Como consecuencia, en cada reacción tienen lugar 2 amplificaciones diferentes. Los
primers y sondas utilizados, así como el protocolo de amplificación han sido descritos en el
apartado de material y métodos.
Polimorfismos de PTPN22 y CTLA4
En relación a la determinación del polimorfismo rs2476601 (PTPN22) se ha utilizado una
reacción de RT-PCR en combinación con sondas de hibridación FRET.
Respecto a la determinación del polimorfismo rs231775 (CTLA4) se ha utilizado una reacción de
RT-PCR en combinación con sondas de hibridación Taqman®.
Los primers y sondas utilizados en ambos casos, así como el protocolo de amplificación han sido
descritos en el apartado de material y métodos.
Informatividad de los biomarcadores genéticos asociados a Enfermedad de Graves
Una vez optimizadas y validadas estas reacciones se procedió al tipaje de muestras de controles
y pacientes con GD y posterior análisis de estos alelos HLA de clase I, así como de los
polimorfismos de PTPN22 y CTLA4, como biomarcadores de susceptibilidad para la GD en
nuestra cohorte de pacientes.
Se ha realizado el tipaje de 175 pacientes con GD y 152 controles. Los resultados obtenidos para
cada una de las muestras se encuentran en el anexo 2.
60 Resultados
Alelos HLA de clase I
En relación al estudio de alelos HLA de clase I asociados con GD, los resultados quedan
resumidos a continuación (Tabla 20):
Datos controles Datos pacientes
SI NO SI NO
B*08 16 136 152 B*08 43 132 175
B*44 42 110 152 B*44 31 144 175
C*03 17 135 152 C*03 29 146 175
C*07 69 83 152 C*07 90 85 175
C*16 25 127 152 C*16 18 157 175
Tabla 20: tipajes de alelos HLA de clase I obtenidos en las muestras de controles y pacientes con GD
Las frecuencias para cada uno de los tipajes obtenidas en nuestro grupo de pacientes y en
nuestro grupo control, en relación a lo descrito en la literatura [97], se muestran a continuación
(Tabla 21):
Frecuencia grupo HUGTiP Frecuencia literatura
Pacientes GD Controles Pacientes GD Controles
HLA n=175 (%) n=152 (%) n=1356 (%) n=986 (%)
C*03 29 (16.6) 17 (11.2) 103 (7.7) 156 (15.9)
C*07 90 (51.4) 69 (45.4) 685 (50.9) 328 (33.3)
C*16 18 (10.3) 25 (16.5) 26 (1.9) 59 (6.0)
B*08 43 (24.6) 16 (10.5) 341 (25.2) 154 (15.6)
B*44 31 (17.7) 42 (27.6) 152 (11.2) 176 (17.9)
Tabla 21: frecuencia para cada uno de los alelos HLA estudiados, nuestro grupo de controles y pacientes
con GD (residentes en Cataluña; a la izquierda) en relación a lo descrito en la literatura [97] (Reino Unido;
a la derecha)
Se representaron los resultados obtenidos en tablas de contingencia 2x2, donde se ve la
presencia o no del alelo correspondiente en el grupo de pacientes con GD o en el grupo control.
En nuestro grupo de pacientes con GD, las asociaciones se han encontrado con los alelos HLA-
B*08 y HLA-B*44, aunque con efectos contrarios, no encontrándose asociaciones con los alelos
HLA-C estudiados (Figura 16).
61 Resultados
GRAVES GRAVES
SI NO SI NO
C*0
3 SI 29 17 46
C*0
7 SI 90 69 159
NO 146 135 281 X2 1.95 NO 85 83 168 X2 1.19
175 152 327 p 0.16 (ns) 175 152 327 p 0.28 (ns)
GRAVES
SI NO
C*1
6 SI 18 25 43
NO 157 127 284 X2 2.70
175 152 327 p 0.1 (ns)
GRAVES GRAVES
SI NO OR 2.77 SI NO OR 0.56
B*0
8 SI 43 16 59 RR 1.48 B
*44 SI 31 42 73 RR 0.75
NO 132 136 268 X2 10.85 NO 144 110 254 X2 4.61
175 152 327 p 0.001 (***)
175 152 327 p 0.032 (*)
Figura 16: tablas de contingencia 2x2 para los diferentes tipajes HLA relacionados con GD. Los cuadros
marcados en rojo corresponden a aquellos alelos con una OR >1 (efecto predisponente), por el contrario
los marcados en verde tienen un OR <1 (efecto protector)
Respecto a los alelos HLA-B, el alelo HLA-B*08 parece tener un efecto predisponente para
padecer la GD (OR=2.77; 95% CI=1.49-5.16) mientras que el alelo HLA-B*44 muestra un efecto
protector para esta misma enfermedad (OR=0.56; 95% CI=0.33-0.95).
Respecto a los alelos HLA-C, a pesar de que los resultados no son estadísticamente significativos,
se observa una tendencia. En el caso de los alelos HLA-C observamos diferencias en las
frecuencias de estos alelos en la población control descrita en la literatura (Reino Unido)
respecto a nuestro grupo control (residentes en Cataluña) (Tabla 21). Parece que los alelos HLA-
C*03 y 07 tienen un efecto predisponente mientras que el alelo HLA-C*16 muestra un efecto
protector.
HLA-B*08 y HLA-C*07 mantienen un fuerte desequilibrio de ligamiento y frecuentemente se
heredan en haplotipo. Así, si tenemos en cuenta la presencia de 2 de estos alelos el efecto
observado es mayor (OR=4.86; 95% CI=2.28-10.39), tal y como se puede observar en la Figura
17. En este caso la probabilidad de tener la GD cuando un individuo presenta estos 2 alelos es de
un 82%. Siendo la frecuencia de estos 2 alelos en nuestro grupo control de un 18% similar a lo
descrito en población europea; 12.8%, según los datos de NMDP (National Marrow Donor
Program).
62 Resultados
GRAVES
B*08-C*07 SI NO OR 4.86
SI 41 9 50 RR 1.70
NO 134 143 277 X2 19.25
175 152 327 p <0.0001 (***)
Sensibilidad 23.43%
Especificidad 94.08%
VPP 82.00%
VPN 51.62%
Figura 17: tabla de contingencia 2x2 para valorar la presencia conjunta de los alelos HLA-B*08-C*07
Polimorfismos de PTPN22 y CTLA4
En relación al estudio de los polimorfismos de PTPN22 y CTLA4 asociados con GD, los resultados
quedan resumidos a continuación (Tablas 22 y 23):
PTPN22 (rs2476601)
Población Alelos; n (frecuencia) Genotipos; n (frecuencia)
A G A|A A|G G|G
Todas* 92 (0.042) 2092 (0.958) 2 (0.002) 88 (0.081) 1002 (0.918)
Europea* 75 (0.099) 683 (0.901) 2 (0.005) 71 (0.187) 306 (0.807)
Grupo HUGTiP control 15 (0.049) 289 (0.951) 0 (0.000) 15 (0.099) 137 (0.901)
Grupo HUGTiP GD 38 (0.109) 312 (0.891) 1 (0.006) 36 (0.206) 138 (0.788)
Tabla 22: frecuencias del SNP rs2476601 en poblaciones control y en nuestra cohorte de pacientes con
GD. *Corresponden a datos obtenidos de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org)
CTLA4 (rs231775)
Población Alelos; n (frecuencia) Genotipos; n (frecuencia)
G A G|G A|G A|A
Todas* 987 (0.452) 1197 (0.548) 229 (0.210) 529 (0.484) 334 (0.306)
Europea* 276 (0.364) 482 (0.636) 45 (0.119) 186 (0.491) 148 (0.391)
Grupo HUGTiP control 103 (0.339) 201 (0.661) 16 (0.105) 71 (0.467) 65 (0.428)
Grupo HUGTiP GD 138 (0.394) 212 (0.606) 29 (0.166) 80 (0.457) 66 (0.377)
Tabla 23: frecuencias del SNP rs231775 en poblaciones control y en nuestra cohorte de pacientes con GD.
*Corresponden a datos obtenidos de la base de datos Ensembl (www.ensembl.org)
Se representaron los resultados obtenidos en tablas de contingencia 2x2, donde se ve la
presencia del alelo normal (G en el caso de PTPN22 y A en el caso de CTLA4) o mutado (A en el
caso de PTPN22 y G en el caso de CTLA4) en el grupo de pacientes con GD o en el grupo control:
63 Resultados
GRAVES GRAVES
PTPN22 SI NO OR 2.35 CTLA4 SI NO
A 38 15 53 RR 1.38 G 138 103 241
G 312 289 601 X2 7.66 A 212 201 413 X2 2.15
175 152 654 p 0.0056 (**) 175 152 654 p 0.1425 (ns)
Sensibilidad 10.86%
Especificidad 95.07%
VPP 71.70%
VPN 48.09%
Figura 18: tablas de contingencia 2x2 para los polimorfismos rs2476601 y rs231775
En el caso del polimorfismo rs2476601 del gen PTPN22, a pesar de que los datos de sensibilidad,
así como de los valores predictivos no son buenos, la presencia del alelo G tiene un efecto
predisponente para la GD (OR=2.35; 95% CI=1.26-4.36). Sin embargo el efecto del polimorfismo
rs231775 del gen CTLA4 no es tan claro en nuestro grupo de pacientes con GD.
Figura 19: frecuencia de los alelos normal (en azul claro) y mutado (en azul oscuro) para los polimorfismos
rs2476601 (a) y rs231775 (b) en nuestro grupo control y en el de pacientes con GD
Alelos HLA de clase I y polimorfismos en genes no HLA
Si valoramos de forma conjunta el efecto del sistema HLA con el de los polimorfismos rs2476601
y rs231775, tenemos los siguientes resultados:
64 Resultados
a)
HLA-B
HLA-B*08 /
PTPN22
GRAVES HLA-B*44 /
PTPN22
GRAVES
SI NO SI NO
SI 9 2 11 SI 8 4 12
NO 166 150 316 NO 167 148 315
175 152 327 175 152 327
X2 3.67 X2 0.87
p 0.0556 (ns) p 0.3521 (ns)
HLA-C
HLA-C*03 /
PTPN22
GRAVES HLA-C*07 /
PTPN22
GRAVES HLA-C*16 /
PTPN22
GRAVES
SI NO SI NO SI NO
SI 6 1 7 SI 18 10 28 SI 6 2 8
NO 169 151 320 NO 157 142 299 NO 169 150 319
175 152 327 175 152 327 175 152 327
X2 2.98 X2 1.43 X2 1.52
p 0.0843 (ns) p 0.2322 (ns) p 0.2174 (ns)
HLA-B y
HLA-C
HLA-B*08 /
C*07 / PTPN22
GRAVES
SI NO
SI 9 2 11
NO 166 150 316 X2 3.67
175 152 327 p 0.0556 (ns)
b)
HLA-B
HLA-B*08 /
CTLA4
GRAVES HLA-B*44 /
CTLA4
GRAVES
SI NO SI NO
SI 24 14 38 SI 20 25 45
NO 151 138 289 NO 155 127 282
175 152 327 175 152 327
X2 1.607 X2 1.727
p 0.2050 (ns) p 0.1889 (ns)
HLA-C
HLA-C*03 /
CTLA4
GRAVES HLA-C*07 /
CTLA4
GRAVES HLA-C*16 /
CTLA4
GRAVES
SI NO SI NO SI NO
SI 22 8 30 SI 54 38 92 SI 11 14 25
NO 153 144 297 NO 121 114 235 NO 164 138 302
175 152 327 175 152 327 175 152 327
X2 5.214 X
2 1.380 X
2 0.9855
p 0.0224 (*) p 0.2401 (ns) p 0.3208 (ns)
RR 1.424
OR 2.588
HLA-B y
HLA-C
HLA-B*08 /
C*07 / CTLA4
GRAVES
SI NO
SI 23 12 35
NO 152 140 292 X2 2.344
175 152 327 p 0.1258 (ns)
Figura 20: tablas de contingencia 2x2 para valorar de forma conjunta la presencia de los alelos HLA de
clase I y los polimorfismos rs2476601 (a)) y rs231775 (b)) en relación con la GD
65 Resultados
Respecto al análisis combinado de los diferentes alelos HLA de clase I con el polimorfismo
rs2476601, no se observa un efecto mayor que al analizarlos de forma individual, de hecho se
pierden las asociaciones observadas por ejemplo para el alelo HLA-B*08 o para el polimorfismo
rs2476601 cuando los estudiamos de forma individual.
Sin embargo, en el caso del análisis combinado de los alelos HLA de clase I con el polimorfismo
rs231775, existe una predisposición a padecer GD cuando un individuo presenta a la vez el alelo
HLA-C*03 y este polimorfismo en CTLA4 (OR=2.59; 95% CI=1.12-6.00).
66 Resultados
RESULTADO 3_DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR RT-PCR
La posibilidad de realizar la tipificación HLA de los 3 loci HLA principales, mediante un método
basado en RT-PCR, puede permitir el uso de esta tecnología en diferentes aplicaciones incluido
el estudio del sistema HLA y su asociación a enfermedad.
Por ello, se ha diseñado, puesto a punto mediante RT-PCR en combinación con sondas de
hibridación FRET y validado un sistema de tipificación para el locus A del sistema HLA,
simplificado en cuanto al número de reacciones y resolución, que complemente a otras
reacciones ya desarrolladas en el laboratorio por esta misma metodología (HLA-B y DR).
Reacciones e información proporcionada por éstas
Esta estrategia se basa en el uso de 9 reacciones simultáneas (con 10 parejas de sondas FRET
diferentes) que amplifican los exones 2 (T1-T3) y 3 (T4-T9) de los alelos HLA-A a la vez que
amplifican el gen de la beta-globina (control interno). Los primers y sondas utilizados, así como
el protocolo de amplificación han sido descritos en el apartado de material y métodos. Este
protocolo ha sido validado con 45 muestras previamente tipadas por PCR-SBT (alta resolución),
obteniendo un 100% de concordancia en los resultados.
Cada alelo HLA-A tiene asociado para cada una de las sondas utilizadas una Tm característica.
Esta Tm depende de lo complementaria que sea la secuencia de ese alelo concreto en relación a
la secuencia de la sonda en cuestión. Las Tm más elevadas corresponden a aquellos tipajes con
una secuencia totalmente complementaria a la sonda en cuestión y a medida que aumentan las
diferencias (mismatch) entre la secuencia del alelo HLA-A y la secuencia de la sonda, tenemos
Tm más bajas.
Dependiendo de lo informativa que sea o no la sonda, en una única reacción podemos tener 1, 2
o hasta 3 Tm, y cada una de ellas será positiva (1) o negativa (0) para cada uno de los alelos del
locus A del sistema HLA.
