1842 – Carl Vogt a descris principiul apoptozei 1885 – Walther Flemming a oferit o descriere mai precisa a MCP 1965 – John F. Kerr a descris necroza celulara programata Lb. gr. "apoptosis“ = "caderea frunzelor" Celula se descompune treptat in componentele sale moleculare, care

ulterior vor fi utilizate de alte celule ale organismului. Apoptoza participa in anumite etape ale dezvoltarii organismului individual,

dar si elimina celulele infectate de virusi, bacterii, etc. Modelul mortii celulelor - pe calea apoptozica sau a necrotica - e

dependenta si de concentratiile intracelulare de NAD+ si ATP. Micsorarea nivelului de NAD+ si ATP induce necroza celulara.

Intr-un organism sanatos moartea programata celulara (MPC) este un mec. de mentinerea homeostaziei. Atat hipofunctia, at si hiperfunctia apoptozei → dereglari de homeostazie.

Dereglari ale apoptozei contribuie la aparitia neoplaziilor (prevenirea sau intarzierea turnover-ului celular normal) si faciliteaza progresia tumorala.

Cunoasterea mec. de reglare a apoptozei poate imbunatati pe viitor tratamentul anticanceros.

Apoptoza este un proces multifazic. Prima faza: primirea semnalului → aparitia unei informatii, transmisa in

celula din exteriorul ei sau generata in compartimentele ei → Semnalul este fixat de receptor si supus analizei → semnalul este transmis de mesagerii, de diferit rang, pana la nucleu → unde are loc includerea programei sinuciderii celulare prin activarea genelor letale sau represia celor antiletale.

Embriogeneza – involutia canalelor Wolff si Muller, formarea degetelor la fat In dezvoltarea fetala tesutul nervos este produs in exces, iar pentru formarea

conexiunilor dintre neuroni este necesara eliminarea surplusului de celule

Organogeneza, turnover tisular normal, absenta unor factori trofici Eliminarea LB si LT la sfarsitul raspunsului imunologic Eliminarea postinflamator a PMN extravazate in tesuturile inflamate Eliminarea celulelor epiteliale si a formarii keratinocitelor

Cele doua procese sunt strans legate pentru a preveni o crestere incontrolabila a numarului de celule

Alterari ale expresiei sau functiei genelor ce controleaza MCP pot deregla acest echilibru contribuind la expansiunea celulelor neoplazice

Condensarea cromatinei (picnoza) Condensarea citoplasmei Fragmentarea nucleului (kariorexis) Distrugerea mitocondriilor cu eliberarea cyt-c Vezicularea membranei plasmatice Contractia si fragmentarea celulara Formarea corpilor apoptotici

Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26:239-57

Fagocit

Celulaapoptotica

PS

ReceptoriiPS

Alterari citoplasmatice si

mitocondrii dilatate

Superagregarea cromatinei.

Leziuni mitocondriale si lipsa invelisului nuclear

Ce anume declanseaza modificarile morfologice din apoptoza?

La celulele animale si ale omului, apoptoza este dependenta de activarea proteolitica a cascadei de caspaze - o familie de proteaze cisteinice care scindeaza specific proteinele dupa resturile de acid aspartic.

“caspaze” (Cistein Aspartaze) Caspazele sunt prezente in toate

celulele animale ca si enzime inactive

Enzimele active sunt heterotetrameri compusi din 2 subunitati mari si 2 subunitati mici cu 2 situsuri active / molecula

Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases: enemies within. Science 1998;281:1312-6Cryns V, Yuan Y. Proteases to die for. Genes Dev 1999;12:1551-70

Alnemri ES, Livingston DJ, Nicholson DW, et al. Human ICE/CED-3 Protease Nomenclature. Cell 1996;87:171

Caspaze initiator

Stimuli pro-apoptotici

Caspaze efector

Cascadacaspazelor

Apoptoza

1. Activarea procaspazelor prin scindare proteolitica in subunitati cu asocierea lor ulterioara.

2. Interactiunea functionala intre caspazele initiale si efectoare (finale) subfamiliei caspazei 3.

Exista 3 subfamilii de caspaze:

a) caspazele 1 (1,4,5)b) caspazele 2 (2)c) caspazele 3 (3, 6-10)

Caspazele cliveaza substraturile la nivelul Asp si sunt activate prin proteoliza la nivelul Asp → colaboreaza in cascade proteolitice