La relación de Tm obtenidas para cada sonda y para cada uno de los alelos HLA-A se muestra en
el anexo 3. No obstante, a continuación se muestra un resumen de las Tm para cada una de las
sondas de los principales tipajes (Tabla 23):
67 Resultados
TUBO T1 T7
MARCAJE 640 640 610 640 640
SONDA S2 S3 S240 S570 5.30
Tm 64 54 62 50 57 61 67 45 55 65 45 55 65 65 64 50 65 46 52 62
SECUENCIA C25
TGCT
C
AT
C31
G C01
A AC
T
CG-C
A
CG-_
CG-C
AC
-CA
AC
-_
AC
-C
GT
C30
A C69
-
TC /
TTC
C11…
AC
A*010101 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*02010101 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*03010101 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
A*110101 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*230101 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*24020101 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*250101 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*260101 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*29010101 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*300101 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0
A*310102 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*320101 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*330101 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*340101 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0
A*3601 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0
A*4301 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6601 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*680101 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6901 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*7401 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*8001 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
610610
S5S9 S350
T9
640 610 610
AC+ S14 S540
610
T2 T4 T5 T6
CG+ S14
T8T3
Tabla 23: resultado obtenido para cada una de las sondas con los principales tipajes HLA-A. Marcado con
un 1 están aquellos tipajes que dan señal a la Tm correspondiente de la sonda en cuestión y con un 0
aquellos que no dan señal
Dentro de este set de 9 reacciones obtenido para la tipificación del locus A del sistema HLA, las
características de unas reacciones y otras son diferentes:
Según el número de sondas por reacción:
1 sonda HLA-A por reacción: T1, T3, T4, T5, T6, T7 y T9.
2 sondas HLA-A por reacción: en este caso, cada una de las sondas va marcada de
manera diferente y el análisis de cada una de ellas se hará en el canal de fluorescencia
correspondiente; T2 y T8.
Según la información que proporcionan, podemos distinguir 3 tipos de reacciones diferentes:
Altamente informativas: aquellas reacciones que dan mucha información a nivel
general ya que es posible tener diferentes Tm, dependiendo de la secuencia de cada
alelo, en una única reacción; como son por ejemplo las reacciones T5, T6 y T9. Cada una
de ellas tiene 3 posibles Tm.
Además, las reacciones T5 y T6 son reacciones complementarias, utilizan la misma
sonda (S14) y por ello las 3 Tm observadas son las mismas, pero en este caso los primers
utilizados son diferentes, de manera que en cada reacción se amplifican unos alelos
concretos y contrarios (los que se amplifican en T5 no se amplifican en T6 y viceversa).
68 Resultados
Altamente específicas: aquellas que únicamente dan señal con uno o dos alelos
concretos, por lo que podemos decir que estas reacciones son específicas de estos
alelos en cuestión; como por ejemplo la sonda 5.30 de la reacción T8, que únicamente
da señal para los alelos HLA-A*30 o la sonda 240 de la reacción T2, que solamente da
señal para los alelos HLA-A*30 y HLA-A*31.
Estas reacciones específicas de alelos son útiles si queremos confirmar la presencia o
ausencia de estos y su empleo puede resultar provechoso en diferentes aplicaciones
biomédicas.
Intermedias: el resto de reacciones o sondas tienen características intermedias entre los
dos tipos descritos anteriormente.
Resolución obtenida
A pesar de que analizando los perfiles de Tm obtenidos con este set de 9 reacciones somos
capaces de diferenciar unos alelos HLA-A de otros, la combinación de alelos (en muestras
heterocigotas) genera una serie de indeterminaciones o tipajes que, con esta metodología
basada en la RT-PCR en combinación con sondas de hibridación FRET, no somos capaces de
resolver.
El análisis de estos resultados de tipificación ambiguos obtenidos como consecuencia del tipaje
de muestras heterocigotas, se ha realizado siguiendo las instrucciones descritas en el apartado
de material y métodos. En este análisis se ha tenido en cuenta la frecuencia de cada uno de los
alelos en nuestra población, eliminando aquellos cuya combinación se encuentra a una
frecuencia inferior a 0.00001. A continuación se puede ver un ejemplo de una de las
indeterminaciones que quedan sin resolver (Tabla 24):
Allele_1 Freq_1 Allele_2 Freq_2 Freq_1_2
A*680301 0,00393 A*6602 0,00411 0,00002
A*8001 0,00254 A*680101 0,01831 0,00005
A*680101 0,01831 A*680101 0,01831 0,00034
Tabla 24: ejemplo de una de las indeterminaciones que quedan sin resolver con esta aproximación para el
tipaje del HLA-A. Cada una de las filas corresponde a un posible individuo, con 2 alelos diferentes, la
frecuencia de estos y la frecuencia de la combinación, y en este caso la indeterminación afecta a 3
posibles combinaciones de alelos HLA-A
En este caso, un individuo que fuera HLA-A*68:03:01 / 66:02 (la frecuencia para esta
combinación de alelos es de 0.00002; es decir aparecerá en 2 individuos de cada 100.000
individuos que estudiemos) no se distinguiría de individuos que fueran HLA-A*68:01:01 / 80:01
(con una frecuencia de 0.00005) o HLA-A*68:01:01 homocigotos (con una frecuencia de
0.00034). Con esta aproximación no somos capaces de detectar estas diferencias. El resumen de
todas las indeterminaciones que no quedan resueltas con esta aproximación metodológica se
encuentra en el anexo 3.
69 Discusión
DISCUSIÓN
En este trabajo se ha abordado la complejidad del sistema HLA desde dos puntos de vista:
Por un lado, explorando la asociación del sistema HLA y enfermedad, concretamente en
dos AID como son la CD y la GD. Además, en el caso de la GD, se han estudiado
polimorfismos en otros genes no HLA (PTPN22 y CTLA4) pero cuya función también está
relacionada con el sistema inmune. Asimismo, se ha evaluado el efecto combinado de
estos polimorfismos en genes no HLA con las variantes HLA.
Por otro lado, se ha definido una metodología de tipificación de baja resolución para el
locus A del sistema HLA.
Para ambos estudios, se han puesto en marcha diferentes técnicas de RT-PCR en combinación
con sondas de hibridación, que nos han permitido resolver el polimorfismo de los diferentes loci
HLA así como de los otros genes estudiados (PTPN22 y CTLA4). Y con todo ello se han
desarrollado un conjunto de pruebas, aplicables en un laboratorio de tipaje HLA, para poder
predecir mejor la susceptibilidad de un individuo a padecer estas AID.
Dadas las ventajas que tiene la RT-PCR en comparación con otros métodos utilizados en la
genotipificación del sistema HLA, como son la rapidez, la ausencia de procesamiento post-PCR,
el número de muestras que somos capaces de procesar al mismo tiempo, el menor coste según
el objetivo del estudio concreto (en aquellos casos donde sólo queramos determinar por
ejemplo un alelo) hace que sea un método fácil de implementar y con una gran aplicabilidad en
el trabajo asistencial de los laboratorios de tipaje.
BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA
La CD es una enfermedad multifactorial donde los alelos HLA representan el mayor componente
de predisposición genética. Por ello, a pesar de que el tipaje HLA no representa en este caso un
valor diagnóstico absoluto, permite asesorar respecto al riesgo de padecer o no esta
enfermedad. Tanto es así que el tipaje HLA de los alelos asociados (HLA-DQ2/DQ8) está
considerado dentro del algoritmo diagnóstico de las guías de la ESPGHAN (European Society for
Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition) [11] para el diagnóstico de esta
enfermedad. En la práctica clínica diaria, el tipaje de estos alelos HLA asociados a CD es una
determinación solicitada con frecuencia al laboratorio de inmunología, por parte de los clínicos
que se encargan del diagnóstico y seguimiento de estos pacientes. De hecho, la determinación
de los alelos HLA-DQ2/DQ8, mediante esta tecnología aquí presentada, ha sido solicitada en más
de 5.000 estudios, desde su implementación en la rutina diagnóstica del laboratorio de HLA del
LIRAD en el año 2008.
Hay diferentes tecnologías para el tipaje de los alelos HLA y en los últimos años se han
desarrollado diferentes métodos comerciales para el tipaje de los alelos HLA asociados
específicamente con la CD [127], no obstante en el trabajo aquí presentado se propone un
70 Discusión
método basado en la RT-PCR en combinación con sondas de hibridación, que ha servido de base
para la elaboración de un kit comercial.
Tipificación HLA asociado a Celiaquía mediante PCR a tiempo real
En la aproximación descrita en este trabajo, se ha conseguido la tipificación HLA-DQ2/DQ8
mediante RT-PCR, utilizando 3 reacciones de amplificación en combinación con dos parejas de
sondas de hibridación FRET. Este método de tipificación permite una genotipificación de estos
alelos, asociados con la CD, altamente informativa, de manera automatizada, con un tiempo de
procesamiento corto y sin fase de manipulación después de la amplificación (post-PCR) lo que
disminuye enormemente el riesgo de contaminación.
Además, en aquellos pacientes que sean HLA-DQB1*02 positivos, la ampliación de este método
con 2 reacciones adicionales basadas en esta misma tecnología, con el objetivo de ver si este
alelo está en homocigosis o heterocigosis, supone una mejora adicional a la técnica para la
determinación de los alelos HLA asociados a CD. En este caso, se trata de una reacción para
confirmar la presencia del alelo HLA-DQB1*02 y otra para ver si se encuentra en dosis única o en
doble dosis.
Todas estas características hacen que la técnica aquí descrita sea útil en el cribado de la
población susceptible de padecer CD y fácilmente aplicable en un laboratorio de tipaje HLA que
reciba un volumen importante de muestras.
Informatividad de los marcadores HLA en el estudio de sospecha de la Enfermedad Celiaca
De acuerdo a lo descrito en la literatura [128], también en nuestro grupo de pacientes a estudio
se confirma la predisposición genética para la CD asociada a los alelos HLA-DQ2/DQ8. La
relevancia clínica del tipaje de alelos HLA asociados a la CD en el estudio de sospecha de esta
enfermedad viene dado por el alto VPN de esta prueba, que es altamente informativo. En
nuestro estudio, igual que en otros trabajos previos [129], el VPN de esta prueba está cercano al
98%. Por el contrario, a pesar de la elevada sensibilidad de la misma (>98%), su VPP es bajo,
cercano al 60%, dato que disminuye la probabilidad de un individuo de tener la enfermedad solo
por el hecho de ser positivo para este biomarcador en cuestión.
Además, se ha comprobado que el hecho de tener el alelo HLA-DQB1*02 en homocigosis
confiere un mayor riesgo para desarrollar la CD, ya que mientras solamente un 44.4% de
individuos con este alelo en heterocigosis presentaba un estudio compatible con CD, un 78.6%
de los individuos con el mismo en homocigosis tenía el estudio serológico compatible. Además,
la determinación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 aumenta la especificidad de la
metodología previa (determinación HLA-DQ2/DQ8). Cuando se realiza exclusivamente esta
última determinación la especificidad es de un 51.16%, sin embargo cuando ampliamos el
estudio a la evaluación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02, ésta aumenta hasta un
86.96%.
71 Discusión
Por otro lado, no hemos observado un efecto entre la dosis de este alelo (heterocigosis vs
homocigosis) en relación a los niveles de autoAc o de acuerdo a la severidad de la lesión
histopatológica (grado de Marsh, en la biopsia intestinal).
Respecto a los niveles de autoAc, este dato difiere de otros estudios presentes en la
literatura [98] donde se han encontrado niveles significativamente más elevados de Ac
anti-Tg2 en aquellos pacientes con doble dosis del alelo HLA-DQB1*02, en relación a
aquellos pacientes con dosis única o negativos para el mismo. Esto podría ser debido a
que el número de pacientes incluidos en nuestro estudio es mayor o a las diferencias en
cuanto a la severidad de la enfermedad en estos. Además, en nuestro caso, la técnica
utilizada para la cuantificación de los Ac anti-Tg2 tiene un límite máximo de detección
de 100 UI/ml, por ello en aquellos pacientes con un resultado >100 UI/ml el valor que
hemos empleado para el análisis ha sido de 100 UI/ml (por no tener relevancia a nivel
clínico), hecho que puede hacer que estemos infravalorando algunos pacientes en cada
grupo.
En relación a la lesión histopatológica y al contrario que en este mismo estudio [98],
dentro del grupo de pacientes con una biopsia de grado Marsh 3, observamos una
proporción más elevada de individuos con el alelo HLA-DQB1*02 en heterocigosis que
en homocigosis (56.25% vs 34.38%). Además, un 9.37% de estos pacientes no lo
presentan.
Otros biomarcadores genéticos en la Enfermedad Celiaca
A pesar de que la asociación entre los genes HLA de clase II y la CD se conoce desde hace más de
40 años, todavía a día de hoy, se desconoce un gran porcentaje de la heredabilidad de esta
enfermedad. En este sentido, el papel de loci genéticos no-HLA en la susceptibilidad a
desarrollar la CD es importante y algunos de ellos se ha visto que están implicados además en
otras AID. Los primeros estudios GWAS se realizaron en el año 2007, donde se identificaron
regiones que contenían genes implicados en el control de la respuesta inmune, como por
ejemplo IL2 o IL21, desde entonces el número de genes implicados ha ido aumentando, sin
embargo el RR o la OR observada, para estos factores genéticos, en ningún caso es tan elevada
como en el caso de los genes HLA (Tabla 1) [16, 130, 131]. Respecto a los polimorfismos
rs2476601 y rs231775 que en este trabajo han sido estudiados en relación con la GD, en el caso
de la CD, a pesar de que hay algún estudio que sugiere por ejemplo que la presencia del
polimorfismo de PTPN22 confiere un riesgo genético incrementado a padecer CD [132], su papel
no ha sido claramente confirmado. Por ello, en el presente trabajo estos polimorfismos de
PTPN22 y CTLA4 no han sido estudiados en relación con la CD.
BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES
Las AITD al igual que otras AID han sido consideradas enfermedades multifactoriales, donde se
incluyen distintos factores genéticos y/o ambientales [133]. Dentro de los factores genéticos, el
sistema HLA tiene un papel relevante en estas AID, como ya se ha comentado.
72 Discusión
Alelos HLA asociados con la Enfermedad de Graves
En el trabajo aquí presentado se han optimizado 6 reacciones, por RT-PCR, necesarias para el
tipaje de los diferentes alelos HLA de clase I que han sido descritos como loci de susceptibilidad
para la GD [97]. Y de esta manera se ha evaluado la presencia de estos alelos HLA de clase I en
nuestra cohorte de pacientes como posibles biomarcadores de la GD.
En nuestro grupo de pacientes y controles, se ha confirmado la asociación de los alelos HLA-B
con la GD [97]. Hemos observado que el alelo HLA-B*08 confiere un mayor riesgo a desarrollar
la GD (OR=2.77) mientras que el HLA-B*44 tiene un efecto protector (OR=0.56) siendo los
resultados estadísticamente significativos. La asociación observada con el alelo HLA-B*08 en
nuestro grupo a estudio es mayor en relación a la previamente descrita en población del Reino
Unido (OR=2.77 vs OR=1.62).
Respecto a los alelos HLA-C, no se ha confirmado la asociación con GD, que se había descrito
como más fuerte que la de los alelos HLA-B. En nuestra población a estudio, los resultados
obtenidos respecto a los alelos HLA-C no son estadísticamente significativos, a pesar de que se
observa una tendencia de los alelos HLA-C*03 y 07 con efecto predisponente y del alelo HLA-
C*16 con efecto protector. Es destacable el hecho de que la tendencia observada en relación al
HLA-C*03 es contraria a la asociación descrita previamente [97]. Un hecho a considerar es que la
frecuencia para los alelos HLA-C en nuestro grupo control varia sustancialmente con lo descrito
en la literatura (población del Reino Unido), sin embargo, nuestros datos están en concordancia
con los datos de frecuencias de estos alelos HLA en población española.
Los alelos HLA-B*08 y HLA-C*07 están con frecuencia codificados en un haplotipo común, por
ello, cuando estudiamos su presencia de forma simultánea en nuestro grupo de pacientes y
controles, el efecto predisponente observado es mayor (OR=4.86) aumentando el VPP de la
prueba de un 72.88% o un 56.60% para los alelos HLA-B*08 y HLA-C*07 respectivamente hasta
un 82.00% si tenemos en cuenta el haplotipo HLA-B*08-C*07. En la literatura no se había
observado este efecto conjunto, de hecho se había descrito que la asociación de los alelos HLA-B
y HLA-C con la GD era independiente y que dicho haplotipo no confería una susceptibilidad
adicional a desarrollar la enfermedad.
En este estudio, hemos demostrado que hay importantes diferencias poblacionales en la
asociación entre los alelos HLA-B y HLA-C y la GD.
Polimorfismos en PTPN22 y CTLA4 asociados con la Enfermedad de Graves
Se han desarrollado 2 reacciones de RT-PCR en combinación con sondas de hibridación para la
determinación de los polimorfismos rs2476601 y rs231775 correspondientes a los genes PTPN22
y CTLA4, respectivamente. De esta manera, se ha evaluado el papel de estos polimorfismos en la
GD estudiando su presencia o ausencia en nuestro grupo de controles y pacientes con esta
enfermedad.
73 Discusión
Respecto al polimorfismo rs2476601, se ha encontrado un efecto predisponente para padecer la
GD (OR=2.35), sin embargo este efecto no se observa cuando valoramos de forma conjunta la
presencia de este polimorfismo y los diferentes alelos HLA-B y HLA-C relacionados con GD.
Respecto al polimorfismo rs231775, no se ha encontrado asociación en relación a la GD, sin
embargo al analizar de forma conjunta la presencia de este polimorfismo y los diferentes alelos
HLA-B y HLA-C relacionados con GD, se ha visto que el hecho de presentar el alelo HLA-C*03 y
este polimorfismo confiere una mayor susceptibilidad a padecer esta enfermedad (OR=2.59).
En nuestro grupo de pacientes se han confirmado las asociaciones de ciertos alelos HLA de clase
I (siendo el factor más importante el haplotipo HLA-B*08-C*07) así como el polimorfismo
rs2476601 o la combinación del alelo HLA-C*03 con el polimorfismo rs231775, como factores
genéticos de susceptibilidad a la GD. A pesar de ello, los valores de OR observados para cada
uno de ellos son modestos o no explican el total de pacientes con GD. Estos datos confirman el
hecho de que esta enfermedad, al igual que otras AID, es una enfermedad compleja en la que
múltiples factores genéticos deben jugar un papel o interactuar proporcionando así un nivel de
susceptibilidad a desarrollarla. No obstante, los factores genéticos evaluados en este trabajo son
también contribuyentes a este riesgo genético.
DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO REAL
La necesidad de la tipificación HLA viene dada por el papel que juega el sistema HLA en
diferentes campos biomédicos, como son por ejemplo la compatibilidad en el trasplante de
órganos para lograr un menor rechazo del órgano implantado o en la patogénesis de algunas
AID, definiendo así la relación HLA y enfermedad. Por ello y debido a que los genes HLA son los
más polimórficos de todo el genoma humano, en este campo se están experimentando
continuamente una serie de mejoras metodológicas con el fin de llegar a la identificación de
todas las especificidades del sistema HLA.
Desde los inicios de la tipificación HLA con métodos serológicos, hasta las técnicas actuales
basadas en la tecnología de amplificación de DNA, se ha ido aumentado el nivel de resolución
obtenido. No obstante, el uso de las diferentes técnicas de biología molecular para la resolución
del elevado grado de polimorfismo del sistema HLA (tipaje HLA) depende en gran medida de las
necesidades de cada laboratorio [80]. La elección de una técnica u otra puede estar influenciada
por diferentes parámetros como son la resolución requerida (alta o baja) según el objetivo del
estudio, el número de muestras a procesar y estudiar, el tiempo de respuesta definido por la
urgencia clínica, el número de personal o los equipamientos con los que cuenta el laboratorio,
etc. Y de acuerdo a esto, normalmente los laboratorios clínicos utilizan una combinación de las
técnicas disponibles en el mercado, buscando así la máxima eficiencia.
Teniendo en cuenta estas premisas, en el laboratorio de HLA del LIRAD se puso en marcha un
abordaje del sistema HLA utilizando la metodología de la RT-PCR, con el objetivo de generar un
sistema rápido y robotizable de tipificación HLA que pudiera ser de utilidad para el trasplante y
el diagnóstico de ciertas AID. De esta manera, se obtuvieron protocolos para la tipificación de
HLA-B27, HLA-B y HLA-DR por PCR con diferentes modalidades de sondas de hibridación [85, 90,
74 Discusión
91]. La facilidad, solidez, reproducibilidad y eficiencia de la técnica para la detección del HLA-B27
hizo que en este laboratorio esta técnica se incorporase entre sus métodos habituales de
diagnóstico, habiendo sido una de las técnicas que se ha auditado y acreditado por la EFI
(European Federation of Immunogenetics).
Reacciones desarrolladas por PCR a tiempo real para el tipaje del HLA-A
Hoy en día existen técnicas nuevas y atractivas que pueden ser aplicadas en la tipificación HLA,
como es el caso de la secuenciación masiva [82]. Estas técnicas a pesar de ser más laboriosas y
costosas resultan adecuadas para la obtención de una tipificación de alta resolución. En el
presente trabajo se ha abordado la tipificación del locus A del sistema HLA para obtener una
baja-media resolución mediante una metodología rápida y económica basada en la RT-PCR. Con
sólo 9 reacciones no se ha logrado obtener una alta resolución del locus HLA-A y dada la
existencia de las nuevas tecnologías de alta resolución citadas previamente, no se ha planteado
aumentar la resolución mediante este procedimiento.
No obstante, este sistema desarrollado en este trabajo puede tener interés en las siguientes
situaciones:
Complementa las reacciones ya puestas en marcha en el laboratorio, para poder
disponer de un conjunto de reactivos útiles para la tipificación de baja-media resolución
de los principales loci HLA con relevancia clínica.
En aquellos casos donde no es necesaria una alta resolución, por ejemplo en los estudios
de cribado de familiares compatibles.
En el caso de procesar un elevado número de muestras para una determinación HLA-A
concreta, ya que la facilidad técnica, la eliminación de los pasos post-PCR (que evita
posibles errores debido a la contaminación) y la existencia en el mercado de robots
capaces de preparar la mezcla de reacción, hacen posible una total automatización del
proceso.
En las situaciones de comprobación y resolución de ambigüedades de tipificación
generadas por aquellas técnicas de alta resolución que analizan la secuencia de ambos
alelos a la vez, como por ejemplo la PCR-SBT convencional.
En estudios HLA y enfermedad. Tradicionalmente no han sido descritas asociaciones
entre alelos HLA-A y diferentes enfermedades (con excepción del alelo HLA-A*29 y la
retinopatía de Birdshot) [57]. Pero, recientemente, se ha descrito la asociación del alelo
HLA-A*24 con la T1D, confiriendo este alelo un efecto predisponente para esta
enfermedad con una OR≈1.5. Además parece ser que este alelo muestra una asociación
significativa con una edad más temprana de debut de la enfermedad [134, 135]. Por
ejemplo, para estudios donde se quisiera poner de manifiesto la presencia o ausencia
del alelo HLA-A*24, se podría utilizar la combinación de reacciones siguiente: T2 + T6
75 Discusión
Presencia o ausencia de HLA-A*24:
T2: con la sonda 3 darían positivo los tipajes siguientes:
HLA-A*23 / 24 / 25 / 32
T6: 3 posibles Tm diferentes
HLA-A*24 daría señal a 55ºC
HLA-A*23 / 32 darían señal a 65ºC
HLA-A*25 no daría señal
En estudios HLA y predisposición a ADR. Por ejemplo, para estudios donde se quisiera
poner de manifiesto la presencia o ausencia del alelo HLA-A*31 en relación a la
hipersensibilidad por carbamazepina [113], se podría utilizar la combinación de
reacciones siguiente: T2 + T8
Presencia o ausencia de HLA-A*31:
T2: con la sonda 240 darían positivo los tipajes siguientes:
HLA-A*30 / 31
T8: con la sonda 5.30 solo darían positivo aquellos alelos HLA-A*30
76 Conclusiones
CONCLUSIONES
A partir del trabajo aquí presentado se puede concluir lo siguiente:
ESTUDIOS HLA Y ENFERMEDAD
Se ha demostrado la utilidad de la RT-PCR para la resolución del polimorfismo HLA en relación a
AID. Gracias a la facilidad técnica, rapidez, así como a la posibilidad de automatización, la RT-PCR
constituye un método aplicable a la rutina diagnóstica de un laboratorio de tipaje HLA. De esta
manera, se ha logrado la implementación de unas pruebas capaces de predecir la susceptibilidad
de un individuo a padecer estas AID (CD y GD).
Enfermedad celiaca: la tipificación HLA-DQ2/DQ8 presenta un elevado VPN y la
ampliación del estudio a la evaluación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 supone
una mejora adicional a la técnica ya que aumenta el VPP de esta prueba. A pesar de
esto, no se han observado diferencias en la lesión histopatológica (clasificación de
Marsh) o en los valores de Ac anti-Tg2 en relación a dicho genotipo.
Enfermedad de Graves:
Alelos HLA de clase I: se ha observado asociación en el caso de los alelos
HLA-B. El alelo HLA-B*08 confiere susceptibilidad a GD, mientras que el
alelo HLA-B*44 confiere resistencia. Respecto a los diferentes alelos HLA-C
estudiados, no se ha observado asociación con la GD. Al analizar de forma
combinada estos alelos HLA de clase I, el haplotipo HLA-B*08-C*07 es el
que confiere una mayor susceptibilidad a padecer esta enfermedad.
Polimorfismos en genes no HLA: el polimorfismo rs2476601 predispone a
GD, mientras que no se ha observado asociación entre el polimorfismo
rs231775 y la GD. No obstante, al analizar de forma conjunta el efecto de
los alelos HLA de clase I y de estos polimorfismos en genes no HLA se ha
encontrado asociación entre el alelo HLA-C*03 y el polimorfismo rs231775
con la GD.
TIPAJE DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO REAL
La metodología descrita, basada en la RT-PCR en combinación con sondas de hibridación
FRET, es capaz de resolver el polimorfismo del locus A del sistema HLA a nivel de media-
baja resolución, mediante la utilización de 9 reacciones.
A pesar de que en algunos casos esta metodología resulta insuficiente debido al número
de indeterminaciones que quedan sin resolver, algunas de estas reacciones pueden ser
utilizadas con otra finalidad, como son por ejemplo los estudios de asociación HLA y
enfermedad, estudios familiares, reacciones para la resolución de ambigüedades
generadas por otras tecnologías, etc.
77 Anexos
ANEXOS
Anexo 1_BIOMARCADORES HLA EN LA ENFERMEDAD CELIACA
Reacciones para la determinación de HLA-DQ2/DQ8
En la siguiente figura se muestra la localización de los diferentes primers y sondas, utilizados en
las reacciones para la determinación de los alelos HLA asociados a CD (Figura 21):
REACCIONES DETERMINACIÓN DEL HLA DQ2 / DQ8
cDNA 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610
DQA1*01:01:01 TTCTTCAAGA TCAGTTACCT CACCTTCCTC CCTTCTGCTG ATGAGATTTA TGACTGCAAG GTGGAGCACT GGGGCCTGGA CCAGCCTCTT CTGAAACACT GGG
DQA1*02:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TG-------- ---------- ---
DQA1*03:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TG-------- ---------- ---
DQA1*04:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---
DQA1*05:01:01:01 ---------- ---------- ----C----- ---------- -G----G--- ---------- ---------- ---------- -A-------- ---------- ---
DQA1*06:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---
cDNA 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
DQB1*02:01:01 CTACTTCACC AACGGGACAG AGCGCGTGCG TCTTGTGAGC AGAAGCATCT ATAACCGAGA AGAGATCGTGC GCTTCGACA GCGACGTGGG GGAGTTCCGG GCGGTGACGC TGCTGGGGCT
cDNA 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370
DQB1*02:01:01 GCCTGCCGCC GAGTACTGGA ACAGCCAGAA GGACATCCTG GAGAGGAAAC GGGCGGCGGT GGACAGGGTG TGCAGACACA ACTACCAGTT GGAGCTCCGC ACGACCTTGC
DQA1*05_F DQA5s DQA5a DQA1*05_R
DQB1*02-03 F R1a-640 R1s
DQB1*02-03 R D354
Figura 21: localización de los primers (en azul y verde) y sondas (en amarillo) utilizados en las reacciones
para la determinación del HLA-DQ2/DQ8 asociado a CD
Reacciones para la determinación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02
En la siguientes figuras se muestra la localización de los diferentes primers y sondas, utilizados
en la reacciones para la determinación de la dosis génica del alelo HLA-DQB1*02 (Figuras 22 y
23).