Functional, caspazele se grupeaza in caspaze “initiator” si “efector”

Caspazele efectoare sunt dependente de caspazele initiatoare

Substraturi: protein-kinazele si alte proteine de transductie a semnalului, proteine ale citoscheletului si ale matricei nucleare, proteine de reparare a ADN-ului si subunitati inhibitorii ale endonucleazelor

Clasificarea caspazelor

Mediatori aiinflamatiei

Casp-1

Casp-4

Casp-5

Activatori ai apoptozei

Casp-2

Casp-8

Casp-9

Casp-10

Efectori ai apoptozei

Casp-3

Casp-6

Casp-7

Deletii ale genei caspazei-3 in celule MCF7 Mutatii ale genei caspazei-8 in neuroblastoame si alte

tumori solide Mutatii ale genei caspazei-5 in cancerele de colon Mutatiile asociate cu starile neoplazice la nivelul

genelor ce codifica caspazele probabil contribuie la rezistenta la apoptoza

Datorita redundantei membrilor familei caspazelor aceste mutatii nu previn apoptoza, lasand cai alternative ale apoptozei intacte

Extrinseca Celulele CTL si NK introduc

proteaze pro-apoptotice – granzima B

Receptorii familiei TNF (factorul necrotic cancerigen)

Mitocondria poate participa la calea TNFR prin cross-talk

Intrinseca Eliberarea cyt c din

mitocondrie Factori de stress asupra

RE/Golgi Calea nucleara de reglare a

apoptozei

Cai de realizare a MPC1. Calea determinata de inductorii fiziologici, actiunea carora se realizeaza prin receptorii celulari, ce au functia de a include mecanismele programei apoptozei. Schematic: inductor > receptor > adaptori > caspazele initiale > reglatori > caspazele finale. Receptorul (Fas) interactioneaza cu ligandul (FasL) (proteina transmembranara a T-Kiler), se activeaza si include PMC infectata de virus (desen 1).

2. In celulele supuse actiunii inductorului apoptozei, brusc se micsoreaza potentialul membranar, ce duce la cresterea permeabilitatii membranei interne mitocondriale, consecinta la formarea porilor.

Recent se confirma ca un rol-cheie in apoptoza il poseda mitocondriile.

Unul din simptomele cele mai timpurii ale apoptozei e depolarizarea membranei interne mitoconcondriale. Atit apoptoza, cit si depolarizarea membranei mitocondriale se protejeaza prin utilizarea inhibitorilor, ce blocheaza formarea de pori in membrana interna.

In celulele fara DNA mitocondrial (p°) apoptoza poate fi provocata de factorul necrotic cancerigen (TNF)

In celulele martor (p+), ce poseda mitocondrii cu DNA, ambele substante (TNF, Antimicina A) induc apoptoza. Se confirma ca natura semnalelor primare ce provoaca apoptoza e diferita. TNF e un semnal exterior de autodistrugere, caruia celula se supune. Antimicina A este un inhibitor specific absolut, care blocheaza

transportul e- intre hemul bh si citocroma b . Dintre proteinele mitocondriale, ca factori apoptogeni sunt si:

citocrom c, procaspazele 2, 3, 9; proteina AIF (apoptosis inducing factor).

3. In unele cazuri MPC se realizeaza ca rezultat al efectului combinat a 2 cai – cu participarea receptorilor membranei plasmatice si a citocromului C mitocondrial.

Lezarea DNA duce la acumularea in celule a proteinelor genei p53, care stopeaza inmultirea celulelor si (sau) induce apoptoza. In mai mult de 50% cazuri in celulele cancerigene gena p53 este

inactiva - este dereglata reglarea homeostazei celulare de p53. proteina p53 - este un factor de transcriptie, ce regleaza

activitatea genelor. Se presupune ca, raspunsul la formarea p53 e dependent de gradul de alterare a genomului celular.

4. Exista si calea de transmitere a semnalului MPC cu participarea RE, unde este localizata procaspaza 12.

Dereglarile homeostaziei Ca2+ intracelular la adaosul tapcigarginei sau a preparatului Ca2+ ionoforic - A23187 duc la apoptoza, determinata de activarea procaspazei 12.