78 Anexos
Reacción HLA-DQB1*02 EXÓN 1 DQB1*02_ex1_F Sonda_ex1
cDNA 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
DQB1*05:01:01:01 ATGTCTTGGA AGAAGTCTTT GCGGATCCCC GGAGACCTTC GGGTAGCAAC TGTCACCTTG ATGCTGGCGA TCCTGAGCTC CTCACTGGCT GAGGGCAGAG
CAATTATGTCTTGGA AAAAGG AC TGTGACCTTG ATGCTGTCGA T
DQB1*05:01:01:02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*06:01:01 ---------- -----G---- ---------- ----G----- ---C-C---- ---G------ ---------- -G------A- -C--G----- ----------
DQB1*06:02:01 ---------- -----G---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- -CT------- ----------
DQB1*06:03:01 ---------- -----G---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- -CT------- ----------
DQB1*06:09 ---------- -----G---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- -CT------- ----------
DQB1*02:01:01 ---------- -A---G---- ---------- ----G----- ---C------ ---G------ ------T--- -G------A- -C--G----- ----------
DQB1*02:02 ---------- -A---G---- ---------- ----G----- ---C------ ---G------ ------T--- -G------A- -C--G----- ----------
DQB1*03:01:01:01 ---------- -A---G---- ---------- ----G----- ---C------ ---T------ ---------- -G------A- -C--G----- ----------
DQB1*03:01:01:02 ---------- -A---G---- ---------- ----G----- ---C------ ---T------ ---------- -G------A- -C--G----- ----------
DQB1*03:01:01:03 ---------- -A---G---- ---------- ----G----- ---C------ ---T------ ---------- -G------A- -C--G----- ----------
DQB1*03:02:01 ---------- -----G---- ---------T ----G----- ---------- ---G------ ---------- -G------A- -C-GG----- ----------
DQB1*03:03:02:01 ---------- -----G---- ---------T ----G----- ---------- ---G------ ---------- -G------A- -C-GG----- ----------
DQB1*03:03:02:02 ---------- -----G---- ---------T ----G----- ---------- ---G------ ---------- -G------A- -C-GG----- ----------
DQB1*03:03:02:03 ---------- -----G---- ---------T ----G----- ---------- ---G------ ---------- -G------A- -C-GG----- ----------
DQB1*03:05:01 ---------- -----G---- ---------T ----G----- ---------- ---G------ ---------- -G------A- -C-GG----- ----------
EXÓN 1 INTRÓN 1 DQB1*02_ex1_R
cDNA 110 120 130 140 150 160 170 180
DQB1*05:01:01:01 ACTCTCCCG G TAAGTGCAGG AAAGCTGCTC TCCAGAGCCG CCACTCTGGG AACAGGCTTT CCTTGGGCTG GGGTATGGGG
TACTCTGGG AACAGGCTCT C
DQB1*05:01:01:02 --------- - ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:01 --------- - ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:02 --------- - ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*06:01:01 --C------ - ---------- GC-------- ---------- ---------- -------A-- ---------- -----G----
DQB1*06:02:01 --------- - ---------- GC-------- ---------- ---------- --------C- ---------- ----------
DQB1*06:03:01 --------- - ---------- GC-------- ---------- ---------- --------C- ---------- ----------
DQB1*06:09 --------- - ---------- GC-------- ---------- ---------- --------C- ---------- ----------
DQB1*02:01:01 --------- - ---------- GC-------- ---------- -T-------- --------C- ---------- -----C----
DQB1*02:02 --------- - ---------- GC-------- ---------- -T-------- --------C- ---------- -----C----
DQB1*03:01:01:01 --------- - ---------- GC-------- ---------- ---------- -----A--C- ---------- ----------
DQB1*03:01:01:02 --------- - ---------- GC-------- ---------- ---------- -----A--C- ---------- ----------
DQB1*03:01:01:03 --------- - ---------- GC-------- ---------- ---------- -----A--C- ---------- ----------
DQB1*03:02:01 --------- - ---------- GCCA------ ---------- ---------- --------C- ---------- -----G----
DQB1*03:03:02:01 --------- - ---------- GCCA------ ---------- ---------- --------C- ---------- -----G----
DQB1*03:03:02:02 --------- - ---------- GCCA------ ---------- ---------- --------C- ---------- -----G----
DQB1*03:03:02:03 --------- - ---------- GCCA------ ---------- ---------- --------C- ---------- -----G----
DQB1*03:05:01 --------- - ---------- GCCA------ ---------- ---------- --------C- ---------- -----G----
Figura 22: localización de los primers (en verde) y sonda (en azul) utilizados en la reacción para la
confirmación del HLA-DQB1*02
Reacción HLA no DQB1*02 Sense_no DQB1*02
gDNA 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540
DQB1*05:01:01:01 GGCTGGCGGG AACTGGAGGT CGCGCGGGCG GTTCCACAGC TCCGGTCCGG GTCAGGGCGG CGGCTGGGGG CGCAGCCGGG CTAGGGCCAG GCTGGGGCCT
GGCNGGCGGG AACTGGA
DQB1*05:01:01:02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*06:01:01 ---A------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G--G------ ---------- ----------
DQB1*06:02:01 ---G------ ---------- ---------- ---------- ---A-G---- ---------- ------C--- G--G------ --G--..... ......----
DQB1*06:03:01 ---G------ ---------- ---------- ---------- ---A-G---- ---------- ------C--- G--G------ --G--..... ......----
DQB1*06:09 ---G------ ---------- ---------- ---------- ---A-G---- ---------- ------C--- G--G------ --G--..... ......----
DQB1*02:01:01 ---C------ ----T-T--- ---------T ---------- -----G---- -------T-- ------C--- G--G-A---- --G--..... .......--G
DQB1*02:02 ---C------ ----T-T--- ---------T ---------- -----G---- -------T-- ------C--- G--G-A---- --G--..... .......--G
DQB1*03:01:01:01 ---C------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G.TG------ --G-----G- --C------G
DQB1*03:01:01:02 ---C------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G.TG------ --G-----G- --C------G
DQB1*03:01:01:03 ---C------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G.TG------ --G-----G- --C------G
DQB1*03:02:01 ---G------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G--G------ --G-----G- --C-------
DQB1*03:03:02:01 ---G------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G--G------ --G-----G- --C-------
DQB1*03:03:02:02 ---G------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G--G------ --G-----G- --C-------
DQB1*03:03:02:03 ---G------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G--G------ --G-----G- --C-------
DQB1*03:05:01 ---G------ ---------- ---------- ---------- -----G---- ---------- ------C--- G--G------ --G-----G- --C-------
EXÓN 2 Sonda_no DQB1*02/Sonda_0601 Antisense_3_no DQB1*02
gDNA 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660
DQB1*05:01:01:01 GACTGACTGG CCCGTGATTC CCCGCAG|AGG ATTTCGTGTA CCAGTTTAA GGCCTGTGCT ACTTCACCAA CGGGACGGAG CGCGTGCGGG GTGTGACCAG ACACATCTAT AACCGAGAGG
TGTGCT ACTTCACCAA CGGGAC TCGG TTATAGATGT RTCTGG
TGTGCT ACTTCACCAA TGGGAC
DQB1*05:01:01:02 ---------- ---------- -------|--- ---------- --------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:01 ---------- ---------- -------|--- ---------- --------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*05:03:01:02 ---------- ---------- -------|--- ---------- --------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
DQB1*06:01:01 -------C-- --G------- -------|--- --------CT --------- -C-A------ ---------- T--------- --------TT A--------- -T-------- ----------
DQB1*06:02:01 -------C-- --G------- -------|--- ---------T --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T--------- -T-------- ----------
DQB1*06:03:01 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T---A----- ---------- ----------
DQB1*06:09 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T---A----- -T-------- ----------
DQB1*02:01:01 C--------- --G------- -T-----|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ------A--- --------TC T-----G--- -AG------- --------A-
DQB1*02:02 C--------- --G------- -T-----|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ------A--- --------TC T-----G--- -AG------- --------A-
DQB1*03:01:01:01 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- -C-A------ ---------- ---------- --------TT A--------- -T-------- ----------
DQB1*03:01:01:02 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- -C-A------ ---------- ---------- --------TT A--------- -T-------- ----------
DQB1*03:01:01:03 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- -C-A------ ---------- ---------- --------TT A--------- -T-------- ----------
DQB1*03:02:01 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T--------- -T-------- ----------
DQB1*03:03:02:01 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T--------- -T-------- ----------
DQB1*03:03:02:02 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T--------- -T-------- ----------
DQB1*03:03:02:03 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ---------- --------TC T--------- -T-------- ----------
DQB1*03:05:01 -------C-- --G------- -------|--- ---------- --------- ---A------ ---------- ------C--- ---------- ---------- -T-------- ----------
Figura 23: localización de los primers (en amarillo) y sondas (en verde y azul) utilizados en la reacción para
la detección de alelos no HLA-DQB1*02
79 Anexos
Resultados obtenidos
En las siguientes tablas, correspondientes al grupo de pacientes con estudio serológico
compatible o no con CD, se muestran los datos demográficos (número de historia clínica (NHC),
sexo (S; H: hombres y M: mujeres) y edad (E)) así como los resultados de los estudios realizados
(aquellos valores marcados en rojo, ya sean estudios serológicos o genéticos, corresponden a
resultados positivos):
Estudios serológicos:
Se han realizado según el algoritmo diagnóstico de la Figura 1.
Biopsia intestinal:
En el caso de pacientes con estudio serológico compatible con CD se muestran las
observaciones correspondientes a la biopsia intestinal.
Estudios de HLA:
Se ha realizado la determinación del HLA-DQ2/DQ8 y en el caso de individuos HLA-
DQB1*02 positivo se ha completado el estudio con las 2 reacciones adicionales
desarrolladas previamente para ver si este alelo se encuentra en homocigosis (marcados
en azul oscuro) o heterocigosis (marcados en azul claro). En aquellos individuos que no
presentaban el alelo HLA-DQB1*02 (marcados en lila) no se ha completado el estudio
con estas 2 reacciones adicionales.
Grupo de pacientes con estudio serológico compatible con CD (Tabla 25):
Nº S E DQA1* DQB1* HLA IgA
(mg/dl)
Ac anti- Dx
Biopsia DQB1*
O5 O2 O302 DQ2 DQ8 Tg2 DGP EMA Descripción Marsh 02
1 H 6 P P N P N 138 98,63 17,49 P CD
Mucosa jejunal con atrofia
moderada, hiperplasia críptica
marcada, presencia de algunos
agregados linfoides
Marsh 3b HETERO-
2 H 7 P P N P N 94 >100 41,17 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HOMO-
3 H 5 P P N P N 100 58,42 13,16 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HOMO-
4 M 6 P P N P N 30,8 >100 40,65 P CD?? HOMO-
5 M 2 P P N P N 122 >100 35,33 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HETERO-
6 M 65 P P N P N 303 35,55 191,13 P CD?? HOMO-
7 H 5 P P N P N 82 >100 >100 P CD Atrofia vellositaria moderada,
hiperplasia de criptas Marsh 3b HOMO-
8 H 15 P P N P N 318 28,5 9,33 P CD?? Cambios inespecíficos Marsh 1 HETERO-
9 H 2 P P N P N 62 >100 >100 P CD Marsh 3b HOMO-
10 M 26 P P N P N 241 19,64 CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HETERO-
11 M 2 P P N P N 116 >100 >100 P CD Marsh 3b HETERO-
12 M 2 N P P N P 119 53,06 12,1 P CD
Biopsia poco alterada pero
buena respuesta a dieta sin
gluten
Marsh 1 HETERO-
80 Anexos
13 M 3 P P N P N 179 >100 228,11 P CD Atrofia vellositaria Marsh 3c HETERO-
14 H 15 P P N P N 76,7 16,55 P CD HETERO-
15 M 2 P P N P N 81 35,57 13,23 P CD?? En 3-4 años se hará prueba de
provocación con gluten Marsh 1 HETERO-
16 M 14 P P N P N 51 - 36 P CD Atrofia vellositaria Marsh 3 HOMO-
17 M 54 P P N P N 190 39,74 29,01 P CD?? HOMO-
18 H 3 P P N P N 75 >100 14,02 P CD Atrofia vellositaria duodenal Marsh 3b HETERO-
19 M 8 P P N P N 146 >100 28,62 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HOMO-
20 H 2 P P N P N 48 76,22 15,53 P CD Infiltrado linfocitario
intraepitelial Marsh 3c HETERO-
21 M 8 P P N P N 68 >100 >100 P CD HOMO-
22 H 9 N N P N P 130 - >100 P CD Atrofia vellositaria Marsh 3
23 M 1 P P N P N 106 26 242,96 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HOMO-
24 M 3 P P N P N 68 54,47 49,95 P CD HETERO-
25 M 12 P P N P N 63 42,23 CD Atrofia vellositaria Marsh 3c HETERO-
26 H 14 P P N P N 93 - N P T1280 CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HETERO-
27 M 10 P P N P N 96 - >100 P CD Atrofia vellositaria moderada-
severa Marsh 3b HETERO-
28 H 66 P P P P P 262 17,3 19 N CD?? HETERO-
29 H 6 P N P N P 169 36,84 8,43 P CD Atrofia vellositaria moderada Marsh 3b
30 M 10 P P N P N 138 >100 58,2 P CD Compatible Marsh 3 HOMO-
31 H 7 P P N P N 58,7 >100 >100 P CD HOMO-
32 M 4 P P N P N 151 16,6 3,17 P CD?? Debut diabético HETERO-
33 M 8 P P N P N 92 41,05 64,92 P CD
Atrofia vellositaria moderada,
aumento de linfocitos
intraepiteliales
Marsh 3b HETERO-
34 M 3 P P N P N 115 >100 >100 P CD
Atrofia vellositaria severa,
marcada linfocitosis
intraepitelial
Marsh 3c HETERO-
35 M 2 P P N P N 45 10,07 >100 P CD Atrofia vellositaria leve.
Linfocitosis intraepitelial Marsh 3a HOMO-
36 M 0 P P N P N 222 67,81 >100 P CD
Atrofia moderada-severa de las
vellosidades, linfocitosis
intraepitelial
Marsh 3b HOMO-
37 M 2 P P N P N 57 60 107,08 CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HETERO-
38 M 12 P P N P N 64 >100 18,17 CD Atrofia vellositaria moderada-
severa, hiperplasia de criptas Marsh 3b HETERO-
39 H 4 P P P P P 88 >100 8,24 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HETERO-
40 M 17 P P N P N 143 - >100 P CD HETERO-
41 M 2 N P P N P 118 >100 PSL P CD Atrofia vellositaria marcada,
infiltrado intraepitelial Marsh 3b HETERO-
42 M 0 P P N P N 177 >100 PSL P CD Pendiente???? HOMO-
43 M 44 P P N P N 210 19,56 3,26 P CD?? Biopsia normal, control anual
anti-tg Marsh 0 HETERO-
44 M 12 P N P N P 103 38,23 22,58 P CD
Atrofia vellositaria severa,
moderado infiltrado
linfoplasmocitario y exocitosis
Marsh 3c
45 H 13 P P N P N 146 >100 >100 P CD?? No biopsia! No clínica digestiva,
debut diabético HOMO-
46 H 1 P P N P N 154 >100 PSL P CD No biopsia!! Buena respuesta a
dieta sin gluten HETERO-
47 M 73 P P N P N 374 44,4 26,49 N CD?? HOMO-
81 Anexos
48 M 2 P P N P N 40,4 >100 102 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HOMO-
49 M 4 N P N N N 162 >100 >100 P CD Atrofia vellositaria severa Marsh 3c HETERO-
50 H 14 P P P P P 149 >100 >100 P CD?? HETERO-
51 H 8 P P N P N 73 - >100 P CD HETERO-
52 M 14 P P N P N 183 - 27 P CD HETERO-
53 H 7 N P P N P 73 >100 33,03 P CD Atrofia vellositaria Marsh 3 HETERO-
54 M 8 P P N P N 102 >100 220,76 P CD HETERO-
55 M 3 P P N P N 92 >100 P CD No biopsia! HOMO-
56 M 34 P P N P N 230 31 20 P CD?? Biopsia sin alteraciones en
vellosidades Marsh 1 HOMO-
57 M 7 P P N P N 130 12 6 P CD?? Biopsia pendiente HOMO-
Tabla 25: características de los pacientes con estudio serológico compatible con CD
Grupo de individuos estudio serológico no compatible con CD (Tabla 26):
Nº S E DQA1* DQB1* HLA IgA
(mg/dl)
Ac anti- DQB1*
O5 O2 O302 DQ2 DQ8 Tg2 DGP Tg2 (IgG) 02
1 H 20 N P N N N 163 0.85 HETERO
2 H 2 P P N P N 68 6.73 6.23 HETERO
3 M 2 P P N P N 72 0.65 3.23 HETERO
4 M 2 P N N N N 30 0.27 1.45
5 H 8 N N P N P 118 0.82
6 M 49 P P N P N 39 0.39 HETERO
7 H 32 P P N P N 247 0.88 HOMO
8 H 55 N N P N P 225 0.82
9 H 43 P N P N P 0.49
10 M 76 P N N N N 104 0.83
11 M 35 P N N N N 186 1.26
12 H 9 N N N N N 266 0.81
13 H 0 P N N N N 28 0.31 14.53
14 H 38 N N N N N 262 1.13
15 H 41 P P N P N 169 1.27 HOMO
16 M 27 P N N N N 159 1.62
17 M 11 N N P N P 1.06 0.03
NEG
18 M 33 P P N P N 154 1.35 HETERO
19 M 14 N N N N N 132 0.6
20 M 6 P P N P N 131 0.8 HETERO
21 H 3 N P N N N 0.26 0.04 0.25 NEG HETERO
22 M 1 N N N N N 53 0.42 32.81
23 H 24 P P N P N 170 0.58 HETERO
24 M 1 P P N P N 50 0.37 1.75 HETERO
25 H 37 N P N N N 288 2.18 HETERO
26 H 1 N N N N N 46 <10 1.9
27 M 34 N N N N N 369 0.94
82 Anexos
28 M 46 P P N P N HETERO
29 H 5 N P N N N 63 0.22 HETERO
30 M 8 P P N P N 68 1.36 HOMO
31 H 2 N P N N N 4.98 0.74 NEG HETERO
32 M 29 P P N P N 224 0.64 HETERO
33 H 41 P P N P N 253 1.57 HETERO
34 M 24 N N N N N 199 0.31
35 M 69 N P N N N 164 1.36 HETERO
36 M 31 P N N N N 219 <10
37 H 1 N N N N N 103 0.42 0.7
38 M 38 N N N N N 142 0.69
39 M 81 N N N N N
40 H 29 N P N N N HETERO
41 M 4 P P N P N 13.4 HETERO
42 H 54 N P N N N 161 1.05 HETERO
43 M 32 P P N P N 284 1.18 HETERO
44 M 24 N N N N N 221 0.81
45 M 12 P P N P N 116 0.31 HETERO
46 H 51 P N N N N 222 0.65
47 M 29 N N N N N 270 0.43
48 H 36 N P N N N 314 1.94 HETERO
49 M 2 P N N N N 111 0.28 1.48
50 H 2 N N N N N 65 0.98 2.45
51 M 38 N N N N N
52 H 7 N N P N P 29 0.88 3.8
53 H 1 P P P P P 30 5.58 3.8 HETERO
54 H 34 N P N N N 185 0.91 HETERO
55 H 11 P P N P N 190 1.41 HETERO
56 H 56 N N N N N 537 1.14
57 H 74 P N N N N 149 <10
58 M 43 P P N P N 259 1.17 HETERO
59 H 54 N N P N P 440 2.31
60 M 53 N N P N P 300 0.99
61 M 43 P N N N N 229 2.68
62 M 52 P N N N N 342 0.9
63 M 5 N N N N N 71 0.33
64 H 26 P P N P N 304 1.67 HETERO
65 M 3 P P N P N 32 0.28
HETERO
66 M 9 N P N N N 136 1.09
HETERO
67 M 7 P P N P N 43 1.27
HETERO
68 H 48 N P N N N 361 1.54
HETERO
69 M 69 N P N N N 329 1.32
HETERO
70 M 33 N N N N N 161 0.91
71 H 9 P P N P N 128 0.89
HOMO
72 M 5 N N N N N 3.98 0.09
NEG
83 Anexos
73 H 3 P P N P N 45 6.55
HETERO
74 H 2 P P N P N 28 0.13 0.76
HETERO
75 M 0 N P N N N 31 0.44 1.83
HETERO
76 M 45 N N P N P 459 1.41
77 M 44 N N P N P 176 0.91
78 M 52 P P N P N 239 1.52
HETERO
79 M 68 N P P N P 130 0.69
HETERO
80 H 51 P N P N P 239 1.37 4.2
81 M 5 P P N P N 86 0.49 HETERO
82 M 1 N P N N N 34 0.3 0.6 HOMO
83 H 38 N P N N N 113 0.43 HOMO
84 H 2 P P N P N 1 HETERO
85 H 3 P P N P N 1 HETERO
86 M 42 N N P N P 150 1
Tabla 26: características de los pacientes con estudio serológico no compatible con CD
84 Anexos
Anexo 2_BIOMARCADORES EN LA ENFERMEDAD DE GRAVES
Alelos HLA de clase I
A continuación se muestra la localización de los primers y sondas utilizados en las reacciones
diseñadas para el tipaje de los alelos HLA-B (Figura 24) y HLA-C (Figura 25) relacionados con la
GD:
85 Anexos
F_B08 p127 P1a gDNA 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320
B*07:02:01 CCATGAGGTA TTTCTACACC TCCGTGTCCC GGCCCGGCCG CGGGGAGCCC CGCTTCATCT CAGTGGGCTA CGTGGACGAC ACCCAGTTCG TGAGGTTCGA CAGCGACGCC
B*08:01:01 ---------- ----G----- G--A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*13:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*14:02:01 ---------- ---------- G--------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*15:01:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*18:01:01:01 ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --------G- ---------- ---------- ----------
B*27:04:01 ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*35:01:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*37:01:01 ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*38:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*39:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*40:01:01 ---------- ----C----- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*41:01 ---------- ----C----- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*44:02:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*45:01 ---------- ----C----- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*46:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*47:01:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*48:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*49:01:01 ---------- ----C----- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*50:01:01 ---------- ----C----- G--A------ ---------- ---------- ---------A -C-------- ---------- --G-T----- ---------- ----------
B*51:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- --------TG ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*52:01:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*53:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*54:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- --G------- --C------- ----------
B*55:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*56:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*57:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*58:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*59:01:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- ---------G ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*67:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
B*73:01 ---------- ----C----- ---------- ----T----- ---------- ---------A -C-------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*78:01:01 ---------- ---------- G--A------ ---------- ---------- --------TG ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*81:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*82:02 ---------- ---------- G-TA------ ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- ---------- ----------
P18s R_B08 gDNA 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430
B*07:02:01 GCGAGTCCGA GAGAGGAGCC GCGGGCGCCG TGGATAGAGC AGGAGGGGCC GGAGTATTGG GACCGGAACA CACAGATCTA CAAGGCCCAG GCACAGACTG ACCGAGAGAG
B*08:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ----A--A-C A--------- ----------
B*13:01:01 A--------- -GAT--C--- C--------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ---------A
B*14:02:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---A------ ---------- ---------G ----A--A-C A--------- ----------
B*15:01:01:01 ---------- -GAT--C--- C--------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*18:01:01:01 ---------- -GAC------ C--------- ---------- -A-------- ---------- ---------- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*27:04:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------G -------A-- ---------- ----------
B*35:01:01:01 ---------- -GAC------ C--------A ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ----A--A-C A--------T ----------
B*37:01:01 ---------- -GAC------ C--------- ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T --------GA
B*38:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---A------ ---------- ---------G ----A--A-C A--------T ---------A
B*39:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---A------ ---------- ---------G ----A--A-C A--------- ----------
B*40:01:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*41:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*42:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*44:02:01:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ---------A
B*45:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*46:01:01 ---------- -GAT--C--- C--------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ------AG-- ----CG---- ---------- ------T---
B*47:01:01:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T --------GA
B*48:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*49:01:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ---------A
B*50:01:01 A--------- -GA------- ---------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ----------
B*51:01:01 ---------- -GAC------ C--------A ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ----A--A-C A--------T ---------A
B*52:01:01:01 ---------- -GAC------ C--------A ---------- ---------- ---------- ------G-G- ---------C ----A--A-C A--------T ---------A
B*53:01:01 ---------- -GAC------ C--------A ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ----A--A-C A--------T ---------A
B*54:01:01 ---------- ---G------ ---------- ---G-G---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*55:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*56:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*57:01:01 ---------- -GAT--C--- C--------A ---------- ---------- ---------- ---G--G-G- ---G--A-AT G------TCC --G------T ---------A
B*58:01:01 ---------- -GAC------ C--------A ---------- ---------- ---------- ---G--G-G- ---G--A-AT G------TCC --G------T ---------A
B*59:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ----A--A-C A--------T ---------A
B*67:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*73:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------G -------A-- ---------- ------T-G-
B*78:01:01 ---------- -GAC------ C--------A ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ----A--A-C A--------- ----------
B*81:01 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
B*82:02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
P20s P20a A25_44as gDNA 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530
B*07:02:01 CCTGCGGAAC CTGCGCGGCT ACTACAACCA GAGCGAGGCC G|GTGAGTGAC CCCGGCCCGG GGCGCAGGTC ACGAC...TCCCC ATCCCCCACG TACGGCCCGG
B*08:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- G---------
B*13:01:01 ------C-C- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- G---------
B*14:02:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- G---------
B*15:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- -------T-- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*18:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*27:04:01 --------C- ----T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*35:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*37:01:01 --------C- ----T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*38:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*39:01:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*40:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*41:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- G---------
B*42:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- G---------
B*44:02:01:01 ------C-C- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*45:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*46:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- -------T-- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*47:01:01:01 --------C- ----T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*48:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*49:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*50:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*51:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*52:01:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*53:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*54:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*55:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*56:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*57:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*58:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*59:01:01:01 --------T- GC--T-C--- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*67:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*73:01 ---------- ---------- ---------- --------A- -|--------- -------T-- ---------- -----CCC----- -A----G--- ----------
B*78:01:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*81:01 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- ----------
B*82:02 ---------- ---------- ---------- ---------- -|--------- ---------- ---------- -----...----- ---------- G---------
Figura 24: primers (en verde) y sondas (en amarillo) utilizados en las reacciones de los alelos HLA-B
asociados con GD
86 Anexos
INTRÓN 2 EXÓN 3
620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740
G TTCTCACACC ATCCAGATAA
G GTCTCACACC CTCCAGAGCA
Cw*010201 CCAGTCACCT TTACCCGGTT TCATTTTCAG TTTAGGCCAA AATCCCCGCG GGTTGGTCGG GACTGGGGCG GGGCTCGGGG GACGGGGCTG ACCACGGGGG CGGGGCCAG|G GTCTCACACC CTCCAGTGGA
Cw*020202 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---.------ ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*0211 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---.------ ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*030202 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---------- ---G------ ---------|- --------T- ------A---
Cw*030401 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---------- ---G------ ---------|- --------T- A-----A---
Cw*030402 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---------- ---G------ ---------|- --------T- A-----A---
Cw*0306 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---------- ---G------ ---------|- --------T- A-----A---
Cw*0313 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---------- ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*0320N ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---------- ---G------ ---------|- --------T- A-----A---
Cw*04010101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---C------ ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*04010102 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*050101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*0508 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*0509 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*06020101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*06020102 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*070101 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*07020101 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*07020102 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G-----C ---------|- ---------- ------A---
Cw*07020103 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*070401 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- T-----A---
Cw*070402 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- T-----A---
Cw*0719 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*0726 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*0730 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*0732N ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*0749 ------G--- ---------- --------G- ---------- ---------- ---------- -G-.------ ---------- ---T------ ---G------ ---------|- ---------- ------A---
Cw*080101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*0802 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*120202 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*12030101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*1208 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
Cw*1213 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*1219 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*1403 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*150201 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- --------T- A-----A---
Cw*1516 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- --------T- A-----A---
Cw*160101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- -------C-- ---------- ---------- ---------|- ---------- ----------
Cw*1701 -T----G--- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G-------- ---------- ---------- ---------- ---------|- T--------- A-----A---
Cw*1801 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------|- ---------- ------A---
E3
750 760 770 780 790 800 810 820 830 (459)840 850 860 870
TGTATGGCTG CGACGTGGGG CCGGACGGGC GCTTCCTCCG CGGGTACCGG CAGGACGCCT ACGACGGCAA GGATTACATC GCCCTGAACG AGGACCTGCG CTCTTGGACC GCGGCGGACA TGGCAGCTCA
TGTACGGCTG CGACGTGGGG CCGGACGGGC GCCTCCTCCG CGGGCATGAC CAGTACGCCT ACGACGGCAA GGATTACATC GCCCTGAACG AGGACCTGCG CTCCTGGACC GCCGCGGACA CGGCGGCTCA
Cw*010201 TGTGTGGCTG CGACCTGGGG CCCGACGGGC GCCTCCTCCG CGGGTATGAC CAGTACGCCT ACGACGGCAA GGATTACATC GCCCTGAACG AGGACCTGCG CTCCTGGACC GCCGCGGACA CCGCGGCTCA
Cw*020202 ---AC----- ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -A--------
Cw*0211 ---AC----- ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ----A----- ---------- ---------- ---------- -A--------
Cw*030202 ---A------ ----G----- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*030401 ---A------ ----G----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*030402 ---AC----- ----G----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*0306 ---A------ ----G----- ---------- ---------- --------T- ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*0313 ---A------ ----G----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*0320N ---A------ ----G----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*04010101 ---T------ ---------- --G------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*04010102 ---T------ ---------- --G------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*050101 ---A------ ---------- ---------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- --------T- ---------- ---------- ---------- AG--------
Cw*0508 ---A------ ---------- ---------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- --------T- ---------- ---------- ---------- AG--------
Cw*0509 ---A------ ---------- ---------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- --------T- ---------- ---------- ---------- AG--------
Cw*06020101 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*06020102 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*070101 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*07020101 ---C------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*07020102 ---C------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*07020103 ---C------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*070401 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*070402 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0719 ---C------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0726 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0730 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0732N ---C------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0749 ---C------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*080101 ---A------ ---------- ---------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- --------T- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*0802 ---A------ ---------- ---------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- --------T- ---------- ---------- ---------- AG--------
Cw*120202 ---AC----- ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --T------- -G--------
Cw*12030101 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------T ---------- -G--------
Cw*1208 ---AC----- ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --T------- -G--------
Cw*1213 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- --------TT ---------- -G--------
Cw*1219 ---A------ ---------- ---C------ ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*1403 ---T------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
Cw*150201 ---A------ ---------- ---------- ---------- ----C----- ----TA---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*1516 ---A------ ---------- ---------- ---------- ----C----- ----TA---- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*160101 ---A------ ---------- ---------- ---------- ---------- ----C----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -G--------
Cw*1701 ---A------ ---------- ---------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --G------- -G--------
Cw*1801 ---T------ ---------- --G------- ---------- -------A-- ----T----- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ---------- -G--------
880 890 900 910 920 930 940 950 960 (590)970 980 990
GATCACCAAG CGCAAGTGGG AGGCGGTCCA TGCGGCGGAG CAGCGGAGAG TCTACCTGGA GGGCCG GTGC GTGGACGGGC TCCGCAGATA CCTGGAGAAC GGGAAGGAGA CGCTGCAGCG
GATCACCCAG CGCAAGTGGG AGGCGGCCCG TGAGGCGGAG CAGCGGAGAG CCTACCTGGA GGGCGA GTGC GTGGAGTGGC TCCGCAGATA CCTGGAGAAC GGGAAGGACA AGCTGGAGCG
Cw*010201 GATCACCCAG CGCAAGTGGG AGGCGGCCCG TGAGGCGGAG CAGCGGAGAG CCTACCTGGA GGGCAC.......GTGC GTGGAGTGGC TCCGCAGATA CCTGGAGAAC GGGAAGGAGA CGCTGCAGCG
Cw*020202 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ----GA.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0211 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ----GA.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*030202 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----CT.......---- ---------- ---------- ----A----T ---------- ----------
Cw*030401 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----CT.......---- ---------- ---------- ----A----T ---------- ----------
Cw*030402 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----CT.......---- ---------- ---------- ----A----T ---------- ----------
Cw*0306 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----CT.......---- ---------- ---------- ----A----T ---------- ----------
Cw*0313 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----CT.......---- ---------- ---------- ----A----T ---------- ----------
Cw*0320N ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----CT.......---- ---------- ---------- ----A----T ---------- ----------
Cw*04010101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*04010102 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*050101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ------A--- ----------
Cw*0508 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ------A--- ----------
Cw*0509 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*06020101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*06020102 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*070101 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*07020101 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*07020102 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*07020103 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*070401 ---------- -------T-- ---------- --C------- ---GAC---- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ------A--- ----------
Cw*070402 ---------- -------T-- ---------- --C------- ---GAC---- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ------A--- ----------
Cw*0719 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0726 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0730 ---------- -------T-- ---------- --G------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0732N ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------CGCAGATACCT ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*0749 ---------- -------T-- ---------- --C------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*080101 ---------- ---------- ---------- -AC------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ------A--- ----------
Cw*0802 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ------A--- ----------
Cw*120202 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*12030101 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*1208 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*1213 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T------ ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*1219 ---------- ---------- ---------- ---------- ---T-C---- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*1403 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*150201 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*1516 ---------- ---------- ---------- ---------- ----T----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*160101 ---------- ---------- ---------- --C------- ----A----- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Cw*1701 ----T----- -------T-- ---------- ---------- ----T----- ---------- ----GA.......---- ---------- -----G---- ---------- ---------- ----------
Cw*1801 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ------.......---- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
SC16/7_Sensor
SC07
F_C03
R_C16
SC03_Sensor R_C03
R_C07
F_C07
F_C16
SC16/7_Anchor
SC03_Anchor
Figura 25: primers (en verde los del alelo HLA-C*03, en rojo los del HLA-C*07 y en amarillo los del HLA-
C*16) y sondas (en gris) utilizados en las reacciones de los alelos HLA-C asociados con GD
87 Anexos
Interpretación de los resultados obtenidos
En cada una de las reacciones diseñadas para el tipaje de los alelos HLA de clase I asociados con
GD, se han obtenido diferentes Tm, según el alelo en cuestión. Estas diferentes Tm obtenidas
para cada uno de los alelos HLA-B y HLA-C en cada una de las reacciones se han codificado en la
siguiente tabla (Tabla 27) utilizando un código binario, de tal manera que se ha marcado como 1
aquel alelo que da positivo a la Tm correspondiente o como 0 aquel alelo que no da señal a la
Tm en cuestión.