Apoptoza, dependenta de RE este in maladia Alzheimer: (neuronii corticali la soricei cu deficit de caspaza 12 sunt rezistenti la apoptoza indusa de o proteina amiloidica, dar nu la apoptoza indusa de cit.c sau cu participarea receptorilor membranari).

tumour-suppressing gene p53 SMACs (second mitochondria-derived activator of caspases) IAP - inhibitor of apoptosis proteins TNF-induced (tumour necrosis factor) Fas receptor (also known as Apo-1 or CD95) binds the Fas ligand (FasL) death-inducing signaling complex (DISC) CTL – limfocite L citotoxice NK – natural killer cell Fas receptor (FasR) is the most intensely studied death receptor. Its

aliases include CD95, Apo-1, and tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6 (TNFRSf6).

DISC – death-inducing signalling complex FADD, Fas-associated death domain GF - growth factor Apaf-1: Apoptotic peptidase activating factor 1 BID = BH3-interacting domain death agonist HtrA2 = high temperature requirement protein A2

BAK – Bcl-2 homolog antagonist/killer BAX – proteina asociata Bcl-2 Bcl-2 – leucemie limfocitara cronica cu celule B BCLXL – Bcl-2-like 1 IAP – inhibitor al proteinei apoptozei PUMA - p53-upregulated modulator of apoptosis SMAC/DIABLO - second mitochondria-derived activator of caspase/direct

IAP binding protein CARD - CAspase Recruitment Domains

Celulele CTL si NK introduc proteaze pro-apoptotice – granzima B (Motyka et al. 2000)

Granzima B (serin proteaza) – cliveaza Asp

Granzima B este capabila sa cliveze si sa activeze numeroase caspaze si substraturile lor (Martin et al. 1996)

Celule de soarece knock-out la care gena FADD lipseste sunt rezistente la inducerea apoptozei prin citokinele familiei TNF (Zhang et al. 1998)

Celule de soarece cu caspaza-8 knock-out nu pot intra in apoptoza ca raspuns la liganzi sau anticorpi ce activeaza D-receptorii familiei TNF → rol esential al caspazei 8 in aceasta cale (Varfolomeev et al. 1998)

DR – death receptorDISC – death-inducing signalling complex

FADD, Fas-associated death domain

DR4 DR5

Procaspaze 8, 10 Procaspaze 8, 10DISC

FADD FADD

Caspase 8,10 Caspase 8,10

Adaptat dupa Hengartner, M.O. 2000. Nature. 407:770.Green, D. and Kroemer, G. 1998. Trends Cell Biol. 8:267.

Calea mitocondrialaCalea extrinseca

FasL

Caspaza 3

DDD D

Fas/Apo1/CD95

FADD

Procaspaza 8

DISC

Caspaza 8

BID

oxidanti deprivare GF alti factori

Bcl-2D

Citocrom c

dATP

Procaspaza 9

Apaf -1

dATP

Apaf -1

Caspaza 9

Procaspaza 3

Apoptozom

Lezare ADN

Tinte celulare

BAD – Bcl-XL/Bcl-2-associated death promoterAlberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, Molecular Biology of the Cell, New York and London: Garland Science,

2002

Mitocondria mai elibereaza si alte proteine pro-apoptotice: endonucleaze G, AIF, Smac (Diablo) si Omi (HtrA2) si antagonisti IAP (proteine inhibitorii a caspazelor)

Celule fara genele pentru Apaf1 sau pro-casp-9 sunt incapabile de apoptoza ca raspuns la agenti ce determina eliberarea cyt c din mitocondrie (Hakem et al. 1998). Totusi, aceste celule pot muri pe cai non-apoptotice, demonstrand ca mitocondria controleaza cai caspazo-dependente cat si caspazo-independente (Haraguchi et al. 2000)

Caspaza 3, 6, 7

Apoptoza

p53

BAX, BAKBCL2, BCLXL

Mitocondria

SMAC/DIABLO

Caspaza 9

PUMA, NOXA

APAF1

Citocrom c

Lezare ADN

IAP

Adaptat dupa Ashkenazi A. Nat Rev Cancer 2002;2:420–430.APAF1 – factorul de activare al proteazei apoptotice-1; BAK – Bcl-2 homolog antagonist/killer; BAX – proteina asociata Bcl-2; Bcl-2 – leucemie limfocitara cronica cu celule B; BCLXL – Bcl-2-like 1; IAP – inhibitor al proteinei apoptozei; PUMA - p53-upregulated modulator of apoptosis; SMAC/DIABLO - second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI

Studii de ablatie genica sugereaza posibilitatea existentei unei cai RE/Golgi → apoptoza care sa implice casp-12 (Nakagawa et al. 2000).