HLA asociados con GD
B*08 B*44_1 B*44_2 C*03 C*07 C*16
Tm 63ºC 50ºC 60ºC 52ºC 56ºC 59ºC 70ºC 67ºC 59ºC 67ºC 60ºC
HLA-B
07 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
08 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
13 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
27 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0
35 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
38 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
39 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
40 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0
41 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0
42 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
44 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
45 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0
46 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
47 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0
48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
49 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0
50 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0
51 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
52 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
53 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
54 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
55 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
56 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
57 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
58 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
59 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
67 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
88 Anexos
73 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0
78 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
82 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
HLA-C
01 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
02 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
03 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
04 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
05 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tabla 27: resumen de las Tm obtenidas en las reacciones para el tipaje de los alelos HLA-B y HLA-C
asociados con GD
Polimorfismos de PTPN22 y CTLA4
A continuación se muestra la localización de los primers y sondas utilizados en las reacciones
diseñadas para el tipaje de los polimorfismos rs2476601 (Figura 26) y rs231775 (Figura 27)
relacionados con la GD. Los polimorfismos rs2476601 y rs231775 se encuentran localizados en
los exones 14 y 1 de los genes PTPN22 y CTLA4, respectivamente.
ATGAACTCCTCAAACTCAAGGCTCACACATCAGCTTCCCAAAGTGCTGGAATTAAAGGCATGAGCCACCATGCCCATCCCACACTTTATTTTATACTTACTGAACTGTACTCACCAGCTTCCTCAACCACAATAAATGATTCAGGTGTCCGTACAGGAAGTGGAGGGGGGATTTCATCATCTATCCTTGGAGCAGTTGCTATCCAAAATGTCAAAAATATTGTAACAATTGTTAATTAGAACAATCCAAAGGAAATTCTT
Figura 26: primers (en verde) y sondas (en azul; donde el SNP corresponde al nucleótido marcado en rojo)
utilizados en las reacciones para la determinación del polimorfismo rs2476601 asociado con GD
89 Anexos
.....cacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctttctattcaagtEXÓN1GCCTTCTGTGTGTGCACATGTGTAATACATATCTGGGATCAAAGCTATCTATATAAAGTCCTTGATTCTGTGTGGGTTCAAACACATTTCAAAGCTTCAGGATCCTGAAAGGTTTTGCTCTACTTCCTGAAGACCTGAACACCGCTCCCATAAAGCCATGGCTTGCCTTGGATTTCAGCGGCACAAGGCTCAGCTGAACCTGGCTACCAGGACCTGGCCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTGCAAAGEXÓN1gtgagtgagacttttggagcatgaa..........gttccc
tttggcttttccatgctagEXÓN2CAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGC
Figura 27: primers (en verde) y sondas (en azul; donde el SNP corresponde al nucleótido marcado en rojo)
utilizados en las reacciones para la determinación del polimorfismo rs231775 asociado con GD
Resultados obtenidos
A continuación se muestran los resultados obtenidos, tanto para el tipaje de los alelos HLA de
clase I estudiados como los referentes a los polimorfismos de PTPN22 y CTLA4 en el grupo de
pacientes (Tabla 28) y controles (Tabla 29):
HLA-B* HLA-C* PTPN22 CTLA4 HLA-B* HLA-C* PTPN22 CTLA4
08 44 03 07 16 rs2476601 rs231775 08 44 03 07 16 rs2476601 rs231775
1 293 N N N N P G/A A/A 89 237 N N P N N G/A A/G
2 305 N N N P N G/G A/G 90 452 P N N P N G/G A/G
3 308 N P N N P G/A G/G 91 453 N N P N N G/G A/G
4 310 N N N P N G/A A/A 92 455 N N N N N G/G A/G
5 314 N N N P N G/G A/G 93 459 P N N P N G/G A/G
6 334 N N N N N G/G G/G 94 464 P N N P N G/G A/A
7 378 N P N N N G/G A/G 95 471 P N N P N G/G A/G
8 38 N N P N N G/G A/G 96 472 N P P N N G/G A/G
9 381 N N N N N G/G A/A 97 474 N P N P N G/G A/G
10 389 N P N N P G/A A/G 98 476 N P N N N G/G A/G
11 390 N N N N N G/G A/A 99 477 P N N P N G/G A/A
12 391 N N N P N G/G A/G 100 478 N N N N N G/G G/G
13 393 N N P N N G/G A/G 101 479 N N N P P G/A A/G
14 394 N N N P N G/A G/G 102 480 N N N P N G/G A/A
15 40 N P N N P G/G A/A 103 481 N N N N N G/G G/G
16 403 P N P N N G/G A/A 104 482 P N N P N G/G A/A
17 265 N N N N N G/G A/A 105 483 N N N N P G/G A/G
18 270 N N N N N G/A A/G 106 484 N P N N P G/G A/G
19 278 N N N N N G/G A/A 107 485 P N N P N G/G A/G
20 286 N P N N P G/G A/G 108 488 N N N P N G/G A/A
21 277 P N N P N G/G A/A 109 490 N N P N N G/G A/G
22 287 P N N P N G/G G/G 110 491 P P N P P G/G A/A
23 336 P N N P N G/G A/G 111 492 P N N P N G/G A/A
24 208 P N N P N G/G A/A 112 493 N N N N N G/G A/A
25 124 P P N P N G/G A/G 113 494 N P N P P G/G G/G
26 200 N N N N N G/G G/G 114 495 N N N N N G/G A/G
90 Anexos
27 204 N N P N N G/G A/G 115 500 N N P N N G/G A/G
28 26 N N N N N G/A G/G 116 501 N N N P N G/G G/G
29 212 N P N N P G/G A/G 117 502 P N N P N G/G A/G
30 220 N N N N N G/G G/G 118 PGB5 N N N N N G/A G/G
31 242 N N N P N G/G A/G 119 PGB7 P N N P N G/G A/G
32 255 N P N P N G/G G/G 120 PGB12 N P N N N G/G G/G
33 373 N N N P N G/G A/G 121 PGB13 P N P P N G/A A/G
34 164 N N N N N G/G G/G 122 PGB14 N N N P N G/G A/G
35 10 P N N P N G/G A/A 123 PGB20 N N P N N G/G A/A
36 102 N N N P N G/G A/A 124 PGB31 P N N P N G/G A/G
37 107 N N N P N G/G A/G 125 85 N N N P N G/G A/G
38 108 N N N N N G/A A/G 126 172 N N N P N G/A G/G
39 119 N N P N N G/G A/A 127 259 P N N P N G/G A/G
40 134 P N N P N G/G A/A 128 459 N N N N N G/G A/G
41 35 N N P N N G/G G/G 129 550 N N P N N A/A A/G
42 186 N N N N N G/G A/A 130 551 N N N P N G/G A/G
43 140 N N N N N G/G A/G 131 553 N N N N N G/G A/A
44 141 N N P N N G/G A/G 132 524 N N N P N G/G A/A
45 143 N N N P N G/G A/G 133 561 P N N P N G/G A/A
46 172 N N P N N G/G G/G 134 574 N P N N N G/A A/G
47 412 N N N N N G/A G/G 135 635 P N N P N G/G A/A
48 413 N N N N P G/G A/A 136 636 P N N P N G/G A/A
49 416 N N P N N G/G A/A 137 646 N N P N N G/G A/G
50 417 P N N P N G/G A/A 138 648 P N N P N G/G A/G
51 421 P N N P N G/G A/G 139 653 N N N N N G/G A/G
52 423 N N N P N G/G A/A 140 655 P N N P N G/G A/G
53 424 N N N N N G/G A/G 141 658 N N N N N G/A G/G
54 425 N N P N N G/A A/G 142 659 N N N N N G/A A/G
55 426 N N N P N G/G A/G 143 665 N N N P N G/G A/A
56 429 N N N N N G/G A/A 144 671 N P N P N G/A A/G
57 430 N N P N N G/G G/G 145 673 N P N P N G/G A/A
58 442 P N N P N G/G G/G 146 674 N N P P N G/G A/G
59 443 N N N P N G/G G/G 147 676 N P P N N G/G A/G
60 445 P N N P N G/G A/G 148 678 N P N P N G/G A/A
61 446 N P N N N G/G A/A 149 681 N N N P N G/G A/G
62 161 P N N P N G/G A/A 150 687 N N N P N G/A A/A
63 196 N N N N N G/G A/A 151 688 P N N P N G/A A/G
64 179 N N N N N G/G A/G 152 689 P N N N N G/G A/G
65 180 P N N P N G/A G/G 153 690 N P N N N G/A A/A
66 183 N N N N N G/G A/G 154 691 N N N P N G/G A/A
67 2 P N N P N G/G A/G 155 692 P N N P P G/G A/G
68 193 N N N P N G/G A/A 156 698 N N N P N G/G A/A
69 176 N N N P N G/G A/A 157 699 P N N P N G/A A/A
70 257 P N N P N G/A A/A 158 700 P N P P N G/A A/G
71 145 N P N N N G/G A/A 159 701 N N N P N G/G A/G
91 Anexos
72 139 P N N P N G/A A/G 160 702 N N N P N G/G A/A
73 157 N P N N P G/G A/A 161 703 N N N P N G/G A/G
74 146 N N P N N G/G G/G 162 704 N N N P N G/A A/G
75 450 N N P P N G/G A/A 163 705 N N N N N G/G A/A
76 45 N N N N N G/G A/G 164 706 N N N P N G/G A/A
77 46 N N N P N G/G A/G 165 707 P N N P N G/A A/A
78 53 N N N N P G/A A/A 166 708 N P N N P G/G A/A
79 57 N N N P N G/A G/G 167 709 N N N N N G/G A/A
80 73 N P P N N G/A A/A 168 710 N N P N N G/G G/G
81 81 N N N P N G/G A/G 169 712 N N P N N G/G A/A
82 92 N N N P N G/G G/G 170 714 P N N P N G/A A/A
83 98 N N N N N G/G A/A 171 720 N N N N N G/G A/A
84 112 N P N P N G/G A/A 172 734 N P N N N G/G A/G
85 158 N N N N N G/A A/A 173 735 N P N P N G/A A/G
86 166 N N N P N G/G A/G 174 736 N N N N N G/G A/A
87 190 N N N N N G/G A/G 175 737 N P N N P G/A A/G
88 213 N P P N P G/G G/G
Tabla 28: resultados genéticos obtenidos para el grupo de pacientes con GD
Nº nº Eyra HLA PTPN22 CTLA4
Nº nº Eyra HLA PTPN22 CTLA4
1 201205161218142 B*18 B*51 Cw*05 Cw*15 G/G A/A
77 201206131221198 B*35 B*37 Cw*04 Cw*06 G/G A/G
2 201205161218143 B*07 B*18 Cw*05 Cw*07 G/G A/A
78 201206131221216 B*40 B*49 Cw*03 Cw*07 G/A G/G
3 201205161218173 B*08 B*51 Cw*07 Cw*14 G/G A/G
79 201206141221338 B*15 B*35 Cw*03 Cw*04 G/G A/G
4 201205171218287 B*08 B*18 Cw*05 Cw*07 G/G A/A
80 201206141221339 B*08 B*35 Cw*04 Cw*07 G/G A/G
5 201205171218288 B*08 BL Cw*07 BL G/G A/G
81 201206141221343 B*08 B*14 Cw*07 Cw*08 G/G A/G
6 201205171218316 B*14 B*27 Cw*02 Cw*08 G/G G/G
82 201206141221344 B*15 B*35 Cw*03 Cw*04 G/G A/A
7 201205181218472 B*13 B*44 Cw*06 Cw*16 G/G A/G
83 201206141221357 B*07 B*49 Cw*07 BL G/G A/A
8 201205191218525 B*18 B*51 Cw*05 Cw*15 G/G A/A
84 201206151221519 B*40 B*51 Cw*03 Cw*15 G/G A/A
9 201205191218526 B*07 B*51 Cw*02 Cw*07 G/G A/A
85 201206151221520 B*49 B*57 Cw*06 Cw*07 G/G A/A
10 201205201218527 B*18 B*51 Cw*05 Cw*14 G/G A/A
86 201206151221543 B*08 B*44 Cw*05 Cw*07 G/A A/G
11 201205201218528 B*44 B*52 Cw*05 Cw*12 G/G G/G
87 201206151221544 B*18 B*51 Cw*07 Cw*15 G/G A/G
12 201205211218644 B*15 B*45 Cw*06 Cw*07 G/G A/A
88 201206161221545 B*07 B*18 Cw*05 Cw*07 G/G A/G
13 201205211218650 B*44 B*52 Cw*12 Cw*16 G/G A/G
89 201206161221546 B*07 B*44 Cw*02 Cw*07 G/G A/A
14 201205211218666 B*08 B*40 Cw*07 Cw*15 G/G G/G
90 201206171221547 B*14 B*18 Cw*05 Cw*08 G/G A/A
15 201205211218667 B*27 B*57 Cw*01 Cw*06 G/A A/G
91 201206191221857 B*35 BL Cw*03 Cw*04 G/G A/A
16 201205211218670 B*18 B*51 Cw*01 Cw*05 G/G A/A
92 201206191221886 B*15 B*57 Cw*03 Cw*06 G/G A/A
17 201205211218671 B*51 B*58 Cw*07 Cw*12 G/G A/G
93 201206281222884 B*07 B*45 Cw*06 Cw*07 G/G A/G
18 201205211218672 B*07 B*18 Cw*07 BL G/G A/A
94 201206281222886 B*40 B*51 Cw*03 Cw*14 G/G A/G
19 201205221218801 B*35 B*57 Cw*04 Cw*07 G/A A/A
95 201206291222996 B*18 B*44 Cw*05 Cw*16 G/G A/A
20 201205221218802 B*14 B*18 Cw*05 Cw*08 G/G A/G
96 201206291222997 B*08 B*51 Cw*07 Cw*15 G/G G/G
21 201205221218849 B*42 B*44 Cw*04 Cw*17 G/G A/A
97 201206291222999 B*44 BL Cw*04 Cw*05 G/G A/A
22 201205221218850 B*35 B*49 Cw*07 BL G/G A/G
98 201207031223285 B*14 B*35 Cw*04 Cw*08 G/G A/G
92 Anexos
23 201205221218851 B*18 B*51 Cw*07 Cw*16 G/A A/A
99 201207031223286 B*13 B*38 Cw*06 Cw*12 G/G A/G
24 201205231219049 B*08 B*35 Cw*04 Cw*07 G/A A/G
100 201207041223431 B*51 BL Cw*02 Cw*14 G/G A/G
25 201205231219050 B*15 B*44 Cw*03 Cw*05 G/A A/A
101 201207041223432 B*27 B*44 Cw*02 Cw*16 G/G A/A
26 201205241219143 B*14 B*44 Cw*04 Cw*08 G/G A/G
102 201207051223433 B*07 BL Cw*07 BL G/G A/A
27 201205241219144 B*08 B*50 Cw*06 Cw*07 G/G A/G
103 201207051223434 B*14 B*35 Cw*04 Cw*08 G/G A/G
28 201205241219191 B*08 BL Cw*07 BL G/G A/G
104 201207051223435 B*27 B*45 Cw*02 Cw*16 G/G A/G
29 201205241219192 B*27 B*37 Cw*01 Cw*06 G/G A/G
105 201207051223436 B*07 B*82 Cw*03 Cw*15 G/G A/A
30 201205241219201 B*08 B*51 Cw*02 Cw*07 G/G A/G
106 201207051223522 B*07 B*14 Cw*07 Cw*08 G/G A/A
31 201205241219202 B*14 B*57 Cw*07 Cw*08 G/G G/G
107 201207051223523 B*15 B*44 Cw*06 Cw*16 G/G A/A
32 201205251219313 B*14 B*18 Cw*05 Cw*08 G/G A/G
108 201207051223524 B*39 B*44 Cw*07 BL G/G A/G
33 201205251219314 B*14 B*40 Cw*03 Cw*08 G/G A/G
109 201207051223525 B*35 B*50 Cw*04 Cw*05 G/G A/G
34 201205291219437 B*08 B*13 Cw*06 Cw*07 G/G G/G
110 201207061223705 B*07 B*51 Cw*07 Cw*14 G/A A/G
35 201205291219471 B*35 B*51 Cw*04 Cw*15 G/G A/G
111 201207061223706 B*18 B*35 Cw*04 Cw*05 G/G A/A
36 201205301219598 B*07 B*44 Cw*07 Cw*16 G/G A/G
112 201207071223707 B*18 B*38 Cw*05 Cw*12 G/G A/G
37 201205301219599 B*35 B*49 Cw*04 Cw*07 G/A A/G
113 201207071223708 B*07 B*44 Cw*07 Cw*16 G/A A/G
38 201205301219610 B*07 B*44 Cw*05 Cw*07 G/G A/G
114 201206251222438 B*27 B*35 Cw*01 Cw*04 G/G A/G
39 201205301219611 B*15 B*38 Cw*03 Cw*12 G/G A/A
115 201205021216647 B*14 B*44 Cw*08 Cw*16 G/G A/A
40 201205301219612 B*44 B*55 Cw*03 Cw*16 G/G A/G
116 201205021216678 B*08 B*18 Cw*05 Cw*07 G/G A/A
41 201205301219613 B*50 B*51 Cw*06 Cw*16 G/G A/G
117 201205021216679 B*13 B*18 Cw*05 Cw*06 G/G A/G
42 201205311219765 B*42 B*49 Cw*07 Cw*17 G/G A/G
118 201205021216680 B*08 B*51 Cw*07 Cw*15 G/G A/G
43 201205311219766 B*44 B*49 Cw*05 Cw*07 G/G A/G
119 201205021216681 B*39 B*58 Cw*07 Cw*12 G/G A/A
44 201205311219786 B*27 B*35 Cw*02 Cw*04 G/G A/G
120 201205021216682 B*27 B*58 Cw*01 Cw*03 G/G A/A
45 201205311219787 B*35 B*57 Cw*04 Cw*06 G/G A/A
121 201205021216683 B*40 B*45 Cw*02 Cw*06 G/G G/G
46 201205311219788 B*35 B*49 Cw*04 Cw*07 G/G A/A
122 201205031216795 B*39 B*52 Cw*05 Cw*12 G/G A/A
47 201206011219946 B*39 B*53 Cw*04 Cw*12 G/G A/G
123 201205031216796 B*44 BL Cw*05 Cw*07 G/G A/A
48 201206011219947 B*44 BL Cw*16 BL G/G A/G
124 201205031216814 B*13 B*44 Cw*06 Cw*16 G/G A/G
49 201206051220208 B*14 B*15 Cw*07 Cw*08 G/G A/A
125 201205031216815 B*27 B*51 Cw*02 Cw*14 G/G A/A
50 201206051220228 B*18 B*35 Cw*04 Cw*07 G/G A/A
126 201205041216941 B*44 B*50 Cw*06 Cw*16 G/G A/A
51 201206051220247 B*07 B*51 Cw*07 Cw*14 G/G A/G
127 201205041216942 B*39 B*44 Cw*04 Cw*12 G/G A/G
52 201206061220348 B*35 B*51 Cw*04 Cw*15 G/G A/A
128 201205051216957 B*44 BL Cw*05 Cw*16 G/G A/G
53 201206061220359 B*14 B*35 Cw*04 Cw*08 G/G A/G
129 201205051216958 B*27 B*44 Cw*02 Cw*05 G/A A/G
54 201206061220404 B*07 B*27 Cw*02 Cw*07 G/G A/A
130 201205071217102 B*18 B*35 Cw*04 Cw*05 G/A A/A
55 201206061220406 B*44 B*49 Cw*05 Cw*07 G/G A/A
131 201205071217103 B*15 B*49 Cw*07 BL G/G A/G
56 201206071220443 B*35 B*39 Cw*01 Cw*07 G/G G/G
132 201205071217104 B*15 B*38 Cw*07 Cw*12 G/A A/G
57 201206071220444 B*07 B*52 Cw*07 Cw*12 G/G A/G
133 201205081217129 B*40 B*49 Cw*03 Cw*07 G/G A/A
58 201206071220529 B*27 B*38 Cw*02 Cw*12 G/G A/G
134 201205081217240 B*15 B*44 Cw*03 Cw*16 G/G A/G
59 201206071220530 B*35 B*51 Cw*04 Cw*15 G/A A/A
135 201205081217262 B*27 B*37 Cw*01 Cw*06 G/G A/G
60 201206071220550 B*07 B*27 Cw*01 Cw*07 G/A A/G
136 201205101217610 B*35 BL Cw*04 BL G/G A/G
61 201206081220699 B*35 B*57 Cw*04 Cw*08 G/G A/A
137 201205101217614 B*07 B*44 Cw*05 Cw*07 G/G A/A
62 201206081220700 B*15 B*51 Cw*07 Cw*16 G/G A/G
138 201205101217631 B*15 B*44 Cw*04 Cw*07 G/G A/G
63 201206081220733 B*39 B*51 Cw*01 Cw*07 G/G A/A
139 201205101217632 B*35 B*51 Cw*04 Cw*16 G/G G/G
64 201206091220760 B*08 B*15 Cw*07 BL G/G A/A
140 201205101217633 B*07 B*08 Cw*07 BL G/G G/G
65 201206101220762 B*45 B*49 Cw*07 Cw*16 G/G A/A
141 201205111217674 B*14 B*50 Cw*06 Cw*08 G/G A/A
93 Anexos
66 201206101220764 B*07 B*35 Cw*04 Cw*07 G/G A/A
142 201205111217675 B*07 B*57 Cw*07 BL G/G A/A
67 201206111220888 B*44 B*58 Cw*03 Cw*05 G/G A/G
143 201205121217687 B*15 B*18 Cw*07 BL G/G A/A
68 201206111220889 B*44 BL Cw*16 BL G/G A/A
144 201205121217688 B*37 B*44 Cw*06 Cw*16 G/G A/A
69 201206111220914 B*35 B*49 Cw*04 Cw*07 G/G A/A
145 201205141217814 B*35 B*40 Cw*12 Cw*15 G/G A/G
70 201206121221017 B*35 B*44 Cw*04 Cw*05 G/G G/G
146 201205141217815 B*27 B*49 Cw*02 Cw*07 G/G A/G
71 201206121221046 B*44 B*49 Cw*05 Cw*07 G/G A/A
147 201205151217987 B*14 B*40 Cw*03 Cw*08 G/G G/G
72 201206121221049 B*35 B*44 Cw*04 BL G/G A/G
148 201205151218004 B*39 B*44 Cw*07 Cw*16 G/G A/A
73 201206121221050 B*44 B*50 Cw*06 Cw*16 G/G A/A
149 201207091223859 B*14 B*44 Cw*05 Cw*08 G/G G/G
74 201206121221064 B*40 B*44 Cw*02 Cw*05 G/G A/G
150 201207091223860 B*13 B*44 Cw*04 Cw*06 G/G G/G
75 201206121221065 B*07 B*44 Cw*05 Cw*07 G/G A/G
151 201207091223861 B*14 B*44 Cw*08 Cw*16 G/G G/G
76 201206131221196 B*38 B*51 Cw*12 Cw*14 G/G A/A
152 201207091223862 B*35 B*53 Cw*04 BL G/G A/A
Tabla 29: resultados genéticos obtenidos para el grupo de controles
94 Anexos
Anexo 3_DESARROLLO DE LA TIPIFICACIÓN DEL LOCUS A DEL SISTEMA HLA POR PCR A TIEMPO
REAL
Reacciones utilizadas en la tipificación del locus A del sistema HLA por RT-PCR
A continuación se muestra la localización de los diferentes primers y sondas utilizados en las
reacciones diseñadas para el tipaje de los alelos HLA-A (Figura 28):
95 Anexos
Figura 28: primers (en verde) y sondas (en azul) utilizados en las reacciones para el tipaje de los alelos
HLA-A
Interpretación de los resultados obtenidos
De la misma manera que en las reacciones diseñadas para el tipaje de los alelos HLA de clase I
asociados con GD, aquí también se han obtenido diferentes Tm para cada una de las sondas
80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
GTGAGTG CGGGGTCGGG AGGGAAACCG CCTCTGCGGG GAGAAGCAAG GGGCCCTCCT GGCGGGGGCG CAGGACCGGG GGAGCCGCGC CGGGAGGAGG GTCGGGCAGG TCTCAGCCAC TGCTCGCCCC CAG|GCTCCCA CTCCATGAGG TATTTCTTCA CATCCGTGTC
250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410
CCGGCCCGGC CGCGGGGAGC CCCGCTTCAT CGCCGTGGGC TACGTGGACG ACACGCAGTT CGTGCGGTTC GACAGCGACG CCGCGAGCCA GAAGATGGAG CCGCGGGCGC CGTGGATAGA GCAGGAGGGG CCGGAGTATT GGGACCAGGA GACACGGAAT ATGAAGGCCC
420 430 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580
ACTCACAGAC TGACCGAGCG AACCTGGGGA CCCTGCGCGG CTACTACAAC CAGAGCGAGG ACG|GTGAGTG ACCCCGGCCC GGGGCGCAGG TCACGACCCC TCATCCCCCA CGGACGGGCC AGGTCGCCCA CAGTCTCCGG GTCCGAGATC CACCCCGAAG CCGCGGGACT
590 600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750
CCGAGACCCT TGTCCCGGGA GAGGCCCAGG CGCCTTTACC CGGTTTCATT TTCAGTTTAG GCCAAAAATC CCCCCGGGTT GGTCGGGGCG GGGCGGGGCT CGGGGGACTG GGCTGACCGC GGGGTCGGGG CCAG|GTTCTC ACACCATCCA GATAATGTAT GGCTGCGACG
760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 870 880 890 900 910 920
TGGGGCCGGA CGGGCGCTTC CTCCGCGGGT ACCGGCAGGA CGCCTACGAC GGCAAGGATT ACATCGCCCT GAACGAGGAC CTGCGCTCTT GGACCGCGGC GGACATGGCA GCTCAGATCA CCAAGCGCAAG TGGGAGGCG GTCCATGCGG CGGAGCAGCG GAGAGTCTAC
930 940 950 960 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090
CTGGAGGGCC GGTGCGTGGA CGGGCTCCGC AGATACCTGG AGAACGGGAA GGAGACGCTG CAGCGCACGG |GTACCAGGGG CCACGGGGCG CCTCCCTGAT CGCCTATAGA TCTCCCGGGC TGGCCTCCCA CAAGGAGGGG AGACAATTGG GACCAACACT AGAATATCAC
1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260
CCTCCCTCTG GTCCTGAGGG AGAGGAATCC TCCTGGGTTT CCAGATCCTG TACCAGAGAG TGACTCTGAG GTTCCGCCCT GCTCTCTGAC ACAATTAAGG GATAAAATCT CTGAAGGAGT GACGGGAAGA CGATCCCTCG AATACTGATG AGTGGTTCCC TTTGACACCG
S2a
S2s
Sv2
As_gral
Intrón 2_forward
Intrón 3_reverse
S14a
S14s
S3s
S3a
S570_s
S570_a
S5s y S5.30s
S5a
S350s
S350a
S240a
S240s
S9a
S9s
S540s
S540a
SSP_66_AC/CG
96 Anexos
utilizadas en cada una de las reacciones, según el alelo en cuestión. Estas diferentes Tm se han
codificado en la siguiente tabla (Tabla 28) de tal manera que se ha marcado como 1 aquel alelo
que da positivo a la Tm correspondiente o como 0 aquel alelo que no da señal a la Tm en
cuestión.