Caspaza 12 la celulele umane este nefunctionala datorita prezentei precoce a unui codon stop (Fischer et al. 2002)

S-a mai sugerat o relatie intre casp-2 si Golgi dar detaliile sunt inca neclare (Mancini et al. 2000)

Casp-2 si casp-12 sunt proteine ce contin domenii CARD, dar nu se cunoaste care sunt proteinele adaptor care se leaga de CARD si care controleaza activarea acestor proteaze

CARD - CAspase Recruitment Domains

Calea nucleara de reglare a apoptozei este centrata asupra unor mici unitati nucleare – POD (Pml oncogenic domains) sau corpi nucleari (NB)

Ablatia genei pml duce la o rezistenta generala la apoptoza printr-un mecanism inca necunoscut (Wang et al. 1998)

Au fost localizate cateva proteine pro-apoptotice in NB: Daax, DAPK3 si Par4 (1997-2000)

PAR4 - Prader-Willi/Angelman region gene 4DAPK3 – death associated kinase 3

Wang Z-G, Ruggero D, Ronchetti S, et al. Pml is essential for multiple apoptotic pathways. Nat Genet 1998;20:266-72

Salomoni P, Pandolfi PP. The role of PML in tumor suppression. Cell 2002;108:165-70

Pml a fost prima data identificata datorita fuziunii sale cu gena RAR in t(15;17) cromozomiala din leucemia promielomonocitica, unde disloca NB si se creaza un status apoptozo-rezistent (Salomoni et al. 2002)

Desi exista diverse mecanisme de activare a casp-initiator, in cele mai multe cazuri mecanismele biologice sunt foarte similare

Activarea caspazelor poate fi explicata prin “modelul proximitatii induse” (Salvesen, Dixit 1999)

Acest model se bazeaza pe observatia empirica a faptului ca formele neprelucrate a caspazelor nu sunt in totalitate inactive ci poseda o activitate proteazica redusa (~1%)

Aduse in stransa apozitie prin interactiuni proteice, zimogenele se pot trans-procesa reciproc → proteaze active total

Acest mecanism este clar in caile de activare a caspazelor prin receptorii fam. TNF (extrinseca) si cyt c mitocondrial (intrinseca)

Salvesen GS, Dixit VM. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:10964-7

NF-kB induce exprimarea unor gene antiapoptotice: familia BCL-2 (BCL-XL, BFL-1), familia IAP (C-IAP2) si familia genei DED (C-FLIP) (Karin M, Lin A. 2002)

Karin M, Lin A. NFkappaB at the crossroads of life and death. Nat Immunol 2002;3:221-7Karin M, Cao Y, Greten FR, Li Z-W. NFκB in cancer: from innocent bystander to major culprit. Nat Rev Genet 2002;2:301-10

Cresteri ale activitatii NF-kB cresc rezistenta celulara la apoptoza afectand: Calea intrinseca (mitocondriala): ↑ Bcl-2 antiapoptotice Calea extrinseca (receptorii fam. TNF): reglarea FLIP Cai comune ce implica caspazele efector ca si rezultat al supra-expresiei C-IAP2

Date recente arata o hiperactivitate a NF-kB in numeroase neoplazii solide si hematopoietice (Karin M et al., 2002)

Medicamentele anticanceroase ┴ activitatea proteozomilor → supresia degradarii IkB ┴ NF-kB (Hayashi et al. 2000)

IkB kinazele (IKK) → fosforilarea IkB (pentru degradarea IkB), sunt de asemenea evaluate ca tinte pentru noi medicamente

Virusul HIV, prezinta locusuri pentru NF-kB ce controleaza expresia genelor virale si contribuie la replicarea virala si patogenicitatea virala.

In cazul virusului HIV-1, NF-kB este implicata in parte in activarea virusului.

YopJ, secretata de Yersinia pestis (ciuma bubonica), previne degradarea IkB. Aceasta determina ca acest patogen sa inhibe efectiv calea NF-kB si astfel sa blocheze raspunsul imun al unei persoane infectate cu Yersinia.