97 Anexos
TUBO T1 T7
MARCAJE 640 640 610 640 640
SONDA S2 S3 570 5.30
Tm 64 54 62 50 57 61 67 45 55 65 45 55 65 65 64 50 65 46 52 62
SECUENCIA C2
5
TGC
TC
AT
C3
1
G
C0
1
A AC
T
CG
-CA
CG
-_
CG
-C
AC
-CA
AC
-_
AC
-C
GT
C3
0
A
C6
9 -
TC /
TTC
C1
1…
AC
A*010101 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0102 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0103 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0104N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0106 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
A*0107 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0108 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0109 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0110 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0111 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0112 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
A*0113 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0114 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0115N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0116N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0117 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0118N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0119 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*0120 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0
A*0121 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0122N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0123 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0124 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0125 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
A*0126 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0127N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0128 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0129 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0130 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0131N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0132 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0133 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0134N 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0135 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0136 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0137 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0138 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0139 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0140 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0141 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
A*0142 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0143 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0144 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0145 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0146 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0147 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0148 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0149 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0150 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*0151 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
A*02010101 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0202 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*020301 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*0204 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*020501 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*020601 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0207 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0208 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*0209 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*0210 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*0211 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*0212 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
A*0213 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
A*0214 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*0215N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0216 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*021701 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*0218 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0219 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1
A*022001 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0221 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*022201 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*0224 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0225 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0226 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0227 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
A*0228 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0229 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0230 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0231 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0232N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0233 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0234 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*023501 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0236 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0
A*0237 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1
A*0238 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1
A*0239 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0240 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0241 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0242 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0243N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0244 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1
A*0245 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0246 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
T2 T3 T4 T5 T6 T8 T9
610 640 610 610 610 610
S9 S5 CG+ S14 AC+ S14 S350 S540
98 Anexos
A*0247 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*0248 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0249 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0250 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*0251 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0252 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 0
A*0253N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0254 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1
A*0255 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*025601 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0257 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*0258 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*0259 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0260 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0261 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0262 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0263 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*0264 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0265 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*0266 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0267 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0268 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0269 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0270 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0271 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0272 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0273 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*027401 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0275 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0276 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0277 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0
A*0278 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0279 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0280 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0281 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0282N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0
A*0283N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0284 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*0285 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0286 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0287 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0288N 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0289 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0290 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0291 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0292 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0293 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0294 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0295 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0296 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*029701 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*0299 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9201 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9202 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*9203 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9204 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*9205 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9206 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9207 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9208 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*9209 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9210 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*9211 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9212 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9213 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9214 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9215 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*9216 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9217 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*9218 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9219 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9220 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9221 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9222 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*9223 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9224 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9225N 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9226 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9227 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9228 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9229 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9230 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9231 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9232 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9234 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9236 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*9237 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9238 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9239 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9240 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9241 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9242 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1
A*9243 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9244 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9245 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9246 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9247 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9248 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
99 Anexos
A*9249 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0
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A*9252 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*9253 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0
A*9254 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*9255 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*9256 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*9259 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0
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A*9263 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9264 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9265 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9273 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9275 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9277 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9285 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
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A*9287 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9288 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9289 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9290 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9291 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0
A*9292 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9293 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9294 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9295 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9296 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9297 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9298 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*9299 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*03010101 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
A*0302 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1
A*0303N 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0307 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0309 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0313 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0315 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0317 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0323 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0327 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0343 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0
A*0344 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0346 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
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A*0348 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
A*0349 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0
100 Anexos
A*0350 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0
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A*1105 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1106 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1107 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1108 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*1109 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1110 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1111 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1112 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1113 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1114 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*111501 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
A*1116 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1117 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1118 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1119 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1120 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1121 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1122 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1123 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*112401 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*1125 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*1126 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1127 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
A*1129 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1130 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1131 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*1132 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1133 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1134 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
A*1135 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*1136 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1137 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1138 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
A*1139 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
A*1140 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1141 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1142 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1143 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1144 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*1145 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1146 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1147 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1148 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1
A*1149 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1150Q 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
A*1151 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1152 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1153 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1154 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*1155 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*230101 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2302 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
A*230301 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2304 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0
A*2305 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2306 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2307N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2308N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2309 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2310 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
A*2311N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2312 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2313 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2314 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
A*2315 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
A*2316 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2317 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2318 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2319Q 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2320 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2321 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
101 Anexos
A*2322 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2323 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2324 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2325 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*24020101 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*240301 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1
A*2404 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2405 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1
A*2406 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
A*2407 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2408 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2409N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2410 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1
A*2411N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*241301 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0
A*2414 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1
A*2415 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2417 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2418 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0
A*2419 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2420 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2421 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2422 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0
A*2423 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2424 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
A*2425 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2426 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2427 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2428 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2429 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2430 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2431 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2432 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2433 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1
A*2434 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2435 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2436N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2437 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2438 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2439 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2440N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2441 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2442 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2443 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2444 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2445N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2446 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2447 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2448N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2449 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2450 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2451 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2452 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2453 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2454 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2455 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2456 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2457 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
A*2458 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2459 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2460N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2461 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2462 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2463 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2464 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2465 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2466 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1
A*2467 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2468 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2469 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2470 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2471 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2472 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2473 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2474 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2475 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2476 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2477 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2478 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2479 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2480 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2481 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2482 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2483N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2484N 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2485 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2486N 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2487 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0
A*2488 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2489 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2490N 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2491 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*2492 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1
A*2493 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1
A*2494 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
A*2495 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
A*2496 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
A*2497 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
A*2498 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
A*2499 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
102 Anexos
A*250101 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2502 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2503 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2504 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2505 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2506 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2507 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2508 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2509 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2510 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*2511 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
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A*2603 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
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A*2616 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
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A*2635 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0
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A*2903 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
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A*2909 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0
A*2910 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
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103 Anexos
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A*3214 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
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A*3216 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
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A*3309 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3310 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
A*3311 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3312 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3313 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3314 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3315 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3316 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3317 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3318 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3319 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1
A*3320 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3321 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3322 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0
A*3323 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3324 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3325 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3326 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3327 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3328 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3329 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*340101 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0
A*3402 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3403 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3404 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3405 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0
A*3406 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3407 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3408 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*3601 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0
A*3602 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0
A*3603 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0
A*3604 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0
A*3605 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0
A*4301 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6601 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6602 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
104 Anexos
A*6603 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6604 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6605 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6606 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6607 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
A*6608 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6609 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*6610 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
A*6611 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6612 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*680101 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*68020101 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*680301 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6804 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6805 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6806 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0
A*6807 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*680801 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0
A*6809 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1
A*6810 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6811N 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6812 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6813 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6814 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6815 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6816 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6817 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6818N 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6819 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6820 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6821 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6822 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6823 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6824 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6825 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6826 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1
A*6827 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6828 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6829 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6830 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6831 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6832 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6833 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6834 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6835 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6836 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6837 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6838 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6839 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6840 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6841 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6842 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6843 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6844 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0
A*6845 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6846 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6847 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6848 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0
A*6901 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0
A*7401 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7402 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7403 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7404 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7405 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7406 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7407 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7408 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7409 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7410 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7411 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7412N 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7413 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*7414N 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
A*8001 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
Tabla 30: resumen de las Tm obtenidas en las reacciones para el tipaje de los alelos HLA-A
Resolución obtenida por esta metodología
El resumen de las ambigüedades de tipificación relevantes que han sido generadas por el
sistema de tipificación establecido en este trabajo queda recogido a continuación (Tabla 29):
105 Anexos
Allele_1 Freq_1 Allele_2 Freq_2 Freq_1_2 Allele_1 Freq_1 Allele_2 Freq_2 Freq_1_2 Allele_1 Freq_1 Allele_2 Freq_2 Freq_1_2 Allele_1 Freq_1 Allele_2 Freq_2 Freq_1_2
A*3206 0,00011 020101 0,02605 0,00000 A*7401 0,01733 A*6602 0,00411 0,00007 A*0260 0,00016 A*6602 0,00411 0,00000 A*1104 0,00019 A*2417 0,00134 0,00000
A*320101 0,02147 68020101 0,02605 0,00056 A*8001 0,00254 330301 0,04265 0,00011 A*0260 0,00016 680101 0,01831 0,00000 A*0302 0,00317 A*2417 0,00134 0,00000
A*250101 0,00827 A*7403 0,00002 0,00000 A*7401 0,01733 A*3402 0,00985 0,00017 A*680301 0,00393 A*6602 0,00411 0,00002 A*3102 0,00055 A*1104 0,00019 0,00000
A*2502 0,00002 330101 0,01330 0,00000 A*330301 0,04265 A*6602 0,00411 0,00018 A*8001 0,00254 680101 0,01831 0,00005 A*03010101 0,08758 A*310102 0,03166 0,00277
A*2502 0,00002 320101 0,02147 0,00000 A*330301 0,04265 A*3402 0,00985 0,00042 A*680101 0,01831 A*680101 0,01831 0,00034 A*300101 0,03327 A*7401 0,01733 0,00058
A*2602 0,02191 A*3206 0,00011 0,00000 A*7401 0,01733 330301 0,04265 0,00074 A*2609 0,00002 A*3601 0,00723 0,00000 A*300101 0,03327 A*310102 0,03166 0,00105
A*320101 0,02147 A*6601 0,00619 0,00013 A*290201 0,02248 A*330301 0,04265 0,00096 A*340101 0,00474 A*3601 0,00723 0,00003 A*8001 0,00254 310102 0,03166 0,00008
A*2609 0,00002 320101 0,02147 0,00000 A*330301 0,04265 A*330301 0,04265 0,00182 A*03010101 0,08758 A*2609 0,00002 0,00000 A*7401 0,01733 310102 0,03166 0,00055
A*3206 0,00011 A*6602 0,00411 0,00000 A*0102 0,00214 020101 0,02605 0,00006 A*1104 0,00019 A*3402 0,00985 0,00000 A*290201 0,02248 A*310102 0,03166 0,00071
A*3206 0,00011 340101 0,00474 0,00000 A*010101 0,08599 68020101 0,02605 0,00224 A*03010101 0,08758 A*3402 0,00985 0,00086 A*310102 0,03166 A*310102 0,03166 0,00100
A*3206 0,00011 330101 0,01330 0,00000 A*1105 0,00015 020101 0,02605 0,00000 A*1104 0,00019 340101 0,00474 0,00000 A*300101 0,03327 A*1104 0,00019 0,00001
A*2410 0,00080 250101 0,00827 0,00001 A*110101 0,07670 68020101 0,02605 0,00200 A*0302 0,00317 340101 0,00474 0,00002 A*03010101 0,08758 A*300101 0,03327 0,00291
A*2410 0,00080 260101 0,02413 0,00002 A*2603 0,00043 A*6901 0,00170 0,00000 A*1104 0,00019 A*6602 0,00411 0,00000 A*1104 0,00019 A*3004 0,00271 0,00000
A*2410 0,00080 680101 0,01831 0,00001 A*6901 0,00170 A*4301 0,00080 0,00000 A*03010101 0,08758 A*6602 0,00411 0,00036 A*0302 0,00317 A*3004 0,00271 0,00001
A*2410 0,00080 020101 0,02605 0,00002 A*02010101 0,14032 A*6601 0,00619 0,00087 A*8001 0,00254 A*3402 0,00985 0,00002 A*300101 0,03327 A*3104 0,00008 0,00000
A*250101 0,00827 A*6901 0,00170 0,00001 A*02010101 0,14032 A*260101 0,02413 0,00339 A*3402 0,00985 A*6602 0,00411 0,00004 A*300101 0,03327 A*8001 0,00254 0,00008
A*0207 0,00363 250101 0,00827 0,00003 A*4301 0,00080 020101 0,02605 0,00002 A*340101 0,00474 A*3402 0,00985 0,00005 A*300101 0,03327 A*290201 0,02248 0,00075
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A*7401 0,01733 020101 0,02605 0,00045 A*260101 0,02413 A*3402 0,00985 0,00024 A*0216 0,00023 A*2425 0,00745 0,00000 A*03010101 0,08758 A*4301 0,00080 0,00007
A*020501 0,01323 A*330301 0,04265 0,00056 A*260101 0,02413 A*290201 0,02248 0,00054 A*0216 0,00023 020101 0,11128 0,00003 A*4301 0,00080 A*4301 0,00080 0,00000
A*330301 0,04265 68020101 0,02605 0,00111 A*2609 0,00002 A*2602 0,02191 0,00000 A*8001 0,00254 240301 0,00230 0,00001 A*8001 0,00254 A*4301 0,00080 0,00000
A*330301 0,04265 A*4301 0,00080 0,00003 A*260101 0,02413 A*340101 0,00474 0,00011 A*24020101 0,11128 A*1104 0,00019 0,00002 A*0305 0,00020 010101 0,00611 0,00000
A*7401 0,01733 A*6601 0,00619 0,00011 A*8001 0,00254 A*6601 0,00619 0,00002 A*0302 0,00317 A*2425 0,00745 0,00002 A*1104 0,00019 290201 0,02248 0,00000
A*330301 0,04265 A*6601 0,00619 0,00026 A*260101 0,02413 A*4301 0,00080 0,00002 A*0302 0,00317 020101 0,11128 0,00035 A*03010101 0,08758 A*290201 0,02248 0,00197
A*7401 0,01733 260101 0,02413 0,00042 A*260101 0,02413 A*6601 0,00619 0,00015 A*0219 0,00002 020101 0,11128 0,00000 A*1104 0,00019 A*3601 0,00723 0,00000
A*260101 0,02413 A*330301 0,04265 0,00103 A*8001 0,00254 260101 0,02413 0,00006 A*24020101 0,11128 A*2414 0,00011 0,00001 A*8001 0,00254 A*3601 0,00723 0,00002
A*7401 0,01733 680101 0,01831 0,00032 A*260101 0,02413 A*260101 0,02413 0,00058 A*2405 0,00011 290201 0,02248 0,00000 A*0302 0,00317 A*3601 0,00723 0,00002
A*330301 0,04265 A*680101 0,01831 0,00078 A*1104 0,00019 680101 0,01831 0,00000 A*230101 0,08363 A*290201 0,02248 0,00188 A*3601 0,00723 A*3601 0,00723 0,00005
A*1104 0,00019 330301 0,04265 0,00001 A*03010101 0,08758 A*680101 0,01831 0,00160 A*230101 0,08363 A*2405 0,00011 0,00001 A*03010101 0,08758 A*1104 0,00019 0,00002
A*03010101 0,08758 A*330301 0,04265 0,00374 A*3402 0,00985 680101 0,01831 0,00018 A*230101 0,08363 A*230101 0,08363 0,00699 A*03010101 0,08758 A*8001 0,00254 0,00022
A*290201 0,02248 A*680101 0,01831 0,00041 A*03010101 0,08758 A*03010101 0,08758 0,00767
A*8001 0,00254 A*1104 0,00019 0,00000
A*0302 0,00317 A*1104 0,00019 0,00000
A*0302 0,00317 A*8001 0,00254 0,00001
A*0302 0,00317 A*0302 0,00317 0,00001
A*29010101 0,00611 A*8001 0,00254 0,00002
A*29010101 0,00611 A*29010101 0,00611 0,00004
Tabla 31: indeterminaciones sin resolver para la aproximación de tipaje del HLA-A por RT-PCR
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