Karnolsky IN. Cytogenetic abnormalities in chronic lymphocytic leukemia. Folia Med (Plovdiv) 2000;42:5-10Hayashi T, Faustman D. Essential role of human leukocyte antigen-encoded proteasome subunits in NFκB activation and prevention

of tumor necrosis factor-a-induced apoptosis. J Biol Chem 2000;275:5238-47

Protein kinaza Akt (PKB) joaca un rol important in legarea factorilor de crestere si oncoproteinelor la calea apoptotica.

Celulele umane prezinta 3 tipuri de gene Akt. Akt pot fosforila diverse proteine apoptotice: BAD (fosforilarea BAD inhiba capacitatea sa de a heterodimeriza cu Bcl-X (Datta et al. 1999)

Kim AH, Khursigara G, Sun X, et al. Akt1 phosphorylates and negatively regulates ASK1. Mol Cell Biol 2001;21:893-901Testa JR, Bellacosa A. AKT plays a central role in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:10983-5.

Akt poate fosforila si casp-9, blocand apoptoza pe calea mitocondriala (Cardone et al. 1998) Akt are un rol important si in activarea NF-kB (Ozes et al. 1999) Akt se opune apoptozei indusa de kinaza Ask1 (Kim et al. 2001) si promoveaza degradarea

p53 prin actiunea sa asupra Mdm2 (Testa JR, Bellacosa A, 2001).

PI-3K - Phosphatidylinositol-3-kinaseBAD – Bcl-XL/Bcl-2-associated death promoter

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, Molecular Biology of the Cell, New York and London: Garland Science, 2002

Expresia Bcl-2 in epiteliul mamar este estrogen-dependenta. Prin inhibarea activitatii transcriptionale a ER, antiestrogenii (Tamoxifen) reduc expresia Bcl-2 si promoveaza apoptoza in celulele tumorale mamare, explicand efectele benefice ale agentilor antihormonali in tratamentul cancerelor mamare (Teixeira et al. 1995)

Guzey M, Kitada S, Reed JC,Apoptosis induction by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 prostate cancer.Mol Cancerl Ther 2002;1:667-77.

Similar, vitamina D si unii analogi sintetici activeaza receptorul vitaminei D (VDR) si inhiba expresia unor gene Bcl-2 antiapoptotice (Bcl-2, Bcl-XL) restabilind sensibilitatea la apoptoza. Doze mari de vitamina D se folosesc in prezent in trialuri clinice pentru cancer prostatic (Guzey et al. 2002).

Diosgenina (Trigonella sp.), activeaza apoptoza in celule canceroase mamare probabil prin scaderea expresiei Bcl-2 antiapoptotic si prin activarea casp-9

Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., Molecular Biology of the Cell, 4th ed., New York, Garland Publishing, 2002

Ardelean A, Biologie celulara si moleculara, Ed. Vasile Goldis Univ. Press, 2007

Benga Gh., Biologie Celulară şi Moleculară, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1985 Cooper G.M., The Cell - A Molecular Approach, 2nd ed., Sunderland (MA),

Sinauer Associates, Inc.; 2000 Craciun C, Florea A, Dragos N, Ardelean A, Introduction to Cell and Molecular

Biology, Cluj Univ. Press, 1999 Cruce M., Biologie Celulară şi Moleculară, Ed. Aius Craiova, 2002 Diculescu I., Onicescu D., Benga Gh., Popescu L.M., Biologie Celulară, Ed. D.P.

Buc., 1983 Frăsinel N., Verdeş D., Biologie Celulară şi Moleculară, Ed. Mirton, Timişoara,

1994 Lodish H., Berk A., Zipursky S., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., Molecular

Cell Biology, 4th ed., New York, W. H. Freeman & Co., 1999. Kufe, DW; Pollock, RE; Weichselbaum, RR.; Bast, RC., Jr.; Gansler, TS.; Holland, JF.;

Frei III, E., Cancer Medicine, BC Decker Inc. ; 2003 Mixich F., Ardelean A., Principii fundamentale de biologie moleculară, Ed.

Med. Univ. Craiova, 2002 Moldoveanu E, Popescu LM, Apoptoza - Mecanisme moleculare, ed. a II-a, Ed.

Univ. Carol Davila Bucuresti, 1999 Strachan T., Read A.P., Human Molecular Genetics, 2nd ed. Oxford, UK, BIOS

Scientific Publishers Ltd; 1999